KR101498346B1 - 이중특이성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중특이성 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

이중특이성 항체{BISPECIFIC ANTIBODIES}
본 발명은 이중특이성 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
매우 다양한 다중특이성 재조합 항체 포맷, 예를 들면, IgG 항체 포맷 및 단일쇄 영역의 융합에 의한 4가 이중특이성 항체가 최근에 개발되었다(예를 들면, 문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15, 159-163 (1997)]; WO 2001/077342 호; 및 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech. 25, 1233-1234 (2007)] 참조).
또한, 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 유지되지 않는 여러 다른 새로운 포맷, 예를 들면, 다이아(dia)-, 트라이아(tria)- 또는 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 여러 단일쇄 포맷(scFv, 비스-scFv)이 개발되었다(문헌[Holliger, P., et al., Nature Biotech 23, 1126-1136 (2005)]; 문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74, 3-14 (2007)]; 문헌[Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318, 65-74 (2007)]; 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotech. 25, 1290-1297 (2007)]).
모든 상기 포맷은 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 내지 또 다른 결합 단백질(예, scFv)에 융합되거나, 예를 들면, 2개의 Fab 단편 또는 scFv에 융합되기 위한 링커를 사용한다(문헌[Fischer, N., Leger O., Pathobiology 74, 3-14 (2007)]). 예를 들어, 천연 항체와 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 매개되는 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포독성(ADCC)과 같은 작동인자 기능을 유지하기를 원할 수 있음을 주지해야 한다.
WO 2007/024715 호에는 조작처리된 다가 및 다중특이성 결합 단백질로서 이중 가변 영역 면역글로불린이 보고되어 있다. 생물학적으로 활성인 항체 이량체의 제조 방법은 US 6,897,044 호에 보고되어 있다. 펩티드 링커를 통해 서로 연결된 4개 이상의 가변 영역을 갖는 다가 Fv 항체 구조물이 US 7,129,330 호에 보고되어 있다. 이량체 및 다량체 항원 결합 구조물은 US 2005/0079170 호에 보고되어 있다. 연결 구조에 의해 서로 공유적으로 결합된 3개 또는 4개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이성 항원-결합 단백질(상기 단백질은 천연 면역글로불린이 아니다)이 US 6,511,663 호에 보고되어 있다. WO 2006/020258 호에는 원핵 및 진핵 세포에서 효과적으로 발현될 수 있고, 치료 및 진단 방법에 유용한 4가 이중 특이성 항체가 보고되어 있다. 두가지 유형의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 하나 이상의 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 연결되지 않은 이량체로부터 하나 이상의 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 연결된 이량체를 분리하거나 선택적으로 합성하는 방법이 US 2005/0163782 호에 보고되어 있다. 이중특이성 4가 수용체는 US 5,959,083 호에 보고되어 있다. 3개 이상의 작용성 항원 결합 부위를 갖는 조작처리된 항체가 WO 2001/077342 호에 보고되어 있다.
다중특이성 및 다가 항원-결합 폴리펩티드는 WO 1997/001580 호에 보고되어 있다. WO 1992/004053 호는, 전형적으로 동일 항원 결정인자에 결합하는 IgG 부류의 단클론성 항체로부터 제조된 단독접합체가 합성 가교결합에 의해 공유 결합됨을 보고하고 있다. 항원에 대한 높은 결합활성(avidity)을 갖는 올리고머 단클론성 항체가 WO 1991/06305 호에 보고되어 있는데, 여기서 함께 결합되어 4가 또는 6가 IgG 분자를 형성하는 2개 이상의 면역글로불린 단량체를 갖는, 전형적으로 IgG 부류의 올리고머가 분비된다. 인터페론 감마 활성이 발병원인 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 양-유래 항체 및 조작처리된 항체 구조물이 US 6,360,860 호에 보고되어 있다. US 2005/0100543 호에는 이중특이성 항체의 다가 담체인 표적성 구조물이 보고되어 있다, 즉, 표적성 구조물의 각 분자는 2개 이상의 이중-특이성 항체의 담체로서 작용할 수 있다.
유전자 처리된 이중특이성 4가 항체는 WO 1995/009917 호에 보고되어 있다. WO 2007/109254 호에는 안정화된 scFv로 이루어지거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고되어 있다.
EGFR 및 IGF-1R에 대한 이중특이성 항체는 문헌[Lu, D., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 318 507-513 (2004)]; 문헌[Lu, D., et al., Biol. Chem., 279 2857-2865 (2004)]; 및 문헌[Lu, D., et al., J. Biol. Chem., 280 19665-19672 (2005)]으로부터 알려져 있다.
US 2007/0274985 호는 2개 이상의 단일쇄 항체 분자가 결합된, 헤테로머성(heteromeric) 항체를 포함한 이량체에 또한 결합될 수 있는 단일쇄 Fab(scFab) 단백질을 포함하는 합성 항체 분자에 관한 것이다.
WO 2009/080253 호는 이중특이성 2가 항체에 관한 것이다.
그러나, 다중특이성 항체의 다양한 문제 및 양태들(예를 들면, 약동학적 및 생물학적 성질, 안정성, 응집성, 발현 수율, 부산물)을 고려하여, 또 다른 대안적인 다중특이성 항체 포맷에 대한 요구가 존재한다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이다:
(a) 1차 항원에 특이적으로 결합하는 1차 전장(full length) 항체의 중쇄 및 경쇄;
(b) 중쇄의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된, 2차 항원에 특이적으로 결합하는 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 상기 (a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 영역 및 상기 (b)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 영역이 각각 항체 CH3 영역들 사이의 원래의 계면에서의 변형을 포함하는 계면에서 만나고, 이때 (i) 한 중쇄의 CH3 영역에서, 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써 다른 중쇄의 CH3 영역의 계면 내의 공간(cavity)에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 영역의 계면 내에 돌출부를 형성하고, (ii) 다른 중쇄의 CH3 영역에서, 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어 1차 CH3 영역의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 2차 CH3 영역의 계면 내에 공간을 형성하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 양쪽 CH3 영역 사이에 다이설파이드 가교가 형성될 수 있도록 두 CH3 영역이 모두 각 CH3 영역의 상응하는 위치에서의 아미노산으로 시스테인(C)의 도입에 의해 더 변형되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 상기 (b)의 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)이 다음 위치들 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 다이설파이드 안정화되는 것을 특징으로 한다:
(i) 중쇄 가변 영역 위치 44 대 경쇄 가변 영역 위치 100,
(ii) 중쇄 가변 영역 위치 105 대 경쇄 가변 영역 위치 43, 또는
(iii) 중쇄 가변 영역 위치 101 대 경쇄 가변 영역 위치 100.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 항체가 IgG1의 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 항체가 Asn297에서 당 쇄로 글리코실화되는 것을 특징으로 하고, 이때 당 쇄내의 푸코스의 양은 65% 이하이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물, 암을 치료하기 위한 상기 조성물, 암의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 상기 이중특이성 항체의 용도, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 이중특이성 항체를 투여함으로써 암에 걸린 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 쇄를 암호화하는 핵산 분자이다.
본 발명은 또한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현할 수 있는, 본 발명에 따른 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 재조합 생산을 위한 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다.
본 발명은 또한, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 상기 이중특이성 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 제조 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 이중특이성 항체를 제조하기 위한 상기 방법에 의해 수득된 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 제조 방법이다:
(a) aa) 1차 항원에 특이적으로 결합하는 1차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄; 및 ab) 중쇄의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된, 2차 항원에 특이적으로 결합하는 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
(b) 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계.
본 발명에 따른 이중특이성 항체가 포유동물 세포(예를 들면, HEK293 세포 및 CHO 세포)에서의 우수한 발현 수율, 안정성, 생물학적 또는 약리학적 활성, 약동학적 성질과 같은 유용한 특성들을 갖는 것이 밝혀졌다. 이들은, 예를 들면, 암과 같은 질환의 치료에 사용될 수 있다. 3개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 본 발명에 따른 상기 이중특이성 항체들은 특히 포유동물 세포에서의 발현시 유용한 부산물 프로필을 갖는다.
도 1은 전형적인 순서로 가변 및 불변 영역을 포함하는 두 쌍의 중쇄 및 경쇄를 갖는 1차 항원 1에 특이적으로 결합하는 CH4 영역을 갖지 않는 전장 항체의 도식적 구조이다.
도 2는 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 도식적 구조이다.
도 3a 및 3b는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형된 CH3 영역을 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 도식적 구조이다.
도 4a 및 4b는 놉-인투-홀 변형된 CH3 영역, 및 2차 항체 중쇄 및 경쇄의 VH 및 VL 영역의 다이설파이드 안정화를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 도식적 구조이다.
도 5는 본 발명에 따른 이중특이성 항체 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06에 의한 HUVEC 증식의 억제를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 이중특이성 항체 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06에 의한 Tie2 포스포릴화의 억제를 나타낸 것이다.
도 7은 OA-Ak18-scFab-GA201(도 7a) 및 OA-GA201-scFab-Ak18(도 7b)의 웨스턴 블롯(환원) 결과이다.
도 8은 단일특이성 모항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18 또는 <EGFR>ICR62와 비교하여 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT(용량-의존적)에 의한 H322M 암 세포의 성장 억제를 나타낸 것이다.
도 9는 비아코어(Biacore)(표면 플라스몬 공명)-센소그램(Sensogram)이다: 이중특이성 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 아민 커플링된 인간 EGFR 및 인간 IGF1R의 동시 결합을 나타내었다(x-축: 공명, y-축: 시간).
도 10은 단일특이성 모 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18 또는 <EGFR>ICR62와 비교한 OA-GA201-scFab-Ak18_WT에 의한 BxPC3 이종이식(Xenograft) 모델에서 종양 성장 억제를 나타낸 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이다:
(a) 1차 항원에 특이적으로 결합하는 1차 전장(full length) 항체의 중쇄 및 경쇄;
(b) 중쇄의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된, 2차 항원에 특이적으로 결합하는 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄.
용어 "전장 항체"는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 이루어지는 항체를 의미한다(도 1 참조). "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항체 중쇄 가변 영역(VH), 항체 불변 중쇄 영역 1(CH1), 항체 힌지(hinge) 영역(HR), 항체 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 영역 3(CH3)(VH-CH1-HR-CH2-CH3으로 약칭); 및 서브클래스(subclass) IgE의 항체인 경우 선택적으로 항체 중쇄 불변 영역 4(CH4)로 이루어지는 폴리펩티드이다. 바람직하게, "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어지는(VL-CL로 약칭) 폴리펩티드이다. 항체 경쇄 불변 영역(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 2개의 전장 항체 쇄는 CL 영역과 CH1 영역 사이에 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역들 사이에 폴리펩티드간 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 IgG(예를 들면, IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 천연 항체이다. 본 발명에 따른 전장 항체는 단일 종, 예를 들면, 인간으로부터 유래될 수 있거나, 또는 이들은 키메라화 또는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는, 둘다 동일 항원에 특이적으로 결합하는, 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 각각 형성된 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서의 마지막 아미노산을 의미한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서의 마지막 아미노산을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "펩티드 링커"는 바람직하게는 합성 기원을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미한다. 본 발명에 따른 이들 펩티드는 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단을 2차 전장 항체(2차 항원에 특이적으로 결합하는)의 중쇄의 N-말단에 연결시키기 위해 사용된다. 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄를 갖는 펩티드 링커는 30개 이상의 아미노산의 길이, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 양태에서, 펩티드 링커는 32 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 태양에서, 상기 링커는 (GxS)n으로, 여기서 G는 글라이신이고, S는 세린이고, (x는 3, n은 8, 9 또는 10, 및 m은 0, 1, 2 또는 3)이거나 (x는 4, n은 6, 7 또는 8, 및 m은 0, 1, 2 또는 3)이고, 바람직하게 x는 4이고 n은 6 또는 7이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고, 보다 바람직하게는 x는 4이고, n은 7이고 m은 2이다. 한 태양에서, 상기 링커는 (G4S)6G2이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 이중특이성 항체의 CH3 영역은 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 기술에 의해 변형될 수 있고, 상기 기술은 예를 들면, WO 96/027011 호 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9, 617-621 (1996)]; 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16, 677-681 (1998)]에 여러 예와 함께 상세히 기술되어 있다. 상기 방법에서는, 2개의 CH3 영역의 상호작용 표면이 상기 2개의 CH3 영역을 함유하는 두 중쇄의 헤테로이량체화를 증가시키도록 변형된다. (두 중쇄의) 2개의 CH3 영역은 각각 "놉"일 수 있는 한편, 다른 하나는 "홀"일 수 있다. 다이설파이드 가교의 도입은 헤테로이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16, 677-681 (1998)]; 문헌[Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270, 26-35 (1997)]), 수율을 증가시킨다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 또한, 한 중쇄의 CH3 영역 및 다른 중쇄의 CH3 영역이 각각 항체 CH3 영역들 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 만나고; 이때 상기 계면은 이중특이성 항체의 생성을 촉진하기 위해 변형되고, 상기 변형은 (a) 한 중쇄의 CH3 영역이 변형되어, 이중특이성 항체내의 다른 중쇄의 CH3 영역의 원래 계면과 만나는 한 중쇄의 CH3 영역의 원래 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써 다른 중쇄의 CH3 영역의 계면내의 공간에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 영역의 계면내에 돌출부를 생성하고, (b) 다른 중쇄의 CH3 영역이 변형되어, 이중특이성 항체내의 1차 CH3 영역의 원래 계면과 만나는 2차 CH3 영역의 원래 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써 1차 CH3 영역의 계면내의 돌출부가 위치할 수 있는 2차 CH3 영역의 계면내에 공간을 생성하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 상기 (a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 영역 및 상기 (b)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 영역이 각각 항체 CH3 영역들 사이의 원래 계면에서의 변형을 포함하는 계면에서 만나고, 이때 (i) 한 중쇄의 CH3 영역에서, 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써 다른 중쇄의 CH3 영역의 계면 내의 공간에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 영역의 계면 내에 돌출부를 형성하고, (ii) 다른 중쇄의 CH3 영역에서, 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써 1차 CH3 영역의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 2차 CH3 영역의 계면 내에 공간을 형성하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V)으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 한 양태에서, 두 CH3 영역은 모두, 두 CH3 영역 사이에 다이설파이드 가교가 생성될 수 있도록 각각의 CH3 영역의 상응하는 위치에 아미노산으로 시스테인(C)의 도입에 의해 추가로 변형된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 영역에 T366W 돌연변이를 포함하고, "홀 쇄"의 CH3 영역에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, "놉 쇄"의 CH3 영역내에 Y349C 돌연변이를 도입하고 "홀 쇄"의 CH3 영역내에 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써, CH3 영역 사이에 추가의 쇄간 다이설파이드 가교를 또한 사용할 수 있다(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16, 677-681 (1998)]).
또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 두 CH3 영역 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이, 및 두 CH3 영역의 다른 하나에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 이중특이성 항체는 두 CH3 영역 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이, 및 두 CH3 영역의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다(하나의 CH3 영역에서 추가의 Y349C 돌연변이 및 다른 CH3 영역에서 추가의 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 다이설파이드 가교를 형성한다)(번호는 항상 카밧(Kabat)의 EU 지수에 따른다). 그러나, 또한 EP 1870459 A1 호에 기술된 바와 같은 다른 놉-인-홀 기술에 대안적으로 또는 추가적으로 사용할 수 있다. 따라서, 이중특이성 항체의 또 다른 예는 "놉 쇄"의 CH3 영역에서 R409D; K370E 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 영역에서 D399K; E357K 돌연변이이다(번호는 항상 카밧의 EU 지수에 따른다).
또 다른 태양에서, 이중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 영역에 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 영역에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 추가적으로 "놉 쇄"의 CH3 영역에 R409D; K370E 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 영역에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다.
또 다른 태양에서, 이중특이성 항체는 두 CH3 영역 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이, 및 두 CH3 영역의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 이중특이성 항체는 두 CH3 영역 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이, 및 두 CH3 영역의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 및 추가적으로 "놉 쇄"의 CH3 영역에 R409D; K370E 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 영역에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다.
한 태양에서, (2차 항원에 특이적으로 결합하는) 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 위치 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 안정화된다:
i) 중쇄 가변 영역 위치 44 대 경쇄 가변 영역 위치 100,
ii) 중쇄 가변 영역 위치 105 대 경쇄 가변 영역 위치 43, 또는
iii) 중쇄 가변 영역 위치 101 대 경쇄 가변 영역 위치 100(번호는 항상 카밧의 EU 지수에 따른다).
한 태양에서, (2차 항원에 특이적으로 결합하는) 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 위치: 중쇄 가변 영역 위치 44 대 경쇄 가변 영역 위치 100 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 다이설파이드 안정화된다.
상기 또 다른 다이설파이드 안정화는 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 VH 및 VL 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 달성된다. 단일쇄 Fv의 안정화를 위해 비천연 다이설파이드 가교를 도입하는 기술은, 예를 들면, WO 94/029350 호, 문헌[Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. 10, 1453-1459 (1997)]; 문헌[Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393 (1998)]; 또는 문헌[Schmidt, M., et al., Oncogene 18, 1711-1721 (1999)]에 기술되어 있다. 한 태양에서, 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들 사이의 선택적 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 영역 위치 44와 경쇄 가변 영역 위치 100 사이에 존재한다. 한 태양에서, 상기 가변 영역들 사이의 선택적 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 영역 위치 105와 경쇄 가변 영역 위치 43 사이에 존재한다(번호는 항상 카밧의 EU 지수에 따른다).
한 태양에서, 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 VH 및 VL 사이에 상기 선택적 다이설파이드 안정화를 갖는 본 발명에 따른 이중특이성 항체가 바람직하다.
한 태양에서, 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 VH 및 VL 사이에 상기 선택적 다이설파이드 안정화를 갖지 않는 본 발명에 따른 이중특이성 항체가 바람직하다.
본 발명에 따른 이중특이성 항체의 두 부분 모두 항원-결합 부위를 포함한다(1차 전장 항체 중쇄 및 경쇄는 하나의 항원 결합 부위를 포함하고, 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다). 본원에서 사용된 용어 "결합 부위" 또는 "항원-결합 부위"는 각각의 항원이 실질적으로 결합하는 본 발명에 따른 상기 이중특이성 항체의 영역을 의미한다. 1차 전장 항체중쇄 및 경쇄, 및 2차 전장 항체 중쇄 및 경쇄에서 항원 결합 부위는 각각 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)으로 이루어진 쌍에 의해 형성된다.
목적 항원(예, EGFR)에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 항원에 대해 공지된 항체(예, 항-EGFR 항체)로부터, 또는 (b) 무엇보다 항원 단백질 또는 핵산 또는 그의 단편을 사용하는 신생 면역화 방법에 의해 또는 파지 디스플레이에 의해 수득된 새로운 항체 또는 항체 단편으로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 항체의 항원-결합 부위는 항원에 대한 결합 부위의 친화도에 다양한 정도로 기여하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 3개의 중쇄 가변 영역 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 영역 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. CDR 및 프레임워크 영역(framework region, FR)의 크기는 상기 영역들이 서열들중 가변성에 따라 정의된 아미노산 서열의 편집된 데이터베이스와 비교하여 결정된다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 말한다. 예를 들면, 천연 항체는 단일특이성이다. 본원에서 사용된 용어 "이중특이성" 항체는 2개 이상의 항원-결합 부위를 가지고 2개의 상이한 항원 또는 동일 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명에 따른 "이중특이성" 항체는 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 한 태양에서, 본 발명의 항체는 2개의 상이한 항원, 즉, 1차 항원으로 VEGF 및 2차 항원으로 ANG-2에 대해, 또는 예를 들면, 1차 항원으로 EGFR 및 2차 항원으로 IGF-1R에 대해 이중특이성이거나, 그 반대도 가능하다.
본원에서 사용된 용어 "단일특이성" 항체는 그 각각이 동일 항원의 동일 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다.
본 출원에 사용된 용어 "-가"는 항체 분자에 특정 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 따라서, 용어 "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 항체 분자중에 각각 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 의미한다. 예를 들어, 천연 항체, 또는 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 2개의 결합 부위를 가지고 2가이다.
본원에서 사용된 용어 "EGFR"은 c-erbB 원발암유전자(proto-oncogene)에 의해 암호화된 170 kDa 막횡단 수용체이고 내재성 티로신 키나제 활성을 나타내는 인간 표피 성장 인자 수용체(HER-1 또는 Erb-B1으로도 알려져 있음, 서열번호: 13)를 말한다(문헌[Modjtahedi H., et al., Br. J. Cancer 73, 228-235(1996)]; 문헌[Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94, 1593-1611 (2002)]. 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스 등록물 P00533은 EGFR의 서열을 제공하고 있다. 스위스프롯 데이터베이스 등록 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3 및 P00533-4에 의해 확인된 것들을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) EGFR의 이소형(isoform) 및 변이체(예를 들면, 대안적 RNA 전사체, 절두형(truncated), 다형체 등)도 또한 존재한다. EGFR은 리간드, 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 암피레귤린, 헤파린-결합 EGF(hb-EGF), 베타셀룰린 및 에피레귤린에 결합하는 것으로 알려져 있다(문헌[Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94, 1593-1611 (2002)]; 문헌[Mendelsohn, J., and Baselga, J., Oncogene 19, 6550-6565(2000)]). EGFR은 세포 증식, 분화, 세포 생존, 세포사멸(apoptosis), 혈관신생(angiogenesis), 미토게네시스(mitogenesis) 및 전이를 제어하는 신호 전달 경로의 활성화를 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 티로신-키나제 매개 신호 전환 경로를 통한 많은 세포 과정들을 조절한다(문헌[Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14, 1346-1363 (2003)]; 문헌[Tsao, A.S., and Herbst, R.S., Signal 4, 4-9 (2003)]; 문헌[Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94, 1593-1611 (2002)]; 및 문헌[Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73, 228-235 (1996)]).
본원에서 사용된 용어 "IGF-1R"은 막횡단 단백질 티로신 키나제 부류에 속하는 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR, CD 221 항원; 서열번호: 14)이다(문헌[LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16, 143-163 (1995)]; 및 문헌[Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57, 1050-1063 (2000)]). 스위스프롯 데이터베이스 등록물 P08069는 IGF-1R의 서열을 제공하고 있다. IGF-IR은 IGF-I과 고친화도하에 결합하여 생체내에서 상기 리간드에 대한 생리학적 반응을 개시한다. IGF-IR은 또한 IGF-II에도 결합하지만, 약간 더 낮은 친화도하에 결합한다. IGF-IR의 과발현은 세포의 종양 전환을 촉진하고, IGF-IR이 세포의 악성 전환에 수반되므로 암의 치료를 위한 치료제의 개발에 유용한 표적이라는 증거가 존재한다(문헌[Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57, 1050-1063 (2000)]).
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합한다(즉, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체이다). 이중특이성 항체는 인간 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587; WO 2005/005635 호, <IGF-1R>클론 18 또는 <IGF-1R>AK18로 약칭) 및 인간화 <EGFR>ICR62(WO 2006/082515 호, <EGFR>ICR62로 약칭)의 항원-결합 부위를 기초로 한다. 상기 이중특이성 2가 항체의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열들은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3(OA-Ak18-scFab-GA201에 대해); 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7(OA-GA201-scFab-Ak18에 대해); 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4(OA-Ak18-scFab-GA201_WT에 대해); 및 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 8(OA-GA201-scFab-Ak18_WT에 대해)에 나타내었다.
본 발명에 따른 이중특이성 <EGFR-IGF-1R> 항체는 EGFR 및 IGF-1R 표적 치료법을 필요로 하는 인간 환자에 대해 이점을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체는 상기와 같은 질환, 특히 암을 앓고 있는 환자에 대해 이점을 제공하는 매우 유용한 성질을 갖는다. 본 발명에 따른 이중특이성 <EGFR-IGF-1R> 항체는, 예를 들면, 단일특이성 모 <IGF-1R> 항체에 비해 IGF-1R 수용체의 내재화의 감소를 나타낸다. 또한, 이들은 항원 EGFR 및 IGF-1R을 둘 다 발현하는 암을 앓고 있는 환자에 대해 효능/독성 비와 관련하여 이점을 나타내는 두 항원 EGRF 및 IGF-1R 둘 다를 발현하는 종양 세포의 우수한 표적화를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 한 태양에서, 이중특이성 항체는 항-IGF-1R/항-EGFR 항체이고, 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 태양에서, 이중특이성 항체는 항-IGF-1R/항-EGFR 항체이고, 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 태양에서, 이중특이성 항체는 항-IGF-1R/항-EGFR 항체이고, 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 태양에서, 이중특이성 항체는 항-IGF-1R/항-EGFR 항체이고, 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체이다.
본 발명의 한 태양에서, 이중특이성 항체는 항-IGF-1R/항-EGFR 항체이고, (a) 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나; (d) 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 태양에서, 상기 이중특이성 항체 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 하기의 성질(실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 분석으로 측정) 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 IGF-1R의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 EGFR의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R>HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)에 비해 IGF-1R의 하향조절을 50% 이상 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 7의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 8의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR3H에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 7의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR3H에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 8의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 7의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되고; 하기 성질(실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 분석으로 측정)중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 IGF-1R의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 EGFR의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R>HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)에 비해 IGF-1R의 하향조절을 50% 이상 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 8의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되고; 하기 성질(실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 분석으로 측정)중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 IGF-1R의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 EGFR의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R>HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)에 비해 IGF-1R의 하향조절을 50% 이상 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR3H에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 7의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되고; 하기 성질(실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 분석으로 측정)중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 IGF-1R의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 EGFR의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R>HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)에 비해 IGF-1R의 하향조절을 50% 이상 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고, 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 CDR3H에 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 가지고, 결합 친화도의 KD 값은 서열번호: 8의 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되고; 하기 성질(실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 분석으로 측정)중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 한다:
- 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 IGF-1R의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 H322M 종양 세포상에서 5 nM 이하(바람직하게는 2 nM 이하)의 IC50 하에 EGFR의 포스포릴화를 억제한다;
- 이중특이성 항-IGF-1R/항-EGFR 항체는 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R>HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)에 비해 IGF-1R의 하향조절을 50% 이상 감소시킨다.
결합 친화도의 KD 값이 비돌연변이 아미노산 서열의 결합 친화도의 KD 값과 비교할 때 같거나 4배 미만으로 감소되는 서열번호: 7 또는 서열번호: 8의 CDR3H에서의 아미노산 잔기 치환의 예는, 예를 들면, EP 10166860.6 호에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "VEGF"는, 예를 들면, 문헌[Leung, D.W., et al., Science 246, 1306-1309 (1989)]; 문헌[Keck, P.J., et al., Science 246, 1309-1312 (1989)]; 및 문헌[Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264, 20017-20024 (1989)]에 기술되어 있는 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF/VEGF-A)(서열번호: 15)이다. VEGF는 종양 및 안구내 질환과 관련된 정상 및 비정상 혈관신생 및 신혈관형성(neovascularization)의 조절에 수반된다(문헌[Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18, 4-25 (1997)]; 문헌[Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91, 153-159 (1993)]; 문헌[Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26, 86-91 (1995)]; 문헌[Brsown, L.F., et al., Cancer Res. 53, 4727-4735 (1993)]; 문헌[Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73, 931-934 (1996)]; 및 문헌[Dvorak, H., et al., Am. J. Pathol. 146, 1029-1039 (1995)]). VEGF는 여러 공급원으로부터 분리된 동종이량체 당단백질이다. VEGF는 내피 세포에 대해 매우 특이적인 미토겐 활성을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "ANG-2"는 문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277, 55-60 (1997)]; 및 문헌[Cheung, A.H., et al., Genomics 48, 389-391 (1998)]에 기술된 인간 안지오포이에틴-2(ANG-2)(대안적으로, ANGPT2 또는 ANG2로 약칭됨)이다. 안지오포이에틴-1 및 -2 및 ANG-2는 혈관 내피 내에서 선택적으로 발현되는 티로신 키나제의 한 부류인 Tie에 대한 리간드로서 발견되었다(문헌[Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407, 242-248 (2000)]). 현재 안지오포이에틴 부류의 4가지의 확정된 구성원이 존재한다. 안지오포이에틴-3 및 -4(Ang-3 및 Ang-4)는 마우스와 인간에서 동일한 유전자좌의 광범위하게 나뉜 대응물을 나타낼 수 있다(문헌[Kim, I., et al., FEBS Let, 443, 353-356 (1999)]; 문헌[Kim, I., et al., J Biol Chem 274, 26523-26528 (1999)]). ANG-1 및 ANG-2는 원래 조직 배양 시험에서 각각 작용물질 및 길항물질로서 확인되었다(예를 들면, ANG-1에 대해서는 문헌[Davis, S., et al., Cell 87, 1161-1169 (1996)] 참조; 및 ANG-2에 대해서는 문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277, 55-60 (1997)] 참조). 알려져 있는 안지오포이에틴은 모두 Tie2에 주로 결합하고, Agn-1 및 -2 둘 다 Tie2에 3 nM(Kd)의 친화도하에 결합한다(문헌[Maisonpierre, P.C., et al., Science 277, 55-60 (1997)]).
바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 상기 이중특이성 항체는 인간 VEGF 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합한다(즉, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 이중특이성 항-VEGF/항-ANG-2 항체이다). 이중특이성 항체는 바람직하게는 항-VEGF 항체 베바시주맙 및 ANG2i-LC06(WO 2010/040508 호(PCT 출원번호 PCT/EP2009/007182 호)에 기술되어 있고 파지 디스플레이를 통해 수득되었음)의 항원-결합 부위를 기초로 한다. 이들 이중특이성 2가 항체의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS에 대해), 및 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 12(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06에 대해)에 나타내었다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 VEGF에 특이적으로 결합하고 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 ANG-2에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, (a) 1차 전장 항체가 VEGF에 특이적으로 결합하고 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고; (b) 2차 전장 항체가 ANG-2에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때, 상기 연결된 중쇄 및 경쇄는 서열번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 이중특이성 항체는 항-VEGF/항-ANG-2 항체이고, 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 이중특이성 항체는 항-VEGF/항-ANG-2 항체이고, 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 전장 항체는 하나 이상의 면역글로불린 부류의 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 면역글로불린 부류로는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 이소타입(isotype), 및 IgG 및 IgA의 경우 그의 아형이 포함된다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 전장 항체는 IgG 유형 항체의 불변 영역 구조를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 분자의 제제를 말한다.
용어 "키메라성 항체"는 한 공급원 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉, 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는, 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항체를 말한다. 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라성 항체"의 다른 바람직한 형태는 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 원래 항체로부터 변형되거나 변화된 형태이다. 상기 키메라성 항체는 또한 "부류-전환 항체"로도 지칭된다. 키메라성 항체는 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 절편 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 절편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라성 항체를 제조하는 방법은 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술을 포함하고 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Morrision, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호 참조).
용어 "인간화된 항체"는 프레임워크 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린과 비교할 때 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 말한다. 바람직한 태양에서, 뮤린 CDR은 "인간화 항체"를 제조하기 위해 인간 항체의 프레임워크 영역내에 그래프트된다(예를 들면, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (1988)]; 및 문헌[Neuberger, M.S., et al., Nature 314, 268-270 (1985)] 참조). 특히 바람직한 CDR은 키메라성 항체에 대해 상기 언급한 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체"의 다른 형태는, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여, 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변화된 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지되어 있다(문헌[van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 368-374 (2001)]). 인간 항체는 또한, 면역화시 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리 또는 선택부분을 생성할 수 있는 유전자전이 동물(예를 들면, 마우스)에서 생성될 수 있다. 상기 생식 계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 배열의 전이는 항원 자극시 인간 항체의 생성을 야기할 것이다(예를 들면, 문헌[Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-2555 (1993)]; 문헌[Jakobovits, A., et al., Nature 362, 255-258 (1993)]; 문헌[Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7, 33-40 (1993)] 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R., and Winter, G.J., Mol. Biol. 227, 381-388 (1992)]; 문헌[Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)]). 콜(Cole) 등 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술은 또한 인간 단클론성 항체의 제조에 이용가능하다(문헌[Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 및 문헌[Boerner, P., et al., J. Immunol. 147, 86-95 (1991)]). 본 발명에 따른 키메라 및 인간화 항체에 대해 이미 언급했듯이, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 또한, 예를 들면, "부류 전환", 즉, Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들면, IgG1으로부터 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이로)에 의해, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련하여, 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역에서 변형된 상기 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생산되거나 단리된 모든 인간 항체, 예를 들면, NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자를 위해 유전자전이성인 동물(예, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포내에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함하는 것이다. 상기 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 가변 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과돌연변이에 적용되었다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 그와 관련되긴 하지만, 생체내에서 인간 항체 생식 계열 레퍼토리 내에 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "가변 영역"(경쇄의 가변 영역(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 수반되는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 의미한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 영역들은 동일한 일반 구조를 가지고, 각각의 영역은 그 서열이 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 광범위하게 보존, 연결되는 4개의 프레임워크(FR) 영역들을 포함한다. 프레임워크 영역은 β-시트 형태를 취하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄 중의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 그의 3차원 구조로 유지되고 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화도에 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 또 다른 목적을 제공한다.
용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합부"는 본원에서 사용되는 경우, 항원-결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 이외의 다른 가변 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서 C-말단까지 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 쇄에 있어 CDR은 상기 프레임워크 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3은 주로 항원 결합에 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의에 따라 결정된다.
본원에서 사용된 용어 "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한"은 시험관내 분석에서, 바람직하게는 정제된 야생형 항원을 사용한 플라스몬(plasmon) 공명 분석(비아코어(BIAcore), 지이헬스케어(GE Healthcare), 스웨덴 웁살라)에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 말한다. 결합 친화도는 ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대해 일정한 척도), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)에 의해 결정된다. 한 태양에서, 결합 또는 특이적 결합은 10-8 몰/l 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 몰/l의 결합 친화도(KD)를의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 10-8 몰/l 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 몰/l의 결합 친화도(KD)하에 특이적인 각각의 항원에 특이적으로 결합한다.
FcγRIII에 대한 항체의 결합은 비아코어 분석법(지이헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)에 의해 조사할 수 있다. 결합 친화도는 용어 ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)로 정의된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 특정 태양에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 군들을 포함하고, 특정 태양에서 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
특정 태양에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물중에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
본 출원에 사용된 용어 "불변 영역"은 가변 영역이 아닌 항체의 영역들의 전부를 의미한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접 수반되지는 않지만, 다양한 작동인자 기능을 나타낸다. 그 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체는 다음 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 여러 개가 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 서브클래스로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 5개 항체 부류 모두에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역(CL)은 κ(카파) 및 λ(람다)로 지칭된다.
본 출원에 사용된 용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역"은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 의미한다. 상기 불변 영역은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 카밧(Kabat, E.A.)에 의해 기술되었다(예를 들면, 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28, 214-218 (2000)]; 문헌[Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 2785-2788 (1975)] 참조).
용어 "보체-의존성 세포독성(CDC)"은 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된 과정을 의미한다. 항체에 대한 C1q의 결합은 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 상기 Fc 부분 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있다(상기 참조). 상기 Fc 부분 결합 부위는, 예를 들면, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(번호는 카밧의 EU 지수에 따른다)에 의해 규정된다. 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 통상적으로 C1q 및 C3 결합을 포함한 보체 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않고 C1q 및/또는 C3에 결합하지 않는다.
IgG4 서브클래스의 항체가 감소된 Fc 수용체(FcγRIIIa) 결합을 나타내는 반면, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435는, 변형되는 경우, 또한 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 잔기들이다(문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001)]; 문헌[Lund, J., et al., FASEB J. 9, 115-119 (1995)]; 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86, 319-324 (1995)]; EP 0 307 434 호).
한 태양에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG1 항체에 비해 감소된 FcR 결합을 가지고, 전장 모 항체는 S228, L234, L235 및/또는 D265에 돌연변이를 갖는 IgG4 서브클래스 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 FcR 결합과 관련되고/되거나 PVA236 돌연변이를 함유한다. 한 태양에서, 전장 모 항체에서의 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236이다. 또 다른 태양에서, 전장 모 항체에서의 돌연변이는 IgG4 S228P 및 L235E에서 및 IgG1 L234A 및 L235A에서 일어난다.
또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 상기 전장 항체가 인간 IgG1 서브클래스의 항체임을 특징으로 한다.
용어 "항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)"은 작동인자 세포의 존재하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용해를 말한다. ADCC는 바람직하게는, 새로 단리된 PBMC와 같은 작동인자 세포 또는 백혈구 연층으로부터 정제된 작동인자 세포, 예를 들면, 단구 또는 자연 살해(NK) 세포 또는 영구적으로 성장하는 NK 세포주와 같은 작동인자 세포의 존재하에 본 발명에 따른 항체로 EGFR 및 IGF-1R 발현 세포의 제제를 처리함으로써 측정된다.
용어 "보체-의존성 세포독성(CDC)"은 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된 과정을 의미한다. 항체에 대한 C1q의 결합은 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 상기 Fc 부분 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있다(상기 참조). 상기 Fc 부분 결합 부위는, 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(번호는 카밧의 EU 지수에 따른다)에 의해 규정된다. 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 통상적으로 C1q 및 C3 결합을 포함한 보체 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않고 C1q 및/또는 C3에 결합하지 않는다.
항체의 불변 영역은 ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성) 및 CDC(보체-의존성 세포독성)에 직접 수반된다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 불변 영역에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 항체에 대한 C1q의 결합은 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 상기 불변 영역 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127, 2555-2560 (1981)]; 문헌[Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16, 907-917 (1979)]; 문헌[Burton, D.R., et al., Nature 288, 338-344 (1980)]; 문헌[Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37, 995-1004 (2000)]; 문헌[Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164, 4178-4184 (2000)]; 문헌[Hezareh, M., et al., J. Virol. 75, 12161-12168 (2001)]; 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86, 319-324 (1995)] 및 EP 0 307 434 호에 기술되어 있다. 상기 불변 영역 결합 부위는, 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(번호는 카밧의 EU 지수에 따른다)에 의해 규정된다.
한 태양에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 바람직하게는 인간 기원으로부터 유래된 IgG1 또는 IgG3 서브클래스(바람직하게는 IgG1 서브클래스)의 불변 영역을 포함한다. 한 태양에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 바람직하게는 인간 기원으로부터 유래된 IgG1 또는 IgG3 서브클래스(바람직하게는 IgG1 서브클래스)의 Fc 부분을 포함한다.
단클론성 항체의 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)은 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180 (1999)] 및 US 6,602,684 호에 기술된 바와 같이 그의 올리고사카라이드 성분을 조작처리함으로써 향상될 수 있다. 가장 보편적으로 사용되는 치료용 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 영역에서 Asn297에 보존된 N-결합 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 결합된 2개의 복합 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드는 CH2 영역 사이에 혼입되어 폴리펩티드 골격과 광범위한 접촉을 형성하고, 그의 존재는 항체가 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)과 같은 작동인자 기능을 매개하는데 필수적이다(문헌[Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995)]; 문헌[Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163, 59-76 (1998)]; 문헌[Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15, 26-32 (1997)]). 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180 (1999)] 및 WO 99/54342 호는 이등분된 올리고사카라이드의 생성을 촉진하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III("GnTIII")의 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 과발현이 항체의 시험관내 ADCC 활성을 상당히 증가시킴을 밝혔다. Asn297 탄수화물의 조성에서의 변형 또는 그의 제거도 또한 FcγR 및 C1q에 대한 결합에 영향을 미친다(문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180 (1999)]; 문헌[Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74, 288-294 (2001)]; 문헌[Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276, 45539-45547 (2001)]; 문헌[Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276, 16478-16483 (2001)]; 문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001)]; 문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277, 26733-26740 (2002)]; 및 문헌[Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263, 133-147 (2002)]).
푸코스의 양을 감소시켜 단클론성 항체의 세포-매개 작동인자 기능을 증대시키는 방법은, 예를 들면, WO 2005/018572 호, WO 2006/116260 호, WO 2006/114700 호, WO 2004/065540 호, WO 2005/011735 호, WO 2005/027966 호, WO 1997/028267 호, US 2006/0134709 호, US 2005/0054048 호, US 2005/0152894 호, WO 2003/035835 호, WO 2000/061739 호, 문헌[Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306, 151-160 (2005)]; 문헌[Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem., 278, 3466-3473 (2003)], WO 03/055993 호 또는 US 2005/0249722 호에 기술되어 있다.
인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 코어 푸코실화 바이안테너리 복합 올리고사카라이드 글리코실화가 2개 이하의 Gal 잔기로 종결되기 때문에 Asn297에서 일어난다. IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 인간 불변 중쇄 영역은 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]; 및 문헌[Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166, 1351-1361 (1987)]; 문헌[Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178, 515-527 (1989)]에 상세히 보고되어 있다. 이들 구조는 말단 Gal 잔기의 양에 따라, G0, G1(α-1,6- 또는 α-1,3-) 또는 G2 글리칸 잔기로 지칭된다(문헌[Raju, T.S., Bioprocess Int. 1, 44-53 (2003)]). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는, 예를 들면, 문헌[Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14, 201-207 (1997)]에 기술되어 있다. 비-글리코변형된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 항체는 통상적으로 85% 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다. 전장 모 항체의 변형된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 바람직하게, 이등분, 환원/비-푸코실화 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 또 다른 태양에서, 이등분, 환원/비-푸코실화 올리고사카라이드는 복합체이다.
본 발명에 따라서, "푸코스의 양"은 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정되고 평균값으로 계산된, Asn297에 결합된 모든 글리코구조물(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 총합에 대하여, Asn297에서 당쇄내 상기 당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 MALDI-TOF에 의해 N-글리코시다제 F 처리된 샘플에서 확인된 모든 글리코구조물(예를 들면, 각각 복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조물)에 대한 푸코스-함유 구조물의 비율이다
본 발명에 따른 이중특이성 <EGFR-IGF-1R> 항체는 그의 모 <EGFR> 및/또는 <IGF-1R> 항체에 비해 EGFR 및 IGF-1R 수용체의 내재화의 감소를 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 바람직한 한 태양에서, 이중특이성 <EGFR-IGF-1R> 항체는 Asn297에서 당쇄로 글리코실화되는데(IgG1 또는 IgG3 서브클래스, 바람직하게는 IgG1 서브클래스), 이때 상기 당쇄 내 푸코스의 양은 65% 이하이다(번호는 카밧에 따른다). 또 다른 태양에서, 상기 당쇄 내 푸코스의 양은 5 내지 65%, 바람직하게는 20 내지 40%이다. 본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역에서 대략 위치 297에 위치한 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 미미한 서열 변이를 기준으로, Asn297은 또한 위치 297의 일부 아미노산(통상적으로 ±3개 이하의 아미노산) 상위 또는 하위에, 즉, 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 상기 글리코조작처리된 항체는 또한 본원에서 비푸코실화(afucosylated) 항체로 지칭된다.
본 발명에 따른 비푸코실화 이중특이성 항체는, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 Fc 영역에서 올리고사카라이드를 부분적으로 푸코실화시키기에 충분한 양으로 발현하도록 조작처리된 글리코변형된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 한 태양에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 다르게는, 숙주 세포의 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성은 US 6,946,292 호에 따라서 글리코변형된 숙주 세포를 제공하기 위해 감소되거나 경감될 수 있다. 항체 푸코실화의 양은, 예를 들면, 발효 조건(예, 발효 시간)에 의해, 또는 상이한 푸코실화 양을 갖는 2개 이상의 항체의 조합에 의해 예정될 수 있다. 상기 비푸코실화 항체 및 각각의 글리코조작처리 방법은 WO 2005/044859 호, WO 2004/065540 호, WO 2007/031875 호, 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180 (1999)], WO 99/154342 호, WO 2005/018572 호, WO 2006/116260 호, WO 2006/114700 호, WO 2005/011735 호, WO 2005/027966 호, WO 97/028267 호, US 2006/0134709 호, US 2005/0054048 호, US 2005/0152894 호, WO 2003/035835 호, WO 2000/061739 호에 기술되어 있다. 이들 글리코조작처리된 항체는 증가된 ADCC를 갖는다. 본 발명에 따른 비푸코실화 항체를 제공하는 다른 글리코조작처리 방법은, 예를 들면, 문헌[Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306, 151-160 (2005)]; 문헌[Shinkawa, T., et al., J. Biol Chem, 278, 3466-3473 (2003)]; WO 03/055993 호 또는 US 2005/0249722 호에 기술되어 있다.
한 태양은, WO 2005/044859 호, WO 2004/065540 호, WO 2007/031875 호, 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17, 176-180 (1999)], WO 99/154342 호, WO 2005/018572 호, WO 2006/116260 호, WO 2006/114700 호, WO 2005/011735 호, WO 2005/027966 호, WO 97/028267 호, US 2006/0134709 호, US 2005/0054048 호, US 2005/0152894 호, WO 2003/035835 호 또는 WO 2000/061739 호에 기술되어 있는 절차를 사용한, Asn297에서 당쇄로 글리코실화되는 IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 이중특이성 항체의 제조 방법으로, 이때 상기 당쇄 내 푸코스의 양은 65% 이하이다.
한 태양은 문헌[Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306, 151-160 (2005)]; 문헌[Shinkawa, T., et al., J. Biol Chem, 278, 3466-3473 (2003)]; WO 03/055993 호 또는 US 2005/0249722 호에 기술되어 있는 절차를 사용한, Asn297에서 당쇄로 글리코실화되는 IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 이중특이성 항체의 제조 방법으로, 이때 상기 당쇄 내 푸코스의 양은 65% 이하이다.
본 발명에 따른 항체는 재조합 방법에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이고, 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 항체의 후속 분리 및 약학적으로 허용되는 순도로의 통상적인 정제하에 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현을 포함한다. 숙주 세포에서 전술한 바와 같은 항체의 발현에 있어, 각각의 변형된 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터내에 삽입시킨다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 이.콜라이(E. coli) 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 세포에서 수행되고, 항체는 세포(상등액 또는 용해후 세포)로부터 회수된다. 항체의 재조합 제조를 위한 일반적인 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202 (1999)]; 문헌[Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8, 271-282 (1996)]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16, 151-161 (2000)]; 문헌[Werner, R.G., Drug Res. 48, 870-880 (1998)]의 종설 논문에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 이중특이성 항체는, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA의 공급원으로 작용할 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터내에 삽입될 수 있고, 이것은 이어서 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내에 형질감염되어 숙주 세포에서 재조합 단클론성 항체의 합성을 달성한다.
이중특이성 항체의 아미노산 서열 변이체(또는 돌연변이체)는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 DNA에 도입함으로써, 또는 뉴클레오티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 상기 변형은 매우 제한된 범위내에서만 수행될 수 있다. 예를 들면, 변형은 IgG 이소타입 및 항원 결합과 같은 상기 언급한 항체 특징을 변형시키지 않으나, 재조합체 생성, 단백질 안정성을 개선하거나 정제를 촉진할 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위해 조작처리될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 의미한다. 한 태양에서, HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로 사용된다.
본원에서 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 상호교환적으로 사용되고, 모든 상기 호칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 용어는 1차 대상 세포, 및 전이 수에 관계없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량에 있어 정확하게 일치할 필요는 없는 것으로 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 명확한 명칭을 의도하는 경우, 문맥으로부터 명백할 것이다.
NS0 세포에서의 발현은, 예를 들면, 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32, 109-123 (2000)]; 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73, 261-270 (2001)]에 기술되어 있다. 일시적 발현은, 예를 들면, 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30, E9 (2002)]에 기술되어 있다. 가변 영역의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 (1989)]; 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289 (1992)]; 및 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204, 77-87 (1997)]에 기술되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK 293)은 문헌[Schlaeger, E.J., and Christensen, K., Cytotechnology 30, 71-83 (1990)]; 및 문헌[Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194, 191-199 (1996)]에 기술되어 있다.
원핵세포에 적합한 대조 서열은, 예를 들면, 프로모터, 선택적으로 작동유전자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 작용적 관계에 놓일 때 "작용가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전구-서열 또는 분비 리더는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구-단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작용가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 상기 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하기 위해 위치하는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 연결된다. 일반적으로, "작용가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 해독 프레임에 인접하여 그에 존재함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접되어서는 안된다. 연결은 통상적인 제한효소 부위에서 접합에 의해 수행된다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
항체의 정제는 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 분야에 공지된 기타 방법을 포함한 표준 기술에 의해 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행된다(문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조). 미생물 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환 (카복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 친황성(thiophilic) 흡착(예를 들면, 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들면, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예를 들면, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)과 같이, 다양한 방법들이 잘 확립되어 있고 단백질 정제에 널리 사용된다(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 93-102 (1998)]).
본원에서 사용된 용어 "형질전환"은 벡터/핵산의 숙주 세포로의 전이 과정을 말한다. 큰 세포벽 장애물을 갖지 않는 세포를 숙주 세포로 사용하는 경우, 형질감염은, 예를 들면, 문헌[Graham, F.L., and van der Eb, A.J., Virology 52, 456ff (1973)]에 기술된 바와 같은 칼슘 포스페이트 침전 방법에 의해 수행된다. 그러나, 예를 들면, 핵 주입 또는 원형질체 융합에 의해 세포내에 DNA를 도입하는 다른 방법도 또한 이용할 수 있다. 원핵 세포, 또는 실질적인 세포벽 구조물을 함유하는 세포를 사용하는 경우, 예를 들면, 형질감염의 한 방법은 문헌[Cohen, F.N., et al., PNAS, 69, 7110ff (1972)]에 기술된 바와 같은 염화칼슘을 이용한 칼슘 처리이다.
본원에서 사용된 "발현"은 핵산이 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA(전사체로도 지칭됨)가 이어서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 말한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 총칭적으로 유전자 산물로 지칭된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유도되는 경우, 진핵 세포에서의 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전이시키는 핵산 분자, 특히 자가-복제되는 핵산 분자이다. 상기 용어는 주로 DNA 또는 RNA의 세포내 삽입(예를 들면, 염색체 통합)에 작용하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA의 복제에 작용하는 벡터의 복제, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역에 작용하는 발현 벡터를 포함한다. 하나보다 많은 전술한 바와 같은 기능을 제공하는 벡터도 포함된다.
"발현 벡터"는 적절한 숙주 세포내에 도입되는 경우, 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 통상적으로 목적하는 발현 산물을 생성하도록 작용할 수 있는 발현 벡터로 이루어진 적합한 숙주 세포를 말한다.
본 발명에 따른 이중특이성 항체는 포유동물 세포에서의 우수한 발현 수율, 안정성, 생물학적 또는 약리학적 활성, 약동학적 성질 또는 독성과 같은 유용한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들은, 예를 들면, 암과 같은 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항체, 특히 이중특이성 <IGF-1R-EGFR> 항체는 두 수용체 IGF-1R 및 EGFR 모두를 발현하는 암 세포의 성장 억제, 및 암을 앓고 있는 환자에게 이점을 제공하는 항종양 효능과 같은 매우 유용한 성질을 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이성 <IGF-1R-EGFR> 항체는 그의 모 단일특이성 <IGF-1R> 및 <EGFR> 항체와 비교할 때 두 수용체 IGF-1R 및 EGFR 모두를 발현하는 암 세포에 대해 두 수용체 IGF-1R 및 EGFR 모두의 감소된 내재화를 나타낸다.
본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 약학 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제형화된, 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 태양은 암을 치료하기 위한 본 발명에 따른 이중특이성 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암을 치료하기 위한 상기 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.
본원에서 사용된 "약학적 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여(예를 들면, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 전문가에 의해 인지되듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 투여 경로에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 또는 상기 화합물을 상기 물질과 함께 동시-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 화합물은 대상에게 적절한 담체, 예를 들면, 리포솜 또는 희석제 중에서 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제로는 식염수 및 완충제 수용액이 포함된다. 약학적 담체로는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학적으로 활성 물질을 위한 상기 매질 및 약제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"이란 어구는 장내 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식, 통상적으로, 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한하지 않고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 캡슐내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피하내, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
본원에서 사용된 용어 암은 증식성 질환, 예를 들면, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위선암, 위암, 대장암, 유방암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암, 뇌하수체 선종 및 유잉(Ewing) 육종을 말하고, 상기 암들중 임의 암의 난치성 암, 또는 하나 이상의 상기 암들의 조합을 포함한다.
상기 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기의 멸균 절차에 의해서 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산 등의 혼입 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 혼입하는 것도 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 약제의 혼입에 의해 주사가능한 약학적 형태의 지연된 흡수가 이루어질 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 투여형으로 제형화된다.
본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분들의 실제 투여량 수준은, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 환자에게 독성없이 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설률, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 질병, 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의료 분야에 공지된 유사 요인들을 포함하여 다양한 약동학적 요인들에 따라 달라질 것이다.
조성물은 멸균되어야 하고 조성물이 주사기로 전달가능할 정도로 유동성이어야 한다. 물 이외에, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수 용액이다.
예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해서, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨 또는 솔비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다.
아미노산 서열에 대한 설명
서열번호: 1 <IGF-1R> 중쇄, OA-Ak18-scFab-GA201(+WT)
서열번호: 2 <IGF-1R> 경쇄, OA-Ak18-scFab-GA201(+WT)
서열번호: 3 OA-Ak18-scFab-GA201의 다이설파이드 안정화 VH 44/VL 100을 갖는 <EGFR> 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호: 4 OA-Ak18-scFab-GA201_WT의 <EGFR> 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호: 5 <EGFR> 중쇄, OA-GA201-scFab-Ak18(+WT)
서열번호: 6 <EGFR> 경쇄, OA-GA201-scFab-Ak18(+WT)
서열번호: 7 OA-GA201-scFab-Ak18의 다이설파이드 안정화 VH 44/VL 100을 갖는 <IGF-1R> 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호: 8 OA-GA201-scFab-Ak18_WT의 <IGF-1R> 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호: 9 <VEGF> 중쇄, Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06(+SS)
서열번호: 10 <VEGF> 경쇄, Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06(+SS)
서열번호: 11 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS의 다이설파이드 안정화 VH 44/VL 100을 갖는 <ANG-2> 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호: 12 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06의 <ANG-2> 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄
서열번호: 13 인간 EGFR
서열번호: 14 인간 IGF-1R
서열번호: 15 인간 VEGF
서열번호: 16 인간 ANG-2
하기의 실시예, 서열표 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 나타내었다. 본 발명의 진의에서 벗어나지 않고 나타낸 절차에 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
실험 절차
실시예
재료 및 방법
재조합 DNA 기술
문헌[Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242 (1991)]에 나와 있다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 번호에 따라 번호를 매긴다(문헌[Edelman, G.M., et al., PNAS 63, 78-85 (1969)]; 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242 (1991)]). GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 매디슨) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 인포맥스 벡터 NT1 어드밴스(Infomax's Vector NT1 Advance) 스윗 버전 8.0을 서열 제작, 지도작성, 분석, 주석 및 도해에 사용하였다.
DNA 서열분석
DNA 서열은 세퀴설브(SequiServe, 독일 바테르스테텐) 및 게네아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스버그)에서 수행된 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 단편은 게네아트 AG(독일 레겐스버그)에서 자동 유전자 합성에 의한 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 제조하였다. S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 "놉-인투-홀" 항체 중쇄, 및 비변형 VH 영역 또는 scFab 항체 단편과 함께 CH3 영역에 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 "놉-인투-홀" 중쇄, 및 항체 경쇄를 암호화하는 유전자 절편들은 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 접하고(BamHI - XbaI 또는 BamHI - KpnI), pGA18(ampR) 플라스미드 내에 클로닝하였다. 상기 플라스미드 DNA는 형질전환된 세균으로부터 정제되고 UV 분광분석법에 의해 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 모든 구조물들은 진핵 세포에서 분비를 위한 단백질을 표적화하는 리더 펩티드(MGWSCIILFLVATATGVHS)를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 사용하여 설계하였다.
발현 플라스미드의 제작
모든 "놉-인투-홀" 중쇄 및 항체 경쇄 암호화 발현 플라스미드의 제작을 위해 로슈(Roche) 발현 벡터를 사용하였다. 벡터는 다음의 요소들로 이루어진다:
- 선택 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)의 복제 기점, oriP,
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기점,
- 이. 콜라이에서 암피실린 내성을 제공하는 β-락타마제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 속발성 초기(immediately early) 인핸서 및 프로모터,
- 인간 1-면역글로불린 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열, 및
- 유일한 BamHI 및 XbaI 제한효소 부위.
비변형 VH 영역 또는 scFab 단편을 갖는 "놉-인투-홀" 중쇄, 및 비변형 경쇄를 포함하는 면역글로불린 유전자를 기술된 바와 같이 유전자 합성에 의해 제조하고 pGA18(ampR) 플라스미드 내에 클로닝하였다. 합성된 DNA 절편을 갖는 pG18(ampR) 플라스미드 및 로슈 발현 벡터를 BamHI 및 XbaI 또는 BamHI 및 KpnI 제한 효소(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 적용하였다. 이어서, 정제된 "놉-인투-홀" 중쇄 및 비변형 경쇄 암호화 DNA 절편들을 분리된 로슈 발현 벡터 BamHI/XbaI 또는 BamHI/KpnI 단편에 접합시켜 최종 발현 벡터를 수득하였다. 최종 발현 벡터를 이. 콜라이 세포내에 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 분리하고(미니프렙(Miniprep)) 제한효소 분석 및 DNA 서열분석에 적용하였다. 적당한 클론들을 150 ml의 LB-Amp 배지에서 성장시키고, 다시 플라스미드 DNA를 단리하고(맥시프렙(Maxiprep)) 서열 보전성을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
HEK293 세포에서 이중특이성 항체의 일시적 발현
재조합 이중특이성 항체는 프리스타일(FreeStyle, 상표) 293 발현 시스템을 제조사의 지시(인비트로겐(Invitrogen), USA)에 따라 사용하여 인간 배아 신장 293-F 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다. 간략하게, 현탁액 프리스타일(상표) 293-F 세포를 37 ℃/8% CO2에서 프리스타일(상표) 293 발현 배지중에서 배양하고, 세포를 새로운 배지에 1 내지 2 x 106 생존 세포/ml의 밀도로 형질감염일에 접종하였다. "놉-인투-홀" DNA-293펙틴 복합체를 325 ㎕의 293펙틴(상표)(인비트로겐, 독일) 및 250 ㎍의 "놉-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA를 250 ml 최종 형질감염 부피에 대해 1:1:1 또는 1:2:1 몰비로 사용하여 옵티-멤(Opti-MEM, 등록상표) I 배지(인비트로겐, USA) 중에서 제조하였다. 항체 함유 세포 배양 상등액을 형질감염 7 일후에 14000 g에서 30 분간 원심분리하여 수거하고 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과시켰다. 상등액은 정제시까지 -20 ℃에서 저장하였다.
이중특이성 항체의 정제
이중특이성 항체는 단백질 A-세파로스(상표)(지이헬쓰케어, 스웨덴) 및 슈퍼덱스(Superdex)200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양물 상등액으로부터 정제하였다. 간략하게, 멸균 여과된 세포 배양물 상등액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 평형화된 하이트랩 프로테인에이(HiTrap ProteinA) HP(5 ml) 컬럼상에 적용하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척하였다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 2.8)으로 용출시키고, 단백질 함유 분획을 0.1 ml의 1 M 트리스(pH 8.5)로 중화시켰다. 이어서, 용출된 단백질 분획을 모으고, 아미콘(Amicon) 한외 원심분리 필터 장치(MWCO: 30 K, 밀리포어(Millipore))를 사용하여 3 ml의 부피로 농축하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl(pH 6.0)로 평형화된 슈퍼덱스200 하이로드(HiLoad) 120 ml 16/60 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴) 상에 부하시켰다. 5% 미만의 고분자량 응집체를 갖는 정제된 이중특이성 항체를 함유하는 분획을 모으고, -80 ℃에서 1.0 mg/ml 분취량으로 저장하였다.
정제된 단백질의 분석
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 결정하였다. 이중특이성 및 대조군 항체의 순도 및 분자량은 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE에 의해서 분석하고 쿠마시(Coomassie) 브릴리언트 블루로 염색하여 분석하였다. 뉴페이지(NuPAGE, 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐, USA)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다(4 내지 20% 트리스-글리신 겔). 이중특이성 및 대조군 항체 샘플의 응집체 함량은 25 ℃에서 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl(pH 7.0) 반응 완충액(running buffer) 중에서 슈퍼덱스 200 분석용 크기-배제 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴)을 사용하여 고성능 SEC에 의해 분석하였다. 25 ㎍ 단백질을 0.5 ml/분의 유량으로 컬럼상에 주입하고 50 분에 걸쳐 등용매 용출시켰다. 안정성 분석을 위해, 1 mg/ml의 정제된 단백질의 농축물을 4 ℃ 및 40 ℃에서 7 일동안 배양한 후 고성능 SEC로 평가하였다. 환원된 이중특이성 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 골격의 보전성은, 펩티드-N-글리코시다제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)를 사용한 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 나노일렉트로스프레이(NanoElectrospray) Q-TOF 질량 분광분석법에 의해 확인하였다.
표면 플라스몬 공명
결합 친화도는 25 ℃에서 표준 결합 분석법, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 기술(비아코어(등록상표), GE-헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)을 사용하여 측정한다. 친화도 측정을 위해, 30 ㎍/ml의 항 Fcγ 항체(양으로부터, 잭슨 임뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))를 표준 아민-커플링 및 SPR 기기(비아코어 T100) 상에서의 차단 화학에 의해 CM-5 센서 칩의 표면에 커플링시켰다. 접합후에, 단일- 또는 이중특이성 Her3/cMet 항체를 25 ℃에서 5 ㎕/분의 유량으로 주입한 후, 인간 HER3 또는 c-Met ECD를 30 ㎕/분으로 순차 희석(0 nM에서 1000 nM까지)하였다. 결합 실험을 위한 반응 완충액으로 PBS/0.1% BSA를 사용하였다. 이어서, 상기 칩을 10 mM 글리신-HCl(pH 2.0) 용액의 60초 펄스에 의해 재생시켰다.
EGFR / IGF -1R 표면 플라스몬 공명
SPR 실험은 비아코어 T100 기기(GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 수행하였다. IGF-1R 또는 EGFR을 표준 아민-커플링 화학을 이용하여 CM5 바이오센서칩의 표면상에 고정화시켰다. IGF-1R 또는 EGFR을 200 RU(IGF-1R) 또는 100 RU(EGFR)의 목적으로 고정화 위저드(wizard) 절차를 이용하여 나트륨 아세테이트(pH 5.0) 중에서 1 ㎍/ml로 주입하였다. 참조 대조군 플로우 셀(flow cell)을 비히클 완충액 만을 사용하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 처리하였다. 항체를 1x PBS(pH 7.4), 0.05% 트윈 20(로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))에 희석시키고, 30 ㎕/분의 유량으로 3.125 내지 50 nM의 증가하는 농도로 주입하였다. 접촉 시간(결합 단계)은 3 분(EGFR 결합) 및 5 분(IGF-1R 결합)이었고, 해리 시간은 10 분(EGFR) 및 3 분(IGF-1R)이었다. EGFR 결합은 5 ㎕/분의 유량에서 30 초 동안 0.85% 인산의 주입에 의해 재생시켰다. IGF-1R 결합은 5 ㎕/분으로 1 분동안 4 M 염화마그네슘의 주입에 의해 재생시켰다. 동적 속도 상수 및 평형 해리 상수는 비아이벨루에이션(Biaevaluation) 소프트웨어 내의 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하여 계산하였다.
동시 결합을 밝히기 위해, 이중특이성 항체를 1 분동안 5 ㎕/분의 유량으로 25 nM에서 EGFR 표면 상에 주입하였다. 항체를 EGFR 표면에 포착시킨 후에, IGF-1R을 30 ㎕/분의 유량으로 2.5 내지 80 nM 사이의 증가하는 농도로 주입하였다. 표면을 5 ㎕/분의 유량에서 30 초 동안 0.85% 인산의 주입에 의해 재생시켰다. 동적 속도 상수 및 평형 해리 상수는 비아이벨루에이션 소프트웨어 내의 1:1 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 계산하였다.
ANG -2 결합 표면 플라스몬 공명( 비아코어 )
항원, 예를 들면, 인간 ANG-2에 대한 항체의 결합은 비아코어 T100 기기(GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 간략하게, 친화도 측정을 위해 양<hIgG-Fcγ> 다클론성 항체를 인간 ANG-2에 대한 항체의 제공을 위해 아민 커플링을 통해 CM5 칩상에 고정화하였다(도 6B). 결합은 25 ℃에서 HBS 완충액(HBS-P; 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈 20, pH 7.4) 중에서 측정하였다. 정제된 ANG-2-His(R&D 시스템 또는 하우스 정제)를 용액중의 6.25 내지 200 nM의 다양한 농도로 첨가하였다. 결합은 3 분의 ANG-2-주입에 의해 측정하였고; 해리는 칩 표면을 HBS 완충액으로 3 분간 세척함으로써 측정하였고, KD 값은 1:1 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 평가하였다. ANG-2 제제의 이질성으로 인해 1:1 결합은 관찰할 수 없었고; 따라서, KD 값은 상대 평가일 뿐이다. 음성 대조군 데이터(예를 들면, 완충제 곡선)를 시스템 고유 기준선 변화의 보정을 위하고 노이즈 신호 감소를 위해 샘플 곡선으로부터 제하였다. 비아코어 T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1을 센서그램의 분석 및 친화도 데이터의 계산을 위해 이용하였다. 다르게는, Ang-2는 아민 커플링(BSA-프리)에 의해 CM5 칩 상에 고정화된 펜타His항체(PentaHisAntibody)(펜타His-Ab BSA-프리, 키아겐(Qiagen) 번호 34660)에 의해 2000-1700 RU의 포착 수준하에 포착될 수 있었다(하기 참조).
VEGF 결합 표면 플라스몬 공명( 비아코어 )
이중특이성 <VEGF-Ang-2> 항체의 VEGF 결합은 비아코어 T100 기기 상에서 표면 플라스몬 공명 기술을 이용하여 하기의 프로토콜에 따라 분석하고, T100 소프트웨어 패키지를 이용하여 분석하였다. 간략하게, <VEGF> 항체를 양의 항 인간 IgG(JIR 109-005-098)에 결합시켜 CM5-칩 상에 포착시켰다. 포착 항체를 다음과 같이 표준 아미노 커플링을 이용하여 아미노 커플링에 의해 고정화시켰다: HBS-N 완충제가 반응 완충제로 작용하였고, 활성화를 700 RU의 리간드 밀도를 위해 EDC/NHS의 혼합물에 의해 수행하였다. 포착-항체를 커플링 완충제 NaAc(pH 5.0, c = 2 ㎍/ml)에 희석하였고, 최종적으로 여전히 활성화된 카복실기는 1 M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하였다. Mab <VEGF> 항체의 포착은 5 ㎕/분의 유량 및 10 nM의 c(Mab<VEGF>)에서 수행하였고, 반응 완충제 + 1 mg/ml BSA로 희석하였다; 약 30 RU의 포착 수준이 도달되어야 한다. rhVEGF(rhVEGF, R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 293-VE)를 분석물로 사용하였다. <VEGF> 항체에 결합하는 VEGF의 동적 특성화는 37 ℃에서 반응 완충제로서 PBS + 0.005%(v/v) 트윈 20 중에서 수행하였다. 샘플은 300 내지 0.29 nM의 일련의 농도의 rhVEGF와 함께 50 ㎕/분의 유량 및 80 초의 결합 시간 및 1200의 해리 시간하에 주입하였다. 유리 포착 항체 표면의 재생은 10 mM 글리신(pH 1.5) 및 각 분석 주기후 60 초의 접촉 시간하에 수행하였다. 동적 상수는 통상적인 이중 참조(double referencing) 방법을 이용하여 계산하였다(대조군 기준: 포착 분자 양 항 인간 IgG에 대한 rhVEGF의 결합, 측정 플로우 셀에 대한 블랭크, rhVEGF 농도 "0", 모델: 랭뮤어 1:1 결합, 포착 분자 결합으로 인해 국소로 맞춰진 Rmax).
HEK293 - Tie2 세포주의 생성
ANG2 자극된 Tie2 포스포릴화에 의한 안지오포이에틴-2 항체의 방해 및 세포상에서 Tie2에 대한 ANG2의 결합을 측정하기 위해, 재조합 HEK293-Tie 세포주를 생성하였다. 간략하게, CMV 프로모터 및 네오마이신 내성 마커의 제어하에 전장 인간 Tie2(서열번호 108)를 암호화하는 DNA3 기본 플라스미드(RB22-pcDNA3 토포 hTie2)를 형질감염 시약으로 퓨진(Fugene)(로슈 어플라이드 사이언스)을 사용하여 HEK293 세포(ATCC) 내에 형질감염시키고, 내성 세포를 DMEM 10% FCS, 500 ㎍/ml G418 중에서 선별하였다. 개개의 클론을 클로닝 실린더를 통해 단리하고, 이어서 FACS에 의해 Tie2 발현에 대해 분석하였다. 클론 22가 G418의 부재하에서조차 높고 안정한 Tie2 발현을 갖는 클론으로 확인되었다(HEK293-Tie2 클론22). HEK293-Tie2 클론22를 이어서 세포 분석: ANG2 유도된 Tie2 포스포릴화 및 ANG2 세포 리간드 결합 분석에 사용하였다.
VEGF 유도된 HUVEC 증식 분석
VEGF 항체의 세포 기능을 측정하기 위해 VEGF 유도된 HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포, 프로모셀(Procmocell) #C-12200) 증식을 선택하였다. 간략하게, 96 웰 당 5000 HUVEC 세포(낮은 계대배양 횟수, 5회 이하 계대배양)를 콜라겐 I-코팅된 BD 바이오코트 콜라겐 I 96-웰 마이크로타이터 플레이트(BD #354407/35640)에서 100 ㎕의 결핍(starvation) 배지(EBM-2 내피 기본 배지 2, 프로모셀 # C-22211, 0.5% FCS, 페니실린/스트렙토마이신) 중에서 밤새 배양하였다. 변하는 농도의 항체를 rhVEGF(30 ng/ml의 최종 농도, BD # 354107)와 혼합하고, 실온에서 15 분간 예비-배양하였다. 이어서, 혼합물을 HUVEC 세포에 첨가하고 이들을 37 ℃, 5% CO2에서 72 시간동안 배양하였다. 분석일에, 플레이트를 30 분간 실온으로 평형화시키고, 세포 생존율/증식을 셀타이터-글로티엠(CellTiter-GloTM) 발광 세포 생존률 분석 키트를 사용하여 매뉴얼(프로메가(Promega), # G7571/2/3)에 따라 측정하였다. 발광은 분광광도계에서 측정하였다.
ANG2 유도된 Tie2 포스포릴화 분석
이중특이성 <ANG2-VEGF> 항체에 의한 ANG2 유도된 Tie2 포스포릴화의 억제를 하기 분석 원리에 따라 측정하였다. HEK293-Tie2 클론22를 <ANG2-VEGF> 항체의 부재 또는 존재하에서 ANG2로 5 분간 자극하고, P-Tie2를 샌드위치 ELISA로 정량화하였다. 간략하게, 웰 당 2x105 HEK293-Tie2 클론22 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 96 웰-마이크로타이터 플레이트 상에서 100 ㎕ DMEM, 10% FCS, 500 ㎍/ml 제네티신(Geneticin) 중에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, <ANG2-VEGF> 항체의 적정 열을 마이크로타이터 플레이트(4배 농축, 75 ㎕ 최종 부피/웰, 이중)에서 제조하고, 75 ㎕의 ANGPT2(R&D 시스템즈 # 623-AN) 희석물(4배 농축 용액으로서 3.2 ㎍/ml)과 혼합하였다. 항체 및 ANG2를 실온에서 15 분간 예비-배양하였다. 100 ㎕의 혼합물을 HEK293-Tie2 클론 22 세포(1 mM NaV3O4와 함께 5 분간 예비-배양됨, 시그마 #S6508)에 가하고 37 ℃에서 5 분간 배양하였다. 이어서, 세포를 웰 당 200 ㎕ 빙냉 PBS + 1 mM NaV3O4로 세척하고, 얼음상에서 웰 당 120 ㎕의 용해 완충제(20 mM 트리스, pH 8.0, 137 mM NaCl, 1% NP-40, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA, 1 mM NaV3O4, 1 mM PMSF 및 10 ㎍/ml 아프로티닌(Aprotinin))를 첨가하여 용해시켰다. 세포를 마이크로타이터 플레이트 진탕기 상에서 4 ℃에서 30 분간 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 미리 정제하지 않고 총단백질 측정 없이 p-Tie2 ELISA 마이크로타이터 플레이트(R&D 시스템즈, R&D #DY990)로 직접 옮겼다. P-Tie2의 양은 제조사의 지시에 따라 정량화하였고, 억제에 대한 IC50 값을 엑셀(Excel)용 XLfit4 분석 플러그-인(용량-반응 단일 부위, 모델 205)을 사용하여 측정하였다.
세포 역가 글로( glow ) 분석
세포 생존율 및 증식은 세포 역가 글로 분석(프로메가)을 이용하여 정량화하였다. 상기 분석은 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 간략하게, 세포를 96-웰 플레이트에서 100 ㎕의 총 부피로 목적하는 기간동안 배양하였다. 증식 분석을 위해, 세포를 배양기에서 꺼내어 실온에서 30 분간 방치하였다. 100 ㎕의 세포 역가 글로 시약을 가하고 다중-웰 플레이트를 오비탈 진탕기상에 2 시간 두었다. 발광은 마이크로타이어 판독기(테칸(Tecan)) 상에서 15 분후에 정량화하였다.
실시예 1a
이중특이성 2가 < VEGF - ANG -2> 항체 분자의 발현 및 정제
상기 재료 및 방법에서 기술한 절차에 따라서, 이중특이성 2가 <VEGF-ANG-2> 항체 분자 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS 및 Ang2-VEGF OA-Aba-N-scFabLC06을 발현시키고 정제하였다. <VEGF> 부분의 VH 및 VL은 베바시주맙을 기초로 한다. <ANG2> 부분의 VH 및 VL은 ANG2i-LC06(PCT 출원 번호 PCT/EP2009/007182 호에 기술되어 있고, 파지 디스플레이에 의해 수득되었다)의 VH 및 VL 서열을 기초로 한다. 이들 이중특이성 2가 항체들의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열들은 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS에 대해)에, 그리고 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 12(Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06에 대해)에 나타내었다. Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS 및 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06의 발현은 웨스턴 블롯으로 확인하였다. Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06SS 및 Ang2-VEGF OA-Ava-N-scFabLC06의 정제는 하기의 수율을 제공하였다.
Figure 112012087075958-pct00001
* 질량 스펙트럼: 동형(homomeric) 중쇄 이량체는 검출되지 않았다.
결합 및 기타 성질들은 기술된 바와 같이 측정하였다.
실시예 1b
이중특이성 2가 < IGF -1R- EGFR > 항체 분자의 발현 및 정제
Figure 112012087075958-pct00002
상기 재료 및 방법에서 기술한 절차에 따라서, 이중특이성 2가 <IGF-1R-EGFR> 항체 분자 OA-Ak18-scFab-GA201 및 OA-GA201-scFab-Ak18을 1:1:1 플라스미드 비로 발현시키고 정제하였다. 이중특이성 항체는 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587; WO 2005/005635 호, <IGF-1R>클론18 또는 <IGF-1R> AK18로 약칭) 및 인간화 <EGFR>ICR62(WO 2006/082515 호, <EGFR>ICR62로 약칭)의 항원-결합 부위를 기초로 한다. 상기 이중특이성 2가 항체들의 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열들은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3(OA-Ak18-scFab-GA201에 대해)에; 그리고 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7(OA-GA201-scFab-Ak18에 대해)에 나타내었다. OA-Ak18-scFab-GA201 및 OA-GA201-scFab-Ak18의 발현은 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 세포 배양물 상등액의 단백질 A 정제 후에, 두 구조물 모두 분석용 SEC로 검출할 때 약 148 kDa의 예상 분자량을 갖는 이중특이성 항체 50 내지 58% 및 100 kDa의 분자량을 갖는 반쪽 항체를 높은 수준으로 나타내었다. SEC 정제 후에, 두 구조물 모두 148 kDa의 분쟈랑을 갖는 동종 단량체 86 내지 90% 및 100 kDa의 잔류 부산물을 나타내었다. OA-GA201-scFab-Ak18은 또한 1:2:1의 플라스미드 비로 발현시켰고, 단백질 A 및 SEC 정제에 적용하였다. 1:1:1 발현비와 비교하여, 단백질 A 정제후 반쪽 항체의 양은 바이오어낼라이저(Bioanalyzer)(캘리퍼 분석)로 검출할 때 1:2:1 발현 수준하에 30%에서 6%로 감소되었다. SEC 정제된 단백질의 질량 스펙트럼 분석은 형질감염시 플라스미드 비의 변화에 의해 반쪽 중쇄 1 인간화 <EGFR>ICR62 항체의 효과적인 제거를 입증하였다. OA-GA201-scFab-Ak18 정제 수율은 HEK293 세포에서 발현시 1:2:1 플라스미드 비 하에 40% 만큼 증가하였다.
이중특이성 2가 <IGF-1R-EGFR> 항체 분자 OA-GA201-scFab-Ak18_WT(서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 8에 나타낸 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열)를 1:1:1 및 1:2:1의 플라스미드 비로 발현시키고 유사하게 정제하였다.
1:2:1 플라스미드 비에 대한 결과:
Figure 112012087075958-pct00003
3개 플라스미드 만을 갖는 OA-scFab 구조물은 4개의 발현 플라스미드를 갖는 이중특이성 분자를 생성하기 위해 놉-인투-홀 기술을 사용하는 유사한 헤테로이량체 접근방법에 비해(예를 들면, WO 2009/080253 호 참조). 유용한 부산물 프로필의 이점을 갖는다. 본 발명에 따른 항체들은 잘못 짝을 이룬 경쇄 또는 경쇄가 결여된 항체의 완전한 부재를 나타낸다(데이터 나타내지 않음).
기술된 1:2:1 방법은 고순도를 갖는 이중특이성 분자, 및 반쪽 항체의 확연한 감소 및 잘못 짝을 이룬 경쇄 또는 경쇄가 결여된 항체의 완전한 부재를 제공하는 것으로 나타났다(데이터 나타내지 않음).
결합 및 기타 성질들은 기술된 바와 같이 측정하였다.
이중특이성 2가 <IGF-1R-EGFR> 항체 분자 OA-Ak18-scFab-GA201_WT(서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4(OA-Ak180scFab-GA201_WT에 대해)에 나타낸 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열)를 발현시키고 유사하게 정제하였다.
실시예 2
두 항원 모두에 대한 이중특이성 항체의 (동시) 결합
상이한 이중특이성 항체 포맷들의 결합을 그로부터 결합 모듈러스 및 이중특이성 항체가 유도된 '야생형' IgG의 결합과 비교하였다. 이들 분석은 전술한 바와 같은 표면 플라스몬 공명(비아코어)을 적용하여 수행하였다. 이중특이성 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT의 IGF-1R 및 EGFR에 대한 결합을 검출하였다.
기기: 비아코어 T100(GE 헬쓰케어), T200 민감성 증대 소프트웨어: T200 대조용, 버전 1.0; 소프트웨어: T200 평가용, 버전 1.0
칩: CM5-칩
분석
제조사의 지시에 따라 플로우 셀 1 내지 4에 표준 아민 커플링: 반응 완충제: HBS-N 완충제, 리간드 밀도를 위해 EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화. EGFR은 커플링 완충제 NaAc(pH 4.5, c = 15 ㎍/ml)로 희석하고; 최종적으로 잔류하는 활성화된 카복실기는 1 M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하였다.
플로우 셀 1 상의 아민 커플링된 EGFR을 가능한 완충제-효과의 보정 또는 비특이적 결합을 위한 참조 대조군 표면으로 사용하였다.
동시 결합은 25 ℃에서 30 ㎕/분의 유량으로 측정하였다. 이중특이성 항체를 2 분간 c = 10 nM의 농도에서 주입한 후 즉시 인간 또는 개 IGF1R을 연속 주입하였다(결합 시간: 2 분, 해리 시간: 3 분, c = 150 nM).
모든 샘플을 반응 완충제 + 1 mg/ml BSA로 희석하였다.
각각의 주기 후에, 15 mM NaOH, 1 분의 접촉 시간, 30 ㎕/분의 유량을 이용하여 재생을 수행하였다. 음성 대조군: IGF1R 대신 희석 완충제를 음성 대조군으로 주입하였다.
결과
이중특이성 항체: OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 아민 커플링된 인간 EGFR 및 인간 IGF1R의 동시 결합을 나타내었다(센서그램 도 9 참조).
실시예 3a
ANG2 - VEGF - Mab Tie2 포스포릴화 억제
이중특이성 <ANG2-VEGF> 항체에 의한 VEGF 유도된 HUVEC 증식의 억제를 전술한 분석 원리에 따라 측정하고, 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 3b
ANG2 - VEGF - Mab Tie2 포스포릴화 억제
이중특이성 <ANG2-VEGF> 항체에 의한 ANG2 유도된 Tie2 포스포릴화의 억제를 전술한 분석 원리에 따라 측정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
실시예 4
이중특이성 < EGFR - IGF1R > 항체에 의한 IGF -1R의 내재화/하향조절
인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)은 IGF-1R 신호를 억제하고 IGF-1R의 내재화 및 후속 하향조절을 유도한다. 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 잠재적 억제 활성을 평가하기 위해, IGF-1R의 하향조절 정도를 분석하였다.
종양 세포에서 IGF-1 수용체(IGF-1R)의 양에 대한 본 발명 항체의 영향을 검출하기 위해, 시간-과정 실험 및 IGF-IR 및 EGFR 특이성 항체를 사용한 후속 ELISA 분석을 수행하였다.
인간 H322M 종양 세포(NCI로부터 수득)를 37 ℃ 및 5% CO2에서 96-웰 플레이트(1x104 세포/웰)에서 10% 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 펜스트렙(PenStrep)으로 보충된 RPMI 배지중에서 밤새 배양하였다.
배지를 조심스럽게 제거하고 100 ㎕의 총 부피의 RPMI 배지에 희석된 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 용액으로 교체하였다. 세포를 37 ℃ 및 5% CO2에서 3 시간 이상 24 시간 이하 동안 배양하였다.
배지를 흡입시켜 조심스럽게 제거하고 세포를 120 ㎕/웰의 차가운 MES-용해 완충제(25 mM MES, pH 6.5, 2% 트리톤 X-100, 60 nM 옥틸글루코사이드, 150 mM NaCl, 10 mM Na3VO4 및 컴플리트(Complete, 등록상표) 프로테아제 억제제)로 용해시켰다. 플레이트를 추가 분석시까지 -20 ℃에서 저장하였다.
IGF -1R 검출
PBS, 3% BSA 및 0.2% 트윈(등록상표) 20 중의 AK1a-비오티닐화 항체(WO 2004/087756 호에 기술된 <IGF-1R> HUMAB 클론 1a(DSM ACC 2586), 로슈, 독일)의 1:200 희석물을 2.4 ㎍/ml의 최종 농도로 스트렙타비딘-MTP(로슈 ID. 번호: 11965891001)에 첨가하였다. 스트렙타비딘-MTP를 실온에서 1 시간동안 교반한 다음, 0.1% 트윈(등록상표)20을 함유하는 PBS 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다.
PBS/트윈 용액을 제거한 후, 100 ㎕의 세포 용해물을 항체 코팅된 스트렙타비딘-MTP의 각 웰에 가하였다.
이어서, MTP를 실온에서 교반하에 1 시간동안 더 배양하고, 이어서 0.1% 트윈(등록상표) 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다.
PBS, 3% BSA 및 0.2% 트윈(등록상표) 20에 1:750으로 희석된 인간 IGF-1Rβ 토끼 항체(200 ㎍/ml, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 카탈로그 번호 sc-713)를 사용하여 포착 항체 Ak1a에 의해 결합된 IGF-1R을 검출하였다. 웰 당 100 ㎕를 첨가하고 실온에서 일정하게 교반하면서 1 시간동안 배양하였다. 이어서, 용액을 제거하고, 웰을 0.1% 트윈(등록상표) 20 함유 PBS 200 ㎕로 3회 세척하였다. 퍼옥시다제 표지된 항-토끼 IgG-HRP(셀 시그널링 카탈로그 번호 7074)를 PBS, 3% BSA 및 0.2% 트윈(등록상표) 20 중에 1:4000의 희석율로 2차 검출 항체로 사용하였다. 상기 희석물 100 ㎕를 각 웰에 가하고 실온에서 교반하에 1 시간동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 0.1% 트윈(등록상표)20 용액을 함유하는 PBS로 6회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 퍼옥시다제 기질 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘(로슈, BM-블루 ID-번호 11484581)을 첨가하고 교반하에 실온에서 20 분간 배양하였다. 25 ㎕/웰의 1M H2SO4를 가하고 실온에서 5 분간 더 배양하여 색 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18보다 하향조절을 덜 유도한다. OA-GA201-scFab-Ak18_WT에 의한 하향조절은 <IGF-1R> HUMAB 클론 18에 비해 50% 넘게 감소되었다.
실시예 5
이중특이성 < EGFR - IGF1R > 항체에 의한 EGFR - 및 IGF -1R- 신호전달 경로의 억제
인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)은 IGF-1R-신호전달을 억제하고, 인간화 래트 항-EGFR 항체 ICR62는 EGFR에 의한 신호전달을 억제한다. 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 잠재적 억제 활성을 평가하기 위해, 두 경로 모두를 향한 신호전달의 억제 정도를 분석하였다.
10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 펜스트렙으로 보충된 RPMI 배지중의 인간 종양 세포(H322M, 3x104 세포/웰)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 접종하고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다.
배지를 조심스럽게 제거하고, 100 ㎕의 무혈청 DMEM 배지(1 mg/ml RSA, 10 mM Hepes, 1% 펜스트렙으로 보충)로 교체하고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 2.5 시간 이상동안 배양하였다.
배지를 다시 조심스럽게 제거하고, 50 ㎕의 총부피의 무혈청 DMEM 배지 중의 이중특이성 항체 및 대조군 항체(<IGF-1R> HUMAB 클론 18 및 <EGFR>ICR62 최종 농도 0.01 mg/ml)의 희석물로 교체한 후, 37 ℃ 및 5% CO2에서 30 분동안 배양하였다. 50 ㎕ IGF-1(10 nM) 또는 EGF(20 ng/ml)(무혈청 DMEM 배재에 희석)를 첨가하여 세포를 자극하고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 10 분간 배양하였다.
배지를 조심스럽게 제거하고, 세포를 100 ㎕/웰의 빙냉 PBS로 1회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 바이오래드(BioRad) 세포 용해 완충제(바이오래드 세포 용해 키트(바이오래드 카탈로그 #171-304012))를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 플레이트를 추가 분석시까지 -20 ℃에서 저장하였다.
500 g에서 5 분간 원심분리하여 멀티스크린(MultiScreen) HTS-필터 플레이트를 통해 세포 용해물을 여과시킴으로써 세포 파편을 제거하였다. EGFR 포스포릴화에 대해서 P-EGFR(Tyr) 비드 키트(밀리포어(Millipore) 카탈로그 #46-603) 및 IGF-1R 포스포릴화에 대해서는 P-IGF-1R(Tyr1131) 비드 키트(바이오래드 카탈로그 #171V27343)를 사용하여 루미넥스(Luminex) 시스템으로, 여과된 세포 용해물에서의 EGFR 및 IGF-1R 포스포릴화를 분석하였다. 루미넥스 분석은 인단백 검출 시약 키트(Phosphoprotein Detection Reagent Kits)(바이오래드 카탈로그 #171-304004)를 사용하여 바이오플렉스 인단백 검출 매뉴얼(BioPlex Phosphoprotein Detection manual)(바이오래드 불레틴 #2903)에 기술된 바와 같이 수행하였다.
이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 H322M 종양 세포 상에서 IGF-1R의 포스포릴화(IC50: 1 nM, 최대 억제율: >70%), 및 EGFR의 포스포릴화(IC50: 1 nM, 최대 억제율: >90%)를 효과적으로 억제한다.
실시예 6
이중특이성 < EGFR - IGF1R > 항체에 의한 3D 배양물중 NCI - H322M 종양 세포의 성장 억제
인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)은 IGF-1R을 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제한다(WO 2005/005635 호). 유사한 방식으로, 인간화 래트 항-EGFR 항체 <EGFR>ICR62는 EGFR을 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다(WO 2006/082515 호). 종양 세포주의 성장 분석에서 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 잠재적 억제 활성을 평가하기 위해, EGFR 및 IGF-1R을 발현하는 H322M 세포에서의 억제 정도를 분석하였다.
10% FBS(PAA), 1 mM 나트륨 피루베이트(깁코(Gibco), 독일 다름스타트), 비-필수 아미노산(깁코) 및 2 mM L-글루타민(시그마, 독일 스테인하임)으로 보충된 RPMI 1640 배지(PAA, 오스트리아 파싱) 중에서 H322M 폐암 세포(NCI)를 배양하였다. 배양 배지를 함유하는, 96-웰 폴리-HEMA(폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트)(폴리사이언시즈, 미국 펜실베니아주 워링턴))코팅된 플레이트에 25000 세포/웰을 접종하였다. 동시에, 상이한 농도의 이중특이성 항체들을 첨가하고 7 일동안 배양하였다. 셀타이터 글로(CellTiterGlo, 등록상표)(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨) 분석을 이용하여, 제조사의 지시에 따라 세포의 ATP-함량을 측정함으로써 세포 생존율을 검출하였다.
결과는 도 8에 나타내었다. 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 H322M 세포의 증식을 용량-의존적으로 억제한다. 1000 nM의 용량에서, 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 단일특이성 모 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론18 또는 <EGFR>ICR62와 비교할 때 개선된 증식 억제를 나타내었다.
실시예 7
EGFR 및 IGF -1R 발현을 갖는 피하 이종이식 모델에서 이중특이성 < EGFR -IGF1R> 항체의 생체내 효능
인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)은 IGF-1R을 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제한다(WO 2005/005635 호). 유사한 방식으로, 인간화 래트 항-EGFR 항체 <EGFR>ICR62는 EGFR을 발현하는 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다(WO 2006/082515 호). 생체내 종양 성장에 대한 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 잠재적 억제 활성을 평가하기 위해, EGFR 및 IGF-1R의 발현을 특징으로 하는 피하 이종이식 모델 BxPC-3을 이용하였다.
인간 췌장암 세포주 BxPC-3의 세포(ATCC에서 수득)를, 37 ℃, 수분 포화 대기중 5% CO2에서, 10% 소 태아 혈청(세라 플러스(Sera Plus); PAN(상표), 바이오테크 게엠베하) 및 2 mM L-글루타민(PAN(상표), 바이오테크 게엠베하)으로 보충된 RPMI 1640 배지(PAN(상표), 바이오테크 게엠베하)에서 배양하였다. 접종일에, BxPC-3 종양 세포를 배양 플라스크로부터 수거하고(1x 트립신-EDTA, 로슈 다이아그노스틱스), 배양 배지로 옮기고, 원심분리하고, PBS로 1회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 세포 주입시, 최종 역가는 1x108 세포/ml로 조정하였다. 이어서, 100 ㎕의 상기 현탁액(1x107 세포에 상응)을 암컷 SCID 베이지(beige) 마우스의 우측 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양이 자리잡고 150 내지 250 mm3의 평균 크기에 이른 후에 비히클, <EGFR-IGF1R> 항체 및 대조군 항체(<IGF-1R> HUMAB 클론 18 및 <EGFR>ICR62)를 사용한 처리를 시작하였다. 종양 부피를 일주일에 2회 측정하고, 동물 체중을 동시에 모니터하였다. 단일 처리, 및 단일 항체들의 조합을 이중특이성 항체를 사용한 치료법과 비교하였다.
이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT(20 mg/kg; 복강내, 매주 1회 (q7d))는 피하 BxPC3 이종이식 모델에서 강한 항-종양 효능을 나타내었고(도 10 및 하기 표 참조), 단일특이성 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론18(10 mg/kg; 복강내, 매주 1회 (q7d)) 및 <EGFR>ICR62(10 mg/kg; 복강내, 매주 1회 (q7d))의 조합보다 종양 성장을 약간 우수하게 억제하였다.
Figure 112012087075958-pct00004

실시예 8
이중특이성 < EGFR - IGF1R > 항체의 글리코조작 유도체의 제조
인산칼슘-형질감염 접근방법을 이용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 글리코조작 유도체를 생성하였다. 지수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 인산칼슘 방법에 의해 형질감염시켰다. 비변형 항체의 생성을 위해, 세포를 1:1 비의 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로만 형질감염시켰다. 글리코조작 항체의 생성을 위해, 세포를 4개의 플라스미드, 즉 항체 발현을 위한 2개, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현을 위한 1개 및 만노시다제 II 발현을 위한 1개 플라스미드로, 각각 4:4:1:1의 비로 동시-형질감염시켰다. 10% FCS로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 T 플라스크에서 세포를 부착성 단층 배양물로 성장시키고, 이들이 50 내지 80% 융합되었을 때 형질감염시켰다. T75 플라스크의 형질감염을 위해, FCS로 보충된 약 14 ml의 DMEM 배양 배지(10% v/v 최종 부피에서)(결국 250 ㎍/ml)에 750 만(내지 800 만)개 세포를 형질감염 24 시간전에 접종시키고, 세포를 37 ℃에서 5% CO2 대기하의 배양기에서 밤새 놓아두었다. 형질감염될 각각의 T75 플라스크를 위해, 경쇄와 중쇄 발현 벡터 사이에 동등하게 나뉜 전체 플라스미드 벡터 DNA 47 ㎍, 235 ㎕의 1 M CaCl2 용액을 혼합하고 물을 469 ㎕의 최종 부피로 첨가하여 DNA, CaCl2 및 물의 용액을 제조하였다. 상기 용액에 469 ㎕의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 용액을 pH 7.05에서 첨가하고, 10 초동안 직접적으로 혼합하고 실온에서 20 초간 정치시켰다. 현탁액을 2% FCS로 보충된 약 12 ml의 DMEM으로 희석하고, 기존 배지 대신에 T75에 첨가하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 약 17 내지 20 시간동안 배양한 후, 배지를 약 12 ml의 DMEM, 10% FCS로 교체하였다. 조정된 배양 배지를 형질감염후 5 내지 7 일에 수거하고, 210 내지 300xg에서 5 분간 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고(또는 달리 1200 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 4000 rpm에서 10 분간 2차 원심분리한다) 4 ℃에서 유지시켰다.
분비된 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 슈퍼덱스 200 컬럼(아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)) 상에서 최종 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 정제하여 완충제를 포스페이트 완충 식염수로 교환하고 순수한 단량체 IgG1 항체를 수거하였다. 항체 농도는 280 nm에서의 흡광도로부터 분광광도계를 사용하여 평가하였다. 항체를 25 mM 인산칼슘, 125 mM 염화나트륨, pH 6.7의 100 mM 글리신 용액중에 제형화하였다.
항체 발현 벡터를 GnT-III 글리코실트랜스퍼라제 발현 벡터와 함께, 또는 GnT-III 발현 벡터 및 골지(Golgi) 만노시다제 II 발현 벡터와 함께 항체 발현 벡터를 동시-형질감염시켜 이중특이성 항체의 글리코조작 변이체를 생성하였다. 글리코조작 항체를 비-글리코조작 항체에 대해 전술한 바와 같이 정제하고 제형화하였다. 항체의 Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드를 하기에 기술하는 바와 같은 MALDI/TOF-MS로 분석하여 푸코스의 양을 측정하였다.
Figure 112012087075958-pct00005

올리고사카라이드는 PNGaseF 절단에 의해 항체로부터 효소적으로 방출시키고, 이때 항체는 PVDF 막 상에 고정되거나 용액중에 존재한다.
방출된 올리고사카라이드를 함유하는 생성된 절단 용액을 MALDI/TOF-MS 분석을 위해 직접 제조하거나, MALDI/TOF-MS 분석을 위한 샘플 제조에 앞서 EndoH 글리코시다제로 더 절단한다. 본 발명에 따른 모든 이중특이성 항체에 있어, GE는 당조작을 의미한다.
실시예 9
이중특이성 < EGFR - IGF1R > 항체의 FcgRIIIa 에 대한 결합 및 ADCC - 반응능
해당 항체에 의한 ADCC 매개 정도는 결합되는 항원 뿐 아니라, ADCC 반응을 유발하는 Fc 수용체로 알려진 FcgRIIIa에 대한 불변 영역의 친화도에 따라서도 달라진다. 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 FcgRIIIa에 대한 결합을 분석하기 위해, 비아코어 기술을 적용하였다. 상기 기술에 의해, 재조합적으로 생성된 FcRIIIa 영역에 대한 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 결합을 평가하였다.
모든 표면 플라스몬 공명 측정은 25 ℃에서 비아코어 3000 기기(지이헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴) 상에서 수행하였다. 유출 및 희석 완충제는 PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 6.0, 0.005%(v/v) 트윈 20이었다. 가용성 인간 FcRIIIa를 10 mM 나트륨-아세테이트(pH 5.0)에 희석하고, 표준 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴)를 사용하여 CM5 바이오센서 칩 상에 고정화시켜 약 1000 RU의 FcgRIIIa 표면 밀도를 수득하였다. HBS-P(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20; GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴)를 고정화시에 반응 완충제로 사용하였다. XGFR 이중특이성 항체를 PBS, 0.005%(v/v) 트윈 20(pH 6.0)으로 450 nM의 농도로 희석하고, 30 ㎕/분의 유량으로 3 분에 걸쳐 주입하였다. 이어서, 센서 칩을 PBS, pH 8.0, 0.005%(v/v) 트윈 20으로 1 분간 재생시켰다. 데이터 분석은 비아이벨루에이션 소프트웨어(비아코어, 스웨덴)를 사용하여 수행하였다.
FcgRIIIa에 대한 이중특이성 <EGFR-IFG1R> 항체의 결합 반응능이 어느 정도로 또한 종양 세포를 향한 시험관내 ADCC 활성으로 번역되는지를 분석하기 위해, ADCC 반응능을 세포 분석으로 측정하였다. 상기 분석을 위해, 글리코변형 유도체 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체를 제조하고(상기 참조), 하기에 기술하는 바와 같이 비아코어 ADCC-반응능 분석 포맷 및 또한 시험관내 ADCC 분석에서 시험하였다.
인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 작동인자 세포로 사용하고, 필수적으로 제조사의 지시에 따라 히스토팩(Histopaque)-1077(그레이너 류코셉(Greiner Leucosep) #227288)을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 정맥 혈액을 건강한 자원자로부터 헤파린화 주사기를 사용하여 취하였다. 상기 혈액을 PBS(Ca++ 또는 Mg++ 비함유)로 1:0.75 내지 1:1.3으로 희석하고 히스토팩-1077 상에 적층시켰다. 상기 구배를 실온(RT)에서 쉬지않고 30 분동안 800 x g에서 원심분리하였다. PBMC를 함유하는 중간상을 수거하고 PBS(2개의 구배로부터 세포 당 50 ml)로 세척하고 실온에서 10 분간 400 x g에서 원심분리하여 수거하였다. 펠릿을 PBS로 재현탁시킨 후, PBMC를 계수하고 실온에서 10 분간 400 x g에서 원심분리하여 2차로 세척하였다. 이어서, 세포를 후속 절차를 위해 적절한 배지에 재현탁시켰다.
ADCC 분석에 사용된 작동인자 대 표적 비는 PBMC에 대해 25:1이었다. 환저 96 웰 플레이트의 웰 당 50 ㎕를 첨가하기 위해 작동인자 세포를 AIM-V 배지중에 적절한 농도로 제조하였다. 표적 세포는 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 성장시킨 인간 EGFR/IGFR 발현 세포(예를 들면, H322M, A549 또는 MCF-7)이었다.
표적 세포를 PBS에서 세척하고, 계수하고, 1 x 106 세포/ml로 조정하였다. 세포를 37 ℃/5% CO2에서 30 분간 칼세인(Calcein) AM(10 μM)으로 표지화하였다. 표지화 후에, 세포를 PBS에 2회 세척하고, 96-웰 환저 플레이트에서 50 ㎕(AIM-V 배지) 중에 5000 세포/웰로 접종하였다. 항체를 AIM-V로 희석하고, 50 ㎕로 예비-플레이팅된 표적 세포에 첨가하였다. 이어서, 작동인자 세포를 첨가하고, 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 대기중에 37 ℃에서 4 시간동안 배양하였다. 배양 기간 후에, 플레이트를 200g에서 10 분간 원심분리하고, 80 ㎕의 상등액을 흑색 형광 플레이트/투명 바닥으로 옮기고, 형광성(Ex 485 nm/Em 535 nm)을 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 판독기로 측정하였다.
하기의 대조군이 분석에 포함되었다:
- 배경: 세포 표지화 후 50 ㎕ 상등액-분취량 + 100 ㎕ 배지
- 자발적 용해: 50 ㎕ 표적 세포 현탁액 + 100 ㎕ 배지
- 최대 용해: 50 ㎕ 표적 세포 현탁액 + 100 ㎕ 배지/1.5% 트리톤 X-100
- 용해 대조군 w/o 항체: 50 ㎕ 표적 세포 현탁액 + 50 ㎕ 배지 + 50 ㎕ PBL
%항체 의존성 세포독성은 다음과 같이 계산한다:
%ADCC = x - 자발적 방출/최대 용해 - 자발적 용해 x 100
실시예 10
이중특이성 < EGFR - IGF1R > 항체의 글리코구조물의 분석
푸코스- 및 비-푸코스(a-fucose) 함유 올리고사카라이드 구조물의 상대비의 측정을 위해, 정제된 항체 물질의 방출된 글리칸을 MALDI-Tof-질량 분석법으로 분석하였다. 이를 위해, 단백질 골격으로부터 올리고사카라이드를 방출시키기 위해, 항체 샘플(약 50 ㎍)을 37 ℃에서 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 6.0) 중의 5 mU N-글리코시다제 F(프로자임(Prozyme) # GKE-5010B)와 함께 밤새 배양하였다. 이어서, 방출된 글리칸 구조물들을 분리하고, 뉴팁(NuTip)-카본 피펫 팁(글리겐(Glygen)에서 입수: 뉴팁1 내지 10 ㎕, 카탈로그 Nr#NT1CAR)을 사용하여 탈염시켰다. 1 단계로, 3 ㎕의 1M NaOH로 세척한 후 20 ㎕의 순수한 물(예를 들면, 베이커사(Baker)로부터 HPLC-구배 등급, #4218), 3 ㎕의 30%(v/v) 아세트산 및 다시 20 ㎕의 순수한 물로 세척하여 올리고사카라이드의 결합을 위해 뉴팁-카본 피펫 팁을 제조하였다. 이를 위해, 각각의 용액을 뉴팁-카본 피펫 팁내의 크로마토그래피 물질의 꼭대기위로 부하시키고 그를 통해 압착시켰다. 그런 다음, 10 ㎍의 항체에 상응하는 글리칸 구조물을, 전술한 N-글리코시다제 F 절단물을 4 내지 5회 위아래로 당겨서 뉴팁-카본 피펫 팁내의 물질에 결합시켰다. 뉴팁-카본 피펫 팁 내의 물질에 결합된 글리칸을 전술한 바와 같은 방식으로 20 ㎕의 순수한 물로 세척하고, 0.5 ㎕의 10% 및 2.0 ㎕의 20% 아세토니트릴 각각으로 단계적으로 용출시켰다. 상기 단계를 위해, 용출액을 0.5 ml 반응 바이알에 충전하고, 각각 4 내지 5회 위아래로 당겼다. MALDI-Tof 질량 분석법에 의한 분석을 위해 두 용출물을 합쳤다. 상기 측정을 위해, 0.4 ㎕의 합한 용출액을 MALDI 표적상에서 20% 에탄올/5 mM NaCl에 5 mg/ml로 용해시킨 1.6 ㎕ SDHB 매트릭스 용액(2,5-다이하이드록시벤조산/2-하이드록시-5-메톡시벤조산)(브루커 달토닉스(Bruker Daltonics) #209813)과 혼합하고, 적절히 조정된 브루커 울트라플렉스(Bruker Ultroflex) TOF/TOF 기기로 분석하였다. 통상적으로, 50 내지 300회 시도를 기록하고, 단일 실험으로 요약하였다. 수득된 스펙트럼은 굴곡성 분석 소프트웨어(브루커 달토닉스)로 평가하고, 질량은 검출된 피크 각각에 대해 측정하였다. 이어서, 각각의 구조물(예를 들면, 푸코스 함유 또는 비함유 각각 복합체, 하이브리드 및 올리고- 또는 고-만노스 구조)에 대해 계산된 질량과 이론적으로 예상된 질량을 비교하여 푸코스 또는 비-푸코스 함유 글리콜 구조물들에 피크를 지정하였다.
하이브리드 구조물의 비를 측정하기 위해, 항체 샘플을 N-글리코시다제 F 및엔도-글리코시다제 H로 동시에 절단하였다. N-글리코시다제 F는 단백질 골격으로부터 모든 N-결합 글리칸 구조물(복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고만노스 구조물)을 방출하고, 엔도-글리코시다제 H는 글리칸의 환원 말단에서 2개의 GlcNAc- 잔기 사이에서 하이브리드 유형 글리칸을 추가로 분리시킨다. 상기 절단물을 이어서 N-글리코시다제 F 절단된 샘플에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 처리하고 MALDI-Tof 질량 분석법으로 분석하였다. N-글리코시다제 F 절단물 및 혼합 N-글리코시다제 F/엔도 H 절단물로부터의 패턴을 비교하여, 특정 글리코 구조물의 신호의 감소 정도를 이용하여 하이브리드 구조물의 상대 함량을 평가하였다.
각 글리코구조물의 상대량은 개개 글리코 구조물의 피크 높이, 및 검출된 모든 글리코 구조물의 피크 높이의 합의 비로부터 계산한다. 푸코스의 양은 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조물 각각)에서 확인된 모든 글리코 구조물에 대한 푸코스-함유 구조물의 비율이다. 비푸코실화의 양은 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조물 각각)에서 확인된 모든 글리코 구조물에 대한 푸코스-결여 구조물의 비율이다.
OA-GA201-scFab-Ak18_WT에 대해 측정된 푸코스의 양은 25% 내지 40%이었다.
실시예 11
상이한 EGFR 및 IGF -1R 발현을 갖는 세포에 대한 이중특이성 < EGFR - IFG1R > 항체의 결합
인간 항-IGF-1R 항체 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587)은 IGF-1R을 발현하는 세포에 결합하고, 인간화 래트 항-EGFR 항체 ICR62는 그 표면 상에서 EGFR을 발현하는 세포에 결합한다. EGFR 및 IGF-1R에 대한 단일특이성 2가 항체와 비교하여 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 결합 성질을 평가하기 위해, 경쟁 결합 분석을 상이한 IGF-1R/EGFR 발현비를 갖는 세포 상에서 수행하였다.
빙냉 완충제(PBS + 2% FCS, 깁코)에 희석된 인간 종양 세포(예를 들면, A549, TC-71, MDA-MB-231, 2 x 105 세포/웰)를, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 표지된 단일특이성 항체(HUMAB 클론 18 또는 인간화 래트 항-EGFR 항체 ICR62)(1 ㎍/ml의 최종 농도) 및 대조군으로 상이한 농도의 비표지 <EGFR-IGF1R> 항체 또는 비표지 단일특이성 항체 또는 Fab 단편의 혼합물에 첨가하였다(100 내지 0.002 ㎍/ml의 최종 적정 범위). 혼합물을 얼음위에서 45 분간 배양하였다. 세포를 150 내지 200 ㎕ 완충제(PBS + 2% FCS)를 첨가하여 2회 세척하고, 이어서 원심분리(300g; 5 분, 4 ℃)하였다. 이어서, 6.25 ㎕/ml의 7-AAD(BD #559925)를 함유하는 200 ㎕의 고정 완충제(1x 셀픽스(CellFix), BD #340181)에 세포를 재현탁시키고, 얼음위에서 10 내지 20 분간 배양시켜 사멸 세포중 7-AAD를 고정 및 침투시켰다. 샘플의 형광성 신호를 FACS로 분석하고 IC50 값을 계산하였다.
<IGF-1R> HUMAB 클론18에 대한 경쟁성 결합 분석의 결과(IC50 값)를 표 X에 나타내었다. IGF-1R 및 EGFR을 둘 다 발현하는 A549 종양 세포상에서, 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT의 결합은 <IGF-1R> HUMAB 클론 18에 비해 월등하였으며(약 3배), IGF-1R 및 EGFR 둘 다에 동시에 결합하는 이중특이성 항체의 능력으로 인해 <IGF-1R> HUMAB 클론 18 Fab 단편에 비해 유사하게 월등하였다(약 30배). IGF-1R은 발현하지만 EGFR은 발현하지 않는 TC-71 종양 세포 상에서, 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체 OA-GA201-scFab-Ak18_WT의 결합은 <IGF-1R> HUMAB 클론 18 Fab 단편과 필적하였다. 이러한 상황에서, IGF-1R 뿐 아니라 EGFR도 발현되었고, OA-GA201-scFab-Ak18_WT는 단지 하나의 결합 팔에 의해 IGF-1R에만 결합할 수 있다.
IGF-1R 및 EGFR을 발현하는 세포에 더 강하게 결합하는 이중특이성 <EGFR-IGF1R> 항체의 능력은 종양 조직에 대한 우수한 표적화를 달성하고, 잠재적으로 단일특이성 IGF-1R 및 EGFR 표적화 항체에 비해 유리한 안전성 프로필 및 PK 성질을 제공하기 위해 활용될 수 있다.
Figure 112012087075958-pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> Bispecific antibodies <130> 26643 WO <140> PCT/EP2011/054505 <141> 2011-03-24 <150> EP10003270.5 <151> 2010-03-26 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> <IGF-1R> heavy chain, OA-Ak18-scFab-GA201 (+WT) <400> 1 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> <IGF-1R> light chain, OA-Ak18-scFab-GA201 (+WT) <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 3 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> <EGFR> peptide connected heavy and light chain with disulfide stabilization VH 44 /VL100 ofOA-Ak18-scFab-GA201 <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 245 250 255 Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe 260 265 270 Thr Phe Thr Asp Tyr Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 275 280 285 Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr 290 295 300 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser 305 310 315 320 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 325 330 335 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met 340 345 350 Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 355 360 365 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 385 390 395 400 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 405 410 415 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 420 425 430 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 435 440 445 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 450 455 460 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 465 470 475 480 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 485 490 495 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 500 505 510 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 515 520 525 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 530 535 540 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 545 550 555 560 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 565 570 575 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 580 585 590 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 595 600 605 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 610 615 620 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 625 630 635 640 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 645 650 655 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 660 665 670 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 675 680 685 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 <210> 4 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> <EGFR> peptide connected heavy and light chain of OA-Ak18-scFab-GA201_WT <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 245 250 255 Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe 260 265 270 Thr Phe Thr Asp Tyr Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 275 280 285 Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr 290 295 300 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser 305 310 315 320 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 325 330 335 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met 340 345 350 Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 355 360 365 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 370 375 380 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 385 390 395 400 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 405 410 415 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 420 425 430 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 435 440 445 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 450 455 460 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 465 470 475 480 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 485 490 495 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 500 505 510 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 515 520 525 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 530 535 540 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 545 550 555 560 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 565 570 575 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 580 585 590 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 595 600 605 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 610 615 620 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 625 630 635 640 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 645 650 655 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 660 665 670 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 675 680 685 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 <210> 5 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> <EGFR> heavy chain, OA-GA201-scFab-Ak18 (+WT) <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala 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Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 14 <211> 1367 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val 930 935 940 Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg 945 950 955 960 Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val 965 970 975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys 1010 1015 1020 Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala 1025 1030 1035 Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val 1040 1045 1050 Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val 1055 1060 1065 Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr 1070 1075 1080 Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met 1085 1090 1095 Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile 1100 1105 1110 Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala 1115 1120 1125 Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val 1130 1135 1140 Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg 1145 1150 1155 Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu 1160 1165 1170 Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 1175 1180 1185 Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp 1190 1195 1200 Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn 1205 1210 1215 Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys 1220 1225 1230 Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile 1250 1255 1260 Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser 1265 1270 1275 Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu 1280 1285 1290 Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser 1295 1300 1305 Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His 1310 1315 1320 Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala 1325 1330 1335 Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg 1340 1345 1350 Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1355 1360 1365 <210> 15 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly 130 135 140 Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr 145 150 155 160 Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln 165 170 175 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 16 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human angiopoietin-2 (ANG-2) with leader and His-tag <400> 16 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285 Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 325 330 335 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg 355 360 365 Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 Ser Gly His His His His His His 500

Claims (28)

  1. (a) 1차 항원에 특이적으로 결합하는 1차 전장 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄;
    (b) 중쇄의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된, 2차 항원에 특이적으로 결합하는 2차 전장 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는
    이중특이성 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 영역 및 (b)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 영역이 각각 항체 CH3 영역들 사이의 원래 계면에서의 변형을 포함하는 계면에서 만나고;
    여기서, (i) 한 중쇄의 CH3 영역에서, 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 치환되어, 다른 중쇄의 CH3 영역의 계면 내의 공간(cavity)에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 영역의 계면 내에 돌출부를 형성하고,
    (ii) 다른 중쇄의 CH3 영역에서, 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 치환되어, 1차 CH3 영역의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 2차 CH3 영역의 계면 내에 공간을 형성하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  3. 삭제
  4. 제 2 항에 있어서,
    두 CH3 영역 사이에 다이설파이드 가교가 형성될 수 있도록, 각각의 CH3 영역의 상응하는 위치에 아미노산으로서 시스테인(C)의 도입에 의해 두 CH3 영역이 모두 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    (b)의 2차 전장 항체의 중쇄 및 경쇄의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)이 하기 위치들 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 다이설파이드 안정화되는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체:
    (i) 중쇄 가변 영역 위치 44 대 경쇄 가변 영역 위치 100,
    (ii) 중쇄 가변 영역 위치 105 대 경쇄 가변 영역 위치 43, 또는
    (iii) 중쇄 가변 영역 위치 101 대 경쇄 가변 영역 위치 100.
  6. 제 1 항에 있어서,
    항체가 IgG1의 불변 영역을 포함하는 이중특이성 항체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    (a) 1차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    (b) 2차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    (a) 1차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    (b) 2차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    (a) 1차 전장 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하고 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    (b) 2차 전장 항체가 IGF-1R에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때 상기 펩티드 연결된 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    (a) 1차 전장 항체가 VEGF에 특이적으로 결합하고 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    (b) 2차 전장 항체가 ANG-2에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때 상기 연결된 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  12. 제 1 항에 있어서,
    (a) 1차 전장 항체가 VEGF에 특이적으로 결합하고 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고;
    (b) 2차 전장 항체가 ANG-2에 특이적으로 결합하고 펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 중쇄를 포함하고, 이때 상기 연결된 중쇄 및 경쇄가 서열번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이성 항체.
  13. 제 6 항에 있어서,
    항체가 Asn297에서 당 쇄로 글리코실화되고, 이때 당 쇄 내의 푸코스의 양이 65% 이하인 이중특이성 항체.
  14. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 암의 치료를 위한 약학 조성물.
  15. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료를 위한 이중특이성 항체.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 쇄를 암호화하는 핵산 분자.
  19. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 18 항에 따른 핵산을 발현할 수 있는, 제 18 항에 따른 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터.
  20. 제 19 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  21. (a) (aa) 1차 항원에 특이적으로 결합하는 1차 전장 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄; 및 (ab) 중쇄의 N-말단이 펩티드 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된, 2차 항원에 특이적으로 결합하는 2차 전장 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고;
    (b) 숙주 세포를 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에서 배양하고;
    (c) 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계를 포함하는,
    제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 제조 방법.
  22. 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
  23. 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
  24. 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
  25. 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IGF-1R 및 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
  26. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 Asn297에서 당 쇄로 글리코실화되고, 이때 당 쇄 내의 푸코스의 양이 65% 이하인 이중특이성 항체.
  27. 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 VEGF 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
  28. 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 VEGF 및 인간 ANG-2에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체.
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