MX2012010559A - Anticuerpos biespecificos. - Google Patents

Anticuerpos biespecificos.

Info

Publication number
MX2012010559A
MX2012010559A MX2012010559A MX2012010559A MX2012010559A MX 2012010559 A MX2012010559 A MX 2012010559A MX 2012010559 A MX2012010559 A MX 2012010559A MX 2012010559 A MX2012010559 A MX 2012010559A MX 2012010559 A MX2012010559 A MX 2012010559A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
heavy chain
chain
Prior art date
Application number
MX2012010559A
Other languages
English (en)
Other versions
MX340124B (es
Inventor
Erhard Kopetzki
Ulrich Brinkmann
Pablo Umana
Joerg Thomas Regula
Christian Klein
Rebecca Croasdale
Wilma Lau
Juergen Michael Schanzer
Harald Duerr
Katharina Wartha
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of MX2012010559A publication Critical patent/MX2012010559A/es
Publication of MX340124B publication Critical patent/MX340124B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

La presente invención está relacionada con anticuerpos biespecíficos, métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos, y usos de los mismos.

Description

ANTICUERPOS BIESPECIFICOS Campo de la Invención La presente invención está relacionada con anticuerpos biespecíf icos , métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos, y usos de los mismos.
Antecedentes de la Invención Se han desarrollado una gran variedad de formatos de anticuerpo multiespecíf ico recombinante en los últimos tiempos, por ejemplo, anticuerpos biespecíf icos tetravalentes, por ejemplo, mediante la fusión de un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (véase por ejemplo, Coloma, M.J., y otros, Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO2001/077342 ; y Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234) .
También se han desarrollado otros nuevos formatos en los que la estructura núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) no se conserva, como los dia- , tria- o tetra-anticuerpos , minianticuerpos o varios formatos de cadena sencilla (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger P, y otros, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136, 2005; Fischer N. , Léger 0., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen J, y otros, Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C. y otros Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297) .
Ref. 233607 Todos estos formatos utilizan enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a otra proteína de unión (por ejemplo, scFv) o para fusionar por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv. (Fischer N. , Léger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Debe tenerse en cuenta que se quieran retener funciones efectoras, como por ejemplo, la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) , que están mediadas por la unión del receptor Fe, al mantener un alto grado de similitud con los que aparecen en la naturaleza.
En la patente O 2007/024715 se describen dominios variables duales de inmunoglobulinas como proteínas de unión modificadas multivalentes y multiespecíficas . Un proceso para la preparación de dímeros de anticuerpo biológicamente activos se describe en US 6,897,044. La construcción del anticuerpo multivalente Fv con al menos cuatro dominios variables unidos entre ellos mediante enlazadores peptídicos se describen en US 7,129,330. Las estructuras diméricas y multiméricas de unión a antígeno se describen en US 2005/0079170. Las proteínas de unión a antígeno monoespecíficas tri o tetravalentes que comprenden tres o cuatro fragmentos Fab unidos entre ellos de forma covalente mediante una estructura conectora, y que no son una inmunoglobulina natural, se describen en US 6,511,663. En WO 2006/020258 los anticuerpos biespecífieos tetravalentes descritos pueden expresarse de forma eficiente en células procariotas y eucariotas, y son útiles en los métodos terapéuticos y de diagnóstico. Un método para separar o sintetizar preferiblemente dimeros que están unidos mediante al menos un puente de disulfuro intercadena de dimeros que no están unidos mediante al menos un puente de disulfuro intercadena de una mezcla que comprende los dos tipos de dimeros de polipéptido se describe en US 2005/0163782. Los receptores tetravalentes biespecífieos se describen en US 5,959,083. Los anticuerpos modificados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales se describen en WO 2001/077342.
Los polipéptidos de unión a antígeno multiespecífieos y multivalentes se describen en WO 1997/001580. La patente WO 1992/004053 describe homoconjugados , preparados normalmente a partir de anticuerpos monoclonales de clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico que están unidos de forma covalente mediante reticulaciones sintéticas. Los anticuerpos monoclonales oligoméricos con alta avidez por los antígenos se describen en WO 1991/06305 en la que los oligómeros, normalmente de la clase IgG, se secretan con dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados juntos para formar moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes . Los anticuerpos derivados de oveja y los constructos de anticuerpos modificados se describen en US 6,350,860, que pueden utilizarse para tratar enfermedades en las que la actividad del interferón gamma es patogénica. En US 2005/0100543 se describen constructos dirigidos que son transportadores multivalentes de anticuerpos biespecífieos , es decir, cada molécula de un constructo dirigido puede servir como transportador de dos o más anticuerpos biespecífieos .
Los anticuerpos tetravalentes biespecífieos modificados genéticamente se describen en O 1995/009917. En WO 2007/109254 se describen las moléculas de unión estabilizadas que consisten o comprenden un scFv estabilizado .
Los anticuerpos biespecífieos frente a EGFR y IGF- 1R se conocen de Lu, D., y otros, Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; Lu, D., y otros, J. Biol. Chem. , 279 (2004) 2856-2865; y Lu, D., y otros, J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72.
La US 2007/0274985 está relacionada con moléculas de anticuerpo sintéticas que comprenden proteínas Fab (scFab) de cadena sencilla que también puede asociarse a dímeros, que incluye anticuerpos heteroméricos , en los que al menos dos moléculas de anticuerpo de cadena sencilla están asociadas.
La WO 2009/080253 está relacionada con anticuerpos bivalentes biespecíficos .
No obstante, en vista de los diferentes problemas y aspectos de los anticuerpos multiespecífieos (como por ejemplo, propiedades farmacocinéticas y biológicas, estabilidad, agregación, rendimiento de expresión, productos secundarios) existe una necesidad de otros formatos de anticuerpo multiespecíf ico alternativos.
Breve Descripción de la Invención En un aspecto la invención está relacionada con un anticuerpo bivalente biespecífico que comprende a) la cadena ligera y la cadena pesada de un primer anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno ; b) la cadena ligera y la cadena pesada de un segundo anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el N-terminal de la cadena pesada está conectado con el C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido enlazador.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza además en que el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de b) se encuentran en una superficie que comprende una alteración de la superficie original entre los dominios CH3 de los anticuerpos ; en el que i) en el dominio CH3 de una cadena pesada un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido con un volumen de cadena lateral mayor, generando así una protuberancia en la superficie del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede posicionar en una cavidad en la superficie del dominio CH3 de la otra cadena pesada y en el que ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido que posee un volumen de cadena lateral más pequeño, generando así una cavidad en la superficie del segundo dominio CH3 en el que la protuberancia en la superficie del primer dominio CH3 se puede colocar.
En otro aspecto el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que ambos dominios CH3 están alterados además por la introducción de una cisteína (C) como aminoácido en las correspondientes posiciones de cada dominio CH3 de forma que puede formarse un puente de disulfuro entre ambos dominios CH3.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa bajo b) están estabilizados mediante la introducción de puentes disulfuro entre las siguientes posiciones: i) la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 2, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tales cadenas pesada y ligera conectadas por péptido poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 3.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 7.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo comprende una región constante de IgGl.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo está glucosilado con una cadena de azúcar en la Asn297 en el que la cantidad de fucosa en la cadena de azúcar es del 65% o inferior.
Otros aspectos de la invención son una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo biespecífico, tal composición para el tratamiento del cáncer, el uso de tal anticuerpo biespecífico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, un método de tratamiento de pacientes que padecen cáncer mediante la administración de tal anticuerpo biespecífico a un paciente que necesita tal tratamiento .
Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención.
La invención proporciona además vectores de expresión que contienen tales ácidos nucleicos de acuerdo con la invención capaces de expresar tales ácidos nucleicos en una célula hospedera procariota o eucariota, y células hospederas que contienen tales vectores para la producción recombinante de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención .
La invención comprende además una célula hospedera procariota o eucariota que comprende un vector de acuerdo con la invención.
La invención comprende además un método para la producción de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, caracterizado porque expresa un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula hospedera procariota o eucariota y que recupera tal anticuerpo biespecífico de tal célula o el sobrenadante del cultivo celular. La invención comprende además el anticuerpo obtenido por tal método para la producción de un anticuerpo biespecífico.
Otro aspecto de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende los pasos de a) transformar una célula hospedera con vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican aa) la cadena ligera y la cadena pesada de un primer anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno; y ab) la cadena ligera y la cadena pesada de un segundo anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el N-terminal de la cadena pesada está conectado con el C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido enlazador; y b) cultivar la célula hospedera bajo condiciones que permiten la síntesis de tal molécula de anticuerpo; y c) recuperar tal molécula de anticuerpo de tal cultivo .
Se ha encontrado que los anticuerpos biespecífieos de acuerdo con la invención poseen características valiosas como buenos rendimientos de expresión en células de mamífero como células HEK293 y células CHO, estabilidad, actividad biológica o farmacológica, propiedades farmacocinéticas . Pueden utilizarse por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades como el cáncer. Estos anticuerpos biespecífieos de acuerdo con la invención comprenden 3 cadenas de polipéptido que especialmente poseen un valioso perfil de producción de productos secundarios durante su expresión en células de mamífero.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Estructura esquemática de un anticuerpo de longitud completa sin el dominio CH4 que se une de forma específica a un primer antígeno 1 con dos pares de cadenas ligeras y pesadas que comprenden los dominios variables y constantes en un orden normal .
Figura 2. Estructura esquemática del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención Figuras 3a y 3b. Estructura esquemática del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que incluye dominios CH3 modificados de de botón en ojal (hélice super-enrrollada) .
Figuras 4a y 4b. Estructura esquemática del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que incluye dominios CH3 modificados de botón en ojal y estabilización de disulfuro del dominio VH y VL de la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo Figura 5. Inhibición de la proliferación HUVEC mediante un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 Figura 6. Inhibición de la fosforilación Tie2 mediante anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 Figuras 7a y 7b. Western blot (reducido) de 0A-Akl8-scFab-GA201 (Figura 7a) y OA-GA201-scFab-Akl8 (Figura 7b) Figura 8. Inhibición del crecimiento de células cancerígenas H322M mediante el anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1 > OA-GA201-scFab-Akl8_TS (dependiente de dosis) en comparación con los anticuerpos monoespecífieos parentales <IGF-1R> HUMAB Clon 18 o <EGFR>ICR62. Mediante ensayo de proliferación 3D, NCI-H322M. Titulación celular tras 7 días 2,5 X 10Exp3 células/pocilio.
Figura 9. Biacore (Resonancia de plasmón en superficie) -Sensograma : el anticuerpo biespecífico OA-GA201-scFab-Akl8_TS mostró unión simultánea de EGFR humano acoplado a amina y IGF1R humano (eje x: respuesta, eje y: tiempo) .
Figura 10. Inhibición de crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto BxPC3 por medio de OA-GA201-scFab-Akl8_TS comparado con la combinación de anticuerpos monoespecíficos <IGF-1R> HUMAB Clon 18 y <EGFR>ICR62.
Descripción Detallada de la Invención En un aspecto la invención está dirigida a un anticuerpo biespecífico que comprende a) la cadena ligera y la cadena pesada de un primer anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno; b) la cadena ligera y la cadena pesada de un segundo anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el N-terminal de la cadena pesada está conectado con el C-terminal de cadena ligera mediante un péptido enlazador.
El término "anticuerpo de longitud completa" denota un anticuerpo que consta de dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa" (véase la Figura 1) . Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consta en la dirección N-terminal hacia C-terminal de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de la cadena pesada del anticuerpo (CH1) , una región bisagra de un anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de la cadena pesada de anticuerpo (CH2), y un dominio constante 3 de la cadena pesada de anticuerpo (CH3), abreviado como VH-CH1-HR-CH2 -CH3 ; y opcionalmente un dominio constante 4 de la cadena pesada de anticuerpo (CH4) cuando es un anticuerpo de la subclase IgE. Preferiblemente la "cadena pesada del anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consta en la dirección N-terminal hacia C-terminal de VH, CH1, HR, CH2 y CH3. Una "cadena ligera del anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consta en la dirección N-terminal hacia C-terminal de un dominio variable en la cadena ligera del anticuerpo (VL) , y un dominio constante en la cadena ligera del anticuerpo (CL) , abreviado como VL-CL. El dominio constante en la cadena ligera del anticuerpo (CL) puede ser ? (kappa) o ? (lambda) . Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa están unidas a través de puentes disulfuro inter-polipéptido entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos son los anticuerpos naturales como IgG (por ejemplo, IgG 1 y IgG2), IgM, IgA, IgD, e IgE. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención pueden ser de especies únicas como por ejemplo, humanos, o pueden ser quimeras o anticuerpos humanizados. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención comprenden dos sitios de unión a antígeno formado cada uno por un par de VH y VL, que se unen ambos de forma específica al mismo antígeno. El C-terminal de la cadena ligera o pesada de tal anticuerpo de longitud completa denota el último aminoácido en el C-terminal de tal cadena ligera o pesada. El N-terminal de la cadena ligera o pesada de tal anticuerpo de longitud completa denota el último aminoácido en el N-terminal de tal cadena ligera o pesada.
El término "enlazador peptídico" tal como se utiliza en la invención denota un péptido con secuencias de aminoácidos, que es preferiblemente de origen sintético. Estos péptidos de acuerdo con la invención se utilizan para conectar el C-terminal de la cadena ligera con el N-terminal de la cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa (que se une específicamente a un segundo antígeno) mediante un péptido enlazador. El enlazador peptídico de la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa es un péptido con una secuencia de aminoácido con una longitud de al menos 30 aminoácidos, preferiblemente con una longitud de 32 a 50 aminoácidos. En una modalidad el enlazador peptídico es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de 32 a 40 aminoácidos. En una modalidad tal enlazador es (GxS)n con G = glicina, S serina, (x =3, n= 8 , 9 ó 10 y m= 0, 1, 2 ó 3) o (x = 4 y n= 6, 7 ó 8 y m= 0, i, 2 Ó 3), preferiblemente con x = 4, n= 6 ó 7 y m= 0, 1, 2 Ó 3, más preferiblemente con x = 4 , n= 7 y m= 2. En una modalidad tal enlazador es (G4S)6G2. Preferiblemente los dominios CH3 del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención puede alterarse mediante la tecnología "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos en por ejemplo, O 96/027011, Ridgway J.B., y otros, Protein Eng 9 (1996) 617-621; y Merchant, A.M. , y otros, Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. En este método las superficies de interacción de los dos dominios CH3 están alterados para aumentar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) pueden ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal" . La introducción de un puente de disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant, A.M, y otros, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., y otros.
J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) y aumenta el rendimiento.
En un aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza además en que el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran en una superficie que comprende una superficie original entre los dominios CH3 de los anticuerpos; en el que tal superficie está alterada para promover la formación del anticuerpo biespecífico, en la que la alteración se caracteriza en que: a) el dominio CH3 de una cadena pesada está alterado, por lo que en la superficie original el dominio CH3 de una cadena pesada que encuentra la superficie original del dominio CH3 de la otra cadena pesada en el anticuerpo biespecífico, un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido con un volumen de cadena lateral mayor, generando así una protuberancia en la superficie del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede posicionar en una cavidad en la superficie del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) el dominio CH3 de la otra cadena pesada está alterado, por lo que en la superficie original del segundo dominio CH3 que encuentra la superficie original del primer dominio CH3 en el anticuerpo biespecífico un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido que posee un volumen de cadena lateral más pequeño, generando así una cavidad en la superficie del segundo dominio CH3 en el que la protuberancia en la superficie del primer dominio CH3 es colocable.
Así el anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza preferiblemente en que el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de b) se encuentran en una superficie que comprende una alteración de la superficie original entre los dominios CH3 de los anticuerpos ; en el que i) en el dominio CH3 de una cadena pesada un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido con un volumen de cadena lateral mayor, generando así una protuberancia en la superficie del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede posicionar en una cavidad en la superficie del dominio CH3 de la otra cadena pesada y en el que ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido que posee un volumen de cadena lateral más pequeño, generando así una cavidad en la superficie del segundo dominio CH3 en el que la protuberancia en la superficie del primer dominio CH3 es colocable .
Preferiblemente, tal residuo aminoacídico con una cadena lateral de mayor volumen se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptófano ( ) .
Preferiblemente tal residuo aminoacídico con un menor volumen de cadena lateral se selecciona del grupo que consiste en alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .
En un aspecto de la invención ambos dominios CH3 están alterados además por la introducción de una cisteína (C) como aminoácido en las correspondientes posiciones de cada dominio CH3 de forma que puede formarse un puente de disulfuro entre ambos dominios CH3.
En una modalidad, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366 en el dominio CH3 de la "cadena botón" y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena ojal". También puede utilizarse un puente de disulfuro intercadena adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M, y otros, Nature Biotech 16 (1998) 677-681) por ejemplo, introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena botón" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena ojal".
En otra modalidad, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dominios CH3 y mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en los otros dos dominios CH3. En otra modalidad preferible el anticuerpo biespecífico comprende mutaciones Y349C, T366 en uno de los dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en los otros dos dominios CH3 (la mutación adicional Y349C en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C en el otro dominio CH3 forma un puente de disulfuro intercadena) (la numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Pero también pueden utilizarse otras tecnologías de botón en ojal como se describe en la EP 1870459A1, de forma alternativa o adicional. Así otro ejemplo para el anticuerpo biespecífico son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal" (la numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) .
En otra modalidad el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena botón" y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena ojal" y de forma adicional mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal".
En otra modalidad el anticuerpo biespecífico comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en los otros dos dominios CH3 o tal anticuerpo biespecífico trivalente, comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en los otros dos dominios CH3 y de forma adicional mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal" .
En una modalidad el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa (que se une específicamente a un segundo antígeno) están estabilizados mediante la introducción de puentes disulfuro entre las siguientes posiciones: i) la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (la numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) .
En una modalidad el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa (que se une específicamente a un segundo antígeno) están estabilizados mediante la introducción de puentes disulfuro entre las siguientes posiciones: la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
Tal estabilización mediante disulfuro adicional se logra mediante la introducción de un puente de disulfuro entre los dominios variables VH y VL de la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa. Las técnicas para introducir puentes de disulfuro artificiales para la estabilización de una cadena sencilla Fv se describen por ejemplo, en O 94/029350, Rajagopal V., y otros, Prot . Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi , H., y otros, Nuclear Medicine & Biology, Vol . 25, (1998) 387-393; o Schmidt, M . , y otros, Oncogene (1999) 18, 1711 -1721. En una modalidad el puente de disulfuro opcional entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera. En una modalidad el puente de disulfuro opcional entre los dominios variables está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera (la numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) .
En una modalidad es preferible un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención con tal estabilización opcional mediante disulfuros entre los dominios variables VH y VL de la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa.
En una modalidad es preferible un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención sin tal estabilización opcional mediante disulfuros entre los dominios variables VH y VL de la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa.
Ambas partes del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprenden sitios de unión a antígeno (el primer anticuerpo de longitud completa de la cadena ligera y pesada comprende un sitio de unión a antígeno, y la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa comprende un sitio de unión a antígeno) . Los términos "sitio de unión" o "sitio de unión a antígeno" tal como se utiliza en este documento denota la(s) región (es) de tal anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención al que se une de hecho el correspondiente antígeno. Los sitios de unión a antígeno en la cadena ligera y pesada del primer anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera y pesada del segundo anticuerpo de longitud completa se forman cada uno mediante una pareja que consiste de un dominio variable en la cadena ligera del anticuerpo (VL) y un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) .
Los sitios de unión a antígeno que se unen al antígeno deseado (por ejemplo, EGFR) pueden derivarse a a) a partir de anticuerpos conocidos al antígeno (por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR) o b) a partir de nuevos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo obtenidos mediante métodos de inmunización de novo utilizando entre otros la proteína de antígeno o ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos o mediante presentación en fagos.
Un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención contiene seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) que contribuyen en variar los grados de afinidad del sitio de unión por el antígeno. Existen tres CDR de dominios variables de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominios variables de cadena ligera (CDRL1 , CDRL2 y CDRL3) . El alcance de las CDR y regiones marco (FR, por sus siglas en inglés) se determina mediante comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en que estas regiones se han definido de acuerdo con la variabilidad entre las secuencias.
La especificidad de anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecífieos . El término anticuerpo "biespecífico" tal como se utiliza en este documento denota un anticuerpo que posee dos o más sitios de unión a antígenos y se une a dos antígenos diferentes o dos epítopos diferentes del mismo antígeno. "Anticuerpos biespecífieos" de acuerdo con la invención son anticuerpos que poseen dos especificidades de unión a antígeno diferentes. En una modalidad los anticuerpos de la presente invención son biespecífieos para dos antígenos diferentes, es decir, VEGF como primer antígeno y ANG-2 como segundo antígeno o por ejemplo, EGFR como primer antígeno y IGF- IR como segundo antígeno, o viceversa.
El término anticuerpo "monoespecífico" tal como se utiliza en este documento denota un anticuerpo que posee uno o más sitios de unión cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno.
El término "valente" tal como se utiliza en la presente solicitud denota la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Así, los términos "trivalente", "tetravalente", "pentavalente" y "hexavalente" denotan la presencia de tres sitios de unión, cuatro sitios de unión, cinco sitios de unión, y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo natural por ejemplo o un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención posee dos sitios de unión y es bivalente.
El término "EGFR" tal como se utiliza en este documento se refiere al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (también conocido como HER-1 o Erb-Bl, SEC ID NO: 13) es un receptor de transmembrana de 170 kDa codificado por el proto-oncogén c-erbB, y muestra actividad tirosina cinasa intrínseca (Modjtahedi, H., y otros, Br . J. Cáncer 73 (1996) 228-235; Herbst, y Shin, Cáncer 94 (2002) 1593-1611) . La entrada de la base de datos SwissProt P00533 proporciona la secuencia de EGFR. También existen isoformas y variantes de EGFR (por ejemplo, transcritos de ARN alternativos, versiones truncadas, polimorfismos, etc.) lo que incluye pero no se limita a aquellas identificadas con los números de entrada de la base de datos Swissprot P00533-1, P00533-2, P00533-3 y P00533-4. Se sabe que EGFR se une a ligandos que incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento transformante-a (TGF- a, por sus siglas en inglés) , amfiregulina, EGF de unión a heparina (hb-EGF) , betacelulina y epiregulina (Herbst, y Shin, Cáncer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, y Baselga, Oncogene 19 (2000) 6550-6565) . EGFR regula numerosos procesos celulares a través de rutas de transducción de señales mediadas por la tirosina cinasa, lo que incluye, pero no se limita a la activación de rutas de transducción de señales que controlan la proliferación celular, diferenciación, supervivencia celular, apoptosis, angiogénesis , mitogénesis y metástasis (Atalay, G., y otros, Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, y Herbst, Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, y Shin, Cáncer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., y otros, Br. J. Cáncer 73 (1996) 228-235).
El término "IGF-1R" tal como se utiliza en este documento se refiere al receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina humana (IGF-IR, CD 221 antígeno; SEC ID NO: 14) pertenece a la familia de proteínas tirosina cinasa de transmembrana (LeRoith, D., y otros, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; y Adams , T.E., y otros, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063) . La entrada de la base de datos SwissProt P08069 proporciona la secuencia de IGF-IR. IGF-IR se une a IGF-I con alta afinidad e inicia la respuesta fisiológica a este ligando in vivo. IGF-IR también se une a IGF- II, no obstante con una afinidad ligeramente inferior. La sobreexpresión de IGF-IR promueve la transformación neoplásica de células y existen evidencias que IGF-IR está involucrado en la transformación maligna de células y es por lo tanto una diana útil para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer (Adams, T.E., y otros, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063).
En un aspecto preferible de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se une específicamente a IGF-1R humano así como a EGFR humano (es decir, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención es un anticuerpo biespecífico anti IGF-1R / anti EGFR) . El anticuerpo biespecífico está basado en los sitios de unión a antígeno del <IGF-1R> HUMAB Clon 18 humano (DSM ACC 2587; WO 2005/005635, abreviado como <IGF-1R> Clon 18 o <IGF-1R> AK18) y <EGFR>ICR62 humanizado (WO 2006/082515 abreviado como <EGFR>ICR62) . Las secuencias de aminoácidos relevantes de las cadenas ligera pesada de estos anticuerpos bivalentes biespecífieos , se proporcionan en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 (para OA-Akl8-scFab-GA201) ; en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 (para OA-GA201-scFab-Akl8 ) ; en SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2, SEC ID NO : 4 (para OA-Akl8 -scFab-GA201_TS) , y en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8 (para OA-GA201-scFab-Akl8_TS) .
Los anticuerpos biespecífieos <EGFR- IGF- 1R> de acuerdo con la invención muestran beneficios para los pacientes humanos que necesitan una terapia dirigida de EGFR y IGF- IR. Los anticuerpos de acuerdo con la invención presentan propiedades muy valiosas que provocan un beneficio para el paciente que padece de una enfermedad, especialmente los que padecen cáncer. Los anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF-1R> de acuerdo con la invención muestran por ejemplo, una reducción de la internalización del receptor IGF-1R en comparación con el anticuerpo parental monoespecífico <IGF-1R> . Además muestran una buena localización de células tumorales que expresan ambos antígenos EGFR y IGF- IR que representan un beneficio respecto a la proporción eficacia/toxicidad para pacientes que padecen de un cáncer que expresa ambos antígenos EGFR y IGF- IR.
Así en un aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal péptido enlazador que conecta la cadena ligera y pesada posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 3.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF-1R y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal péptido enlazador que conecta la cadena ligera y pesada posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal péptido enlazador que conecta la cadena ligera y pesada posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal péptido enlazador que conecta la cadena ligera y pesada posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 8.
Así en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-IGF-lR/ anti-EGFR y se caracteriza en que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2 y de SEC ID NO : 3. De acuerdo con esto, un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF- IR humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y de SEC ID NO: 3.
Así en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-IGF-lR/ anti-EGFR y se caracteriza en que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2 y de SEC ID NO : 4. De acuerdo con esto, un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF- IR humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y de SEC ID NO: 4.
Así en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-IGF-lR/ anti-EGFR y se caracteriza en que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6 y de SEC ID NO : 7. De acuerdo con esto, un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF-1R humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y de SEC ID NO : 7.
Así en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-IGF-lR/ anti-EGFR y se caracteriza en que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6 y de SEC ID NO: 8. De acuerdo con esto, un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF- IR humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y de SEC ID NO: 8.
En una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-IGF-lR/ anti-EGFR que se caracteriza en que a) comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO : 2 y de SEC ID NO : 3. b) comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y de SEC ID NO : 4. c) comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y de SEC ID NO : 7, o d) comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6 y de SEC ID NO : 8.
En una modalidad de la invención tal anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-IGF-lR/ anti-EGFR que se caracteriza en tener una o más de las siguientes propiedades (determinadas en los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 5) : el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de IGF-IR con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2 nM o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti -IGF-IR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de EGFR con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2n M o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR reduce la regulación negativa de IGF-1R en un 50% o más en comparación con el anticuerpo anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) .
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF-1R y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido en los CRD, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO: 7.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido en los CRD, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO: 8.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido del CDR3H, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO : 7.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF-1R y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 8 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido del CDR3H, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO: 8.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido en los CRD, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO: 7; y con una o más de las siguientes propiedades (determinadas en los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 5) : el anticuerpo biespecífico anti - IGF- lR/anti -EGFR inhibe la fosforilación de IGF-1R con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2 nM o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de EGFR con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2 nM o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR reduce la regulación negativa de IGF-1R en un 50% o más en comparación con el anticuerpo anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) .
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido en los CRD, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO: 8 ; y con una o más de las siguientes propiedades (determinadas en los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 5) : el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de IGF-1R con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2 nM o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti - IGF- lR/anti -EGFR inhibe la fosforilación de EGFR con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2n M o menos) sobre células tumorales H322M el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR reduce la regulación negativa de IGF- IR en un 50% o más en comparación con el anticuerpo anti-IGF- IR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) .
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido del CDR3H, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO: 7 ; y con una o más de las siguientes propiedades (determinadas en los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 5) : el anticuerpo biespecífico anti - IGF- lR/anti -EGFR inhibe la fosforilación de IGF-1R con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2 nM o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de EGFR con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2n M o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR reduce la regulación negativa de IGF- IR en un 50% o más en comparación con el anticuerpo anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) .
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une de forma específica al IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada a la cadena ligera mediante un enlazador peptídico en el que las cadenas pesada y ligera conectadas poseen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8 con no más de 1 sustitución en los residuos de aminoácido del CDR3H, y en el que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada de SEC ID NO : 8 ; y con una o más de las siguientes propiedades (determinadas en los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 5) : el anticuerpo biespecífico anti-IGF- lR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de IGF-1R con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2 nM o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti-IGF-lR/anti-EGFR inhibe la fosforilación de EGFR con una CI50 de 5 nM o menos (preferiblemente 2n M o menos) sobre células tumorales H322M; el anticuerpo biespecífico anti - IGF- lR/anti -EGFR reduce la regulación negativa de IGF-1R en un 50% o más en comparación con el anticuerpo anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) .
Ejemplos de sustitución en los residuos de aminoácido del CDR3H de SEC ID NO : 7 o de SEC ID NO: 8 en los que el valor de KD de la afinidad de unión es igual o está reducida menos de 4 veces cuando se compara con el valor de KD de la afinidad de unión de la secuencia de aminoácidos inmutada, se describe por ejemplo en PE10166860.6.
El término "VEGF" tal como se utiliza en este documento se refiere al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF-A) (SEC ID NO: 15) que se describe en por ejemplo, Leung, D.W., y otros, Science 246 (1989) 1306-9; Keck, P.J., y otros, Science 246 (1989) 1309-12 y Connolly, D.T., y otros, J. Biol . Chem. 264 (1989) 20017-24. VEGF está involucrado en la regulación de la angiogénesis normal y anormal y en la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara, N . , y otros, Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A.,y otros, J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., y otros, Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., y otros, Cáncer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., y otros, Brit. J. Cáncer. 73 (1996) 931-934; y Dvorak, H., y otros, Am. J. Pathol . 146 (1995) 1029-1039) . VEGF es una glucoproteína homodimérica que se ha aislado a partir de varias fuentes. VEGF muestra una actividad mitogénica altamente específica para las células endoteliales .
El término "ANG-2" tal como se utiliza en este documento se refiere a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) (abreviada alternativamente con ANGPT2 o ANG2 ) (SEC ID NO: 16) que se describe en Maisonpierre, P.C., y otros, Science 277 (1997) 55-60 y Cheung, A.H., y otros, Genomics 48 (1998) 389-91. Las angiopoyetinas-1 y -2 y ANG-2 se descubrieron como ligandos de los Tie, una familia de tirosina cinasas que se expresan de forma selectiva en el endotelio vascular. Yancopoulos, G.D., y otros, Nature 407 (2000) 242-48. Existen ahora cuatro miembros seguros de la familia de la angiopoyetina . La angiopoyetina-3 y 4 (Ang-3 y Ang-4) pueden representar homólogos ampliamente divergentes del mismo locus génico en ratones y humanos. Kim, I., y otros, FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., y otros, J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. ANG-1 y ANG-2 se identificaron originariamente en experimentos de cultivo de tejidos como agonista y antagonista, respectivamente (véase por ejemplo ANG-1: Davis, S., y otros, Cell 87 (1996) 1161-69; y para ANG-2: Maisonpierre, P.C., y otros, Science 277 (1997) 55- 60).
Todas las angio oyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2 , y ambas Ang-1 y Ang-2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd) . Maisonpierre , P.C., y otros, Science 277 (1997) 55-60.
En una modalidad preferible tal anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se une específicamente a VEGF humano asi como a ANG-2 humano (es decir, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención es un anticuerpo biespecífico anti-VEGF / anti-ANG-2) . El anticuerpo biespecífico preferiblemente se basa en los sitios de unión a antígeno del anticuerpo anti-VEGF bevacizumab y ANG2Í-LC06 (que se describe en WO2010/040508 (solicitud PCT NO PCT/EP2009/007182) y que se obtuvo mediante presentación en fagos) . Las secuencias relevantes de aminoácidos de cadena ligera y pesada de estos anticuerpos bivalentes, biespecífieos se proporcionan en SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 (para Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS) , y en SEC ID NO: 9, SEC ID NO : 10, SEC ID NO: 12 (para Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06) .
Así en un aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a VEGF y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a ANG-2 y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal péptido enlazador que conecta la cadena ligera y pesada posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11.
En otro aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a VEGF y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a ANG-2 y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal péptido enlazador que conecta la cadena ligera y pesada posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.
Así en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-VEGF/ anti-ANG-2 y se caracteriza en que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10 y de SEC ID NO: 11.
Así en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo anti-VEGF/ anti-ANG-2 y se caracteriza en que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10 y de SEC ID NO: 12.
Los anticuerpos de longitud completa de la invención comprende regiones constantes de inmunoglobulina de una o más clases de inmunoglobulina. Las clases de inmunoglobulina incluye los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE y, en el caso de IgG y IgA, sus subtipos. En una modalidad preferible, un anticuerpo de longitud completa de la invención posee una estructura de dominio constante de un anticuerpo de tipo IgG.
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en este documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir, una región de unión, de un origen o especie, y al menos una porción de una región constante derivada de un origen o especie diferente, normalmente obtenido mediante técnicas de ADN recombinante . Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana son preferibles. Otras formas preferibles de "anticuerpos quiméricos" incluidas en la presente invención son aquellos en los que la región constante se ha modificado o cambiado de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión de Clq y/o la unión del receptor Fe (FcR) . Tales anticuerpos quiméricos también se denominan "anticuerpos con cambio de clase" . Los anticuerpos quiméricos son el producto de expresión de los genes de las inmunoglobulinas que comprenden segmentos de ADN que codifican las regiones variables de la inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican las regiones constantes de la inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos involucran las técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica y son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Morrison, S.L., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81 (1984) 6851-6855; y las patentes US 5.202.238 y US 5.204.244.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que las regiones marco o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para comprender las CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad comparada con la de la inmunoglobulina parental . En una modalidad preferible, una CDR murina se inserta en una región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado." Véase, por ejemplo, Riechmann, L., y otros, Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., y otros, Nature 314 (1985) 268-270. Las CDR particularmente preferibles corresponden a aquellas que representan las secuencias que reconocen los antígenos mencionados anteriormente para los anticuerpos quiméricos.
Otras formas de "anticuerpos humanizados" incluidos en la presente invención son aquellos en los que la región constante se ha modificado o cambiado de forma adicional respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión de Clq y/o la unión del receptor de Fe (FcR) .
El término "anticuerpo humano", como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos con las regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en la materia (van Dijk, M.A. , y van de inkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol . 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras una inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en a ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia del conjunto de genes de la inmunoglobulina de línea germinal humana a la línea germinal de tales ratones de mutantes resultará en la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., y otros, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., y otros, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M . , y otros, Year Immunol . 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom, H.R., y Winter, G. , J. Mol. Biol . 227 (1992) 381-388; Marks , J.D., y otros, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Colé y otros, y Boerner y otros. también están disponibles para la preparación de anticuerpos humanos monoclonales (Colé y otros, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P. , y otros, J. Immunol . 147 (1991) 86-95). Como ya se ha mencionado para los anticuerpos quiméricos y humanizados de acuerdo con la invención, el término "anticuerpo humano" como se usa aquí también comprende aquellos anticuerpos que están modificados en la región constante para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión de Clq y/o la unión de FcR, por ejemplo, mediante "cambio de clase", es decir, el cambio o mutación de las partes Fe (por ejemplo, mutación de IgGl a IgG4 y/o IgGl/lgG4. ) El término "anticuerpo humano recombinante" , como se utiliza aquí, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se han preparado, expresado, creado o aislado mediante medios recombinantes , como los anticuerpos aislados a partir de una célula hospedera como una célula NSO o CHO o a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de la inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen las regiones variables y constantes reorganizadas. Los anticuerpos recombinantes humanos de acuerdo con la invención se han sometido una hipermutación somática in vivo. Por lo tanto, las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque son derivadas y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no aparecer naturalmente en un repertorio de anticuerpos de línea germinal humana in vivo.
El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) ) como se usa aquí indica cada par de cadenas ligeras y pesadas que están directamente involucradas en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas ligeras y pesadas variables humanas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones marco adoptan una conformación de lámina ß y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional a través de las regiones marco y formar junto con las CDR de la otra cadena el punto de unión del antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/ afinidad de la unión de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan otro objeto de la invención.
Los términos "región hipervariable" o "porción de unión del antígeno de un anticuerpo", como se utiliza aquí, se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende los residuos aminoacídicos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones "marco" o "FR" , como se utilizan aquí, son aquellas regiones del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden de N- a C-terminal los dominios FR1, CDR1 , FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por tales aminoácidos marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye la mayor parte de la unión del antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .
Tal como se utiliza aquí, los términos "unión a" o "que se une específicamente a" o "unido de forma específica a" se refiere a la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno en un ensayo in vi tro, preferiblemente en un ensayo de resonancia en plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia) con antígeno purificado de tipo salvaje. La afinidad de la unión está definida por los términos ka (tasa constante para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación), y KD (kD/ka) . En una modalidad, unión o unido de forma específica a significa una afinidad de unión (KD) de 10"8 mol/1 o inferior, preferiblemente de 10"9 M a 10"13 mol/1. Así, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención está preferiblemente unido de forma específica a cada antígeno por el que es específico con una afinidad de unión (KD) de 10"8 mol/1 o inferior, preferiblemente de 10~9 M a 10"13 mol/1.
La unión del anticuerpo a FCYRIII puede analizarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia) . La afinidad de la unión está definida por los términos ka (tasa constante para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno), kD (constante de disociación), y KD (kD/ka) .
El término "epítopo" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopo incluyen agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales específicas tridimensionales o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une mediante un anticuerpo.
En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando este reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
El término "región constante" tal como se utiliza en las presentes solicitudes denota la suma de los dominios de un anticuerpo diferente a la región variable. La región constante no está involucrada directamente en la unión de un antígeno, pero presenta varias funciones efectoras . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse además en subclases, como IgGl, IgG2 , IgG3 , y IgG4 , IgAl y IgA2. Las regiones constantes de las cadenas pesadas que corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las regiones constantes de las cadenas ligeras (CL) que pueden encontrarse en las cinco clases de anticuerpo se denominan K (kappa) y ? (lambda) .
El término "región constante de origen humano" tal como se utiliza en la presente solicitud denota una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2 , IgG3 , o IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Las regiones constantes son bien conocidas en la técnica y por ejemplo, se describen en Kabat, E.A., (véase por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).
El término "citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) " denota un proceso que se inicia mediante la unión del factor del complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo se produce por interacciones proteína-proteína definidas en el llamado lugar de unión. Tales lugares de unión de la parte Fe son conocidos en la materia (véase más arriba) . Tales lugares de unión de la parte Fe se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de las subclases IgGl, IgG2 e IgG3 normalmente muestran activación del complemento, lo que incluye la unión de Clq y C3 , mientras IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une a Clq y/o C3.
Mientras que los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran una unión reducida al receptor Fe (FcyRIIIa) , los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una fuerte unión. No obstante, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, y His435 son residuos que, si se alteran, proporcionan también una reducción en la unión al receptor Fe (Shields, R.L., y otros, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., y otros, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., y otros, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434) .
En una modalidad un anticuerpo de acuerdo con la invención posee una unión reducida a FcR en comparación con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo parental de longitud completa respecto a la unión de FcR de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/ o contiene la mutación PVA236. En una modalidad las mutaciones el anticuerpo parental de longitud completa son S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra modalidad las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa están en IgG4 S228P y L235E y en IgGl L234A y L235A.
En otra modalidad el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que tal anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana.
El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) " se refiere a la lisis de las células diana humanas por un anticuerpo de acuerdo con la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se analiza preferiblemente mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan EGFR y IGF-IR con un anticuerpo de acuerdo con la invención en presencia de células efectoras, como las CMSP recién aisladas o células efectoras purificadas de la capa leucoplaquetar, como los monocitos o las células "aniquiladoras naturales" (NK, por sus siglas en inglés) , o una línea celular de NK en crecimiento permanente.
El término "citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) " indica un proceso iniciado mediante la unión del factor del complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo es originada por interacciones proteína-proteína definidas en el llamado sitio de unión. Tales sitios de unión de la parte Fe son conocidos en la materia (véase anteriormente) . Tales sitios de unión de la parte Fe se caracterizan por ejemplo por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de subclase IgGl , IgG2 e IgG3 normalmente muestran una activación del complemento, lo que incluye la unión a Clq y C3 , mientras que los IgG4 no activan el sistema de complemento y no se unen a Clq y/o C3.
La región constante de un anticuerpo está directamente involucrada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) y la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . La activación del complemento (CDC) es iniciada mediante la unión del factor del complemento Clq a la región constante de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo se origina mediante interacciones proteína-proteína definidas en el llamado sitio de unión. Tales sitios de unión de la región constante son conocidos en la materia y se describen por ejemplo en Lukas, T.J., y otros, J. Immunol . 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. , y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., y otros, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., y otros, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., y otros, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. , y otros, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., y otros, Immunology 86 (1995) 319-324; y en la PE 0 307 434. Tales sitios de unión de la región constante se caracterizan por ejemplo por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) .
En una modalidad los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención comprenden una región constante de la subclase IgGl o IgG3 (preferiblemente de la subclase IgGl) , que tiene preferiblemente un origen humano. En una modalidad los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención comprenden una parte Fe de la subclase IgGl o IgG3 (preferiblemente de la subclase IgGl) , que tiene preferiblemente un origen humano.
La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) de anticuerpos monoclónales pueden aumentarse mediante las modificaciones de su componente oligosacárido, como se describen en Umana, P., y otros, Nature Biotechnol . 17 (1999) 176-180, y en la US 6,602,684. Los anticuerpos tipo IgGl, los anticuerpos que se utilizan como terapéuticos más frecuentemente, son glucoproteínas con un sitio de glucosilación conservado N-ligado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 están ocultos entre los dominios CH2 , en contacto extensivo con el armazón polipeptídico, y su presencia es esencial para que el anticuerpo pueda mediar las funciones efectoras como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M.R. , y otros, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R. , y otros, Immunol . Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). Umana, P., y otros. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 y WO 99/54342 muestran que la sobreexpresión en células ováricas de hámster chino (CHO) de la ß(1,4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III ( "GnT III"), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisectados, aumenta significativamente la actividad de ADCC de los anticuerpos in vitro. Las alteraciones en la composición del carbohidrato en Asn297 o su eliminación afectan también a la unión a FcyR y Clq (Umana, P., y otros, Nature Biotechnol . 17 (1999) 176-180; Davies, J., y otros, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., y otros, J. Biol . Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., y otros, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., y otros, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., y otros, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., y otros, J. Immunol . Methods 263 (2002) 133-147) .
Los métodos para aumentar las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales se describen por ejemplo en las patentes WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739, Niwa, R., y otros, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., y otros, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 o US 2005/0249722.
La glucosilación de las IgGl o IgG3 humanas ocurre en Asn297 como una glucosilación de oligosacárido complejo biantenario de núcleo fucosilado terminada con hasta dos residuos de Gal . Las regiones constantes de las cadenas pesadas humana de subclase IgGl o IgG3 se describen en detalle en Kabat, E.A., y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) , y en Brüggemann, M. , y otros, J. Exp . Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., y otros, Methods Enzymol . 178 (1989) 515-527. Estas estructuras se denominan residuos de glucano GO , Gl (a-1,6- o a- 1,3-) o G2, dependiendo de la cantidad de residuos de Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53) . La glucosilación de tipo CHO de las partes Fe del anticuerpo se describe por ejemplo en Routier, F.H., Glycocon ugate J. 14 (1997) 201-207. Los anticuerpos que se expresan de forma recombinante en células hospederas CHO no glucomodificada normalmente están fucosilados en Asn297 en una cantidad de al menos el 85%. Los oligosacáridos modificados de del anticuerpo parental bivalente monoespecífico pueden ser híbridos o complejos. Preferiblemente, los oligosacáridos reducidos/no fucosilados, bisectados, son híbridos. En otra modalidad los oligosacáridos reducidos/no fucosilados, bisectados, son complejos.
De acuerdo con la invención, "cantidad de fucosa" significa la cantidad de tal azúcar en la cadena de azúcar en Asn297, en relación con el sumatorio de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo estructuras de alta mañosa híbridas y complejas) medido mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y calculado como un valor promedio. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a todas las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-Glucosidasa F (por ejemplo, estructuras de oligo y alta mañosa, respectivamente, híbridas y complejas) mediante MALDI-TOF (véase Ejemplo 10) .
Los anticuerpos biespecífieos <EGFR- IGF- 1R> de acuerdo con la invención muestran una reducción de la internalización del receptor EGFR y IGF-IR en comparación con sus anticuerpos < EGFR > y/ o <IGF-1R> parentales . Por lo tanto en una modalidad preferible de la invención, el anticuerpo biespecífico <EGFR- IGF- 1R> está glucosilado (subclase IgGl o IgG3 , preferiblemente subclase IgGl) con una cadena de azúcar en Asn297 en la que la cantidad de fucosa en tal cadena de azúcar es del 65% o inferior (numeración de acuerdo con la Kabat) . En otra modalidad la cantidad de fucosa en tal cadena de azúcar está entre el 5% y el 65%, preferiblemente entre 20% y 40%. "Asn297" de acuerdo con la invención significa un aminoácido asparagina localizado alrededor de la posición 297 en la región Fe. Basado en variaciones menores de secuencia de anticuerpos, Asn297 puede también localizar algunos aminoácidos (normalmente no más de +3 aminoácidos) por encima o por debajo de la posición 297, es decir, entre la posición 294 y la 300. Los anticuerpos glucomodificados también se denominan en este documento anticuerpos afocusilados .
El anticuerpo biespecífico afocusilado de acuerdo con la invención puede expresarse en una célula hospedera glucomodificada diseñada para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad GnTIII y un polipéptido con actividad Manll en una cantidad suficiente para fucosilar de acuerdo con la invención los oligosacáridos de la región Fe. En una modalidad, el polipéptido con actividad GnTIII es un polipéptido de fusión. Alternativamente, la actividad al , 6 - fucosiltransferasa de la célula hospedera puede reducirse o eliminarse de acuerdo con la US 6,946,292 para generar células hospederas glucomodificadas . La cantidad de fucosilación del anticuerpo puede predeterminarse por ejemplo mediante las condiciones de fermentación (por ejemplo, tiempo de fermentación) o mediante una combinación de al menos dos anticuerpos con diferente grado de fucosilación. Los anticuerpos afocusilados y los correspondientes métodos de glucomodificación se describen en WO 2005/044859, O 2004/065540, WO2007/031875 , Umana, P., y otros, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Estos anticuerpos glucomodificados poseen una ADCC aumentada. Otros métodos de glucomodificación que proporcionan anticuerpos afucosilados de acuerdo con la invención se describen por ejemplo, en Niwa, R. , y otros, J. Immunol . Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., y otros, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 o US 2005/0249722.
Una modalidad es un método de preparación del anticuerpo biespecífico de la subclase IgGl o IgG3 que está glucosilado con una cadena de azúcar en la Asn297 en la que la cantidad de fucosa en tal cadena de azúcar es del 65% o inferior, utilizando el procedimiento descrito en WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana , P., y otros, Nature Biotechnol . 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 o WO 2000/061739.
Una modalidad es un método de preparación del anticuerpo biespecífico de la subclase IgGl o IgG3 que está glucosilado con una cadena de azúcar en la Asn297 en la que la cantidad de fucosa en tal cadena de azúcar es del 65% o inferior, utilizando el procedimiento descrito en Niwa, R. , y otros, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., y otros, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 o US 2005/0249722.
El anticuerpo de acuerdo con la invención se produce mediante métodos recombinantes . Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la invención y otro aspecto es una célula que comprende tal ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos en la materia y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el subsiguiente aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos anteriormente mencionados en una célula hospedera, se insertan los ácidos nucleicos que codifican las correspondientes cadenas ligera y pesada modificadas en vectores de expresión mediante métodos estándar. La expresión se realiza en células hospederas procariotas o eucariotas apropiadas como las células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o de las células tras la lisis) . Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., y otros, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol . 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.
Los anticuerpos biespecífieos de acuerdo con la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como por ejemplo, la proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de tales ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células hospederas como las células HEK 293, células CHO, o células de mieloma que de otro modo no producen las proteínas de las inmunoglobulinas, para conseguir la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas .
Las variantes de la secuencia de aminoácidos (o imitantes) del anticuerpo biespecífico se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Tales modificaciones pueden realizarse, sin embargo, sólo en un rango muy limitado. Por ejemplo, las modificaciones no deben alterar las características del anticuerpo anteriormente mencionadas, como el isotipo IgG y la unión al antígeno, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.
El término "célula hospedera" como se utiliza en la presente solicitud indica cualquier tipo de sistema celular que pueda modificarse para generar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, las células HEK293 y células CHO se utilizan como células hospederas.
Tal como se utiliza aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de éstos sin importar el número de pases. También se entenderá que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que posee la misma función o actividad biológica para la que se ha seleccionado la célula transformada originalmente. Cuando haya distintas designaciones, quedará claro a partir del contexto.
La expresión en células NSO se describe en, por ejemplo, Barnes, L.M., y otros, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., y otros, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y., y otros, Nucí. Acids. Res. 30 E9 (2002). El clonaje de dominios variables se describe en Orlandi, R. , y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Norderhaug, L . , y otros, J. Immunol . Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferible (HEK 293) se describe en Schlaeger, E.-J., y Christensen, K. , en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y en Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.
Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operador, y un sitio de unión al ribosoma. Es conocido que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de poliadenilacion.
Un ácido nucleico está "ligado de forma operativa" cuando se sitúa en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder de secreción está ligado de forma operativa al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado de forma operativa a una secuencia codificante si esta afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está ligado de forma operativa a una secuencia codificante si éste está posicionado de forma que facilita su traducción. Generalmente, "ligado de forma operativa" significa que las secuencias de ADN que están ligadas están contiguas, y en el caso de un líder de secreción, contiguo y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué estar contiguos. La unión se consigue mediante la ligación de dianas de restricción adecuadas. Si no existen estas dianas, se utilizan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
La purificación de anticuerpos se realiza para poder eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, lo que incluye tratamiento alcalino/SDS , bandas CsCl, cromatográfica en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otras bien conocidas en la técnica. Véase Ausubel, F., y otros, ed. Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing y Wilee interscience , New York (1987) . Los diferentes métodos están bien establecidos y ampliamente utilizados para la purificación de proteínas, como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio de iones (por ejemplo intercambio de cationes (resinas carboximetilo) , intercambio de aniones (resinas aminoetilo) e intercambio de modo mixto) , adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH) , interacción hidrofóbica o cromatografía de absorción aromática (por ejemplo con fenil- sepharose , resinas aza-arenofílica, o ácido m-aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad con quelantes de metales (por ejemplo con material de afinidad para Ni (II)- y Cu(II)-), cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforáticos (como la electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vij ayalakshmi , M. , A., Appl . Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .
El término "transformación" como se utiliza aquí se refiere al proceso de transferir vectores/ácidos nucleicos en una célula hospedera. Si se utilizan células sin barreras de pared celular formidables como células hospederas, la transfección se llevará a cabo por ejemplo mediante el método de precipitación con fosfato como se describe en Graham, F.L., y Van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456ff. No obstante, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en las células como la inyección nuclear o fusión de protoplastos . Si se utilizan células procariotas o células que contiene constructos de pared celular sustanciales, se usará por ejemplo un método de transfección con tratamiento por calcio utilizando cloruro cálcico como se describe en Cohén, F . N, y otros, PNAS . 69 (1972) 7110ff .
Tal como se utiliza aquí, "expresión" se refiere al proceso mediante el que un ácido nucleico se transcribe en ARNm y/o al proceso mediante el que un A Nm transcrito (también referido como transcrito) se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos, o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan en general como producto génico. Si el polinucleótido deriva de ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el corte y empalme de ARNm.
Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular auto-replicativa, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en una y/o entre células hospederas. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, integración cromosómica) , replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación de ADN o ARN, y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción de ADN o ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas.
Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedera adecuada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" se refiere normalmente a una célula hospedera adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para proporcionar un producto de expresión deseado.
Se ha encontrado que los anticuerpos biespecífieos de acuerdo con la invención presentan características valiosas como buen rendimiento de expresión en células de mamífero, estabilidad, actividad biológica o farmacológica, propiedades farmacocinéticas o toxicidad. Pueden utilizarse por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades como el cáncer. Los anticuerpos de acuerdo con la invención, especialmente los anticuerpos biespecífieos <IGF-1R - EGFR> muestran propiedades muy valiosas como inhibición del crecimiento de células cancerígenas que expresan ambos receptores IGF-1R y EGFR, y eficacia antitumoral que provoca un beneficio para un paciente que padece cáncer. Los anticuerpos biespecífico <IGF-1R - EGFR> de acuerdo con la invención muestran una internalización reducida de ambos receptores IGF-IR y EGFR cuando se comparan con sus anticuerpos parentales monoespecíficos <IGF-1R> y <EGFR> sobre células cancerígenas que expresan ambos receptores IGF-1R y EGFR.
Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, formulada junto con un transportador farmacéutico.
Una modalidad de la invención es el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para el tratamiento del cáncer.
Otro aspecto de la invención es tal composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento a pacientes que padecen cáncer mediante la administración de un anticuerpo de acuerdo con la invención a un paciente en necesidad de tal tratamiento.
Tal como se utiliza aquí, "transportador farmacéutico" incluye cualquier solvente, medio de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el transportador es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión) .
Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una serie de métodos conocidos en la técnica. Como podrá apreciarse por el experto en la materia, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención mediante ciertas rutas de administración, será necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un transportador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones reguladoras de pH salinas y acuosas. Los transportadores farmacéuticos incluyen soluciones estériles acuosas o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. La utilización de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida en la técnica .
Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" como se utiliza aquí, indica los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea , intraespinal , epidural e intraesternal .
El término cáncer como se utiliza aquí se refiere a enfermedades proliferativas , como los linfornas, leucemias linfocíticas , cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células grandes (NSCL, por sus siglas en inglés) , cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares , cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma endometrial, carcinoma cervical, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tiroides, cáncer paratiroeo, cáncer de glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de penes, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelula , cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas , schwanomas, ependimonas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewing, lo que incluye versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores .
Estas composiciones pueden también contener adyuvantes como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse mediante procedimientos de esterilización, supra, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, y similares. Será también deseable incluir agentes isotónicos, como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede hacerse con la inclusión de agentes que retrasan la absorción como el monoestearato de aluminio y gelatina.
Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, la composición, y el modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de la variedad de factores farmacocinéticos lo que incluye la actividad de las composiciones particulares empleadas de la presente invención, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular a ser empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente a tratar, y factores similares bien conocidos en el campo de la medicina.
La composición debe ser estéril y fluida hasta el punto en que la composición pueda liberarse mediante una jeringa. Además de agua, el transportador preferible es una solución salina tamponada isotónica.
Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de recubrimientos como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula necesario en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos . En muchos casos, es preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, pol ialcoholes como el manitol o el sorbitol, y cloruro sódico.
Descripción de las Secuencias de Aminoácidos SEC ID NO: 1 <IGF-1R> cadena pesada, 0A-Akl8-scFab-GA201 (+TS) SEC ID NO: 2 <IGF-1R> cadena ligera, 0A-Akl8-scFab-GA201 (+TS) SEC ID NO: 3 <EGFR> cadenas pesada y ligera conectadas por péptido con estabilización disulfuro VH 44 /VL100 de OA-Akl8-scFab-GA201 SEC ID NO: 4 <EGFR> cadenas pesada y ligera conectadas por péptido de OA-Akl8-scFab-GA201_TS SEC ID NO: 5 <EGFR> cadena pesada, OA-GA201-scFab-Akl8 (+TS) SEC ID NO: 6 <EGFR> cadena ligera, OA-GA201-scFab-Akl8 (+TS) SEC ID NO: 7 <IGF-1R> cadenas pesada y ligera conectadas por péptido con estabilización disulfuro VH 44/VL100- OA-GA201-scFab-Akl8 SEC ID NO: 8 <IGF-1R> cadenas pesada y ligera conectadas por péptido de OA-GA201-scFab-Akl8_TS SEC ID NO: 9 <VEGF> cadena pesada, Ang2 -VEGF OA- Ava-N-scFabLC06 (+SS) SEC ID NO: 10 <VEGF> cadena ligera, Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 (+SS) SEC ID NO: 11 <ANG-2> cadenas pesada y ligera conectadas por péptido con estabilización disulfuro VH 44/VL100 de Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS SEC ID NO: 12 <A G-2> cadenas pesada y ligera conectadas por péptido de Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 SEC ID NO: 13 EGFR Humano SEC ID NO: 14 IGF- IR Humano SEC ID NO: 15 VEGF Humano SEC ID NO: 16 ANG-2 Humano Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan como apoyo para un mejor entendimiento de la presente invención, cuyo verdadero alcance se fija en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos indicados sin alejarse del espíritu de la invención.
Procedimiento Experimental Ej emplos Materiales y Métodos Técnicas de ADN recombinante Se utilizan los métodos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. , y otros, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de las secuencias de ADN y proteína y gestión de datos de secuencia La información general respecto a las secuencias de nucleótido de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se proporciona en: Kabat, E.A., y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Publicación del NIH NO 91-3242. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo se numeran de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., y otros, PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. , Publicación del NIH NO 91-3242) . Se utilizó el paquete informático del GCG (Genetics Computer Group, Madison, isconsin) versión 10.2 y Infomax' s Vector NTI Advance suite versión 8.0 para la creación de secuencias, mapeado, análisis, anotación e ilustración.
Determinación de la secuencia de ADN Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación de doble cadena realizada en SequiServe (Vaterstetten, Alemania) y Geneart AG (Regensburg, Alemania) .
Síntesis génica Los segmentos génicos deseados se prepararon en Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automatizada. Los segmentos génicos que codifican cadenas pesadas de anticuerpo "botón en ojal" portadoras de las mutaciones S354C y T366W y cadenas pesadas "botón en ojal" portadoras de las mutaciones Y349C, T366S, L368A y Y407V en el dominio CH3 en combinación con dominios VH no modificados o fragmentos de anticuerpo scFab asi como cadenas ligeras de anticuerpos que están flanqueados por sitios únicos de escisión por restricción mediante endonucleasas (BamHI - Xbal o BamHI - Kpnl) y se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR) . El ADN plasmídico se purificó a partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopia UV. La secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Todas los constructos se diseñaron con una secuencia de ADN en el extremo 5' que codifica un péptido líder (MGWSCIILFLVATATGVHS) , que dirige las proteínas a secretarse en células eucariotas .
Construcción de plásmidos de expresión Se utilizó un vector de expresión de Roche para la construcción de todas las cadenas pesadas "botón en ojal" así como un anticuerpo de cadena ligera que codifica plásmidos de expresión. El vector está compuesto de los siguientes elementos : un gen de resistencia a higromicina como marcador de selección, - un origen de replicación, oriP, del virus Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés) , - un origen de replicación, del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli un gen de beta-lactamasa que confiere la resistencia a ampicilina en E. coli, el potenciador temprano inmediato y promotor del citomegalovirus humano (HCMV) , - la secuencia señal de poliadenilación de 1-inmunoglob lina ("poli A") humana, y sitios de restricción únicos BamHI y Xbal .
Los genes de inmunoglobulina que comprenden las cadenas pesadas "botón en ojal" con dominios VH o fragmentos scFab no modificados así como cadenas ligeras no modificadas se prepararon mediante síntesis génica y se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR) tal como se describe. Los plásmidos pG18 (ampR) portadores de los segmentos de ADN sintetizados y el vector de expresión de Roche se digirieron con enzimas de restricción BamHI y Xbal o BamHI y Kpnl (Roche Molecular Biochemicals) y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. Las cadenas ligeras y pesadas "botón en ojal" purificadas no modificadas que codifican segmentos de ADN se ligaron entonces a los vectores de expresión aislados de los fragmentos BamHl/Xbal o BamHl/Kpnl de Roche resultando en los vectores de expresión finales. Los vectores de expresión finales se transformaron en células de E. coli, los plásmidos de expresión de ADN se aislaron (Miniprep) y sometieron a análisis con enzimas de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones correctos se hicieron crecer en 150 mi de medio LB-Amp, de nuevo se aisló el plásmido de ADN (Maxiprep) y la integridad de secuencia se confirmó mediante secuenciación de ADN.
Expresión transitoria de anticuerpos biespecí fieos en células HEK293 Los anticuerpos biespecífieos recombinantes se expresaron mediante transfección transitoria de células de riñon embrionario humano 293 -F utilizando el sistema de Expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA) . Brevemente, las células FreeStyle™ 293-F en suspensión se cultivaron en medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37°C/C02 8% y las células se sembraron en medio fresco a una densidad de l-2xl06 células viables/ml el día de la transfección. Los complejos "botón en ojal" ADN-293fectin se prepararon en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de plásmido de ADN de cadena pesada y cadena ligera 1 y 2 de "botón en ojal" en una proporción molar 1:1:1 o 1:2:1 para un volumen final de transfección de 250 mi. El anticuerpo que contienen sobrenadantes de cultivo celular se recogieron 7 días tras la transfección mediante centrifugación a 14000 g durante 30 minutos y se filtró a través de un filtro estéril (0,22 im) . Los sobrenadantes se guardaron a -20°C hasta la purificación.
Purificación de anticuerpos biespecífieos Los anticuerpos biespecíficos se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos mediante cromatografía de afinidad utilizando Proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex200. Brevemente, los sobrenadantes de cultivos celulares filtrados estériles se aplicaron a una columna HiTrap Proteína A HP (5 mi) equilibrada con regulador de pH PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2.7 mM, pH 7.4). Las proteínas no unidas se eliminaron mediante lavados con regulador de pH de equilibrado. El anticuerpo y las variantes de anticuerpo se eluyeron con regulador de pH citrato 0.1 M, pH 2.8, y las fracciones que contienen proteína se neutralizaron con 0.1 mi de Tris 1 M, pH 8.5. Después, las fracciones de proteína eluída se juntaron, se concentraron con un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (M CO: 30 K, Millipore) en un volumen de 3 mi y se cargaron en una columna de filtración en gel Superdex200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con Histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6.0. Las fracciones que contienen anticuerpos biespecífieos purificados con menos del 5% de agregados de alto peso molecular se juntaron y se almacenaron en alícuotas de 1.0 mg/ml a -80°C.
Análisis de proteínas purificadas La concentración de proteína de muestras de proteína purificada se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base de las secuencia de aminoácidos. La pureza y peso molecular de los anticuerpos biespecífieos y anticuerpos control se analizaron mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1, 4-ditiotreitol 5 mM) y se tiñó con azul brillante de Coomassie. El sistema de geles preparados NuPAGE® (Invitrogen, USA) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (geles de Tris-Glicina al 4-20%) . El contenido agregado de las muestras de anticuerpo biespecífico y anticuerpo control se analizó mediante SEC de alto rendimiento utilizando una columna analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en H2P04 200 mM, KCl 250 mM, pH 7,0 regulador de pH de reacción a 25°C. Se inyectó 25 µg de proteína en la columna en una tasa de flujo de 0,5 ml/min y se eluyó de forma isocrática durante 50 minutos. Para el análisis de estabilidad, se prepararon concentraciones de 1 mg/ml de proteínas purificadas y se incubaron a 4°C y 40°C durante 7 días y después se analizaron mediante SEC de alto rendimiento. La integridad de la estructura de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo biespecífico reducido se verificó mediante espectrometría de masas por NanoElectropulverización Q-TOF tras eliminar los N-glicanos mediante tratamiento enzimático con Péptido-N-Glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals ) .
Resonancia de plasmón en superficie La afinidad de unión se determinó con un ensayo de unión estándar a 25°C, como la técnica de resonancia de plasmón en superficie (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suecia) . Para las mediciones de afinidad, se acoplaron 30 µ9/??1 de anticuerpos anti FCY (de cabra, Jackson Immuno Research) a la superficie de un chip sensor CM-5 mediante acoplamiento de amina estándar y bloqueo químico en un instrumento RPS (Biacore T100) . Tras la conjugación, los anticuerpos mono o biespecífieos Her3/cMet se inyectaron a 25°C a una tasa de flujo de 5 µ?/min, seguido por una dilución seriada (0 nM a 1000 nM) de HER3 humano o c-Met ECD a 30 µ?/min. Como regulador de pH de reacción para el experimento de unión se utilizó PBS/ BSA 0.1%. El chip se regeneró entonces con un pulso de 60 s de glicina-HCl 10 mM, solución a pH 2.0.
Resonancia de plasmón en superficie de EGFR/IGF-IR Los experimentos de RPS se realizaron utilizando un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia) . Se inmovilizaron IGF-1R o EGFR en la superficie de un chip biosensor CM5 utilizando química de acoplamiento de amina estándar. Se inyectó IGF- IR o EGFR en acetato de sodio, pH 5.0 a 1 µg/ml utilizando el proceso de inmovilización wizard con una meta de 200 RU (IGF-1R) o 100 RU (EGFR) . Las células de flujo control de referencia se trataron de la misma manera pero con regulador de pH vehículo solo. Los anticuerpos se diluyeron en lxPBS pH 7.4, Tween20 0.05% (Roche Diagnostics GmbH) y se inyectó a concentraciones crecientes entre 3.125 y 50 nM con una tasa de flujo de 30 µ?/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue de 3 min (unión de EGFR) y 5 min (unión de IGF- IR) , el tiempo de disociación fue de 10 min (EGFR) y 3 min (IGF- IR) . La unión de EGFR se regeneró con una inyección de ácido fosfórico 0.85% durante 30 s a una tasa de flujo de 5 µ?/min. La unión de IGF-IR se regeneró con una inyección de cloruro de magnesio 4 M durante 1 min a 5 µ?/min. Las constantes de tasa cinética y constantes de equilibrio de disociación se calcularon mediante la utilización del modelo de unión Langmuir 1:1 con el programa Biaevaluation .
Para demostrar la unión simultánea, los anticuerpos biespecíficos se inyectaron en la superficie de EGFR a 25 nM durante 1 min, tasa de flujo 5 µ?/min. Tras capturar el anticuerpo en la superficie de EGFR, se inyectó IGF- IR a concentraciones crecientes entre 2.5 y 80 nM con una tasa de flujo de 30 µ?/min. La superficie se regeneró con una inyección de 0.85% ácido fosfórico durante 30s a una tasa de flujo de 5 µ?/min. Las constantes de tasa cinética y constantes de equilibrio de disociación se calcularon mediante la utilización del modelo de unión Langmuir 1:1 con el programa Biaevaluation.
Resonancia de plasmón en superficie de la unión de ANG-2 (Biacore) La unión de anticuerpos al antígeno por ejemplo, ANG-2 humano se investigó mediante resonancia de plasmón en superficie utilizando un instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia) . Brevemente, para las mediciones de afinidad se inmovilizaron anticuerpos policlonales de cabra <hIgG-Fcgamma> en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina para la presentación de anticuerpos frente a ANG-2 humano (Figura 6) . La unión se midió en regulador de pH HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0.005%, ph 7.4), 25°C. Se añadió ANG-2-His purificado (R&D systems o método de purificación propio) en varias concentraciones entre 6.25 nM y 200 nM en solución. La asociación se midió mediante una inyección de ANG-2 de 3 minutos; se midió la disociación mediante el lavado de la superficie del chip con regulador de pH HBS durante 3 minutos y el valor de KD se estimó utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1. Debido a la heterogeneidad de la preparación de ANG-2 no se observó unión 1:1; los valores de KD son solo estimaciones relativas. Los datos de control negativo (por ejemplo, curvas de regulador de pH) se sustrajeron de las curvas de muestra para corregir la deriva basal intrínseca del sistema y para la reducción de la señal de ruido de fondo. Se utilizó el programa Evaluation Biacore T100 versión 1.1.1 para el análisis de sensorgramas y para el cálculo de los datos de afinidad. Alternativamente, pudo capturarse Ang-2 con un nivel de captura de 2000-1700 RU mediante un PentaHisAnticuerpo (PentaHis-Ab libre de BSA, Qiagen NO 34660) que se inmovilizó en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina (libre de BSA) (ver más abajo) .
Resonancia de plasmón en superficie de unión de VEGF (Biacore) La unión de VEGF anticuerpos biespecífieos <VEGF- Ang-2> se analizó utilizando tecnología de resonancia de plasmón en superficie en un instrumento Biacore T100 de acuerdo con el siguiente protocolo y se analizó utilizando el paquete informático T100: Brevemente, los anticuerpos <VEGF> se capturaron en un chip CM5 mediante la unión de un anticuerpo de cabra anti IgG humana (JIR 109-005-098) . El anticuerpo de captura se inmovilizó mediante el acoplamiento de amino utilizando acoplamiento de amino estándar como sigue: regulador de pH HBS-N utilizado como regulador de pH de reacción, la activación se realizó mezclando EDC/NHS esperando una densidad de ligando de 700 RU. El anticuerpo de captura se diluyó en regulador de pH de acoplamiento NaAc, pH 5.0, c = 2 µg/ml, finalmente se bloquearon los grupos carboxilo aún activos mediante inyección de etanolamina 1M. La captura de anticuerpos Mabs <VEGF> se realizó a una tasa de flujo de 5 µ?/min y c (Mabs<VEGF>) = 10 nM, se diluyeron con regulador de pH de reacción + BSA 1 mg/ml ; se puede alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 30 RU. Se utilizó rhVEGF como analito (rhVEGF, R&D-Systems NO de Cat . , 293 -VE) . La caracterización cinética de la unión de VEGF a los anticuerpos <VEGF> se realizó a 37°C en PBS + 0.005% (v/v) y Tween20 como regulador de pH de reacción. La muestra se inyectó con una tasa de flujo de 50 µ?/min y un tiempo de asociación de 80 seg. y un tiempo de disociación de 1200 seg . con una concentración seriada de rhVEGF de 300 a 0.29 nM. La regeneración de del anticuerpo de captura de superficie libre se realizó con glicina 10 mM pH 1.5 y un tiempo de contacto de 60 seg. tras cada ciclo de analito. Las constantes cinéticas se calcularon utilizando el método de doble referencia usual (referencia control: unión de rhVEGF a la molécula de captura anticuerpo de cabra anti IgG humano, blancos en la medición de células en flujo, rhVEGF concentración "0", Modelo: unión Langmuir 1:1, (Rmax ajustado a local debido a la unión de la molécula de captura) .
Generación de la línea celular HEK293-Tie2 Se generó una línea celular recombinante HEK293-Tie para poder determinar la interferencia de los anticuerpos angiopoyetina-2 con la fosforilación de Tie2 estimulado con ANG2 y la unión de ANG2 a Tie2 en células. Brevemente, un plásmido basado en pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2) que codifica para Tie2 humano de longitud completa (Id. de Sec . NO 108) bajo control de un promotor CMV y un marcador de resistencia a neomicina se transfectó utilizando Fugene (Roche Applied Science) como reactivo de transfección en células HEK293 (ATCC) y las células resistentes se seleccionaron en DMEM FCS 10%, G418500 g/ml . Se aislaron los clones individuales a través de un cilindro de clonaje, y se analizó posteriormente para la expresión de Tie2 mediante FACS . El clon 22 se identificó como clon con una expresión de Tie2 alta y estable aún en ausencia de G418 (clon 22 HEK293-Tie2) . El clon 22 de HEK293-Tie2 se utilizó posteriormente para ensayos de celulares: fosforilación de Tie2 inducida por ANG2 y ensayo de unión al ligando celular ANG2.
Ensayo de proliferación HUVEC inducido por VEGF La proliferación de HUVEC inducida por VEGF (células endoteliales de vena umbilical humana, Promocell #C-12200) se escogió para medir la función celular de anticuerpos contra VEGF. Brevemente, 5000 células HUVEC (número bajo de pases, <5 pases) por 96 cavidades, se incubaron en ???µ? de medio de deprivación (EBM-2 basal medio endotelial 2, Promocell # C-22211, FCS 0.5%, Penicilina/Estreptomicina) en una placa microtitulada de 96 cavidades BD Biocoat recubierta con colágeno I (BD N°354407 / 35640 durante la noche. Varias concentraciones de anticuerpo se mezclaron con rhVEGF (30 ng/ml concentración final, BD NO 354107) y se preincubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se añadió a las células HUVEC y se incubaron durante 72 h a 37°C, C02 5%. El día del análisis, la placas se equilibró a temperatura ambiente durante 30 min. y se determinó la viabilidad /proliferación celular utilizando el equipo de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-GloTM de acuerdo con el manual (Promega, NO G7571/2/3) . Se determinó la luminiscencia en un espectrofotómetro .
Ensayo de fosforilación de Tie2 inducida por ANG2 La inhibición de la fosforilación de Tie2 inducida por ANG2 mediante los anticuerpos biespecífico <ANG2-VEGF> se midió de acuerdo con el siguiente ensayo. El clon 22 HEK293-Tie2 se estimuló con ANG2 durante 5 minutos en ausencia o presencia de anticuerpos <ANG2-VEGF> y se cuantificó P-Tie2 mediante un ELISA en sándwich. Brevemente, 2xl05 células del clon 22 HEK293-Tie2 por cavidad se hicieron crecer durante la noche en una placa microtitulada de 96 cavidades recubierta de Poli-D-Lisina en 100 µ? de DMEM, FCS 10%, 500 ug/ml de geneticina. Al día siguiente se preparó una fila de titulación de anticuerpos <ANG2-VEGF> en una placa microtitulada (concentrado 4 veces, volumen final /cavidad 75 µ? , duplicados) y se mezcló con 75 µ? de una dilución (3.2 g/ml como solución concentrada 4 veces) de ANGPT2 (R&D systems NO 623 -AN] . Los anticuerpos y ANG2 se preincubaron durante 15 min. a temperatura ambiente. Se añadieron 100 µ? de la mezcla a las células del clon 22 HEK293-Tie2 (preincubados durante 5 min. con NaV304 1 m , Sigma N°S6508) y se incubó durante 5 min. a 37°C. Posteriormente, las células se lavaron con 200 µ? de PBS enfriado con hielo + NaV304 lmM por cavidad y se lisaron mediante la adición de 120 µ? de regulador de pH de lisis (Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 137 mM, NP-40 1%, glicerol 10%, EDTA 2 mM, NaV304 1 mM, PMSF 1 mM y 10 µ9/p?1 de aprotinina) por cavidad en hielo. Las células se lisaron durante 30 min. a 4°C en un agitador de placas microtituladas y 100 µ? de lisado se transfirió directamente a una placa microtitulada de ELISA p-Tie2 (R&D Systems, R&D N°DY990) sin centrifugación previa sin determinación de proteína total, las cantidades de P-Tie2 se cuantificaron de acuerdo con la instrucciones del fabricante y los valores de CI50 para la inhibición se determinaron utilizando el análisis XLfit4 con la ampliación para Excel (dosis respuesta de un sitio, modelo 205) .
Ensayo de titulación celular Glow La viabilidad y proliferación celular se cuantificó utilizando el ensayo de titulación celular Glow (Promega) . El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se cultivaron en placas de 96 cavidades en un volumen total de 100 µ? durante el periodo de tiempo deseado. Para el ensayo de proliferación, las células se eliminaron en el incubador y se colocaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió 100 µ? del reactivo de titulación celular y se colocaron placas de multicavidades en un agitador orbital durante 2 min. Se cuantificó la luminiscencia tras 15 min. en un lector de microplacas (Tecan) .
Ejemplo la Expresión y purificación de moléculas de anticuerpo biespecífico bivalente <VEGF-A G-2> De acuerdo con los procedimientos descritos en los materiales y métodos anteriores, se expresaron y purificaron las moléculas de anticuerpo biespecífico, bivalente <VEGF-ANG-2> Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS y Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06. La parte VH y VL de <VEGF> está basada en bevacizumab. La parte VH y VL de <ANG2> está basada en las secuencias VH y VL de ANG2Í-LC06 (que se describe en la solicitud PCT NO PCT/EP2009/007182 y que se obtuvo mediante la presentación en fagos) . Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada relevantes de estos anticuerpos bivalentes, biespecífieos se proporcionan en SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 (para Ang2-VEGF OA-Ava-N-ScFabLC06SS) , y en SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12 (para Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06) . La expresión de Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS y Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 se confirmó mediante Western blot . La purificación de Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS y Ang2 -VEGF OA-Ava-N-scFabLC06 dio lugar a los siguientes rendimientos.
* MassSpec: no se detectaron dímeros de cadena pesada homomérica La unión y otras propiedades se determinaron como se describe Ejemplo Ib Expresión y purificación de moléculas de anticuerpo biespecífico bivalente <IGF-1R - EGFR> Tabla: Vista general de moléculas de anticuerpo biespecífico bivalente <IGF-1R - EGFR> De acuerdo con los procedimientos descritos en los materiales y métodos anteriores, se expresaron y purificaron las moléculas de anticuerpo biespeclfico bivalente <IGF-1R -EGFR> OA-Akl8-scFab-GA201 y OA-GA201-scFab-Akl8 con una proporción de plásmido 1:1:1. El anticuerpo biespecífico está basado en los sitios de unión a antígeno de <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587; WO 2005/005635, abreviado como <IGF-lR>Clon 18 o <IGF-1R> AK18) y <EGFR>ICR62 humanizado (WO 2006/082515 abreviado como <EGFR>ICR62) . Las secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras y pesadas relevantes de estos anticuerpos bivalentes, biespecífieos se proporcionan en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3 (para OA-Akl8-scFab-GA201) , y en SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 7 (para OA-GA201-scFab-Akl8) . La expresión de OA-Akl8 -scFab-GA201 y OA-GA201-scFab-Akl8 se confirmó mediante Western blot . Tras la purificación de Proteína A del sobrenadante del cultivo celular ambas constructos mostraron entre un 50 y un 58% del peso molecular esperado de anticuerpo biespecífico de aproximadamente 148 kDa tal como se detectó mediante análisis por SEC una gran cantidad de medio anticuerpo con un peso molecular de 100 kDa. Tras la purificación por SEC ambas constructos mostraron entre un 86 y un 90% de monómero homogéneo con un peso molecular de 148 kDa y un producto secundario residual de 100 kDa. El OA-GA201-scFab-Akl8 también se expresó con una proporción de plásmido 1:2:1 y se sometió a purificación con Prot A y SEC. En comparación con la proporción de expresión 1:1:1, la cantidad de medio anticuerpo tras la purificación con Prot A se redujo de un 30% a un 6% con un nivel de expresión 1:2:1 tal como se detectó mediante un Bioanalizador (calibrador de análisis) . El análisis de espectrometría de masas de las proteínas purificadas mediante SEC confirmó la eliminación eficiente de la mitad de la cadena pesada del anticuerpo 1 humanizada <EGFR>ICR62 al cambiar la proporción de plásmido tras la transíección . El rendimiento de la purificación de OA-GA201-scFab-Akl8 aumentó en un 40% con una proporción de plásmido 1:2:1 tras la expresión en células HEK293.
La molécula de anticuerpo biespecífico, bivalente <IGF-1R - EGFR> OA-GA201-scFab-Akl8_TS , (con las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada relevantes proporcionadas en SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 6, SEC ID NO: 8 se expresaron con una proporción de plásmido 1:1:1 y 1:2:1 y se purificaron de forma análoga.
Resultados para la proporción de plásmido 1:2:1 Los constructos OA-scFab con solo 3 plásmidos posee la ventaja de un perfil de producción de producto secundario valioso sobre una aproximación heterodimérica similar utilizando la tecnología de botón en ojal para generar moléculas biespecíficas con 4 plásmidos de expresión (véase por ejemplo, WO 2009/080253. Los anticuerpos de acuerdo con la invención muestran una total ausencia de cadenas ligeras mal emparejadas o anticuerpos que carezcan de cadenas ligeras (datos no mostrados) .
El método 1:2:1 descrito mostró proporcionar moléculas biespecíficas con gran pureza y una clara reducción de la mitad de anticuerpos y una total ausencia de cadenas ligeras mal emparejadas o anticuerpos que carezcan de cadenas ligeras (datos no mostrados) .
La unión y otras propiedades se determinaron como se describe .
La molécula de anticuerpo biespecíf ico, bivalente <IGF-1R - EGFR> 0A-Akl8 - scFab-GA201_TS , (con las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada relevantes proporcionadas en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 (para OA-Akl8-scFab-GA201_TS) , puede expresarse y purificarse de forma análoga.
Ejemplo 2 Unión (simultánea) de anticuerpos biespecíficos a ambos antígenos Se comparó la unión de los diferentes formatos de anticuerpo biespecífico respecto a la unión de las IgG "salvajes" de los módulos de unión y anticuerpos biespecíficos de los que derivan. Estos análisis se llevaron a cabo aplicando resonancia de plasmón en superficie (Biacore) tal como se ha descrito anteriormente. La unión simultánea de anticuerpo biespecífico OA- GA201-scFab-Akl8_TS a IGF- IR y EGFR pudo detectarse.
Instrumento: Biacore T100 (GE Healthcare) , T200 sensibilidad aumentada Programa: T200 Control, Versión 1.0 Programa: T200 Evaluation, Versión 1.0 Chip: Chip CM5 Ensayo Acoplamiento amina estándar en células en flujo 1 a 4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante: regulador de pH de reacción: regulador de pH HBS-N, activación mediante la mezcla de EDC/NHS, con el objeto de la densidad de ligando. El EGFR se diluyó en regulador de pH de acoplamiento NaAc, pH 4.5, c = 15 µg/ml; finalmente los grupos carboxilo activados restantes se bloquearon mediante inyección de etanolamina 1 M.
Se utilizó EGFR acoplado en amina en células en flujo 1 como superficie de referencia control para la corrección de posibles efectos del regulador de pH o unión no específica .
La unión simultánea se midió a una tasa de flujo de 30 µ?/min a 25°C. Los Ab biespecífieos se inyectaron durante 2 minutos a una concentración de c = 10 nM seguido inmediatamente de una inyección consecutiva de IGFIR humano o cyno (tiempo de asociación: 2 minutos, tiempo de disociación: 3 minutos, c = 150 nM) .
Todas las muestras se diluyeron con regulador de pH de reacción + 1 mg/ml de BSA.
Tras cada ciclo, se realizó la regeneración utilizando NaOH 15 mM, tiempo de contacto 1 minuto, tasa de flujo 30 µ?/min. Control negativo: en lugar de IGFIR se inyectó regulador de pH de dilución como control negativo.
Resultados Anticuerpos biespeelficos : OA-GA201-scFab-Akl8 TS mostró unión simultánea de EGFR humano acoplado a amina y IGF1R humano (véase sensograma de la Figura 9) .
Ejemplo 3a Inhibición de la fosforilación de Tie2 por ANG2-VEGF-Mab La inhibición de la proliferación de VEGF inducida por HUVEC mediante los anticuerpos biespecífieos <A G2-VEGF> se midió de acuerdo con el ensayo descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 3b Inhibición de la fosforilación de Tie2 por ANG2- VEGF-Mab La inhibición de la fosforilación de Tie2 inducido por ANG2 mediante los anticuerpos biespecífieos <ANG2-VEGF> se midió de acuerdo con el ensayo descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 6.
Ejemplo 4 Internalización/regulación negativa de IGF- IR mediante anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> Los anticuerpos anti-IGF-lR humanos <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) inhiben la señalización de IGFR1 e inducen la internalización y posterior regulación negativa de IGF- IR. Para evaluar la actividad inhibidora potencial de los anticuerpos biespecífico <EGFR- IGF1R> , se analizó el grado de regulación negativa de IGF-1R.
Para poder detectar los efectos del anticuerpo de la invención en la cantidad de receptor de IGF-I (IGF- IR) en células tumorales, se realizaron experimentos de seguimiento a lo largo del tiempo y posterior análisis ELISA con anticuerpos específicos de IGF-IR y EGFR.
Las células tumorales H322M humanas (obtenidas a partir de NCI) se cultivaron en placas de 96 cavidades (lxlO4 células/cavidad) durante la noche a 37 °C y 5% C02 en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10%, L-glutamina 2 mM y PenStrep 1%.
El medio se retiró con cuidado y se sustituyó por una solución de anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1R> diluido en medio RPMI en un volumen total de 100 µ? . Las células se incubaron a 37 °C y C02 5% durante al menos 3 pero no más de 24 horas.
El medio se retiró con cuidado mediante aspiración y las células se lisaron con 120 µ?/cavidad de regulador de pH de lisis MES (MES 25 mM pH 6.5, Tritón 2% X-100, octilglucósido 60 nM, NaCl 150 mM, Na3V04 10 mM, w inhibidor Complete® de proteasa) . Las placas se almacenaron a -20°C hasta un posterior análisis.
Detección de IGF- IR Se añadió una dilución 1:200 de anticuerpo AKla-Biotinilado (<IGF-1R> HUMAB Clon la (DSM ACC 2586) descrito en WO2004/087756 , Roche, Alemania) en PBS, BSA 3% y Tween®20 0.2% a una concentración final de 2.4 ig/ml a cada cavidad de un PMT recubierto de estreptavidina (Roche ID. No: 11965891001) . La PMT de estreptavidina se agitó durante 1 hora a TA y después se lavó tres veces con 200 µ? por cavidad de PBS que contienen Tween®20 al 0.1%.
Tras la eliminación de la solución PBS/T een, se añadió 100 µ? de lisado celular a cada cavidad del PMT de estreptavidina recubierto de anticuerpo.
Las PMT se incubaron entonces durante otra hora a TA con agitación y se lavaron 3 veces con PBS que contienen Tween®20 al 0.1% posteriormente.
Se utilizó anticuerpo de conejo IGF-IR^ (200 µ9/t?1, Santa Cruz Biotechnology, NO de Cat. sc-713) diluido 1:750 en PBS, BSA 3% y Tween®20 al 0.2% para detectar el IGF-1R unido mediante el anticuerpo de captura AKla. Se añaden 100 µ? por cavidad y se incubaron durante 1 hora a TA con agitación constante. La solución se eliminó posteriormente y los cavidades se lavaron tres veces con 200 µ? de PBS que contienen Tween®20 al 0.1%. La igG-HRP anti-conejo marcada con peroxidasa (Cell signaling No. Cat. 7074) se utiliza como anticuerpo de detección secundario en una dilución de 1:4000 en PBS, BSA 3% y Tween®20 al 0.2%. Se añadieron 100 µ? de este a cada cavidad y se incubaron durante 1 hora a TA con agitación. La placa se lavó entonces seis veces con PBS que contiene una solución al 0.1% de Tween®20. Se añadieron 100 µ? por cavidad del sustrato de peroxidasa de 3,3' -5,5'-tetrametilbenzidina (Roche, BM-Blue ID-No. : 11484581) y se incubó durante 20 minutos a TA con agitación. Se paró la reacción de color al añadir 25 µ? por cavidad de H2S04 1M y se incubó durante otros 5 minutos a TA. La absorbancia se midió a 50nm.
El anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS induce menos regulación negativa que el anticuerpo anti-IGF-lR humano <IGF-1R> HUMAB Clon 18. La regulación negativa mediante OA-GA201-scFab-Akl8_TS se redujo en un > 50% en comparación con <IGF-1R> HUMAB Clon 18.
Ejemplo 5 Inhibición de las rutas de señalización de EGFR así como de IGFIR mediante anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> Los anticuerpos anti-IGF-lR humano <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) inhiben la señalización de IGFR1 y los anticuerpos humanizados de rata anti-EGFR ICR62 inhiben la señalización de EGFR. Para evaluar la actividad inhibitoria potencial de los anticuerpos biespecífico <EGFR- IGF1R> , se analizó el grado de inhibición de la señalización hacia ambas rutas .
Las células tumorales humanas (H322M, 3 x 104 células/cavidad) en medio RPMI se suplementaron con 10% suero fetal bovino, L-glutamina 2 mM y PenStrep al 1% se sembraron en placas microtituladas de 96 cavidades y se cultivaron durante la noche a 37°C y C02 al 5%.
El medio se retiró con cuidado y se sustituyó por 100 µ? de medio DMEM libre de suero (suplementado con 1 mg/ml de RSA, Hepes 10 mM, PenStrep 1%) y se incubó durante al menos 2.5 horas a 37°C y C02 al 5%.
El medio se retiró de nuevo con cuidado y se sustituyó mediante una dilución de anticuerpos biespecífieos , y anticuerpos control (<IGF-1R> HUMAB Clon 18 y <EGFR>ICR62 concentración final 0.01 mg/ml) en medio DMEM libre de suero a un volumen total de 50 µ? seguido por una incubación durante 30 min a 37°C y C02 al 5%. Las células se estimularon mediante la adición de 50 µ? de IGF-1 (10 nM) o EGF (20 ng/ml) (diluido en medio DMEM libre de suero) y se incubó durante 10 min. a 37°C y 5% C02.
El medio se retiró cuidadosamente y las células se lavaron una vez con 100 µ?/cavidad de PBS enfriado con hielo. Las células se lisaron mediante la adición de 100 µ?/cavidad de regulador de pH de lisis celular de BioRad (BioRad Cell Lysis Kit (BioRad NO Cat . 171-304012) Las placas se guardaron a -20°C hasta un análisis posterior.
Se retiraron los restos celulares mediante la filtración de los lisados celulares a través de placas con filtro HTS MultiScreen mediante la centrifugación a 500 g durante 5 min. Se analizó la fosforilación de EGFR y IGF- IR en lisados celulares filtrados con un sistema Luminex utilizando el equipo de cuentas P-EGFR (Tyr) (Millipore NO Cat . 46-603) para el análisis de la fosforilación de EGFR y el equipo de cuentas P-IGF-1R (Tyrll31) (BioRad NO Cat. 171V27343) para el análisis de la fosforilación de IGF-1R. Los ensayos Luminex se realizaron como se ha descrito en el manual de detección de fosfoproteína BioPlex (BioRad Boletín NO 2903) utilizando los equipos de reactivos de detección de fosfoproteína (BioRad NO Cat. 171-304004) .
El anticuerpo biespecífico <EGFR- IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS inhibe de forma efectiva la fosforilación de IGF-1R (CI50: 1 n , máxima inhibición: > 70%) y la fosforilación de EGFR (CI50: 1 nM, máxima inhibición: > 90%) sobre células tumorales H322M.
Ejemplo 6 Inhibición del crecimiento de células tumorales NCI-H322M en cultivos 3D mediante anticuerpos biespecí fieos <EGFR- IGF1R> El anticuerpo anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 humano (DSM ACC 2587) inhibe el crecimiento de las líneas celulares tumorales que expresan IGF-1R (WO 2005/005635) . De forma similar, el anticuerpo humanizado de rata anti-EGFR <EGFR>ICR62 demostró que inhibe el crecimiento de las líneas celulares tumorales que expresan EGFR (WO 2006/082515) . Para evaluar la actividad inhibidora potencial de los anticuerpos biespecífico <EGFR-IGF1R> en los ensayos de crecimiento de líneas celulares tumorales, se analizó el grado de inhibición en células H322M que expresan EGFR así como IGF-1R.
Las células de carcinoma de pulmón H322M (NCI) se cultivaron en medio RPMI 1640 (PAA, Pasching, Austria) suplementado con FBS al 10% (PAA) , piruvato sódico lmM (Gibco, Darmstadt, Alemania), aminoácidos no esenciales (Gibco) y L-glutamina 2mM (Sigma, Steinheim, Alemania) . 25000 células/cavidad se sembraron en placas recubiertas de 96 cavidades de poli-HEMA (poli (2-hidroxietilmetacrilato) (Polysciences , Warrington, PA, USA)) que contienen el medio de cultivo. Concomitantemente , se añadieron diferentes concentraciones de anticuerpos biespecíficos y se incubaron durante 7 días. El ensayo CellTiterGlo® (Promega , Madison, WI , USA) se utilizó para detectar la viabilidad celular al medir el contenido de ATP de las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados se muestran en la Figura 8. El anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS inhibe de forma dependiente de dosis la proliferación de células H322M. A una dosis de 1000 nM el anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS mostró una inhibición de la proliferación mejorada cuando se compara con los parental anticuerpos monoespecífieos <IGF-1R> HUMAB Clon 18 o <EGFR>ICR62.
Ejemplo 7 Eficacia in vivo de los anticuerpos biespecí fieos <EGFR-IGF1R> en un modelo de xenoinjerto subcutáneo con expresión de EGFR y IGF- IR El anticuerpo humano anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) inhibe el crecimiento de líneas celulares tumorales que expresan IGF-1R (WO 2005/005635) . De forma similar, el anticuerpo humanizado de rata anti-EGFR <EGFR>ICR62 demostró que inhibe el crecimiento de las líneas celulares tumorales que expresan EGFR (WO 2006/082515) . Para evaluar la actividad inhibidora potencial de los anticuerpos biespecífico <EGFR-IGF1R> en el crecimiento tumoral in vivo, se utilizó el modelo de xenoinjerto subcutáneo BxPC-3 que se caracteriza por la expresión de EGFR así como de IGF-1R.
Las células de la línea celular de carcinoma pancreático humano BxPC-3 (obtenida de ATCC) se cultivaron en medio RPMI 1640 (PAN™ Biotech GmbH) , suplementado con suero fetal bovino al 10% (Sera Plus; PAN™ Biotech GmbH) y L-glutamina 2 m (PAN™ Biotech GmbH) a 37°C en una atmósfera saturada con agua a C02 5%. El día de la inoculación, se retiraron las células tumorales BxPC-3 ( tripsina-EDTA lx, Roche Diagnostics) de los frascos de cultivo y se transfirieron en medio de cultivo, se centrifugaron, se lavaron una vez y se resuspendieron en PBS . Para la inyección de células, la titulación final se ajustó a 1x10s células/ml .
Posteriormente 100 µ? de esta suspensión (que corresponde a lxlO7 células) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones hembra beige SCID. El tratamiento con vehículo, anticuerpos <EGFR-IGF1R> y anticuerpos control (<IGF-1R> HUMAB Clon 18 y <EGFR>ICR62) comenzó tras el establecimiento de los tumores y tras haber alcanzado un tamaño medio de 150-250 mm3. El volumen tumoral se midió dos veces en una semana y los pesos de los animales se monitorizaron en paralelo. Los tratamientos únicos y la combinación de anticuerpos únicos se comparó con la terapia de anticuerpo biespecífico .
El anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS (20 mg/kg; i.p., una vez por semana (q7d) muestra una fuerte eficacia anti -tumoral en el modelo de xenoinjerto s.c. BxPC3 (ver Figura 10 y Tabla siguiente) e inhibió el crecimiento tumoral ligeramente mejor que la combinación de anticuerpos monoespecífieos <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (10 mg/kg; i.p. una vez por semana (q7d) y <EGFR>ICR62 (10 mg/kg; i.p., una vez por semana (q7d) Ejemplo 8 Preparación de derivados glucomodi ficados de anticuerpos biespecí fieos <EGFR-IGF1R> Los derivados glucomodificados de anticuerpos biespecífico <EGFR-IGF1R> se produjeron mediante la co-transfección de células HEK293-EBNA con el anticuerpo de mamífero de vectores de expresión de la cadena ligera y pesada utilizando un método de transfección calcio fosfato. Se transfectaron células HEK293-EBNA en crecimiento exponencial mediante el método de calcio fosfato. Para la producción de anticuerpos no modificados, las células se transfectaron solo con vectores de expresión de anticuerpo de cadena ligera y pesada en una proporción 1:1. Para la producción del anticuerpo glucomodificado, las células se cotransfectaron con cuatro plásmidos, dos para la expresión de anticuerpo, uno para la expresión de un polipéptido de fusión GnTIII, y uno para la expresión de manosidasa II en una proporción de 4:4:1:1, respectivamente. Las células se hicieron crecer como cultivos en monocapa adherentes en frascos T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%, y se transfectaron cuando estuvieron en confluencia entre el 50 y 80%. Para la transfección de un frasco T75, se sembraron 7.5 (hasta 8) millones de células 24 horas antes de la transfección en alrededor de 14 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (a 10% V/V final) , (finalmente 250 g/ml neomicina) , y las células se colocaron a 37 °C en un incubador con una atmósfera de C02 al 5% durante la noche. Para cada frasco de T75 a transfectar, se preparó un frasco con solución de ADN, CaCl2 y agua mezclando 47 µg de plásmido vector de ADN total dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena ligera y pesada, 235 µ? de una solución 1M de CaCl2, y se añadió agua a un volumen final de 469 µ? . A esta solución, se le añadió 469 µ? de una solución HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HP04 1.5 mM a pH 7.05, se mezcló inmediatamente durante 10 seg. y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 seg. La suspensión se diluyó con alrededor de 12 mi de medio DMEM suplementado con FCS 2%, y se añadió al T75 en lugar del medio existente. Las células se incubaron a 37°C, C02 al 5% durante alrededor de 17 a 20 horas, después el medio se sustituyó con alrededor de 12 mi de DMEM, FCS al 10%. El medio de cultivo acondicionado se recogió de 5 a 7 días tras la transfección se centrifugó durante 5 min. a 210-300 *g, se filtró a través de un filtro estéril de 0.22 µ?t? (o alternativamente se centrifugó durante 5 min. a 1200 rpm, seguido por una segunda centrifugación durante 10 min. a 4000 rpm) y se mantuvo a 4°C.
Los anticuerpos secretados se purificaron mediante cromatografía de afinidad de Proteína A y un paso final de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) cambiando el regulador de pH a regulador de H fosfato salino y recogiendo los anticuerpos monoméricos IgGl puros. La concentración de anticuerpos se estimó utilizando un espectrofotómetro a partir de la absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos están formulados en una solución 25 mM de fosfato potásico, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM a pH 6,7.
Las variantes glucomodificadas de anticuerpos biespecífieos se produjeron mediante cotransfección de vectores de expresión de anticuerpos junto con un vector de expresión GnT-III glucosiltransferasa , o junto con un vector de expresión GnT-III más un vector de expresión de manosidasa II Golgi . Los anticuerpos glucomodificados se purificaron y formularon tal como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos no glucomodificadas . Los oligosacáridos unidos a la región Fe del anticuerpos se analizaron mediante MALDI/TOF-MS tal como se describe más adelante para determinar la cantidad de fucosa .
Los oligosacáridos se liberaron enzimát icamente de los anticuerpos mediante digestión con PNGasaF, con los anticuerpos inmovilizados en una membrana PVDF o en solución.
La solución de digestión resultante que contiene los oligosacáridos liberados se preparó directamente para el análisis MALDI/TOF-MS o se digirió con EndoH glucosidasa antes de la preparación de muestras para el análisis MALDI/TOF-MS . Para todos los anticuerpos biespecí fieos de acuerdo con la invención, GE significa glucomodificado .
Ejemplo 9 Unión a FcgRIIIa y competencia ADCC de anticuerpos biespecí fieos <EGFR-IGF1R> El grado de mediación de ADCC mediante un anticuerpo determinado depende no solo del antígeno al que se uno, sino también depende de las afinidades de las regiones constantes del FcgRIIIa, que se conoce como el receptor Fe que dispara la reacción ADCC. Para el análisis de la unión de anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> al bFcgRIIIa, se utilizó un método Biacore. Con esta tecnología, se analizó la unión de anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> a los dominios FcgRIIIa producidos de forma recombinante .
Todas las medidas de resonancia de plasmón en superficie se realizaron en un instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare Biosciences AB, Suecia) a 25°C. El regulador de pH de reacción y de dilución fue PBS (KH2P04 1 mM, Na2HP04 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM) , H 6.0, Tween20 0.005% (v/v) . El FcgRIIIa humano soluble se diluyó en sodio-acetato 10 mM, pH 5.0 y se inmovilizó en un chip biosensor CM5 utilizando el equipo de acoplamiento estándar amina (GE Healthcare Biosciences AB, Suecia) para obtener densidades en superficie de FcgRIIIa de aproximadamente 1000 RU. Se utilizó HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 0.005%; GE Healthcare Biosciences AB, Suecia) como regulador de pH de reacción durante la inmovilización. Los anticuerpos biespecíficos XGFR se diluyeron con PBS, Tween20 0.005% (v/v) , pH 6.0 a una concentración de 450 nM y se inyectaron durante 3 minutos a una tasa de flujo de 30 µ?/minuto. Después, el chip sensor se regeneró durante 1 minuto con PBS, pH 8.0, Tween20 0.005% (v/v). El análisis de los datos se realizó con el programa BIAevaluation (BIAcore, Suecia) .
Para analizar en qué grado la competencia de unión de los anticuerpos biespecíficos <EGFR-IGF1R> a FcgRIIIa se traduce también en la actividad ADCC in vitro hacia las células tumorales, la competencia ADCC se determinó en ensayos celulares. Para estos ensayos, se prepararon derivados glucomodificados de anticuerpos biespecíficos <EGFR-IGF1R> (véase anteriormente) y se analizaron en un formato de ensayo de competencia ADCC y también en un ensayo ADCC in vitro tal como se describe más adelante.
Las células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP, por sus siglas en inglés) se utilizaron como células efectoras y se prepararon utilizando Histopaque-1077 (Greiner Leucosep NO 227288) siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. En breve, se tomó la sangre venosa con jeringas heparinizadas de voluntarios sanos. La sangre se diluyó 1:0.75-1,3 con PBS (sin Ca++ ni Mg++) y se extendió una capa en un Histopaque-1077. El gradiente se centrifugó a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin pausa. La interfase que contiene las CMSP se recogió y se lavó con PBS (50 mi por células de dos gradientes) y se recogieron por centrifugación a 400 x g durante 10 minutos a TA. Tras la resuspensión del botón con PBS, se contaron las CMSP y se lavaron una segunda vez por centrifugación a 400 x g durante 10 minutos a TA. Las células se resuspendieron entonces en el medio apropiado para los procedimientos posteriores .
La proporción de efector y diana utilizada para los ensayos ADCC fue de 25:1 para las CMSP. Las células efectoras se prepararon en el medio AIM-V a la concentración apropiada para poder añadir 50 µ? por cavidad en placas de 96 cavidades de fondo redondeado. Las células diana eran células que expresan EGFR/IGFR humanas (por ejemplo, H322M, A549, o MCF-7) crecidas en DMEM que contienen FCS al 10%.
Las células diana se lavaron en PBS, se contaron y se ajustaron a lxl0E6 células/ml. Las células se marcaron con calceína AM (10 µ?) durante 30 min a 37°/C02 5%. Tras el mareaje se lavaron las células dos veces en "PBS y se sembraron 5000 células /cavidad en 50 µ? (medio AIM-V) en placas de 96 cavidades de fondo redondeado. Se diluyeron los anticuerpos en AIM-V, se añadieron en 50 µ? de las células diana preplaqueadas . Después se añadieron las células efectoras y la placa se incubó durante 4 horas a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene C02 al 5%. Tras el periodo de incubación, las placas se centrifugaron a 200 g durante 10 min y 80 µ? de sobrenadante se transfirió a una placa fluorescente negra de fondo transparente y se midió la fluorescencia (Ex 485nm/Em 535nm) con un lector Tecan Infinite.
Los siguientes controles se incluyen en el ensayo: - fondo: 50µ1 de alícuota de sobrenadante tras el mareaje de células + 100 µ? de medio - lisis espontánea: 50 µ? suspensión de células diana + 100 µ? de medio - lisis máxima: 50 µ? suspensión de células diana + 100 µ? de medio / Tritón X-100 1.5% - control de lisis sin anticuerpo: 50 µ? suspensión de células diana + 50 µ? de medio + 50 µ? PBL el% de citotoxicidad dependiente de anticuerpo se calculó como sigue: % ADCC = x - liberación espontánea/ lisis máx. - lisis espontánea x 100 Ejemplo 10 Análisis de la glucoestructura de los anticuerpos biespecí fieos <EGFR-IGF1R> Para la determinación de las proporciones relativas de estructuras de oligosacárido que contienen fucosa y no fucosa (a-fucosa) , se analizaron los glicanos liberados del material de anticuerpo purificado mediante espectrometría de masas MALDI-Tof . Para ello, la muestra de anticuerpo (alrededor de 50 µg) se incubó durante la noche a 37°C con 5 mU de N-glucosidasa F (Prozyme NO GKE-5010B) en regulador de pH fosfato sódico 0.1 M, pH 6.0, para poder liberar el oligosacárido de la estructura proteica. Posteriormente, las estructuras glicano liberadas se aislan y desalinizan utilizando puntas de pipeta NuTip-Carbón (obtenidas de Glygen: NuTipl-10 µ?, NO Cat. NT1CAR) . Como primer paso, se prepararon las puntas de pipeta NuTip-Carbon para unir los oligosacáridos mediante su lavado con 3 µ? de NaOH 1M seguido por 20 µ? de agua pura (por ejemplo, gradiente en HPLC de Baker, NO 4218) , 3 µ? de ácido acético 30% v/v y de nuevo 20 µ? de agua pura. Para ello, las correspondientes soluciones se cargaron encima del material cromatográfico en la punta de pipeta NuTip-Carbon y se presionó a través de esta. Tras esto, las estructuras glicano correspondientes a los 10 µg de anticuerpo se unieron al material en las puntas de pipeta NuTip-Carbon empujando hacia arriba y hacia abajo cuatro o cinco veces el material digerido con N-Glucosidasa F descrito anteriormente.
Los glicanos unidos al material en la punta de pipeta NuTip-Carbon se lavaron con 20 µ? de agua pura de la manera en que se ha descrito anteriormente y se eluyeron por pasos con 0.5 µ? de acetonitrilo al 10% y 2.0 µ? de acetonitrilo al 20%, respectivamente. Para este paso, las soluciones de elución se rellenaron en viales de reacción de 0.5 mi y se empujaron hacia arriba y hacia abajo cuatro o cinco veces cada uno. Para el análisis mediante espectrometría de masas MALDI-Tof, se combinaron ambas eluciones. Para esta medición, 0.4 µ? de las eluciones combinadas se mezclaron en la diana MALDI con 1.6 µ? de solución de matriz SDHB (ácido 2 , 5-dihidroxibenzoico/ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzoico [Bruker Daltonics N°209813] disuelto en etanol 20% / NaCl 5 mM a 5 mg/ml) y se analizó con un instrumento Bruker Ultraflex TOF/TOF adecuadamente sintonizado. Por rutina, se registraron de 50 a 300 tomas y se resumieron en un único experimento. El espectro obtenido se evaluó mediante el programa de análisis flex (Bruker Daltonics) y se determinaron las masas para cada uno de los picos detectados. Posteriormente, los picos se asignaron a estructuras glicol que contienen fucosa o a-fucosa (no fucosa) comparando las masas calculadas y las masas esperadas en teoría para las correspondientes estructuras (por ejemplo, complejas, híbridas y oligo o alta mañosa, respectivamente, con y sin fucosa) .
Para la determinación de la proporción de estructuras híbridas, la muestra de anticuerpo se digirió de forma concomitante con N-glucosidasa F y endo-glucosidasa H. La N-glucosidasa F libera todas las estructuras glicano N-unidas (estructuras complejas, híbridas y oligo o alta mañosa) del esqueleto proteico y la endo-glucosidasa H escinde todos los tipos de glicano híbridos de forma adicional entre los dos residuos GlcNAc en el extremo reductor del glicano. Esta digestión se trató posteriormente y se analizó mediante espectrometría de masas MALDI-Tof de la misma forma como se ha descrito anteriormente para la muestra digerida con N-glucosidasa F. Al comparar el patrón de la digestión con N-glucosidasa F y la digestión combinada de N-glucosidasa F/Endo H, el grado de reducción de las señales de una estructura glico específica se utiliza para estimar el contenido relativo de estructuras híbridas .
La cantidad relativa de cada glucoestructura se calcula a partir de la proporción de altura del pico de una estructura glico individual y la suma de alturas de picos de todas las estructures glico detectadas. La cantidad de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a todas las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-Glucosidasa F (por ejemplo, estructuras de oligo y alta mañosa, respectivamente, híbridas y complejas) . La cantidad de afucosilación es el porcentaje de estructuras que carecen de fucosa en relación a todas las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-Glucosidasa F (por ejemplo, estructuras de oligo y alta mañosa, respectivamente, híbridas y complejas) .
La cantidad de fucosa determinada para OA-GA201-scFab-Akl8_TS estuvo entre el 25% y el 40%.
Ejemplo 11 Unión de anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> a células con diferente expresión de EGFR y IGF- IR El anticuerpo humano anti-IGF-lR <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) se une a las células que expresan IGF- IR y el anticuerpo humanizado de rata anti-EGFR ICR62 se une a las células que expresan EGFR en su superficie. Para analizar las propiedades de unión de los anticuerpos biespecíficos <EGFR-IGF1R> en comparación con los anticuerpos monoespecíficos bivalentes hacia EGFR y IGF-IR, se realizaron ensayos de unión competitivos en células con diferentes proporciones de expresión de IGF- IR/EGFR.
Las células tumorales humanas (por ejemplo, A549, TC-71, MDA-MB-231, 2 x 105 células/cavidad) diluidas en regulador de pH enfriado con hielo (PBS + FCS 2%, Gibco) se añadieron a una mezcla de anticuerpos monoespecíficos marcados (HUMAB Clon 18 o anticuerpo humanizado de rata anti-EGFR ICR62) (concentración final de 1 g/ml) y diferentes concentraciones de anticuerpos <EGFR-IGF1R> sin marcar o anticuerpos monoespecífico sin marcar o fragmentos Fab como controles (rango de titulación final de 100 a 0.002 µg/ .l) en una placa de 96 cavidades microtitulada . La mezcla se incubó en hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron 2 veces mediante la adición de 150-200 µ? de regulador de pH (PBS + FCS 2%) y posterior centrifugación (300 g; 5 min, 4°C) . Las células se resuspendieron entonces en 200 µ? de regulador de pH de fijación (lx CellFix, BD N°340181) que contiene 6.25 µ?/ml de 7-AAD (BD N°559925) y se incubaron durante 10-20 min en hielo para permitir la fijación y penetración de 7-AAD en las células muertas. La señal fluorescente de las muestras se analizó mediante FACS y se calcularon los valores de CI50.
Los resultados del análisis de unión competitiva versus <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (valores CI50) se muestran en la Tabla X. Sobre las células tumorales A549, que expresan ambos IGF-IR y EGFR, la unión de anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS fue superior a <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (- 3x) y superior a fragmento Fab de <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (~ 30x) probablemente debido a la capacidad del anticuerpos biespecífieos de unirse a ambos IGF-IR y EGFR de forma simultanea (efectos de avidez) . Sobre las células tumorales TC-71, que expresan IGF-IR pero no EGFR, la unión del anticuerpo <EGFR-IGF1R> OA-GA201-scFab-Akl8_TS fue comparable a la del fragmento Fab de <IGF-1R> HUMAB Clon 18. En este caso, en el que se expresó solamente IGF-IR y no EGFR, OA-GA201-scFab-Akl8_TS puede unirse solo a IGF-IR con un brazo de unión.
Esta capacidad de los anticuerpos biespecífieos <EGFR-IGF1R> de unirse más fuerte a células que expresan IGF- IR y EGFR puede explotarse para lograr una localización superior de tejidos tumorales y resultar potencialmente en perfiles de seguridad favorables y propiedades PK en comparación con anticuerpos monoespecíficos de IGF-IR y EGFR.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo biespecífico caracterizado porque comprende a) la cadena ligera y la cadena pesada de un primer anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno; b) la cadena ligera y la cadena pesada de un segundo anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el N-terminal de la cadena pesada está conectado con el C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido enlazador.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de b) se encuentran en una superficie que comprende una alteración de la superficie original entre los dominios CH3 de los anticuerpos ; en el que i) en el dominio CH3 de una cadena pesada un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido con un volumen de cadena lateral mayor, generando así una protuberancia en la superficie del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede posicionar en una cavidad en la superficie del dominio CH3 de la otra cadena pesada y en el que ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido que posee un volumen de cadena lateral más pequeño, generando así una cavidad en la superficie del segundo dominio CH3 en el que la protuberancia en la superficie del primer dominio CH3 es colocable.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque tal residuo de aminoácido con un volumen de cadena lateral mayor se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) y tal residuo de aminoácido que posee un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste en alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , valina (V) .
4. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque ambos dominios CH3 están alterados además por la introducción de una cisteína (C) como aminoácido en las correspondientes posiciones de cada dominio CH3 de forma que puede formarse un puente de disulfuro entre ambos dominios CH3.
5. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) de las cadenas pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa bajo b) están estabilizados mediante la introducción de puentes disulfuro entre las siguientes posiciones: i) la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de la cadena pesada en la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
6. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de IgGl .
7. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada * conectada a la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3.
8. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 2, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 4.
9. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7.
10. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF- IR y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.
11. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a VEGF y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a ANG-2 y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11.
12. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el primer anticuerpo de longitud completa se une específicamente a VEGF y comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9, y una cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO : 10, y b) el segundo anticuerpo de longitud completa se une específicamente a ANG-2 y comprende una cadena pesada conectada con la cadena ligera mediante un péptido enlazador en el que tal cadenas pesada y ligera conectadas por péptido posee la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.
13. El anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque el anticuerpo está glucosilado con una cadena de azúcar en la Asn297 en el que la cantidad de fucosa en la cadena de azúcar es del 65% o inferior.
14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13.
15. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque es para el tratamiento del cáncer.
16. El uso de un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer .
17. Un método de tratamiento de pacientes que padecen cáncer, caracterizado porque comprende la administración de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 a un paciente que necesita tal tratamiento .
18. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica una cadena de un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
19. Un vector de expresión caracterizado porque contiene tal ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18, capaz de expresar tal ácido nucleico en una célula hospedera eucariota o procariota.
20. Una célula hospedera eucariota o procariota caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 19.
21. Un método para la preparación de un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13 , caracterizado porque comprende los pasos de a) transformar una célula hospedera con vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican aa) la cadena ligera y la cadena pesada de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno; y ab) la cadena ligera y la cadena pesada de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el N-terminal de la cadena pesada está conectado con el C-terminal de la cadena ligera mediante un péptido enlazador; y b) cultivar la célula hospedera bajo condiciones que permiten la síntesis de tal molécula de anticuerpo; y c) recuperar tal molécula de anticuerpo de tal cultivo.
22. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF-IR humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y de SEC ID NO: 3.
23. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF-IR humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y de SEC ID NO : 4.
24. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF-1R humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y de SEC ID NO : 7.
25. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a IGF-1R humano y EGFR humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y de SEC ID NO: 8.
26. El anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado porque el anticuerpo está glucosilado con una cadena de azúcar en la Asn297 en el que la cantidad de fucosa en la cadena de azúcar es del 65% o inferior.
27. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a VEGF humano y ANG-2 humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10 y de SEC ID NO: 11.
28. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a VEGF humano y ANG-2 humano, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10 y de SEC ID NO: 12.
MX2012010559A 2010-03-26 2011-03-24 Anticuerpos biespecificos. MX340124B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10003270 2010-03-26
PCT/EP2011/054505 WO2011117330A1 (en) 2010-03-26 2011-03-24 Bispecific antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2012010559A true MX2012010559A (es) 2012-11-23
MX340124B MX340124B (es) 2016-06-28

Family

ID=42330134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012010559A MX340124B (es) 2010-03-26 2011-03-24 Anticuerpos biespecificos.

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10106600B2 (es)
EP (1) EP2552481B1 (es)
JP (1) JP5726287B2 (es)
KR (1) KR101498346B1 (es)
CN (1) CN102946902B (es)
AR (1) AR080793A1 (es)
BR (1) BR112012024312A2 (es)
CA (1) CA2789074A1 (es)
HK (1) HK1182625A1 (es)
MX (1) MX340124B (es)
RU (1) RU2573588C2 (es)
TW (1) TW201138821A (es)
WO (1) WO2011117330A1 (es)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
PL3318571T3 (pl) * 2011-03-16 2021-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Chromatografia jonowymienna o ulepszonej selektywności do rozdzielania monomerów, agregatów i fragmentów polipeptydowych przez modulację fazy ruchomej
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
DK2773671T3 (da) 2011-11-04 2021-11-15 Zymeworks Inc Udformning af stabilt heterodimert antistof med mutationer i fc-domænet
CN104379601B (zh) 2012-02-03 2021-04-09 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途
WO2013150043A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
US9062120B2 (en) * 2012-05-02 2015-06-23 Janssen Biotech, Inc. Binding proteins having tethered light chains
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
AU2013293092A1 (en) * 2012-07-23 2015-02-26 Zymeworks Inc. Immunoglobulin constructs comprising selective pairing of the light and heavy chains
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
JP6347490B2 (ja) 2012-11-28 2018-06-27 ザイムワークス，インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖−軽鎖対およびその使用
MX2015010350A (es) 2013-02-26 2015-10-29 Roche Glycart Ag Moleculas de union a antigeno biespecificas que activan la celula t.
CA2891493C (en) 2013-02-26 2022-03-15 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
RU2019108429A (ru) * 2013-04-29 2019-05-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифицированные асимметричные антитела, связывающие fc-рецептор, и способы их применения
ES2746136T3 (es) 2013-04-29 2020-03-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos modificados de unión a FcRn humano y procedimientos de uso
CN103509117B (zh) * 2013-05-06 2016-03-09 江苏匡亚生物医药科技有限公司 抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途
CA2910945A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
WO2015014979A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Tnfa-il-17 bispecific antibodies
KR20160044023A (ko) 2013-08-19 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체 생산 부산물의 분리
WO2015025054A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 Medizinische Universität Wien Dye-specific antibodies for prestained molecular weight markers and methods producing the same
MX2016006301A (es) 2013-11-13 2016-12-16 Zymeworks Inc Construcciones de unión a antígeno monovalente que se dirigen a egfr y/o her2, y sus usos.
JP6817064B2 (ja) 2013-11-27 2021-01-20 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合性コンストラクト
JP6510532B2 (ja) 2013-12-20 2019-05-08 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｈｅｒ２抗体及び使用方法
RU2016129959A (ru) 2013-12-30 2018-02-02 Эпимаб Биотерепьютикс Инк. Иммуноглобулин с тандемным расположением fab-фрагментов и его применение
KR20160104636A (ko) 2014-01-15 2016-09-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 단백질 Ａ-결합이 개선된 Ｆｃ-영역 변이체
CN103864935A (zh) * 2014-03-06 2014-06-18 中国药科大学 一种靶向egfr/kdr特异性双链抗体
CN104974260B (zh) * 2014-04-01 2019-06-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗hgf/vegf双特异性抗体、其制备方法及应用
NZ725423A (en) * 2014-04-25 2023-07-28 Pf Medicament Igf-1r antibody and its use as addressing vehicle for the treatment of cancer
LT3134125T (lt) 2014-04-25 2020-01-10 Pierre Fabre Médicament Antikūno ir vaisto konjugatas bei jo panaudojimas vėžio gydymui
HUE044862T2 (hu) 2014-04-25 2019-11-28 Pf Medicament IGF-1R ellenanyag-drog konjugátum és alkalmazása rák kezelésében
EP4026850A1 (en) 2014-05-28 2022-07-13 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
AU2015282627B2 (en) 2014-06-30 2020-04-02 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
PE20211533A1 (es) 2014-08-04 2021-08-16 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de unon a antigeno activadoras de celulas t
KR20170080584A (ko) * 2014-11-10 2017-07-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항체 및 안과학에서 이의 사용 방법
DK3221355T3 (da) 2014-11-20 2020-12-07 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler CD3 og folatreceptor 1 (FolR1) samt PD-1-aksebindende antagonister
EP3223848A4 (en) * 2014-11-27 2018-07-18 Zymeworks Inc. Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2016087514A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
AR103477A1 (es) 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2
WO2017004149A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Multi-specific binding proteins
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
PL3356404T3 (pl) 2015-10-02 2022-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała anty-pd1 i sposoby ich stosowania
AR106201A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t
AU2016334063B2 (en) 2015-10-08 2023-05-25 Zymeworks Bc Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
KR20180085740A (ko) 2015-12-09 2018-07-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체
AU2016383475B2 (en) * 2015-12-28 2024-02-22 Innate Pharma Variable regions for NKp46 binding proteins
IL259588B2 (en) 2016-01-08 2023-09-01 Hoffmann La Roche Methods for the treatment of cea-positive cancer using pd-1 spindle-binding antagonists and bispecific antibodies against anti-cea and anti-cd3
BR112018015715A2 (pt) * 2016-02-03 2019-02-05 Amgen Inc construtos de anticorpo de engate de célula t biespecífica bcma e cd3
CN109195993B (zh) 2016-02-06 2022-05-10 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
AU2017238172A1 (en) 2016-03-21 2018-09-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
ES2947230T3 (es) 2016-03-22 2023-08-03 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa
SG11201808289SA (en) * 2016-03-25 2018-10-30 Biomunex Pharmaceuticals Binding molecules to cd38 and pd-l1
CN109071635B (zh) * 2016-05-02 2023-09-01 豪夫迈·罗氏有限公司 Contorsbody－单链靶标结合物
JP7022123B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
WO2018098363A2 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
CN106946989B (zh) * 2017-03-02 2020-02-18 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 抗cea抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
BR112019025105A2 (pt) 2017-06-30 2020-10-20 Zymeworks Inc. fabs quiméricos estabilizados
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
AU2019218959A1 (en) 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
CN110540593B (zh) * 2018-05-29 2022-05-17 上海药明生物技术有限公司 新型的抗cd3/抗cd20双特异性抗体
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
MA54052A (fr) * 2018-10-29 2022-02-09 Hoffmann La Roche Formulation d'anticorps
CA3124796A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CN114126714A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
CA3130628A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
CN114026122A (zh) 2019-02-21 2022-02-08 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
CN110294806A (zh) * 2019-07-08 2019-10-01 徐州医科大学 一种磷酸化抗体及其应用
CN110577603B (zh) * 2019-08-15 2021-12-28 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗cd3和抗cd19双特异性抗体
CN110669137B (zh) * 2019-10-24 2021-07-16 高新 一种多特异性抗体及其制备方法和用途
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
US11780920B2 (en) 2020-06-19 2023-10-10 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to CD3 and CD19
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
CN116782937A (zh) 2020-12-10 2023-09-19 优特力克斯有限公司 抗pd-1抗体及其用途
CN114716548A (zh) 2021-01-05 2022-07-08 (株)爱恩德生物 抗-fgfr3抗体及其用途
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
CN113278071B (zh) 2021-05-27 2021-12-21 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人干扰素α受体1单克隆抗体及其应用
CN113683694B (zh) 2021-09-03 2022-05-13 江苏荃信生物医药股份有限公司 一种抗人tslp单克隆抗体及其应用
CN113603775B (zh) 2021-09-03 2022-05-20 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人白介素-33单克隆抗体及其应用
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines

Family Cites Families (365)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4150149A (en) 1976-11-29 1979-04-17 Professional Staff Association Of The Los Angeles County Harbor General Hospital Method and means for the early detection and diagnosis of certain types of cancers
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
IL86164A0 (en) 1987-04-28 1988-11-15 Tamir Biotechnology Ltd Improved dna probes
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
KR970005898B1 (ko) 1987-09-21 1997-04-21 젠- 프로우브 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
ES2064374T3 (es) 1988-04-01 1995-02-01 Carter Wallace Escision especifica de enlaces peptidicos mediante fosfinas organicas que tienen cadenas laterales nucleofilas.
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
FR2632955B1 (fr) 1988-06-20 1991-12-27 Oris Ind Derives de nucleosides utilisables pour la synthese d'oligonucleotides marques, oligonucleotides obtenus a partir de ces derives et leur synthese
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
FR2642074B1 (fr) 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
DE69006018T3 (de) 1989-03-21 2004-01-15 Immune Response Corp Inc Impfung und methoden gegen krankheiten, die von pathologischen reaktionen der spezifischen t-zellen abstammen.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69031919T3 (de) 1989-07-19 2005-01-27 Connetics Corp., Palo Alto T-zell-rezeptor-peptide als heilmittel für autoimmune und bösartige krankheiten
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
AU648056B2 (en) 1989-11-07 1994-04-14 Bristol-Myers Squibb Company Oligomeric immunoglobulins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2090317A1 (en) 1990-08-31 1992-03-01 Edith A. Wolff Homoconjugated immunoglobulins
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5290925A (en) 1990-12-20 1994-03-01 Abbott Laboratories Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
CA2071137A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Clarence C. Lee Composition and method for revitalizing scar tissue
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
IE922292A1 (en) 1991-07-15 1993-01-27 Jolla Pharma Modified phosphorous intermediates for providing functional¹groups on the 5' end of oligonucleotides
WO1993005060A1 (de) 1991-08-28 1993-03-18 Boehringer Mannheim Gmbh Funktionalisierte trägermaterialien für gleichzeitige synthese und direktmarkierung von oligonukleotiden als primer für matrizenabhängige enzymatische nukleinsäuresynthesen
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
ATE295420T1 (de) 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994004550A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Triplex Pharmaceutical Corporation Cholesteryl-modified triple-helix forming oligonucleotides and uses thereof
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
WO1994010308A1 (en) 1992-10-23 1994-05-11 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
BR9207175A (pt) 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
DE4310141A1 (de) 1993-03-29 1994-10-06 Boehringer Mannheim Gmbh Homobidentale trifunktionelle Linker
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
JPH08507549A (ja) 1993-12-27 1996-08-13 バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド 水溶性の非免疫原性ポリアミド架橋剤
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5824483A (en) 1994-05-18 1998-10-20 Pence Inc. Conformationally-restricted combinatiorial library composition and method
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5849879A (en) 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9504344D0 (en) 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU6163196A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Smithkline Beecham Corporation Method for obtaining receptor agonist antibodies
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
AU6514096A (en) 1995-07-27 1997-02-26 Carsten Behrens A new achiral linker reagent for the incorporation of multiple amino groups into oligonucleotides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
AU6873396A (en) 1995-10-16 1997-05-07 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
EP0861325A1 (de) 1995-11-16 1998-09-02 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von peptiden über streptavidin-fusionsproteine
US5736626A (en) 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
DK0894135T3 (da) 1996-04-04 2004-12-06 Unilever Nv Multivalent og multispecifikt antigenbindingsprotein
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
WO1997043451A1 (en) 1996-05-15 1997-11-20 Biogenex Laboratories Non-nucleotide linking reagents
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
ES2361267T3 (es) 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.
EP0915987A2 (en) 1997-04-21 1999-05-19 Donlar Corporation POLY-($g(a)-L-ASPARTIC ACID), POLY-($g(a)-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
CA2288600C (en) 1997-05-02 2010-06-01 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1015480A2 (en) 1997-08-18 2000-07-05 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
DK1049787T3 (da) 1998-01-23 2005-04-04 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofderivater med flere anvendelsesmuligheder
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6117986A (en) 1998-06-10 2000-09-12 Intergen Company, L.P. Pyrimidines linked to a quencher
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
CA2335364C (en) 1998-06-22 2010-05-04 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
DE69934425T2 (de) 1998-10-23 2007-09-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Thrombopoietin substitute
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
WO2000035956A1 (fr) 1998-12-16 2000-06-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps monoclonal anti-vegf humain
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
CN1232039A (zh) 1999-04-02 1999-10-20 中国人民解放军海军总医院 一种基因工程双特异抗体及其应用
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6872806B1 (en) 1999-06-25 2005-03-29 The Governors Of The University Of Alberta Polypeptide compositions formed using a coiled-coil template and methods of use
EP1074563A1 (en) 1999-08-02 2001-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimeric polypeptides enhancing dimer formation through electrostatic interactions and disulfide bond, method for production and uses thereof
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US6727356B1 (en) 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
PL358215A1 (en) 2000-03-24 2004-08-09 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
DE10021678A1 (de) 2000-05-05 2002-04-18 Stefan Duebel Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen
WO2001090192A2 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Imclone Systems Incorporated Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
CA2410551A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
DE10044373A1 (de) 2000-09-08 2002-03-21 Roche Diagnostics Gmbh Neues Reagenz zur Markierung von Nukleinsäuren
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
RU2430927C2 (ru) 2000-10-20 2011-10-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Агонистическое соединение, способное специфически узнавать и поперечно сшивать молекулу клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу
US6610472B1 (en) 2000-10-31 2003-08-26 Genetastix Corporation Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast
ATE519783T1 (de) 2000-12-22 2011-08-15 Grad Carole Legal Representative Of Kaplan Howard ßPHAGE DISPLAYß BIBLIOTHEKE VON MENSCHLICHEN VH FRAGMENTEN
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20050118164A1 (en) 2001-03-09 2005-06-02 William Herman Targeted ligands
US20030027751A1 (en) 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
EE05294B1 (et) 2001-05-11 2010-04-15 Amgen Inc. TALL-1-ga seostuv ainekompositsioon
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US20030082547A1 (en) 2001-08-27 2003-05-01 Ewing Gregory J. Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7053202B2 (en) 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20030170230A1 (en) 2002-02-05 2003-09-11 Caterer Nigel Robert Compositions and methods for assembly and stabilization of antibody Fv fragments via antiparallel heterogeneous coiled-coil peptide regions and uses thereof
US20030157091A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Dyax Corporation Multi-functional proteins
EP1490677A4 (en) 2002-02-27 2006-01-18 California Inst Of Techn COMPUTER METHOD FOR DESIGNING ENZYMES FOR THE INCORPORATION OF AMINO ACID ANALOGUES INTO PROTEINS
EP1487879B1 (en) 2002-03-01 2012-12-26 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CA2484182A1 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Genpat77 Pharmacogenetics Ag Novel antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
KR100527334B1 (ko) 2002-06-07 2005-11-09 (주)넥스젠 올리고뉴클레오타이드의 신규한 링커
JP2006512895A (ja) 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
EP1549344B1 (en) 2002-10-10 2015-01-07 Merck Patent GmbH Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
EP1431298B1 (en) 2002-12-20 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH Mannitol and glucitol derivatives
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20040157330A1 (en) 2003-01-09 2004-08-12 Arizeke Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for targeted biological delivery of molecular carriers
ATE475708T1 (de) 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion
AU2004205684A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
MXPA05008521A (es) 2003-02-13 2005-10-20 Pharmacia Corp Anticuerpos a c-met para el tratamiento de canceres.
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
US7238792B2 (en) 2003-03-18 2007-07-03 Washington State University Research Foundation Foldable polymers as probes
ATE549359T1 (de) 2003-04-02 2012-03-15 Hoffmann La Roche Antikörper gegen den insulinähnlichen wachstumsfaktor i-rezeptor und deren verwendungen
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
RS20181002A1 (sr) 2003-05-30 2018-12-31 Genentech Inc Tretman sa anti-vegf antitelima
CA2529945A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
PL1639011T3 (pl) 2003-06-30 2009-05-29 Domantis Ltd Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb)
US20050100543A1 (en) 2003-07-01 2005-05-12 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US7579157B2 (en) * 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
CA2534077A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2536408A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
CA2534959A1 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20050064509A1 (en) 2003-09-23 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Use of templated self assembly to create novel multifunctional species
CN1326881C (zh) 2003-09-29 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途
SG143252A1 (en) 2003-10-09 2008-06-27 Ambrx Inc Polymer derivatives
PL1692182T3 (pl) 2003-11-05 2010-09-30 Roche Glycart Ag Przeciwciała CD20 o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej
SG149815A1 (en) 2003-11-06 2009-02-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005051976A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
CA2494571C (en) 2003-12-02 2010-02-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides containing molecular rods
EP2275448A3 (en) 2003-12-19 2013-02-06 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
NZ586034A (en) 2004-02-02 2011-10-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
US7705150B2 (en) 2004-02-04 2010-04-27 Biosearch Technologies, Inc. Cyanine dyes
EP1725585A2 (en) 2004-03-10 2006-11-29 Lonza Ltd Method for producing antibodies
US20060102423A1 (en) 2004-07-12 2006-05-18 Lang Tracy H Safety harnesses
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
US20060067930A1 (en) 2004-08-19 2006-03-30 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2577405A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Anti-fc-gamma riib receptor antibody and uses therefor
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1842226B2 (en) 2004-11-03 2014-07-02 Iris International, Inc. Homogeneous analyte detection
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
NZ556029A (en) 2004-12-21 2010-04-30 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US7722867B2 (en) * 2005-02-07 2010-05-25 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
EP1858914B1 (en) 2005-02-24 2013-12-04 The University Of Queensland Peptide networks
WO2006093794A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
ES2707152T3 (es) 2005-04-15 2019-04-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
EP1877441A2 (en) 2005-04-26 2008-01-16 Bioren, Inc. Method of producing human igg antibodies with enhanced effector functions
AU2006239851B2 (en) 2005-04-26 2011-06-16 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
US7795009B2 (en) 2005-06-15 2010-09-14 Saint Louis University Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP2395024B1 (en) 2005-08-26 2018-12-19 Roche Glycart AG Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
EP1801114B8 (de) 2005-11-23 2009-12-02 Roche Diagnostics GmbH Polynukleotid mit Phosphatmimetikum
CA2633211A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Astrazeneca Ab Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or flt1 antagonist for treating cancer
KR101388320B1 (ko) 2005-12-15 2014-04-22 뽈리쁠뤼스-트랑스펙씨옹 양이온성 올리고뉴클레오티드, 이를 제조하기 위한 자동화방법 및 이의 용도
FR2894959B1 (fr) 2005-12-15 2008-02-29 Galderma Res & Dev Derives biphenyliques agonistes selectifs du recepteur rar-gamma
US20070196274A1 (en) 2006-01-20 2007-08-23 Le Sun Immunoconjugates with improved efficacy for the treatment of diseases
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
JP2009526857A (ja) 2006-02-15 2009-07-23 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 機能性抗体
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
WO2007108013A2 (en) 2006-03-22 2007-09-27 National Institute Of Immunology Novel bioconjugates as therapeutic agent and synthesis thereof
PL1999154T3 (pl) 2006-03-24 2013-03-29 Merck Patent Gmbh Skonstruowane metodami inżynierii heterodimeryczne domeny białkowe
CA2649359A1 (en) 2006-04-21 2007-11-01 Peoplebio, Inc. Method for differentially detecting multimeric form from monomeric form of multimer-forming polypeptides through three-dimensional interactions
US20070274985A1 (en) * 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
WO2008005828A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Novo Nordisk A/S PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE COMPOSITIONS COMPRISING ANTIBODY MOLECULES SPECIFIC TO LAMININ-5 α3 CHAIN DOMAINS G1G2 AND USE THEREOF
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
EP2061901A2 (en) 2006-10-31 2009-05-27 Noxxon Pharma AG Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CN101205255A (zh) 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用
MX2009006779A (es) 2006-12-19 2009-08-27 Genentech Inc Antagonistas especificos para terapia con adyuvantes y neo-adyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana.
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101037671B (zh) 2007-02-14 2010-07-07 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面h抗原的单克隆抗体
KR101598229B1 (ko) 2007-02-16 2016-02-26 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. Ｅｒｂｂ3에 대한 항체 및 이의 용도
US10259860B2 (en) 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
WO2008137120A1 (en) 2007-05-03 2008-11-13 Tethys Bioscience, Inc. Binding reagents that contain small epitope binding molecules
CA2687117A1 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
SI2170959T1 (sl) 2007-06-18 2014-04-30 Merck Sharp & Dohme B.V. Protitelesa proti receptorjem pd-1 za humano programirano smrt
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
EP2069401A4 (en) 2007-07-31 2011-02-23 Medimmune Llc MULTISPECIENT EPITOP BINDING PROTEINS AND THEIR USE
AU2008286759B2 (en) 2007-08-15 2014-05-08 Isp Investments Inc. Polyvinylamide polymers containing polymerizable functionalities
EP2178914A2 (en) 2007-08-15 2010-04-28 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
DE102007038753A1 (de) 2007-08-16 2009-02-19 Giesecke & Devrient Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die Kalibrierung eines Sensorsystems
CN101842116A (zh) 2007-08-28 2010-09-22 比奥根艾迪克Ma公司 结合igf-1r多个表位的组合物
US8709727B2 (en) 2007-09-17 2014-04-29 Mattias Strömberg Magnetic detection of small entities
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US20090117105A1 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of National Defence Humanized anti-venezuelan equine encephalitis virus recombinant antibody
WO2009059278A1 (en) 2007-11-02 2009-05-07 Centocor, Inc. Semi-synthetic glp-1 peptide-fc fusion constructs, methods and uses
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
JP2009181819A (ja) 2008-01-31 2009-08-13 Hitachi High-Technologies Corp 荷電粒子線装置
EP2250278B1 (en) 2008-02-21 2023-04-05 Burnham Institute for Medical Research Methods and compositions related to peptides and proteins with c-terminal elements
JP4438875B2 (ja) 2008-02-27 2010-03-24 三菱自動車工業株式会社 車両の貯蔵燃料量推定装置
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
BRPI0919382A2 (pt) * 2008-09-26 2016-01-05 Roche Glycart Ag anticorpos bi-específicos anti-egfr/anti-igf-1r
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
RU2011127198A (ru) 2008-12-04 2013-01-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
JP5587975B2 (ja) 2009-04-07 2014-09-10 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異的抗−ＥｒｂＢ−３／抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体
DE102009016373A1 (de) 2009-04-07 2010-10-21 V. KRÜTTEN MEDIZINISCHE EINMALGERÄTE GmbH Verbindungsstück für den Sondenschlauch einer enteralen Ernährungssonde und Anordnung aus einer enteralen Ernährungssonde und einem enteralen Überleitsystem
WO2010115589A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
JP5612663B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-22 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ＥｒｂＢ−１／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
EP2419120A4 (en) 2009-04-08 2016-01-06 Univ California HUMAN PROTEIN CONCERNS WITH CONTROLLED SERUM PHARMACOKINETICS
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
AU2010252284A1 (en) 2009-05-27 2011-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
EP2451479B1 (en) 2009-07-06 2015-04-01 F.Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
RU2573915C2 (ru) 2009-09-16 2016-01-27 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение
DK2483310T3 (da) 2009-09-29 2014-09-01 Roche Glycart Ag Bispecifik dødsreceptor-agonistiske antistoffer
EP2519544A1 (en) 2009-12-29 2012-11-07 Emergent Product Development Seattle, LLC Polypeptide heterodimers and uses thereof
MX346731B (es) 2010-04-23 2017-03-30 Genentech Inc * Producción de proteínas heteromultiméricas.
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EA201291482A1 (ru) 2010-07-09 2013-10-30 Байоджен Айдек Хемофилия Инк. Химерные факторы коагуляции
EP2609112B1 (en) 2010-08-24 2017-11-22 Roche Glycart AG Activatable bispecific antibodies
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
CN103384681B (zh) 2010-12-23 2018-05-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 结合剂
CN103384831B (zh) 2010-12-23 2016-02-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂来检测多肽二聚体
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
JP5768147B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価抗原結合タンパク質
CN103764665A (zh) 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
DK2748202T3 (en) 2011-08-23 2018-09-17 Roche Glycart Ag BISPECIFIC ANTI-BINDING MOLECULES
PE20141521A1 (es) 2011-08-23 2014-10-25 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
CN103781801B (zh) 2011-08-23 2018-02-09 罗切格利卡特公司 包含两个Fab片段的无Fc的抗体及使用方法
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
MX354049B (es) 2011-12-21 2018-02-09 Hoffmann La Roche Método rápido para la clonación y expresión de segmentos génicos de regiones variables de anticuerpos cognados.
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
EP2855531A1 (en) 2012-05-24 2015-04-08 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
KR20150023906A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 둘 이상의 상이한 표적 독립체를 함유하는 맞춤형의 선별적인 다중특이적 치료용 분자의 선별 및 제조 방법 및 그의 용도
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
BR112014032193A2 (pt) 2012-06-27 2017-06-27 Hoffmann La Roche métodos de produção de anticorpos biespecíficos e de determinação de combinação, anticorpo biespecífico, formulação e uso de anticorpo biespecífico
KR20150036606A (ko) 2012-07-13 2015-04-07 자임워크스 인코포레이티드 항-cd3 구조체를 포함하는 이중특이적 비대칭 이형이합체
CN104619715B (zh) 2012-09-14 2018-06-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同实体的分子的生产和选择方法及其用途
EP2900696A1 (en) 2012-09-25 2015-08-05 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
MX2015012059A (es) 2013-03-15 2016-01-12 Merck Patent Gmbh Anticuerpos biespecificos tetravalentes.
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
RU2012143798A (ru) 2014-05-10
EP2552481B1 (en) 2017-02-22
BR112012024312A2 (pt) 2018-10-23
MX340124B (es) 2016-06-28
WO2011117330A1 (en) 2011-09-29
AR080793A1 (es) 2012-05-09
CN102946902A (zh) 2013-02-27
JP5726287B2 (ja) 2015-05-27
HK1182625A1 (en) 2013-12-06
RU2573588C2 (ru) 2016-01-20
EP2552481A1 (en) 2013-02-06
KR20120130276A (ko) 2012-11-29
KR101498346B1 (ko) 2015-03-03
TW201138821A (en) 2011-11-16
CN102946902B (zh) 2015-04-08
JP2013523104A (ja) 2013-06-17
US10106600B2 (en) 2018-10-23
US20110293613A1 (en) 2011-12-01
CA2789074A1 (en) 2011-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2573588C2 (ru) Биспецифические антитела
US10793621B2 (en) Nucleic acid encoding dual Fc antigen binding proteins
US10640555B2 (en) Bispecific antigen binding proteins
JP5612663B2 (ja) 二重特異性抗ＥｒｂＢ−１／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
EP2443153B1 (en) Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
RU2570633C2 (ru) Три- или тетраспецифические антитела
JP5587975B2 (ja) 二重特異的抗−ＥｒｂＢ−３／抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体
MX2013009781A (es) Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
WO2013164325A1 (en) Multispecific antigen binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration