KR20060121212A - 세린 프로테아제, 세린 효소들을 인코딩하는 핵산 및 이를편입시킨 벡터 및 숙주 세포 - Google Patents

세린 프로테아제, 세린 효소들을 인코딩하는 핵산 및 이를편입시킨 벡터 및 숙주 세포 Download PDF

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제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 신규한 세린 프로테아제, 이들 효소를 인코딩하는 신규한 유전 물질, 및 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 단백질 분해 단백질 및 이로부터 개발된 변형 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 셀룰로모나스 종으로부터 수득되는 프로테아제 조성물, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA 를 포함한 벡터, 벡터 DNA 로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 숙주 세포들에 의해 생산되는 효소를 제공한다. 본 발명은 또한 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 프로테아제(들)를 포함한 세정 조성물(예컨대, 세제 조성물), 동물 사료 조성물, 및 섬유 및 가죽 가공 조성물을 제공한다. 대안적인 구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 야생형 프로테아제로부터 유래하는 변이 (즉, 변형) 프로테아제를 제공한다. 이들 변이 프로테아제들은 또한 다수의 용도에서 사용된다.
세린 프로테아제, 미크로코시니애, DNA, 벡터, 형질전환

Description

세린 프로테아제, 세린 효소들을 인코딩하는 핵산 및 이를 편입시킨 벡터 및 숙주 세포 {SERINE PROTEASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING SERINE ENZYMES AND VECTORS AND HOST CELLS INCORPORATING SAME}
본 출원은 35 U.S.C. § 119 하에서, 2003 년 11 월 19 일자로 출원된 공동-계류중인 U.S. 가특허출원 일련번호 제 60/523,609 호에 대하여 우선권을 주장한다.
본 발명은 신규한 세린 프로테아제, 이들 효소들을 인코딩하는 신규한 유전 물질 및, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종 (Cellulomonas spp.) 을 포함하는 미크로코시니애 종 (Micrococcineae spp.) 으로부터 수득되는 단백질 분해 단백질 및 이로부터 개발되는 변형 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 셀룰로모나스 종으로부터 수득되는 프로테아제 조성물, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA 를 포함한 벡터, 상기 벡터 DNA 로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포에 의해 생산되는 효소를 제공한다. 본 발명은 또한, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 프로테아제(들)을 포함한 세정 조성물 (예컨대, 세제 조성물), 동물 사료 조성물, 및 섬유 및 가죽 가공 조성물을 제공한다. 대안적인 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 야생형 프로테아제들로부터 유래된 변이 (mutant) (즉, 변형(variant)) 프로테아제를 제공한다. 이들 변이 프로테아제들은 또한 다수의 용도들에서 사용된다.
세린 프로테아제들은 넓은 범위의 특이성 및 생물학적 기능들을 가진 다양한 부류의 효소들을 포함하는 카르보닐 가수분해효소들의 하위 군이다(예컨대, Stroud, Sci. Amer., 131:74-88 참조). 이들의 기능적 다양성에도 불구하고, 하기와 같은 유전적으로 별개인 2 이상의 효소 집단들의 세린 프로테아제들의 촉매 기관이 연구되었다: 1) 서브틸리신; 및 2) 포유류 키모트립신-관련 및 상동 세균 세린 프로테아제 (예컨대, 트립신 및 S. 그리세우스 (S. griseus) 트립신). 이들 두 집단들의 세린 프로테아제들은 매우 유사한 촉매작용 기작을 보인다 (예컨대, Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46:331-358 [1977] 참조). 나아가, 1 차 구조가 관련이 없음에도 불구하고, 이들 두 효소 집단들의 3 차 구조는 함께 세린, 히스티딘 및 아스파르트산으로 이루어진 아미노산들의 보존된 3 작용기 촉매 (catalytic triad) 를 일으킨다. 상기 서브틸리신 및 키모트립신-관련 세린 프로테아제 모두 아스파르트산, 히스티딘 및 세린을 포함하는 3 작용기 촉매를 갖고 있다. 상기 서브틸리신-관련 프로테아제들에서 이들 아미노산들의 상대적 순서는, 아미노에서 카르복시 말단으로 읽어서, 아스파르트산-히스티딘-세린이다. 그러나, 상기 키모트립신-관련 프로테아제들에서, 상기 상대적 순서는 히스티딘-아스파르트산-세린이다. 상기 서브틸리신에 대하여는, 주로 세정 및 사료 용도에서의 유용 성에 기인하여 많은 연구가 수행되어 왔다. 추가적인 연구는 다양한 용도들에서의 이들 효소들의 기능성에 악영향을 끼칠 수 있는 불리한 환경 조건들 (예컨대, 산화제, 킬레이트화제, 극한 온도 및/또는 pH 에의 노출) 에 초점이 맞추어져 왔다. 그럼에도 불구하고, 당업계에서는 이들 불리한 조건들에 저항하고 당업계에 현재 공지되어 있는 것들과 비교해 활성이 유지되거나 또는 향상된 활성을 가질 수 있는 효소계에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 신규한 세린 프로테아제, 이들 효소들을 인코딩하는 신규한 유전 물질 및, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 단백질 분해 단백질 및 이로부터 개발되는 변형 단백질들을 제공한다. 특히, 본 발명은 셀룰로모나스 종으로부터 수득되는 프로테아제 조성물, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA를 포함한 벡터, 상기 벡터 DNA 로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포들에 의해 생산되는 효소를 제공한다. 본 발명은 또한, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 프로테아제(들)를 포함한 세정 조성물(예컨대, 세제 조성물), 동물 사료 조성물, 및 섬유 및 가죽 가공 조성물을 제공한다. 대안적인 구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 야생형 프로테아제들에서 유래한 변이 (즉, 변형) 프로테아제들을 제공한다. 이들 변이 프로테아제들은 또한 다수의 용도에서 사용이 발견된다.
본 발명은 상기 미크로코시니애의 일원으로부터 수득된 단리된 세린 프로테아제들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나딘 (cellulomonadin) 들이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스, 오엘스코비아 (Oerskovia), 셀룰로시미크로비움 (Cellulosimicrobium), 자일라니박테리움 (Xylanibacterium) 및 프로미크로모노스포라 (Promicromonospora) 로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득된다. 추가적인 구현예들에서, 상기 프로테아제는 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 을 포함한 세린 프로테아제와의 아미노산 동일성이 45% 이상인 단리된 세린 프로테아제들을 제공한다. 일부 구현예예서, 단리된 세린 프로테아제는 동일성이 50% 이상, 바람직하게는 55% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 65% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 더 바람직하게는 90%, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 99% 이다.
본 발명은 또한 상기 미크로코시니애로부터 수득되는 세린 프로테아제들과 면역학적 교차반응성을 가지는 단리된 세린 프로테아제들을 포함한 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 세린 프로테아제들은 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득되는 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가진다. 대안적인 구현예들에서, 세린 프로테아제들은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가진다. 또 다른 구현예들에서는, 세린 프로테아제들은 미크로코시니애로부터 수득되는 세린 프로테아제, 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 및/또는 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 세린 프로테아제 중 어느 하나의 절편들(즉, 일부)과의 교차반응성을 가진다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 제공하는데, 이때 상기 서열은 하기 위치들을 포함한 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다: 2, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 43, 46, 49, 51, 54, 61, 64, 65, 67, 70, 71, 76, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 90, 93, 99, 100, 105, 107, 109, 112, 113, 116, 118, 119, 121, 123, 127, 145, 155, 159, 160, 163, 165, 170, 174, 179, 183, 184, 185, 186, 187 및 188. 대안적인 구현예들에서, 상기 서열은 하기 위치들을 포함한 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다: 1, 4, 22, 27, 28, 30, 32, 41, 47, 48, 55, 59, 63, 66, 69, 75, 77, 80, 84, 87, 88, 89, 92, 96, 110, 111, 114, 115, 117, 128, 134, 144, 143, 146, 151, 154, 156, 158, 161, 166, 176, 177, 181, 182, 187 및 189.
일부 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서의 아미노산 치환을 하나 이상 포함한 아미노산 서열을 가진 프로테아제 변형체들을 제공한다. 대안적인 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 의 일부를 적어도 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서의 아미노산 치환을 하나 이상 포함한 아미노산 서열을 가진 프로테아제 변형체들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 치환은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어진다: 2, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 43, 46, 49, 51, 54, 61, 64, 65, 67, 70, 71, 76, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 90, 93, 99, 100, 105, 107, 109, 112, 113, 116, 118, 119, 121, 123, 127, 145, 155, 159, 160, 163, 165, 170, 174, 179, 183, 184, 185, 186, 187 및 188. 대안적인 구현예들에서, 상기 치환은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어진다: 1, 4, 22, 27, 28, 30, 32, 41, 47, 48, 55, 59, 63, 66, 69, 75, 77, 80, 84, 87, 88, 89, 92, 96, 110, 111, 114, 115, 117, 128, 134, 144, 143, 146, 151, 154, 156, 158, 161, 166, 176, 177, 181, 182, 187 및 189. 일부 바람직한 구현예들에서, 프로테아제 변형체들은 서열번호: 8 을 포함한 아미노산 서열을 포함하는데, 이때 14, 16, 35, 36, 65, 75, 76, 79, 123, 127, 159 및 179 로 이루어진 군에서 선택되는 위치들 중 하나 이상의 아미노산 위치가 또 다른 아미노산으로 치환된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 R14L, R16I, R16L, R16Q, R35F, T36S, G65Q, Y75G, N76L, N76V, R79T, R123L, R123Q, R127A, R127K, R127Q, R159K, R159Q 및 R179Q 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이 (mutation) 를 포함한다. 일부 대안적인 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q 및 R16Q/R79T 로 이루어진 군에서 선택되는 다중 변이를 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 하기 변이들 R123L, R127Q 및 R179Q 를 포함한다.
본 발명은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가지는 프로테아제 변형체들을 제공한다: T36I, A38R, N170Y, N73T, G77T, N24A, T36G, N24E, L69S, T36N, T36S, E119R, N74G, T36W, S76W, N24T, N24Q, T36P, S76Y, T36H, G54D, G78A, S187P, R179V, N24V, V90P, T36D, L69H, G65P, G65R, N7L, W103M, N55F, G186E, A70H, S76V, G186V, R159F, T36Y, T36V, G65V, N24M, S51A, G65Y, Q71I, V66H, P118A, T116F, A38F, N24H, V66D, S76L, G177M, G186I, H85Q, Q71K, Q71G, G65S, A38D, P118F, A38S, G65T, N67G, T36R, P118R, S114G, Y75I, I181H, G65Q, Y75G, T36F, A38H, R179M, T183I, G78S, A64W, Y75F, G77S, N24L, W103I, V3L, Q81V, R179D, G54R, T36L, Q71M, A70S, G49F, G54L, G54H, G78H, R179I, Q81K, V90I, A38L, N67L, T109I, R179N, V66I, G78T, R179Y, S187T, N67K, N73S, E119K, V3I, Q71H, I11Q, A64H, R14E, R179T, L69V, V150L, Q71A, G65L, Q71N, V90S, A64N, I11A, N145I, H85T, A64Y, N145Q, V66L, S92G, S188M, G78D, N67A, N7S, V80H, G54K, A70D, P118H, D2G, G54M, Q81H, D2Q, V66E, R79P, A38N, N145E, R179L, T109H, R179K, V66A, G54A, G78N, T109A, R179A, N7A, R179E, H104K, A64R 및 V80L. 또 다른 구현예들에서는, 상기 프로테아제 변형체들의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다: H85R, H85L, T62I, N67H, G54I, N24F, T40V, T86A, G63V, G54Q, A64F, G77Y, R35F, T129S, R61M, I126L, S76N, T182V, R79G, T109P, R127F, R123E, P118I, T109R, 171S, T183K, N67T, P89N, F1T, A64K, G78I, T109L, G78V, A64M, A64S, T10G, G77N, A64L, N67D, S76T, N42H, D184F, D184R, S76I, S78R, A38K, V72I, V3T, T107S, A38V, F47I, N55Q, S76E, P118Q, T109G, Q71D, P118K, N67S, Q167N, N145G, I28L, I11T, A64I, G49K, G49A, G65A, N170D, H85K, S185I, I181N, V80F, L69W, S76R, D184H, V150M, T183M, N67Q, S51Q, A38Y, T107V, N145T, Q71F, A83N, S76A, N67R, T151L, T163L, S51F, Q81I, F47M, A41N, P118E, N67Y, T107M, N73H, 67V, G63W, T10K, I181G, S187E, T107H, D2A, L142V, A143N, A8G, S187L, V90A, G49L, N170L, G65H, T36C, G12W, S76Q, A143S, F1A, N7H, S185V, A110T, N55K, N67F, N7I, A110S, N170A, Q81D, A64Q, Q71L, A38I, N112I, V90T, N145L, A64T, I11S, A30S, R123I, D2H, V66M, Q71R, V90L, L68W, N24S, R159E, V66N, D184Q, E133Q, A64V, D2N, G13M, T40S, S76K, G177S, G63Q, S15F, A8K, A70G 및 A38G. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 향상된 카제인 가수분해 성능을 가진다.
본 발명은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가지는 프로테아제 변형체들을 제공한다: R35E, R35D, R14E, R14D, Q167E, G49C, S15R, S15H, I11W, S15C, G49Q, R35Q, R35V, G49E, R123D, R123Y, G49H, A38D, R35S, F47R, R123C, T151L, R14T, R35T, R123E, G49A, G49V, D56L, R35N, R35A, G12D, R35C, R123N, T46V, R123H, S155C, T121E, R127E, S113C, R123T, R16E, T46F, T121L, A38C, T46E, R123W, T44E, N55G, A8G, E119G, R35P, R14G, F59W, R127S, R61E, R14S, S155W, R123F, R123S, G49N, R127D, E119Y, A48E, N170D, R159T, S99A, G12Q, P118R, F165W, R127Q, R35H, G12N, A22C, G12V, R16T, Y57G, T100A, T46Y, R159E, E119R, T107R, T151C, G54C, E119T, R61V, I11E, R14I, R61M, S15E, A22S, R16C, T36C, R16V, L125Q, M180L, R123Q, R14A, R14Q, R35M, R127K, R159Q, N112P, G124D, R179E, G49L, A41D, G177D, R123V, E119V, T10L, T109E, R179D, G12S, T10C, G91Q, S15Y, S155Y, R14C, T163D, T121F, R14N, F165E, N24E, A41C, R61T, G12I, P118K, T46C, I11T, R159D, N170C, R159V, S155I, I11Q, D2P, T100R, R159S, S114C, R16D 및 P134R. 대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제 변형체들은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진다: S99G, T100K, R127A, F1P, S155V, T128A, F165H, G177E, A70M, S140P, A87E, D2I, R159K, T36V, R179C, E119N, T10Y, I172A, A8T, F47V, W103L, R61K, D2V, R179V, D2T, R159N, E119A, G54E, R16Q, G49S, R16I, S51L, S155E, S15M, R179I, T10Q, G12H, R159C, R179T, T163C, R159A, A132S, N157D, G13E, L141M, A41T, R123M, R14M, A8R, Q81P, N24T, T10D, A88F, R61Q, S99K, R179Y, T121A, N112E, S155T, T151V, S99Q, T10E, S92T, T109K, T44C, R123A, A87C, S15F, S155F, D56F, T10F, A83H, R179M, T121D, G13D, P118C, G49F, Q174C, S114E, T86E, F1N, T115C, R127C, R123K, V66N, G12Y, S113A, S15N, A175T, R79T, R123G, R179S, R179N, R123I, P118A, S187E, N112D, A70G, E119L, E119S, R159M, R14H, R179F, A64C, A41S, R179W, N24G, T100Q, P118W, Q81G, G49K, R14L, N55A, R35K, R79V, D2M, T160D, A83D, R179L, S51A, G12P, S99H, N42D, S188E, T10M, L125M, T116N, A70P, Q174S, G65D, S113D, E119Q, A83E, N170L, Q81A, S51C, P118G, Q174T, I28V, S15G 및 T116G. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시, 향상된 LAS 안정성을 가진다.
본 발명은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가지는 프로테아제 변형체들을 제공한다: G26I, G26K, G26Q, G26V, G26W, F27V, F27W, I28P, T29E, T129W, T40D, T40Q, R43D, P43H, P43K, P43L, A22C, T40H, P89W, G91L, S18E, F59K, A30M, A30N, G31M, C33M, G161L, G161V, P43N, G26E, N73P, G84C, G84P, G45V, C33L, Y9E, Y9P, A147E, C158H, I28W, A48P, A22S, T62R, S137R, S155P, S155R, G156I, G156L, Q81A, R96C, I4D, I4P, A70P, C105E, C105G, C105K, C105M, C105N, C105S, T128A, T128V, T128G, S140P, G12D, C33N, C33E, T164G, G45A, G156P, S99A, Q167L, S155W, I28T, R96F, A30P, R123W, T40P, T39R, C105P, T100A, C105W, S155K, T46Y, R123F, I4G, S155Y, T46V, A93S, Y57N, Q81S, G186S, G31H, T10Y, G31V, A83H, A38D, R123Y, R79T, C158G, G31Y, Q81P, R96E, A30Y, R159K, A22T, T40N, Y57M, G31N, Q81G, T164L, T121E, T10F, Q146P, R123N, V3R, P43G, Q81H, Q81D, G161I, C158M, N24T, T10W, T128S, T160I, Y176P, S155F, T128C, L125A, P168Y, T62G, F166S, S188A, Q81F, T46W, A70G 및 A38G. 대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제 변형체들은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진다: S188E, S188V, Y117K, Y117Q, Y117R, Y117V, R127K, R127Q, R123L, T86S, R123I, Q81E, L125M, H32A, S188T, N74F, C33D, F27I, A83M, Q71Y, R123T, V90A, F59W, L141C, N170E, T46F, S51V, G162P, S185R, A41S, R79V, T151C, T107S, T129Y, M180L, F166C, C105T, T160E, P89A, R159T, T183P, S188M, T10L, G25S, N24S, E119L, T107L, T107Q, G161K, G15Q, S15R, G153K, G153V, S188G, A83E, G186P, T121D, G49A, S15C, C105Y, C105A, R127F, Q71A, T10C, R179K, T86I, W103N, A87S, F166A, A83F, R123Q, A132C, A143H, T163I, T39V, A93D, V90M, R123K, P134W, G177N, V115I, S155T, T110D, G105L, N170D, T107A, G84V, G84M, L111K, P168I, G154L, T183I, S99G, S15T, A8G, S15N, P189S, S188C, T100Q, A110G, A121A, G12A, R159V, G31A, G154R, T182L, V115L, T160Q, T107F, R159Q, G144A, S92T, T101S, A83R, G12HM S15H, T116Q, T36V, G154, Q81C, V130T, T183A, P118T, A87E, T86M, V150N 및 N24E. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 향상된 열안정성을 가진다.
본 발명은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가지는 프로테아제 변형체들을 제공한다: T36I, I172T, N24E, N170Y, G77T, G186N, I181L, N73T, A38R, N74G, N24A, G54D, S76D, R123E, 159E, N112E, R35E, R179V, R123D, N24T, R179T, R14L, A38D, V90P, R14Q, R123I, R179D, S76V, R79G, R35L, S76E, S76Y, R79D, R79P, R35Q, R179N, N112D, R179E, G65P, Y75G, V90S, R179M, R35F, R123F, A64I, N24Q, R14I, R179A, R127A, R179I, N170D, R35A, R159F, T109E, R14D, N67D, G49A, N112Q, G78D, T121E, L69S, T116E, V90I, T36S, T36G, N145E, T86D, S51D, R179K, T107E, T129S, L142V, R79A, R79E, A38H, T107S, R123A, N55E, R123L, R159N, G65D, R14N, G65Q, R123Q, N24V, R14G, T116Q, A38N, R159Q, R179Y, A83E, N112L, S99N, G78A, T10N, H85Q, R35Q, N24L, N24H, G49S, R79L, S76T, S76L, G65S, N55F, R79V, G65T, R123N, T86E, Y75F, F1T, S76N, S99V, R79T, N112V, R79M, T107V, R79S, G54E, G65V, R127Q, R159D, T107H, H85T, R35T, T36N, Q81E, R123H, S76I, A38F, V90T 및 R14T. 대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제 변형체들은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진다: G65L, S99D, T107M, S113T, S99T, G77S, R14M, A64N, R61M, A70D, Q71G, A93D, S92G, N112Y, S15W, R159K, N67G, T10E, R127H, A64Y, R159C, A38L, T160E, T183E, R127S, A8E, S51Q, N7L, G63D, A38S, R35H, R14K, T107I, G12D, A64L, S76W, A41N, R35M, A64V, A38Y, T183I, W103M, A41D, R127K, T36D, R61T, G65Y, G13S, R35Y, R123T, A64H, G49H, A70H, A64F, R127Y, R61E, A64P, T121D, V115A, R123Y, T101S, T182V, H85L, N24M, R127E, N145D, Q71H, S76Q, A64T, G49F, A64Q, T10D, F1D, A70G, R35W, Q71D, N121I, A64M, T36H, A8G, T107N, R35S, N67T, S92A, N170L, N67E, S114A, R14A, R14S, Q81D, S51H, R123S, A93S, R127F, I19V, T40V, S185N, R123G, R179L, S51V, T163D, T109I, A64S, V72I, N67S, R159S, H85M, T109G, Q71S, R61H, T107A, Q81V, V90N, T109A, A38T, N145T, R159A, A110S, Q81H, A48E, S51T, A64W, R159L, N67H, A93E, T116F, R61S, R123V, V3L 및 R159Y. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 향상된 케라틴 가수분해 활성을 가진다.
본 발명은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진 프로테아제 변형체들을 제공한다: T36I, P89D, A93T, A93S, T36N, N73T, T36G, R159F, T36S, A38R, S99W, S76W, T36P, G77T, G54D, R127A, R159E, H85Q, T36D, S76L, S99N, Y75G, S76Y, R127S, N24E, R127Q, D184F, N170Y, N24A, S76T, H85L, Y75F, S76V, L69S, R159K, R127K, G65P, N74G, R159H, G65Q, G186V, A48Q, T36H, N67L, R14I, R127L, T36Y, S76I, S114G, R127H, S187P, V3L, G78D, R123I, I181Q, R35F, H85R, R127Y, N67S, Q81P, R123F, R159N, S99A, S76D, A132V, R127F, A143N, S92A, N24T, R79P, S76N, R14M, G186E, N24Q, N67A, R127T, H85K, G65T, G65Y, R179V, Y75I, I11Q, A38L, T36L, R159Y, R159D, N24V, G65S, N157D, G186I, G54Q, N67Y, R127G, S76A, A38S, T109E, V66H, T116F, R123L, G49A, A64H, T36W, D184H, S99D, G161K, P134E, A64F, N67G, S99T, D2Q, S76E, R16Q, G54N, N67V, R35L, Q71I, N7L, N112E, L69H, N24H, G54I, R16L, N24M, A64Y, S113A, H85F, R79G, I11A, T121D, R61V 및 G65L. 대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제 변형체들은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진다: N67Q, S187Q, Q71H, T163D, R61K, R159V, Q71F, V31F, V90I, R79D, T160E, R123Q, A38Y, S113G, A88F, A70G, I11T, G78A, N24L, S92G, R14L, D184R, G54L, N112L, H85Y, R16N, G77S, R179T, V80L, G65V, T121E, Q71D, R16G, P89N, N42H, G49F, I11S, R61M, R159C, G65R, T183I, A93D, L111E, S51Q, G78N, N67T, A38N, T40V, A64W, R159L, T10E, R179K, R123E, V90P, A64N, G161E, H85T, A8G, L142V, A41N, S185I, Q71L, A64T, R16I, A38D, G54M, N112Q, R16A, R14E, V80H, N170D, S99G, R179N, S15E, G49H, A70P, A64S, G54A, S185W, R61H, T10Q, A38F, N170L, T10L, N67F, G12D, D184T, R14N, S187E, R14P, N112D, S140A, N112G G49S, L111D, N67M, V150L, G12Y, R123K, P89V, V66D, G77N, S51T, A8D, I181H, T86N, R179D, N55F, N24S, D184L, R61S, N67K, G186L, F1T, R159A, I11L, R61T, D184Q, A93E, Q71T, R179E, L69W, T163I, S188Q, L125V, A38V, R35A, P134G, A64V, N145D, V90T 및 A143S. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 향상된 BMI 성능을 가진다.
본 발명은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진 프로테아제 변형체들을 제공한다: T36I, N170Y, A38R, R79P, G77T, L69S, N73T, S76V, S76Y, R179V, T36N, N55F, R159F, G54D, G65P, L69H, T36G, G177M, N24E, N74G, R159E, T36S, Y75G, S76I, S76D, A8R, A24A, V90P, R159C, G65Q, T121E, A8V, S76L, T109E, R179M, A8T, T107N, G186E, S76W, R123E, A38F, T36P, N67G, Y75F, S76N, R179I, S187P, N67V, V90S, R127A, R179Y, R35F, N145S, G65S, R61M, S51A, R179N, R123D, N24T, N55E, R79C, G186V, R123I, G161E, G65Y, A38S, R14L, V90I, R79G, N145E, N67L, R127S, R150Y, M180D, N67T, A93D, T121D, Q81V, T109I, A93E; T107S, R179T, R179L, R179K, R159D, R179A, R79E, R123F, R79D, T36D, A64N, L142V, T109A, I172V, A83N, T85A, R179D, A38L, I126L, R127Q, R127L, L69W, R127K, G65T, R127H, P134A, N67D, R14M, N24Q, A143N, N55S, N67M., S51D, S76E, T163D, A38D, R159K, T183I, G63V, A8S, T107M, H85Q, N112E, N67F, N67S, A64H, T86I, P134E, T182V, N67Y, A64S, G78D, V90T, R61T, R16Q, G65R, T86L, V90N, R159Q, G54I, S76C, R179E, V66D, L69V, R127Y, R35L, R14E 및 T86F. 대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제 변형체들은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진다: G186I, A64Q, T109G, G64L, N24L, A8E, N112D, A38H, R179W, S114G, R123L, A8L, T129S, N170D, R159N, N67C, S92C, T107A, G54E, T107E, T36V, R127T, A8N, H85L, A110S, N170C, A64R, A132V, T36Y, G63D, W103M, T151V, R123P, W103Y, S76T, S187T, R127F, N67A, P171M, A70S, R159H, S76Q, L125V, G54Q, G49L, R14I, R14Q, A83I, V90L, T183E, R159A, T101S, G65D, G54A, T107Q, Q71M, T86E, N24M, N55Q, R61V, P134D, R96K, A88F, N145Q, A64M, A64T, N24V, S140A, A8H, A64I, R123Q, T183Q, N24H, A64W, T62I, T129G, R35A, T40V, I11T, A38N, N145G, A175T, G77Q, T109H, A8P, R35E, T109N, A110T, N67Q, G63P, H85R, S92G, A175V, S51Q, G63Q, T116F, G65A, R79L, N145P, L69Q, Q146D, A83D, F166Y, R123A, T121L, R123H, A70P, T182W, S76A, A64F, T107H, G186L,Q81I, R123K, A64L, N67R, V3L, S187E, S161K, T86M, I4M, G77N, G49A, A41N, G54M, T107V, Q81E, A38I, T109L, T183K, A70G, Q71D, T183L, Q81H, A64V, A93Q, S188E, S51F, G186P, G186T, R159L, P134G, N145T, N55V, V66E, R159V, Y176L 및 R16L. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 낮은 pH 조건하에서 향상된 BMI 성능을 가진다.
본 발명은 또한 서열번호: 8, 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 9로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 중 적어도 일부를 포함하는 세린 프로테아제들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 이들 세린 프로테아제들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5 로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 세린 프로테아제들은 서열번호: 8 에 개시된 것과 유사한 아미노산 서열들을 갖는 변형체들이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 미크로코시니애의 일원으로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4의 변형체들로부터 수득된다.
본 발명은 또한 상기 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서 이루어지는 아미노산 치환을 하나 이상 포함한 아미노산 서열을 가지는 단리된 프로테아제 변형체들을 제공하는데, 이때 상기 프로테아제의 아미노산은 Arg14, Ser15, Arg16, Cys17, His32, Cys33, Phe52, Asp56, Thr100, Val115, Thr116, Tyr117, Pro118, Glu119, Ala132, Glu133, Pro134, Gly135, Asp136, Ser137, Thr151, Ser152, Gly153, Gly154, Ser155, Gly156, Asn157, Thr164 및 Phe165 를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들의 3 작용기 촉매는 His 32, Asp56 및 Ser137 을 포함한다. 대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 Cys131, Ala132, Glu133, Pro134, Gly135, Thr151, Ser152, Gly153, Gly154, Ser155, Gly156, Asn157 및 Gly 162, Thr 163 및 Thr164 를 포함한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들의 아미노산 서열은 Phe52, Tyr117, Pro118 및 Glu119 를 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들의 아미노산 서열들은 Gly 154 부터 기질 주쇄까지 주쇄 대 주쇄 수소결합을 가진다.
구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 3 개의 이황화 결합을 가진다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 이황화 결합들은 C17 과 C38, C95 와 C105, 및 C131 과 C158 사이에 위치한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 이황화 결합들은 서열번호: 8 의 C17 과 C38, C95 와 C105, 및 C131 과 C158 사이에 위치한다. 대안적인 프로테아제 변형체 구현예들에서, 상기 이황화 결합들은 서열번호: 8 내의 이황화 결합들에 등가인 위치들에 위치한다.
본 발명은 또한 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서 이루어진 아미노산 치환을 하나 이상 포함한 아미노산 서열들을 가진 단리된 프로테아제 변형체들을 제공하는데, 이때 상기 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 변경된 기질 특이성들을 가진다. 일부 더욱 바람직한 구현예들에서, 상기 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 변경된 pI 를 가진다. 추가적인 바람직한 구현예들에서, 상기 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 향상된 안정성을 가진다. 더욱 더 바람직한 구현예들에서, 상기 변형체들은 변경된 표면 특성들을 나타낸다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 변형체들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 변경된 표면 특성들을 나타낸다. 추가적인 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 변형체들은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 부위에서의 하나 이상의 치환 변이들을 포함한다: 1, 2, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 24, 25, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 및 184.
본 발명은 또한 상기 야생형 프로테아제와 비교시 하나 이상의 향상된 특성을 가지는 프로테아제 변형체들을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 변형체들은 상기 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 세린 프로테아제의 변형체들이다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4 의 변형체들로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 향상된 특성은 산 안정성, 열안정성, 카제인 가수분해, 케라틴 가수분해, 세정 성능 및 LAS 안정성으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서 이루어지는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 아미노산 서열들을 가진 프로테아제 변형체들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 발현 벡터들을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 이들 발현 벡터들을 포함한 숙주 세포들을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 바실러스 (Bacillus sp.), 스트렙토마이세스 (Streptomyces sp.), 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) 및 트리코더마 (Trichoderma sp.) 로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포들에 의해 생산되는 세린 프로테아제를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 및 78 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한 변형 프로테아제들을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호: 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 77 로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 하나 이상의 프로테아제 변형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 발현 벡터들을 제공한다. 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 이들 발현 벡터들을 포함한 숙주 세포들을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 바실러스, 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스 및 트리코더마로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포들에 의해 생산되는 세린 프로테아제들을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 미크로코시니애의 일원으로부터 수득된 단리된 세린 프로테아제의 적어도 일부를 포함한 조성물을 제공하는데, 이때 상기 프로테아제는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 및 서열번호: 4 로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 인코딩된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 서열은 서열번호: 1 의 적어도 일부를 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 이들 발현 벡터들을 포함한 숙주 세포들을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 바실러스, 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스 및 트리코더마로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포들에 의해 생산되는 세린 프로테아제들을 제공한다.
본 발명은 또한 변형 세린 프로테아제들을 제공하는데, 이때 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 내의 아미노산 위치들에 대응되는 하나 이상의 치환을 포함하며, 상기 변형 프로테아제들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시, 케라틴 가수분해, 열안정성, 카제인 활성, LAS 안정성 및 세정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성의 성능이 보다 우수하다.
본 발명은 또한 하기 특징을 가진 뉴클레오티드 서열을 포함한 단리된 폴리뉴클레오티드들을 제공한다: (i) 서열번호: 4 에 대한 동일성이 70% 이상이거나, (ii) 중간 내지 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 유래한 탐침자에 혼성화할 수 있거나, 또는 (iii) 서열번호: 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에 상보적임. 구현예들에서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 인코딩하는 발현 벡터들을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 이들 발현 벡터들을 포함한 숙주 세포들을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 바실러스, 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스 및 트리코더마로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포들에 의해 생산되는 세린 프로테아제들을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 4 에 개시된 서열의 적어도 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 프로테아제 활성을 가진 효소를 생산하는 방법을 제공한다: 숙주 세포를 서열번호: 4 와의 서열 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 숙주 세포를 숙주 세포에 적합한 조건하에서 배양하는 단계. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스, 트리코더마 및 바실러스 종으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 서열번호: 4 의 대응 절편과 실질적으로 동일한 4 내지 150 개 뉴클레오티드 서열을 포함한 탐침자들을 제공하는데, 이때 상기 탐침자는 단백질 분해 활성을 가진 효소를 코딩하는 핵산 서열을 검출하는데 사용되며, 상기 핵산 서열은 미크로코시니애의 일원으로부터 수득된다. 일부 구현예들에서, 상기 미크로코시니애는 셀룰로모나스 종이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스는 셀룰로모나스 균주 69B4 이다.
본 발명은 또한 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함한 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 프로테아제가 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 프로테아제는 상기 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 을 포함한 세린 프로테아제와의 아미노산 동일성이 45% 이상인 단리된 세린 프로테아제들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 단리된 세린 프로테아제는 동일성이 50% 이상, 바람직하게는 55% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 65% 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 더 바람직하게는 90%, 훨씬 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이다. 75.
본 발명은 또한, 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함한 세정 조성물로서 이때 상기 세린 프로테아제들 중 하나 이상이 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가지는, 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 세린 프로테아제들은 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득되는 세린 프로테아제와 면역학적 교차반응성을 가진다. 대안적인 구현예들에서, 상기 세린 프로테아제들은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 세린 프로테아제와 면역학적 교차반응성을 가진다. 또 다른 구현예들에서, 상기 세린 프로테아제들은 상기 미크로코시니애, 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 및/또는 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 세린 프로테아제로부터 수득되는 세린 프로테아제들 중 어느 하나의 절편(즉, 일부)와의 교차반응성을 가진다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함한 세정 조성물로서 이때 상기 프로테아제가 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 서열을 가진 변형 프로테아제인, 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 치환들은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어진다: 2, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 43, 46, 49, 51, 54, 61, 64, 65, 67, 70, 71, 76, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 90, 93, 99, 100, 105, 107, 109, 112, 113, 116, 118, 119, 121, 123, 127, 145, 155, 159, 160, 163, 165, 170, 174, 179, 183, 184, 185, 186, 187 및 188. 대안적인 구현예들에서, 상기 치환들은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어진다: 1, 4, 22, 27, 28, 30, 32, 41, 47, 48, 55, 59, 63, 66, 69, 75, 77, 80, 84, 87, 88, 89, 92, 96, 110, 111, 114, 115, 117, 128, 134, 144, 143, 146, 151, 154, 156, 158, 161, 166, 176, 177, 181, 182, 187 및 189. 또 다른 구현예들에서, 상기 프로테아제는 서열번호: 8 에 개시된 것과 등가인 아미노산 서열 내의 하기 위치들에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: 14, 16, 35, 36, 65, 75, 76, 79, 123, 127, 159 및 179. 또 다른 구현예들에서, 상기 프로테아제는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함한다: R14L, R16I, R16L, R16Q, R35F, T36S, G65Q, Y75G, N76L, N76V, R79T, R123L, R123Q, R127A, R127K, R127Q, R159K, R159Q 및 R179Q. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 프로테아제는 R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q 및 R16Q/R79T 의 집합들로 이루어진 군에서 선택되는 변이들의 집합을 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 하기 변이들 R123L, R127Q 및 R179Q 를 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 변형 세린 프로테아제들은 서열번호: 8 내의 아미노산 위치들에 대응되는 하나 이상의 치환을 포함하며, 상기 변형 프로테아제들은 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시, 케라틴 가수분해, 열안정성, 카제인 활성, LAS 안정성 및 세정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성의 성능이 보다 우수하다. 일부 구현예들에서, 상기 변형 프로테아제는 서열번호: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 및 78 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 대안적인 구현예들에서, 상기 변형 프로테아제 아미노산 서열은 서열번호: 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 77 로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 인코딩된다.
본 발명은 또한 서열번호: 4 와의 서열 동일성이 70 % 이상인 아미노산 서열을 포함한 단백질 분해 효소를 세정 유효량으로 포함하는 세정 조성물 및 적당한 세정 제형물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난아제 (mannanase), 펙티나제 (pectinase), 큐티나아제 (cutinase), 산화환원효소 (oxidoreductase), 헤미셀룰라아제 (hemicellulase), 및 셀룰라아제 (cellulase) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소 또는 효소 유도체들을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함한 조성물로서 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함하는, 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 안정화제는 붕사 (borax) 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 효소를 음이온성 계면활성제에 대해 고정시키는데 적합한 경쟁적 저해제들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 프로테아제는 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 프로테아제는 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함한 조성물로서 상기 세린 프로테아제가 자가융해상으로 안정한 변형체인, 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 변형 프로테아제는 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움, 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 변형 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 변형 프로테아제는 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 0.0001 중량% 이상의 본 발명의 세린 프로테아제 및, 임의로는 부속 성분을 포함한 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물은 부속 성분을 포함한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 조성물은 충분한 양의 pH 조절제를 포함하여 순(neat) pH 가 약 3 내지 약 5 인 조성물이 생성되도록 하는데, 이때 상기 조성물에는 약 3 내지 약 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질이 본질적으로 부재하다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 가수분해되는 물질들은 계면활성제 물질을 포함한다. 추가적인 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 액체 조성물이다. 또 다른 구현예들에서, 상기 계면활성제 물질은 산화에틸렌 부분을 포함한 소듐 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한다.
본 발명은 추가적으로, 하나 이상의 산 안정성 효소를 포함한 세정 조성물로서 충분한 양의 pH 조절제를 포함하여 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 조성물이 생성되게 하고 이때 상기 조성물에 약 3 내지 약 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질이 본질적으로 부재하는, 세정 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 상기 가수분해되는 물질은 계면활성제 물질을 포함한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 액체 조성물이다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 계면활성제 물질은 산화에틸렌 부분을 포함하는 소듐 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 적당한 부속 성분을 포함한다. 일부 추가적인 구현예들에서, 상기 조성물은 적당한 부속 성분을 포함한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 조성물은 약 0.001 내지 약 0.5 중량% 의 ASP 를 포함한다. 일부 대안적인 바람직한 구현예들에서, 상기 조성물은 약 0.01 내지 약 0.1 중량% 의 ASP 를 포함한다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는 세정 방법을 제공한다: a) 표면 및/또는 직물을 포함한 물품을 본 발명의 세린 프로테아제를 적절한 농도로 포함한 세정 조성물에 접촉시키는 단계; 및 b) 임의로, 상기 표면 또는 물질을 세척 및/또는 헹구는 단계. 대안적인 구현예들에서, 본원에 제시된 임의의 적당한 조성물이 이들 방법들에서 사용된다.
본 발명은 또한 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 하나 이상의 세린 프로테아제를 포함한 동물 사료를 제공한다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 프로테아제는 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움, 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 프로테아제는 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 가지며 단백질 분해 활성을 가진 단리된 폴리펩티드 (예컨대, 프로테아제) 를 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 40% 내지 98% 인 단리된 폴리펩티드들을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 50% 내지 95% 이다. 일부 추가적인 바람직한 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은, 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 60% 내지 90% 이다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 65% 내지 85% 이다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 90% 내지 95% 이다.
본 발명은 또한, 미크로코시니애 아목(亞目)의 세균들로부터 수득되는 프로테아제들을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 프로미크로모노스포라시애(Promicromonosporaceae) 과(科) 의 구성원들로부터 수득된다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 자일라니미크로비움 (Xylanimicrobium), 자일라니박테리움, 자일라니모나스 (Xylanimonas), 마이셀리게네란스 (Myceligenerans), 및 프로미크로모노스포라 속(屬) 중의 임의의 구성원으로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나다시애 (Cellulomonadaceae) 과의 구성원들로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나스 및 오엘스코비아 속의 구성원들로부터 수득된다. 일부 추가적인 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나스 종에서 유래한 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 피미 (Cellulomonas fimi), 셀룰로모나스 비아조테아 (Cellulomonas biazotea), 셀룰로모나스 셀라세아 (Cellulomonas cellasea), 셀룰로모나스 호미니스 (Cellulomonas hominis), 셀룰로모나스 플라비게나 (Cellulomonas flavigena), 셀룰로모나스 페르시카 (Cellulomonas persica), 셀룰로모나스 이라넨시스 (Cellulomonas iranensis), 셀룰로모나스 겔리다 (Cellulomonas gelida), 셀룰로모나스 휴밀라타 (Cellulomonas humilata), 셀룰로모나스 투르바타 (Cellulomonas turbata), 셀룰로모나스 우다 (Cellulomonas uda), 셀룰로모나스 페르멘탄스 (Cellulomonas fermentans), 셀룰로모나스 자일라닐리티카 (Cellulomonas xylanilytica), 셀룰로모나스 휴밀라타 및 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 선택된다.
대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 오엘스코비아 종에서 유래한 것이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 오엘스코비아 종은 오엘스코비아 제넨시스 (Oerskovia jenensis), 오엘스코비아 파우로메타볼라 (Oerskovia paurometabola), 오엘스코비아 엔테로필라 (Oerskovia enterophila), 오엘스코비아 투르바타 (Oerskovia turbata) 및 오엘스코비아 투르바타 균주 DSM 20577 에서 선택된다.
일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화-비행시간형 (matrix assisted laser desorption/ionizaton-time of flight, "MALDI-TOF") 분광광도계로 측정된 바 약 17kD 내지 21kD 의 외견상의 분자량을 가진다.
본 발명은 또한, 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 40% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제들을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 50% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 60% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 70% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 80% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 90% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 95% 이상이다. 본 발명은 또한 상기 제시된 폴리뉴클레오티드들 중 어느 하나를 포함한 발현 벡터들을 제공한다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 프로테아제를 발현하도록 본 발명의 발현 벡터들로 형질전환된 숙주 세포들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 세균이고, 다른 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 진균류 (fungi) 이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 세균 숙주 세포들은 바실러스 및 스트렙토마이세스 속으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예들에서, 진균성 숙주 세포들이 트리코더마 속의 구성원들인 반면, 다른 대안적인 바람직한 구현예들에서, 상기 진균성 숙주 세포들은 아스퍼질러스 속의 구성원들이다.
본 발명은 또한 하기 특징을 가진 뉴클레오티드 서열을 포함한 단리된 폴리뉴클레오티드들을 제공한다: (i) 서열번호: 3 또는 4 에 대한 동일성이 70% 이상이거나, (ii) 중간 내지 고도의 엄격한 조건하에서, 서열번호: 3 또는 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 유래한 탐침자와 혼성화할 수 있거나, 또는 (iii) 서열번호: 3 또는 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에 상보적임. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터들을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포들을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 프로테아제 활성을 가진 하나 이상의 효소를 생산하는 방법을 제공한다: 숙주 세포를 서열번호: 4 와의 서열 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로 형질전환시키는 단계, 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 숙주 세포에 적합한 조건하에서 배양하여 프로테아제를 생산하는 단계; 및 상기 프로테아제를 회수하는 단계. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 스트렙토마이세스 종이고, 한편, 다른 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 바실러스 종, 트리코더마 종 및/또는 아스퍼질러스 종이다. 일부 구현예들에서, 상기 스트렙토마이세스 종은 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 이다. 대안적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 T. 리이세이 (T. reesei) 이다. 또 다른 구현예들에서, 상기 아스퍼질러스 종은 A. 니게르 (A. niger) 이다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 프로테아제들을 인코딩하는 DNA 의 절편(즉, 일부)을 제공한다. 이들 절편들은 본원에 기술된 셀룰로모나스 69B4 로부터의 성숙한 프로테아제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 또는 단백질 분해 활성을 가진 이들의 단편을 단리 또는 동정하는데 사용될 수 있는 부분적 길이의 DNA 절편들을 수득하는데 사용된다. 일부 구현예들에서, 서열번호: 1 에 제시된 DNA 의 부분들은, 프로테아제 또는 단백질 분해 활성을 가지는 이의 일부를 인코딩하는, 다른 종들 및 특히 미크로코시니애 종으로부터의 DNA 의 상동 절편들을 수득하는데 사용된다.
본 발명은 또한, 서열번호: 1, 2, 3 또는 4 의 절편과 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한 하나 이상의 탐침자로서 상기 탐침자가 단백질 분해 활성을 가진 효소를 코딩하는 핵산 서열을 검출하는데 사용되고 상기 핵산 서열은 세균성 원천으로부터 수득되는 것인, 탐침자를 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 세균성 원천은 셀룰로모나스 종이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 세균성 원천은 셀룰로모나스 균주 69B4 이다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 프로테아제들 중 하나 이상을 포함한 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 조성물은 세정 조성물이다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 40% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 90% 이상이고/이거나 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열을 포함한 하나 이상의 프로테아제를 세정 유효량으로 포함한 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 하나 이상의 적당한 세정 부속물을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 속에서 유래한 것이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 피미, 셀룰로모나스 비아조테아, 셀룰로모나스 셀라세아, 셀룰로모나스 호미니스, 셀룰로모나스 플라비게나, 셀룰로모나스 페르시카, 셀룰로모나스 이라넨시스, 셀룰로모나스 겔리다, 셀룰로모나스 휴밀라타, 셀룰로모나스 투르바타, 셀룰로모나스 우다 및 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 선택된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 균주 69B4 이다. 또 다른 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난아제 및 셀룰라아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소 또는 효소 유도체들을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 45% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 60% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 75% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 90% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고/이거나 서열번호: 8 의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한, 단리된 자연 발생 프로테아제들을 제공하는데, 이때 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 종에서 단리한 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 로부터 단리된다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 세린 프로테아제들의 유전자-조작된 변형체들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 유전자-조작된 변형체들은 재조합 DNA 기법들을 사용하여 유전적으로 변형된 것이고, 한편, 다른 구현예들에서, 상기 변형체들은 자연적으로 발생한 것이다. 본 발명은 또한 상동 효소들의 유전자-조작된 변형체들을 포괄한다. 일부 구현예들에서, 상기 유전자-조작된 변형 상동 프로테아제들은 재조합 DNA 기법들을 사용하여 유전적으로 변형된 것이고, 한편, 다른 구현예들에서, 상기 변형 상동 프로테아제들은 자연적으로 발생한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 셀룰로모나스 69B4 프로테아제(즉, ASP)와 면역학적으로 교차-반응하는 세린 프로테아제들을 제공한다. 실제로, 본 발명은 동물(이에 제한되는 것은 아니나 인간 포함)에서 면역 반응을 자극하고/하거나 임의 부류의 항체들에 의해 인식되는 ASP 프로테아제의 절편들(예컨대, 에피토프들)을 포괄하는 것을 의도하였다. 본 발명은 또한 ASP 에피토프들과의 교차-반응성 있는 프로테아제 상의 에피토프들을 포괄한다. 일부 구현예들에서, 상기 ASP 에피토프들은 항체들에 의해 인식되나, 동물(이에 제한되는 것은 아니나 인간 포함)에서 면역 반응을 자극하지는 않는 반면, 다른 구현예들에서는, 상기 ASP 에피토프들은 하나 이상의 동물 종(이에 제한되는 것은 아니나 인간 포함)에서 면역 반응을 자극하고, 임의 부류의 항체들에 의해 인식된다. 본 발명은 또한 교차-반응성 에피토프들을 동정하고 평가하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 특징을 가지는 신호 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공한다: (i) 서열번호: 9 에 대한 서열 동일성이 70% 이상이거나, (ii) 중간 내지 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 9 를 인코딩하는 폴리펩티드 서열에서 유래한 탐침자와 혼성화할 수 있거나, 또는 (iii) 서열번호: 9 에 제시된 폴리펩티드 서열에 상보적임. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 상기 기술한 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 또 다른 추가적인 구현예들에서는, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 프로테아제 생산 방법을 제공한다: (a) 서열번호: 4 에 대한 서열 동일성이 70% 이상, 서열번호: 4 에 대한 서열 동일성이 95% 이상 및/또는 서열번호: 4 의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 숙주 세포에 적합한 조건하에서 배양하여 상기 프로테아제를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 프로테아제를 회수하는 단계. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 바실러스 종 (예컨대, B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 클라우시이 (B. clausii) 또는 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis)) 이다. 대안적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 스트렙토마이세스 종 (예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스) 이다. 추가적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 트리코더마 종 (예컨대, 트리코더마 리이세이) 이다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 아스퍼질러스 종 (예컨대, 아스퍼질러스 니게르) 이다.
인식될 것인 바, 본 발명의 이점은 세린 프로테아제 활성을 가진 단백질들을 인코딩하는 추가적인 폴리뉴클레오티드들을 단리할 수 있는 능력을 제공하는 폴리뉴클레오티드가 단리되는 것인데, 이때 이의 골격은 본 발명의 셀룰로모나스 프로테아제의 골격과 실질적으로 동일하다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 세린 프로테아제들을 비교적 대량으로 생산할 수 있는 숙주 세포들을 생산하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 세정 조성물, 뿐만 아니라 사료 구성요소, 섬유 가공, 가죽 피니싱 (finishing), 곡물 가공, 육류 가공, 세정, 단백질 가수분해물의 제조, 소화제, 살균 조성물, 정균 (bacteriostatic) 조성물, 진균억제 조성물, 구강 관리, 모발 관리 및/또는 피부 관리를 포함하는 생활용품을 포함하는, 폴리펩티드들의 분해 또는 합성이 요구되는 다양한 상업적 응용성을 가진 프로테아제를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제들과 비교시 필적할만한 또는 향상된 세척 성능을 가진 효소 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적 및 이점들은 본 명세서로부터 명백하다.
본 발명은 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 가지는, 단백질 분해 활성을 가진 단리된 폴리펩티드 (예컨대, 프로테아제) 를 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 40% 내지 98% 인 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 50% 내지 95% 이다. 일부 추가적인 바람직한 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 60% 내지 90% 이다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 65% 내지 85% 이다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 8 에 개시된 서열과의 동일성이 대략 90% 내지 95% 이다.
본 발명은 또한 미크로코시니애 아목의 세균에서 수득되는 프로테아제들을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 프로미크로모노스포라시애 과의 구성원들로부터 수득된다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 자일라니미크로비움, 자일라니박테리움, 자일라니모나스, 마이셀리게네란스, 및 프로미크로모노스포라 속 중 임의의 구성원으로부터 수득된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나다시애 과의 구성원들로부터 수득된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나스 및 오엘스코비아 속의 구성원들로부터 수득된다. 일부 추가적인 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 셀룰로모나스 종에서 유래된 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 피미, 셀룰로모나스 비아조테아, 셀룰로모나스 셀라세아, 셀룰로모나스 호미니스, 셀룰로모나스 플라비게나, 셀룰로모나스 페르시카, 셀룰로모나스 이라넨시스, 셀룰로모나스 겔리다, 셀룰로모나스 휴밀라타, 셀룰로모나스 투르바타, 셀룰로모나스 우다, 셀룰로모나스 페르멘탄스, 셀룰로모나스 자일라닐리티카, 셀룰로모나스 휴밀라타 및 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 선택된다.
대안적인 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 오엘스코비아 종에서 유래한 것이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 오엘스코비아 종은 오엘스코비아 제넨시스, 오엘스코비아 파우로메타볼라, 오엘스코비아 엔테로필라, 오엘스코비아 투르바타 및 오엘스코비아 투르바타 균주 DSM 20577 에서 선택된다.
일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화-비행시간형 ("MALDI-TOF") 분광광도계로 측정된 바, 약 17kD 내지 21kD 의 외견상의 분자량을 가진다.
본 발명은 또한, 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 40% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제들을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 50% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 60% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 70% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 80% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 90% 이상이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 서열번호: 8 에 대한 아미노산 서열 동일성이 95% 이상이다. 본 발명은 또한 상기 제시된 폴리뉴클레오티드들 중 어느 하나를 포함한 발현 벡터들을 제공한다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 프로테아제를 발현하도록 본 발명의 발현 벡터들로 형질전환된 숙주 세포들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 세균이고, 다른 구현예들에서, 상기 숙주 세포들은 진균류이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 세균 숙주 세포들은 바실러스 및 스트렙토마이세스 속으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 대안적인 바람직한 구현예들에서, 상기 진균성 숙주 세포들이 트리코더마 속 구성원들인 반면, 다른 대안적인 바람직한 구현예들에서, 상기 진균성 숙주 세포들은 아스퍼질러스 속의 구성원들이다.
본 발명은 또한 하기 특징을 가진 뉴클레오티드 서열을 포함한 단리된 폴리뉴클레오티드들을 제공한다: (i) 서열번호: 3 또는 4 에 대한 동일성이 70% 이상이거나, (ii) 중간 내지 고도의 엄격한 조건하에서, 서열번호: 3 또는 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 유래한 탐침자와 혼성화할 수 있거나, 또는 (iii) 서열번호: 3 또는 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에 상보적임. 일부 구현예들에서, 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터들을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포들을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 프로테아제 활성을 가진 하나 이상의 효소들을 생산하는 방법을 제공한다: 숙주 세포를 서열번호: 4 와의 서열 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로 형질전환시키는 단계, 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 숙주 세포에 적합한 조건하에서 배양하여 프로테아제를 생산하는 단계; 및 상기 프로테아제를 회수하는 단계. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포가 스트렙토마이세스 종인 반면, 다른 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 바실러스 종, 트리코더마 종 및/또는 아스퍼질러스 종이다. 일부 구현예들에서, 상기 스트렙토마이세스 종은 스트렙토마이세스 리비단스이다. 대안적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 T. 리이세이이다. 또 다른 구현예들에서, 상기 아스퍼질러스 종은 A. 니게르이다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 프로테아제들을 인코딩하는 DNA 의 절편(즉, 일부)을 제공한다. 이들 절편들은 본원에 기술된 셀룰로모나스 69B4 로부터의 성숙한 프로테아제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들 또는 단백질 분해 활성을 가진 이들의 단편을 단리 또는 동정하는데 사용될 수 있는 부분적 길이의 DNA 절편들을 수득하는데 사용된다. 일부 구현예들에서, 서열번호: 1 에 제시된 DNA 의 부분들은, 프로테아제 또는 단백질 분해 활성을 가지는 이의 일부를 인코딩하는, 다른 종들 및 특히 미크로코시니애 종으로부터의 DNA 의 상동 절편들을 수득하는데 사용된다.
본 발명은 또한, 서열번호: 1, 2, 3 또는 4 의 절편과 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한 하나 이상의 탐침자로서 상기 탐침자가 단백질 분해 활성을 가진 효소를 코딩하는 핵산 서열을 검출하는데 사용되고 상기 핵산 서열은 세균성 원천으로부터 수득되는 것인, 탐침자를 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 세균성 원천은 셀룰로모나스 종이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 세균성 원천은 셀룰로모나스 균주 69B4 이다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 프로테아제들 중 하나 이상을 포함한 조성물을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 조성물은 세정 조성물이다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 40% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 90% 이상이고/이거나 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열을 포함한 하나 이상의 프로테아제를 세정 유효량으로 포함한 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 하나 이상의 적당한 세정 부속물을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 종에서 유래한 것이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 피미, 셀룰로모나스 비아조테아, 셀룰로모나스 셀라세아, 셀룰로모나스 호미니스, 셀룰로모나스 플라비게나, 셀룰로모나스 페르시카, 셀룰로모나스 이라넨시스, 셀룰로모나스 겔리다, 셀룰로모나스 휴밀라타, 셀룰로모나스 투르바타, 셀룰로모나스 우다 및 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 선택된다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 균주 69B4 이다. 또 다른 구현예들에서, 상기 세정 조성물은 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난아제 및 셀룰라아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소 또는 효소 유도체들을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 45% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 60% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 75% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 90% 이상, 서열번호: 8 에 대한 서열 동일성이 95% 이상이고/이거나 서열번호: 8 의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한, 단리된 자연 발생 프로테아제들을 제공하는데, 이때 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 종에서 단리되는 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 로부터 단리된다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 세린 프로테아제들의 유전자-조작된 변형체들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 유전자-조작된 변형체들은 재조합 DNA 기법들을 사용하여 유전적으로 변형된 것이고, 한편, 다른 구현예들에서, 상기 변형체들은 자연적으로 발생한 것이다. 본 발명은 또한 상동 효소들의 유전자-조작된 변형체들을 포괄한다. 일부 구현예들에서, 상기 유전자-조작된 변형 상동 프로테아제들은 재조합 DNA 기법들을 사용하여 유전적으로 변형된 것이고, 한편, 다른 구현예들에서, 상기 변형 상동 프로테아제들은 자연적으로 발생한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 ASP 프로테아제와 면역학적으로 교차-반응하는 세린 프로테아제들을 제공한다. 실제로, 본 발명은 동물(이에 제한되는 것은 아니나 인간 포함)에서 면역 반응을 자극하고/하거나 임의 부류의 항체들에 의해 인식되는 ASP 프로테아제의 절편들(예컨대, 에피토프들)을 포괄하는 것을 의도하였다. 본 발명은 또한 ASP 에피토프들과의 교차-반응성 있는 프로테아제 상의 에피토프들을 포괄한다. 일부 구현예들에서, 상기 ASP 에피토프들은 항체들에 의해 인식되나, 동물(이에 제한되는 것은 아니나 인간 포함)에서 면역 반응을 자극하지는 않는 반면, 다른 구현예들에서는, 상기 ASP 에피토프들은 하나 이상의 동물 종(이에 제한되는 것은 아니나 인간 포함)에서 면역 반응을 자극하고, 임의 부류의 항체들에 의해 인식된다. 본 발명은 또한 교차-반응성 에피토프들을 동정하고 평가하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 특징을 가지는 신호 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공한다: (i) 서열번호: 9 에 대한 서열 동일성이 70% 이상이거나, (ii) 중간 내지 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 9 를 인코딩하는 폴리펩티드 서열에서 유래한 탐침자와 혼성화할 수 있거나, 또는 (iii) 서열번호: 9 에 제시된 폴리펩티드 서열에 상보적임. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 상기 기술한 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 또 다른 추가적인 구현예들에서는, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 프로테아제 생산 방법을 제공한다: (a) 서열번호: 4 에 대한 서열 동일성이 70% 이상, 서열번호: 4 에 대한 서열 동일성이 95% 이상 및/또는 서열번호: 4 의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 숙주 세포에 적합한 조건하에서 배양하여 상기 프로테아제를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 프로테아제를 회수하는 단계. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 바실러스 종 (예컨대, B. 서브틸리스, B. 클라우시이 또는 B. 리체니포르미스) 이다. 대안적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 스트렙토마이세스 종 (예컨대, 스트렙토마이세스 리비단스) 이다. 추가적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 트리코더마 종 (예컨대, 트리코더마 리이세이) 이다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 아스퍼질러스 종 (예컨대, 아스퍼질러스 니게르) 이다.
인식될 것인 바, 본 발명의 이점은 세린 프로테아제 활성을 가진 단백질들을 인코딩하는 추가적인 폴리뉴클레오티드들을 단리할 수 있는 능력을 제공하는 폴리뉴클레오티드가 단리되는 것인데, 이때 이의 골격은 본 발명의 셀룰로모나스 프로테아제의 골격과 실질적으로 동일하다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 세린 프로테아제들을 비교적 대량으로 생산할 수 있는 숙주 세포들을 생산하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 세정 조성물, 뿐만 아니라 사료 구성요소, 섬유 가공, 가죽 피니싱 (finishing), 곡물 가공, 육류 가공, 세정, 단백질 가수분해물의 제조, 소화제, 살균 조성물, 정균 (bacteriostatic) 조성물, 진균억제 조성물, 구강 관리, 모발 관리 및/또는 피부 관리를 포함한 생활용품을 포함하는, 폴리펩티드들의 분해 또는 합성이 요구되는 다양한 상업적 응용성을 가진 프로테아제를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제들과 비교시 필적할만한 또는 향상된 세척 성능을 가진 효소 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적 및 이점들은 본 명세서로부터 명백하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 신규한 세린 프로테아제, 이들 효소들을 인코딩하는 신규한 유전 물질 및, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 단백질 분해 단백질 및 이로부터 개발되는 변형 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 셀룰로모나스 종으로부터 수득되는 프로테아제 조성물, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA 를 포함한 벡터, 상기 벡터 DNA 로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포들로 생산되는 효소를 제공한다. 본 발명은 또한, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애 종으로부터 수득되는 프로테아제(들)를 포함한 세정 조성물(예컨대, 세제 조성물), 동물 사료 조성물, 및 섬유 및 가죽 가공 조성물을 제공한다. 대안적인 구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 야생형 프로테아제들로부터 유래된 변이 (즉, 변형) 프로테아제들을 제공한다. 이들 변이 프로테아제들은 또한 다수의 용도에서 사용된다.
알칼리성 소다 호수 내 및 주위에서 그람-양성 호알칼리성 (alkalophilic) 세균을 단리하였다(예컨대, 미국 특허 제 5,401,657 호, 이는 참조로서 본원에 포함됨). 이들 호알칼리성 세균들을 서로에 대해 및 또한 공지된 세균 집합물에 대해서 수리분류학 (numerical taxonomy) 의 원칙들에 따라 분석하고, 분류학적으로 특징을 부여하였다. 호알칼리성 세균에 대한 6 개의 천연 군집 또는 페논들을 생성하였다. 상기 단리된 균주들 중에 69B4 로 밝혀진 균주가 있었다.
셀룰로모나스 종은 셀룰로모나다시애 과, 미크로코시니애 아목, 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목, 악티노박테리아 강의 구성원들로 분류된 그람-양성 세균이다. 셀룰로모나스는 가늘고, 종종 불규칙적인 막대모양으로 성장하는데, 이따금 분지를 나타내나 균사체는 형성되지 않는다. 또한, 기생 성장 (aerial growth) 이 없고 포자도 형성되지 않는다. 셀룰로모나스와 스트렙토마이세스는 유전자 수준에서 관계가 멀 뿐이다. 셀룰로모나스와 스트렙토마이세스 간의 큰 유전적 (게놈적) 차이는 표현형적 특성들에서의 커다란 차이로 반영된다. 스트렙토마이세스의 세린 프로테아제들이 이전에 조사된 반면, 셀룰로모나스 종에 의해 분비되는 임의의 세린 프로테아제 (대략 MW 18,000 내지 20,000) 에 대하여는 어떠한 보고도 없었던 것으로 보인다. 또한, 셀룰로모나스 프로테아제를 세정 및/또는 사료 산업에 사용하였다는 보고는 이전에 없었던 것으로 보인다.
스트렙토마이세스는 스트렙토마이세타시애 (Streptomycetaceae) 과, 스트렙토마이시니애 (Streptomycineae) 아목, 악티노마이세탈레스 목, 악티노박테리아 강의 구성원들로 분류된 그람-양성 세균이다. 스트렙토마이세스는 광범위하게 가지를 뻗는 1 차 또는 기질 균사체 및 성숙시에 특유의 포자를 생성시키는 풍부한 기생 균사체로 성장한다. 스트렙토그리신 (streptogrisin) 은 광범위한 스트렙토마이세스 종들로부터 다량으로 분비되는 세린 프로테아제이다. 스트렙토마이세스 프로테아제들의 아미노산 서열은 스트렙토마이세스 그리세우스 스트렙토그리신 C (등록번호: P52320); 스트렙토마이세스로부터의 알칼리성 프로테이나제 (proteinase) (EC 3.4.21.-) (등록번호: PC2053); 스트렙토마이세스로부터의 알칼리성 세린 프로테이나제 I (등록번호: S34672), 스트렙토마이세스 리비단스로부터의 세린 프로테아제 (등록번호: CAD4208); 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor) A3(2) 로부터의 추정적 세린 프로테아제 (등록번호: NP_625129); 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 (Streptomyces avermitilis) MA-4680 로부터의 추정적 세린 프로테아제 (등록번호: NP_822175); 스트렙토마이세스 리비단스로부터의 세린 프로테아제 (등록번호: CAD42809); 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 A3(2) 로부터의 추정적 세린 프로테아제 전구체 (등록번호: NP_628830) 를 포함하는 9 개 이상의 상이한 스트렙토마이세스 종으로부터 결정되었다. 스트렙토마이세스 그리세우스 변이체 알칼로필러스 (alcalophilus) 프로테아제로부터 단리된, 겉보기 분자량 19,000 달톤의 정제된 천연 알칼리성 프로테아제 및 이를 함유한 세정 조성물이 기술되었다 (예컨대, 미국 특허 제 5,646,028 호, 이는 참조로 본원에 포함됨).
본 발명은 이들 유기체들에 의해 생산된 프로테아제 효소들을 제공한다. 중요하게도, 이들 효소들은 안정성 및 단백질 분해 활성이 우수하다. 이들 효소들은 다양한 용도들에서 사용되는데, 이에 제한되는 것은 아니나, 세정 조성물, 동물 사료, 섬유 가공 등이 있다. 본 발명은 또한 이들 효소들을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 순수한 또는 비교적 순수한 형태이다.
본 발명은 또한 재조합 유기체들에서 본 발명의 프로테아제들을 생산하기에 적당한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 구현예들에서, 재조합 산물은 상기 프로테아제들을 상업적으로 실행가능한 양으로 생산하는 방법을 제공한다.
다른 표시가 없는 한, 본 발명의 실행은, 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 에서 흔히 사용되는 통상적인 기술들을 포함하는데, 이들은 당업계의 기술의 범위 내에 있는 것이다. 이러한 기술들은 당업자들에게 공지되어 있으며, 수많은 교재 및 참조문헌들에 기술되어 있다(예컨대, Sambrook 등, "Molecular Cloning: Laboratory Manual", 제 2 판 (Cold Spring Harbor), [1989]); 및 Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology" [1987]). 상기 및 이하 등 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 간행물들은, 참조로서 본원에 명백히 포함된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, Singleton 및 Sainsbury 의 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 제 2 판 (John Wiley and Sons, NY (1994)) 및 Hale 및 Marham 의 The Harper Collins Dictionary of Biology (Harper Perennial, NY (1991)) 는 당업계의 숙련된 자들에게 본 발명에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적인 사전을 제공한다. 본원에 기술된 것들과 동등한 임의의 방법 및 물질들이 본 발명의 실행에 사용되나, 바람직한 방법 및 물질들은 본원에 기술된 것들이다. 따라서, 바로 직후에 정의되는 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조하여 좀 더 충분히 기술된다. 또한, 본원에 사용된 바, 단수형 낱말들인 "a", "an" 및 "the" 는 문맥에서 달리 명백히 표시하고 있지 않는 한, 복수형의 참조를 포함한다. 수적인 범위는 상기 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 다른 표시가 없는 한, 각각, 핵산은 왼쪽에서 오른쪽으로 5' 에서 3' 방향으로 기록되며; 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카르복시 방향으로 기록된다. 본 발명이 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들에 한정되지 않는데, 이는 이들이 당업계의 숙련된 자들에 의해 사용되는 맥락에 따라 다양할 수 있기 때문임은 자명할 것이다.
본 발명의 실행은, 다른 표시가 없는 한, 단백질 정제, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술 및 단백질 서열분석의 통상적인 방법들을 이용하는데, 이들은 모두 당업자들의 기술의 범위 내에 있다.
또한, 본원에 제시된 표제들은 본 명세서를 전체적으로 참조할 때 나타나는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예들에 대한 제한이 아니다. 따라서, 바로 직후에 정의되는 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조할 때 좀 더 충분히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여, 다수의 용어들을 하기에서 정의한다.
I. 정의
본 원에서 사용된 바, 용어 "프로테아제" 및 "단백질 분해 활성"은 펩티드 또는 펩티드 결합을 가진 기질을 가수분해할 수 있는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 나타낸다. 단백질 분해 활성을 측정하는 다수의 주지의 절차들이 존재한다(Kalisz, "Microbial Proteinases", In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988]). 예를 들어, 각 프로테아제들의 공업적 기질을 가수분해하는 능력을 분석하는 비교 검정으로 단백질 분해 활성을 확인할 수 있다. 이러한 프로테아제 또는 단백질 분해 활성 분석에 유용한 대표적인 기질로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 디-메틸 카제인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625) 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 있다. 이 기질들을 이용한 비색분석법이 당업계에 공지되어 있다(예컨대, WO 99/34011; 및 미국 특허 제 6,376,450 호 참조; 둘 다 참조로서 본원에 포함됨). pNA 검정 (예컨대, Del Mar 등, Anal. Biochem., 99:316-320 [1979] 참조) 또한 기울기 용리 동안 수집되는 분획들에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용된다. 이 검정은 효소가 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해함에 따라 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 상기 가수분해 반응으로부터의 황색 생성 속도를 분광광도계로 410 nm 에서 측정하며, 이는 상기 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 이용하여 총 단백질 농도를 측정할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비는 효소 순도를 제공한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "ASP 프로테아제", "Asp 프로테아제" 및 "Asp " 는 본원에 기술된 세린 프로테아제를 지칭한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 Asp 프로테아제는 본원에서 셀룰로모나스 균주 69B4 로부터 수득되는 69B4 프로테아제로 설계된 프로테아제이다. 따라서, 바람직한 구현예들에서, 용어 "69B4 프로테아제" 는 서열번호: 8 에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래하는 자연 발생적인 성숙 프로테아제를 지칭한다. 대안적인 구현예들에서, 본 발명은 상기 ASP 프로테아제의 일부를 제공한다.
용어 "셀룰로모나스 프로테아제 동족체 (homologue)" 는 셀룰로모나스 균주 69B4 에서 유래하는 성숙한 프로테아제와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 자연 발생적 프로테아제 또는 이러한 자연 발생적 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 프로테아제로서, 상기 프로테아제들은 상기와 같은 핵산들에 의해 인코딩되는 세린 프로테아제의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예들에서, 이들 프로테아제 동족체들은 "셀룰로모나딘"으로 지칭된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "프로테아제 변형체", "ASP 변형체", "ASP 프로테아제 변형체" 및 "69B 프로테아제 변형체" 는 야생형 ASP 와 특히 기능이 유사하나 아미노산 서열에서 변이를 가져 상기 야생형 프로테아제와 서열이 다른 프로테아제를 참조할 때 사용된다.
본원에서 사용된 바, "셀룰로모나스 아종" 은 "셀룰로모나스" 속에 속하는 모든 종들을 지칭하는 것으로서, 이들은 악티노박테리아 강, 악티노마이세탈레스 목, 미크로코시니애 아목, 셀룰로모나다시애 과의 구성원으로 분류되는 그람-양성 세균이다. 상기 셀룰로모나스 속이 계속적으로 분류학적 재조직화를 거치고 있다는 것이 인식되어야 한다. 따라서, 상기 속은 재분류된 종들을 포함하는 것을 의도한다.
본원에서 사용된 바, "스트렙토마이세스 아종"은 "스트렙토마이세스" 속의 모든 종들을 지칭하는 것으로서, 이들은 악티노박테리아 강, 악티노마이세탈레스 목, 스트렙토마이시니애 아목, 스트렙토마이세타시애 과의 구성원들로 분류되는 그람-양성 세균이다. 상기 스트렙토마이세스 속이 계속적으로 분류학적 재조직화를 거치고 있다는 것이 인식되어야 한다. 따라서, 상기 속은 재분류된 종들을 포함하는 것을 의도한다.
본원에서 사용된 바, "바실러스 속" 은, 당업계의 숙련된 자들에게 공지된 바의 "바실러스" 속의 모든 종들을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나 B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시이, B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 키르쿨란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus) 및 B. 투링기엔시스 (B. thuringiensis) 가 있다. 상기 바실러스 속이 계속적으로 분류학적 재조직화를 거치고 있다는 것이 인식되어야 한다. 따라서, 상기 속이 재분류된 종들을 포함하는 것을 의도하였는데, 이에 제한되는 것은 아니나 현재 "지오바실러스 스테아로테르모필루스" 로 명명되어 있는 B. 스테아로테르모필루스와 같은 유기체를 포함한다. 산소의 존재하에서 저항성 있는 내생포자를 생산하는 것이 상기 바실러스 속을 정의하는 특징으로 간주되나, 이 특징은 또한 최근 명명된 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus) 및 비르기바실러스 (Virgibacillus) 에도 적용된다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 은 중합체 형태의 임의 길이의, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나의 뉴클레오티드를 지칭하는 것이다. 이 용어들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기들을 포함한 중합체, 또는 기타 천연, 화학적, 생화학적으로 변형된, 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기들을 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예들이다: 유전자, 유전자 절편, 염색체 절편, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침자 및 프라이머. 일부 구현예들에서, 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 (analog), 우라실, 기타 당류 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오산 (thioate), 및 뉴클레오티드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예들에서, 뉴클레오티드들의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소로 개재된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "DNA 구축물" 및 "형질전환 DNA" 는 숙주 세포 또는 유기체 내로 서열들을 도입하는데 사용되는 DNA 를 지칭하는데에 상호교환적으로 사용된다. 상기 DNA 는 PCR 또는 당업자들에게 공지된 임의의 기타 적당한 기술(들)로 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 DNA 구축물은 관심 서열을 포함한다(예컨대, 도입되는 서열로서). 일부 구현예들에서, 상기 서열은 제어 요소 (예컨대, 프로모터 등) 등의 추가 요소들에 작동가능하게 연결된다. 상기 DNA 구축물은 선별가능 표지자를 추가로 포함한다. 이는 상동성 박스 (homology box) 들이 측면에 위치한 도입 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단 (예컨대, 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 측면들) 에 추가된, 기타 비-상동성 서열들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 도입 서열의 말단들은, 상기 형질전환 DNA 가 폐쇄된 고리를 형성하도록 폐쇄된다. 상기 형질전환 서열들은 야생형이거나, 변이 또는 변형된 것일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 DNA 구축물은 숙주 세포 염색체와 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예들에서, 상기 DNA 구축물은 비-상동 서열들을 포함한다. 상기 DNA 구축물이 시험관 내에서 만들어지면, 이는 하기에 사용될 수 있다: 1) 숙주 세포의 목적 표적 서열 내로 이종 서열 삽입, 및/또는 2) 상기 숙주 세포 염색체의 영역에 돌연변이유발 (즉, 내재성 서열을 이종 서열로 치환), 3) 표적 유전자 제거; 및/또는 복제 플라스미드를 숙주 내로 도입.
본원에서 사용된 바, 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는, 표적 세포 내 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소들을 가진, 재조합으로 또는 합성으로 생성된 핵산 구축물을 지칭한다. 상기 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스 또는 핵산 절편 내로 편입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열들 중에, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예들에서, 발현 벡터는 이종 DNA 절편들을 숙주 세포 내로 편입시키고 발현시키는 능력을 갖고 있다. 다수의 원핵 및 진핵 발현 벡터들이 상업적으로 입수가능하다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업계의 숙련된 자들의 지식에 속한다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 이들의 문법적 등가물들과 상호교환가능하게 사용된다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업계의 숙련된 자들의 지식에 속한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "벡터"는 하나 이상의 세포 유형 내로 핵산들을 도입시키도록 고안된 폴리뉴클레오티드 구축물을 지칭한다. 벡터들로는, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 있다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드 구축물은 적당한 숙주 내에서 상기 DNA 의 발현을 유효하게 할 수 있는 적당한 전구서열 (prosequence) (예컨대, 분비성 등) 에 작동가능하게 연결된 프로테아제 (예컨대, 전구체 또는 성숙한 프로테아제) 를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로 사용되는 환형 이중-가닥 (ds) DNA 구축물을 지칭하는데, 이는 일부 진핵생물 또는 원핵생물에서 잉여염색체 자가-복제 유전 요소를 형성하거나, 또는 숙주 염색체 내로 통합된다.
본원에서 핵산 서열을 세포 내로 도입시키는 맥락에서 사용되는 바, 용어 "도입" 은 핵산 서열을 세포 내로 전달시키기에 적당한 임의의 방법을 지칭한다. 이러한 도입 방법으로는, 이에 제한되는 것은 아니나 원형질체 융합, 트랜스펙션, 형질전환 (transformation), 접합 및 형질도입 (transduction) 이 있다(예컨대, Ferrari 등, "Genetics", in Hardwood 등, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., 57-72 페이지, [1989] 참조).
본원에서 사용된 바, 용어 "형질전환된" 및 "안정하게 형질전환된" 은 게놈 내로 통합되거나 또는 2 이상의 세대동안 유지되는 에피솜 플라스미드로서의 비-본래적인 (이종) 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "선별가능 표지자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열" 은 숙주 세포 내에서 발현이 가능한 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로서, 이때 상기 선별가능 표지자의 발현은 상기 발현된 유전자를 포함한 세포에 대응 선별제의 존재하에서 또는 필수 영양분의 부재하에서 성장하는 능력을 부여한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "선별가능 표지자" 및 "선별 표지자"는 상기 벡터를 포함한 숙주들의 선별을 용이하게 하는, 숙주 세포 내에서 발현 가능한 핵산 (예컨대, 유전자) 을 지칭한다. 이러한 선별가능 표지자의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 항균제가 있다. 따라서, 용어 "선별가능 표지자" 는 숙주 세포가 관심 도입 DNA 를 획득했거나 또는 어떤 다른 반응이 일어났다는 표시를 제공하는 유전자들을 지칭한다. 전형적으로, 선별가능 표지자들은 숙주 세포에 항균제 저항성 또는 대사적 이점을 제공하여 상기 외인성 DNA 를 포함한 세포가 상기 형질전환 동안 어떠한 외인성 서열도 받아들이지 않은 세포와 구별되도록 하는 유전자들이다. "거주 선별가능 표지자"는 형질전환될 미생물의 염색체 상에 위치하는 것이다. 거주 선별가능 표지자는 형질전환 DNA 구축물 상의 선별가능 표지자와는 다른 유전자를 인코딩한다. 선별 표지자는 당업계의 숙련된 자들에게 주지되어 있다. 상기 언급된 바와 같이, 바람직하게는 상기 표지자는 항균제 저항성 표지자이다(예컨대, ampR; phleoR; specR ; kanR; eryR; tetR; cmpR; 및 neoR; 예컨대, Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995]; Palmeros 등, Gene 247:255-264 [2000]; 및 Trieu-Cuot 등, Gene, 23:331-341 [1983] 참조). 본 발명에 따라 유용한 기타 표지자들로는, 이에 제한되는 것은 아니나 영양요구 표지자, 예컨대 트립토판; 및 검출 표지자, 예컨대 β-갈락토시다제가 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "프로모터" 는 하류 유전자의 직접 전사에 기능하는 핵산 서열을 지칭한다. 바람직한 구현예들에서, 상기 프로모터는 표적 유전자가 발현되고 있는 숙주 세포에 적절한 것이다. 상기 프로모터는, 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열들 ("제어 서열"로도 지칭됨) 과 함께, 주어진 유전자를 발현시키는데 필요하다. 일반적으로, 상기 전사 및 번역 조절 서열로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 정지 서열, 번역 시작 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열들이 있다.
핵산은, 또 다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 분비 선도자 (즉, 신호 펩티드) 를 인코딩하는 DNA 가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 단백질원 (preprotein) 으로 발현될 경우 이를 상기 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동가능하게 연결하거나; 프로모터 또는 인핸서가, 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 경우 이를 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결하거나; 또는 리보솜 결합 부위가, 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 이를 코딩 서열에 작동가능하게 연결한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이라는 것은 연결될 DNA 서열들이 인접해 있으며, 분비 선도자의 경우 인접해 있고 해독면에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서들은 인접해 있지 않다. 연결은, 편리한 제한효소 인식부위에서의 연결로 성취된다. 이러한 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 연결자들을 통상의 실시에 따라 사용한다.
본원에서 사용된 바 용어 "유전자"는 폴리펩티드를 인코딩하고 상기 코딩 영역의 전ㆍ후 영역 및 개별 코딩 단편(엑손)들 사이의 개재 서열 (인트론) 을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, DNA 단편) 를 지칭한다.
본원에서 사용된 바, "상동 유전자들" 은, 상이하나 보통은 관련된 종들로부터의 유전자 쌍을 지칭하는 것으로서, 이들은 서로 대응되고 서로 동일하거나 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화 (즉, 새로운 종의 발달) 에 의해 갈라진 유전자 (예컨대, 오르토로그 (orthologous) 유전자), 및 유전적 중복으로 분리된 유전자 (예컨대, 반이 (paralogous) 유전자) 를 포괄한다.
본원에서 사용된 바, "오르토로그" 및 "오르토로그 유전자"는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자 (즉, 상동 유전자) 로부터 진화된 상이한 종의 유전자들을 지칭한다. 전형적으로, 오르토로그들은 진화의 과정 동안 동일한 기능을 유지한다. 오르토로그들의 동정은 새로이 서열 분석된 게놈 내에서의 신뢰할 만한 유전자 기능 예측에 사용된다.
본원에서 사용된 바, "반이" 및 "반이 유전자" 는 게놈 내 중복에 의해 관련된 유전자들을 지칭한다. 오르토로그들이 진화의 과정동안 동일 기능을 유지한 반면, 반이들은 새로운 기능을 진화시키는데, 그럼에도 불구하고 일부 기능들은 종종 본래의 것과 관련되어 있다. 반이 유전자들의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 모두 세린 프로테이나제이며 동일 종 내에 함께 발생하는 트립신, 키모트립신, 엘라스타제 및 트롬빈을 인코딩하는 유전자들이 있다.
본원에서 사용된 바, "상동성" 은 서열 유사성 또는 동일성을 지칭하며, 동일성이 바람직하다. 이 상동성은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정된다 (예컨대, Smith 및 Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA 등의 프로그램; 및 Devereux 등, Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).
본원에서 사용된 바, "유사 서열" 은 유전자의 기능이 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제를 기초로 한 유전자와 본질적으로 동일한 것이다. 추가로, 유사 유전자들은, 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제의 서열과의 서열 동일성이 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이다. 다르게는, 유사 서열은 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제 영역에서 발견되는 유전자에 대하여 70 내지 100% 의 정렬을 갖고/갖거나 셀룰로모나스 균주 69B4 염색체 내의 유전자들과 정렬되는 영역에서 발견되는 5 내지 10 개 이상의 유전자를 가진다. 추가적인 구현예들에서, 상기 특성들 중 하나 이상이 상기 서열에 적용된다. 유사 서열은 공지의 서열 정렬 방법들로 결정된다. 보통 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이나, 상기 및 하기 언급된 바와 같이, 서열들을 정렬시키는데 사용되는 기타의 방법들이 있다.
한가지 유용한 알고리즘의 예는 PILEUP 이다. PILEUP 은 점진적 쌍 정렬을 사용하여 관련 서열들의 군으로부터 다중의 서열 정렬을 생성시킨다. 이는 또한 상기 정렬을 생성시키는데 사용된 군집 관계들을 보여주는 트리 (tree) 를 작성할 수 있다. PILEUP 은 Feng 및 Doolittle (Feng 및 Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]) 의 점진적 정렬 방법의 간소화를 사용한다. 상기 방법은 Higgins 및 Sharp (Higgins 및 Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]) 에 기술된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 매개변수들로는, 3.00 의 디폴트 갭 웨이트, 0.10 의 디폴트 갭 길이 웨이트, 및 가중된 엔드 갭이 있다.
또 다른 유용한 알고리즘의 예는, Altschul 등에 의해 기술된 BLAST 알고리즘이다(Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 및 Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다(Altschul 등, Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 수 개의 검색 매개변수를 사용하는데, 이 중 대다수는 디폴트 값으로 설정된다. 조절가능한 매개변수들은 하기 값들로 설정된다: 오버랩 범위 (span) = 1, 오버랩 단편 (fraction) = 0.125, 단어 임계값 (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 매개변수들은 동적인 값들이며, 관심 서열에 대해 검색되는 특정 서열의 구성 및 특정 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립된다. 그러나, 상기 값들을 조절하여 민감도를 증가시킬 수 있다. % 아미노산 서열 동일성 값은 정렬된 영역 내에서 정합하는 동일 잔기들의 수를 "보다 긴" 서열의 잔기들의 총 수로 나누어 결정된다. 상기 "보다 긴" 서열은 정렬된 영역 내에서 실제 잔기의 수가 가장 많은 것이다(정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입되는 갭은 무시함).
따라서, "퍼센트 (%) 핵산 서열 동일성" 은 출발 서열 (즉, 관심 서열) 의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다. 바람직한 방법은 각각 1 및 0.125 로 설정된 오버랩 범위 및 오버랩 단편과 함께, 상기 디폴트 매개변수들로 설정된 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 이용한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이 핵산의 한 가닥을 염기쌍 형성을 통해 상보 가닥과 결합시키는 방법을 지칭한다.
핵산 서열이 중간 내지 고도의 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 특이적으로 기준 핵산 서열에 혼성화하는 경우에, 상기 핵산 서열은 기준 핵산 서열에 "선택적으로 혼성화가능"한 것으로 고려된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 탐침자의 용융 온도 (Tm) 에 기초한다. 예를 들어, "최고 엄격성"은 전형적으로 약 Tm-5 ℃ (탐침자의 Tm 보다 5°이하임) 에서 일어나고; "고도 엄격성"은 상기 Tm 의 약 5-10 ℃ 이하에서 일어나며; "중간 엄격성"은 상기 탐침자의 Tm 의 약 10-20 ℃ 이하에서 일어나고; "저 엄격성"은 상기 Tm 의 약 20-25 ℃ 이하에서 일어난다. 기능상으로, 최고 엄격 조건은 혼성화 탐침자에 대하여 엄밀한 동일성 또는 거의 엄밀한 동일성을 가진 서열을 동정하는데 사용될 수 있으며; 반면 중간 또는 저 엄격성의 혼성화는 폴리뉴클레오티드 서열 동족체를 동정하거나 검출하는데 사용될 수 있다.
중간 및 고도의 엄격한 혼성화 조건은 당업계에 주지되어 있다. 고도의 엄격한 조건의 예로서는, 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X Denhardt 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/㎖ 변성된 담체 DNA 중에서의 약 42 ℃ 에서의 혼성화 후, 실온에서 2X SSC 및 0.5% SDS 중에서 2 회 세척 및 42 ℃ 에서의 0.1X SSC 및 0.5% SDS 중에서 2 회 추가 세척하는 것이 있다. 중간 엄격한 조건의 예로서는, 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 황산염 및 20 mg/㎖ 변성된 전단된 연어 정자 DNA 를 포함한 용액 중에서 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 약 37 - 50 ℃ 에서 1x SSC 중에서 여과기들을 세척하는 것이 있다. 당업계의 숙련된 자들은 탐침자 길이 등등의 인자들을 조절하는데 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 법을 알고 있다.
본원에서 사용된 바, "재조합" 은, 이종 핵산 서열의 도입으로 변형되었거나 또는 세포가 이렇게 변형된 세포에서 유래한 것인 세포 또는 벡터에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래의 (재조합이 아닌) 형태에 속하는 동일 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 고의적인 인간 개입의 결과로서 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않은 중에, 다르게 비정상적으로 발현된 본래적 유전자를 발현한다. "재조합", "재조합하는 것" 및 "재조합된" 핵산을 생성하는 것은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 절편의 집합체이고, 이때 상기 집합체는 키메라 유전자를 일으킨다.
바람직한 구현예에서, 변이 DNA 서열은 하나 이상의 코돈 내에서 부위집중 돌연변이 생성 (site saturation mutagenesis) 으로 생성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 부위집중 돌연변이 생성은 2 개 이상의 코돈들에 대하여 수행된다. 또 다른 구현예에서, 변이 DNA 서열은 야생형 서열과의 상동성이 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과 또는 98% 초과이다. 대안적인 구현예들에서, 변이 DNA 는 예를 들어, 방사선 조사, 니트로소구아니딘 등의 임의의 공지된 변이 생성 방법을 사용하여 생체내에서 생성된다. 상기 목적 DNA 서열을 그 후 단리하고, 본원에 제시된 방법에서 사용한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "표적 서열"은, 도입되는 서열이 상기 숙주 세포 게놈 내로 삽입되는 것이 바람직한 경우에 상기 서열을 인코딩하는 숙주 세포 내 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 상기 표적 서열은 기능적인 야생형 유전자 또는 오페론을 인코딩하는 반면, 다른 구현예들에서, 상기 표적 서열은 기능적인 변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능적 유전자 또는 오페론을 인코딩한다.
본원에서 사용된 바, "측면 서열" 은 논의되는 서열의 상류 또는 하류 중 어느 하나의 임의 서열을 지칭한다(예컨대, 유전자 A-B-C 에 있어서, 유전자 B 는 A 및 C 유전자 서열들의 측면에 위치한다). 바람직한 구현예에서, 상기 도입되는 서열의 양 측면에 상동성 박스가 위치한다. 또 다른 구현예에서, 도입 서열 및 상동성 박스는 양 측면에 스터퍼 서열이 위치해 있는 단위를 포함한다. 일부 구현예들에서, 측면 서열은 한쪽 측면에만 존재하나(3' 또는 5' 둘 중 하나), 바람직한 구현예들에서는, 표적 서열의 양 측면에 존재한다. 일부 구현예들에서, 측면 서열은 한쪽 측면에만 존재하나(3' 또는 5' 둘 중 하나), 바람직한 구현예들에서는, 표적 서열의 양 측면에 존재한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "스터퍼 서열"은 상동성 박스들 (전형적으로 벡터 서열들) 의 측면에 위치하는 임의의 잉여 DNA 를 지칭한다. 그러나, 상기 용어는 임의의 비-상동 DNA 서열을 포괄한다. 임의 이론에 제한되고자 하는 것은 아니나, 스터퍼 서열은 세포가 DNA 획득을 개시하도록 하는 중요하지 않은 표적을 제공한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은 증폭된 유전자가 게놈 내에 초기에 존재했던 것보다 큰 복제수로 존재하도록 특정 DNA 서열을 과잉적으로 복제하는 방법을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 약물 (예컨대, 저해가능 효소에 대한 저해제) 의 존재하에서의 배양에 의해 세포를 선별하면, 상기 약물의 존재하에서의 성장에 필요한 유전자 산물을 인코딩하는 내재성 유전자의 증폭 또는 이 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 (즉, 입력) 서열의 증폭, 또는 둘 다가 일어난다.
"증폭" 은 주형 특이성을 수반하는 핵산 복제의 특별한 경우이다. 이는 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이나 특이적 주형에는 의존적이지 않은 복제) 와는 대조적이다. 주형 특이성은 여기에서 복제 (즉, 적절한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 의 정확도 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 "표적" 특이성의 관점에서 빈번히 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 선별해 내기 위해 탐색된다는 의미에서 "표적들"이다. 증폭 기술은 일차적으로는 이 선별을 위해 고안되어 왔다.
본원에서 사용된 바, 용어 "공-증폭"은 증폭가능 표지자를 다른 유전자 서열 (즉, 발현 벡터 내에 포함된 것들 등의 하나 이상의 선별불가의 유전자들을 포함한) 과 함께 단일 세포 내로 도입하고, 상기 세포가 증폭가능 표지자 및 나머지 선별불가 유전자 서열들을 모두 증폭하도록 적절한 선택압을 적용하는 것을 지칭한다. 상기 증폭가능 표지자는 물리적으로 다른 유전자 서열들에 연결시키거나 또는, 대안적으로는 하나는 증폭가능 표지자를 포함하고 다른 하나는 선별불가 표지자를 포함한 2 개의 별개의 DNA 조각을 상기 동일 세포 내로 도입시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "증폭가능 표지자", "증폭가능 유전자" 및 "증폭 벡터" 는 적절한 배양 조건하에서 상기 유전자의 증폭을 허용하는 유전자를 인코딩하는 유전자 또는 벡터를 지칭한다.
"주형 특이성"은 효소의 선택으로 대부분의 증폭 기술에서 성취된다. 증폭 효소들은 이들이 사용되는 조건하에서 이종 핵산 혼합물 중의 특정 핵산 서열들만을 처리하는 효소들이다. 예를 들어, Qβ 복제효소의 경우, MDV-1 RNA 가 상기 복제효소의 특이적 주형이다 (예컨대, Kacian 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972] 참조). 다른 핵산들은 이 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 유사하게, T7 RNA 중합효소의 경우, 이 증폭 효소는 자신의 프로모터들에만 엄격한 특이성을 가진다(Chamberlin 등, Nature 228:227 [1970] 참조). T4 DNA 리가아제의 경우에, 상기 효소는, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 기질과 상기 주형 간에 연결 접점에서 불일치가 존재하는 경우에 상기 2개의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 연결하지 않을 것이다(Wu 및 Wallace, Genomics 4:560 [1989] 참조). 마지막으로, Taq 및 Pfu 중합효소들은, 고온에서 기능할 수 있는 이들의 능력 때문에, 프라이머들이 결합되어 그에 의해 한정되는 서열들에 대하여 높은 특이성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며; 고온은 결과적으로 표적 서열들과의 프라이머 혼성화를 촉진하고 비-표적 서열들과의 혼성화는 촉진하지 않는 열역학적 조건들을 생성한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "증폭가능 핵산"은 임의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산들을 지칭한다. "증폭가능 핵산"이 보통 "시료 주형"을 포함할 것으로 예기된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "시료 주형"은 "표적" (하기 정의됨) 이 존재하는지에 대하여 분석되는 시료에서 기원한 핵산을 지칭한다. 반대로, "배경 주형"은 시료에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 시료 주형 이외의 핵산과 관련하여 사용된다. 배경 주형은 가장 종종 우발적이다. 이는 이월 (carryover) 의 결과일 수 있고, 또는 상기 시료로부터 정제 제거되어야 하는 핵산 오염물의 존재에 기인한 것일 수도 있다. 예를 들어, 검출되어야 할 것들 외의 유기체들로부터의 핵산은 테스트 시료 중에 배경으로 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "프라이머"는 정제된 제한효소 절단으로 자연적으로 발생한 것이든지 또는 합성적으로 생산된 것이든지 간에, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 산물의 합성이 유도되는 조건 (즉, 뉴클레오티드 및 유도제 예컨대 DNA 중합효소 등의 존재 하 및 적당한 온도 및 pH) 하에 놓일 때 합성 개시 시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 프라이머는 증폭 중의 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이나, 다르게는 이중 가닥일 수도 있다. 이중 가닥일 경우, 상기 프라이머를, 신장 산물을 제조하기 위해 사용하기 전에 먼저 그의 가닥들이 분리되도록 처리한다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 상기 프라이머는 상기 유도제의 존재하에서 신장 산물들의 합성을 촉발시키기에 충분히 길어야 한다. 상기 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 원천 및 상기 방법의 사용을 포함하는 다수의 인자들에 따라 다를 것이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "탐침자" 는 정제된 제한효소 절단으로 자연적으로 발생한 것이든지 또는 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭으로 제조된 것이든지 간에, 또 다른 관심 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드의 서열) 를 지칭한다. 탐침자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 탐침자은 특정 유전자 서열의 검출, 동정 및 단리에 유용하다. 본 발명에 사용되는 임의의 탐침자를, 이에 제한되는 것은 아니나 효소 (예컨대, ELISA 및 효소-기반 조직화학 검정), 형광, 방사선 및 발광 시스템들을 포함하는 임의의 검출 시스템에서 검출가능하도록 임의의 "리포터 분자" 로 표지하는 것을 고려할 수 있다. 본 발명을 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지로 제한하려는 의도는 없다.
본원에서 사용된 바, 용어 "표적" 은 중합효소 연쇄 반응과 관련하여 사용될 때, 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머가 결합한 핵산의 영역을 지칭한다. 따라서, 상기 "표적" 은 다른 핵산 서열들로부터의 선별되도록 추구된다. "단편"은 상기 표적 서열 내의 핵산 영역으로 정의된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR") 은, 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제 4,683,195 호, 4,683,202 호 및 4,965,188 호의 방법들을 지칭하는데, 이들에는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 의 혼합물 중의 표적 서열의 단편의 농도를 증가시키는 방법들이 있다. 표적 서열을 증폭시키는 이 방법은 목적하는 표적 서열을 함유한 DNA 혼합물에 과량의 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입시킨 후, DNA 중합효소의 존재하에서 정확한 순서의 열 주기 (thermal cycling) 를 수행하는 것으로 이루어진다. 상기 2 개의 프라이머들은 상기 이중 가닥 표적 서열의 각 가닥들에 상보적이다. 증폭을 실행하기 위하여, 상기 혼합물을 변성시키고 그 후 프라이머를 표적 분자 내의 이들의 상보 서열들에 어닐링 (annealing) 시킨다. 어닐링 후, 상기 프라이머들은 중합효소에 의해 신장되어 새로운 상보 가닥들의 쌍이 형성된다. 변성, 프라이머 어닐링 및 중합효소 신장의 단계들을 수 회 (즉, 변성, 어닐링 및 신장이 하나의 "주기" 를 구성하며; 다수의 "주기들"이 있다) 반복하여 고농도의 목적 표적 서열의 증폭된 단편을 수득할 수 있다. 상기 목적 표적 서열의 증폭된 단편의 길이는 서로에 대한 프라이머들의 상대적 위치로 결정되며, 따라서, 이 길이는 제어가능한 매개변수이다. 상기 방법의 반복 양상 때문에, 상기 방법은 "중합효소 연쇄 반응" (이하 "PCR") 으로 지칭된다. 목적하는 표적 서열의 증폭 단편들이 상기 혼합물 중 주된 서열 (농도의 면에서) 이 되기 때문에, 이들은 "PCR 증폭된" 것으로 불린다.
본원에서 사용된 바, 용어 "증폭 시약"은, 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외한 증폭에 필요한 시약들 (데옥시리보뉴클레오티드 삼인산, 완충액 등) 을 지칭한다. 전형적으로, 기타 반응 구성요소들과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 위치시키고 담는다.
PCR 로, 게놈 DNA 중의 특정 표적 서열의 단일 사본을 수 개의 상이한 방법론 (예컨대, 표지된 탐침자를 이용한 혼성화; 비오틴-부착된 프라이머 편입 후 아비딘-효소 접합체 검출; 32P-표지된 데옥시뉴클레오티드 삼인산, 예컨대 dCTP 또는 dATP 의, 상기 증폭된 단편으로의 편입) 에 의해 검출가능한 수준으로 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA 외에, 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 적절한 프라이머 분자들의 집합으로 증폭시킬 수 있다. 특히, PCR 방법 자체로 생성된 증폭된 단편들은, 그 자체가 이후의 PCR 증폭을 위한 효율적인 주형들이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "PCR 산물", "PCR 절편" 및 "증폭 산물" 은, 변성, 어닐링 및 신장의 PCR 단계들의 2 회 이상의 순환이 완료된 후 생성된 화합물들의 혼합물을 지칭한다. 이 용어들은 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 단편의 증폭이 있는 경우를 포괄한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열들의 복제 및 증폭을 지칭한다. 이 방법에서는, 역전사가 PCR 에 연결되어 있는데, 가장 흔히는 미국 특허 제 5,322,770 호 (참조로서 본원에 포함됨) 에 기술된 바의, 열안정 중합효소를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 중합효소의 역전사효소 활성에 기인하여 cDNA 로 변환되며, 그 후, 상기 중합효소의 중합활성 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같이) 으로 증폭된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한효소" 는 특정 뉴클레오티드 서열 또는 그 부근의 이중가닥 DNA 를 절단하는 세균성 효소를 지칭한다.
"제한효소 인식부위" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및 절단되는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 흔히 DNA 절편들의 삽입 부위이다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 제한효소 인식부위들은 선택적 표지자 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단으로 가공된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "염색체 통합"은 도입되는 서열을 숙주 세포의 염색체 내로 도입하는 방법을 지칭한다. 상기 형질전환 DNA 의 상동 영역들은 상기 염색체의 상동 영역들에 정렬한다. 그 후, 상동성 박스들 사이의 서열은 이중 교차 (즉, 상동 재조합) 중에 상기 도입되는 서열로 치환된다. 본 발명의 일부 구현예들에서, DNA 구축물의 불활성화 염색체 단편의 상동 구획들은 바실러스 염색체의 고유한 염색체 영역의 측면에 위치한 상동 영역들에 정렬한다. 그 후, 상기 고유한 염색체 영역은 이중 교차 (즉, 상동 재조합) 중에 상기 DNA 구축물에 의해 결실된다.
"상동 재조합"은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오티드 서열들의 부위에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 사이의 DNA 절편들의 교환을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다.
본원에서 사용된 바 "상동 서열"은, 비교를 위해 최적으로 정렬시 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대한 서열 동일성이 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 또는 70% 인 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 구현예들에서, 상동 서열들은 85% 내지 100% 서열 동일성을 가지는 반면, 다른 구현예들에서는 90% 내지 100% 의 서열 동일성이 존재하고, 더욱 바람직한 구현예들에서는, 95% 내지 100% 의 서열 동일성이 존재한다.
본원에서 사용된 바 "아미노산"은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 지칭한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바, "관심 단백질" 및 "관심 폴리펩티드"는 목적하는 및/또는 평가되는 단백질/폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 상기 관심 단백질은 세포내 발현되는 한편, 다른 구현예들에서, 이는 분비되는 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구현예들에서, 이들 효소는 본 발명의 세린 프로테아제들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 관심 단백질은 신호 펩티드에 융합된 분비 폴리펩티드이다(즉, 분비될 단백질 상에서의 아미노-말단 신장). 거의 모든 분비 단백질들은 표적화 및 막을 통한 전구체 단백질의 전좌에서 결정적인 역할을 하는 아미노-말단 단백질 신장을 사용한다. 이 신장된 부분은 막 이동 중간에 또는 그 후 즉시 단백질 분해로 제거된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "이종 단백질"은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 이종 단백질의 예로서는, 프로테아제를 포함하는 가수분해효소 등의 효소들이 있다. 일부 구현예들에서, 상기 단백질들을 인코딩하는 유전자가 자연 발생적 유전자들인 반면, 다른 구현예들에서는, 변이 및/또는 합성 유전자들이 사용된다.
본원에서 사용된 바, "상동 단백질"은 세포 내 본래적인 또는 자연 발생적인 단백질 또는 폴리펩티드이다. 바람직한 구현예들에서, 상기 세포가 그람-양성 세포인 반면, 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 세포는 바실러스 숙주 세포이다. 대안적인 구현예들에서, 상기 상동 단백질은 다른 유기체들에 의해 생산되는 본래적인 단백질인데, 이에 제한되는 것은 아니나 대장균 (E. coli), 스트렙토마이세스, 트리코더마, 및 아스퍼질러스가 있다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 통하여 상동 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포괄한다.
본원에서 사용된 바, "오페론 영역"은 공통의 프로모터로부터 단일 전사 단위로 전사되는 인접 유전자들의 군을 포함하며, 이에 의해 공동-조절된다. 일부 구현예들에서, 상기 오페론은 조절 유전자를 포함한다. 가장 바람직한 구현예들에서, RNA 수준으로 측정시 고도로 발현되나 미지의 또는 불필요한 기능을 가진 오페론이 사용된다.
본원에서 사용된 바, "항균 영역"은 항균 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한 영역이다.
폴리뉴클레오티드는, 그의 본래적 상태로 또는 당업계의 숙련된 자들에게 공지된 방법으로 조작시에, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 이의 절편을 생성할 경우, RNA 또는 폴리펩티드를 "인코딩한다"고 불린다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥 또한 상기 서열들을 인코딩한다고 불린다.
당업계에 공지된 바와 같이, RNA 중합효소로 DNA 를 전사하여 RNA 를 생산할 수 있으나, RNA 를 역전사효소로 역전사하여 DNA 를 생산할 수 있다. 따라서 DNA 는 RNA 를 인코딩할 수 있고, 그 반대도 가능하다.
용어 "조절 단편" 또는 "조절 서열" 또는 "발현 제어 서열"은 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 상기 인코딩된 아미노산 서열의 발현을 일으키는 DNA 의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 상기 아미노산을 인코딩하는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 저해, 억제 또는 촉진할 수 있다.
"숙주 균주" 또는 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 DNA 를 포함한 발현 벡터용으로 적당한 숙주를 지칭한다.
효소는, 상기 효소가 세포 내에서 대응 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 더 높은 수준으로 발현될 경우 숙주 세포 내에서 "과발현"이다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. IUPAC-IUB JCBN (Joint Commission on Biochemical Nomenclature) 에 따라 정의되는 아미노산에 대한 3-문자 코드는 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된다. 또한, 폴리펩티드가 유전 코드의 축퇴성에 기인하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것은 자명하다.
"전구서열"은, 신호 서열 및 성숙한 프로테아제 사이에 존재하는 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구 서열의 절단으로 성숙한 활성 프로테아제가 생성될 것이다.
용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드"는 단백질의 성숙한 또는 전구 형태의 분비에 참여할 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 지칭한다. 신호 서열에 대한 이 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 인코딩되는 모든 아미노산 서열들을 포함하는 것을 의도한다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내재성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예컨대, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또 다른 분비 단백질을 인코딩하는 유전자로부터일 수도 있다. 한 가지 예시적인 외인성 신호 서열은 바실러스 렌투스 (ATCC 21536) 로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 잔여물에 융합된 바실러스 서브틸리스 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 최초 7 개 아미노산 잔기들을 포함한다.
용어 "하이브리드 신호 서열"은, 서열 일부가 발현될 유전자의 신호 서열에 융합되어 발현 숙주로부터 수득되는 신호 서열을 지칭한다. 일부 구현예들에서는, 합성 서열이 이용된다.
용어 "실질적으로 동일한 신호 활성"은 발효 배지 내로의 프로테아제의 실질적으로 동일한 분비로 표시되는 바의 신호 활성을 지칭하는 것으로서, 예를 들어 발효 배지 프로테아제 수준이 서열번호: 5 및/또는 9 의 신호 서열에 의해 제공되는 바와 같이 발효 배지 내 분비된 프로테아제 수준의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상이다.
단백질 또는 펩티드의 "성숙한" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 지칭한다. 예시하자면, 본 발명의 프로테아제의 성숙한 형태는 적어도 서열번호: 8 의 1-189 의 잔기 위치들과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작동가능하게 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 지칭한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관계된 추가적인 폴리뉴클레오티드들 (예컨대, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오티드) 을 가질 수 있다.
"자연 발생적인 효소"는 자연에서 발견되는 것과 동일한 변형되지 않은 아미노산 서열을 가진 효소를 지칭한다. 자연 발생적 효소들은 본래적 효소들, 특정 미생물에서 자연적으로 발현되거나 발견되는 효소들을 포함한다.
용어 "~로부터 유래한" 및 "~에서 수득한" 은 당해 유기체의 균주에 의해 생산되거나 생산가능한 프로테아제 뿐 아니라, 이러한 균주에서 단리한 DNA 서열에 의해 인코딩되고 상기와 같은 DNA 서열을 포함한 숙주 유기체에서 생산되는 프로테아제도 지칭한다. 부가적으로, 상기 용어는, 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 인코딩되며 당해 프로테아제의 특이적 특성들을 가지는 프로테아제를 지칭한다. 예시하자면, "셀룰로모나스에서 유래한 프로테아제"는 셀룰로모나스에 의해 천연적으로 생성되는 단백질 분해 활성을 가진 효소들 뿐 아니라, 유전자 조작 방법들의 사용을 통해 상기 세린 프로테아제를 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 비-셀룰로모나스 유기체들에 의해 생산되는, 셀룰로모나스 원천에 의해 생산되는 것들과 유사한 세린 프로테아제들도 지칭한다.
이 정의의 영역 내에서 "유도체"는 일반적으로, 상기 유도체가 야생형의, 본래적인 또는 부모 형태에서와 유사한 목적들에 유용한 정도로 야생형의, 본래적인 또는 부모 형태에서 관찰되는 특징적인 단백질 분해 활성을 보유한다. 세린 프로테아제의 기능적인 유도체들은 본 발명의 세린 프로테아제의 일반적 특징들을 갖는, 자연 발생적으로, 합성으로 또는 재조합으로 생산된 펩티드 또는 펩티드 절편들을 포괄한다.
용어 "기능적 유도체"는 세린 프로테아제를 인코딩하는 핵산의 기능상의 특징을 갖는 핵산 유도체를 지칭한다. 본 발명의 세린 프로테아제를 인코딩하는 핵산의 기능적인 유도체들은 자연 발생적으로, 합성으로 또는 재조합으로 생산된 핵산 또는 절편들을 포괄하고, 본 발명의 특징적인 세린 프로테아제를 인코딩한다. 본 발명에 따른 세린 프로테아제를 인코딩하는 야생형 핵산은 당업계에 공지된 유전 코드의 축퇴성에 기초한 자연 발생적 대립유전자 및 동족체들을 포함한다.
2 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일한"은, 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정된 바, 상기 2 개 서열 중 최대 대응으로 정렬시 동일한 잔기들의 수를 지칭한다.
용어 "최적 정렬"은 가장 높은 퍼센트 동일성 점수를 주는 정렬을 지칭한다.
2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오티드 및/또는 유전자 서열들 (적절한 경우) 에 대하여 "퍼센트 서열 동일성", "퍼센트 아미노산 서열 동일성", "퍼센트 유전자 서열 동일성" 및/또는 "퍼센트 핵산/폴리뉴클레오티드 서열 동일성"은, 상기 서열들이 최적으로 정렬시 2 개 서열들 내의 동일한 잔기들의 백분율을 지칭한다. 따라서, 80% 아미노산 서열 동일성은 최적으로 정렬된 2 개의 폴리펩티드 서열 내에서 80% 의 아미노산들이 동일하다는 것을 의미한다.
2 개의 핵산 또는 폴리펩티드들의 맥락에서 "실질적으로 동일한" 이라는 어구는, 따라서, 표준 매개변수를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예컨대, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 기준 서열과 비교시 서열 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상 및 바람직하게는 99% 이상인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 2 개의 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다는 한가지 표시는, 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드에 대하여 면역학적으로 교차-반응성이 있는 것이다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환에 의해 다른 폴리펩티드들은 면역학적 교차-반응성이 있다. 따라서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 2 개 펩티드들이 보존적 치환에 의해서만 다른 경우, 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2 개의 핵산 서열들이 실질적으로 동일한 또 다른 표시는, 상기 두 분자들이 엄격한 조건들 (예컨대, 중간 내지 고도 엄격성의 범위 내) 하에서 서로 혼성화하는 것이다.
이 맥락에서 "동등한" 이라는 어구는, 중간 내지 최고의 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 에 나타난 바와 같은 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 세린 프로테아제 효소들을 지칭한다. 예를 들어, 동등하다는 것은, 동등한 성숙 세린 프로테아제가 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 가진 성숙한 셀룰로모나스 세린 프로테아제에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및/또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다.
용어 "단리된" 또는 "정제된"은 그의 본래적 환경 (예컨대, 이것이 자연 발생적인 것일 경우 그의 천연적 환경) 으로부터 제거된 물질을 지칭한다. 예를 들어, 상기 물질은, 자연 발생적 또는 야생형 유기체 중에, 또는 자연 발생적 또는 야생형 유기체로부터 발현시에 정상적으로는 존재하지 않는 구성요소와 조합되어 존재하는 것보다 더 높거나 더 낮은 농도로 특정 조성물 중에 존재할 때 "정제된" 것으로 말해진다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니나, 자연계에서 공존하는 물질들의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 또한 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리된 것일 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어 전기영동 겔 또는 블럿 (blot) 내에서 본질적으로 하나의 밴드를 야기할 경우, 정제된 것으로 말해진다.
DNA 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 그의 천연 유전적 환경에서 제거되어 기타의 이질적인 또는 원치 않는 코딩 서열들이 없고, 유전적으로 조작된 단백질 생산 시스템 내에 사용하기에 적당한 형태인 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 단리된 분자들은 이들의 천연 환경으로부터 분리된 것들이며, cDNA 및 게놈 클론들이 있다. 본 발명의 단리된 DNA 분자들에는, 이들이 통상적으로는 결합되어 있는 다른 유전자들은 없으나, 프로모터 및 종결자 등의 자연 발생적 5' 및 3' 비번역 영역이 포함되어 있을 수 있다. 결합 영역들의 동정은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다(예컨대, Dynan 및 Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열"은 다르게는 "클로닝된 DNA 서열"로 지칭된다.
단백질과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 그의 본래적 환경과 다른 조건에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질에는, 다른 단백질, 특히 기타 상동 단백질들이 실질적으로 부재하다. 단리된 단백질은, SDS-PAGE 로 측정시, 10% 초과로 순수하고, 바람직하게는 20% 초과로 순수하며, 더욱 더 바람직하게는 30% 초과로 순수하다. 본 발명의 또 다른 면은, SDS-PAGE 로 측정된 바, 고도로 정제된 형태 (즉, 40% 초과, 60% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 97% 초과, 및 심지어 99% 초과로 순수) 의 단백질을 포괄한다.
본원에서 사용된 바, 용어, "조합 돌연변이법"은 출발 서열의 변형체들의 라이브러리들을 생성시키는 방법들을 지칭한다. 이들 라이브러리들에서, 변형체들은 미리 정의된 변이들의 집합으로부터 선택되는 1 개 또는 수 개의 변이들을 포함한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 변이들의 집합의 일원들이 아닌 임의적 변이들을 도입시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법들에는, 2000 년 10 월 26 일자 출원된 미국 특허 출원 일련번호 제 09/699.250 호 (이는 참조로서 본원에 포함됨) 에 개시된 것들이 있다. 대안적인 구현예들에서, 조합 돌연변이 방법들은 상업적으로 입수가능한 키트들 (예컨대, QuikChange® Multisite, Stratagene, San Diego, CA) 을 포괄한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "변이체들의 라이브러리"는 그 자신들의 대부분의 게놈이 동일하나 하나 이상의 상이한 유전자들의 동족체를 포함하는 세포들의 집단을 지칭한다. 이러한 라이브러리는, 예를 들어, 향상된 특질을 가진 유전자들 또는 오페론들을 동정하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "출발 유전자"는 본 발명을 사용하여 개선 및/또는 변화될 관심 단백질을 인코딩하는 관심 유전자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "다중 서열 정렬" ("MSA") 은, 알고리즘 (예컨대, Clustal W) 을 사용하여 정렬된 일련의 출발 유전자의 다수의 동족체들을 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열"은 관심 특정 단백질 또는 서열의 모든 변형체들이 비교되는 전형적인 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 용어는 또한 관심 DNA 서열 내에 가장 흔히 존재하는 뉴클레오티드들을 나타내는 서열을 지칭한다. 유전자의 각 위치에 있어서, 상기 보존 서열은 MSA 내 상기 위치에서 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "보존 변이"는 출발 유전자의 서열과 보존 서열 간의 차이를 지칭한다. 보존 변이들은 출발 유전자의 서열들과 MSA 로부터 생성된 보존 서열을 비교함으로써 동정된다. 일부 구현예들에서, 보존 변이들은 보존 서열과 더욱 유사하도록 출발 유전자 내로 도입된다. 보존 변이들은 또한, 출발 유전자 내의 아미노산을, 출발 유전자 내의 상기 아미노산의 빈도수와 비교해 상기 위치에서 MSA 에서 보다 빈번히 발견되는 아미노산으로 변경시키는 아미노산 변경을 포함한다. 따라서, 보존 변이라는 용어는, 출발 유전자의 아미노산을, MSA 내에서 상기 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변경을 포함한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "최초 명중(hit)"은 조합적 보존 돌연변이유발 라이브러리를 스크리닝하여 동정된 변형체를 지칭한다. 바람직한 구현예들에서, 최초 명중들은 출발 유전자와 비교시 향상된 성능 특성들을 가진다.
본원에서 사용된 바, 용어 "향상된 명중"은 강화된 조합적 보존 돌연변이유발 라이브러리를 스크리닝하여 동정된 변형체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "향상 변이" 및 "성능-강화 변이" 는 상기 출발 유전자 내로 도입시에 성능 향상을 유도하는 변이를 지칭한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 변이들은 상기 방법의 스크리닝 단계 동안 동정된 명중들을 서열분석함으로써 동정된다. 대부분의 구현예들에서, 명중들에서 보다 흔히 발견되는 변이들은, 스크리닝되지 않은 조합적 보존 돌연변이유발 라이브러리와 비교시, 향상 변이들일 가능성이 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "강화된 조합적 보존 돌연변이유발 라이브러리는, 보다 이전의 CCM 돌연변이유발 및 스크리닝 단계로부터의 스크리닝 및/또는 서열분석 결과에 기초하여 설계 및 구축되는 CCM 라이브러리를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 상기 강화된 CCM 라이브러리는 보다 이전의 CCM 단계로부터 생성된 최초 명중의 서열에 기초한다. 추가적인 구현예들에서, 상기 강화된 CCM 은 보다 이전의 돌연변이유발 및 스크리닝 단계로부터의 최초 명중에서 빈번히 관찰된 변이들이 촉진되도록 고안된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 이는 보다 이전의 CCM 라이브러리들에서 사용된 다른 프라이머들과 비교해 성능-감소 변이를 인코딩하는 프라이머들을 생략하거나 또는 성능-강화 변이를 인코딩하는 프라이머들의 농도를 증가시킴으로써 성취된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "성능-감소 변이"는, 스크리닝되지 않은 조합적 보존 돌연변이유발 라이브러리와 비교시 스크리닝으로부터 생성된 명중들에서 덜 빈번히 발견되는 조합적 보존 돌연변이유발 라이브러리 중의 변이를 지칭한다. 바람직한 구현예들에서, 상기 스크리닝 방법은 "성능-감소 변이"를 포함한 풍부한 변형체들을 제거 및/또는 감소시킨다.
본원에서 사용된 바, 용어 "기능적 검정"은 단백질의 활성에 대한 표시를 제공하는 검정을 지칭한다. 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 용어는 단백질에 대하여 그의 보통의 역량 중에서 작용하는 능력을 분석하는 검정 시스템을 지칭한다. 예를 들어, 효소의 경우, 기능적 검정은 반응을 촉매함에 있어서의 효소의 효과성을 측정하는 것을 수반한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "표적 특성"은 변경될 출발 유전자의 특성을 지칭한다. 본 발명을 임의의 특정 표적 특성에 제한하고자 하는 것은 아니다. 그러나, 일부 바람직한 구현예들에서, 표적 특성이 유전자 산물의 안정성 (예컨대, 변성, 단백질 분해 또는 기타 분해 인자들에 대한 저항성) 인 반면, 다른 구현예들에서는, 생산 숙주 내 생산 수준이 변경된다. 실제로는, 출발 유전자의 임의의 특성이 본 발명에서 사용될 것으로 예상된다.
본원에서 사용된 바, 핵산의 맥락에서 용어 "특성" 또는 이의 문법적 등가어는 선별 또는 검출될 수 있는 핵산의 임의의 특질 또는 속성을 지칭한다. 이들 특성들로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리펩티드에의 결합에 영향을 미치는 특성, 특정 핵산을 포함한 세포에 부여된 특성, 유전자 전사에 영향을 미치는 특성 (예컨대, 프로모터 강도, 프로모터 인식, 프로모터 조절, 인핸서 기능), RNA 가공에 영향을 미치는 특성 (예컨대, RNA 스플라이싱, RNA 안정성, RNA 입체배위 (conformation) 및 전사후 변형), 번역에 영향을 미치는 특성 (예컨대, mRNA 의 수준, 조절, 리보솜 단백질에의 결합, 번역후 변형) 이 있다. 예를 들어, 원하는 특질을 야기하거나 또는 원하지 않는 특질들을 동정하기 위하여 전사 인자, 중합효소, 조절인자 등에 대한 핵산의 결합 부위를 변경시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바, 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "특성" 또는 이의 문법적 등가어는 선별 또는 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의 특질 또는 속성을 지칭한다. 이들 특성들로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 산화적 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리성 안정성, pH 활성 프로필, 단백질 분해에 대한 저항성, KM, kcat, kcat/kM 비, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합할 수 있는 능력, 수용체에 결합할 수 있는 능력, 분비되는 능력, 세포 표면 상에 전시되는 능력, 올리고머화할 수 있는 능력, 신호할 수 있는 능력, 세포 증식을 자극할 수 있는 능력, 세포 증식을 저해할 수 있는 능력, 세포 사멸 (apoptosis) 을 유도할 수 있는 능력, 인산화 또는 당화에 의해 변형되는 능력, 질병을 치료할 수 있는 능력이 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "스크리닝"은 당업계에서의 통상의 의미를 가지며, 일반적으로 다단계 과정이다. 첫번째 단계에서, 변이 핵산 또는 그로부터의 변형 폴리펩티드를 생성한다. 두번째 단계에서는, 상기 변이 핵산 또는 변형 폴리펩티드의 특성을 결정한다. 세번재 단계에서는, 상기 결정된 특성을, 대응하는 전구체 핵산의 특성, 대응하는 자연 발생적 폴리펩티드의 특성 또는 변이 핵산 생성용 출발 물질 (예컨대, 최초 서열) 의 특성과 비교한다.
변경된 특성을 가진 핵산 또는 단백질을 수득하기 위한 스크리닝 절차는 출발 물질의 특성에 좌우되는데, 상기 변이 핵산의 생성은 상기 출발 물질의 변형을 용이하게 하고자 의도된 것은 당업계의 숙련된 자에게 자명할 것이다. 당업계의 숙련된 자는 따라서 본 발명이 스크리닝되는 임의의 특정 특성에 제한되지 않으며 특성들에 대한 하기의 설명이 단지 예증적인 실례들을 나열한 것임을 이해할 것이다. 임의 특정 특성에 대한 스크리닝 방법은 일반적으로 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 변이 전후의 결합, pH, 특이성 등을 측정할 수 있는데, 이때 변화는 변경을 나타낸다. 바람직하게는, 스크리닝을, 이에 제한되는 것은 아니나 칩, 파아지 표면발현 및 다중 기질 및/또는 지시자들을 이용한 검정들을 포함하는, 복합 시료들을 동시에 스크리닝하는 것을 포함하는 고효율 방식으로 수행한다.
본원에서 사용된 바, 일부 구현예들에서, 스크리닝은, 변형체들의 집단으로부터 관심 변형체들을 풍부하게 하는 선별 단계를 포괄한다. 이들 구현예들의 예로서는, 숙주 유기체에 대하여 성장 이점을 제공하는 변형체들의 선별 및 파아지 표면발현 또는 임의의 기타 표면발현 방법이 있는데, 이때 변형체들을, 이들의 결합 또는 촉매 특성에 기초하여 변형체들의 집단으로부터 포획할 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 변형체들의 라이브러리를 스트레스 (열, 프로테아제, 변성) 에 노출시키고, 이어서 여전히 그대로인 변형체들을 스크리닝으로 동정하거나 선별로 풍부하게 한다. 상기 용어가 임의의 적당한 선별 방법을 포괄하는 것을 의도한다. 실제로, 본 발명을 임의 특정 스크리닝 방법에 제한시키고자 하는 의도는 없다.
본원에서 사용된 바, 용어 "표적화된 랜덤화"는 1 개 또는 수 개의 위치가 랜덤화된 다수의 서열들을 생산하는 방법을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 랜덤화는 랜덤화 위치에서 완성된다(즉, 모든 4 개의 뉴클레오티드들, A, T, G 및 C 이 발생할 수 있다). 대안적인 구현예들에서, 뉴클레오티드의 랜덤화는 상기 4 개 뉴클레오티드들의 부분집합에 한정된다. 표적화된 랜덤화는 1 개 또는 수 개의 관심 단백질을 코딩하는 서열의 1 개 또는 수 개의 코돈들에 적용될 수 있다. 발현시, 생성되는 라이브러리들은, 상기 랜덤화된 코돈의 랜덤화 전략으로 결정되는 바 하나 이상의 아미노산 위치가 모든 20 개 아미노산들의 혼합물 또는 아미노산들의 부분집합을 포함할 수 있는 단백질 집단들을 생성한다. 일부 구현예들에서, 표적화된 랜덤화로부터 생성된 집단의 개별 구성원들은, 코돈의 표적화된 또는 랜덤한 삽입 또는 결실 때문에, 아미노산의 수가 다르다. 또 다른 구현예들에서, 생산되는 단백질 집단들 내에 합성 아미노산들이 포함된다. 일부 바람직한 구현예들에서는, 표적화된 랜덤화로부터 생성된 집단의 구성원들 중 대다수는 상기 보존 서열에 대해서 출발 유전자보다 더 큰 서열 상동성을 보인다. 일부 구현예들에서, 상기 서열은 하나 이상의 관심 단백질을 인코딩한다. 대안적인 구현예들에서, 상기 단백질들은 상이한 생물학적 기능을 갖는다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 도입되는 서열은 하나 이상의 선별가능 표지자를 포함한다.
용어 "변형 서열" 및 "변형 유전자들"은 본원에서 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 간섭을 포함한 서열을 지칭하는데에 상호교환가능하게 사용된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 변형 서열의 발현 산물은 절단된 단백질이다(예컨대, 상기 변형이 상기 서열의 결실 또는 간섭일 경우). 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 절단된 단백질은 생물학적 활성을 보유한다. 대안적인 구현예들에서, 상기 변형 서열의 발현 산물은 신장된 단백질이다(예컨대, 상기 핵산 서열 내로의 삽입을 포함한 변형). 일부 구현예들에서, 삽입은 절단된 단백질을 일으킨다(예컨대, 상기 삽입의 결과로 정지 코돈이 형성되는 경우). 따라서, 삽입은 발현 산물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질 둘 중 하나를 야기할 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "변이 서열" 및 "변이 유전자는 상호교환가능하게 사용되며, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈 내의 변경을 가진 서열을 지칭한다. 상기 변이 서열의 발현 산물은 야생형과 비교하여 변경된 아미노산 서열을 가진 단백질이다. 상기 발현 산물은 변경된 기능적 역량 (예컨대, 강화된 효소적 활성) 을 가진다.
용어 "변이유발 프라이머" 또는 "변이유발 올리고뉴클레오티드" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨) 는 주형 서열의 일부에 대응하고 그에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 조성물을 지칭하는 것으로 의도하였다. 변이유발 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확히 매칭되지는 않을 것이며, 상기 프라이머 내의 부정합(들)은 핵산 라이브러리 내로 목적하는 변이를 도입하는데 사용된다. 본원에서 사용된 바, "비-변이유발 프라이머" 또는 "비-변이유발 올리고뉴클레오티드"는 주형 핵산에 정확히 매칭할 올리고뉴클레오티드 조성물을 지칭한다. 본 발명의 한 가지 구현예에서는, 변이유발 프라이머들만 사용된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서는, 변이유발 프라이머가 포함된 하나 이상의 영역에 있어서, 올리고뉴클레오티드 혼합물에 비-변이유발 프라이머도 포함되도록 프라이머들을 설계한다. 변이유발 프라이머들 및 상기 변이유발 프라이머들 중 하나 이상에 대응하는 비-변이유발 프라이머들의 혼합물을 첨가함으로써, 다양한 조합적 변이 패턴들을 제시하는 결과적인 핵산 라이브러리를 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 변이 핵산 라이브러리의 구성원 중 일부가 특정 위치들에서 그들의 전구체 서열을 보유한 반면 다른 구성원들은 상기 위치들에서 변이인 것을 원하는 경우, 상기 비-변이유발 프라이머들은 주어진 잔기에 대하여 핵산 라이브러리 내 특정 수준의 비-변이 구성원들을 획득하게 하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법들은 길이가 일반적으로 10 내지 50 개 염기, 더욱 바람직하게는 길이가 약 15 내지 45 개 염기인 변이유발 및 비-변이유발 올리고뉴클레오티드들을 이용한다. 그러나, 목적하는 돌연변이유발 결과를 수득하기 위하여 염기 10 개보다 더 짧거나 또는 염기 50 개보다 더 긴 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 대응 변이유발 및 비-변이유발 프라이머들에 있어서, 대응 올리고뉴클레오티드들의 길이가 동일할 필요는 없으며, 단지, 부가될 변이에 대응하는 영역 내에 오버랩이 존재하면 된다.
프라이머들은 본 발명에 따라 미리 정의된 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 생성된 라이브러리가 동일 또는 상이한 부위에서 상당한 수준의 일정 특정 변이 및 보다 적은 양의 다른 변이를 갖는 것을 원할 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조절함으로써, 목적하는 편향 라이브러리를 생산하는 것이 가능하다. 대안적으로는, 보다 적은 또는 보다 많은 양의 비-변이유발 프라이머들을 첨가함으로써, 변이 핵산 라이브러리 내에 대응 변이(들)가 생성되는 빈도를 조절하는 것이 가능하다.
본원에서 사용된 바, "인접 변이"라는 어구는 동일 올리고뉴클레오티드 프라이머 내에 나타나는 변이들을 지칭한다. 예를 들어, 인접 변이들은 서로 인접하여 있거나 또는 가까이에 있을 수 있으나, 이들은 동일 프라이머에 의해 생성된 변이 주형 핵산들에 도입될 것이다.
본원에서 사용된 바, "비인접 변이"라는 어구는 별개의 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 나타난 변이들을 지칭한다. 예를 들어, 비인접 변이들은 개별적으로 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 의해 생성된 변이 주형 핵산들 내로 도입될 것이다.
용어 "야생형 서열" 또는 "야생형 유전자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 것으로서, 숙주 세포 내의 본래적인 또는 자연 발생적인 서열을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트의 출발 지점인 관심 서열을 지칭한다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질 중 하나를 인코딩할 수 있다. 상동 단백질은 숙주 세포가 간섭없이 생산하는 것이다. 이종 단백질은 숙주 세포가 간섭 없이는 생산하려 하지 않는 것이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "항체"는 면역글로불린을 지칭한다. 항체들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 항체들을 생산하는 것이 바람직한 임의 종들로부터 직접 수득되는 면역글로불린들을 포함한다. 또한, 본 발명은 변형 항체들을 포괄한다. 상기 용어는 또한, 완전한 항체가 결합하는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 보유하며 다클론성 항체들, 단클론성 항체들, 키메라 항체들, 항-이디오타입 (항-ID) 항체들을 포함하는 항체 절편들을 지칭한다. 항체 절편들은, 이에 제한되는 것은 아니나 상보성 결정 영역 (CDR), 단쇄 절편 가변 영역 (scFv), 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다. 다클론성 및 단클론성 항체들 또한 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, 상기 항체들은 단클론성 항체들이다.
용어 "산화 안정한"은 본 발명의 단백질 분해, 가수분해, 세정 또는 기타 과정 동안에, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출 또는 접촉되면서, 우세한 조건들하에서 주어진 기간에 걸쳐 지정된 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제들을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은, 예를 들어, 적어도 1 분, 3 분, 5 분, 8 분, 12 분, 16 분, 20 분 등의 주어진 기간에 걸쳐 표백- 또는 산화제에 접촉된 후, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 단백질 분해 활성을 보유한다. 일부 구현예들에서, 상기 안정성은 실시예들에 기술된 바와 같이 측정한다.
용어 "킬레이트제에 안정한"은, 본 발명의 단백질 분해, 가수분해, 세정 또는 기타 과정 동안에, 예를 들어 킬레이트화제에 노출 또는 접촉되면서, 우세한 조건들하에서 주어진 기간에 걸쳐 지정된 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제들을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은, 예를 들어, 적어도 10 분, 20 분, 40 분, 60 분, 100 분 등의 주어진 기간에 걸쳐 킬레이트화제에 접촉된 후, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 단백질 분해 활성을 보유한다. 일부 구현예들에서, 상기 킬레이트제 안정성은 실시예들에 기술된 바와 같이 측정한다.
용어 "열적으로 안정한" 및 "열에 안정한"은 단백질 분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 기타 과정 동안에, 예를 들어 변경된 온도에 노출되면서, 우세한 조건들하에서 주어진 기간에 걸쳐 확인된 온도들에 노출된 후 지정된 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제들을 지칭한다. 변경된 온도는, 증가되거나 저하된 온도들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 예를 들어, 적어도 60 분, 120 분, 180 분, 240 분, 300 분 등의 주어진 기간에 걸쳐 변경된 온도에 노출된 후, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 단백질 분해 활성을 보유한다. 일부 구현예들에서, 상기 열안정성은 실시예들에 기술된 바와 같이 측정한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 맥락에서 용어 "강화된 안정성"은 다른 세린 프로테아제 (예컨대, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교시 일정 시간에 걸쳐 단백질 분해 활성을 보다 높게 보유한 것을 지칭한다.
산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 맥락에서 용어 "감소된 안정성"은 다른 세린 프로테아제 (예컨대, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교시 일정 시간에 걸쳐 단백질 분해 활성을 보다 낮게 보유한 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "세정 조성물"은 다른 표시가 없는 한, 과립 또는 분말-형태의 다목적 또는 "중질 (heavy-duty)" 세척제, 특별히 세정 세제; 액체, 겔 또는 페이스트-형태의 다목적 세척제, 특히 소위 중질 액체 유형; 액체 고급-섬유 (fine-fabric) 세제; 손 세척용 식기세척제 또는 경질 식기세척제, 특별히 거품이 풍부한 유형의 것들; 가정용 및 공업용의 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 유형들을 포함하는, 기계세척용 식기세척제; 항균성 손세척용 유형을 포함하는 액체 세정 및 소독제, 세정 바(bar), 구강세정제, 의치 세정제, 자동차 또는 카페트 샴푸, 욕실 세정제; 헤어 샴푸 및 헤어-린스; 샤워 겔 및 폼 바스 (foam bath) 및 금속 전용 세제; 및 표백 첨가제 및 "얼룩제거용 스틱 (얼룩-stick)" 또는 전처리 유형들 등의 세정 보조제를 포함한다.
본원에서 실시예에 기술된 테스트 방법들이 본 발명의 각 매개변수들의 값들을 결정하는데 사용되는 것은 자명할 것인 바, 이러한 발명은 본원에서 기술되고 청구되어 있다.
다른 언급이 없는 한, 모든 구성요소 또는 조성물의 수준은 상기 구성요소 또는 조성물의 활성 수준과 관련되며, 시중에서 구매가능한 공급원 중에 존재할 수 있는 불순물, 예를 들어, 잔류 용매 또는 부산물은 제외한다.
효소 구성요소 중량은 전체 활성 단백질을 기준으로 한다.
모든 백분율 및 비는 다른 표시가 없는 한 중량기준으로 계산된다. 모든 백분율 및 비는 다른 표시가 없는 한 전체 조성물을 기준으로 계산된다.
본 명세서 전체를 통해 제시되는 모든 최대 수치상의 제한은, 마치 본원에 보다 낮은 수치상의 제한이 명백히 기재된 것처럼, 이와 같은 모든 보다 낮은 수치상의 제한을 포함한다는 것은 자명할 것이다. 본 명세서 전체를 통해 제시되는 모든 최저 수치상의 제한은, 마치 보다 높은 수치상의 제한이 본원에 명백히 기재된 것처럼, 이와 같은 모든 보다 높은 수치상의 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체를 통해 제시되는 모든 수치상의 범위는, 마치 본원에 보다 좁은 수치상의 범위가 모두 명백히 기재된 것처럼, 이러한 보다 넓은 수치상의 범위 내에 속하는 모든 보다 좁은 수치상의 범위를 포함할 것이다.
용어 "세정 활성"은 본 발명의 단백질 분해, 가수분해, 세정 또는 기타 과정 동안에 우세한 조건들하에서 상기 프로테아제에 의해 성취되는 세정 성능을 지칭한다. 일부 구현예들에서, 세정 성능은, 얼룩들을 표준 세척 조건들에 적용한 후 다양한 크로마토그래피적, 분광분석적 또는 기타 정량적 방법론들에 의해 결정된 바, 효소 민감성 얼룩들, 예를 들어 풀, 혈액, 우유, 또는 난백 (egg) 단백질에 관한 다양한 세정 검정들의 적용으로 결정된다. 대표적인 검정들로는, 이에 제한되는 것은 아니나 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (둘 다 참조로서 본원에 포함됨) 에 기술된 것들, 뿐만 아니라 하기 실시예에 포함된 방법들이 있다.
용어 프로테아제의 "세정 유효량"은 특정 세정 조성물 내 목적하는 효소 활성 수준을 성취하는 본원에서 앞서 기술된 프로테아제의 양을 지칭한다. 이러한 유효량은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 확인되며, 사용되는 특정 프로테아제, 세정 응용, 특정 조성의 상기 세정 조성물, 및 액체 또는 건조 (예컨대, 과립, 바) 조성물의 필요성 여부 등의 다수의 인자들에 기초한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "세정 부속물"은 목적하는 특정 유형의 세정 조성물 및 생성물의 형태 (예컨대, 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 스프레이, 정제, 겔; 또는 발포체 조성물) 에 대하여 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하는데, 상기 물질들은 또한 바람직하게는 상기 조성물에 사용되는 프로테아제 효소와 융화성이 있다. 일부 구현예들에서, 과립 조성물이 "조밀한" 형태인 반면, 다른 구현예들에서는, 상기 액체 조성물은 "농축된" 형태이다.
세정 활성의 맥락에서 용어 "강화된 성능"은, 표준 세척 주기 및/또는 복수의 세척 주기 후 보통의 평가로 결정되는 바, 난백, 우유, 풀 또는 혈액 등의 일정 효소 민감성 얼룩에 대한 증가된 또는 보다 큰 세정 활성을 지칭한다.
세정 활성의 맥락에서 용어 "감소된 성능"은 표준 세척 주기 후 보통의 평가로 결정되는 바, 난백, 우유, 풀 또는 혈액 등의 일정 효소 민감성 얼룩에 대한 감소된 또는 보다 덜한 세정 활성을 지칭한다.
세정 활성의 맥락에서 용어 "상대적 성능"은, 이에 제한되는 것은 아니나 OPTIMASETM 프로테아제 (Genencor), PURAFECTTM 프로테아제 제품 (Genencor), SAVINASETM 프로테아제 (Novozymes), BPN'-변형체들 (예컨대, 미국 특허 제 Re 34,606 호 참조), RELASETM, DURAZYMETM, EVERLASETM, KANNASETM 프로테아제 (Novozymes), MAXACALTM, MAXAPEMTM, PROPERASETM 프로테아제 (Genencor; 또한, 미국 특허 제 Re 34,606 호, 미국 특허 제 5,700,676 호; 5,955,340 호; 6,312,936 호; 6,482,628 호 참조) 및 B. 렌투스 변형 프로테아제 제품 [예를 들어 WO 92/21760, WO 95/23221 및/또는 WO 97/07770 에 기술된 것들 (Henkel)] 을 포함하는, 비교 서브틸리신 프로테아제 (예컨대, 시판되는 프로테아제) 의 세정 활성의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상을 지칭한다. 대표적인 서브틸리신 프로테아제 변형체들로는, 이에 제한되는 것은 아니나 BPN'의 76, 101, 103, 104, 120, 159, 167, 170, 194, 195, 217, 232, 235, 236, 245, 248 및/또는 252 위치들과 등가인 잔기 위치들에서 치환 또는 결실을 가진 것들이 있다. 세정 성능은 표준 세척 주기 조건들 후 보통의 분광분석적 또는 분석적 방법론으로 결정된 바, 풀, 혈액 또는 우유 등의 효소 민감성 얼룩에 관한 다양한 세정 검정들에서 본 발명의 프로테아제들을 상기 서브틸리신 프로테아제들과 비교하여 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 바, "저 세제 농도" 시스템은 세척수 내에 약 800 ppm 미만의 세제 구성요소들이 존재하는 세제들을 포함한다. 일본 세제들은 보통 세척수 내에 대략 667 ppm 의 세제 구성요소들을 함유하는 바, 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 고려된다.
본원에서 사용된 바, "중 세제 농도" 시스템은 세척수 내에 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 구성요소들이 존재하는 세제들을 포함한다. 북아메리카 세제들은 보통 세척수 내에 대략 975 ppm 의 세제 구성요소들을 함유하므로, 일반적으로 중 세제 농도 시스템으로 고려된다. 브라질의 세제들은 전형적으로 세척수 내에 대략 1500 ppm 의 세제 구성요소들을 가진다.
본원에서 사용된 바, "고 세제 농도" 시스템은 세척수 내에 약 2000 ppm 초과의 세제 구성요소들이 존재하는 세제들을 포함한다. 유럽의 세제들은 세척수 내에 대략 3000-8000 ppm 의 세제 구성요소들을 갖기 때문에, 일반적으로 고 세제 농도 시스템으로 고려된다.
본원에서 사용된 바, "섬유 세정 조성물"로서는, 세탁 부가 조성물 및 얼룩진 섬유 (예컨대, 천, 리넨류 및 기타 섬유 물질) 의 담금 및/또는 전처리에 사용하기에 적당한 조성물들을 포함하는 손 및 기계 세탁 세제 조성물이 있다.
본원에서 사용된 바, "비-섬유 세정 조성물"로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 식기세척 세제 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물 및 개인 세정 조성물을 포함하는, 비-섬유 (즉, 섬유) 표면 세정 조성물들이 있다.
본원에서 "조밀한" 형태의 세정 조성물은 밀도 및, 조성물의 면에서는 무기 충진제 염의 양으로 가장 잘 나타난다. 무기 충진제 염은 분말 형태의 세제 조성물의 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충진제 염은 상당한 양으로 존재하는데, 전형적으로 전체 조성물에 대하여 전형적으로 17 ~ 35 중량% 이다. 대조적으로, 조밀한 조성물에서, 충진제 염은 전체 조성물의 15% 를 초과하지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예들에서, 충진제 염은 조성물에 대하여 10 중량%, 또는 더욱 바람직하게는, 5 중량% 를 초과하지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예들에서, 무기 충진제 염은 황산염 및 염화물의 알칼리- 및 알칼리토금속 염에서 선택된다. 바람직한 충진제 염은 황산나트륨이다.
II. 세린 프로테아제 효소들 및 세린 프로테아제 효소들을 인코딩하는 핵산
본 발명은 프로테아제들을 인코딩하는 아미노산 서열들을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 이들 폴리뉴클레오티드들은 서열번호: 6 ~ 8 에 나타난 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 92% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상이고/이거나 (예컨대, 상기 아미노산 서열의 적어도 일부가, 기질들의 펩티드 연결들에 대한 가수분해를 촉매하는 성숙한 프로테아제를 포함하는, 단백질 분해 활성을 가짐), 확인된 세척 조건들하에서 상당하는 또는 강화된 세척 성능을 나타낸다.
일부 구현예들에서, 퍼센트 동일성 (아미노산 서열, 핵산 서열, 유전자 서열) 은, 2 개의 서열들을 정렬시키고, 상기 정렬된 서열들 간에 정합되는 것들의 정확한 개수를 세고, 보다 짧은 서열의 길이로 나눈 후, 그 결과에 100 을 곱함으로써, 상기 2 개 분자들 간의 서열 정보의 직접 비교로 결정된다. 상기한 것들 등의 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램들이 이들 분석에 사용된다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하는 프로그램들은 위스콘신 서열 분석 패키지, 버전 8 (Genetics Computer Group, Madison, WI) 에서 이용가능하며, 예를 들어, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램들이 있는데, 이들은 또한 Smith 및 Waterman 알고리즘에 의존한다. 이들 프로그램들은 제조자에 의해 추천되고 상기 언급된 위스콘신 서열 분석 패키지에 기술된 디폴트 매개변수들로써 용이하게 이용된다.
서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 알고리즘인데, 이는 문헌 [Altschul, 등, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)] 에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 내 동일 길이의 단어로 정렬시 일정 양의 값의 임계 점수 T 에 부합하거나 이를 만족시키는 문의 서열 내 W 길이의 짧은 단어들을 동정함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (high scoring sequence pair, HSP) 을 동정하는 것을 수반한다. 이들 초기의 이웃 단어 명중들은 이들을 포함한 더 긴 HSP 를 찾기 위한 출발점으로 작용한다. 상기 단어 명중들은 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 비교되는 두 서열 각각을 따라 양 방향으로 확장된다. 단어 명중들의 단어 신장은 하기 경우에 정지된다: 상기 누적 정렬 점수가 최대 성취 값에서 X 양만큼 떨어질 때; 상기 누적 점수가 0 이하로 될 때; 또는 두 서열 중 하나의 말단에 도달할 때. 상기 BLAST 알고리즘 매개변수들인 W, T 및 X 는 상기 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 상기 BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어길이 (W) 11, BLOSUM62 점수 행렬 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참조) 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M'5, N'-4 및 양 가닥들의 비교를 사용한다.
그 후 상기 BLAST 알고리즘은 2 개 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(예컨대, Karlin 및 Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993] 참조). 상기 BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 한 가지 유사성 측정은 최소 합 확률 (P(N)) 인데, 이는 2 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 간의 정합이 우연히 일어났을 가능성의 지표를 제공한다. 예를 들어, 핵산은, 테스트 핵산과 세린 프로테아제 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우에 본 발명의 세린 프로테아제 핵산과 유사하다고 간주된다. 상기 테스트 핵산이 세린 프로테아제 폴리펩티드를 인코딩하는 경우에는, 상기 비교의 결과로서 최소 합 확률이 약 0.5 미만 및 더욱 바람직하게는 약 0.2 미만일 경우에 지정된 세린 프로테아제 핵산과 유사한 것으로 간주된다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 서열들은 BLAST 및 단백질 번역 서열 툴로 분석되었다. 일부 실험에서, 바람직한 버전은 BLAST (Basic BLAST 버전 2.0) 이었다. 프로그램으로는 "BlastX" 를 선택하였고, 데이터베이스로는 "nr"을 선택하였다. 표준/디폴트 매개변수 값들을 이용하였다.
일부 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 1 에 개시된, 길이가 대략 1621 개 염기쌍인 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 시작 코돈은 서열번호: 1 에서 볼드체로 나타나 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 이들 아미노산 서열들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들은, 발현될 경우, 서열번호: 9 의 아미노산 1 ~ 28 을 인코딩하는 신호 서열 (서열번호: 5 의 뉴클레오티드 1 ~ 84); N-말단 전구서열 (서열번호: 6 의 아미노산 잔기 29 ~ 198 을 인코딩하는 뉴클레오티드 84 ~ 594); 성숙한 프로테아제 서열 (서열번호: 8 의 아미노산 잔기 1 ~ 189 를 인코딩하는 서열번호: 2 의 뉴클레오티드 595 ~ 1161); 및 C-말단 전구서열 (서열번호: 6 의 아미노산 잔기 388 ~ 495 를 인코딩하는 뉴클레오티드 1162 ~ 1486) 을 인코딩하는 것으로 여겨지는 1485 개 염기쌍 부분 (서열번호: 2 의 잔기 1 ~ 1485) 을 포함한다. 대안적으로는, 상기 신호 펩티드, 상기 N-말단 전구서열, 성숙한 세린 프로테아제 서열 및 C-말단 전구서열은 1 ~ 189 로 번호가 매겨진 서열번호: 6 의 성숙한 프로테아제의 아미노산 잔기들, 즉, 신호 펩티드 (잔기 -198 내지 -71), N-말단 전구서열 (잔기 -171 내지 -1), 성숙한 세린 프로테아제 서열 (잔기 1 ~ 189) 및 C-말단 전구서열 (잔기 190 ~ 298) 과 관련하여 번호가 매겨진다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 단백질 분해 활성을 가진 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드 및 전구체 프로테아제를 인코딩하는 서열번호: 2 의 일부의 뉴클레오티드 1 내지 1485 의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예dptj, 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전구체 셀룰로모나스 프로테아제 (서열번호: 3) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 1 내지 1412 의 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 셀룰로모나스 프로테아제 (서열번호: 4) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부의 뉴클레오티드 1 내지 587 의 서열을 포함한다.
숙련된 당업자에게는 자명할 것으로, 유전 코드의 축퇴성 때문에, 다양한 폴리뉴클레오티드들이 각각 서열번호: 6, 7 및/또는 8 에 제시된 신호 펩티드, 전구체 프로테아제 및/또는 성숙한 프로테아제, 또는 상기 기술된 % 서열 동일성을 가지는 프로테아제를 인코딩할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예는, 각각 신호 펩티드 및 전구체 프로테아제, 전구체 프로테아제 및/또는 성숙한 프로테아제를 인코딩하는 서열번호: 2, 3 및/또는 4 의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 뉴클레오티드 서열를 포함한 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은, 프로테아제들을 인코딩하는 DNA 의 절편 또는 일부를 제공하는데, 단 상기 인코딩된 절편은 단백질 분해 활성을 보유한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 전구체 프로테아제를 인코딩하는 서열번호: 2 의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호: 1 의 잔기 185 ~ 1672 의 서열에 대하여 상기 서열 길이의 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70%, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상을 가지는 폴리뉴클레오티드들을 포괄한다. 대안적인 구현예들에서, 상기 서열 길이의 이들 절편 또는 일부는 재조합 DNA 서열 내의 DNA 서열의 셔플링 (shuffling) 에 유용한, 상기 서열 길이의 인접 부분들이다(예컨대, 미국 특허 제 6,132,970 호 참조).
본 발명의 또 다른 구현예로서는, 당업계의 인식된 기술들에 따라 본원에 기술된 셀룰로모나스 69B4 로부터의 성숙한 프로테아제 효소 또는 단백질 분해 활성을 가지는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 단리 또는 동정하는데 사용될 수 있는 부분적 길이의 DNA 절편들을 수득하는데 사용되는, 본원에 기술된 DNA 의 절편들이 있다. 나아가, 서열번호: 1 에 제시된 DNA 는 프로테아제 또는 단백질 분해 활성을 가진 이의 일부를 인코딩하는 다른 종들 및 특히 셀룰로모나스 종으로부터의 DNA 의 상동 절편들을 동정하는데 사용된다.
또한, 본 발명은 게놈 또는 cDNA 기원의 핵산을 스크리닝하기 위한 탐침자 또는 프라이머로서 서열번호: 1 로부터 구축된 프라이머 또는 탐침자 서열 또는 적당한 이들의 일부 또는 절편 (예컨대, 적어도 약 5 ~ 20 개 또는 10 ~ 15 개 인접 뉴클레오티드) 을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은, 서열번호: 1, 2, 3 및/또는 4 내의 서열들에 기초하여 목적하는 길이의 DNA 탐침자들 (즉, 일반적으로 100 내지 1000 개 염기 길이) 을 제공한다.
일부 구현예들에서는, DNA 절편들을 전기영동으로 단리하고, 겔로부터 절단시킨 후, 상기 겔의 한천 매트릭스로부터 회수한다. 바람직한 구현예들에서는, 이 정제된 DNA 절편을 그 후 표지하여 (예를 들어, Megaprime 표지 시스템을 제조자의 지시에 따라 사용) DNA 내에 P32 를 편입시킨다. 상기 표지된 탐침자를 주어진 기간동안 (예컨대, 5 분) 95 ℃ 가 되도록 가열하여 변성시킨 후, 즉시 막 및 예비혼성화 용액에 첨가한다. 상기 혼성화 반응은 적절한 시간동안 적절한 조건들 (예컨대, 37 ℃ 에서 18 시간동안) 하에서 온건하게 진탕 또는 회전되면서 진행된다. 상기 막을 헹구고(예컨대, SSC/0.3% SDS 중에서 2 회), 그런 다음 적절한 세척 용액 중에서 온건히 교반하면서 세척한다. 목적하는 엄격도는 상기 막 (여과기) 을 세척하는 조건들의 반영이다. 본원의 일부 구현예들에서는, "저-엄격성" 조건들이 20 ℃ 에서 15 분간 0.2X SSC/0.1% SDS 용액으로 세척하는 것을 포함하는 한편, 다른 구현예들에서, "중-엄격성" 조건들은 37 ℃ 에서 30 분간 0.2X SSC/0.1% SDS 용액으로 세척하는 것을 포함하는 세척 단계를 추가로 포함하며, 한편 다른 구현예들에서, "고-엄격성" 조건들은 37 ℃ 에서 45 분간 0.2X SSC/0.1% SDS 용액으로 세척하는 것을 포함하는 세척 단계를 추가로 포함하며, 또 다른 구현예들에서, "최대-엄격성" 조건들은 37 ℃ 에서 60 분간 0.2X SSC/0.1% SDS 용액으로 세척하는 것을 포함하는 세척 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현예들은 중간, 고도 및/또는 최대 엄격성 조건들하에서 서열번호: 1, 2, 3, 4 및/또는 5 에 제시된 뉴클레오티드 서열에서 유래한 탐침자에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드들을 제공한다.
세척 후, 상기 막을 건조시키고 결합된 탐침자를 검출한다. P32 또는 또 다른 방사성동위원소를 표지물로 사용할 경우, 결합된 탐침자를 자가방사법 (autoradiography) 으로 검출한다. 기타의 탐침자들에 대한 가시화 방법들은 당업계의 숙련된 자들에 잘 알려져 있다. 결합된 탐침자의 검출은 핵산 서열이 목적하는 상동성, 및 따라서 서열번호: 1, 2, 3, 4 및/또는 5 에 대한 동일성을 가진 것을 나타내며, 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4 및/또는 5 의 핵산 서열의 일부 또는 전부를 게놈 또는 cDNA 기원의 다른 핵산과 혼성화시키는 것을 포함하는, 본 발명에 포함되는 프로테아제를 인코딩하는 핵산의 검출 방법들을 제공한다.
상기 지적한 바와 같이, 다른 구현예들에서, 혼성화 조건들은 핵산 결합 복합체의 용융 온도 (Tm) 에 기초하여 하기 설명되는 정의된 "엄격성"을 부여한다. "최대 엄격성"은 전형적으로 약 Tm - 5 ℃ (탐침자의 Tm 에서 5 ℃ 이하) 에서; "고도 엄격성"은 Tm 보다 약 5 ℃ 내지 10 ℃ 이하에서; "중간 엄격성"은 Tm 보다 약 10 ℃ 내지 20 ℃ 이하에서; 및 "저 엄격성"은 Tm 보다 약 20 ℃ 내지 25 ℃ 이하에서 일어난다. 당업계의 숙련된 자들에 공지되어 있는 바와 같이, 중간, 고도 및/또는 최대 엄격성 혼성화는, 조건들이 폴리뉴클레오티드 서열 동족체 또는 등가의 폴리뉴클레오티드 서열들을 동정 또는 검출하기에 최적이 되도록 선택된다.
또 다른 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 프로테아제들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한 핵산 구축물들 (즉, 발현 벡터들) 을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 이들 벡터들 중 하나 이상으로 형질전환된 숙주 세포들을 제공한다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 신호 서열을 추가로 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 5 에 대한 서열 동일성이 65% 이상, 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 98% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한 신호 활성을 가진 폴리뉴클레오티드들을 포괄한다. 따라서, 이들 구현예들에서, 본 발명은 추정상의 신호 서열, 및 중간, 고도 및/또는 최대 엄격성의 조건들하에서 서열번호: 5 에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 유래한 탐침자와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드들을 가진 서열을 제공하는데, 이때 상기 신호 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 신호 서열과 실질적으로 동일한 신호 활성을 가진다.
일부 구현예들에서는, 발효 배지 내로 프로테아제가 출발 물질과 실질적으로 동일한 수준으로 분비되는 것에 의해 상기 신호 활성을 알 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 3 의 신호 서열에 의해 제공되는 발효 배지 내 분비되는 프로테아제 수준의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 발효 배지 프로테아제 수준을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 분비된 프로테아제 수준은 pNA 검정 등의 프로테아제 활성 분석들로 확인된다 (예컨대, 하기 Del Mar, [1979], 참조). 그람-양성 숙주 세포 내 이종 또는 상동 단백질의 분비 수준을 측정하고 분비된 단백질들을 검출하는 또 다른 방법으로는, 상기 단백질에 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체들을 사용하는 것이 있다. 예로서는, 당업자들에게 주지되어 있는 효소결합 면역흡착분석법 (ELISA), 방사성면역측정법 (RIA) 및 FACS (fluorescent activated cell sorting) 가 있다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 서열번호: 9, 서열번호: 2 의 뉴클레오티드 잔기 위치 1 내지 85 및/또는 서열번호: 5 에 나타난 바와 같은, 신호 펩티드의 아미노산 서열 (서열번호: 5 의 뉴클레오티드 1 ~ 84) 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 본 발명은 저, 중간, 고도 엄격성 및/또는 최대 엄격성 조건들 하에서 서열번호: 5 에 나타난 핵산 서열에 혼성화하나 상기 서열과 실질적으로 동일한 신호 활성을 가지는 핵산 서열들을 추가로 포괄한다. 본 발명은 상기와 같은 모든 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열들에 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 대표적인 상보적 뉴클레오티드 서열들로는, 서열번호: 1 ~ 5 에 제시된 것들이 있다.
본 발명의 추가적인 양상은 서열번호: 6 (즉, 신호 및 전구체 프로테아제), 서열번호: 7 (즉, 전구체 프로테아제) 및/또는 서열번호: 8 (즉, 성숙한 프로테아제) 의 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 65%, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드들을 포괄한다. 이들 폴리펩티드들의 단백질 분해 활성은 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 결정되며, 세제 기능을 평가하는데 사용되는 것들과 같은 방법들이 있다. 또 다른 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 단리된 것이다. 본 발명의 추가적인 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 6, 7 또는 8 의 아미노산 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열들을 포함한다. 일부 추가적인 구현예들에서, 상기 폴리펩티드들은 서열번호: 6, 7 또는 8 의 일부와 동일하다.
일부 구현예들에서, 본 발명은, 서열번호: 6 에 제시된 바와 같이 길이가 대략 495 개 아미노산인 아미노산 서열을 포함한, 단백질 분해 활성을 가진 단리된 폴리펩티드들을 제공한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은, 서열번호: 7 에 제시된, 길이가 대략 467 개 아미노산인 아미노산 서열을 포함한, 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드들을 포괄한다. 일부 구현예들에서, 이들 아미노산 서열들은 신호 서열 (서열번호: 9 의 아미노산 1 ~ 28); 및 전구체 프로테아제 (서열번호: 7 의 아미노산 1 ~ 467) 를 포함한다. 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 N-말단 전구서열 (서열번호: 7 의 아미노산 1 ~ 170), 성숙한 프로테아제 서열 (서열번호: 8 의 아미노산 1 ~ 189) 및 C-말단 전구서열 (서열번호: 7 의 아미노산 360 ~ 467) 을 포함한 폴리펩티드들을 포괄한다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명은 전구체 프로테아제 서열 (예컨대, 서열번호: 7 의 아미노산 1 ~ 467) 을 포함한 폴리펩티드들을 포괄한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 아미노산들 (예컨대, 서열번호: 8 의 1 ~ 189) 을 포함한 성숙한 프로테아제 서열을 포함한 폴리펩티드들을 포괄한다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니나 아미노산 서열 상동성 연구를 통해 동정되는 미크로코시니애를 포함하는, 세균 종들에서 유래한 상기 기술한 서열의 아미노산 서열들을 포함한 폴리펩티드들 및/또는 프로테아제들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 전구체 미크로코시니애 프로테아제의 아미노산 잔기는, 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제 내의 특정 잔기 또는 상기 잔기의 일부와 상동이거나 (즉, 일차 또는 삼차 구조 내의 위치에서 대응되거나) 유사할 경우(즉, 결합, 반응 또는 화학적으로 상호작용하는 기능적 역량이 동일 또는 유사함), 셀룰로모나스 균주 69B4 의 잔기와 등가이다.
일부 바람직한 구현예들에서, 일차 구조에 대한 상동성을 확립하기 위하여, 전구체 프로테아제의 아미노산 서열을, 셀룰로모나스 균주 69B4 성숙 프로테아제 아미노산 서열 및 특히 서열이 알려진 프로테아제들과 같은 모든 또는 대다수의 셀룰로모나스에서 불변인 것으로 확인된 보존 잔기들의 집합과 직접 비교한다. 상기 보존 잔기들을 정렬시킨 후, 정렬을 유지시키기 위하여 필요한 삽입 및 결실을 허용하면서 (즉, 임의적 결실 및 삽입을 통한 보존 잔기들의 제거를 피함), 성숙한 프로테아제 (서열번호: 8) 및 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 특정 아미노산들에 대응하는 잔기들을 결정한다. 보존 잔기들의 정렬은 바람직하게는 이러한 잔기들의 100% 를 보존하여야 한다. 그러나, 보존 잔기들에 대하여 75% 초과 또는 45% 정도의 낮은 정렬도 등가의 잔기들을 한정하는데 적절하다. 그러나, 서열번호: 8 의 3 작용기 촉매인 His32/Asp56/Ser137 의 보존은 유지되어야 한다.
예를 들어, 일부 구현예들에서, 셀룰로모나스 균주 69B4 및 기타 상기 기술한 미크로코시니애 종으로부터의 프로테아제들의 아미노산 서열들은 정렬시에 아미노산 서열들 간의 최대량의 상동성을 생성한다. 이들 서열들의 비교는, 각 서열에 다수의 보존 잔기들이 포함되어 있음을 나타낸다. 이들은 문의된 전구체 또는 성숙 미크로코시니애 프로테아제에서 동정된 아미노산들의 등가의 잔기 위치들을 확립하기 위하여 동정 및 이용되는 잔기들이다.
이들 공통 잔기들은 미크로코시니애 동족체 (예컨대, 본원에서 셀룰로모나스 셀라세아 (DSM 20118) 및/또는 셀룰로모나스 동족체) 중의 하나 이상에서 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제의 대응 아미노산 잔기들을 확인하는데 사용된다. 이들 특정 아미노산 서열들은 셀룰로모나스 69B4 프로테아제의 서열과 정렬될 때 보존 잔기들의 최대 상동성을 생성한다. 이 정렬에 의해, 셀룰로모나스 69B4 의 서열들 및 특정 잔기 위치들이 다른 셀룰로모나스 종과의 비교로 관찰된다. 따라서, 상기 3 작용기 촉매 (예컨대, 셀룰로모나스 69B4 프로테아제에서) 에 대한 등가의 아미노산은 다른 미크로코시니애 종에서 동정가능하다. 본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제 동족체들은 서열번호: 8 의 His32/Asp56/Ser137 에 대한 등가물을 포함한다.
2 개의 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차-반응성 있는 것이다. 면역학적 교차반응성을 측정하는 방법들은 당업계에 기술되어 있으며, 본원의 실시예에도 기술되어 있다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환들에 의해 상이해진 폴리펩티드들은 면역학적 교차-반응성이 있다. 따라서, 2 개의 폴리펩티드들이 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 폴리펩티드는 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다.
본 발명은 다양한 공급원으로부터 수득되는 프로테아제들을 포괄한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 세균에서 수득되고, 다른 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 진균류에서 수득된다.
일부 특히 바람직한 구현예들에서, 세균성 원천은 미크로코시니애 아목의 구성원들에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 세균성 원천은 프로미크로모노스포라시애 과이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로미크로모노스포라시애 종은 프로미크로모노스포라 시트레아 (Promicromonospora citrea) (DSM 43110), 프로미크로모노스포라 수쿠모에 (Promicromonospora sukumoe) (DSM 44121), 프로미크로모노스포라 에어롤라타 (Promicromonospora aerolata) (CCM 7043), 프로미크로모노스포라 빈도보넨시스 (Promicromonospora vindobonensis) (CCM 7044), 마이셀리게네란스 실리고우엔스 (Myceligenerans xiligouense) (DSM 15700), 이소프테리콜라 바리아빌리스 (Isoptericola variabilis) (DSM 10177, 구(舊) 셀룰로시미크로비움 바리아빌레), 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 (Cellulosimicrobium cellulans) (DSM 20424, 구(舊) 노카르디아 셀룰란스, 셀룰로모나스 셀룰란스), 셀룰로시미크로비움 푼케이 (Cellulosimicrobium funkei), 자일라니모나스 셀룰로실리티카 (Xylanimonas cellulosilytica) (LMG 20990), 자일라니박테리움 울미 (Xylanibacterium ulmi) (LMG 21721) 및 자일라니미크로비움 파크노대 (Xylanimicrobium pachnodae) (DSM 12657, 구(舊) 프로미크로모노스포라 파크노대) 를 포함하고/포함하거나 이들로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 세균성 원천 셀룰로모나다시애 과이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나다시애 종은 셀룰로모나스 피미 (ATCC 484, DSM 20113), 셀룰로모나스 비아조테아 (ATCC 486, DSM 20112), 셀룰로모나스 셀라세아 (ATCC 487, 21681, DSM 20118), 셀룰로모나스 덴버렌시스 (Cellulomonas denverensis), 셀룰로모나스 호미니스 (DSM 9581), 셀룰로모나스 플라비게나 (ATCC 482, DSM 20109), 셀룰로모나스 페르시카 (ATCC 700642, DSM 14784), 셀룰로모나스 이라넨시스 (ATCC 700643, DSM 14785); 셀룰로모나스 페르멘탄스 (ATCC 43279, DSM 3133), 셀룰로모나스 겔리다 (ATCC 488, DSM 20111, DSM 20110), 셀룰로모나스 휴밀라타 (ATCC 25174, 구(舊) 악티노마이세스 휴미페러스 (Actinomyces humiferus)), 셀룰로모나스 우다 (ATCC 491, DSM 20107), 셀룰로모나스 자일라닐리티카 (LMG 21723), 셀룰로모나스 셉티카 (Cellulomonas septica), 셀룰로모나스 파라호미니스 (Cellulomonas parahominis), 오엘스코비아 투르바타 (ATCC 25835, DSM 20577, 이명(異名) 셀룰로모나스 투르바타), 오엘스코비아 제넨시스 (DSM 46000), 오엘스코비아 엔테로필라 (ATCC 35307, DSM 43852, 구(舊) 프로미크로모노스포라 엔테로필라), 오엘스코비아 파우로메타볼라 (DSM 14281), 및 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 를 포함하고/포함하거나 이들로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 구현예들에서, 상기 세균성 원천은 또한, 테르모비피다 (Thermobifida) 종, 라로박터 (Rarobacter) 종 및/또는 리소박터 (Lysobacter) 종을 포함하고/포함하거나 이들로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 테르모비피다 종은 테르모비피다 푸스카 (Thermobifida fusca) (구(舊) 테르모모노스포라 푸스카 (Thermomonospora fusca)) (tfpA, AAC23545; Lao 등, Appl. Environ. Microbiol., 62: 4256-4259 [1996] 참조) 이다. 대안적인 구현예에서, 상기 라로박터 종은 라로박터 파에시타비더스 (Rarobacter faecitabidus) (RPI, A45053; 예컨대, Shimoi 등, J. Biol. Chem., 267:25189-25195 [1992] 참조) 이다. 또 다른 구현예에서, 상기 리소박터 종은 리소박터 엔자이모게네스 (Lysobacter enzymogenes) 이다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 진균성 원천들에서 수득 및/또는 단리한 폴리펩티드들 및/또는 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 진균성 원천에는 메타리지움 (Metarhizium) 종이 있다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 진균성 원천은 메타리지움 아니소플리애 (Metarhizium anisopliae) (CHY1 (CAB60729)) 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 미국 특허 제 5,401,657 호 (이는 참조로서 본원에 포함됨) 에 기술된 분류학적 위치의 군집 2 에서 선택되는 셀룰로모나스 균주에서 유래한 폴리펩티드들 및/또는 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. US 특허 제 5,401,657 에서, 알칼리성 호수 내 및 주위에서 단리한 20 개의 세균 균주들을 하기를 기초로 그람-양성 세균으로 공지된 세균 유형에 배정하였다: (1) Dussault 변형 그람 염색 반응 (Dussault, J. Bacteriol., 70:484-485 [1955]); (2) KOH 민감도 테스트 (Gregersen, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 5:123-127 [1978]; Halebian 등, J. Clin. Microbiol., 13:444-448 [1981]); 및 (3) 아미노펩티다제 반응 (Cerny, Eur. J. Appl. Microbiol., 3:223-225 [1976]; Cerny, Eur. J. Appl. Microbiol., 5:113-122 [1978]). 또한, 대부분의 경우, Collins 에 의해 기술된 방법 (Collins, In Goodfellow 및 Minnikin (eds), Chemical Methods in Bacterial Systematics, Academic Press, London [1985], pp. 267-288 참조) 을 사용하는 퀴논 분석 (Collins 및 Jones, Microbiol. Rev., 45:316-354 [1981]) 을 기초로 확인하였다. 또한, 균주들을 200 개 특성들에 대하여 테스트하고, 수리분류학의 원리들을 사용하여 결과들을 분석할 수 있다(예컨대, Sneath 및 Sokal, Numerical Taxonomy, W.H. Freeman & Co.,. San Francisco, CA [1973] 참조). 테스트되는 대표적인 특성들, 테스트 방법, 및 체계화 방법들 역시 미국 특허 제 5,401,657 호에 기술되어 있다.
미국 특허 제 5,401,657 호에 기술된 바와 같이, 200 개 단위 특성들로 이루어진 표현형적 자료의 점수를 매기고, "n.times.t" 행렬의 형태로 제시하였는데, 이때 "t" 열은 유사성을 기초로 구분되는 "t" 세균 균주를 나타내고, "n" 행은 단위 특성들이다. 세균 균주의 분류학적 유사성은 유사 계수를 이용하여 평가하였다(상기 Sneath 및 Sokal, pp. 114-187). 많은 상이한 계수들이 생물학적 분류에 사용되었지만, 단지 소수만이 세균학에서 정규적으로 사용되어 왔다. 3 개의 연관계수(예컨대, 상기 Sneath 및 Sokal, p. 129), 즉, Gower, Jaccard 및 단순매칭 (Simple Matching) 계수들이 적용되었다. 이들은 세균학적 자료의 분석에 빈번히 적용되었고, 이들을 이용시 확고한 분류들이 생성되는 것으로 나타난 바, 당업계의 숙련된 자들에 의해 널리 받아들여지고 있다.
코딩된 자료를, 영국 Leicester 대학의 DEC VAX 컴퓨터로 구동되는 TAXPAK 프로그램 패키지를 이용하여 분석하였다(Sackin, Meth. Microbiol., 19:459-494 [1987]).
TAXPAK 중의 RTBNSIM 프로그램을 이용하여, 네거티브 매치 (negative match) 를 선택적으로 허용하면서 Gower 계수 (SG) 를 이용하여 모든 쌍의 균주들에 대하여 유사성 행렬을 구축하였다(상기 Sneath 및 Sokal, pp. 135-136 참조). 분석에 대한 일차적인 수단 및 본원에 제시된 분류학적 자료의 대다수가 토대로 하는 것으로서, 유사성 행렬들을 생성시키는 다른 계수들보다 Gower 계수를 선택하였는데, 그 이유는 Gower 계수가 모든 유형, 즉, 2-상태, 다중상태 (순서화된 및 질적인) 및 정량적인 특성들 또는 자료들에 적용가능하기 때문이다.
TAXPAK 중의 SMATCLST 서브-루틴을 구동시켜, UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages) 알고리즘 (Unweighted Average Linkage 방법으로도 공지됨) 을 사용하여 유사성 행렬에 대한 군집 분석을 수행하였다.
계통수는 세균 균주들 간의 유사성의 수준을 나타낸다. 일부 구현예들에서, 계통수는 TAXPAK 중의 DENDGR 프로그램을 이용하여 수득된다. Jaccard 계수 (SJ) (상기 Sneath 및 Sokal, p.131) 및 단순 매칭 계수 (SSM) (Sneath, P.H.A. 및 Sokal, R.R., 동서 p. 132 참조) 를 사용하여 TAXPAK 중의 RTBNSIM 프로그램을 구동시킴으로써 표현형적 자료들을 재분석하였다. TAXPAK 내 UPGMA 옵션을 가진 SMATCLST 및 DENDGR 서브-루틴들을 사용하여 추가로 2 개의 계통수를 수득하였다.
SG/UPGMA 방법을 사용하여, 유사성 수준이 79% 인 호알칼리성 세균에 대한 6 개의 자연 군집 또는 페논들을 생성하였다. 이들 6 개 군집들에는 알칼리성 호수들에서 단리한 20 개의 호알칼리성 세균 중 15 개가 포함되었다. 도해의 수준에 대한 79% 의 선택이 임의적인 것이기는 하나, 이는 수리분류학의 현재의 관행과 일치하는 것이었다(예컨대, Austin Priest, Modern Bacterial Taxonomy, Van Nostrand Reinhold, Wokingham, U.K., [1986], p. 37 참조). 상기 도해를 보다 낮은 백분율로 할 경우 상기 자료에 의해 정의가 뒷받침되지 않는 명백히 관련없는 유기체들의 군들을 결합시킬 것이다. 상기 79% 수준에서, 군집들 중 3 개는 (잠재적으로 새로운 분류군들을 나타내는) 새로이 단리된 균주들 중 13 개를 대표하는 신규한 호알칼리성 세균을 배타적으로 포함한다. 프로테아제 69B4 는 이 방법에 의해 군집 2 로 분류되었다.
이 수준으로의 군집화의 유의미성은 TESTDEN 프로그램의 결과들로 지지되었다. 이 프로그램은, 유클리디안 제곱 (Squared Euclidean) 거리, 또는 측정으로서 이들의 여집합 (complement) 을 이용하고 상기 군집들이 초구적 (hyperspherical) 이라는 것을 가정하여 UPGMA 로 생성된 계통수 내의 모든 양분된 군집 쌍들 (4 개 이상의 균주들을 포함) 에 대한 유의미성을 테스트한다. 임계 오버랩은 0.25% 로 설정되었다. 상기 군집들의 분리는 매우 유의미하다.
SJ 계수는 잠재적으로 주관적인 질적 자료에 부과되는 과도한 가중치에 기인한 왜곡들 또는 네거티브 매치를 기초로 하는 SG 계수 내의 페논들을 검출하는데 사용될 수 있기 때문에, 후자에 대한 유용한 보조자이다. 따라서, SJ 계수는 SG 계수를 사용하여 초기에 정의된 군집들의 타당성을 확인하는데 유용하다. Jaccard 계수는 생화학적으로 반응성 없는 유기체들을 비교하는데 특히 유용하다(상기 Austin 및 Priest, p. 37). 또한, 네거티브 특성 상태들에 대한 매칭 허용성에 대한 문제들이 있을 수 있으며(상기 Sneath 및 Sokal, p. 131 참조), 이러한 경우에는 단순 매칭 계수가 대안적으로 널리 적용된다. 균주 69B4 는 이 방법에 의해 군집 2 로 분류되었다.
대체로, 상기 SG /UPGMA 방법으로 생성된 모든 군집들 (특별히 새로운 세균 군집들) 을 SJ/UPGMA 방법 (공표현형적 상관, 0.795) 및 SSM/UPGMA 방법 (공표현형적 상관, 0.814) 으로 생성된 계통수 내에서 회복시켰다. 이들 형질전환의 주된 효과는 모든 바실러스 균주들을 단일한 큰 군집으로 모은 것인데, 이는 또한 호알칼리성 바실러스 종들 및 상기 새로운 호알칼리성 세균들 간의 분리 및 후자의 유일무이성을 역설하는데 기능한다. 이들 방법들을 기초로, 69B4 는 군집 2 세균인 것으로 고려된다.
본 발명의 다른 면에서, 폴리뉴클레오티드는 셀룰로모나스 균주 69B4 의 16S rRNA 유전자 뉴클레오티드 서열과의 서열 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98% 인 16S rRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 가진 세균에서 유래한 것이다. 상기 16S rRNA 유전자의 서열은 GenBank 에 등록번호 X92152 로 기탁되었다.
도 1 은 신규한 균주 69B4 와, 셀룰로모나다시애 과 (셀룰로모나스 균주 69B4 포함) 및 미크로코시니애 아목의 다른 관련 속의 구성원들과의 관계를 도시하는 뿌리가 생략된 계통수를 제공한다. 상기 계통수는 정렬된 16S rDNA 서열 (1374 nt) 로부터 TREECONW v.1.3b 를 사용하여 구축되었다(Van de Peer 및 De Wachter, Comput. Appl. Biosci., 10: 569-570 [1994]). 거리 추정은 Jukes 및 Cantor 의 치환율 보정 (Jukes 및 Cantor, "Evolution of protein molecules", In, Munro (ed.), Mammalian Protein Metabolism, Academic Press, NY, pp.21-132, [1969]) 및 Neighbor-Joining 알고리즘에 의해 추단되는 트리 토폴로지 (tree topology) (Saitou 및 Nei, Mol. Biol. Evol., 4:406-425 [1987]) 를 이용하여 계산하였다. 노드에서의 숫자는 100 개의 재표본 자료 집합들로부터의 부트스트랩 값을 지칭하며(Felsenstein, Evol., 39:783-789 [1985]), 스케일바 (scale bar) 는 100 nt 중 2 개 뉴클레오티드 치환을 표시한다.
균주 69B4 는 셀룰로모나다시애 과의 셀룰로모나스 및 오엘스코비아의 구성원들과 가장 가까운 16S rDNA 관계를 나타낸다. 가장 가까운 친척은 균주 69B4 16S rRNA 유전자 서열에 대한 셀룰로모나스 균주 69B4 의 16S rRNA 유전자 뉴클레오티드 서열과의 서열 동일성이 95% 이상인 C. 셀라세아 (C. cellasea) (DSM 20118) 및 C. 피미 (C. fimi) (DSM 20113) 인 것으로 여겨진다(예컨대, 동일성이 각각 96% 및 95% 임).
본 발명의 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 셀룰로모나스 종은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM16035) 이다. 이 균주는 본래 케냐의 아카시아 캠프 (Acacia Camp) 의 Bogoria 호수의 연안대 (위도 0˚ 12'N, 경도 36˚ 07'E) 에서 1988 년 10 월 10 일 수집한 침전물 및 물의 표본에서 단리되었다. 수온은 33 ℃ 였고, pH 10.5, 전도율은 44 mS/cm 이었다. 셀룰로모나스 균주 69B4 는 하기 기술되는 표현형적 특징들을 가진 것으로 결정되었다. 신선한 배양물은 그람-양성의 가느다란, 일반적으로 곧은, 대략 0.5 ~ 0.7 ㎛ x 1.8 ~ 4 ㎛ 의 간상 세균이었다. 보다 오래된 배양물에는 주로 짧은 간상 및 구상 세포가 포함되어 있었다. 세포들은 경우에 따라 쌍을 이루거나 V-형으로 나타났으나, 일차 분지 (primary branching) 는 관찰되지 않았다. 내생포자는 검출되지 않았다. 알칼리성 GAM 한천 상에서, 상기 균주는, 37 ℃ 에서 2 ~ 3 일 인큐베이션 후에 전체 테두리의 직경이 약 2 ㎜ 인 불투명하고 반짝이는 담황색의 환형 및 볼록한 또는 돔형의 콜로니를 형성한다. 콜로니들은 루프로 긁어낼 때 응집하는 경향을 가진 것으로서 점착성 또는 점액성이었다. 중성 트립톤 소야 한천 상에서, 균주 증식은 보다 덜 왕성하였는데, 일반적으로 직경 <1 mm 의 반투명 황색 콜로니가 형성되었다. 상기 배양물은 조건적으로 혐기적이었는데, 이는 이들이 엄격히 혐기적인 조건하에서 증식할 수 있었기 때문이다. 그러나, 혐기적 조건하에서의 증식은 호기적 증식과 비교할 때 현저히 감소되었다. 상기 균주는 또한 표준 산화효소, 요소분해효소, 아미노펩티다제 및 KOH 테스트에서 음성으로 나타났다. 또한, 질산염은 감소되지 않았으나 상기 유기체들이 카탈라아제 양성이고 알칼리성 조건하에서 DNA 분해효소가 생성되었다. 증식에 바람직한 온도 범위는 20 ~ 37 ℃ 이었고, 최적 온도는 약 30 ~ 37 ℃ 이었다. 15 ℃ 또는 45 ℃ 에서는 아무런 증식이 관찰되지 않았다.
상기 균주는 호알칼리성 및 약간 호염성이다. 상기 균주는 또한 6.0 내지 10.5 의 pH 값, 최적으로는 약 pH 9 ~ 10 에서 증식이 일어나는 특징을 가질 수 있다. pH 11 또는 pH 5.5 에서는 아무런 증식이 관찰되지 않았다. pH 7 미만에서의 증식은 최적 온도에서 증식한 배지보다 보다 덜 왕성하고 덜 풍부했다. 상기 균주는 0 ~ 8% (w/v) NaCl 을 함유한 배지에서 성장하는 것으로 관찰되었다. 나아가, 상기 균주는 화학유기영양체 (chemo-organotroph) 로 특징지어질 수도 있는데, 그 이유는 상기 균주가 효모 추출물 및 펩톤; 및 가수분해된 녹말, 젤라틴, 카제인, 카르복시메틸셀룰로오스 및 비결정성 셀룰로오스 등의 복합 기질 상에서 증식했기 때문이다.
상기 균주는 호흡성이자 발효성의 대사를 가진 것으로 관찰되었다. (API 50CH): L-아라비노스, D-자일로오스, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-만노스, 람노스 (약함), 셀로비오스, 말토오스, 슈크로오스, 트레할로스, 젠티오비오스, D-투라노스, D-릭소스 및 5-케토-글루코네이트 (약함) 로부터 호기적으로 및 혐기적으로 모두 산이 생성되었다. 아미그달린 (amygdalin), 알부틴 (arbutin), 살리신 및 에스쿨린 또한 이용된다. 상기 균주는 하기를 이용할 수 없었다: 리보오스, 락토오스, 갈락토오스, 멜리비오스, D-라피노스, 글리코겐, 글리세롤, 에리트리톨, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 아라비톨, 글루코네이트 및 락테이트.
상기 균주는, 암피실린, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 푸시딘산, 메티실린, 노보비오신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 술파푸라졸, 올레안도마이신, 폴리믹신, 리팜피신, 반코마이신 및 바시트라신에 취약하나; 젠타마이신, 니트로푸란토인, 날리딕산, 술프메톡사졸, 트리메토프림, 페니실린 G, 네오마이신 및 카나마이신에는 저항성 있는 것으로 결정되었다.
본 발명의 프로테아제 이외에, 하기 효소들이 생산되는 것으로 관찰되었다(ApiZym, API Coryne); C4-에스테라제, C8-에스테라제/리파아제, 류신 아릴아미다제, 알파-키모트립신, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제 및 피라진아미다제.
상기 균주는 하기의 화학분류학적 특징들을 나타내는 것으로 관찰되었다. 주요 지방산 (전체의 >10%) 들은 C16:1 (28.1%), C18:0 (31.1%), C18:1 (13.9%) 이었다. N-포화 (79.1%), n-불포화 (19.9%). 탄소수가 짝수인 지방산이 98% 를 차지하였다. 주요 극성 지질 구성요소들로는: 포스파티딜글리세롤 (PG) 및 3 개의 미확인 당지질 (알파-나프톨 양성) 이 존재하였고; DPG, PGP, PI 및 PE 는 검출되지 않았다. 메나퀴논들인 MK-4, MK-6, MK-7 및 MK-9 는 존재하는 주요 이소프레노이드였다. 세포벽 펩티도글리칸 유형은 펩티드간 연결에서 디아미노산으로서의 L-오르니틴 및 D-아스파르트산을 가진 A4β 였다. 독성 평가에 있어서는, 셀룰로모나스 속의 세균에 관련된 독성 또는 병원성 문제가 공지된 바 없다.
주어진 유기체 종 내에서 자연적으로 발생하는 효소의 서열에 변화가 있을 수 있지만, 동일 종의 유기체에 의해 생산되는 특정 유형의 효소들은 일반적으로 주어진 조건 (예컨대, 온도, pH, 물의 경도, 산화적 분위기, 킬레이트 분위기 및 농도 등) 하에서 기질 특이성 및/또는 단백질 분해 활성 수준이 실질적으로 동일하다. 따라서, 본 발명의 목적상, 셀룰로모나스의 다른 균주 및 종 또한 본 발명의 셀룰로모나스 프로테아제를 생산하며 따라서 본 발명의 프로테아제들의 유용한 공급원을 제공할 것으로 예기된다. 실제로, 본원에 제시된 바와 같이, 미크로코시니애의 다른 구성원들이 본 발명에 사용될 것으로 기대된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 단백질 분해 폴리펩티드들은 물리화학적으로 특징지어지는 한편, 다른 구현예들에서, 이들은 기능을 기초로 특징지어지며, 또 다른 구현예들에서는, 이들은 특성들에 대한 두 집합 모두를 사용하여 특징지어진다. 물리화학적 특징 부여는, 단백질의 분자량을 측정하기 위하여는 SDS 전기영동, 겔 여과, 아미노산 조성, 질량 분석법 (예컨대 MALDI-TOF-MS, LC-ES-MS/MS 등) 및 침강을, 단백질의 pI 를 측정하기 위해서는 등전집속법 (isoelectric focusing) 을, 단백질의 아미노산 서열을 결정하기 위해서는 아미노산 서열분석을, 단백질의 3 차 구조를 결정하기 위해서는 결정학 연구를, 및 단백질 내에 존재하는 항원성 에피토프를 결정하기 위해서는 항체 결합법 등의 공지된 방법들을 이용한다.
일부 구현예들에서, 기능적 특징들은 프로테아제 분야의 숙련된 자에게 주지된 방법들로 결정되며, 이에 제한되는 것은 아니나, 디-메틸 카제인 ("DMC") 및/또는 AAPF-pNA 등의 다양한 시판 기질들의 가수분해들이 있다. 기능적 특징 부여에 대한 이 바람직한 방법은 본원에 제시된 실시예들에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 분자량이 약 17kD 내지 약 21kD, 예를 들어 약 18kD 내지 19kD, 예를 들어 18700 달톤 내지 18800 달톤, 예를 들어 약 18764 달톤 (MALDI-TOF-MS 로 측정) 이다. 본 발명의 또 다른 면에서, 상기 프로테아제는 도 3 에 개시된 바와 같은 MALDI-TOF-MS 스펙트럼이 측정되었다.
성숙한 프로테아제는 또한 DMC 등의 단백질 분해 활성 (예컨대, 펩티드 결합을 가진 기질에 대한 가수분해 활성) 을 나타낸다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 확인된 조건하에서 향상된 세척 성능을 제공한다. 본 발명이 본원에 기술된 프로테아제 69B 를 포괄하지만, 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은, 69B4 의 단백질 분해 활성과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 단백질 분해 활성을 나타낸다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제들은 SAVINASE® (Novzymes) 또는 PURAFECT® (Genencor) 라는 상표명으로 시판되는 프로테아제들의 동일 조건하에서의 단백질 분해 활성과 비교할 때, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 단백질 분해 활성을 나타낸다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 확인된 조건하에서 69B4 와 비교시, 동일 조건하에서 필적할만한 또는 향상된 세척 성능을 나타낸다. 일부 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 확인된 조건하에서, 동일 조건하의 SAVINASE® (Novozymes) 또는 PURAFECT® (Genencor) 라는 상표명으로 시판되는 프로테아제와 비교시 필적할만한 또는 향상된 세척 성능을 나타낸다.
또 다른 추가적인 구현예들에서, 상기 프로테아제들 및/또는 본 발명의 프로테아제들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 정제된 형태로 (즉, 특정 조성물 내에서 자연 발생적 또는 야생형 유기체에 존재하는 것보다 더 높거나 더 낮은 농도로 존재함), 또는 자연 발생적 또는 야생형 유기체에서 발현시에는 정상적으로는 존재하지 않는 구성요소들과 함께 제공된다. 그러나, 본 발명의 프로테아제들이 적합한 다양한 용도에서 다양한 프로테아제 순도의 범위가 사용될 것이기 때문에, 본 발명을 임의의 특정 순도 수준의 프로테아제들에 제한시키려는 의도는 없다.
III. 본 발명의 미크로코시니애 (예컨대 , 셀룰로모나스 ) 프로테아제들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 수득
일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제를 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 클로닝된 DNA (예컨대, DNA "라이브러리"), 화학적 합성, cDNA 클로닝, PCR, 게놈 DNA 또는 이의 절편들의 클로닝으로부터 당업계에 공지된 표준 절차들에 의해 수득되거나, 또는 세균 또는 진균 종들 등의 목적 세포로부터 정제된다 (예를 들어, 상기 Sambrook 등, [1989]; 및 Glover 및 Hames (eds.), DNA Cloning: A Practical Approach, Vols 1 및 2, 제 2 판 참조). 폴리뉴클레오티드 서열의 합성은 자동화된 합성기의 사용 (예컨대, Needham-VanDevanter 등, Nucl. Acids Res., 12:6159-6168 [1984] 참조) 을 포함하여 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Beaucage 및 Caruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 [1981]). DNA 서열들은 또한 다양한 시판 공급원으로부터 맞추거나 주문될 수 있다. 본원에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 일부 구현예들에서, 게놈 DNA 로부터 유래한 핵산 서열은 코딩 영역 외에 조절 영역을 포함한다.
게놈 DNA 로부터 유전자의 분자 클로닝을 수반하는 일부 구현예들에서, DNA 절편이 생성되는데, 이들의 일부는 목적하는 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예들에서는, 다양한 제한효소를 사용하여 상기 DNA 를 특정 부위에서 절단한다. 일부 대안적인 구현예들에서는, 망간의 존재하에서 DNA 분해효소를 사용하여 DNA 를 분해하거나, 또는 DNA 를 (예컨대, 초음파 분쇄로) 물리적으로 전단한다. 생성된 선형 DNA 절편을 그 후, 이에 제한되는 것은 아니나, 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, PCR 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 표준 기술들로 크기에 따라 분리하고 증폭시킨다.
핵산 절편을 생성시킨 후에는, 다양한 방법으로 프로테아제를 인코딩하는 특정 DNA 절편에 대한 동정을 실시할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, asp 유전자 또는 이의 특이적 RNA, 또는 탐침자 또는 프라이머 등의 이의 절편을 인코딩하는 단백질 가수분해 효소를 단리한 후 표지하고, 그 후 이를 당업자들에게 주지된 혼성화 검정들에 사용하여 생성된 유전자를 검출한다(예컨대, Benton 및 Davis, Science 196:180 [1977]; 및 Grunstein 및 Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961 [1975] 참조). 바람직한 구현예들에서, 상기 탐침자에 대하여 상당한 서열 유사성을 공유한 DNA 절편들을 중간 내지 고도 엄격성 하에서 혼성화시킨다.
일부 바람직한 구현예들에서, 증폭은 당업계에 공지되어 있는 PCR 을 사용하여 실시된다. 일부 바람직한 구현예들에서, PCR 프라이머로서 서열번호: 1, 2, 3 및/또는 4 로부터의 약 4 개 이상의 뉴클레오티드 및 약 60 개 정도의 많은 뉴클레오티드 (즉, 절편), 바람직하게는 약 12 내지 30 개 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 약 25 개 뉴클레오티드의 핵산 서열이 임의 적당한 조합으로 사용된다. 이들 동일 절편들은 또한 혼성화 및 생성물 검출 방법들에서도 탐침자로 사용된다.
일부 구현예들에서, cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터의 본 발명의 핵산 구축물들의 단리는, 서열번호: 1 ~ 5 에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 단백질의 아미노산 서열을 기초로 제조된 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하는 PCR 을 이용한다. 상기 프라이머들은 임의 단편 길이일 수 있는데, 예를 들어 길이가 뉴클레오티드 4 개 이상, 5 개 이상, 8 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상이다. 본원 중의 예시적인 탐침자들은 실시예에서 보다 자세히 기술된 TTGWHCGT 및 GDSGG 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 프라이머를 이용하였다.
상기의 관점에서, 서열번호: 1 ~ 5 에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 기초한 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열들은 다른 종들, 특히 프로테아제 69B4 에 의해 나타나는 세린 프로테아제 활성을 가진 효소들을 인코딩하는 세균으로부터의 폴리뉴클레오티드들의 동일 또는 상동 절편들을 수득하는데 유용하다는 것은 자명할 것이다.
IV. 본 발명의 세린 프로테아제들의 발현 및 회수
본 발명의 세린 프로테아제들의 발현 및 회수용으로 임의 적당한 방법들이 본원에서 사용된다. 실제로, 당업계의 숙련된 자들에게는 단백질 분해 활성을 가진 셀룰로모나스-유래의 폴리펩티드, 및 부가적인 효소 (예컨대, 단백질 분해 활성을 가진 제 2 의 펩티드, 예컨대 프로테아제, 셀룰라아제, 만난아제 또는 아밀라아제 등) 를 클로닝하는데 적당한 다수의 방법들이 공지되어 있다. 본 발명의 효소(들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)의 하나 이상의 (예컨대, 다수의) 사본을 원하는 임의의 추가적인 서열들과 함께, 숙주 세포의 유전자들 또는 게놈 내로 도입하는 다수의 방법들이 또한 당업계에 공지되어 있다.
일반적으로, 유전자들의 클로닝 및 외인성 프로테아제 인코딩 영역 (외인성 인코딩 영역들의 복수의 사본 포함) 을 상기 유전자들 내로 도입하는 표준 절차들이 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 유도체 또는 이의 동족체를 수득하는데 사용된다. 실제로, 실시예를 포함하여 본 명세서는 상기와 같은 교시를 제공한다. 그러나, 당업계에 공지된 부가적인 방법들 또한 적당하다(예컨대, 상기 Sambrook 등 (1989); 상기 Ausubel 등, [1995]; 및 Harwood 및 Cutting, (eds.) Molecular Biological Methods for Bacillus," John Wiley 및 Sons, [1990]; 및 WO 96/34946 참조).
일부 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열들을 적절한 발현 벡터 내에서 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되어 발현되고, 이들은 당업계에 잘 확립된 방법들에 따라 상기 발현 벡터에 의해 이용되어 적절한 숙주가 형질전환된다. 일부 구현예들에서는, 본 발명의 DNA 서열의 발현시에 생산되는 폴리펩티드들을 당업계에 잘 확립된 방법들에 따라 세포 배양물의 발효물로부터 단리시키고, 다양한 방식으로 정제한다. 당업계의 숙련된 자들은 가장 적절한 단리 및 정제 방법을 선택할 수 있다.
보다 특히는, 본 발명은 구축물, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드들을 포함한 벡터, 이러한 벡터들로 형질전환된 숙주 세포, 이러한 숙주 세포들에 의해 발현된 프로테아제, 미생물, 특히, 이에 제한되는 것은 아니나 셀룰로모나스 종을 포함하는 미크로코시니애의 구성원들에서 유래한 세린 프로테아제 효소들의 발현 방법 및 생산 시스템을 제공한다. 일부 구현예들에서, 세린 프로테아제(들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 상기 세린 프로테아제(들)의 발현에 적당한 재조합 숙주 세포를 생산하는데 사용된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 발현 숙주들은 상기 프로테아제(들)를 상업성 있는 양으로 생산할 수 있다.
IV. 재조합 벡터
상기 언급한 바와 같이, 일부 구현예들에서, 본 발명은 상기 언급한 폴리뉴클레오티드들을 포함한 벡터들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제를 인코딩하는 본 발명의 벡터들 (즉, 구축물들) 은 게놈 기원이다(예컨대, 게놈 라이브러리의 사용 및 표준 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 탐침자를 사용한 혼성화로 상기 프로테아제의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열에 대한 스크리닝을 통해 제조). 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 프로테아제를 인코딩하는 DNA 서열은 셀룰로모나스 균주 69B4 로부터 염색체 DNA 를 단리시키고 PCR 방법으로 상기 서열을 증폭시켜 수득한다(실시예 참조).
대안적인 구현예들에서는, 상기 프로테아제를 인코딩하는 본 발명의 핵산 구축물을 확립된 표준 방법들로 합성하여 제조한다(예컨대, Beaucage 및 Caruthers, Tetra. Lett. 22:1859-1869 [1981]; 및 Matthes 등, EMBO J., 3:801-805 [1984] 참조). 포스포라미다이트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드를 (예컨대, 자동화 DNA 합성기로) 합성하고, 정제하고, 어닐링한 후, 적당한 벡터 내에서 연결하고 클로닝한다.
추가적인 구현예들에서, 상기 핵산 구축물은 혼합 합성 및 게놈 기원이다. 일부 구현예들에서, 상기 구축물은, 표준 기술들에 따라 합성 또는 게놈 DNA 의 절편들 (적절한 것으로서) 을 연결하여 제조하는데, 이때 상기 절편들은 전체 핵산 구축물의 다양한 부분들에 대응한다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 구축물을 포함한 벡터를 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 재조합 벡터들을 포괄한다. 본 발명에서는 자율적으로 복제하는 벡터 및 숙주 세포 게놈 내로 (일시적으로 또는 안정적으로) 통합되는 벡터를 포함하여 임의의 적당한 벡터가 사용될 것으로 예기된다. 실제로, 널리 다양한 벡터들, 및 진균 (곰팡이 및 효모), 세균, 곤충 및 식물 세포 내에서의 클로닝, 형질전환 및 발현에 적당한 발현 카세트들이 당업계의 숙련된 자들에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 벡터 또는 카세트는 핵산의 전사 및 번역을 지휘하는 서열, 선별가능 표지자 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 적당한 벡터는 전사 개시 제어를 담당하는 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 절편의 3' 영역을 포함한다. 이들 제어 영역들은, 선택된 제어 영역이 숙주 세포 내에서 기능할 수 있는 한, 상기 숙주와 상동인 또는 이종인 유전자들로부터 유래할 수 있다.
상기 벡터는 바람직하게는 본 발명의 프로테아제를 인코딩하는 DNA 서열이 상기 DNA 의 전사에 필요한 부가적 단편들에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터이다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스성 DNA 에서 유래한 것이거나, 또는 대안적인 구현예들에서, 이는 둘 다의 요소들을 포함한다. 대표적인 벡터들에는, 이에 제한되는 것은 아니나 pSEGCT, pSEACT 및/또는 pSEA4CT, 및 본원의 실시예에 기술된 모든 벡터들이 포함된다. 이러한 벡터의 구축은 본원에 기술되어 있고, 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제 6,287,839 호; 및 WO 02/50245 참조). 일부 바람직한 구현예들에서, 벡터 pSEGCT (약 8302 bp; 도 5 참조) 는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드들을 포함한 벡터의 구축에 사용된다(예컨대, pSEG69B4T; 도 6 참조). 대안적인 바람직한 구현예들에서, 벡터 pSEA469B4CT (도 7 참조) 는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드들을 포함한 벡터의 구축에 사용된다. 실제로, 본원에 기술된 모든 벡터들을 본 발명에 사용할 것을 의도하였다.
일부 구현예들에서, 전사에 필요한 부가적인 단편들에는, 당업계에 공지된 바와 같은 조절 단편들 (예컨대, 프로모터, 분비 단편, 저해제, 전체 조절제 등) 이 있다. 한 가지 예에는, 선택 숙주 세포 내에서 전사 활성을 나타내고 상기 숙주 세포에 상동이거나 이종인 단백질들을 인코딩하는 유전자들로부터 유래한 임의의 DNA 서열이 있다. 구체적으로, 세균 숙주 세포에서의 사용을 위한 적당한 프로모터의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나 바실러스 스테아로테르모필루스 말토오스 생성 아밀라아제 유전자, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (BAN) 아밀라아제 유전자, 바실러스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제 유전자, 바실러스 클라우시이 알칼리성 프로테아제 유전자, 바실러스 푸밀러스 (Bacillus pumilus) 자일로시다제 유전자, 바실러스 투링기엔시스 cryIIIA 및 바실러스 리체니포르미스 알파-아밀라아제 유전자의 프로모터가 있다. 부가적인 프로모터로는, 본원에 기술된 A4 프로모터가 있다. 기타 본 발명에 사용되는 프로모터들로는, 이에 제한되는 것은 아니나 파아지 람다 PR 또는 PL 프로모터, 및 대장균 lac, trp 또는 tac 프로모터가 있다.
일부 구현예들에서, 상기 프로모터는 상기 프로테아제를 인코딩하는 유전자 또는 상기 서열과 실질적으로 동일한 프로모터 활성을 가진 이의 절편에서 유래한다. 본 발명은 또한 중간, 고도 및/또는 최대 엄격성 조건하에서 상기 프로모터 서열들에 혼성화하거나 또는 이러한 프로모터에 대하여 약 90% 이상의 상동성 및 바람직하게는 약 95% 의 상동성을 가지나 실질적으로 동일한 프로모터 활성을 가지는 핵산 서열을 포괄한다. 일부 구현예들에서, 이 프로모터는 프로테아제 및/또는 이종 DNA 서열 (예컨대, 본 발명의 프로테아제 외의 또 다른 효소) 의 발현을 촉진시키는데 사용된다. 추가적인 구현예들에서, 상기 벡터는 또한 하나 이상의 선별가능 표지자를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 재조합 벡터들은 상기 벡터가 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 세균 숙주 세포를 포함하는 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 서열들은 플라스미드 복제를 가능하게 하는데 필요한 모든 서열들 (예컨대, ori 및/또는 rep 서열) 을 포함한다.
일부 특히 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로내로 인도하기 위하여, 상기 벡터 내에 신호 서열들 (예컨대, 선도자 서열 또는 전구서열) 을 또한 포함시킨다. 일부 보다 바람직한 구현예들에서는, 분비 신호 서열을 올바른 해독틀 내 전구체 프로테아제를 인코딩하는 DNA 서열 (예컨대, 서열번호: 1 및 2 참조) 에 연결시킨다. 상기 프로테아제가 세포내 발현되는지 또는 분비되는지에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터를, 천연 폴리펩티드 신호 서열 또는 세균 (예컨대, 바실러스), 진균류 (예컨대, 트리코더마), 기타 원핵생물 또는 진핵생물 내에서 기능하는 신호 서열과 함께 또는 신호 서열없이 유전자조작한다. 일부 구현예들에서, 발현은 상기 신호 서열을 제거하거나 또는 부분적으로 제거함으로써 성취된다.
세균 세포들로부터의 분비를 수반하는 일부 구현예들에서, 상기 신호 펩티드는 자연 발생적 신호 펩티드이거나, 또는 이의 기능성 일부인 반면, 다른 구현예들에서, 이는 합성 펩티드이다. 적당한 신호 펩티드에는, 이에 제한되는 것은 아니나 바실러스 리체니포르미스 알파-아밀라아제, 바실러스 클라우시이 알칼리성 프로테아제 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 아밀라아제에서 유래한 서열들이 있다. 한 가지 바람직한 신호 서열은 본원에 기술된 바와 같은 셀룰로모나스 균주 69B4 에서 유래한 신호 펩티드이다. 따라서, 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 신호 펩티드는 본원에 기술된 프로테아제로부터의 신호 펩티드를 포함한다. 이 신호는 상기 69B4 프로테아제 및/또는 이종 DNA 서열 (예컨대 또 다른 야생형 프로테아제, BPN' 변형 프로테아제, GG36 변형 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제, 만난아제 등의 제 2 의 프로테아제) 의 분비를 용이하게 하는데 사용된다. 일부 구현예들에서, 이들 제 2 의 효소들은 당업계에 공지된 DNA 서열 및/또는 아미노산 서열에 의해 인코딩된다(예컨대, 미국 특허 제 6,465,235 호, 제 6,287,839 호, 제 5,965,384 호 및 제 5,795,764 호; 및 WO 98/22500, WO 92/05249, EP 0305216B1 및 WO 94/25576 참조). 나아가, 일부 구현예들에서, 신호 서열 펩티드를 또한 이러한 인코딩된 내재성 프로테아제를 활성화하고 분비시키는 내재성 서열에 작동적으로 연결하는 것이 고려된다.
본 발명의 프로테아제, 프로모터 및/또는 분비 신호 서열을 각각 코딩하는 DNA 서열들을 연결하고 이들을 복제에 필요한 정보를 포함한 적당한 벡터 내로 삽입하는데 사용되는 방법들은 당업계의 숙련된 자들에 주지되어 있다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 구현예들에서는, 특이적 프라이머들을 이용한 PCR 을 사용하여 핵산 구축물을 제조한다.
V. 숙주 세포
상기 언급한 바와 같이, 일부 구현예들에서, 본 발명은 또한 상기 기술한 벡터들로 형질전환된 숙주 세포들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포 내로 도입되는, 본 발명의 프로테아제(들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주에 상동인 반면, 다른 구현예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주에 이종이다. 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 상동인 (예컨대, 숙주 세포에 의해 생산되는 본래적 프로테아제의 부가적 사본들이 도입되는) 일부 구현예들에서는, 이를 또 다른 상동 또는 이종 프로모터 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 대안적인 구현예들에서는, 또 다른 분비 신호 서열 및/또는 종결자 서열이 본 발명에서 사용된다. 따라서, 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드 DNA 서열은 상동 폴리펩티드 서열, 또 다른 유기체로부터의 이종 폴리펩티드 서열 또는 합성 폴리펩티드 서열(들)의 복수의 사본을 포함한다. 실제로는, 본 발명을 임의 특정 숙주 세포 및/또는 벡터들에 제한하려는 의도는 없다.
실제로는, 본 발명의 DNA 구축물이 도입되는 숙주 세포는 본 발명의 알칼리성 프로테아제를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있으며, 이들로는, 이에 제한되는 것은 아니나 세균, 진균류 및 보다 고등한 진핵 세포들이 있다.
본 발명에 사용되는 세균 숙주 세포의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 그람-양성 세균, 예컨대 바실러스, 스트렙토마이세스 및 테르모비피다, 예를 들어 B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 렌투스, B. 브레비스, B. 스테아로테르모필루스, B. 클라우시이, B. 아밀로리쿠에파시엔스, B. 코아굴란스, B. 키르쿨란스, B. 라우투스, B. 메가테리움, B. 투링기엔시스, S. 그리세우스, S. 리비단스, S. 코엘리콜로르; S. 아베르미틸리스 및 T. 푸스카 (T. fusca) 의 균주들; 및 그람-음성 세균, 예컨대 장내세균과 (Enterobacteriaceae) 의 구성원들 (예컨대, 대장균) 이 있다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 B. 서브틸리스, B. 클라우시이 및/또는 B. 리체니포르미스이다. 추가적인 바람직한 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 S. 리비단스의 균주 (예컨대, TK23 및/또는 TK21) 이다. 상기 세균의 형질전환용으로 적당한 방법이 본 발명에서 사용되는데, 이로서는 이에 제한되는 것은 아니나 당업계에 공지된 바와 같은 원형질체 형질전환, 적격 (competent) 세포 사용 등이 있다. 일부 바람직한 구현예들에서, 미국 특허 제 5,264,366 호(참조로서 본원에 포함됨) 에 제시된 방법이 본 발명에 사용된다. S. 리비단스에 있어서, 형질전환 및 단백질 발현을 위한 한 가지 바람직한 방법은 Fernandez-Abalos 등에 의해 기술된 것이다(Fernandez-Abalos 등, Microbiol., 149:1623-1632 [2003] 참조; 또한 Hopwood, 등, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, Innis [1985] 참조, 둘 다 참조로서 본원에 포함됨). 물론, 본원의 실시예에 기술된 방법들이 본 발명에서 사용된다.
본 발명에 사용되는 진균성 숙주 세포의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 트리코더마 종 및 아스퍼질러스 종이 있다. 일부 특히 바람직한 구현예들에서, 숙주 세포는 트리코더마 리이세이 및/또는 아스퍼질러스 니게르이다. 일부 구현예들에서는, 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제 5,364,770 호에 기술된 바와 같이 아스퍼질러스 내에서의 형질전환 및 발현을 수행한다. 물론, 본원의 실시예에 기술된 방법들이 본 발명에서 사용된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제(들)의 효과적인 형질전환 및 발현을 제공하기 위하여 특정 프로모터 및 신호 서열들이 필요하다. 따라서, 바실러스 숙주 세포들의 사용을 수반하는 일부 바람직한 구현예들에서는, aprE 프로모터가, 공지된 바실러스-유래의 신호 및 기타 조절 서열들과 함께 사용된다. 아스퍼질러스 내에서의 발현을 수반하는 일부 바람직한 구현예들에서는, glaA 프로모터가 사용된다. 스트렙토마이세스 숙주 세포들을 포함하는 일부 구현예들에서는, 악티노플라네스 미소우리엔시스 (Actinoplanes missouriensis) 의 글루코오스 이성질화효소 (GI) 프로모터가 사용되는 한편, 다른 구현예들에서는, A4 프로모터가 사용된다.
대장균 등의 세균에서의 발현을 수반하는 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 전형적으로는 불용성 과립 (즉, 봉입체 (inclusion body)) 으로서 세포질 내에 유지된다. 그러나, 다른 구현예들에서, 상기 프로테아제는 세균성 분비 서열에 의해 주변세포질 공간 (periplasmic space) 으로 유도된다. 전자의 경우에, 상기 세포를 용해시켜, 상기 과립을 회수하고 변성시키며, 그 후 변성제를 희석시켜 상기 프로테아제가 재접힘되게 한다. 후자의 경우에, 상기 세포를 (예컨대, 초음파 분쇄 또는 삼투 충격으로) 파괴하여 주변세포질 공간의 내용물들을 방출시키고 상기 프로테아제를 회수함으로써 상기 프로테아제를 주변세포질 공간으로부터 회수한다.
바람직한 구현예들에서는, 본 발명의 형질전환된 숙주 세포들을 본 발명의 프로테아제의 발현을 허용하는 조건하에서 적당한 영양 배지에서 배양한 후, 생성된 프로테아제를 상기 배양물로부터 회수한다. 상기 세포들을 배양하는데 사용되는 배지는 숙주 세포를 증식시키는데 적당한 임의의 통상적인 배지, 예컨대 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지를 포함한다. 적당한 배지는 상업적 공급자들로부터 입수가능하거나 또는 공개된 제조법 (예컨대, ATCC (American Type Culture Collection) 의 일람표 내에 있는) 에 따라 제조할 수 있다. 일부 구현예들에서는, 상기 세포들에 의해 생산된 프로테아제를 통상적인 절차들에 의해 배양 배지로부터 회수하는데, 이들로서는 이에 제한되는 것은 아니나 원심분리 또는 여과에 의해 숙주 세포를 배지로부터 분리시키는 것, 상청액 또는 여과액의 단백질성 구성요소들을 염 (예컨대, 황산암모늄) 을 이용하여 침전시키는 것, 크로마토그래피적 정제 (예컨대, 이온 교환, 겔 여과, 친화 등) 가 있다. 따라서, 본 발명의 프로테아제(들)를 회수하는데 적당한 임의의 방법이 사용될 것이다. 실제로, 본 발명을 임의의 특정 정제 방법에 제한하려는 의도는 없다.
VI. 세린 프로테아제 효소들에 대한 응용
본원에 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 프로테아제들은 이들을 일정 용도들에 매우 적당하게 하는 중요한 특징들을 갖고 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로테아제들은, 현재 사용되는 일부 프로테아제들과 비교시, 향상된 열 안정성, 향상된 산화적 안정성, 및 향상된 킬레이트제 안정성을 갖고 있다.
따라서, 이들 프로테아제들은 세정 조성물에 사용된다. 실제로, 일정 세척 조건하에서, 본 발명의 프로테아제들은 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제들과 비교시 필적할만한 또는 향상된 세척 성능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 세정 및/또는 효소 조성물들이 다양한 세정 조성물들에 제공될 것으로 예기된다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 서브틸리신 프로테아제 (즉, 현재 사용중인 프로테아제) 와 동일한 방식으로 이용된다. 따라서, 본 발명의 프로테아제들은 다양한 세정 조성물, 뿐만 아니라 동물 사료 용도, 가죽 가공 (예컨대, 효해 (bating)), 단백질 가수분해, 및 섬유 용도로 사용된다. 상기 확인된 프로테아제들은 또한 생활용품 용도로도 사용된다.
따라서, 본 발명의 프로테아제들은 다수의 산업적 용도, 특히 세정, 소독, 동물 사료, 및 섬유/가죽 산업 내에서 사용된다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제(들)를 세제, 세척력 증강제, 표백제 및 기타 통상적인 성분들과 조합하여, 예를 들어, 세탁 세제 (분말 및 액체 형태 모두), 세탁 예비담금제, 모든 섬유 표백제, 자동 식기세척 세제 (액체 및 분말 형태 모두), 가정용 세정제, 특히 바 및 액체 비누 용도 및 배수구 오프너 (drain opener) 등의 세탁 및 기타 세정 업계에서 유용한 다양한 신규한 세정 조성물을 생성한다. 또한, 상기 프로테아제는 콘택트 렌즈, 및 기타 품목들의 세정에 사용되는데, 상기 물질들을 상기 세정 조성물의 수용액에 접촉시킨다. 또한 이들 자연 발생적 프로테아제들은, 예를 들어 펩티드 가수분해, 폐기물 처리, 섬유 용도, 의료 기구 세정, 생물막 제거에서 및 단백질 생산에서 용해-절단 효소들로서 사용될 수 있다. 이들 산물들의 조성은, 상기 프로테아제(들)가 사용된 조건에서 그의 기능을 유지하는 한, 본 발명에 중요하지는 않다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물들은 세정 유효량의 프로테아제 또는 상기 프로테아제 효소 제조물을 포함한 효소 조성물을, 당업계의 승인된 양의 상기 조성물의 통상적인 구성요소들과 함께 조합함으로써 용이하게 제조된다.
A. 세정 조성물
본 발명의 세정 조성물은 이롭게는 예를 들어, 세탁 용도, 거친 표면 세정, 자동화 식기세척 용도, 뿐 아니라 의치, 치아, 모발 및 피부 등의 미용 용도에 이용될 수 있다. 그러나, 보다 저온의 용액에서 증가된 효과 및 보다 우수한 색상-안전 프로필이라는 유일무이한 이점때문에, 본 발명의 효소들은 섬유 표백 등의 세탁 용도에 더할 나위 없이 적합하다. 나아가, 본 발명의 효소들은 과립 및 액체 조성물 모두에 이용할 수 있다.
본 발명의 효소들은 또한 세정 첨가제 제품에 이용될 수 있다. 본 발명의 효소들을 포함한 세정 첨가제 제품은 부가적인 표백 표과가 요구되는 세척 공정에 포함시키기에 더할 나위 없이 적합하다. 이러한 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 저온 용액 세정 용도가 있다. 상기 첨가제 제품은 ASP 를 포함하는 가장 단순한 형태의 하나 이상의 프로테아제일 수 있다. 이러한 첨가제는, 과산소 (peroxygen) 공급원을 이용하고 증가된 표백 효과가 요구되는 세정 공정에의 첨가를 위한 투여 형태로 포장될 수 있다. 이러한 단일 투여 형태는, 환 (pill), 정제, 겔캡 (gelcap) 또는 미리 측정된 분말 또는 액체 등의 기타 단일 투여 단위를 포함할 수 있다. 상기와 같은 조성물의 부피를 증가시키기 위하여 충진제 또는 담체 물질을 포함시킬 수 있다. 적당한 충진제 또는 담체 물질들로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 다양한 황산염, 탄산염 및 규산염 뿐만 아니라 탈크, 점토 등이 있다. 액체 조성물용 충진제 또는 담체 물질은 물 또는, 폴리올 및 디올을 포함하는 저분자량의 1 차 및 2 차 알콜일 수 있다. 이러한 알콜의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올이 있다. 상기 조성물은 이러한 물질들을 약 5% 내지 약 90% 함유할 수 있다. pH 를 감소시키기 위해 산성 충진제를 사용할 수 있다. 대안적으로는, 세정 첨가제는 하기 정의되는 활성화된 과산소 공급원 또는 하기 자세히 정의되는 부속 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 세정 조성물 및 세정 첨가제들은 본원에 제시된 ASP 효소 및/또는 변형체들의 유효량을 필요로 한다. 요구되는 효소 수준은 본 발명의 효소들의 하나 이상의 종을 첨가함으로써 성취될 수 있다. 전형적으로 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 본 발명의 효소들을 0.0001 중량% 이상, 약 0.0001 내지 약 1, 약 0.001 내지 약 0.5, 또는 심지어 약 0.01 내지 약 0.1 중량% 로 포함할 것이다.
상기 세정 조성물들은 본원에서 전형적으로 수성 세정 작업에서의 사용동안, 세척수가 약 5.0 내지 약 11.5 또는 심지어 약 7.5 내지 약 10.5 의 pH 를 가지도록 제형화될 것이다. 액체 제품 제형물들은 전형적으로 순 pH 가 약 3.0 내지 약 9.0 또는 심지어 약 3 내지 약 5 가 되도록 제형화된다. 과립 세탁 제품들은 전형적으로 pH 가 약 9 내지 약 11 이 되도록 제형화된다. 추천되는 사용 수준에서의 pH 조절 방법으로는 완충액, 알칼리, 산 등의 사용이 있으며, 당업계의 숙련된 자들에 주지되어 있다.
적당한 낮은 pH 세정 조성물은 전형적으로 순 pH 가 약 3 내지 약 5 이고, 전형적으로는 이러한 pH 환경에서 가수분해되는 계면활성제를 포함하고 있지 않다. 이러한 계면활성제로서는, 하나 이상의 산화에틸렌 부분 또는 심지어 약 1 내지 16 몰의 산화에틸렌을 포함하는 소듐 알킬 술페이트 계면활성제가 있다. 이러한 세정 조성물은 전형적으로 수산화나트륨, 모노에탄올아민 또는 염산 등의 충분한 양의 pH 조절제를 포함하여, 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 세정 조성물을 생성한다. 이러한 조성물은 전형적으로 하나 이상의 산 안정성 효소를 포함한다. 상기 조성물은 액체 또는 고체일 수 있다. 상기와 같은 액체 조성물의 pH 는 순 pH 로서 측정된다. 상기와 같은 고체 조성물의 pH 는 상기 조성물의 10% 고체 용액으로서 측정되는데, 이때 용매는 증류수이다. 이들 구현예들에서, 모든 pH 측정은 20 ℃ 에서 행해진다.
세린 프로테아제(들)를 과립 조성물 또는 액체 중에서 이용할 때, 저장 동안 과립 조성물의 다른 구성요소들로부터 상기 효소를 보호하기 위하여 상기 효소를 캡슐화된 입자의 형태로 하는 것이 바람직할 수 있다. 부가적으로, 캡슐화는 또한 세정 공정 동안 효소의 이용가능성을 제어하는 수단이며, 본원에 제시된 효소들의 성능을 향상시킬 수 있다. 이 점에서, 본 발명의 세린 프로테아제들을 당업계에 공지된 임의의 캡슐화 물질로 캡슐화시킬 수 있다.
상기 캡슐화 물질은 전형적으로 본 발명의 효소들에 대한 촉매의 일부 이상을 캡슐화한다. 전형적으로, 상기 캡슐화 물질은 수-용해성 및/또는 수-분산성이다. 상기 캡슐화 물질은 유리 전이 온도 (Tg) 가 0 ℃ 이상일 수 있다. 유리 전이 온도는 WO 97/11151, 특별히 6 페이지 25 줄 내지 7 페이지 2 줄에 보다 상세히 기술되어 있다.
상기 캡슐화 물질은 탄수화물, 천연 또는 합성 고무, 키틴 및 키토산, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 규산염, 인산염, 붕산염, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 캡슐화 물질이 탄수화물인 경우, 이는 전형적으로 단당류, 올리고당류, 다당류 및 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 전형적으로, 상기 캡슐화 물질은 전분이다. 적당한 전분은 EP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,559 및 US 5,935,826 에 기술되어 있다.
캡슐화 물질은 열가소성 플라스틱, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴 및 이들의 혼합물 등의 플라스틱으로 만들어진 미세구체 (microsphere) 일 수 있으며; 시판되는 사용될 수 있는 미세구체는 Expancel (Stockviksverken, 스웨덴) 에 의해 Expancel® 라는 상표로 공급되는 류 및 PQ 사 (Valley Forge, Pennsylvania, 미국) 에 의해 PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, Extendospheres®, Luxsil®, Q-cel® 및 Sphericel® 라는 상표명으로 공급되는 류이다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 프로테아제들은, 이에 제한되는 것은 아니나 세탁 및 식기 세제를 포함하는 세정 산업에 특히 사용된다. 이 용도들은 효소들을 다양한 환경적 스트레스하에 둔다. 본 발명의 프로테아제들은 다양한 조건하에서의 안정성 때문에, 현재 사용되는 많은 효소들에 비해 이점을 제공한다.
실제로, 다양한 세제 제형물, 세척수 부피, 세척수 온도 및 세척 시간의 길이를 포함하여, 세척에 관련된 프로테아제들이 노출되는 다양한 세척 조건들이 있다. 또한, 상이한 지리학적 지역에서 사용되는 세제 제형물은 세척수에 존재하는 관련 구성요소들의 농도가 상이하다. 예를 들어, 유럽의 세제는 세척수 중에 전형적으로 약 4500 ~ 5000 ppm 의 세제 구성요소들을 가지는 반면, 일본의 세제는 세척수 중에 전형적으로 대략 667 ppm 의 세제 구성요소들을 가진다. 북아메리카, 특히 미국에서, 세제들은 세척수 중에 전형적으로 약 975 ppm 의 세제 구성요소들이 존재한다.
저 세제 농도 시스템은 세척수 중에 약 800 ppm 미만의 세제 구성요소들이 존재하는 세제들을 포함한다. 일본의 세제들은 세척수 중에 대략 667 ppm 의 세제 구성요소들이 존재하므로, 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 고려된다.
중 세제 농도는 세척수 중에 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 구성요소들이 존재하는 세제들을 포함한다. 북아메리카 세제들은 세척수 중에 대략 975 ppm 의 세제 구성요소들이 존재하므로, 일반적으로 중 세제 농도 시스템으로 고려된다. 브라질은 전형적으로 세척수 중에 대략 1500 ppm 의 세제 구성요소들이 존재한다.
고 세제 농도 시스템은 세척수 중에 약 2000 ppm 초과의 세제 구성요소들이 존재하는 세제들을 포함한다. 유럽의 세제들은 세척수 중에 대략 4500 ~ 5000 ppm 의 세제 구성요소들을 가지므로 일반적으로 고 세제 농도 시스템으로 고려된다.
라틴 아메리카의 세제들은 일반적으로 고 거품의 인산염 증강제 세제들이고, 라틴 아메리카에서 사용되는 세제의 범위는, 세척수 중의 세제 구성요소들이 1500 ppm 내지 6000 ppm 범위이므로, 중 및 고 세제 농도 모두의 범위 내에 속할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 브라질은 세척수 중에 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 구성요소들이 존재한다. 그러나, 기타 고 거품의 인산염 증강제 세제 지역들은, 다른 라틴 아메리카 나라들에 제한되지 않고, 세척수 중에 약 6000 ppm 까지의 세제 구성요소들이 존재하는 고 세제 농도 시스템을 가질 수 있다.
앞의 내용에 비추어, 전 세계적으로 전형적인 세척 용액 중의 세제 조성물의 농도는, 예를 들어 일본에서의 약 667 ppm 등의 약 800 ppm 미만의 세제 조성물 ("저 세제 농도 지역") 부터, 예를 들어 미국에서의 약 975 ppm 및 브라질에서의 약 1500 ppm 등의 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm ("중 세제 농도 지역") 까지, 예를 들어 유럽에서의 약 4500 ppm 내지 약 5000 ppm 및 고 거품의 인산염 세척력 증강제 지역에서의 약 6000 ppm 등의 약 2000 ppm 초과 ("고 세제 농도 지역") 까지로 다양하다는 것이 분명하다.
전형적인 세척 용액의 농도는 경험적으로 결정된다. 예를 들어, 미국에서, 전형적인 세탁기는 약 64.4 L 부피의 세척 용액을 수용한다. 따라서, 세척 용액 내에 약 975 ppm 의 세제 농도를 수득하기 위하여는 상기 64.4 L 의 세척 용액에 약 62.79 g 의 세제 조성물을 첨가하여야 한다. 이 양은, 소비자가 상기 세제와 함께 제공되는 계량컵을 이용하여 세척수 내로 계량하여 넣는 전형적인 양이다.
추가적인 예로서, 상이한 지역들은 상이한 세척 온도를 사용한다. 일본에서 세척수의 온도는 전형적으로 유럽에서 사용되는 것보다 낮다. 예를 들어, 북아메리카 및 일본에서 세척수의 온도는 10 내지 30 ℃ (예컨대, 약 20 ℃) 일 수 있는 반면, 유럽에서의 세척수의 온도는 전형적으로 30 내지 60 ℃ (예컨대, 약 40 ℃) 이다.
추가적인 예로서, 상이한 지역들에서는 전형적으로 물의 경도가 상이하다. 물의 경도는 보통 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 (gallon) 당 그레인 (grain) 으로 기술된다. 경도는 수 중의 칼슘 (Ca2+) 및 마그네슘 (Mg2+) 의 양을 측정한 것이다. 미국에서 대부분의 물은 경질이나, 경도의 정도는 다양하다. 중경수 (moderately hard water) (60 ~ 120 ppm) 내지 경수 (121 ~ 181 ppm) 는 60 내지 181 ppm (parts per million, 백만분율) [백만분율을 U.S. 갤런당 그레인으로 환산하는 것은 ppm # 을 17.1 gpg (grains per gallon, 갤런 당 그레인) 로 나눈 것과 같음] 의 경질 광물을 가진다.
물 갤런 당 그레인 (gpg) 백만분율 (ppm)
연수 1.0 미만 17 미만
약경수 1.0 내지 3.5 17 내지 60
중경수 3.5 내지 7.0 60 내지 120
경수 7.0 내지 10.5 120 내지 180
고경수 10.5 초과 180 초과
유럽의 물의 경도는 전형적으로 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 10.5 초과 (예를 들어 10.5 ~ 20.0) 그레인 (예컨대, 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 약 15 그레인) 이다. 북아메리카의 물의 경도는 전형적으로 일본의 물의 경도보다 크나, 유럽의 물의 경도보다는 작다. 예를 들어, 북아메리카의 물의 경도는 3 내지 10 그레인, 3 ~ 8 그레인 또는 약 6 그레인일 수 있다. 일본의 물의 경도는 전형적으로 북아메리카 물의 경도보다 작은데, 보통 4 미만, 예를 들어 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 3 그레인이다.
따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명은 하나 이상의 세척 조건의 집합 (예컨대, 수온, 물의 경도 및/또는 세제 농도) 에서 놀라운 세척 성능을 나타내는 프로테아제를 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 세척 성능에 있어서 서브틸리신 프로테아제에 필적한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 서브틸리신 프로테아제들과 비교시 향상된 세척 성능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예들에서, 본원에 제시된 프로테아제들은 향상된 산화적 안정성, 향상된 열 안정성 및/또는 향상된 킬레이트제 안정성을 나타낸다.
일부 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 ASP 프로테아제, 뿐 아니라 상기 프로테아제의 동족체 및 변형체들을 제공한다. 이들 프로테아제들은 섬유 또는 직물로부터 단백질 기재의 얼룩을 지우는 것이 요구되는 임의 용도들에 사용된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 세탁 첨가제 조성물을 포함하는 손 및 기계 세탁 세제 조성물, 및 얼룩진 섬유의 전처리에 사용하기에 적당한 조성물, 린스제-첨가된 섬유 유연제 조성물 및 일반적인 가정용 거친 표면 세정 작업 및 식기세척 작업에 사용하기 위한 조성물로 제형화된다. 당업자들은 세정 조성물로 사용될 수 있는 상이한 제형물들에 친숙하다. 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 세제 조성물 중에서 필적할만한 또는 향상된 성능을 가진다(즉, 다른 프로테아제들과 비교하여). 일부 구현예들에서, 세정 성능은 난백, 풀, 혈액, 우유 등의 효소-민감성 얼룩들을 이용하는 다양한 세정 검정에서 표준 방법으로 본 발명의 프로테아제들을 서브틸리신 프로테아제들과 비교하여 평가된다. 실제로, 당업자들은 표준 세척 주기 조건하에서 세제 성능을 평가하는데 사용되는 분광분석적 및 기타 분석 방법에 친숙하다.
본 발명에 사용되는 검정에는, 이에 제한되는 것은 아니나 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (예컨대, 실시예 3) 에 기술된 것들이 있다. 미국 특허 제 6,605,458 호에서는, 실시예 3 에서, pH 10.5 의 세제 1회분 3.0 g/ℓ, 세척 시간 15 ℃ 에서 15 분, 물의 경도 6˚dH, 교반 막대가 달린 150 ㎖ 유리 비커 중 효소 농도 10nM, 50 ㎖ 중 섬유 조각 5 개(phi 2.5 cm), Center for Test Materials Holland 로부터의 EMPA 117 테스트 물질이 사용된다. 테스트 물질에 대한 반사율 "R"의 측정은 Macbeth ColorEye 7000 광도계 (photometer) 를 이용하여 460 nm 에서 수행되었다. 본원의 실시예에는 추가적인 방법들이 제시되어 있다. 따라서, 이들 방법들 또한 본 발명에 사용된다.
본 발명의 프로테아제들을 통상적인 세정 조성물에 첨가하는 것은 임의의 특별한 사용 제한을 생성하지 않는다. 다시 말해, 상기 세제용으로 적당한 임의의 온도 및 pH 는, 상기 pH 가 본원에 개시된 범위 내에 있고, 상기 온도가 상기 기술된 프로테아제의 변성 온도 이하인 한, 본 발명의 조성물에도 적당하다. 또한, 본 발명의 프로테아제들은 세제를 포함하지 않는 세정 조성물에서, 단독으로 또는 세척력 증강제 및 안정화제와 병용하여 사용된다.
세정 조성물 또는 세제 중에 사용시, 산화적 안정성은 추가적인 고려 사항이다. 따라서, 일부 응용에서, 상기 안정성은 다양한 용도들에 요구되는 바에 따라 서브틸리신 프로테아제에 비해 향상되거나, 감소하거나 또는 그에 필적한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 향상된 산화적 안정성이 바람직하다. 본 발명의 프로테아제들 중 일부는 이러한 용도들에 특히 사용된다.
세정 조성물 또는 세제 중에 사용시, 열 안정성은 추가적인 고려 사항이다. 따라서, 일부 응용에서, 상기 안정성은 다양한 용도들에 요구되는 바에 따라 서브틸리신 프로테아제에 비해 향상되거나, 감소하거나 또는 그에 필적한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 향상된 열안정성이 바람직하다. 본 발명의 프로테아제들 중 일부는 이러한 용도들에 특히 사용된다.
세정 조성물 또는 세제 중에 사용시, 킬레이트제 안정성은 추가적인 고려 사항이다. 따라서, 일부 응용에서, 상기 안정성은 다양한 용도들에 요구되는 바에 따라 서브틸리신 프로테아제에 비해 향상되거나, 감소하거나 또는 그에 필적한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 향상된 킬레이트제 안정성이 바람직하다. 본 발명의 프로테아제들 중 일부는 이러한 용도들에 특히 사용된다.
본 발명의 일부 구현예들에서는, 서브틸리신 프로테아제들과 비교할 때 상이한 pH 에서 변경된 효소 활성을 나타내는 자연 발생적 프로테아제들이 제공된다. pH-활성 프로필은 효소 활성에 대한 pH 의 도표이고, 실시예에 기술된 바에 따라 및/또는 당업계에 공지된 방법들에 의해 구축될 수 있다. 일부 구현예들에서는, 보다 넓은 프로필을 가진 자연 발생적 프로테아제 (즉, pH 범위들에서 유사한 서브틸리신 프로테아제 보다 큰 활성을 가진 류) 를 수득하는 것이 바람직하다. 다른 구현예들에서, 상기 효소들, 또는 보다 가파른 프로필을 가진 자연 발생적 동족체 (즉, 주어진 pH 에서 서브틸리신 프로테아제와 비교시 향상된 활성을 가지며, 그 외에는 보다 적은 활성을 가지는 류) 는 임의의 pH 에서 현저히 더 큰 활성을 갖지 않는다. 따라서, 다양한 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 적정 pH 및/또는 pH 범위가 상이하다. 본 발명을 임의의 특이적 pH 또는 pH 범위로 제한하려는 의도는 없다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 세정 조성물은 본 발명의 프로테아제들을 상기 조성물의 중량 기준으로 69B4 및/또는 본 발명의 다른 프로테아제에 대하여 0.00001% 내지 10% 수준으로 포함하고, 나머지 (예컨대, 99.999% 내지 90.0%) 는 조성물의 중량 기준으로 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 조성물의 중량 기준으로 69B4 및/또는 다른 프로테아제들을 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 의 69B4 또는 본 발명의 다른 프로테아제 수준으로 포함하고, 상기 세정 조성물의 나머지 (예컨대, 99.9999% 내지 90.0%, 99.999 % 내지 98%, 99.995% 내지 99.5 중량%) 는 세정 부속 물질들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 바람직한 세정 조성물은, 본 발명의 프로테아제 제조물 이외에, 세정 성능 및/또는 섬유 관리 이점들을 제공하는 하나 이상의 부가적인 효소들 또는 효소 유도체들을 포함한다. 이러한 효소들로는, 이에 제한되는 것은 아니나 다른 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 과산화효소, 산화효소 (예컨대 라카아제(laccase)) 및/또는 만난아제가 있다.
본 발명의 조성물에는 알칼리성 용액에서 사용하기에 적당한 임의의 기타 프로테아제가 사용된다. 적당한 프로테아제로서는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것들이 있다. 특히 바람직한 구현예들에서는, 미생물 프로테아제들이 사용된다. 일부 구현예들에서, 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 변이체들이 포함된다. 일부 구현예들에서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제이고, 바람직하게는 알칼리성 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제이다. 알칼리성 프로테아제의 예로서는, 서브틸리신, 특별히 바실러스에서 유래한 류 (예컨대, 서브틸리신, 렌투스, 아밀로리쿠에파시엔스, 서브틸리신 칼스버그 (Carlsberg), 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168) 가 있다. 추가적인 예로서는, 미국 특허 제 RE 34,606 호, 제 5,955,340 호, 제 5,700,676 호, 제 6,312,936 호 및 제 6,482,628 호에 기술된 변이 프로테아제들이 있으며, 상기 문헌들은 모두 참조로서 본원에 포함된다. 추가적인 프로테아제 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 트립신 (예컨대, 돼지 또는 소 기원의) 및 WO 89/06270 에 기술된 푸사리움 (Fusarium ) 프로테아제가 있다. 바람직한 시판되는 프로테아제 효소들로서는, MAXATASE®, MAXACALTM, MAXAPEMTM, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT® 및 PURAFECT® OXP (Genencor) 라는 상표명으로 판매되는 것들, ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYMTM, RELASE® 및 ESPERASE® (Novozymes) 라는 상표명으로 판매되는 것들; 및 BLAPTM (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, 독일) 이라는 상표명 하에 판매되는 것들이 있다. WO95/23221, WO 92/21760 및 미국 특허 제 5,801,039 호, 제 5,340,735 호, 제 5,500,364 호, 제 5,855,625 호에는 다양한 프로테아제들이 기술되어 있다. 부가적인 BPN 변형체 ("BPN'-var 1" 및 "BPN-변형체 1"; 본원에서 지칭된 바) 는 US RE 34,606 에 기술되어 있다. 추가적인 GG36-변형체 ("GG36-var.1" 및 "GG36-변형체 1"; 본원에 지칭된 바) 가 US 5,955,340 및 5,700,676 에 기술되어 있다. 추가적인 GG36-변형체는 US 특허 제 6,312,936 호 및 제 6,482,628 호에 기술되어 있다. 본 발명의 한 가지 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 추가적인 프로테아제 효소들을 조성물의 중량 기준으로 0.00001% 내지 10% 추가적인 프로테아제 수준으로 및 조성물의 중량 기준으로 99.999% 내지 90.0% 의 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 프로테아제들을 조성물의 중량 기준으로 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 69B4 프로테아제 (또는 이의 동족체 또는 변형체들) 수준으로 포함하고, 상기 세정 조성물의 나머지 (예컨대, 99.9999% 내지 90.0%, 99.999 % 내지 98%, 99.995% 내지 99.5 중량%) 는 세정 부속 물질들을 포함한다.
또한, 본 발명에서는 알칼리성 용액에 사용하기에 적당한 임의의 리파아제가 사용된다. 적당한 리파아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 세균 또는 진균 기원의 것들이 있다. 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 변이체들은 본 발명에 모두 포함된다. 유용한 리파아제의 예로서는, 후미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 리파아제 (예컨대, EP 258 068 및 EP 305 216 참조), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제 (예컨대, EP 238 023 참조), 칸디다 (Candida) 리파아제, 예컨대 C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파아제 (예컨대, C. 안타르크티카 리파아제 A 또는 B; 예컨대, EP 214 761 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제, 예컨대 P. 알칼리게네스 (P. alcaligenes) 및 P. 슈도알칼리게네스 (P. pseudoalcaligenes) 리파아제 (예컨대, EP 218 272 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) 리파아제 (예컨대, EP 331 376 참조), P. 스투체리 (P. stutzeri) 리파아제 (예컨대, GB 1,372,034 참조), P. 플루오레센스 (P. fluorescens) 리파아제, 바실러스 리파아제 [예컨대, B. 서브틸리스 리파아제 (Dartois 등, Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. 스테아로테르모필루스 리파아제 (예컨대, JP 64/744992 참조); 및 B. 푸밀러스 리파아제 (예컨대, WO 91/16422 참조)] 가 있다.
나아가, 본 발명의 일부 구현예들에서는 다수의 클로닝된 리파아제들이 사용되는데, 이에 제한되는 것은 아니나 페니실리움 카멤베르티 (Penicillium camembertii) 리파아제 (Yamaguchi 등, Gene 103:61-67 [1991] 참조), 게오트리쿰 칸디둠 (Geotricum candidum) 리파아제 (Schimada 등, J. Biochem., 106:383-388 [1989] 참조) 및 다양한 리조푸스 (Rhizopus) 리파아제, 예컨대 R. 델레마르 (R. delemar) 리파아제 (Hass 등, Gene 109:117-113 [1991] 참조), R. 니베우스 (R. niveus) 리파아제 (Kugimiya 등, Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) 및 R. 오리재 (R. oryzae) 리파아제가 있다.
큐티나아제 등의 다른 유형의 지방분해 효소들 또한 본 발명의 일부 구현예들에서 사용되는데, 이에 제한되는 것은 아니나 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina) 에서 유래한 큐티나아제 (WO 88/09367 참조) 또는 푸사리움 솔라니 피시 (Fusarium solani pisi) 에서 유래한 큐티나아제 (WO 90/09446 참조) 가 있다.
추가적인 적당한 리파아제로서는, 시판되는 리파아제, 예컨대 M1 LIPASETM, LUMA FASTTM 및 LIPOMAXTM (Genencor); LIPOLASE® 및 LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); 및 LIPASE PTM "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., 일본) 가 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 추가로 리파아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.00001% 내지 10% 의 추가적 리파아제 수준으로 포함하고, 나머지는 조성물의 중량 기준으로 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 리파아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 리파아제 수준으로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예들에서는 알칼리성 용액에 사용하기에 적당한 임의의 아밀라아제 (알파 및/또는 베타) 를 또한 사용한다. 적당한 아밀라아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 세균 또는 진균 기원의 것들이 있다. 일부 구현예들에서는 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 변이체들이 포함된다. 본 발명에 사용되는 아밀라아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 B. 리체니포르미스에서 수득한 α-아밀라아제 (예컨대, GB 1,296,839 참조) 가 있다. 본 발명에 사용되는 시판되는 아밀라아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL® 및 BANTM (Novozymes) 및 RAPIDASE® 및 MAXAMYL® P (Genencor International) 이 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 추가로 아밀라아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.00001% 내지 10% 부가적 아밀라아제 수준으로 포함하고, 나머지는 조성물의 중량 기준으로 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 아밀라아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 아밀라아제 수준으로 포함한다.
본 발명의 구현예들에서는 알칼리성 용액에 사용하기에 적당한 임의의 셀룰라아제가 사용된다. 적당한 셀룰라아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 세균 또는 진균 기원의 것들이 있다. 일부 구현예들에서는 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 변이체들이 포함된다. 적당한 셀룰라아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 후미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens) 셀룰라아제 (예컨대, 미국 특허 제 4,435,307 호 참조) 가 있다. 특별히 적당한 셀룰라아제는 색상 보호 이점을 가진 셀룰라아제이다(예컨대, EP 0 495 257 참조).
본 발명에 사용되는 시판되는 셀룰라아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 CELLUZYME® (Novozymes), 및 KAC-500(B)TM (Kao Corporation) 이 있다. 일부 구현예들에서, 셀룰라아제는 성숙한 야생형 또는 변이형 셀룰라아제의 일부 또는 절편으로 편입되는데, 이때 N-말단 부분이 결실된다(예컨대, 미국 특허 제 5,874,276 호 참조).
일부 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 추가로 셀룰라아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.00001% 내지 10% 의 추가적 셀룰라아제 수준으로 포함하고, 나머지는 조성물의 중량 기준으로 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 셀룰라아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 셀룰라아제 수준으로 포함한다.
세제 조성물 및 또는 알칼리성 용액에서 사용하기에 적당한 임의의 만난아제가 본 발명에 사용된다. 적당한 만난아제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 세균 또는 진균 기원의 것들이 있다. 일부 구현예들에서는 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 변이체들이 포함된다. 본 발명에 사용되는 다양한 만난아제들은 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 6,566,114 호, 미국 특허 제 6,602,842 호, 및 미국 특허 제 6,440,991 호, 모두 참조로서 본원에 포함됨).
일부 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 추가로 만난아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.00001% 내지 10% 의 추가적 만난아제 수준으로 포함하고, 나머지는 조성물의 중량 기준으로 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 만난아제를, 조성물의 중량 기준으로 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 만난아제 수준으로 포함한다.
일부 구현예들에서, 과산화효소는 과산화수소 또는 이의 공급원 (예컨대, 과탄산염, 과붕산염 또는 과황산염) 과 함께 사용된다. 대안적인 구현예들에서, 산화효소는 산소와 함께 사용된다. 상기 두 유형의 효소들 모두 "용액 표백"에 (즉, 섬유들을 세척액 중에서 함께 세척시 염색된 섬유로부터 또 다른 섬유로 섬유 염료가 이동하는 것을 방지하기 위하여), 바람직하게는 향상제 (예컨대, WO 94/12621 및 WO 95/01426 참조) 와 함께 사용된다. 적당한 과산화효소/산화효소로는, 이에 제한되는 것은 아니나 식물, 세균 또는 진균 기원의 것들이 있다. 일부 구현예들에서는 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 변이체들이 포함된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 세정 조성물은 추가로 과산화효소 및/또는 산화효소 효소들을, 조성물의 중량 기준으로 0.00001% 내지 10% 의 추가적 과산화효소 및/또는 산화효소 수준으로 포함하고, 나머지는 조성물의 중량 기준으로 세정 부속 물질들을 포함한다. 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 과산화효소 및/또는 산화효소 효소들을, 조성물의 중량 기준으로 0.0001% 내지 10%, 0.001% 내지 5%, 0.001% 내지 2%, 0.005% 내지 0.5% 과산화효소 및/또는 산화효소 효소들 수준으로 포함한다.
본원에는 상기 언급한 효소들의 혼합물이 포함되는데, 특히 69B4 효소, 하나 이상의 추가적인 프로테아제, 하나 이상의 아밀라아제, 하나 이상의 리파아제, 하나 이상의 만난아제 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제의 혼합물이 있다. 실제로, 이들 효소들의 다양한 혼합물이 본 발명에 사용될 것으로 예기된다.
다양한 수준의 상기 프로테아제 및 하나 이상의 부가적인 효소들 모두 독립적으로 10% 까지의 범위이고, 세정 조성물의 나머지는 세정 부속 물질일 수 있음이 고려된다. 세정 부속 물질에 대한 특이적 선택은 세정될 표면, 품목, 또는 섬유, 및 사용 (예컨대, 세척 세제 사용) 동안의 세정 조건들에 바람직한 조성물의 형태를 고려하여 용이하게 이루어진다.
적당한 세정 부속 물질의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 계면활성제, 세척력 증강제, 표백제, 표백 활성자, 표백 촉매, 기타 효소들, 효소 안정화 시스템, 킬란트 (chelant), 형광증백제 (optical brightener), 방오성 (soil release) 중합체, 염료 이동제, 분산제, 거품 억제자, 염료, 향수, 착색제, 충진제 염, 용해보조제, 광활성자, 형광물질 (fluorescer), 섬유 컨디셔너, 가수분해성 계면활성제, 방부제, 산화방지제, 수축방지제, 주름방지제, 살균제, 살진균제, 색상 스페클 (color speckle), 실버케어 (silvercare), 변색 방지제 및/또는 방식제 (anti-corrosion agent), 알칼리도 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료 및 pH 조절제 (예컨대, 미국 특허 제 6,610,642 호, 제 6,605,458 호, 제 5,705,464 호, 제 5,710,115 호, 제 5,698,504 호, 제 5,695,679 호, 제 5,686,014 호 및 제 5,646,101 호; 이들 모두 참조로서 본원에 포함됨) 가 있다. 특이적 세정 조성물 물질의 구현예는 하기에 상세히 예시된다.
세정 부속 물질들이 세정 조성물 내에서 본 발명의 프로테아제들과 혼화되지 않을 경우, 상기 두 구성요소들의 조합이 적절할 때까지 상기 세정 부속 물질 및 프로테아제(들)를 분리된 상태로 (즉, 서로 접촉하지 않은 상태로) 유지하는 적당한 방법이 사용된다. 이러한 분리 방법에는, 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법이 포함된다(예컨대, 겔캡, 캡슐화, 정제, 물리적 분리 등).
바람직하게는 단백질성 얼룩 제거를 필요로하는 다양한 표면을 세정하는데 유용한 조성물에 본원에 제시된 하나 이상의 프로테아제(들)의 유효량이 포함된다. 이러한 세정 조성물로는, 세정 거친 표면, 섬유 및 식기들을 세정하는 용도를 위한 세정 조성물이 있다. 실제로, 일부 구현예들에서, 본 발명은 섬유 세정 조성물을 제공하는 한편, 다른 구현예들에서, 본 발명은 비-섬유 세정 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 또한 구강 관리 (덴트리피스 (dentrifice), 치약, 구강세정제 등, 및 의치 세정 조성물 포함), 피부 및 모발 세정 조성물을 포함하는 개인 관리용으로 적당한 세정 조성물을 제공한다. 본 발명이 임의 형태 (즉, 액체, 과립, 바, 반-고체, 겔, 에멀션, 정제, 캡슐 등) 의 세제 조성물을 포괄하는 것을 의도하였다.
일례로서, 본 발명의 프로테아제가 사용되는 여러 세정 조성물이 하기에 보다 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 세정 조성물을 세탁기 세척 방법(들)에 사용하기에 적당한 조성물로 제형화한 구현예들에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제 및 하나 이상의 세척력 증강제 화합물, 및 바람직하게는 유기 중합체성 화합물, 표백제, 부가적인 효소, 거품 억제제, 분산제, 라임-솝 (lime-soap) 분산제, 오염 현탁물 (soil suspension) 및 재오염방지제 및 부식 저해제에서 선택되는 하나 이상의 세정 부속 물질들을 함유한다. 일부 구현예들에서, 세탁 조성물들은 또한 유연제를 함유한다(즉, 추가적 세정 부속 물질로서).
본 발명의 조성물은 또한 고체 또는 액체 형태의 세제 첨가제 제품에 사용된다. 이러한 첨가제 제품들은 통상적인 세제 조성물의 성능을 보충 및/또는 증가시키기 위한 것이며, 이들을 세정 과정 중 임의 단계에서 첨가할 수 있다.
수동 식기세척 방법에 사용하기 위한 조성물로 제형화되는 구현예들에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제 및, 바람직하게는 유기 중합체성 화합물, 거품 향상제, II 족 금속 이온, 용매, 용해보조제 및 부가적인 효소에서 선택되는 하나 이상의 부가적인 세정 부속 물질을 함유한다.
일부 구현예들에서, 세탁 세제 조성물의 밀도는 본원에서 20 ℃ 에서 측정된 조성물 중 400 내지 1200 g/리터 범위인 반면, 다른 구현예들에서는, 500 내지 950 g/리터 범위이다.
일부 구현예들에서는, 미국 특허 제 6,605,458 호에 제시된 것들 등의 다양한 세정 조성물이 본 발명의 프로테아제들과 함께 사용된다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 조성물이 조밀한 과립 섬유 세정 조성물인 반면, 다른 구현예들에서, 상기 조성물은 색상 섬유의 세탁에 유용한 과립 섬유 세정 조성물이고, 또 다른 구현예들에서, 상기 조성물은 세척 역량을 통해 연화를 제공하는 과립 섬유 세정 조성물이고, 추가적인 구현예들에서, 상기 조성물은 중질 액체 섬유 세정 조성물이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 조성물은 미국 특허 제 6,610,642 호 및 제 6,376,450 호에 기술된 류 등의 섬유 세정 조성물이다. 또한, 본 발명의 프로테아제들은 유럽 또는 일본의 세척 조건들 하에서 특히 유용한 과립 세탁 세제 조성물에 사용된다(예컨대, 미국 특허 제 6,610,642 호 참조).
대안적인 구현예들에서, 본 발명은 본원에 제시된 하나 이상의 프로테아제를 포함한 거친 표면 세정 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 조성물은 미국 특허 제 6,610,642 호, 제 6,376,450 호 및 제 6,376,450 호에 기술된 류 등의 거친 표면 세정 조성물이다.
또 다른 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본원에 제시된 하나 이상의 프로테아제를 포함한 식기세척 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 조성물은 미국 특허 제 6,610,642 호 및 제 6,376,450 호의 것들 등의 거친 표면 세정 조성물이다.
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 본원에 제시된 하나 이상의 프로테아제를 포함한 식기세척 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 조성물은 미국 특허 제 6,376,450 호 및 제 6,376,450 호의 것들 등의 구강 관리 조성물을 포함한다.
상기 화합물 및 세정 부속 물질에 대한 제형 및 설명은 상기 언급한 US 특허 제 6,376,450 호, 제 6,605,458 호, 제 6,605,458 호 및 제 6,610,642 호에 담겨있으며, 이들은 모두 명백히 참조로서 본원에 포함되다. 또 다른 예들은 하기 실시예에 개시되어 있다.
I) 본 발명의 세정 조성물의 제조 및 사용 방법
본 발명의 세정 조성물을 임의의 적당한 형태로 제형화하고 상기 제형자에 의해 선택되는 임의 방법으로 제조할 수 있는데, 이에 대한 비제한적 예들이 미국 특허 제 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,565,422 호, 제 5,516,448 호, 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기술되어 있으며, 이들은 모두 참조로서 본원에 포함된다. 낮은 pH 세정 조성물이 바람직한 경우, 이러한 조성물의 pH 는 모노에탄올아민 또는 HCl 등의 산성 물질 등의 물질을 첨가하여 조절할 수 있다.
II) 본 발명의 세린 프로테아제들 이외의 부속 물질
본 발명의 목적상 필수적인 것은 아니나, 이후 설명되는 비제한적인 목록의 부속물들은 본 발명의 세정 조성물에 사용하기에 적당하며, 바람직하게는, 예를 들어 세정 성능의 보조 또는 강화를 위해, 세정될 기질의 처리를 위해, 또는 향수, 착색제, 염료 등을 가진 경우 세정 조성물의 미감을 조절하기 위해, 본 발명의 일정 구현예들에서 편입될 수 있다. 이러한 부속물들이 본 발명의 세린 프로테아제들 외의 것임은 물론이다. 이들 부가적인 구성요소들의 명확한 성질, 및 이들의 편입 수준은 상기 조성물의 물리적 형태 및 사용될 세정 작업의 본질에 따라 다를 것이다. 적당한 부속 물질로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 계면활성제, 세척력 증강제, 킬레이트화제, 염료 이동 저해제, 침전 보조제 (deposition aid), 분산제, 부가적인 효소 및 효소 안정화제, 촉매 물질, 표백 활성자, 표백 증강제 (bleach booster), 과산화수소, 과산화수소 공급원, 기성 과산 (preformed peracid), 중합체성 분산제, 점토 제거/재오염방지제, 광택제, 거품 억제제, 염료, 향수, 구조 탄성제 (elasticizing agent), 섬유 유연제, 담체, 용해보조제, 가공 보조제 및/또는 안료가 있다. 하기 명세에 더하여, 이러한 다른 부속물 및 사용 수준에 대한 적당한 예는 미국 특허 제 5,576,282 호, 제 6,306,812 호 및 제 6,326,348 호에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 참조로서 포함된다. 상기 언급한 부속 성분은 본 발명의 세정 조성물의 나머지를 구성할 수 있다.
계면활성제 - 본 발명에 따른 세정 조성물은 계면활성제 또는 계면활성제 시스템를 포함할 수 있으며, 이때 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제, 반-극성 비이온성 계면활성제 및 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다. 낮은 pH 세정 조성물, 예컨대 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 조성물이 요구되는 경우, 이러한 조성물은 전형적으로 알킬 에톡실화 황산을 함유하지 않는데, 그 이유는 이러한 계면활성제가 이러한 조성물의 산성 내용물에 의해 가수분해될 수 있는 것으로 여겨지기 때문이다.
상기 계면활성제는 전형적으로는 대상 세정 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 60 중량%, 약 1 중량% 내지 약 50 중량% 또는 심지어 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 수준으로 존재한다.
세척력 증강제 - 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 세제 세척력 증강제 또는 세척력 증강제 시스템을 포함할 수 있다. 세척력 증강제가 사용될 때, 대상 세정 조성물은 전형적으로 상기 대상 세정 조성물의 약 1 중량% 이상, 약 3 중량% 내지 약 60 중량% 또는 심지어 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 세척력 증강제를 포함할 것이다.
세척력 증강제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 알칼리 금속, 폴리포스페이트의 암모늄 및 알카놀암모늄 염, 알칼리 금속 규산염, 알칼리토금속 및 알칼리 금속 탄산염, 알루미노규산염 세척력 증강제 폴리카르복실레이트 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레인산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산 및 카르복시메틸옥시숙신산, 다양한 알칼리 금속, 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산 등의 폴리아세트산의 암모늄 및 치환된 암모늄 염, 뿐 아니라 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레인산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산 등의 폴리카르복실레이트, 및 이들의 가용성 염이 있다.
킬레이트화제 - 본원에서 세정 조성물은 킬레이트화제를 함유할 수 있다. 적당한 킬레이트화제에는, 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트화제 및 이들의 혼합물이 있다.
킬레이트화제를 사용할 경우, 세정 조성물은 대상 세정 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량% 또는 심지어 약 3.0 중량% 내지 약 10 중량% 의 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
침전 보조제 - 본원에서 세정 조성물은 침전 보조제를 함유할 수 있다. 적당한 침전 보조제로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 폴리테레프탈산 등의 방오성 중합체, 카올리나이트 (Kaolinite), 몬모릴로나이트, 애타풀자이트 (atapulgite), 일라이트 (illite), 벤토나이트, 할로이사이트 (halloysite) 및 이들의 혼합물 등의 점토가 있다.
염료 이동 저해제 - 본 발명의 세정 조성물은 또한 하나 이상의 염료 이동 저해제를 포함할 수 있다. 적당한 중합체성 염료 이동 저해제로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-옥시드 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 이들의 혼합물이 있다.
상기 염료 이동 저해제는 대상 세정 조성물에 존재시, 상기 세정 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 또는 심지어 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 수준으로 존재할 수 있다.
분산제 - 본 발명의 세정 조성물은 또한 분산제를 함유할 수 있다. 적당한 수용성 유기 물질에는, 단일- 또는 공-중합체성 산 또는 이들의 염이 있으며, 이때 폴리카르복실산은 서로 2 개 이하의 탄소 원자 만큼 떨어져 있는 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함한다.
효소들 - 상기 세정 조성물은 세정 성능 및/또는 섬유 관리 이점들을 제공하는 하나 이상의 세제 효소들을 포함할 수 있다. 적당한 효소들의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 헤미셀룰라아제, 과산화효소, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라제, 큐티나아제, 펙티나제, 케라티나제, 환원효소, 산화효소, 페놀 산화효소, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나제 (pullulanase), 탄나아제 (tannase), 펜토사나아제 (pentosanase), 말라나제 (malanase), β-글루카나아제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 라카아제, 및 아밀라아제, 또는 이들의 혼합물이 있다. 전형적인 조합은 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제 및/또는 셀룰라아제와 같은 통상적인 응용가능 효소들과 아밀라아제의 칵테일이다.
효소 안정화제 - 세제에 사용을 위한 효소들을 다양한 방법들로 안정화시킬 수 있다. 본원에 이용되는 효소들은, 완성된 조성물 중에 존재하는 칼슘 및/또는 마그네슘 이온들의 수용성 공급원에 의해 안정화될 수 있는데, 이들은 효소들에 상기 이온들을 제공한다.
촉매 금속 착물 - 본 발명의 세정 조성물은 촉매 금속 착물을 포함할 수 있다. 금속-함유 표백 촉매의 한 가지 유형은 정의된 표백 촉매 활성의 전이 금속 양이온, 예컨대 구리, 철, 티탄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴, 또는 망간 양이온, 표백 촉매 활성이 거의 없거나 없는 보조 금속 양이온, 예컨대 아연 또는 알루미늄 양이온, 및 상기 촉매 및 보조 금속 양이온들에 대하여 정의된 안정도 상수를 가지는 기질 (sequestrate), 특히 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라 (메틸렌포스폰산) 및 이들의 수용성 염을 포함한 촉매 시스템이다. 이러한 촉매들은 미국 특허 제 4,430,243 호에 기술되어 있다.
원할 경우, 본원의 상기 조성물에 대하여 망간 화합물을 촉매로 이용할 수 있다. 이러한 화합물 및 사용 수준은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 5,576,282 호에 개시된 망간-기재 촉매가 있다.
본원에서 유용한 코발트 표백 촉매는 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제 5,597,936 호 및 제 5,595,967 호에 기술되어 있다. 이러한 코발트 촉매는 예를 들어 in 미국 특허 제 5,597,936 호 및 제 5,595,967 호에 교시된 것 등의 공지된 절차들로 용이하게 제조된다.
본원에서 조성물들은 또한 적당하게는 거대 다환 (macropolycyclic) 강성 (rigid) 리간드 - "MRL" 로 약기함 - 의 전이 금속 착물을 포함할 수 있다. 실제적인 문제로서 및 제한이 아닌 것으로서, 본원에서 조성물 및 세정 방법들은 수성 세척 매질 중에 약 1 pphm (part per hundred million, 일억분의 1) 이상의 활성 MRL 화학종을 제공하도록 조절될 수 있으며, 바람직하게는 상기 세척액 중에 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 더욱 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 의 MRL 을 제공할 것이다.
본 전이-금속 표백 촉매 중의 바람직한 전이-금속에는, 망간, 철 및 크롬이 있다. 본원에서 바람직한 MRL 은 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸 등의 가교된 특별한 유형의 초-강성 리간드이다.
적당한 전이 금속 MRL 은 예를 들어 WO 00/332601 및 미국 특허 제 6,225,464 호에 교시된 것 등 공지된 절차들에 의해 용이하게 제조된다.
III) 세정 조성물의 제조 및 사용 방법
본 발명의 세정 조성물은 임의의 적당한 형태로 제형화할 수 있으며, 제형화하는 자에 의해 선택된 임의의 방법으로 제조될 수 있는데, 이의 비제한적인 예는 미국 특허 제 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,516,448 호, 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기술되어 있으며, 이들은 모두 참조로서 본원에 포함된다.
IV) 사용 방법
본원에 기술된 세정 조성물들은 일정 부위, 특히 표면 또는 섬유를 세정하는데 사용될 수 있다. 전형적으로 상기 부위 중 적어도 일부를, 순수 형태 또는 세척액 중 희석된 본 발명의 세정 조성물의 구현예와 접촉시키고, 그 후 상기 부위를 임의로는 세척 및/또는 헹군다. 본 발명의 목적상, 세척에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 스크러빙 (scrubbing) 및 기계적 교반이 있다. 상기 섬유는 보통의 소비자 사용 조건에서 세탁될 수 있는 대부분의 임의의 섬유를 포함할 수 있다. 상기 개시된 세정 조성물은 용액 중 전형적으로 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도로 이용된다. 세척 용매가 물인 경우, 수온은 전형적으로 약 5 ℃ 내지 약 90 ℃ 범위이고, 상기 부위가 섬유를 포함하는 경우, 물 대 섬유 질량비는 전형적으로 약 1:1 내지 약 30:1 이다.
B. 동물 사료
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프로테아제를 식품 또는 동물 사료와 혼합하는 것을 특징으로 하는, 식품 또는 동물 사료의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서는, 상기 프로테아제를 가공 전에 건조 제품으로 첨가하는 반면, 다른 구현예들에서는 가공 전ㆍ후에 액체로 첨가한다. 건조 분말을 사용하는 일부 구현예들에서는, 상기 효소를 도정곡 (milled grain) 등의 건조 담체 상에 액체로서 희석한다. 본 발명의 프로테아제들은 미국 특허 제 5,612,055 호, 미국 특허 제 5,314,692 호 및 미국 특허 제 5,147,642 호 (이들 모두 참조로서 본원에 포함됨) 에 기술된 류 등의 동물 사료 구성요소 및/또는 첨가제로 사용된다.
본 발명에 따른 효소 사료 첨가제는 다수의 방법들에서의 제조에 적당하다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 이는 적절한 활성을 가진 상이한 효소들을 혼합하여 효소 혼합물을 제조함으로써 간단히 제조된다. 일부 구현예들에서는, 이 효소 혼합물을 사료와 직접 혼합하는 반면, 다른 구현예들에서는, 이를 도정(milled) 밀, 옥수수 또는 콩가루 등의 곡물-기재의 담체 물질 상에 충진(impregnation)시킨다. 이들 충진된 담체들이 효소 사료 첨가제로 사용되는 바, 본 발명은 또한 이들을 포괄한다.
일부 대안적인 구현예들에서, 곡물-기재의 담체 (예컨대, 도정 밀 또는 옥수수) 를 적절한 활성을 가진 효소들과 동시에 또는 순차적으로 충진시킨다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 도정 밀 담체에 먼저 자일라나제를 분무하고, 두번째로 프로테아제를, 및 임의로는 β-글루카나아제를 분무한다. 이들 충진된 담체들이 효소 사료 첨가제로 사용되는 바, 본 발명은 또한 이들을 포괄한다. 바람직한 구현예들에서, 이들 충진된 담체들은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한다.
일부 구현예들에서는, 본 발명의 사료 첨가제를 동물 사료와 직접 혼합하는 한편, 대안적인 구현예들에서, 이를 비타민 사료 첨가제, 무기질 사료 첨가제 및/또는 아미노산 사료 첨가제 등의 하나 이상의 다른 사료 첨가제와 혼합시킨다. 결과적으로 생성된 여러 상이한 유형의 구성요소들을 포함한 사료 첨가제를 그 후 적절한 양으로 상기 사료와 혼합시킨다.
일부 바람직한 구현예들에서, 곡물-기재의 담체를 포함하는 본 발명의 사료 첨가제를 정상적으로는 사료 1 킬로그램당 0.01-50 g, 더욱 바람직하게는 0.1-10 g/킬로그램 및 가장 바람직하게는 약 1 g/킬로그램의 양으로 혼합시킨다.
대안적인 구현예들에서, 본 발명의 효소 사료 첨가제는 목적하는 효소(들)를 목적하는 상대적인 양으로 생산하는 재조합 미생물을 구축하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 이는 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 인코딩하는 유전자의 복제수를 증가시키고/증가시키거나 적당하게는 상기 프로테아제(들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 강력한 프로모터를 사용함으로써 성취된다. 또 다른 구현예들에서, 상기 재조합 미생물 균주는, 목적하는 바에 따라 일정한 삭제된 효소 활성 (예컨대, 셀룰라아제, 엔도글루카나아제 등) 을 가진다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명에 의해 제공되는 효소 사료 첨가제는 또한, 이에 제한되는 것은 아니나 하나 이상의 자일라나제, α-아밀라아제, 글루코아밀라아제, 펙티나제, 만난아제, α-갈락토시다제, 피타아제 (phytase) 및/또는 리파아제를 포함하는 다른 효소들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 목적하는 활성을 가진 효소들을 자일라나제 및 프로테아제와 혼합한 후 이들을 곡물-기재의 담체에 충진시키거나 또는 대안적으로는 이러한 효소들을 상기와 같은 곡물-기재의 담체 상에 동시에 또는 순차적으로 충진시킨다. 상기 담체를 그 후 이번에는 곡물-기재의 사료와 혼합하여 최종 사료를 제조한다. 대안적인 구현예들에서는, 상기 효소 사료 첨가제를 개별 효소 활성의 용액으로 제형화한 후, 펠렛 또는 분쇄형태 (mash) 로 예비형성된 사료 물질과 혼합시킨다.
또 다른 구현예들에서, 상기 효소 사료 첨가제를 제 2 의 (즉, 상이한) 사료 또는 동물의 음용수에 편입시킴으로써 동물의 식이에 포함시킨다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 효소 혼합물을 곡물-기재의 사료 자체에 편입시키는 것은 필수적이지 않으나, 이러한 편입은 본 발명의 특히 바람직한 구현예를 형성한다. 사료 첨가제 1 g 당 자일라나제 활성 유닛 (unit) 대 사료 첨가제 1 g 당 프로테아제 활성 유닛의 비는 바람직하게는 1:0.001~1,000, 더욱 바람직하게는 1:0.01~100, 및 가장 바람직하게는 1:0.1~10 이다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 효소 혼합물은 바람직하게는 곡물-기재의 사료의 제조에서 사료 첨가제로 사용된다.
일부 구현예들에서, 상기 곡물-기재의 사료는 밀 또는 옥수수 또는 이들 두 곡물들의 조합물을 25 중량% 이상, 또는 더욱 바람직하게는 35 중량% 이상 포함한다. 상기 사료는 또한 프로테아제 (즉, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제) 를, 상기 사료에 1 kg 당 100 ~ 100,000 유닛의 프로테아제 활성이 포함되는 양으로 프로테아제를 포함하도록 하는 양으로 포함한다.
본 발명에 따라 제공되는 곡물-기재의 사료는, 가금류 (예컨대, 칠면조, 거위, 오리, 닭 등), 가축 (예컨대, 돼지, 양, 소, 염소 등) 및 반려 동물 (예컨대, 말, 개, 고양이, 토끼, 쥐 등) 을 포함하는, 다양한 비-인간 동물용 사료로 사용된다. 상기 사료들은 특히 가금류 및 돼지 및 특히 육계에 적당하다.
C. 섬유 및 가죽 처리
본 발명은 또한 본 발명의 프로테아제들 중 하나 이상을 포함하는, 섬유 처리용 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제는 견사 또는 모직물의 처리에 적당한 조성물의 구성요소이다(예컨대, 미국 RE 특허 제 216,034 호, EP 134,267, 미국 특허 제 4,533,359 호 및 EP 344,259 참조).
또한, 본 발명의 프로테아제들은 피테이트 (phytate) 로부터 인을 분리시키는 것이 요구되는 다양한 용도로 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한 개선된 특성들을 가진 모직물 또는 동물 모발 물질을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 방법들은, 플라즈마 처리 방법 및 Delhey 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 모직물, 모 섬유 또는 동물 모발 물질을 전처리하는 단계; 및 상기 전처리된 모직물 또는 동물 모발 물질을, 상기 특성들을 향상시키는데 효과적인 양의 단백질 분해 효소 (예컨대, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제) 로 처리하는 단계들을 포함한다. 일부 구현예들에서는, 상기 단백질 분해 효소 처리를 플라즈마 처리 이전에 수행하는 반면, 다른 구현예들에서는, 이를 플라즈마 처리 후에 수행한다. 일부 추가적인 구현예들에서, 이는 별개의 단계로 수행되는 반면, 다른 구현예들에서, 이는 모직물 또는 동물 모발 물질의 정련 (scouring) 또는 염색과 조합하여 수행된다. 추가적인 구현예들에서, 하나 이상의 계면활성제 및/또는 하나 이상의 유연제가 상기 효소 처리 단계 동안 존재하는 반면, 다른 구현예들에서, 상기 계면활성제(들) 및/또는 유연제(들)는 모직물 또는 동물 모발 물질이 연화 처리되는 별개의 단계에 편입된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 조성물은 모 섬유를 방축가공하는 방법에 사용된다(예컨대, JP 4-327274 참조). 일부 구현예들에서, 상기 조성물은 상기 모 섬유를 저온 플라즈마 처리하고, 블럭-우레탄 수지, 폴리아미드 에포클로로히드린 수지, 글리옥살산 수지, 에틸렌-요소 수지 또는 아크릴레이트 수지 등의 방축가공 수지로 처리한 후, 및 연화 효과를 수득하기 위하여 중량 감소 단백질 분해 효소로 처리함으로써 모 섬유를 방축가공 처리하는 방법들에 사용된다. 일부 구현예들에서, 상기 플라즈마 처리 단계는 저온 처리, 바람직하게는 코로나 방전 처리 또는 글로우 방전 처리이다.
일부 구현예들에서, 상기 저온 플라즈마 처리는 기체, 바람직하게는 공기, 산소, 질소, 암모니아, 헬륨 또는 아르곤으로 이루어진 군에서 선택되는 기체를 사용하여 수행한다. 통상적으로, 공기가 사용되나, 다른 언급된 기체들 중 임의의 것을 사용하는 것도 유리할 수 있다.
바람직하게는, 상기 저온 플라즈마 처리를, 약 2 초 내지 약 300 초간, 바람직하게는 약 5 초 내지 약 100 초간, 더욱 바람직하게는 약 5 초 내지 약 30 초간 약 0.1 토르 (torr) 내지 5 토르의 압력에서 수행한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 Delhey 방법 등의 방법들과 함께 사용된다(예컨대, DE-A-43 32 692 참조). 이 방법에서는, 모직물을 가용성 볼프람의 존재하에서 과산화수소 수용액 중에 처리한 후, 임의로는 모직물의 축융방지 (anti-felting) 특성을 향상시키기 위해 합성 중합체의 용액 또는 분산액 중에 처리한다. 이 방법에서는, 상기 모직물을, 2 ~ 60% (w/w), 바람직하게는 8 ~ 20% (w/w) 의 촉매 (바람직하게는 Na2 WO4) 의 존재하에서 및 비이온성 습윤제의 존재하에서 과산화수소 수용액 (0.1 ~ 35% (w/w), 바람직하게는 2 ~ 10% (w/w)) 중에 처리한다. 바람직하게는, 상기 처리를 pH 8 ~ 11 및 실온에서 수행한다. 처리 시간은 과산화수소 및 촉매의 농도에 따라 다르나, 바람직하게는 2 분 이하이다. 상기 산화적 처리 후, 상기 모직물을 물로 헹군다. 잔류 과산화수소의 제거 및 임의로는 부가적인 표백을 위해, 상기 모직물을 산성 용액의 환원제 (예컨대, 아황산염, 아인산염 등) 중에 추가로 처리한다.
일부 구현예들에서, 상기 효소 처리 단계를 약 1 분 내지 약 120 분간 수행한다. 이 단계를 바람직하게는 약 20 ℃ 내지 약 60 ℃, 더욱 바람직하게는 약 30 ℃ 내지 약 50 ℃ 의 온도에서 수행한다. 대안적으로는, 상기 모직물을 수성 효소 용액 중에 담그거나 이로 메워 넣은 후, 통상적인 온도 및 압력에서, 전형적으로는 약 30 초 내지 약 3 분간 증열 (steaming) 한다. 일부 바람직한 구현예들에서는, 상기 단백질 분해 효소 처리를 완충액을 포함할 수도 있는 산성 또는 중성 또는 알칼리성 매질 중에서 수행한다.
대안적인 구현예들에서는, 상기 효소 처리 단계를 하나 이상의 통상적인 음이온성, 비이온성 (예컨대, Dobanol; Henkel AG) 또는 양이온성 계면활성제의 존재하에서 수행한다. 유용한 비이온성 계면활성제의 예는 Dobanol (Henkel AG) 이다. 또 다른 구현예들에서는, 상기 모직물 또는 동물 모발 물질을 단백질 분해 효소로의 처리 전에 또는 그와 동시에 초음파 처리한다. 일부 바람직한 구현예들에서는, 상기 초음파 처리를 약 50 ℃ 의 온도에서 약 5 분간 수행한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 효소 처리 단계에서 사용되는 단백질 분해 효소의 양은 모직물 또는 동물 모발 물질의 중량을 기준으로 약 0.2 w/w % 및 약 10 w/w % 이다. 일부 구현예들에서는, 처리 단계의 수를 위하여, 간단히 프로테아제를 염색-, 헹굼- 및/또는 정련조에 첨가함으로써 상기 효소 처리를 모직물 또는 동물 모발 물질의 염색 및/또는 정련 동안에 수행한다. 일부 구현예들에서는, 효소 처리를 플라즈마 처리 후에 수행하나, 다른 구현예들에서는, 상기 두 처리 단계를 반대의 순서로 수행한다.
모직물에 통상적으로 사용되는 유연제는 보통 양이온성 유연제로, 유기 양이온성 유연제 또는 실리콘 기재의 제품들이나, 음이온성 또는 비이온성 유연제들도 또한 유용하다. 유용한 유연제의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 폴리에틸렌 유연제 및 실리콘 유연제 (즉, 디메틸 폴리실록산류 (실리콘 오일)), H-폴리실록산류, 실리콘 엘라스토머류, 아미노기능성 디메틸 폴리실록산류, 아미노기능성 실리콘 엘라스토머류 및 에폭시기능성 디메틸 폴리실록산류 및 유기 양이온성 유연제 (예컨대 알킬 4차 암모늄 유도체) 가 있다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 동물 하이드 (hide) 의 처리용 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 프로테아제들은 WO 03/00865 에 기술된 류 (Insect Biotech Co., 대전시, 대한민국) 등의 동물 하이드 처리용 조성물에 사용된다. 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 프로테아제를 이용하여 하이드 또는 피부를 효소 처리하는 것을 포함하는, 하이드 및/또는 피부를 가죽으로 가공하는 방법을 제공한다(예컨대, WO 96/11285 참조). 추가적인 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함하는, 동물 피부 또는 하이드를 가죽이 되도록 처리하기 위한 조성물을 제공한다.
하이드 및 피부는 통상 염장 또는 건조된 생 (raw) 하이드 또는 피부의 형태로 제혁소 (tannery) 에서 입수한다. 하이드 또는 피부의 가죽으로의 가공은 담금, 탈모 및 효해의 단계를 포함하는 여러 상이한 공정 단계들을 포함한다. 이 단계들은 습식 공정을 구성하며, 빔하우스 (beamhouse) 에서 수행된다. 본 발명의 프로테아제들을 이용하는 효소 처리는 가죽의 가공에 수반된 공정 동안의 임의의 시간에 적용가능하다. 그러나, 프로테아제들은 통상 습식 공정 동안 (즉, 담금, 탈모 및/또는 효해 동안) 이용된다. 따라서, 일부 바람직한 구현예들에서, 하나 이상의 본 발명의 프로테아제들을 이용한 효소 처리를 습식 공정 단계 동안 수행한다.
일부 구현예들에서는, 본 발명의 담금 공정들을 통상적인 담금 조건들 (예컨대, pH 6.0 ~ 11 범위의 pH) 하에서 수행한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 범위는 pH 7.0 ~ 10.0 이다. 대안적인 구현예들에서, 온도가 20 ~ 30 ℃ 범위인 반면, 다른 구현예들에서 이는 바람직하게는 24 ~ 28 ℃ 범위이다. 또 다른 추가적인 구현예들에서, 반응 시간이 2 ~ 24 시간 범위인 반면, 바람직한 범위는 4 ~ 16 시간이다. 추가적인 구현예들에서는, 목적하는 바에 따라 텐사이드 (tenside) 및/또는 방부제가 제공된다.
상기 효해 단계의 제 2 단계는 보통 탈회액 (bate) 자체의 첨가로 시작된다. 일부 구현예들에서, 상기 효소 처리는 효해 동안 일어난다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 효소 처리는 탈회 (deliming) 단계 후에 효해 동안 일어난다. 일부 구현예들에서는, 본 발명의 효해 공정을 통상적인 조건들 (예컨대, pH 6.0 ~ 9.0 범위의 pH) 을 사용하여 수행한다. 일부 바람직한 구현예들에서, 상기 pH 범위는 6.0 내지 8.5 이다. 또 다른 구현예들에서, 상기 온도는 20-30 ℃ 의 범위인 반면, 바람직한 구현예들에서, 상기 온도는 25 ~ 28 ℃ 의 범위이다. 일부 구현예들에서, 반응 시간은 20 ~ 90 분 범위인 반면, 다른 구현예들에서, 이는 40 ~ 80 분 범위이다. 가죽 제조 공정은 당업계의 숙련된 자들에 주지되어 있다(예컨대, WO 94/069429, WO 90/1121189, 미국 특허 제 3,840,433 호, EP 505920, GB 2233665 및 미국 특허 제 3,986,926 호, 이들 모두 참조로서 본원에 포함됨).
또 다른 구현예들에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 탈회액을 제공한다. 탈회액은 빔하우스 공정에서, 특히 가죽의 제조 방법의 효해 단계에서의 사용을 위한 화학적으로 활성인 성분들을 포함한 시약 (agent) 또는 효소-함유 제제이다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 프로테아제 및 적당한 부형제를 포함한 탈회액을 제공한다. 일부 구현예들에서, 시약으로서는, 이에 제한되는 것은 아니나 당업계에 공지되고 사용되는 화학 약품들, 예컨대 희석제, 유화제, 탈회제 (delimer) 및 담체가 있다. 일부 구현예들에서는, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 포함한 탈회액을 당업계에 공지된 바대로 제형화한다(예컨대, GB-A2250289, WO 96/11285 및 EP 0784703).
일부 구현예들에서, 본 발명의 탈회액은 탈회액 1 g 당 0.00005 내지 0.01 g 의 활성 프로테아제를 함유하는 반면, 다른 구현예들에서, 상기 탈회액은 탈회액 1 g 당 0.0002 내지 0.004 g 의 활성 프로테아제를 함유한다.
따라서, 본 발명의 프로테아제들은 다수의 용도 및 환경에서 사용된다.
도 1 은 셀룰로모나다시애 과의 구성원들 및 기타 미크로코시니애 아목의 관련된 속에 대한 신규한 균주 69B4 의 관계를 도시하는 뿌리가 생략된 계통수를 제공한다.
도 2 는 ASP 프로테아제의 계통수를 제공한다.
도 3 은 셀룰로모나스 균주 69B4 에서 유래한 프로테아제의 MALDI TOF 스펙트럼을 제공한다.
도 4 는 C. 플라비게나 (C. flavigena) 로부터의 N-말단의 대부분의 트립신분해 (tryptic) 펩티드의 서열을 도시한다.
도 5 는 pSEGCT 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 6 은 pSEGCT69B4 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 7 은 pSEA469BCT 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 8 은 pHPLT-Asp-C1-1 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 9 는 pHPLT-Asp-C1-2 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 10 은 pHPLT-Asp-C2-1 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 11 은 pHPLT-Asp-C2-2 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 12 는 pHPLT-ASP-III 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 13 은 pHPLT-ASP-IV 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 14 는 pHPLT-ASP-VII 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 15 는 pXX-KpnI 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 16 는 p2JM103-DNNP1 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 17 은 pHPLT 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 18 은 개방 pHPLT-ASP-C1-2 에 대한 지도 및 MXL-프로모터 서열을 제공한다.
도 19 는 pENMx3 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 20 은 pICatH 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 21 은 pTREX4 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 22 는 pSLGAMpR2 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 23 은 pRAXdes2-ASP 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 28 은 pAPDI 벡터의 플라스미드 지도를 제공한다.
도 25 는 ASP 자가융해를 보여주는 그래프를 제공한다. 패널 A 는 LAS 부재의 완충액 중에서 관찰된 ASP 자가융해 펩티드들을 보여주는 그래프를 제공한다. 패널 B 는 0.1% LAS 를 함유한 완충액 중에서 관찰된 ASP 자가융해 펩티드들을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 26 은 북아메리카 세척 조건하에서의 액체 TIDE® 세제 중의 특정 세린 프로테아제들 (69B4 [-x-]; PURAFECT® [-◆-]; RELASETM [-▲-]; 및 OPTIMASETM [-■-]) 의 세정 활성 (405 nm 에서의 흡광도) 정량 (ppm) 반응 곡선들을 비교하는 것이다.
도 27 은 일본의 세척 조건하에서의 세제 조성물 III 분말 세제 (0.66 g/ℓ) 북아메리카 농도/세제 제형물 중의 특정 세린 프로테아제들 (69B4 [-x-]; PURAFECT ® [-◆-]; RELASETM [-▲-]; 및 OPTIMASETM [-■-]) 의 세정 활성 (405 nm 에서의 흡광도) 정량 (ppm) 반응 곡선들을 비교하는 그래프를 제공한다.
도 28 은 유럽의 세척 조건하에서의 ARIEL® REGULAR 세제 분말 중의 특정 세린 프로테아제들 (69B4 [-x-]; PURAFECT® [-◆-]; RELASETM [-▲-]; 및 OPTIMASETM [-■-]) 의 세정 활성 (405 nm 에서의 흡광도) 정량 (ppm) 반응 곡선들을 비교하는 그래프를 제공한다.
도 29 는 일본의 세척 조건하에서의 PURE CLEAN 세제 분말 중의 특정 세린 프로테아제들 (69B4 [-x-]; PURAFECT® [-◆-]; RELASETM [-▲-]; 및 OPTIMASETM [-■-]) 의 세정 활성 (405 nm 에서의 흡광도) 정량 (ppm) 반응 곡선들을 비교하는 그래프를 제공한다.
도 30 은 북아메리카의 세척 조건하에서의 세제 조성물 III 분말 (1.00 g/ℓ) 중의 특정 세린 프로테아제들 (69B4 [-x-]; PURAFECT® [-◆-]; RELASETM [-▲-]; 및 OPTIMASETM [-■-]) 의 세정 활성 (405 nm 에서의 흡광도) 정량 (ppm) 반응 곡선들을 비교하는 그래프를 제공한다.
도 31 은 시간 (분) 에 대한 퍼센트 효소 활성의 척도로서의 다양한 세린 프로테아제들 (100 ppm) 의 pH 9.45, 25 ℃ 에서 0.1 M H2O2 를 이용한 상대적인 산화적 불활성화를 보여주는 그래프를 제공한다(69B4 [-x-]; BPN' 변형체 1 [-◆-]; PURAFECT® [-▲-]; 및 GG36-변형체 1 [-■-]).
도 32 는 시간 (분) 에 대한 퍼센트 효소 활성의 척도로서의 다양한 세린 프로테아제들 (100 ppm) 의 pH 8.20, 45 ℃ 에서 10mM EDTA 를 이용한 상대적인 킬레이트제 불활성화를 보여주는 그래프를 제공한다(69B4 [-x-]; BPN' 변형체 1 [-◆-]; PURAFECT® [-▲-]; 및 GG36-변형체 1 [-■-]).
도 33 은 시간 (분) 에 대한 퍼센트 효소 활성의 척도로서의 다양한 세린 프로테아제들 (100 ppm) 의 pH 8.0, 45 ℃ 에서 50 mM Tris 를 이용한 상대적인 열 불활성화를 보여주는 그래프를 제공한다(69B4 [-x-]; BPN' 변형체 1 [-◆-]; PURAFECT® [-▲-]; 및 GG36-변형체 1 [-■-]).
도 34 는 57 ℃ 내지 62 ℃ 의 온도 구배에 대한, pH 8.60 에서의 특정 세린 프로테아제들 (69B4 [-x-]; BPN'-변형체 [-◆-]; PURAFECT® [-▲-]; 및 GG36-변형체-1 [-■-]) 의 상대적인 열 불활성화를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 35 는 37 ℃ 및 5 내지 12 의 pH 범위에서의, 특정 세린 프로테아제들 (2.5 ppm) (69B4 [-x-]; BPN'-변형체 [-◆-]; PURAFECT® [-▲-]; 및 GG36-변형체 1 [-■-]) 의 효소 활성 (405 nm 에서의 흡광도로 측정된 디-메틸 카제인의 가수분해) 을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 36 은 각각 25°, 35°및 45 ℃ 에서 3 (■), 4 (▨), 5 (▤) 내지 6 (▧) 의 pH 범위에서의, 특정 세린 프로테아제들 (2.5 ppm) (69B4, BPN'-변형체, PURAFECT® 및 GG36-변형체 1) 의 % 잔존 활성 (405 nm 에서의 흡광도로 측정된 디-메틸 카제인의 가수분해) 으로 표시된 효소 안정성을 보여주는 막대 그래프를 제공한다.
도 37 은 각각 25°, 35°및 45 ℃ 에서 3 (-◆-), 4 (--■--), 5 (--▲--) 내지 6 (--X--) 의 pH 범위에서의 % 잔존 활성으로 표시된 BPN'-변형체의 효소 안정성을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 38 은 각각 25°, 35°및 45 ℃ 에서 3 (-◆-), 4 (--■--), 5 (--▲--) 내지 6 (--X--) 의 pH 범위에서의 % 잔존 활성으로 표시된 PURAFECT® TM 프로테아제의 효소 안정성을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 39 는 각각 25°, 35°및 45 ℃ 에서 3 (-◆-), 4 (--■--), 5 (--▲--) 내지 6 (--X--) 의 pH 범위에서의 % 잔존 활성으로 표시된 69B4 프로테아제의 효소 안정성을 보여주는 그래프를 제공한다.
실험
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 상세히 기술되는데, 이들은 어떤 식으로든 청구된 본 발명의 영역을 제한하는 의도는 아니다. 첨부된 도면은 본 발명의 명세 및 상세의 필수 구성 부분으로서 간주되도록 의도되었다. 인용된 모든 참조문헌은, 그 안에 기술된 모든 것이 본원에서 구체적으로 참조로서 포함된다. 하기 실시예는 설명을 위해 제공되나 청구된 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니 다.
하기의 실험 명세에서, 하기 약어들이 적용된다: PI (프로테이나제 저해제), ppm (parts per million, 백만분율); M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); gm (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); ㎖ 및 mL (밀리리터); ㎕ 및 ㎕ (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); U (유닛); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min (분); h 및 hr (시간); ℃ (섭씨 도); QS (quantity sufficient, 적당량); ND (not done, 실시하지 않음); NA (not applicable, 해당 없음); rpm (분당 회전수); H2O (물); dH2O (탈이온수); HCl　(염산); aa (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD　(킬로달톤); cDNA (사본 또는 상보성 DNA); DNA (데옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 삼인산); RNA (리보핵산); MgCl2 (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); w/v (중량 대 부피); v/v (부피 대 부피); g (중력가속도); OD (광학 밀도); 둘베코 인산 완충 용액 (DPBS); SOC (2% 박토-트립톤 (Bacto-Tryptone), 0.5% 박토 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl); 테리픽 브로스 (Terrific Broth) (TB; 12 g/ℓ 박토 트립톤, 24 g/ℓ 글리세롤, 2.31 g/ℓ KH2PO4 및 12.54 g/ℓ K2HPO4); OD280 (280 nm 에서의 광학 밀도); OD600 (600 nm에서의 광학 밀도); A405 (405 nm 에서의 흡광도); Vmax (효소 촉매 반응의 최대 초기 속도); PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동); PBS (인산 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25% TWEEN® 20); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PCR (중합효소 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (도데실 황산 나트륨); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 식염수); SDS (도데실황산나트륨); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-히드로클로라이드); Tricine (N-[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-글리신); CHES (2-(N-시클로-헥실아미노) 에탄-술폰산); TAPS (3-{[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판술폰산); CAPS (3-(시클로-헥실아미노)-프로판-술폰산; DMSO (디메틸 술폭시드); DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨); SA (시나핀산 (s,5-디메톡시-4-히드록시 신남산); TCA (트리클로로아세트산); Glut 및 GSH (환원된 글루타티온); GSSG (산화된 글루타티온); TCEP (트리스[2-카르복시에틸] 포스핀); Ci (Curies, 큐리); mCi (밀리큐리); μCi (마이크로큐리); HPLC (고속 액체 크로마토그래피); RP-HPLC (역상 고속 액체 크로마토그래피); TLC (박막 크로마토그래피); MALDI-TOF (매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화-비행시간형); Ts (토실); Bn (벤질); Ph (페닐); Ms (메실); Et (에틸), Me (메틸); Taq (테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 중합효소); Klenow (DNA 중합효소 I 대 (Klenow) 절편); rpm (분당 회전수); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산); bla (β-락타마제 또는 암피실린-저항성 유전자); HDL (중질 액체 세제, 즉, 세탁 세제); MJ Research (MJ Research, Reno, 네바다주); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, 네덜란드); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, 메사추세츠주); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, 캘리포니아주); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, 뉴저지주); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, 독일); Pall (Pall Corp., East Hills, 뉴욕주); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, 캘리포니아주); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, 텍사스주); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, 캘리포니아주); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, 캐나다); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, 뉴저지주); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingeng, 네덜란드); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, 오하이오주); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, 영국); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, 캘리포니아주); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, 영국); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, 아일랜드); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, 핀란드); Kelco (CP Kelco, Wilmington, 독일); Corning (Corning Life Sciences, Corning, 뉴욕주); NEN (NEN Life Science Products, Boston, 매사추세츠주); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, 노르웨이); Dynal (Dynal, Oslo, 노르웨이); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, 텍사스주); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, 메릴랜드주); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, 뉴욕주); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, 미주 리주); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, 뉴저지주); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, 캘리포니아주); BD Biosciences 및/또는 Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, 캘리포니아주); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, 캘리포니아주); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, 노스캐롤라이나주); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, 오레곤주); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, 펜실배이아주); Difco (Difco Laboratories, Detroit, 미시간주); Mediatech (Mediatech, Herndon, 버지니아주); Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, 캘리포니아주); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, 뉴욕주); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, 뉴저지주); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, 메릴랜드주); Millipore (Millipore, Billerica, 매사추세츠주); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, 캘리포니아주); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, 캘리포니아주); NEB (New England Biolabs, Beverly, 매사추세츠주); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, 미주리주); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, 일리노이주); Takara (Takara Bio Inc., Otsu, 일본); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, 스위스); EM Science (EM Science, Gibbstown, 뉴저지주); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, 캘리포니아주); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, 메인주); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, 버지니아주); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, 노스캐롤라이나주); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, 캘리포니아주); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, 미네소타주); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, 캘리포니아주); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, 뉴욕주); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, 버몬트주); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, 뉴저지주); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, 뉴저지주); SynPep (SynPep, Dublin, 캘리포니아주); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, 뉴저지주); Waters (Waters, Inc., Milford, 매사추세츠주); Matrix Science (Matrix Science, Boston, 매사추세츠주); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, 캘리포니아주); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, 미주리주); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, 독일); BASF (BASF Co., Florham Park, 뉴저지주); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, 유타주); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, 스페인); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, 스위스); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, 네덜란드); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, 미시간주); 및 Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, 워싱톤주).
실시예 1
검정들
하기 실시예들에서는, 단백질 정량, 어플리케이션 기반 테스트 및 안정성 기반 테스트 등의 다양한 검정을 사용하였다. 판독의 용이함을 위하여, 하기 검 정들을 하기와 같이 개시하고 이를 각 실시예에서 참조한다. 본 발명의 전개 동안 수행된 실험 중 임의에서 하기 제시된 프로토콜로부터의 이탈은 실시예들에 표시되어 있다.
하기 실시예들에서 사용된 세제 중 일부는 하기 조성을 가졌다. 조성물 I 및 II 에서, 나머지 (100% 까지) 는 향수/염료 및/또는 물이다. 이들 조성물의 pH 는 조성물 I 에 있어서는 약 5 내지 약 7 이고, 조성물 II 에 있어서는 약 7.5 내지 약 8.5 이었다. 조성물 III 에서, 나머지 (100% 까지) 는 물 및/또는 소량의 향수, 염료, 광택제/SRPI/소듐 카르복시메틸셀룰로오스/광표백제/MgSo4/PVPVI/거품 억제제/고분자량 PEG/점토로 구성되었다.
Figure 112006042880563-PCT00001
조성물 III
C14-C15AS 또는 소듐 탈로우 알킬 황산 3.0
LAS 8.0
C12-C15AE3S 1.0
C12-C15E5 또는 E3 5.0
QAS -
제올라이트 A 11.0
SKS-6 (건조 첨가) 9.0
MA/AA 2.0
AA -
3시트르산나트륨 2H2O -
시트르산 (무수물) 1.5
DTPA -
EDDS 0.5
HEDP 0.2
PB1 -
과탄산염 3.8
NOBS -
NACA OBS 2.0
TAED 2.0
BB1 0.34
BB2 -
무수 탄산나트륨 8.0
황산염 2.0
규산염 -
프로테아제 B -
프로테아제 C -
리파아제 -
아밀라아제 -
셀룰라아제 -
펙틴 리아제 0.001
알도스 산화효소 0.05
PAAC -
A. 96-웰 마이크로티터 플레이트에서의 단백질 함량 측정을 위한 TCA 검정
230 RPM 으로의 진탕 및 가습 통기하면서 33 ℃ 에서 4 일간 배양한 마이크로티터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 이 검정을 시작하엿다. 상기 검정에는 새로운 96-웰 평바닥 플레이트를 사용하였다. 먼저, 100 μL/웰의 0.25 N HCl 을 상기 웰들에 넣었다. 그 후, 50 ㎕ 의 여과된 배양 브로스 (broth) 를 상기 웰들에 첨가하였다. 그 후, "바닥값(blank)" 판독을 수득하기 위해 광산란/405 nm 에서의 흡광도 (플레이트 판독기에서 5 초 혼합 모드 사용) 를 측정하였다.
상기 테스트를 위해, 각 플레이트에 100 μL/웰 15% (w/v) TCA 를 넣고 실온에서 5 내지 30 분간 인큐베이션하였다. 그 후 광산란/405 nm 에서의 흡광도 (플레이트 판독기에서 5 초 혼합 모드 사용) 를 측정하였다.
계산은, TCA 를 이용한 테스트 판독으로부터 바닥값 (즉, TCA 무(無)) 을 감함으로써 이루어졌다. 원할 경우, 공지의 환산지수를 이용하여 TCA 판독값을 클론들의 AAPF 검정으로 보정하여 표준 곡선을 생성시킬 수 있다. 그러나, 상기 TCA 결과들은 50 내지 500 ppm 의 단백질 농도에 대해 선형이고, 따라서 우수한 성능의 변형체들을 선택하기 위하여 효소 성능에 대하여 직접 그래프화할 수 있다.
B. 96-웰 마이크로티터 플레이트에서의 프로테아제들의 suc-AAPF-pNA 검정
이 검정 시스템에서, 사용된 시약 용액은 하기이다:
1. 0.005% TWEEN®-80 (Tris 완충액) 을 함유한 100 mM Tris/HCl, pH 8.6
2. 10 mM CaCl2 및 0.005% TWEEN®-80 (Tris 완충액) 을 함유한 100 mM Tris 완충액, pH 8.6
3. DMSO 중의 160 mM suc-AAPF-pNA (suc-AAPF-pNA 스탁 용액) (Sigma: S-7388)
suc-AAPF-pNA 작업 용액을 제조하기 위하여, 100 ㎖ Tris/Ca 완충액에 1 ㎖ AAPF 스탁 (stock) 을 첨가하고, 10 초 이상 잘 혼합시켰다.
각 웰에 10 ㎕ 의 희석된 프로테아제 용액을 첨가하고, 190 ㎕ 1 ㎎/㎖ AAPF-작업 용액을 (재빨리) 첨가하여 검정을 수행하였다. 용액들을 5 초간 혼합하고, 25 ℃ 에서 MTP 판독기로 410 nm 에서의 흡광도 변화를 판독하였다. 프로테아제 활성은 AU (활성 = δODㆍ분-1.㎖-1) 로 나타내었다.
C. 케라틴 가수분해 검정
이 검정 시스템에서, 사용된 화학 약품 및 시약 용액은 하기와 같다:
케라틴 ICN 902111
세제 세제 조성물 II
1.6 g 의 세제를 1000 ㎖ 물 (pH = 8.2) 에 용해시킨다
10,000 gpg 의 0.6 ㎖의 CaCl2/MgCl2 및 1190 mg HEPES 를 첨
가하여, 경도 및 완충액 강도가 각각 6 gpg 및 5 mM 가 되게
한다. NaOH 를 이용하여 pH 를 8.2 로 조절한다.
피크릴술폰산 (TNBS)
Sigma P-2297 (수 중 5% 용액)
시약 A 45.4 g Na2B4O7.10 H2O (Merck 6308) 및 15 ㎖ 의 4N NaOH 를
함께 용해시켜 최종 부피가 1000 ㎖ 가 되도록 한다(필요시
가열함)
시약 B 35.2 g NaH2PO4.1H2O (Merck 6346) 및 0.6 g Na2SO3 (Merck
6657) 를 함께 용해시켜 최종 부피가 1000 ㎖ 가 되게 한다.
방법:
인큐베이션 전에, 케라틴을 한번에 소량씩 100 ㎛ 체로 걸렀다. 그 후, < 100 ㎛ 의 케라틴 10 g 을 세제 용액 중에서 pH 를 8.2 로 일정하게 조절하면서 실온에서 20 분 이상 교반하였다. 마지막으로, 상기 현탁액을 실온에서 20 분간 원심분리하였다(Sorvall, GSA 로터, 13,000 rpm). 그 후 이 과정을 반복하였다. 마지막으로, 젖은 침강물을 세제 중에 현탁하여 총 부피가 200 ㎖ 가 되게 하고, 현탁액을 피펫팅 (pipetting) 동안 계속 교반하였다. 인큐베이션 전에, 마이크로티터 플레이트 (MTP) 들에 Biohit 다채널 피펫 및 1200 ㎕ 팁 (tip) 으로 웰당 200 ㎕ 기질로 채웠다(200 ㎕ 씩 6 회 투여 및 상기 팁에 케라틴이 침전되는 것을 막기 위하여 가능한 한 신속히 투여). 그 후, 상기 여과된 배양물 10 ㎕ 를 상기 기질 함유 MTP 들에 첨가하였다. 상기 플레이트들을 테이프로 덮고, 인큐베이터에 넣은 후, 350 rpm 에서 20 ℃ 에서 3 시간동안 인큐베이션하였다(Innova 4330 [New Brunswick]). 인큐베이션 후에, 상기 플레이트들을 3000 rpm 에서 3 분간 원심분리하였다(iSigma 6K 15 원심분리기). 약 15 분 후에 상기 인큐베이터에서 첫번째 플레이트를 꺼내어, 시약 A 50 ㎖ 당 1 ㎖ TNBS 용액을 혼합하여 TNBS 시약을 제조하였다.
MTP 들에 웰당 60 ㎕ TNBS 시약을 채웠다. 상기 인큐베이션한 플레이트들로부터, 10 ㎕ 를 TNBS 시약 A 가 있는 MTP 들로 옮겨 넣었다. 상기 플레이트들을 테이프로 덮고, 실온에서 20 분간 벤치 진탕기 (BMG Thermostar) 로 500 rpm 으로 진탕하였다. 마지막으로, 상기 웰들에 200 ㎕ 의 시약 B 를 첨가하고, 진탕기에서 1 분간 혼합한 후, MTP-판독기로 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였 다.
케라틴 가수분해 활성 계산:
수득한 흡광도 값을 바닥값 (효소 부재하의 기질) 에 대하여 보정하였다. 결과적인 흡광도는 가수분해 활성에 대한 척도이다. 각 시료 (변이체) 에 있어서 성능 지수 (performance index) 를 계산하였다. 상기 성능 지수는 동일 단백질 농도의 변이체 (실측치) 와 표준 효소 (이론치) 의 성능을 비교한다. 또한, 상기 이론치는, 표준 효소의 랑뮈에 (Langmuir) 방정식의 매개변수들을 사용하여 계산할 수도 있다. 1 초과의 성능 지수 (PI) (PI>1) 는 (표준 [예컨대, 야생형] 과 비교시) 보다 우수한 변이체를 동정하는 반면, 1 의 PI (PI=1) 는 표준과 동일한 성능의 변이체를 동정하고, 1 미만의 PI (PI<1) 는 성능이 표준보다 좋지 않은 변이체를 동정한다. 따라서, 상기 PI 는 승자 및, 일정 환경하에서 사용하기에 덜 바람직한 변형체들을 동정한다.
D. 프로테아제 성능을 테스트하는 마이크로스와치 (Microswatch) 검정
이들 검정에 사용된 모든 세제는 효소를 함유하지 않았다.
세제 조제물:
1. 유럽의 세제 용액:
Milli-Q 물을 물의 경도 (Ca/Mg=4/1) 가 15 gpg 가 되도록 조절하고, 7.6 g/ℓ ARIEL® Regular 세제를 첨가하고, 상기 세제 용액을 30 분 이상 격렬히 교반하였다. 상기 세제를 검정에 사용하기 전에 0.22 ㎛ 여과기 (예컨대 Nalgene 탑 보틀 (top bottle) 여과기) 로 여과하였다.
2. 일본의 세제 용액
Milli-Q 물을 물의 경도 (Ca/Mg=3/1) 가 3 gpg 가 되도록 조절하고, 0.66 g/ℓ 세제 조성물 III 를 첨가한 후, 상기 세제 용액을 30 분 이상 격렬히 교반하였다. 상기 세제를 검정에 사용하기 전에 0.22 ㎛ 여과기 (예컨대 Nalgene 탑 보틀 여과기) 로 여과하였다.
3. 냉수 액체 세제 (US 조건):
Milli-Q 물을 물의 경도 (Ca/Mg=3/1) 가 6 gpg 가 되도록 조절하고, 1.60 g/ℓ TIDE® LVJ-1 세제를 첨가한 후, 상기 세제 용액을 15 분 이상 격렬히 교반하였다. 5mM Hepes 완충액을 첨가하고, pH 를 8.2 로 조정하였다. 상기 세제를 검정에 사용하기 전에 0.22 ㎛ 여과기 (예컨대 Nalgene 탑 보틀 여과기) 로 여과하였다.
4. 낮은 pH 액체 세제 (US 조건):
Milli-Q 물을 물의 경도 (Ca/Mg=3/1) 가 6 gpg 가 되도록 조절하고, 1.60 g/ℓ 세제 조성물 I 을 첨가하고, 상기 세제 용액을 15 분 이상 격렬히 교반하였다. 1N NaOH 용액을 사용하여 pH 를 6.0 으로 설정하였다. 상기 세제를 검정에 사용하기 전에 0.22 ㎛ 여과기 (예컨대 Nalgene 탑 보틀 여과기) 로 여과하였다.
마이크로스와치:
CFT Vlaardingen 에 1/4" 환형 직경의 마이크로스와치들을 주문하고 배달받았다. 마이크로스와치들을 하기 기술한 고정 방법을 사용하여 예비처리하였다. 단일 마이크로스와치들을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 수직으로 놓아 전체 표면 부분 (즉, 웰의 기부 상의 평면이 아닌) 이 노출되게 하였다.
표백 고정 ("수퍼고정(Superfixed)"):
물 10L 를 함유한 10 L 스테인레스 스틸 비커에서, 유럽의 조건에서 사용된 천 조각 (swatch) 들의 고정 (=수퍼 고정) 을 위해 상기 물을 60 ℃ 가 되도록 가열하였다. 일본의 조건(들) 및 기타 조건들에 대하여, 상기 천 조각들을 실온에서 고정시켰다(=3K). 그 후, 10 ㎖ 의 30% 과산화수소 (1 ㎖/L 의 H2O2, H2O2 의 최종 농도는 300 ppm 임) 를 첨가하였다. 그 후, 100 개의 천 조각들 (10 개/L) 을 상기 용액에 첨가하였다. 이따금씩 교반하고 온도를 모니터하면서 상기 용액을 30 분간 그대로 두었다. 상기 천 조각들을 냉수로 7 ~ 8 회 헹구어 낸 후, 작업대 (bench) 에 두어 건조되게 하였다. 상기 천 조각들의 끝이 말리는 것을 방지하기 위해 타월을 천 조각들의 상부에 두었다. 3K 천 조각들에 있어서는, (물을 가열하지 않고 10 배 양의 과산화수소를 첨가하는 것을 제외하고는) 상기 절차를 반복한다.
대안적인 고정 ("3K" 천 조각 고정):
이 특정 천 조각 고정을 실온에서 실시하였으나, 첨가된 30% H2O2 의 양은 상기 수퍼고정된 천조각 고정보다 10 배 더 많다. 거품 형성 (frothing, 거품발생) 이 자명할 것이며 따라서 이를 고려해서 보다 큰 비커를 사용하는 것이 필요하다. 먼저, 8 리터의 증류수를 10 L 비커에 넣고, 80 ㎖ 의 30% 과산화수소를 첨가한다. 물 및 과산화물을 국자로 잘 혼합한다. 그 후, 40 개의 EMPA 116 천 조각들을 상기 용액에 첨가하기 전에 송풍기 (fan) 내로 펼쳐놓아 균일한 고정이 보장되게 한다. 상기 천 조각들을 상기 용액 중에서 처음 5 분간에는 연속해서, 나머지 25 분간은 이따금씩 하여 30 분간 (상기 국자를 사용하여) 소용돌이치게 저었다. 상기 용액을 따라버리고, 상기 천 조각들을 매회 대략 6 리터의 증류수로 6 회 헹구었다. 상기 천 조각들을 종이 타월의 상부에 두어 건조되게 하였다. 공기-건조된 천 조각들을 배출 압착기 (expulsion press) 상에서 1/4" 환형 금형 (die) 을 사용하여 구멍을 뚫었다. 단일 마이크로스와치를 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 수직으로 두어 전체 표면 부분 (즉 상기 웰의 기부상의 평면이 아닌) 이 노출되게 하였다.
효소 시료:
상기 효소 시료들을 각 지역에 대하여 적절한 농도로 테스트한 후, 10 mM NaCl, 0.005% TWEEN®-80 용액 중에 희석시켰다.
테스트 방법:
인큐베이터를 하기와 같이 목적하는 온도로 설정하였다: 냉수 액체 조건에 대하여는 20 ℃; 낮은 pH 액체 조건에 대하여는 30 ℃; 유럽의 조건에 대하여는 40 ℃; 일본의 및 북아메리카 조건에 대하여는 20 ℃. 상기 전처리된 미리 절단된 천 조각들을, 상기 기술한 바와 같이 96-웰 MTP 의 웰들에 넣었다. 효소 시료들을, 필요할 경우, 10 mM NaCl, 0.005% TWEEN®-80 중에 희석시켜 20x 목적하는 농도가 되게 하였다. 상기 기술한 바와 같이 목적하는 세제 용액을 제조하였다. 그 후, MTP 의 각 웰에 190 ㎕ 의 세제 용액을 첨가하였다. 이 혼합물 에, 각 웰에 10 ㎕ 의 효소 용액을 첨가하였다(총 부피가 200 ㎕/웰). 상기 MTP 를 플레이트 실러 (sealer) 로 밀봉하고, 인큐베이터에 350 rpm 으로 교반하면서 60 분간 두었다. 적절한 조건하에서 인큐베이션 후, 각 웰로부터 100 ㎕ 의 용액을 취하여 새로운 MTP 내에 넣었다. 상기 웰당 100 ㎕ 의 용액을 함유한 MTP 를 MTP 판독기로 405 nm 에서 판독하였다. 바닥값 대조군, 및 효소 부재하의 마이크로스와치 및 세제를 함유한 대조군 또한 포함되었다.
Figure 112006042880563-PCT00002
스탁 #1 = Ca/Mg 3:1
(1.92 M Ca2+ = 282.3 g/ℓ CaCl2 .2H2O; 0.64 M Mg2+ = 30.1 g/ℓ MgCl2.6H2O)
스탁 #2 = Ca/Mg 4:1
(2.05 M Ca2+ = 301.4 g/ℓ CaCl2 .2H2O; 0.51 M Mg2+ = 103.7 g/ℓ MgCl2.6H2O)
BMI 성능의 계산:
수득한 흡광도 값을 바닥값 (효소 부재하에서의 마이크로스와치들의 인큐베이션 후 수득됨) 에 대하여 보정하였다. 결과적인 흡광도는 가수분해 활성에 대한 측정값이었다. 각 시료 (변이체) 에 대하여 성능 지수를 계산하였다. 상기 성능 지수는 동일 단백질 농도의 변이체 (실측치) 및 표준 효소 (이론치) 의 성능을 비교한다. 또한, 표준 효소의 랑뮈에 방정식의 매개변수들을 이용하여 이론치를 계산할 수 있다. 1 초과의 성능 지수 (PI) (PI>1) 는 (표준 [예컨대, 야생형] 과 비교시) 보다 우수한 변이체를 동정하는 반면, 1 의 PI (PI=1) 는 표준과 동일한 성능의 변이체를 동정하고, 1 미만의 PI (PI<1) 는 성능이 표준보다 좋지 않은 변이체를 동정한다. 따라서, 상기 PI 는 승자 및, 일정 환경하에서 사용하기에 덜 바람직한 변형체들을 동정한다.
D. 디메틸카제인 가수분해 검정 (96 웰)
이 검정 시스템에서, 사용된 화학 약품 및 시약 용액은 하기와 같다:
디메틸카제인 (DMC): Sigma C-9801
TWEEN®-80: Sigma P-8074
PIPES 완충액 (산 무(無)): Sigma P-1851; 15.1 g 을 약 960 ㎖ 물에 용해
시킨다; 4N NaOH 으로 pH 를 7.0 로 조절한다:
1 ㎖ 5% TWEEN®-80 을 첨가하고, 부피가 1000
㎖ 이 되게 한다. PIPES 및 TWEEN®-80 의
최종 농도는 각각 50 mM 및 0.005% 이다.
피크릴술폰산 (TNBS): Sigma P-2297 (수 중 5% 용액)
시약 A: 45.4 g Na2B4O7.10 H2O (Merck 6308) 및 15
㎖ 의 4N NaOH 를 함께 용해시켜 최종 부피
가 1000 ㎖ 가 되게 한다(필요시 가열함)
시약 B: 35.2 g NaH2PO4.1H2O (Merck 6346) 및 0.6 g
Na2SO3 (Merck 6657) 를 함께 용해시켜 최종
부피가 1000 ㎖ 가 되게 한다.
방법:
상기 기질을 제조하기 위하여, 4 g DMC 를 400 ㎖ PIPES 완충액 중에 용해시켰다. 여과된 배양 상청액을 PIPES 완충액으로 희석시켰는데; 배양 플레이트 내 대조군의 최종 농도는 20 ppm 이었다. 그 후, 각 희석된 상청액 10 ㎕ 를 MTP 웰들 내의 200 ㎕ 기질에 첨가하였다. 상기 MTP 플레이트를 테이프로 덮고, 수 초간 진탕한 후, 37 ℃ 의 오븐에 교반없이 2 시간동안 두었다.
상기 오븐에서 첫번째 플레이트를 꺼내기 약 15 분 전에, 시약 A 50 ㎖ 당 1 ㎖ TNBS 용액을 혼합하여 TNBS 시약을 제조하였다. MTP 를 웰당 60 ㎕ TNBS 시약으로 채웠다. 인큐베이션한 플레이트를 수 초간 진탕하고, 그 후 10 ㎕ 를 TNBS 시약 A 가 있는 MTP 들로 옮겼다. 상기 플레이트들을 테이프로 덮고 및 실온의 벤치 진탕기 (BMG Thermostar) 에서 500 rpm 으로 20 분간 진탕하였다. 마지막으로, 각 웰에 200 ㎕ 시약 B 를 첨가하고, 진탕기로 1 분간 혼합한 후, MTP-판독기를 이용하여 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.
디메틸카제인 가수분해 활성 계산:
수득한 흡광도 값을 바닥값 (효소 부재하의 기질) 에 대하여 보정하였다. 결과적인 흡광도는 가수분해 활성에 대한 측정치이다. 상기 흡광도 및 측정된 단백질 농도를 나누어 시료의 (임의의) 특이적 활성을 계산하였다.
E. 열안정성 검정
이 검정은 완충된 배양 상청액의 가열 전ㆍ후의 디메틸카제인 가수분해를 기초로 한다. 상기 디메틸카제인 가수분해 검정에서 기술된 바와 동일 화학 약품 및 시약 용액을 사용하였다.
방법:
여과된 배양 상청액을 PIPES 완충액 중에 20 ppm 으로 희석하였다(배양 플레이트 중의 대조군들의 농도를 기준으로 함). 그 후, 각 희석된 상청액 50 ㎕ 씩을 MTP 의 빈 웰들에 넣었다. 상기 MTP 플레이트를 60 ℃ 의 iEMS 인큐베이터/진탕기 HT (Thermo Labsystems) 에서 400 rpm 으로 90 분간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트들을 얼음상에서 5 분간 냉각시켰다. 그 후, 상기 용액 10 ㎕ 를 200 ㎕ 디메틸카제인 기질/웰을 함유한 새로운 MTP 에 첨가하였다. 이 MTP 를 테이프로 덮고, 수 초간 진탕한 후, 37 ℃ 의 오븐에서 교반없이 2 시간동안 두었다. DMC 가수분해 검정에 사용된 것과 동일 검출 방법을 사용하였다.
열안정성 계산:
시료의 잔류 활성은, 모두 바닥값들에 대하여 보정된 최종 흡광도 및 초기 흡광도의 비로 나타내었다.
F. LAS 안정성 검정
0.06% LAS (도데실벤젠술포네이트 소듐) 의 존재하에서 테스트 프로테아제를 인큐베이션한 후 LAS 안정성을 측정하고, AAPF 검정을 사용하여 잔류 활성을 측정하였다.
시약:
도데실벤젠술포네이트, 나트륨염 (=LAS): Sigma D-2525
TWEEN®-80: Sigma P-8074
TRIS 완충액 (산 부재): Sigma T-1378; 6.35 g 을 약 960 ㎖ 물에 용해시키고; pH 는 4N HCl 을 이용하여 8.2 로 조절한다. TRIS 의 최종 농도는 52.5 mM 이다.
LAS 스탁 용액: MQ 물 중의 10.5 % LAS 용액(= 100 ㎖ MQ 당 10.5 g)을 제조함
TRIS 완충액-100 mM / pH 8.6 (100mM Tris/0.005% Tween80)
TRIS-Ca 완충액, pH 8.6 (100mM Tris/10mM CaCl2/0.005% Tween80)
기계 설비:
평바닥 MTP: Costar (#9017)
Biomek FX
ASYS 멀티피펫터 (Multipipettor)
Spectramax MTP 판독기
iEMS 인큐베이터/진탕기
Innova 4330 인큐베이터/진탕기
Biohit 다채널 피펫
BMG Thermostar 진탕기
방법:
52.5 mM Tris 완충액 pH 8.2 중에서 0.063% LAS 용액 10 ㎕ 를 제조하였다. 100 ㎖ (100 mM) TRIS 완충액, pH 8.6 에 1 ㎖ 의 100 ㎎/㎖ AAPF 스탁 용액 (DMSO 중) 을 첨가하여 AAPF 작업 용액을 제조하였다. 상기 상청액을 희석시키기 위하여, 평바닥 플레이트들을 희석 완충액으로 채운 후, 상기 상청액의 분취량을 첨가하고 잘 혼합하였다. 희석 비는 배양 플레이트 중의 ASP-대조군의 농도 (AAPF 활성) 에 좌우된다. 목적하는 단백질 농도는 80 ppm 이었다.
상기 희석된 상청액 10 ㎕ 를 190 ㎕ 0.063% LAS 완충액/웰에 첨가하였다. 상기 MTP 를 테이프로 덮고, 수 초간 진탕한 후, 25 ℃ 의 인큐베이터 (Innova 4230) 에서 200 rpm 교반으로 60 분간 두었다. 인큐베이션 10 분 후에 각 웰 중 10 ㎕ 의 혼합물을 190 ㎕ AAPF 작업 용액을 함유한 새로운 MTP 로 옮겨 초기 활성 (t = 10 분) 을 측정하였다. 이들 용액들을 잘 혼합하고, MTP 판독기를 사용하여 AAPF 활성을 측정하였다 (5 분 내에 20 회 판독 및 25 ℃).
인큐베이션 60 분 후 상기 인큐베이션 플레이트로부터 또 다른 10 ㎕ 의 용액을 취하여 최종 활성 (t = 60 분) 을 측정하였다. 그 후 상기 기술한 바와 같이 AAPF 활성을 측정하였다. 계산은 하기와 같이 수행하였다: % 잔류 활성은 [t-60 값]*100 / [t-10 값] 이었다.
G. 스크램블 에그 가수분해 검정
프로테아제들은 스크램블 에그로부터 불용성 입자들을 방출하는데, 상기 계란은 96-웰 마이크로티터 플레이트들의 웰 내로 베이킹 (baking) 되었다. 상기 스크램블 에그로 코팅된 웰들을 프로테아제 함유 배양물 여과액 및 ADW (자동 식기세척기 세제) 의 혼합물로 처리하여 스크램블 에그 분취물 (removal) 중의 효소 성능을 측정하였다. 탁도 (turbidity) 의 비율이 효소 활성의 척도이다.
재료:
수조
기계식 공기 순환기를 가진 오븐 (Memmert ULE 400)
MTP-홀더 (MTP-holder) 및 알루미늄 덮개 및 바닥이 장치된 0.25 cm 크기의 인큐베이터/진탕기 (Multitron)
Biomek FX 액체-취급 시스템 (Beckman)
마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices Spectramax 340, SOFTmax Pro Software)
Nichiryo 8800 멀티 채널 주사기 디스펜서 (dispenser) + 주사기
마이크로티터 플레이트 테이프
팁을 가진 단일 및 다채널 피펫
A 등급 미디엄 (medium) 계란
CaCl2.2H2O (Merck 102382); MgCl2.6H2O (Merck105833); Na2CO3 (Merck 6392)
ADW 생성물:
LH-분말 (= Light House)
절차:
계란 3 개를 유리 비커 중에서 포크로 교반하고 100 ㎖ 우유 (4 ℃ 또는 실온) 를 첨가하였다. 상기 비커를 85 ℃ 수조에 놓고, 상기 혼합물을 스푼으로 계속 교반하였다. 상기 혼합물이 진해지면, 비커의 벽 및 바닥으로부터 조심스럽게 고형화 물질을 계속적으로 긁어내었다. 상기 혼합물이 약간 흐르는 정도일 때(약 25 분 후) 상기 비커를 상기 수조로부터 꺼내었다. 상기 혼합물에 또 다른 40 ㎖ 우유를 첨가하고, 핸드 믹서기 또는 블렌더로 2 분간 블렌딩하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시켰다(얼음조 사용가능). 그 후 상기 기질을 부가적인 5 내지 15% 의 양의 물 (보통 7.5%) 과 함께 교반하였다.
테스트 방법:
먼저, 50㎕ 의 스크램블 에그 기질을 MTP 의 각 웰에 넣었다. 상기 플레이트들을 실온에서 하룻밤동안 (약 17 시간) 건조되게 한 후, 80 ℃의 오븐에 2 시간동안 베이킹 하고, 실온으로 냉각시켰다.
2.85 g 의 LH-분말을 1L 물에 용해시켜 ADW 생성물 용액을 제조하였다. 단지 약 15 분의 용해 시간이 필요하였으며, 용액의 여과는 필요하지 않았다. 그 후, 1.16 ㎖ 인공 경도 용액을 첨가하고, 2120 mg Na2CO3 을 상기 용액 중에 용해시켰다.
188.57g CaCl2.2H2O 및 86.92g MgCl2.6H2O 를 1L 순수 (demi water) 중에서 혼합하여 경도 용액을 제조하였다(1.28 M Ca + 0.43 M Mg 와 같으며 전체적으로 10000 gpg 임). 상기 언급한 양의 ADW, CaCl2 및 MgCl2 는, 190 ㎕ ADW 용액에 10 ㎕ 상청액을 첨가함으로 인해 이미 비례적으로 증가한 값이었다 (200/190x).
상기 기질 플레이트의 각 웰에 ADW 용액 (190 ㎕) 을 첨가하였다. 각 웰에 10 ㎕ 의 상청액을 첨가하고 상기 플레이트를 테이프로 밀봉하여 MTP 를 처리하였다. 상기 플레이트를 예비-가온된 인큐베이터/진탕기에 두고, 금속 덮개 및 클램프로 안전하게 하였다. 그 후 상기 플레이트를 적절한 온도 (미국에서는 50 ℃) 에서 700 rpm 으로 30 분간 세척하였다. 상기 플레이트를 상기 인큐베이터/진탕기에서 꺼내었다. 상기 액체를 온건하게 위ㆍ아래로 움직이면서, 약 125 ㎕ 의 따뜻한 상청액을 비어있는 평바닥 플레이트로 옮겼다. 냉각시킨 후, 상기 분산액의 정확히 100 ㎕ 을 비어있는 평바닥 플레이트의 웰들에 넣었다. 마이크로티터 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.
스크램블 에그 가수분해 활성의 계산:
수득한 흡광도 값을 바닥값 (효소 부재하의 기질) 에 대하여 보정하였다. 결과적인 흡광도는 가수분해 활성에 대한 척도이다. 각 시료 (변이체) 에 있어서 성능 지수를 계산하였다. 상기 성능 지수는 동일 단백질 농도의 변이체 (실측치) 와 표준 효소 (이론치) 의 성능을 비교한다. 또한, 상기 이론치는, 표준 효소의 랑뮈에 방정식의 매개변수들을 사용하여 산출할 수도 있다. 1 초과의 성능 지수 (PI) (PI>1) 는 (표준 [예컨대, 야생형] 과 비교시) 보다 우수한 변이체를 동정하는 반면, 1 의 PI (PI=1) 는 표준과 동일한 성능의 변이체를 동정하고, 1 미만의 PI (PI<1) 는 성능이 표준보다 좋지 않은 변이체를 동정한다. 따라서, 상기 PI 는 승자 및, 일정 환경하에서 사용하기에 덜 바람직한 변형체들을 동정한다.
실시예 2
그람-양성 호알칼리성 세균 69B4 로부터의 69B4 프로테아제 생산
이 실시예는 본 발명에 의해 제공되는 신규한 프로테아제 69B4 를 초기에 단리시키는데 사용되는 셀룰로모나스 균주 69B4 에 대한 설명을 제공한다. 상기 호알칼리성 미생물 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 는 알칼리성 카제인 함유 배지 (gL-1) 상에서 37 ℃ 에서 단리되었다(예컨대, Duckworth 등, FEMS Microbiol. Ecol., 19:181-191 [1996] 참조).
글루코오스 (Merck 1.08342) 10
펩톤 (Difco 0118) 5
효모 추출물 (Difco 0127) 5
K2HPO4 1
MgSO4.7H2O 0.2
NaCl 40
Na2CO3 10
카제인 20
한천 20
부가적인 알칼리성 배양 배지 (Grant Alkaliphile Medium) 을 또한 사용하여 셀룰로모나스 균주 69B4 를 배양하였는데, 하기 제시된 바와 같다:
GAM ("Grant Alkaliphile Medium") 용액 A (g L-1)
글루코오스 (Merck 1.08342) 10
펩톤 (Difco 0118) 5
효모 추출물 (Difco 0127) 5
K2HPO4 1
MgSO4.7H2O 0.2
800 ㎖ 증류수에 용해시키고, 고압멸균법 (autoclaving) 으로 멸균함
GAM 용액 B (g L1)
NaCl 40
Na2CO3 10
200 ㎖ 증류수에 용해시키고 및 고압멸균법으로 멸균함.
용액 A (800 ㎖) 를 용액 B (200 ㎖) 와 혼합하여 완전한 GAM 배지을 제조하였다. 한천 (2% w/v) 을 첨가하여 고체 배지을 제조하였다.
배양 조건
새로 해동시킨 배양물 (냉동 글리세롤 (20% v/v, -80 ℃ 에서 저장된 스탁) 로서 저장) 의 글리세롤 바이알 (vial) 로부터, 접종 루프를 사용하여 미생물을 한천 플레이트 내 상기 기술한 GAM (Grant Alkaliphile Medium) 상에 접종시키고, 37 ℃ 에서 2 일 이상 배양하였다. 그 후 1 개의 콜로니를 사용하여 pH 10 의 GAM 100 ㎖ 를 함유한 500 ㎖ 진탕 플라스크에 접종시켰다. 이 플라스크를 그 후, (시각적 관찰에 따른) 양호한 증식이 수득될 때까지 회전 진탕기에서 280 rpm 으로 1 ~ 2 일간 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 그 후, 브로스 배양물 100 ㎖ 을 이어서 사용하여 5 리터의 GAM 을 함유한 7 L 발효조에 접종하였다. 최대 생산량의 프로테아제를 수득하기 위하여 상기 발효를 37 ℃ 에서 2 ~ 3 일간 진행시켰다. 약 500 rpm 으로 회전하는 임펠러 (impeller) 의 영역 내로 5 L/분의 속도로 공기를 주입하여 전체적으로 충분한 호기성 조건을 유지시켰다. 시작시에 pH 를 pH 10 으로 설정하였으나, 발효 동안 조절하지 않았다.
69B4 조 효소 시료 제조
상기 발효조로부터 배양 브로스를 수집하고, 10 ℃ 에서 5000 x g 로 30 분간 원심분리하여 세포들을 제거하였다. 결과로서 생성된 상청액을 Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems) 상에서 심층 여과로 정화시켰다. 결과적인 무균 배양 상청액을, 차단 (cut-off) 크기가 10kDa 인 한외 여과 카세트 (Pall Omega 10kDa Minisette; Pall) 를 사용한 한외 여과로 추가로 대략 10 배 농축하였다. 생성된 농축 조 69B4 시료를 냉동시키고, 이후의 사용시까지 -20 ℃ 에서 보관하였다.
정제
8K 분획분자량 (Molecular Weight Cut Off, MWCO) Spectra-Por7 (스펙트럼) 반투막 (dialysis tubing) 을 사용하여, 세포-분리된 배양 브로스를 20mM (2-(4-모르폴리노)-에탄 술폰산("MES"), pH 5.4, 1mM CaCl2 에 대하여 투석하였다. 상기 투석은 하룻밤 또는 상기 시료의 전도율이 MES 완충액의 전도율과 같거나 또는 그보다 낮을 때까지 수행되었다. 10x100mm (7.845 ㎖) POROS High Density Sulfo-propyl (HS) 20 (20 미크론) 양이온-교환 컬럼 (PerSeptive Biosystems) 을 가진 BioCad VISION (Applied Biosystems) 을 이용하여 상기 투석된 효소 시료를 정제하였다. 미리 평형으로 한 컬럼 상에 상기 효소를 5mL/분으로 로딩 (loading) 한 후, 상기 컬럼을, 25 개 컬럼 용량 중의 25mM MES, pH 6.2, 1mM CaCl2 내지 25mM (N-[2-히드록시에틸] 피페라진-N'-[2-에탄] 술폰산 [C8H18N2O4S, CAS # 7365-45-9]) ("HEPES") pH 8.0, 1mM CaCl2 의 pH 구배로 40 ㎖/분으로 세척하였다. 상기 진행동안 분획 (8 ㎖) 들을 수집하였다. 5 개 컬럼 용량에 대해 pH 8.0 세척 단계를 유지하고, 그 후 구배 (35 개 컬럼 용량 내 동일 완충액 중의 0 ~ 100 mM NaCl) 를 이용하여 상기 효소를 용출시켰다. pNA 검정 (sAAPF-pNA 검정; DelMar, 등, 상기 참조) 을 사용하여 분획들 중의 프로테아제 활성을 모니터하였다. 40mM NaCl 에서 용출된 프로테아제 활성을 농축시키고, 20mM MES, pH 5.8, 1mM CaCl2 내로 완충액 교환하였다(5K MWCO VIVA Science 20mL 농축기 이용). 이 물질을 상기 효소를 추가적으로 특징화하는데 사용하였다.
실시예 3
세린 프로테아제 유전자 절편의 PCR 증폭
이 실시예에서는, 세린 프로테아제 유전자 절편의 PCR 증폭을 기술한다.
축퇴성 프라이머 설계
공개된 세린 프로테아제 아미노산 서열들의 정렬에 기초하여, 보존된 구조 영역 및 촉매 영역에 대하여 일련의 축퇴성 프라이머들을 설계하였다. 이러한 영역에는, 세린 프로테아제들 중에 고도로 보존된 것들, 뿐 아니라 효소 구조 및 기능에 중요한 것으로 공지된 것들이 포함되었다.
본 발명의 전개 동안, 하기 나타낸 바와 같이 9 개의 공개된 세린 프로테아제들 (스트렙토그리신 C 동족체들) 의 단백질 서열들을 정렬시켰다. 상기 서열들은 하기였다: 스트렙토마이세스 그리세우스 스트렙토그리신 C (등록번호: P52320); 테르모비피다 푸스카로부터의 알칼리성 세린 프로테아제 전구체 (등록번호: AAC23545); 스트렙토마이세스로부터의 알칼리성 프로테이나제 (EC 3.4.21.-) (등록번호: PC2053); 스트렙토마이세스로부터의 알칼리성 세린 프로테이나제 I (등록번호: S34672); 스트렙토마이세스 리비단스로부터의 세린 프로테아제 (등록번호: CAD4208); 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 A3(2)로부터의 추정상의 세린 프로테아제 (등록번호: NP_625129); 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 MA-4680로부터의 추정상의 세린 프로테아제 (등록번호: NP_822175); 스트렙토마이세스 리비단스로부터의 세린 프로테아제 (등록번호: CAD42809); 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 A3(2) 로부터의 추정상의 세린 프로테아제 전구체 (등록번호: NP_628830). 이들 서열들 모두 GenBank 로부터 공개적으로 입수가능하다. 이들 정렬들은 하기에 제시되어 있다. 이 정렬에서, 2 개의 보존된 박스들이 밑줄 쳐 있으며, 볼드체로 나타나 있다.
Figure 112006042880563-PCT00003
Figure 112006042880563-PCT00004
Figure 112006042880563-PCT00005
Figure 112006042880563-PCT00006
2 개의 특정 영역을 선택하여 상기 기준을 충족시키고, 이들 아미노산 영역들을 기초로 순방향 및 역방향 프라이머를 설계하였다. 상기 프라이머들을 설계하기 위해 사용된 특이적 아미노산 영역들은 바로 위의 정렬 내에 나타낸 서열들에서 검은색으로 두드러지게 표시되어 있다. 코돈 사용용 유전 코드를 사용하여, MWG-Biotech 에 의해 축퇴성 뉴클레오티드 PCR 프라이머들이 합성되었다. 생성된 축퇴성 프라이머 서열은 하기이다:
순방향 프라이머 TTGWXCGT_FW: 5' ACNACSGGSTGGCRGTGCGGCAC 3' (서열번호: 10)
역방향 프라이머 GDSGGX_RV: 5' ANGNGCCGCCGGAGTCNCC-3' (서열번호: 11)
모든 프라이머들이 5'-3' 방향으로 합성되었고, 혼합 염기 부위용 표준 IUB 코드가 사용되었다(예컨대, A/C/T/G 에 대하여 "N" 을 표기). 축퇴성 프라이머들인 TTGWXCGT_FW 및 GDSGGX_RV 는, 하기 기술된 바와 같이, PCR 에 의해 셀룰로모나스 속 단리체 69B4 로부터 177 bp 영역을 성공적으로 증폭시켰다.
세린 프로테아제 유전자 절편의 PCR 증폭
상기 기술한 프라이머들을 사용하는 추정상의 세린 프로테아제 유전자 절편의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 셀룰로모나스 속 단리체 69B4 게놈 DNA 를 사용하였다. High Fidelity 플래티넘 Taq 중합효소 (카탈로그 번호: 11304-102; Invitrogen) 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 조건들은 개별 실험들마다 다르게 결정되었으나, 전형적으로는 열 순환기 (thermal cycler, MJ Research) 로 30 회 가동하였다. 1% 아가로스 TBE 겔 상에서의 PCR 반응물의 전기영동으로 증폭이 성공적인 것을 확인하였다. Qiaquick 스핀 겔 추출 키트 (카탈로그 28704; Qiagen) 를 제조자의 지시에 따라 사용하여, 상기 프라이머 TTGWXCGT_FW 및 GDSGGX_RV 를 이용하여 셀룰로모나스 속 69B4 로부터 증폭한 PCR 산물을 겔 추출로 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 시판되는 pCR2.1TOPO 벡터 시스템 (Invitrogen) 내로 제조자의 지시에 따라 클로닝하고, 적격 대장균 TOP10 세포들 내로 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드들을 포함한 콜로니들을 청색/백색 선별을 사용하여 가시화하였다. 재조합 형질전환체들에 대한 신속한 스크리닝을 위하여, 추정상의 양성 (즉, 백색) 콜로니의 배양물로부터 플라스미드 DNA 를 제조하였다. Qiagen 플라스미드 정제 키트를 사용하여 DNA 를 단리시키고, Baseclear 로 서열분석하였다. 클론들 중 하나는, 다양한 스트렙토마이세스 종들의 여러 스트렙토그리신-유사 프로테아제 유전자들 및 또한 기타 세균 종들로부터의 세린 프로테아제 유전자들과 일부 상동성을 나타낸 177 bp 의 DNA 삽입체를 포함하였다. 이 177 bp 절편의 DNA 및 단백질 코딩 서열은 도 13 에 제시되어 있다.
서열 분석
상기 서열들을 BLAST 및 기타 단백질 번역 서열 툴로 분석하였다. 뉴클레오티드 수준에서의 BLAST 비교는 공개된 세린 프로테아제 서열들에 대한 다양한 수준의 동일성을 나타내었다. 초기에, 뉴클레오티드 서열들을 BLAST (Basic BLAST 버전 2.0) 에 제공하였다. 선택된 프로그램은 "BlastX" 였고, 선택된 데이터베이스는 "nr" 이었다. 표준/디폴트 매개변수 값들을 이용하였다. 추정상의 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 유전자 절편에 대한 서열 자료를 FASTA 포맷에 입력하고, 문의 서열을 BLAST 에 제시하여 본 발명의 서열들을 상기 데이터베이스의 기존의 것들과 비교하였다. 결과는, 상기 177 bp 절편에 있어서, S. 그리세우스, S. 리비단스, S. 코엘리콜로르, S. 알보그리세올루스 (S. albogriseolus), S. 플라텐시스 (S. platensis), S. 프라디애 (S. fradiae) 및 스트렙토마이세스를 포함하는 다양한 스트렙토마이세스 종들로부터의 프로테아제 유전자들에 대하여 많은 수의 명중으로 나타났다. 셀룰로모나스 속 단리체 69B4 로부터 클로닝된 177 bp 절편에 대한 추가적인 분석이 요구되는 것으로 결론지어 졌다.
실시예 4
세린 프로테아제를 인코딩하는 셀룰로모나스 69B4 의 게놈으로부터의 역 (inverse) PCR 에 의한 폴리뉴클레오티드 서열 단리
이 실시예에서는, 셀룰로모나스 속 69B4 에 의해 생산되는 세린 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하기 위하여 수행된 실험들이 기술된다.
셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제를 인코딩하는 유전자를 단리하기 위한 셀룰로모나스 속 69B4 게놈 DNA 에 대한 역 PCR
역 PCR 을 사용하여 셀룰로모나스 속 69B4 로부터의 전체-길이 세린 프로테아제 유전자를 단리하고 클로닝하였다. 실시예 3 에 기술된 셀룰로모나스 프로테아제 유전자의 177 bp 절편의 DNA 서열을 기초로, 신규한 DNA 프라이머들을 설계하였다:
69B4int_RV1 5'-CGGGGTAGGTGACCGAGGAGTTGAGCGCAGTG-3' (서열번호: 14)
69B4int_FW2 5'-GCTCGCCGGCAACCAGGCCCAGGGCGTCACGTC-3' (서열번호: 15)
셀룰로모나스 속 69B4 의 염색체 DNA 를 하기 제한효소들 ApaI, BamHI, BssHII, KpnI, NarI, NcoI, NheI, PvuI, SalI 또는 SstII 을 이용하여 절단하고, Qiagen PCR 정제 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호: 28106) 를 사용하여 정제한 후, 제조자의 지시에 따라 T4 DNA 리가아제 (Invitrogen) 로 자가-결찰시켰다. 결찰 혼합물들을 Qiagen PCR 정제 키트로 정제시킨 후, 프라이머 69B4int_RV1 및 69B4int_FW2 로 PCR 을 수행하였다. NcoI 로 절단 후 자가-결찰시킨 DNA 절편에 대한 PCR 의 결과, 대략 1.3 kb 의 PCR 산물이 생성되었다. DNA 서열 분석 (BaseClear) 결과, 이 DNA 절편이 셀룰로모나스로부터의 스트렙토그리신-유사 프로테아제 유전자의 주요 부분을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 이 프로테아제를 "69B4 프로테아제"로 표기하고, 셀룰로모나스 69B4 프로테아제를 인코딩하는 유전자를 "asp 유전자"로 표기하였다. 프라이머 69B40int_FW2 및 또 다른 프라이머: 69B4-for4 (5' AAC GGC GGG TTC ATC ACC GCC GGC CAC TGC GGC C 3' {서열번호: 16}) 를 사용한 추가적인 역 PCR 반응으로 상기 asp 유전자의 전체 서열을 유도하였다. NcoI, BssHII, ApaI 및 PvuI-절단 및 자가-결찰된 셀룰로모나스 속 69B4 의 게놈 DNA 의 DNA 절편에 대한 이들 프라이머를 이용한 역 PCR 의 결과, 상기 asp 유전자에 대한 전체 서열이 동정되었다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열
편의상, 다양한 서열들을 하기에 포함시킨다. 먼저, 하기 제시된 asp 유전자 (서열번호: 1) 의 DNA 서열은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 신호 펩티드 (서열번호: 9) 및 전구체 세린 프로테아제 (서열번호: 7) 를 인코딩한다. 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제의 신호 펩티드를 인코딩하는 개시 폴리뉴클레오티드는 볼드체로 되어 있다(ATG).
Figure 112006042880563-PCT00007
Figure 112006042880563-PCT00008
Figure 112006042880563-PCT00009
하기 DNA 서열 (서열번호: 2) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 전구체 프로테아제 (서열번호: 7) 에 작동적으로 연결된 신호 펩티드 (서열번호: 9) 를 인코딩한다. 셀룰로모나스 균주 69B4 프로테아제의 신호 펩티드를 인코딩하는 개시 폴리뉴클레오티드는 볼드체로 되어 있다(ATG). 별표는 잔기 1486 으로 시작하는 종결 코돈 (TGA) 을 표시한다. 잔기 85, 595 및 1162 는 각각 N 말단 전구서열, 성숙 서열 및 카르복실 말단 전구서열의 초기 잔기들에 관련된 것이며, 볼드체 및 밑줄로 되어 있다.
Figure 112006042880563-PCT00010
Figure 112006042880563-PCT00011
Figure 112006042880563-PCT00012
하기 DNA 서열 (서열번호: 3) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 전구체 프로테아제를 인코딩한다.
Figure 112006042880563-PCT00013
Figure 112006042880563-PCT00014
하기 DNA 서열 (서열번호: 4) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 성숙한 프로테아제를 인코딩한다.
Figure 112006042880563-PCT00015
하기 DNA 서열 (서열번호: 5) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 신호 펩티드를 인코딩한다.
Figure 112006042880563-PCT00016
하기 서열은 서열번호: 1, 2, 3 및 4 에 개시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 신호 서열 [단편 1a ~ c] (잔기 1 ~ 28 [-198 내지 -171]), N-말단 전구서열 [단편 2a ~ r] (잔기 29 ~ 198 [-170 내지 -1]), 성숙한 프로테아제 [단편 3a ~ t] (잔기 199 ~ 387 [1 ~ 189]) 및 C-말단 전구서열 [단편 4a ~ l] (잔기 388 ~ 495 [190 ~ 398]) 을 포함하는, 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 신호 서열 및 전구체 프로테아제의 아미노산 서열 (서열번호: 6) 이다. 성숙한 프로테아제 아미노산 서열의 N-말단 서열은 볼드체로 되어 있다.
Figure 112006042880563-PCT00017
하기 서열 (서열번호: 7) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 전구체 프로테아제의 아미노산 서열이다(서열번호: 7).
Figure 112006042880563-PCT00018
하기 서열 (서열번호: 8) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 성숙한 프로테아제의 아미노산 서열이다. 3 작용기 촉매 잔기들인 H32, D56 및 S132 는 볼드체 및 밑줄로 되어 있다.
Figure 112006042880563-PCT00019
하기 서열 (서열번호: 9) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 (DSM 16035) 에서 유래한 프로테아제의 신호 펩티드의 아미노산 서열이다.
1 MTPRTVTRAL AVATAAATLL AGGMAAQA (서열번호: 9)
하기 서열 (서열번호: 10) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 의 프로테아제의 177 bp 절편을 동정하기 위해 사용된 축퇴성 프라이머이다.
TTGWXCGT_FW: 5' ACNACSGGSTGGCRGTGCGGCAC 3' (서열번호: 10)
하기 서열 (서열번호: 11) 은 셀룰로모나스 균주 69B4 에서 유래한 프로테아제의 177 bp 절편을 동정하기 위해 사용된 역방향 프라이머이다.
GDSGGX_RV: 5' ANGNGCCGCCGGAGTCNCC-3' (서열번호: 11)
하기 DNA (서열번호: 13) 는 셀룰로모나스 균주 69B4 에서 유래한 프로테아제 유전자의 일부를 인코딩하는 177 bp 절편 (서열번호: 12) 의 아미노산 서열이다. 상기 축퇴성 프라이머 (서열번호: 10 및 11) 의 서열들은 밑줄 및 볼드체로 되어 있다.
Figure 112006042880563-PCT00020
셀룰로모나스 속 69B4 프로테아제의 서열에 대한 분석
1:1 v/v 아세토니트릴("ACN")/0.1% 포름산 용액 중의 포화 시나핀산 (3,5-디메톡시-4-히드록시 신남산)("SA") 용액을 제조하였다. 결과적인 혼합물을 60 초간 볼텍싱 (vortexing) 한 후, 14,000 rpm 에서 20 초간 원심분리하였다. 그 후, 5 ㎕ 의 매트릭스 상청액을 0.5 ㎖ 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브로 옮기고, 10 pmole/㎕ 프로테아제 69B4 시료 1 ㎕ 를 상기 SA 매트릭스 상청액에 첨가하고, 5 초간 볼텍싱하였다. 그 후, 분석물/매트릭스 용액 1 ㎕ 를 시료 플레이트로 옮기고, 완전히 건조시킨 후에, 하기로 설정된 Voyager DE-STR (PerSeptive), 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화-비행시간형 (MALDI-TOF) 질량 분광광도계로 분석하였다: 작동 모드: 선형; 추출 모드: 지연형; 극성: 양성; 가속 전압: 25000 V; 추출 지연 시간: 350 nsec; 수득 질량 범위: 4000 ~ 20000 Da; 레이저 발사 수: 100/스펙트럼; 및 레이저 강도: 2351. 결과적으로 생성된 스펙트럼은 도 4 에 제시되어 있다.
본원에 기술된 바와 같이 변형된 당업계에 공지된 방법 (Christianson 등, Anal. Biochem. 223:119-29 [1994]) 을 사용하여, 트립신 지도 (tryptic map) 를 작성하였다. 10 ~ 50 ㎍ 의 프로테아제를 함유한 프로테아제 용액을 1.5 ㎖ 마이크로튜브 내에서 냉각수로 1:1 희석하였다. 1.0 N HCl 을 첨가하여 최종 농도 0.1 N HCl 이 되게 하고, 철저히 혼합한 후, 얼음 상에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 50% 트리클로로-아세트산 ("TCA") 를 첨가하여 최종 농도 10% TCA 로 되게 하고, 혼합하였다. 상기 시료를 얼음 상에서 10 분간 인큐베이션하고, 2 분간 원심분리한 후, 상청액을 따라내었다. 그 후, 차가운 90% 아세톤 1 ㎖ 를 첨가하여 펠렛을 재현탁하였다. 결과적인 시료를 그 후 1 분간 원심분리하고, 상청액을 재빨리 따라내고, 잔류 액체를 진공 흡입으로 제거하였다. 건조 펠렛을 0.65 ㎖ 의 중탄산암모늄 용액 (중탄산염의 최종 농도: 0.5 M) 중의 8.0 M 요소 용액 (480 mg 요소 [Roche, 카탈로그 번호: 1685899]) 12 ㎕ 에 용해시키고 37 ℃ 에서 3 ~ 5 분간 인큐베이션하였다. 상기 용액을 48 ㎕ 의 n-옥틸-베타-D-글루코피라노시드 용액 ("o-물") (200 ㎖ 의 물 중의 200 mg 의 n-옥틸-베타-D-글루코피라노시드 [C14H28O6, f.w. 292.4]) 으로 천천히 희석시켰다. 그 후, 2.0 ㎕ 의 트립신 (1mM HCl 중의 2.5 ㎎/㎖) 을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에서 15 분간 인큐베이션하였다. 10% 트리플루오로아세트산 ("TFA") 6 ㎕ 으로 상기 단백질 분해 반응을 중지시켰다. 1 분간 원심분리하여 상기 시료로부터 불용성 물질 및 거품을 제거하였다. 2.1 X 150 mm C-18 컬럼 (입도 5 ㎕, 공경 300 옹스트롬) 상에서 RP-HPLC 로 상기 트립신 소화물을 분리하였다. 수 중의 0.1% (v/v) TFA 및 아세토니트릴 중의 0.08% (v/v) TFA 로부터 0.2 ㎖-분의 유속으로 용리 구배를 형성하였다. 컬럼 구획을 50 ℃ 가 되도록 가열하였다. 215 nm 에서 펩티드 용출을 모니터하고, 215 nm 및 280 nm 에서 자료를 수집하였다. 그 후, Surveyor HPLC 를 가진 LCQ Advantage 질량 분석기 (둘 다 Thermo Finnigan 사 제조) 로 시료들을 분석하였다. 상기 LCQ 질량 분석기를 하기의 설정으로 가동시켰다: 분무 전압: 4.5kV; 모세관 온도: 225 ℃. TurboSEQUEST 및 Xcalibur (ThermoFinnigan) 를 이용하여 자료 처리를 수행하였다. 또한 Argo BioAnalytica 에 의해 트립신 소화물 부분들의 서열분석을 일부 수행하였다.
asp 유전자의 전체 서열에 대한 분석의 결과, 상기 유전자가 495 개 아미노산의 전구서열 프로테아제를 인코딩하는 것으로 드러났다(서열번호: 6). 첫번째 28 개 아미노산들은 신호 펩티드를 형성하는 것으로 예측되었다. 셀룰로모나스 균주 69B4 에 의해 생산되는 69B4 프로테아제의 성숙 사슬의 질량은 분자량이 18764 이다(MALDI-TOF 로 측정). 상기 성숙 사슬의 N-말단 서열 또한 MALDI-TOF 분석으로 측정하였는데, 이는 하기 서열 FDVIGGNAYTIGGR (서열번호: 17) 로 시작한다. 상기 69B4 프로테아제는, 기타 일부 효소들에서 일어나는 것으로 알려져 있는 바(예컨대, T. 아쿠아티쿠스 아쿠알리신(aqualysin) I; 예컨대, Lee 등, FEMS Microbiol. Lett., 1:69-74 [1994]; Sakamoto 등, Biosci. Biotechnol. Biochem., 59:1438-1443 [1995]; Sakamoto 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 45:94-101 [1996]; Kim 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 231:535-539 [1997]; 및 Oledzka 등, Protein Expr. Purific., 29:223-229 [2003] 참조), NH2- 및 COOH 말단 전구서열을 가진 독특한 전구체 구조를 가지는 것으로 여겨진다. 서열번호: 8 로 제시된 바와 같은 성숙 69B4 프로테아제의 예측 분자량은 18776.42 이었는데, 이는 셀룰로모나스 속 69B4 로부터 단리된 단백질 분해 활성을 가진 정제된 효소의 분자량 (즉, 18764) 과 알맞게 대응한다. 69B4 프로테아제 내의 COOH 말단 전구서열의 예측 역시 하기 제시된 69B4 프로테아제와 T. 아쿠아티쿠스 아쿠알리신 I 과의 정렬에 기초한 것이었다. 이 정렬에서, 셀룰로모나스 69B4 신호 서열 및 전구체 프로테아제의 아미노산 서열들이 테르무스 아쿠아티쿠스의 신호 서열 및 전구체 프로테아제 아쿠알리신 I 과 함께 정렬된다(아쿠알리신 I 의 COOH-말단 전구서열은 밑줄 및 볼드체로 되어 있다).
Figure 112006042880563-PCT00021
Figure 112006042880563-PCT00022
MALDI-TOF 분석으로, 단백질 분해 활성을 가진 셀룰로모나스 속 69B4 으로부터의 정제된 효소의 3 개의 내부 펩티드들의 서열을 결정하였다. 3 개 펩티드 모두 단리된 asp 유전자의 번역 산물에서도 동정되었는데, 이로써 올바른 프로테아제 유전자 (상기 서열번호: 1 참조) 의 동정이 확인되었다.
Asp 및 스트렙토그리신 간의 백분율 동일성 비교
상기 유도된 asp 유전자 (성숙 사슬) 의 폴리펩티드 산물을, BLAST 프로그램 및 실시예 3 에 기술된 바와 같은 설정을 사용하여 다른 세린 프로테아제와의 상동성 분석에 사용하였다. 예비 분석은 약 44 ~ 48% 의 동일성을 보여주었다(하기 표 4-1 참조). 상기 번역된 서열에 대한 분석과 함께, 이 결과는, 상기 asp 유전자가 스트렙토그리신-유사 세린 프로테아제들의 성숙 사슬들과의 서열 동일성이 50% 미만인 프로테아제를 인코딩한다는 증거를 제공하였다. Asp 와 스트렙토마이세스 그리세우스의 스트렙토그리신 A, 스트렙토그리신 B, 스트렙토그리신 C, 스트렙토그리신 D 와의 정렬은 하기에 제시되어 있다. 이 정렬에서, 셀룰로모나스 69B4 성숙 프로테아제 ("69B4 mature") 의 아미노산 서열들을, 스트렙토그리신 C ("Sg-StreptogrisinC_mature"), 스트렙토그리신 B ("Sg-StreptogrisinBmature"), 스트렙토그리신 A ("Sg-StreptogrisinAmature"), 스트렙토그리신 D ("Sg-StreptogrisinDmature") 의 성숙 프로테아제 아미노산 서열들 및 공통 잔기들과 정렬시킨다.
Figure 112006042880563-PCT00023
Figure 112006042880563-PCT00024
백분율 동일성: asp 및 기타 세린 프로테아제들에 의해 인코딩되는 셀룰로모나스 속 69B4 프로테아제들 간의 비교 (성숙 사슬들 간의 동일성)
스트렙토그리신 A S. 그리세우스 스트렙토그리신 B S. 그리세우스 스트렙토그리신 C S. 그리세우스 스트렙토그리신 D S. 그리세우스 알파용균성 (alphalytic) 엔도펩티다제 리소박터 엔자이모게네스
Asp 프로테아제 셀룰로모나스 속 단리체 69B4 48% 45% 47% 46% 44%
추가적인 프로테아제 서열들 또한 조사하였다. 이 분석에서는, BLAST 를 사용하여 단백질 서열 중 ASP 의 성숙 도메인에 대하여 상동인 프로테아제들을 검색하였다. 동정된 것들을 그 후 다중 서열 정렬 프로그램 clustalW 를 사용하여 정렬시켰다. 하기 정렬의 상부의 숫자들은 성숙 ASP 프로테아제의 아미노산 서열을 지칭한다. 하기 정렬의 측면에 있는 숫자들은 정렬의 하부에 기술된 바와 같은 정렬 식별자들이다.
Figure 112006042880563-PCT00025
Figure 112006042880563-PCT00026
Figure 112006042880563-PCT00027
Figure 112006042880563-PCT00028
상기 목록에서, 숫자들은 하기에 대응된다:
1 ASP 프로테아제
2 스트렙토그리신 A (스트렙토마이세스 그리세우스)
3 글루타밀 엔도펩티다제 (스트렙토마이세스 프라디애)
4 스트렙토그리신 B (스트렙토마이세스 리비단스)
5 SAM-P20 (스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
6 SAM-P20 (스트렙토마이세스 알보그리세올루스)
7 스트렙토그리신 B (스트렙토마이세스 그리세우스)
8 글루타밀 엔도펩티다제 II (스트렙토마이세스 그리세우스)
9 글루타밀 엔도펩티다제 II (스트렙토마이세스 프라디애)
10 스트렙토그리신 D (스트렙토마이세스 알보그리세올루스)
11 스트렙토그리신 D (스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
12 스트렙토그리신 D (스트렙토마이세스 그리세우스)
13 S1E 아족 (subfamily) 미지정 펩티다제 (SalO 단백질) (스트렙토마이세스 리비단스)
14 S1E 아족 미지정 펩티다제 (SALO 단백질) (스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
15 스트렙토그리신 D (스트렙토마이세스 플라텐시스)
16 S1E 아족 미지정 펩티다제 (3SC5B7.10 단백질)(스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
17 CHY1 프로테아제 (메타리지움 아니소플리애)
18 스트렙토그리신 C (스트렙토마이세스 그리세우스)
19 스트렙토그리신 C (SCD40A.16c 단백질) (스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
20 S1E 아족 미지정 펩티다제 (I) (스트렙토마이세스)
21 S1E 아족 미지정 펩티다제 (II) (스트렙토마이세스)
22 S1E 아족 미지정 펩티다제 (SCF43A.19 단백질)(스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
23 S1E 아족 미지정 펩티다제 (테르모비피다 푸스카; 구(舊) 테르모모노스포라 푸스카 (Thermomonospora fusca))
24 알파-용균성 엔도펩티다제 (리소박터 엔자이모게네스)
25 S1E 아족 미지정 펩티다제 (SC10G8.13C 단백질) (스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
26 효모-용균성 엔도펩티다제 (라로박터 파에시타비더스)
27 S1E 아족 미지정 펩티다제 (SC10A5.18 단백질) (스트렙토마이세스 코엘리콜로르)
실시예 5
PCR 에 의한 69B4 프로테아제의 신규한 동족체 스크리닝
이 실시예에서는, 69B4 프로테아제의 신규한 동족체들을 스크리닝하는데 사용되는 방법들이 기술된다. 미크로코시니애 아목, 및 특히 셀룰로모나다시애 및 프로미크로모노스포라시애 과로부터의 세균 균주들을 독일 균주보존기관인 DSMZ (Braunschweig) 에 주문하여, 동결건조된 배양물로서 수령하였다. 추가적인 균주들은 BCCMTM/LMG (겐트 (Ghent) 대학교, Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) 로부터 수령하였다. DSMZ 지시사항에 따라 동결건조된 앰풀 (ampoule) 들을 개봉하고, 상기 물질을 무균 생리 식염수 (1.5 ㎖) 로 1 시간동안 재-수화하였다. 충분히 혼합한 후, 재수화된 세포 현탁물 (300 ㎕) 을 이후의 PCR 을 위해 무균 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
PCR 방법
i) 시료의 전처리
상기 재수화된 미생물 세포 현탁물을 끓는 물 조에 10 분간 두었다. 상기 현탁물을 그 후 16000 rpm 으로 5 분간 원심분리하여(Sigma 1-15 원심분리기) 세포 잔해물 및 잔여 세포들을 제거하고, 맑은 상청액 분획을 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다.
(ii) PCR 테스트 조건
이들 유형의 세균 (악티노박테리아) 으로부터의 DNA 는 특징으로서 고도로 GC 가 풍부(전형적으로 >55 몰%)하여 DMSO 의 첨가가 필수적이다. 셀룰로모나스 속 균주 69B4 를 이용한 이전의 작업에 기초하여 선택된 농도는 4% v/v DMSO 이었다.
(iii) PCR 프라이머 (하기 쌍들로부터 선택함)
Prot-int_FW1 5'-TGCGCCGAGCCCGGCGACTC-3' (서열번호: 45)
Prot-int_RV1 5'-GAGTCGCCGGGCTCGGCGCA-3' (서열번호: 46)
Prot-int_FW2 5'-TTCCCCGGCAACGACTACGCGTGGGT-3' (서열번호: 47)
Prot-int_RV2 5'-ACCCACGCGTAGTCGTTGCCGGGGAA-3' (서열번호: 48)
Cellu-FW1 5'-GCCGCTGCTCGATCGGGTTC-3' (서열번호: 49)
Cellu-RV1 5'-GCAGTTGCCGGAGCCGCCGGACGT-3' (서열번호: 50)
(iv) PCR 혼합물 (모든 재료는 Invitrogen 에서 공급받음)
주형 DNA 4 ㎕
10x PCR 완충액 5 ㎕
50mM MgSO4 2 ㎕
10mM dNTP 1 ㎕
프라이머 (10 μM 용액) 각 1 ㎕
플래티넘 Taq hifi 중합효소 0.5 ㎕
DMSO 2 ㎕
MilliQ 물 33.5 ㎕
(v) PCR 프로토콜
1) 94 ℃ 5 분
2) 94 ℃ 30 초
3) 55 ℃ 30 초
4) 68 ℃ 3 분
5) 반복 단계 2 ~ 4 를 29 회 반복한다
6) 68 ℃ 10 분
7) 15 ℃ 1 분
상기 증폭된 PCR 산물 아가로스 겔 전기영동으로 조사하였다. 상기 겔로부터 각 유기체에 대한 독특한 밴드들을 잘라낸 후, Qiagen 겔 추출 키트를 이용하여 정제하고, 동일 프라이머 조합들을 사용하여 BaseClear 로 서열분석하였다.
(vi) 서열 분석
뉴클레오티드 서열 자료를 분석하고, 상기 DNA 서열을 아미노산 서열로 번역하여 69B4-성숙 단백질에 대한 상동성을 조사하였다. Vector NTI suite 9.0.0 의 구성요소인 AlignX 를 사용하여 서열 정렬을 수행하였다. 결과는 표 5-1 에 제시되어 있다. 번호부여는 서열번호: 8 에서 사용된 것이다.
69B4 성숙 프로테아제와 비교한 천연 단리체 균주에서 발견된 (번역된) 아미노산 서열의 퍼센트 동일성
미생물 아미노산 수 오버랩 위치 % 동일성
셀룰로모나스 플라비게나 DSM 20109 101 34 - 134 62
셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112 114 26 - 139 68
셀룰로모나스 피미 DSM20113 109 32 - 140 72
셀룰로모나스 겔리다 DSM 20111 48 142 - 189 69
셀룰로모나스 이라넨시스 DSM 14785 85 52 - 123 66
셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20109 102 32 - 133 63
셀룰로모나스 자일라닐리티카 LMG 21723 143 16 - 158 73
오엘스코비아 투르바타 DSM 20577 111 34 - 144 74
오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000 129 22 - 150 70
셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM 20424 134 35 - 168 53
프로미크로모노스포라 시트레아 DSM 43110 85 52 - 136 75
프로미크로모노스포라 수쿠모에 DSM 44121 85 52 -136 73
자일라니박테리움 울미 LMG 21721 141 16 - 156 64
스트렙토마이세스 그리세우스 ATCC 27001 69B4 프로테아제와 상동인 PCR 산물 검출되지 않음
스트렙토마이세스 그리세우스 ATCC 10137
스트렙토마이세스 그리세우스 ATCC 23345
스트렙토마이세스 프라디애 ATCC 14544
스트렙토마이세스 코엘리콜로르 ATCC 10147
스트렙토마이세스 리비단스 TK23
이 결과는, 69B4 프로테아제 유전자 (성숙 사슬) 의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호: 4 에 기초한 PCR 프라이머들이 미크로코시니애 아목, 및 특히 셀룰로모나다시애 및 프로미크로모노스포라시애 과로부터의 세균 균주들에서 상동 유전자들을 검출하는데 성공적이라는 것을 보여준다.
도 2 는 ASP 프로테아제의 계통수를 제공한다. 유의미한 성숙 서열이 유도된 키모트립신 아족의 유사한 구성원들의 단백질들 및 ASP 동족체들의 성숙 서열로부터 다양한 접근법에 의해 이 프로테아제의 계통을 조사하였다. 당업계에 공지된 단백질 거리 방법 (예컨대, Kimura, The Neutral Theory of Molecular Evolution, Cambridge University Press, Cambridge, UK [1983] 참조) 을 사용하여, 갭이 포함되거나 제외된 유사한 계통수들을 수득하였다. TREECONW v.1.3b (Van de Peer 및 De Wachter, Comput. Appl. Biosci., 10:569 - 570 [1994]) 를 사용하고, Neighbor-Joining 알고리즘 (Saitou 및 Nei, Mol. Biol. Evol., 4:406 - 425 [1987]) 에 의해 추론된 트리 토폴로지를 이용하여, 정렬된 서열 (서열번호: 8 의 16 ~ 181 위치) 로부터 도 2 의 계통수를 구축하였다. 이 계통수에서 표시된 바, 상기 자료는 ASP 계열의 상동 프로테아제들("셀룰로모나딘")이 별개의 단백질 아족을 형성하는 것을 나타낸다. 도 2 에서, 괄호 내에 제시된 숫자들은 본원에 제시된 서열들에 해당한다.
하기는 셀룰로모나스 69B4 ASP 프로테아제와 본원에 기술된 관련 속의 상동 프로테아제 간의 정렬이다 .
Figure 112006042880563-PCT00029
Figure 112006042880563-PCT00030
Figure 112006042880563-PCT00031
Figure 112006042880563-PCT00032
Figure 112006042880563-PCT00033
Figure 112006042880563-PCT00034
Figure 112006042880563-PCT00035
Figure 112006042880563-PCT00036
Figure 112006042880563-PCT00037
Figure 112006042880563-PCT00038
Figure 112006042880563-PCT00039
실시예 6
면역탁본 (Immunoblotting) 을 이용한 69B4 프로테아제의 신규한 동족체 검출
이 실시예에서는, 69B4 의 동족체를 검출하기 위하여 사용된 면역탁본 실험이 기술된다. 이 실험에서는 하기 유기체들을 사용하였다:
1. 셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112
2. 셀룰로모나스 플라비게나 DSM 20109
3. 셀룰로모나스 피미 DSM 20113
4. 셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118
5. 셀룰로모나스 우다 DSM 20107
6. 셀룰로모나스 겔리다 DSM 20111
7. 셀룰로모나스 자일라닐리티카 LMG 21723
8. 셀룰로모나스 이라넨시스 DSM 14785
9. 오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000
10. 오엘스코비아 투르바타 DSM 20577
11. 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM 20424
12. 자일라니박테리움 울미 LMG21721
13. 이소프테리콜라 바리아빌리스 DSM 10177
14. 자일라니미크로비움 파크노대 DSM 12657
15. 프로미크로모노스포라 시트레아 DSM 43110
16. 프로미크로모노스포라 수쿠모에 DSM 44121
17. 아크로마이세스 라모수스 (Agromyces ramosus) DSM 43045
상기 균주들을 먼저 Heart Infusion/탈지유 한천 플레이트 (72 h, 30 ℃) 상에서 배양하여 균주 순도를 확인하고, 상기 탈지유 제거로 프로테아제 반응시키고, 접종원 (inoculum) 으로 사용하였다. 세균 균주들을, 배플 (baffle) 이 달린 100/500 Erlenmeyer 플라스크 내의 카제인 (0.8% w/v) 이 보충된 Brain Heart Infusion 브로스 상에서 230 rpm 으로 30 ℃ 에서 5 일간 배양하였다. 현미경 검사로 미생물 증식을 점검하였다. 4766 x g 에서 30 분간 원심분리하여 상청액을 세포로부터 분리시켰다. 추가로, 9500 rpm 으로 원심분리하여 고형물을 제거하였다. 차단크기 10 kDa 의 Vivaspin 20 ㎖ 농축기 (Vivascience) 를 사용하여 4000 x g 에서의 원심분리로 상청액을 농축하였다. 농축물을 0.5 ㎖ 씩의 분취량으로 -20 ℃ 에서 보관하였다.
일차 항체
Eurogentec (Liege Science Park, Seraing, 벨기에) 에 의해 제조된 면역탁본 반응용 일차 항체 (EP034323) 를, 69B4 성숙 프로테아제 (서열번호: 8) 중의 아미노산 151 ~ 164 및 178 ~ 189, 즉 하기로 이루어진 2 개의 펩티드에 대하여 생성시켰다:
69B4 성숙 프로테아제의 아미노산 서열 중 하기에 나타난 바와 같은 TSGGSGNCRTGGTT (에피토프 1; 서열번호: 51) 및 LRMITTDSGSSP (에피토프 2; 서열번호: 52):
Figure 112006042880563-PCT00040
전기영동 및 면역탁본
시료 제조
1. 농축 배양 상청액 (50 ㎕)
2. PMSF (1 ㎕; 20 ㎎/㎖)
3. 1M HCl (25 ㎕)
4. Nu PAGE LDS 시료 완충액 (25 ㎕) (Invitrogen, Carlsbad, 캘리포니아주, 미국)
혼합 및 90 ℃에서 10 분간 가열.
전기영동
MES-SDS 전기영동용 완충액 (running buffer) 을 이용한 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔 (Invitrogen) 을 사용하여 100 v 로 5 분간 및 200 v 로 계속하여 SDS-PAGE 를 2 회 수행하였다. 가능한 경우, 각 위치에 25 ㎕ 의 시료를 로딩하였다. 각 쌍 중 하나의 겔을 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) 로 염색하고, 나머지 겔은 Boehringer Mannheim 발색 웨스턴 블로팅 프로토콜 (Roche) 을 사용한 면역탁본에 사용하였다.
면역탁본
사용된 이동 완충액 (transfer buffer) 은 하기 이동 완충액이었다: Tris (0.25M) - 글리신 (1.92M) - 메탄올 (20% v/v). PVDF 막을 메탄올, 탈이온수 및 마지막으로 이동 완충액 중에서 연속적으로 급습하여 전습(pre-wetting)하였다.
PAGE 겔을 탈이온수로 잠깐 세척하고, 이동 완충액에 담겨진 블로팅 (blotting) 패드로 이동시키고, 전습된 PVDF 막 및 예비담금된 블로팅 패드로 덮었다. 이동 완충액 중에서 2.5 ~ 3 시간동안 계속하여 400 mA 에서 블로팅을 수행하였다. 상기 막을 Tris 완충 식염수 (TBS) (0.5M Tris, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에 잠깐 세척하였다(2x). 상기 막을 말레인산 용액 (100 mM 말레인산, 150 mM NaCl, pH 7.5) 중의 1% v/v 마우스/토끼 Blocking Reagent (Roche) 중에서 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하여 비-특이적 항체 결합을 방지하였다.
이 반응에 사용된 일차 항체는 1:1000 으로 희석된 EP034323 이었다. 1% Blocking Solution 중에 희석된 Ab 로 작용 시간 30 분으로 상기 반응을 수행하였다. 상기 막을 TBST (TSB + 0.1% v/v Tween 20) 중에서 10 분간 4 회 세척하였다.
2 차 항체는 20 ㎖ 의 1% Blocking Solution 중 항-마우스/항-토끼 IgG (Roche) 73 ㎕ 로 반응 시간 30 분으로 이루어졌다. 상기 막을 TBST 중에서 15 분간 4 회 세척하고, BM 발색 웨스턴 블로팅 시약 (Roche) 으로 염색이 일어날 때까지 기질 반응 (알칼리성 포스파타제) 을 수행하였다.
일차 다클론성 항체와의 교차반응의 결과는 표 6-1 에 나타난다.
면역탁본 결과
균주 면역탁본 결과 추측되는 분자 질량 kDa 69B4 성숙 프로테아제에 대한 % 서열 동일성 HI- 탈지유 한천 상에서의 프로테아제 활성
C. 플라비게나 DSM 20109 양성 21 66 양성
C. 비아조테아 DSM 20112 음성 65 양성
C. 피미 DSM 20112 음성 72 약한 +
C. 겔리다 DSM 20111 양성 20 69 약한 +
C. 우다 DSM 20107 음성 약한 +
C. 이라넨시스 DSM 14785 음성 33 약한 +
C. 셀라세아 DSM 20118 양성 27 61 양성
C. 자일라닐리티카 LMG 21723 음성 69 양성
O. 투르바타 DSM 20577 양성 18 73 양성
O. 제넨시스 DSM 46000 양성 35 78 양성
C. 셀룰란스 DSM 20424 음성 48 양성
P. 시트레아 DSM 43110 음성 28 양성
P. 수쿠모에 DSM 44121 음성 69 양성
X. 울미 LMG21721 음성 72 음성
I. variabilis DSM 10177 음성 양성
X. 파크노대 DSM 12657 음성 약한 +
A. 라모수스 DSM 43045 음성 약한 +
이들 결과에 기초할 때, 이들 실험에 사용된 항체가 69B4 프로테아제에 대하여 매우 높은 백분율의 아미노산 서열 동일성을 가진 동족체를 검출하는데 고도로 특이적이라는 것이 명백하다. 또한, 이들 결과들은, 69B4 성숙 프로테아제 사슬의 C-말단 부분이 특별히 상기 2-펩티드 에피토프들의 영역 중에서 상당히 가변적이라는 것을 나타낸다. 이 실험에서는, 이 영역에서 2 개 이상의 아미노산의 차이가 있는 경우에 웨스턴 블로팅 반응 결과가 음성으로 측정되었다.
실시예 7
역 PCR 및 게놈 워킹 (Walking)
이 실시예에서는, ASP 의 폴리뉴클레오티드 서열들을 해명하기 위하여 수행되는 실험들이 기술된다. 이 실험에 이용된 미생물은 하기와 같다:
1. 셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112
2. 셀룰로모나스 플라비게나 DSM 20109
3. 셀룰로모나스 피미 DSM 20113
4. 셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118
5. 셀룰로모나스 겔리다 DSM 20111
6. 셀룰로모나스 이라넨시스 (DSM 14785)
7. 오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000
8. 오엘스코비아 투르바타 DSM 20577
9. 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM 20424
10. 프로미크로모노스포라 시트레아 DSM 43110
11. 프로미크로모노스포라 수쿠모에 DSM 44121
이들 세균 균주들을 배플이 달린 100/500 Erlenmeyer 플라스크 내 Brain Heart Infusion 브로스 또는 트립톤 소야 (Soya) 브로스 상에서 230 rpm 으로 30 ℃ 에서 2 일간 배양하였다. 4766 x g 에서 30 분간 원심분리하여 세포들을 상기 배양 브로스로부터 분리시켰다.
당업계에 공지된 표준 페놀/클로로포름 추출 방법으로 리소자임(lysozyme)/EDTA 로 용해된 세포로부터 염색체 DNA 를 수득하였다(예컨대, 상기 Sambrook 등, 참조). 염색체 DNA 를 하기 목록에서 선택되는 제한효소들로 절단하였다: ApaI, BamHI, BssHII, KpnI, NarI, NcoI, NheI, PvuI, SalI 또는 SstII.
이들 유기체들의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다. 이들 목록에서, 성숙한 프로테아제는 볼드체로 표시되어 있으며, 신호 서열은 밑줄 쳐 있다.
Figure 112006042880563-PCT00041
Figure 112006042880563-PCT00042
Figure 112006042880563-PCT00043
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Figure 112006042880563-PCT00065
Figure 112006042880563-PCT00066
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Figure 112006042880563-PCT00072
Figure 112006042880563-PCT00073
Figure 112006042880563-PCT00074
역 PCR
역 PCR 을 이용하여, PCR 또는 면역탁본에 의해 본원에 기술된 신규한 셀룰로모나스 속 69B4 프로테아제의 신규한 동족체들인 것으로 나타난 미크로코시니애 아목의 세균 균주들의 염색체 DNA 로부터의 전체-길이의 세린 프로테아제 유전자들을 결정하였다.
절단된 DNA 를, 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호: 28106) 를 사용하여 정제하고, T4 DNA 리가아제 (Invitrogen) 로 자가-결찰시켰다. 결찰 혼합물들을 PCR 정제 키트 (Qiagen) 로 정제하고, 하기 목록에서 선택되는 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하였다:
Figure 112006042880563-PCT00075
증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동 (TBE 완충액 (Invitrogen) 중의 0.8% 아가로스) 으로 검사하였다. 각 유기체에 있어서 1.3 ~ 2.2 kbp 범위의 별개의 밴드들을 겔로부터 절단해내고, Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, BaseClear 로 상기 서열을 분석하였다. 서열 분석 결과, 이들 DNA 절편들이 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 유전자에 대한 프로테아제 유전자 동족체들의 일부 부가적인 부분을 포함하고 있는 것으로 나타났다.
RAGE (Rapid Amplification of Genomic Ends, 게놈 말단 속성 증폭) 을 이용한 게놈 워킹
당업계에 공지된 게놈 워킹 방법 (RAGE) 을 사용하여, PCR 또는 면역탁본에 의해 신규한 셀룰로모나스 속 69B4 프로테아제의 신규한 동족체인 것으로 나타난 미크로코시니애 아목의 세균 균주들의 염색체 DNA 로부터의 전체-길이 세린 프로테아제 유전자들을 결정하였다. Universal GenomeWalkerTM 키트 (BD Biosciences Clontech) 를 사용하여 RAGE 를 수행하였는데, 제조자의 프로토콜 (BD Biosciences 사용자 매뉴얼 PT3042-1, Version # PR03300) 에 일부 변형을 가하였다. 제조자의 프로토콜에 대한 변형으로는, 하기와 같이 수행된 PCR 반응을 위해 GC 함량이 높은 주형 DNA 및 AdvantageTM - GC 게놈 중합효소 믹스 (BD Biosciences Clontech) 사용으로 인하여 총 부피 50 ㎕ 중의 반응 혼합물에 DMSO (3 ㎕) 를 첨가한 것이 있다;
PCR 1 PCR 2
99 ℃ - 0.05 초
94 ℃ - 0.25 초/72 ℃ - 3.00 분 7 회 4 회
94 ℃ - 0.25 초/67 ℃ - 4.00 분 39 회 24 회
67 ℃ - 7.00 분
15 ℃ - 1.00 분
하기 목록 (5' 에서 3' 방향으로 나열) 에서 선택된 프라이머 (Invitrogen, Paisley, 영국) 로 PCR 을 수행하였다;
Figure 112006042880563-PCT00076
Figure 112006042880563-PCT00077
Figure 112006042880563-PCT00078
상기 PCR 산물들을 pCR4-TOPO TA 클로닝 벡터 (Invitrogen) 내로 서브클로닝 (subcloning) 하고, 이를 대장균 Top10 원-샷 (one-shot) 전기적격 (electrocompetent) 세포 (Invitrogen) 내로 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유한 2xTY 배지 중에서 인큐베이션하였다(37 ℃, 260 rpm, 16 시간). 단리된 플라스미드 DNA (Qiagen Qiaprep pDNA 단리 키트를 사용하여 단리함) 를 BaseClear 로 서열분석하였다.
서열 분석
Vector NTI suite v. 9.0.0 중의 ContigExpress 및 AlignX 프로그램 (Invitrogen) 을 사용하고, 주형으로서의 실시예 4 에서 수득한 본래의 폴리뉴클레오티드 서열 및 정렬을 위해 ASP 성숙 프로테아제 및 ASP 전체-길이 서열을 사용하여 PCR 절편 서열로부터 전체 길이 폴리뉴클레오티드 서열을 조립하였다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열들에 대한 결과는 표 7-1 에 제시하였으며, 상기 번역된 아미노산 서열들은 표 7-2 에 제시되어 있다. 천연 세균 균주들 각각에 대하여, 각각의 상동 프로테아제들에 대한 폴리뉴클레오티드 서열 및 번역된 아미노산 서열들은 상기에 제시되어 있다.
표 7-1 은 ASP 프로테아제 및 다른 세균 균주들로부터 수득한 다양한 기타 서열들 간의 비교 정보를 제공한다. Asp-성숙체-프로테아제 동족체들에 대한 아미노산 서열 정보는 하기 13 개 종으로부터 이용가능하다:
1. 셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112
2. 셀룰로모나스 플라비게나 DSM 20109
3. 셀룰로모나스 피미 DSM 20113
4. 셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118
5. 셀룰로모나스 겔리다 DSM 20111
6. 셀룰로모나스 이라넨시스 DSM 14784
7. 셀룰로모나스 자일라닐리티카 LMG 21723
8. 오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000
9. 오엘스코비아 투르바타 DSM 20577
9. 오엘스코비아 투르바타 DSM 20577
10. 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM 20424
11. 프로미크로모노스포라 시트레아 DSM 43110
12. 프로미크로모노스포라 수쿠모에 DSM 44121
13. 자일라니박테리움 울미 LMG 21721
특히, 셀룰로모나스 겔리다로부터의 48 개 아미노산 서열은 유용한 공통 정렬용으로는 너무 짧다. 나머지 12 개 종에 대한 Asp-성숙체에 대한 서열 정렬이 본원에 제시되어 있다. 현재까지, 오엘스코비아 투르바타, 셀룰로모나스 셀라세아, 셀룰로모나스 비아조테아 및 셀룰로시미크로비움 셀룰란스에 대하여 완전한 성숙 서열이 결정되었다. 그러나, 몇가지 문제점들이 있고, 공적으로 알려진 상기 서열 정보에 대하여 서열 정확성이 보장되지 않으며, 셀룰로모나스 셀라세아 프로테아제는 Asp 에 대하여 분명히 상동이다(61.4% 동일성). 그러나, C-말단 영역에 대한 10 개의 독립적인 PCR 절편들에 대한 서열분석은 모두 184 위치에서 정지 코돈을 나타내는데, 이는 C-말단 전구서열이 존재하지 않음을 시사한다. 또한, 셀룰로시미크로비움 셀룰란스는 셀룰로모나스와 가까운 친척관계이고, 명백히 Asp 상동 프로테아제를 갖는다. 그러나, 상기 서열 동일성은 낮아서 단지 47.7% 이다. 이의 43 ~ 44 위치에는 4 개의 아미노산 삽입이 포함되어 있으며, 상기 단백질의 N-말단이 어디에서 시작되는지도 불확실하다. 그럼에도 불구하고, 여기서 제시된 자료는 본원에 기술된 ASP 프로테아제에 상동인 효소들이 존재함을 분명히 나타낸다. 따라서, 본 발명이 셀룰로모나스 균주 69B4 로부터 단리된 ASP 프로테아제, 뿐 아니라 다른 상동 프로테아제들도 포괄하는 것을 의도한다.
이 표에서, 뉴클레오티드 번호는 69B4 프로테아제 (서열번호: 2) 의 전체-길이 유전자에 기초한 것이며, 이때 nt 1 ~ 84 는 신호 펩티드를 인코딩하고, nt 85 ~ 594 는 N-말단 전구서열을 인코딩하고, nt 595 ~ 1161 은 성숙한 69B4 프로테아제를 인코딩하고, nt 1162 ~ 1485 는 C-말단 전구서열을 인코딩한다.
ASP 성숙 프로테아제 유전자 서열과 비교한 천연 단리체 균주들로부터의 상동 폴리뉴클레오티드 서열들의 퍼센트 동일성
균주 전체 염기쌍 오버랩* % 동일성 오버랩 성숙한 프로테아제
69B4 (ASP) 프로테아제 1485 1-1485
셀룰로모나스 플라비게나 DSM20109 555 595-1156 72.3
셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112 627 332-1355 73.7
셀룰로모나스 피미 DSM 20113 474 595-1068 78.7
셀룰로모나스 겔리다 DSM 20118 462 1018-1485 72.2
셀룰로모나스 이라넨시스 DSM14784 257 748-1004 75.2
셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118 904 294-1201 72.7
셀룰로모나스 자일라닐리티카 LMG 21723 429 640-1068 75.1
오엘스코비아 투르바타 DSM 20577 1284 1-1291 73.1
오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000 387 638-1158 72.7
셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM20424 984 251-1199 63.1
프로미크로모노스포라 시트레아 DSM 43110 257 748-1004 75.9
프로미크로모노스포라 수쿠모에 DSM 44121 257 748-1004 77.4
자일라니박테리움 울미 LMG21721 430 638-1068 77.0
하기 표 (표 7-2) 는 전체-길이 ASP 와 비교한 천연 단리체 균주들 중의 번역된 아미노산 서열 자료에 관한 정보를 제공한다.
번역된 아미노산 서열 자료 비교
균주 전체 아미노산 신호 펩티드 오버랩: 위치 N-말단 전구 오버랩: 위치 성숙한 프로테아제 오버랩: 위치 C-말단 전구 오버랩: 위치
69B4 (ASP) 프로테아제 495 28 (1 - 28) 170 (29 - 198) 189 (199 - 387) 108 (388 - 495)
셀룰로모나스 플라비게나 DSM20109 185 185 (199 - 383) 동일성 68.6%
셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112 335 84 (104 - 198) 동일성 35.8% 189 (199 - 387) 동일성 70.4% 완전 62 (388 - 451) 동일성 64.1%
셀룰로모나스 피미 DSM 20113 144 144 (199- 342) 동일성 74.3%
셀룰로모나스 겔리다 DSM 20118 154 48 (340 - 387) 동일성 68.8% 106 (388 - 495) 동일성 63.9% 완전
셀룰로모나스 이라넨시스 DSM14784 85 85 (250 - 334) 동일성 65.9%
셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118 301 98 (99 - 198) 동일성 31.0% 189 (199 - 387) 동일성 68.3% 완전 13 (388 - 400) 동일성 30.8%
셀룰로모나스 자일라닐리티카 LMG 21723 143 143 (214 - 356) 동일성 73.4%
오엘스코비아 투르바타 DSM 20577 428 29 (2 - 30) 동일성 43.3% 171 (31 - 198) 동일성 44.4% 188 (201 - 389) 동일성 73.0% 완전 40 (390 - 429) 동일성 10.0%
오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000 174 174 (214 - 334) 동일성 73.6%
셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM20424 328 117 (82 - 198) 동일성 6% 199 (199 - 387) 동일성 47.7% 완전 12 (388 - 399)
프로미크로모노스포라 시트레아 DSM 43110 85 85 (250 - 334) 동일성 75.3%
프로미크로모노스포라 수쿠모에 DSM 44121 85 85 (250 - 334) 동일성 64.7%
자일라니박테리움 울미 LMG21721 141 141 (214 - 354) 동일성 72.3%
상기 결과들은, 셀룰로모나다시애 및 프로미크로모노스포라시애 과를 포함하는 미크로코시니애 아목의 세균 균주들이 69B4 프로테아제와 상동인 유전자들을 소유함을 명백히 보여준다. 상기 성숙 69B 프로테아제의 영역에 대하여, 상기 유전자 서열 동일성은 약 60% ~ 80% 범위이다. 이들 상동 서열들의 아미노산 서열들은 상기 성숙 69B4 프로테아제 단백질에 대하여 약 45% ~ 80% 의 동일성을 나타낸다. 스트렙토마이시니애 아목의 구성원들에서 유래한 대다수의 스트렙토그리신 프로테아제들과는 반대로, 미크로코시니애 아목으로부터의 이들 69B4 (Asp) 프로테아제 동족체들은 6 개의 시스테인 잔기를 소유하고 있는데, 이들은 성숙 69B4 프로테아제 단백질 내에서 3 개의 이황화교를 형성한다.
실제로는, 본원에 제시된 불완전한 서열들 및 정확성에 관한 의문들에도 불구하고, 본 발명은 Asp 군의 프로테아제들의 필수 요소들 및 스트렙토그리신과의 비교를 제공한다. Asp 는 스트렙토그리신 C 와 함께, 3 개의 이황화교를 가진 것을 특징으로 하는 유일무이한 것이다. 하기 서열에서, Asp 아미노산들은 볼드체로 인쇄되어 있으며, 완전히 보존된 잔기들은 밑줄로 되어 있다. 활성 부위 잔기들은 # 및 이중 밑줄로 표시되어 있다. 시스테인 잔기들은 * 및 밑줄로 표시되어 있다. 이황화 결합은 C17 및 C38 사이, C95 및 C105 사이, 및 C131 및 C158 사이에 위치해 있다.
Figure 112006042880563-PCT00079
표 7-3 (하기) 은 ASP 및 스트렙토그리신 C 에서 차이가 나는 위치들을 표시한다:
ASP 및 스트렙토그리신 C 에서 차이점 있는 위치
ASP 위치 ASP 아미노산 ASP 동족체 스트렙토그리신 C 아미노산
22 A R? S
25 G G N
28 I V A
51 S N? T
55 N H? R
57 Y Y I
65 G D N
74 N R G
76 S D G
77 G G R
79 R T D
88 A A S
122 V V I
125 L L V
126 I V T
141 L V Y
145 N T S
실시예 8
ASP 동족체들에 대한 질량 분광학적 서열분석
이 실시예에서는, 상기 DNA-유래 서열을 확인할 뿐 아니라 성숙 ASP 동족체들의 N-말단 및 C-말단 서열을 확증/확립하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 이 실험들에서 이용된 미생물들은 하기와 같다:
1. 셀룰로모나스 비아조테아 DSM 20112
2. 셀룰로모나스 플라비게나 DSM 20109
3. 셀룰로모나스 피미 DSM 20113
4. 셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118
7. 오엘스코비아 제넨시스 DSM 46000
8. 오엘스코비아 투르바타 DSM 20577
9. 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM 20424
미세정제 (micropurification) 된 ASP 동족체들을, 하기 주요 단계들로 이루어진 질량 분석법에 기초한 단백질 서열분석 절차에 적용하였다: 미세정제, 겔 전기영동, 겔 내 (in-gel) 단백질 가수분해적 절단, 모세관 액체 크로마토그래피 전자분무 텐덤 (tendem) 질량 분석법 (nanoLC-ESI-MS/MS), 상기 질량 분광학적 자료에 대한 데이터베이스 검색, 및 신규 서열분석. 이들 단계들에 대한 상세는 하기에 기술되어 있다. 이전의 실시예 6 에서 기술된 바와 같이, 농축 배양물 시료 (약 200 ㎖) 를 500 ㎖ 의 1M CaCl2 에 첨가하고, 14,000 rpm (모델 5415C Eppendorf) 으로 5 분간 원심분리하였다. 상청액을 얼음 상에서 냉각시키고, 200 ㎖ 1N HCl 로 산성화하였다. 5 분 후에, 200 ㎖ 50% 트리클로로아세트산을 첨가하고, 시료를 14,000 rpm (모델 5415C Eppendorf) 으로 4 분간 원심분리하였다. 상청액을 따라버리고, 펠렛을 먼저 물로 그 다음 90% 아세톤으로 세척하였다. 상기 펠렛을 스피드 백 (speed vac) 으로 건조시킨 후, 2X Protein Preparation (트리스-글리신 시료 완충액; Novex) 완충액 중에 용해시키고, 물로 1 + 1 희석한 후 SDS-PAGE 겔에 적용하였다. NuPAGE MES SDS 전기영동용 완충액으로 SDS-PAGE 를 가동하였다. SDS-PAGE 겔 (1 mm NuPAGE 10% Bis-Tris; Novex) 을 전개시키고, 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 사용하여 염색하였다. SDS-PAGE 후에, ASP 동족체에 해당하는 밴드들을 잘라내고, 당업계의 표준 프로토콜을 사용하여 질량 분광학적 펩티드 서열분석을 위해 가공하였다.
모세관 액체 크로마토그래피 전자분무 텐덤 질량 분석법 (nanoLC-ESI-MS/MS) 을 사용하여 펩티드 매핑 (mapping) 및 서열분석을 수행하였다. 이 분석 시스템은 모세관 HPLC 시스템 (모델 CapLC; Waters) 및 질량 분석기 (모델 Qtof Ultima API; Waters) 로 이루어졌다. 펩티드를 예비-컬럼 (PepMap100 C18, 5um, 100A, 300um ID x 1mm; Dionex) 에 로딩한 후, 0 내지 100% 의 용매 B 구배를 사용하여 모세관 컬럼 (Biobasic C18 75um x 10cm; New Objectives) 상에서 유속 200 nL/분 (5 ㎕/분의 펌프 유속으로부터 정적 분할 (static split) 을 사용하여 생성) 으로 45 분간 크로마토그래피하였다. 용매 A 는 수 중 0.1% 포름산으로 이루어졌고; 용매 B 는 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산이었다. 질량 분석기를 하기 매개변수들을 사용하여 가동하였다: 3.1kV 의 분무 전압, 150C 에서의 탈용매 지대, 400 내지 1900 m/z 에서 획득한 질량 스펙트럼, v-모드 중 6000 의 해상도. 자료 의존적 모드에서, 2.5x10-5 토르에서의 질량 의존성 충돌 에너지 (공급자에 의해 상술된 바) 및 충돌 기체 (아르곤) 를 이용하여 선택 및 절편화된 2 개의 가장 강한 피크를 가진 텐덤 MS 스펙트럼이 획득되었다.
ASP 동족체 DNA 로 수득된 서열들을 포함한 데이터베이스를 사용하여 데이터베이스 검색 프로그램 (Mascot, Matrix Science) 으로 상기 펩티드들의 동일성을 결정하였다. 하기 매개변수들을 이용하여 데이터베이스 검색을 수행하였다: 선택 효소 무(無), 펩티드 오차 2.5Da, MS/MS 이온 오차 0.1Da 및 카르복시아미노메틸 시스테인의 가변적 변형. 비(非)매칭 MS/MS 스펙트럼에 있어서, 수동 신규 서열 할당을 수행하였다. 예를 들어, 도 4 는 이 텐덤 질량 스펙트럼으로부터 결정된 C. 플라비게나의 N-말단의 대부분의 트립신분해 펩티드의 서열을 보여준다. 표 8-1 에서는, 다양한 동족체들에 대하여 단백질 수준에서 확증된 서열의 백분율을 N-말단 및 C-말단 펩티드 서열을 따라 보고한다.
ASP 동족체들에 대한 질량 분광학적 서열분석
ASP 동족체 확증된 서열 % 트립신, 키모트립신 절단 N-말단 및 C-말단 서열 (펩티드 질량, Da)
셀룰로모나스 셀라세아 81, 81 [IY]AWDAFAENVVDWSSR (서열번호: 126) (2026.7) YGGTTYFQPVNEILQAY (서열번호: 127)(1961.8)
셀룰로모나스 플라비게나 70, 50 VDVI\LGGNAYYI/L[...]R (서열번호: 128)(1697.7)
셀룰로모나스 피미 21, ND VDVI/LGGDAY[...]R (서열번호: 129) (1697.6)
주의: ND: 결정되지 않음 결정되지 않은 서열은 [..]로 표시됨 결정되지 않은 서열 순서는 []로 표시됨 구별되지 않는 동중 (isobaric) 잔기들은 I/L 로 표시함
실시예 9
스트렙토마이세스 리비단스 에서의 프로테아제 생산
이 실시예에서는 S. 리비단스에 의한 프로테아제 생산 방법을 개발하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 따라서, 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리펩티드를 포함한 플라스미드를 구축하고, 이러한 벡터를 사용하여 스트렙토마이세스 리비단스 숙주 세포들을 형질전환시켰다. 이 형질전환에 사용된 방법들은 US 특허 제 6,287,839 호 및 WO 02/50245 에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 상기 둘 다 명백히 참조로서 본원에 포함된다.
이들 실험 동안 개발된 한 가지 플라스미드를 "pSEG69B4T" 로 지칭하였다. 이 플라스미드의 구축은 1 개의 pSEGCT 플라스미드 벡터 (WO 02/50245 참조) 를 사용하여 된 것이다. 69B4 프로테아제를 인코딩하는 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 글루코오스 이성질화효소 ("GI") 프로모터를 사용하여 상기 프로테아제의 발현을 유도하였다. GI-프로모터와 69B4 신호-서열, N-말단 전구서열 및 성숙 서열 간의 융합은 융합-PCR 방법에 의해 XbaI-BamHI 절편으로서 구축되었다. 상기 절편을, XbaI 및 BamHI 로 절단된 플라스미드 pSEGCT 내로 연결시켜, 플라스미드 pSEG69B4T 를 생성시켰다(도 6 참조). 본 명세서가 특정 발현 벡터들을 제공하지만, 69B4 프로테아제의 다양한 전구서열과 조합된 상이한 프로모터 및/또는 신호 서열을 이용한 추가적인 벡터들을 본 발명에 사용하는 것도 고려된다.
상기 실험들 동안 개발된 한 가지 부가적인 플라스미드를 "pSEA469B4CT" 로 명명하였다(도 7 참조). 상기 pSEG69B4T 플라스미드로서는, 1 개의 pSEGCT 플라스미드 벡터를 사용하여 이 플라스미드를 구축하였다. 상기 pSEA469B4CT 를 생성하기 위하여, 아스퍼질러스 니게르 (조절 서열) ("A4") 프로모터를 69B4 프로테아제를 인코딩하는 구조 유전자에 작동가능하게 연결시키고, 이를 사용하여 상기 프로테아제의 발현을 유도하였다. 상기 A4-프로모터와 Cel A (스트렙토마이세스 코엘리콜로르-유래) 신호-서열, 상기 asp-N-말단 전구서열 및 asp 성숙 서열 간의 융합은 융합-PCR 방법으로 XbaI-BamHI 절편으로 구축하였다. 상기 절편을, XbaI 및 BamHI 으로 절단된 플라스미드 pSEA4GCT 내로 연결하여, 플라스미드 pSEA469B4CT (도 7 참조) 를 생성하였다. 상기 A4 (A. 니게르) 프로모터 영역의 서열은 하기와 같다:
Figure 112006042880563-PCT00080
이들 실험에서는, 숙주인 스트렙토마이세스 리비단스 TK23 를, 당업계에 공지된 원형질체 방법 (예컨대, Hopwood, 등,. Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, 영국 [1985] 참조) 을 사용하여 상기 기술된 벡터들 중 하나로 형질전환시켰다.
상기 형질전환된 배양물을 확장시켜 2 개의 발효 배양물을 생성하였다. 다양한 시점에서, 상기 발효 브로스의 시료들을 분석을 위해 이동시켰다. 이 실험의 목적상, 탈지유 절차를 사용하여 성공적인 클로닝 여부를 확인하였다. 이들 방법에서, 탈지유 한천 플레이트 중 천공된 구멍들에 30 ㎕ 의 진탕 플라스크 상청액을 점적 (spotting) 하고, 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션된 플레이트들을 하룻밤 인큐베이션한 후 할로 (halo) 가 있는지 육안으로 관찰하였다. 이 실험의 목적을 위해, 동일 시료들을 또한 프로테아제 활성 및 분자량 (SDS-PAGE) 에 대해 검정하였다. 발효 진행의 마지막에, SDS-PAGE에 의해 전체 길이의 프로테아제가 관찰되었다.
상기 발효 브로스의 시료를 하기와 같이 검정하였다: 상기 희석된 상청액 10 ㎕ 를 취하여 190 ㎕의 AAPF 기질 용액 (0.1 M Tris/0.005% TWEEN 중 진한 1 ㎎/㎖, pH 8.6) 에 첨가하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다(25 ℃). pSEG69B4T 를 사용하여 수득한 3 개의 클론 (X, Y, W) 및 pSEA469B4T 를 사용하여 수득한 2 개의 클론들의 발효 브로스에 대한 검정 결과, Asp 가 양쪽 구축물 모두에 의해 발현된 것으로 나타났다. 2 개 클론들 (pSEA469B4T) 에 대한 결과. 실제로, 이 실험들에서 수득한 결과는, 이들 발현 벡터들 모두를 사용하여, 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 스트렙토마이세스 리비단스에서 발현된 것을 보여주었다. 이 실시예에서 2 개의 벡터를 기술하였지만, 상이한 조합의 69B4 프로테아제: pSEA4CT 골격 (벡터) 내 +/- N 말단 및 C 말단 전구서열과 조합된 상이한 프로모터 및/또는 신호 서열들을 사용한 추가적인 발현 벡터들, 뿐 아니라 기타 구축물들도 본 발명에 사용될 것으로 고려된다.
실시예 10
B. 서브틸리스 에서의 프로테아제 생산
이 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 프로테아제 69B4 (본원에서 또한 "ASP", "Asp" 및 "ASP 프로테아제" 및 "Asp 프로테아제"로도 지칭됨) 를 생산하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 이 실시예에서는, 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 (표 10-1; 및 도 9 참조) 를 B. 서브틸리스 내로 형질전환시키는 것이 기술된다. 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다(예컨대, 참조로서 본원에 포함된 WO 02/14490 참조). B. 서브틸리스에서의 ASP 발현을 최적화하기 위하여, DNA2.0 으로 합성 DNA 서열을 제조하고, 이를 이들 발현 실험에 이용하였다. 바실러스 종에 적합하게 된 코돈 활용을 이용한 하기 제시된 DNA 서열 (합성 ASP DNA 서열) 은 야생형 ASP 전구체 단백질을 인코딩한다:
Figure 112006042880563-PCT00081
상기 서열에서, 볼드체는 성숙한 프로테아제를 인코딩하는 DNA 를 나타내고, 표준 폰트는 선도자 서열을 나타내며, 밑줄친 부분은 N-말단 및 C-말단 전구서열을 나타낸다.
합성 ASP 유전자의 발현
Asp 발현 카세트를 pXX-KpnI (도 15 참조) 또는 p2JM103-DNNDPI (도 16 참조) 벡터 내에 구축하고, 이어서 이를 B. 서브틸리스 내에서의 ASP 발현을 위해 pHPLT 벡터 (도 17 참조) 내로 클로닝하였다. pXX-KpnI 는 발현을 이끄는 aprE 프로모터 (B. 서브틸리스), cat 유전자 및 B. 서브틸리스 내 복제수의 증폭을 위한 중복 aprE 프로모터를 가진 pUC 기반 벡터이다. bla 유전자는 대장균에서의 선택적 증식을 허용한다. aprE 프로모터 영역 하류의 리보솜 결합 부위에 도입되는 KpnI 는, HindIII 부위와 함께 pXX-KpnI 내로의 Asp 발현 카세트의 클로닝을 가능하게 한다. 벡터 p2JM103-DNNDPI 는, BCE103 셀룰라아제 중심부(core) (절대 호알칼리성 바실러스로부터의 엔도-셀룰라아제; Shaw 등, J. Mol. Biol., 320:303-309 [2002] 참조) 의 발현을 이끄는 aprE 프로모터 (B. 서브틸리스) 를 포함하는데, 이는 산 불안정성 (acid labile) 연결자 (DDNDPI [서열번호: 132]; Segalas 등, FEBS Lett., 371:171-175 [1995] 참조) 와 프레임이 맞도록 (in frame) 되어 있다. 상기 ASP 발현 카세트 (BamHI 및 HindIII) 를 BCE103-DDNDPI 융합 단백질에 융합시킨다. 분비시에, ASP 는 셀룰라아제 중심부로부터 절단되어 성숙한 프로테아제로 된다.
pHPLT (도 17; 및 Solingen 등, Extremophiles 5:333-341 [2001] 참조) 는 바실러스 리체니포르미스의 열안정 아밀라아제 LAT 프로모터 (PLAT), 그 다음으로 ASP 발현 구축물을 클로닝하기 위한 XbaI 및 HpaI 제한효소 인식부위들을 포함한다. 하기 서열은 DNNDPI 산 불안정성 연결자를 가진 BCE103 셀룰라아제 중심부의 서열이다. 이 서열에서, 볼드체는 산-불안정성 연결자를 나타내며, 표준 폰트는 BCE103 중심부를 나타낸다.
Figure 112006042880563-PCT00082
Figure 112006042880563-PCT00083
(DNA; 서열번호: 133) 및 (아미노산; 서열번호: 134)
상기 Asp 발현 카세트들을 야생형 Asp 신호 펩티드, 또는 25 개 Asp C-말단 신호 펩티드 아미노산들 (MRSKKRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA, 서열번호: 135) 에 융합된 5 개 서브틸리신 AprE N-말단 신호 펩티드 아미노산으로 구축된 하이브리드 신호 펩티드, 또는 19 개 asp C-말단 신호 펩티드 아미노산들 (MRSKKLWISLLLAVATAAATLLAGGMAAQA, 서열번호: 136) 에 융합된 11 개 서브틸리신 AprE N-말단 신호 펩티드 아미노산들로 구축된 하이브리드 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 를 포함한 pXX-KpnI 벡터 내로 클로닝하였다. 이들 발현 카세트들을 또한 asp C-말단 전구서열을 인코딩하는 DNA 를 이용하여 프레임이 맞도록 구축하였다. p2JM103-DNNDPI 벡터 내로의 클로닝을 위한 또 다른 발현 카세트는 ASP N-말단 전구- 및 성숙 서열을 인코딩한다.
pXX-KpnI 또는 p2JM103-DNNDPI 벡터 내로 클로닝된 Asp 발현 카세트들을 대장균 (Electromax DH10B, Invitrogen, 카탈로그 번호: 12033-015) 내로 형질전환시켰다. 사용된 프라이머 및 클로닝 전략은 표 10-1 에 제시되어 있다. 이어서, 상기 발현 카세트들을 이들 벡터들로부터 클로닝한 후, B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00084
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00085
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00086
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00087
amyE::(xylR,pxylA-comK) 균주 내로의 형질전환하기 위한 pHPLT 발현 벡터 내로 도입하였다. pHPLT 내로의 ASP 발현 카세트 클로닝을 위한 프라이머 및 클로닝 전략은 표 10-2 에 제시되어 있다. WO 02/14490 에 기술된 바와 같이 B. 서브틸리스에 대한 형질전환을 수행하였는데, 상기 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 도 12 ~ 21 은 본원에 기술된 다양한 플라스미드들에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
Figure 112006042880563-PCT00088
Figure 112006042880563-PCT00089
Figure 112006042880563-PCT00090
Figure 112006042880563-PCT00091
Figure 112006042880563-PCT00092
MWG 및 Invitrogen 사로부터 프라이머를 입수하였다. Invitrogen 의 프로토콜에 따라 Invitrogen 플래티넘 Taq DNA 중합효소 High Fidelity (카탈로그 번호: 11304-029) 를 PCR 증폭 (0.2 μM 프라이머, 25 내지 30 회까지) 에 사용하였다. 접착 말단 (cohesive end) 의 일반적인 클로닝에 추천되는 Invitrogen 의 프로토콜을 이용하여 Invitrogen T4 DNA 리가아제 (카탈로그 번호: 15224-025) 를 사용하여 ASP 발현 카세트 및 숙주 벡터의 리가아제 반응을 완결하였다.
0.5 g/ℓ CaCl2 대신 0.97 g/ℓ CaCl2.6H2O 를 함유하고 25 mg/ℓ 클로람페니콜 또는 20 mg/ℓ 네오마이신을 함유한 25 ㎖ SMM (Synthetic Maxatase Medium) 을 담은 진탕 플라스크 중에서 p2JM103-ASP 벡터 또는 pHPLT-ASP 벡터들 중 하나를 품은 B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00093
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00094
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00095
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00096
amyE::(xylR,pxylA-comK)) 형질전환체에 대한 선택적인 증식을 수행하였다(미국 특허 제 5,324,653 호 참조; 이는 참조로서 본원에 포함됨). 이 증식의 결과로서, 단백질 분해 활성을 가진 분비된 ASP 프로테아제가 생산되었다. 그러나, NuPage Novex 10% Bis-Tris 겔 (Invitrogen, 카탈로그 번호: NP0301BOX) 을 사용하여 겔 분석을 수행하였다. 분석용 시료를 제조하기 위하여, 2 부피량의 상청액을 1 부피량의 1M HCl, 1 부피량의 4xLDS 시료 완충액 (Invitrogen, 카탈로그 번호: NP0007) 및 1% PMSF (20 ㎎/㎖) 와 혼합한 후, 이어서 70 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 그 후, 각 시료 25 ㎕ 를 10 ㎕ 의 SeeBlue plus 2 예비-염색한 단백질 표준물 (Invitrogen, 카탈로그 번호: LC5925) 과 함께 상기 겔 상에 로딩하였다. 그 결과, 이 실시예에서 기술된 모든 asp 클로닝 전략에 의해 B. 서브틸리스에 의해 충분한 양의 활성 Asp 가 생산되는 것이 분명히 증명되었다.
또한, 동일 발효 브로스의 시료들을 하기와 같이 검정하였다: 상기 희석된 상청액 10 ㎕ 를 취하여, 190 ㎕ 의 AAPF 기질 용액 (0.1 M Tris/0.005% TWEEN® 중의 진한 1 ㎎/㎖, pH 8.6) 에 첨가하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였는데(25 ℃), 이는 상기 증가율이 생산된 ASP 농도에 대한 척도를 제공하기 때문이다. 이 결과들은, 모든 구축물이 측정가능한 ASP 프로테아제 생산을 일으키는 것을 나타내었다.
B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00097
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00098
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00099
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00100
amyE::(xylR,pxylA-comK)) 균주 내에서 합성 및 본래적 asp 유전자를 이용한 pHPLT-ASP-c-1-2 구축물의 발현 수준을 비교하여 바실러스 서브틸리스 내에서의 합성 asp 유전자의 영향을 조사하였다. 하기 프라이머들을 이용하여 플래티넘 pfx 중합효소 (Invitrogen) 를 사용하여 본래적 asp 유전자를 포함한 플라스미드로부터 상기 본래적 유전자를 증폭하였다:
AK04-12.1: RBS를 통한 NheI
TTATGCGAGGCTAGCAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAACG (서열번호: 165)
AK04-11: pHPLT 내 ASP 본래적 C1 융합용 5 aa aprE 를 통한 RBS
taaagagtgagaagcaaaaaacgcacagtcacgcgggccctg (서열번호: 166)
AK04-13: 본래적 ASP 성숙체의 HpaI 3'
gtcctctgttaacttacgggctgctgcccgagtcc (서열번호: 167)
이들 PCR 을 위하여 하기 조건들을 사용하였다: 94 ℃ 2 분간; 그 후 94 ℃ 에서 45 초간, 60 ℃ 에서 30 초간 및 68 ℃ 에서 2 분간 30 초간을 25 회; 그 후 68 ℃ 에서 5 분간. 결과적인 PCR 산물을 E-gel (Invitrogen) 상에서 가동하고, 잘라낸 후, 겔 추출 키트 (Qiagen) 로 정제하였다. 상기 본래적 ASP 를 포함한 이 절편에 대한 pHPLT 벡터를 이용한 리가아제 반응을 T4 DNA 리가아제 (NEB) 를 사용하여 완성하고 이를 바로 B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00101
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00102
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00103
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00104
amyE::(xylR,pxylA-comK)) 내로 형질전환시켰다. B. 서브틸리스로의 형질전환은 WO 02/14490 A2 에 기술된 바와 같이 수행하였는데, 상기 문헌은 참조로서 본원에 포함된다.
진탕 플라스크 내 하기 성분을 함유한 배지 중에서 37 ℃ 에서 증식시켜 상기 Asp 단백질을 생산하였다: 0.03 g/ℓ MgSO4, 0.22 g/ℓ K2HPO4, 21.3 g/ℓ NA2HPO4*7H2O, 6.1 g/ℓ NaH2PO4*H2O, 3.6 g/ℓ 요소, 7 g/ℓ 대두박 (soymeal), 70 g/ℓ Maltrin M150 및 42 g/ℓ 글루코오스, 최종 pH 7.5. 이들 실험에서, 상기 합성 유전자 카세트를 가진 숙주의 생산 수준은 본래적 유전자 카세트를 가진 숙주보다 3 배 더 높은 것으로 나타났다.
추가적인 실험에서, sacB 프로모터 및 aprE 신호 펩티드를 사용하여 바실러스 서브틸리스 내 ASP 의 발현을 조사하였다. TGO 중합효소 (Roche) 및 하기 프라이머들을 사용하여 합성 asp 유전자를 포함한 플라스미드로부터 상기 유전자를 증폭시켰다:
CF 520 (+) ASP (전구) 를 aprE ss 에 융합
GCAACATGTCTGCGCAGGCTAACGAACCGGCTCCTCCAGGA (서열번호: 168)
CF 525 (-) Asp 유전자 HindIII 의 말단
GACATGACATAAGCTTAAGGGGAACTTCCAGAGTC (서열번호: 169)
TGO 중합효소 (Roche) 및 하기 프라이머들을 사용하여 플라스미드 pJHsacBJ2 로부터 상기 sacB 프로모터 (바실러스 서브틸리스), aprE 로부터의 메신저 RNA (+1) 의 시작 및 상기 aprE 신호 펩티드를 증폭하였다:
CF 161 (+) sacB 프로모터의 시작점에서의 EcoRI
GAGCCGAATTCATATACCTGCCGTT (서열번호: 170)
CF 521 (-) CF 520 의 역 상보체 (reverse complement)
TCCTGGAGGAGCCGGTTCGTTAGCCTGCGCAGACATGTTGC (서열번호: 171)
하기 PCR 조건들을 사용하여 양 조각들을 증폭하였다:
94 ℃ 2 분간; 그 후 94 ℃ 에서 30 초간, 50 ℃ 에서 1 분간 및 66 ℃ 에서 1 분간을 30 회; 그 후 72 ℃ 에서 7 분간. 결과적인 PCR 산물을 E-gel (Invitrogen) 상에서 가동시키고, 잘라낸 후, 겔 추출 키트 (Qiagen) 로 정제하였다.
또한, PCR 오버랩 신장 융합 (Ho, Gene, 15:51-59 [1989]) 을 사용하여 하기 프라이머를 이용하여 PFX 중합효소 (Invitrogen) 로 상기 유전자 절편을 sacB 프로모터-aprE 신호 펩티드 절편에 융합시켰다:
CF 161 (+) sacB 프로모터의 시작에서의 EcoRI
GAGCCGAATTCATATACCTGCCGTT (서열번호: 170)
CF 525 (-) Asp 유전자 HindIII 의 말단
GACATGACATAAGCTTAAGGGGAACTTCCAGAGTC (서열번호: 169)
이들 PCR 을 위해 하기 조건들을 사용하였다:
94 ℃ 에서 2 분간; 그 후 94 ℃ 에서 45 초간, 60 ℃ 에서 30 초간 및 68 ℃ 에서 2 분 30 초 간을 25 회; 그 후 68 ℃ 에서 5 분간. 결과적인 PCR 융합 산물을 E-gel (Invitrogen) 상에서 가동하고, 잘라낸 후, 겔 추출 키트 (Qiagen) 로 정제하였다. 상기 정제된 융합체들을 절단하고(EcoRI/HindIII), 강한 전사 종결자를 가진 EcoRI/HindIII pJH101 (Ferrari 등, J. Bacteriol., 152:809-814 [1983]) 벡터 내로 연결하였다(T4 DNA 리가아제, NEB) . 상기 연결 혼합물을 적격 대장균 세포 (Top 10 화학적 적격 세포, Invitrogen) 내로 형질전환시키고, 플라스미드 프렙 (prep) 을 실시하여 상기 플라스미드를 회수하였다(Qiagen spin-prep).
플라스미드 pJHsacB-ASP (1-96 sacB 프로모터; aprE ss 말단을 통한 97-395 aprE +1; 및 396-1472 전구+성숙 asp; 하기 제시된 서열 참조) 를 B. 서브틸리스내로 형질전환시켰다. B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00105
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00106
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00107
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00108
amyE::(xylR,pxylA-comK)) 균주로의 형질전환은 WO 02/14490 A2 에 기술된 바대로 수행하였는데, 상기 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 상기 균주의 하룻밤 배양물 (LB 배지에서 배양) 로부터 염색체 DNA 를 추출해낸 후 이를 균주 BG 3594 로 형질전환시키고 "CF 202" 로 명명하였다. 이 균주는 지시자 플레이트 (LA + 1.6% 탈지유) 상에서 명확한 할로를 생성하였다.
pJHsacB-ASP 서열:
Figure 112006042880563-PCT00109
Figure 112006042880563-PCT00110
9 개-프로테아제 결실 바실러스 서브틸리스 숙주에서 asp 유전자 발현을 조사하였다. 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 (표 10-2 및 도 9 참조) 를 B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00111
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00112
nprE,
Figure 112006042880563-PCT00113
epr,
Figure 112006042880563-PCT00114
ispA,
Figure 112006042880563-PCT00115
bpr,
Figure 112006042880563-PCT00116
vpr,
Figure 112006042880563-PCT00117
wprA,
Figure 112006042880563-PCT00118
mpr-ybfJ,
Figure 112006042880563-PCT00119
nprB) 및 (degU Hy 32, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00120
spoIIE3501, amyE:(xylRPxylAcomK-ermC)) 내로 형질전환시켰다. 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행되었다(예컨대, WO 02/14490 참조; 이는 참조로서 본원에 포함됨). 진탕 플라스크 내 MBD 배지, MOPS 기반 제한 배지 중에서 37 ℃에서 배양하여 Asp 단백질을 생산하였다. NH4Cl2, FeSO4 및 CaCl2 는 기본 배지 밖에 두고, 3 mM K2HPO4 를 사용하고 상기 기본 배지를 60 mM 요소, 75 g/ℓ 글루코오스 및 1 % 소이톤 (soytone) 으로 보충한 것을 제외하고는, 본질적으로는 당업계에 공지된 바대로 MBD 배지를 제조하였다(Neidhardt 등, J. Bacteriol., 119: 736-747 [1974] 참조). 또한, 미세영양소는 1 리터 중에, 400 mg FeSO4.7H2O, 100 mg MnSO4.H2O, 100 mg ZnSO4.7H2O, 50 mg CuCl2.2H2O, 100 mg CoCl2.6H2O, 100 mg NaMoO4.2H2O, 100 mg Na2B4O7.10H2O, 10 ㎖ 의 1M CaCl2, 및 10 ㎖ 의 0.5 M 시트르산나트륨을 함유한 100 X 스탁으로서 구성되었다. 이들 실험에서 수득한 발현 수준은 상당히 높은 것으로 나타났다.
추가적인 구현예들에서, B. 서브틸리스에 대한 식물성 (vegetative) "시그마 A-형" 프로모터들의 "-10" 및 "-35" 영역들에 대한 확립된 공통 서열들을 보다 완벽하게 따르는 프로모터들을 생성하기 위한 자리-집중 (site-saturation) 돌연변이 유발을 통해 개발된 것들 등의 "공통" 프로모터들이 본 발명에 사용된다(Voskuil 등, Mol. Microbiol., 17:271-279 [1995] 참조). 그러나, 본 발명을 임의의 특정 공통 프로모터에 제한하려는 의도는 없으며, 이는 바실러스 세포들에서 기능하는 다른 프로모터들이 본 발명에 사용될 것으로 고려되기 때문이다.
실시예 11
바실러스 클라우시이 에서의 프로테아제 생산
이 실시예에서는, B. 클라우시이 내에서 프로테아제 69B4 (본원에서는 또한 "Asp" 로도 지칭됨) 를 생산하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 바실러스 클라우시이 내에서 Asp 단백질을 발현시키기 위하여는, 이 호알칼리성 미생물의 독특한 조절 시스템 때문에 상기 미생물 내에서 작용하는 프로모터를 사용하는 것이 필수적이었다. B. 클라우시이 PB92 (MAXACAL® 프로테아제) 의 알칼리성 세린 프로테아제에 대한 생산 프로필은 정교한 조절을 가진 강력한 프로모터 (본원에서 "MXL-prom."으로 지칭됨; 서열번호: 173, 174 및 175, 도 18 참조) 를 가져야만 하는 것을 보여왔다. 상기 프로모터 영역 이외에, 또한 신호 서열 (선도자 서열) 이 B. 클라우시이 내에서 단백질을 분비하는데 매우 중요한 것으로 공지되어 있다. 따라서, MAXACAL® 프로테아제 프로모터 영역 및 각각 Asp 선도자의 25, 25 및 0 개 아미노산에 융합된 MAXACAL® 프로테아제 선도자의 3, 6 및 27 개 아미노산을 가진, N-말단 전구 앞쪽의 MAXACAL® 프로테아제 선도자 서열 및 Asp 선도자 서열과 성숙 Asp 단백질과의 개별적인 융합체들을 이용하여 3 개의 구축물을 설계하였다.
이들 구축물을 만들기 위하여는, 상기 융합을 가능하게 하기 위하여 DNA 절편의 증폭을 실시하는 것이 필요하였다. 따라서, Phusion 고 충실도 (high fidelity) 중합효소 (Finnzymes) 를 이용하여 제조자의 지시에 따라 MAXACAL® 프로테아제 및 Asp 주형 DNA 둘 다에 대하여 PCR 을 수행하였다.
MWG-Biotech AG 에서 합성된 하기 프라이머들 (볼드체는 상기 프라이머의 MAXACAL® 프로테아제 부분을 나타냄) 을 이용하여 PCR 반응을 실시하였다:
Figure 112006042880563-PCT00121
이 프라이머는 상기 프로모터 영역으로부터의 HpaI-부위 (GTTAAC) 및 클로닝을 위한 BamHI-부위 (GGATCC) (둘 다 밑줄친 부분) 를 포함한다.
Figure 112006042880563-PCT00122
이 프라이머의 서열은 pHPLT-ASP-C1-2 의 HindIII-부위의 바로 상류에 위치한다(표 10-2 참조).
융합된 MAXACAL® 프로테아제-Asp 선도자 절편을 생성하기 위한 PCR 구성
주형 DNA 프라이머 1 프라이머 2 절편 명칭
pHPLT-ASP-C1-2 1 8 3F
pHPLT-ASP-C1-2 3 8 6F
pHPLT-ASP-C1-2 5 8 27F
pMAX4 2 7 3R
pMAX4 4 7 6R
pMAX4 6 7 27R
3F + 3R 7 8 3F3R
6F + 6R 7 8 6F6R
27F + 27R 7 8 27F27R
표 11-1 에서, "pMAX4" 는 WO 88/06623 에 기술된 주형을 지칭하는데, 상기 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. PCR 절편들인 3F3R, 6F6R, 27F27R 은 BamHI 및 HindIII 모두로 절단되었다. 상기 절단된 PCR 절편들을 T4 리가아제 (Invitrogen) 를 이용하여 BamHI + HindIII-개방 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 (도 18 참조) 내로 연결하였다. 상기 연결 산물을 적격 B. 서브틸리스 세포 (
Figure 112006042880563-PCT00123
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00124
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00125
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00126
amyE::(xylR,pxylA-comK; 예컨대, WO 02/14490 참조; 이는 참조로서 본원에 포함됨) 로 형질전환하고, 네오마이신 (20 mg/ℓ) 상에서 선별하였다. 네오마이신을 함유한 Heart Infusion-한천 플레이트를 사용하여 네오마이신 저항성 콜로니를 동정하였다. Qiagen 의 플라스미드 단리 키트를 사용하여 제조자의 지시사항에 따라 B. 서브틸리스 형질전환체들의 DNA 를 단리하고, 단일 튜브 내에서 NcoI + HpaI 둘 다를 함께 사용하여 절단한 후의 패턴으로, 융합 MAXACAL® 프로테아제-Asp 절편의 출현에 대해 검사하였다. 이 실시예에서 사용된 제한효소들 (즉, BamHI, HindIII, NcoI 및 HpaI) 은 모두 NEB 에서 구입하였고, 공급자의 지시사항에 따라 이들을 사용하였다. 제한효소들 (NcoI + HpaI) 에 의해 2 개의 밴드를 나타낸 B. 서브틸리스 형질전환체들의 DNA 를 사용하여 프로테아제 음성 B. 클라우시이 균주 PBT142 원형질체 세포 (이들은 PB92 에서 유래한 것임) 를 형질전환시켰다.
특허 WO88/06623 에서 B. 알칼로필루스 (B. 클라우시이로 재명명됨) 균주 PB92 의 원형질체 형질전환에 대해 언급된 프로토콜에 따라 B. 클라우시이 균주 PBT142 의 원형질체 형질전환을 수행하였는데, 상기 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 이 프로토콜에 대한 변형은, 1.5% 한천 대신, 8.0 g/ℓ Gelrite 겔람 검 (gellam gum) (Kelco) 을 사용한 점에서 대안적인 재생 플레이트용 방법을 사용한 것이다. 또한, Van der Laan 등 (Van der Laan 등, Appl. Environ. Microbiol., 57:901-909 [1991]) 에 의해 기술된 바와 같이, 1000 mg/ℓ 네오마이신 대신에, 20 mg/ℓ 네오마이신을 사용하였다.
B. 서브틸리스로부터 단리된 모든 3 개 구축물로부터의 DNA (상기 참조) 를 상기와 동일한 프로토콜을 사용하여 B. 클라우시이 PBT142 원형질체 내로 형질전환시켰다. B. 클라우시이 PBT142 내의 형질전환체들을 20 ㎎/ℓ 네오마이신을 함유한 Heart Infusion 한천 플레이트 상에서의 레플리카-평판법 (replica-plating) 으로 선별하였다. 표 11-2 에 나타난 바와 같이 상이한 구축물들을 가진 B. 클라우시이 균주들이 생성되었다.
B. 클라우시이 구축물
구축물 (길이 MAXACALl® 프로테아제 선도자) B. 클라우시이 균주
3 MXL/25ASP PMAX-ASP3
6 MXL/25ASP PMAX-ASP2
27 MXL/0ASP PMAX-ASP1
이들 3 개 균주들을 100 ㎖ 합성 Maxatase 매질 (SMM) 을 담은 진탕 플라스크 중에서 발효시켰다(미국 특허 제 5,324,653 호 참조; 이는 참조로서 본원에 포함됨). 그러나, 0.97 g/ℓ CaCl2.6H2O 대신에, 0.5 g/ℓ CaCl2 를 사용하였다. 또한, 0.5 ㎖/ℓ 소포제 5693 대신에, 0.25 ㎖/ℓ Basildon 을 사용하였다. 상기 100 ㎖ SSM 진탕 플라스크에, 선도자 구축물들을 포함한 3 개의 B. 클라우시이 균주들의 20 ㎎/ℓ 네오마이신을 함유한 10 ㎖ TSB (트립톤 소야 브로스) 중의 예비-배양물 0.2 ㎖ 를 접종하였다. 상기 프로테아제 생산치는, 진탕 플라스크에서 3 일간 배양 후 (상기 기술된) AAPF-검정으로 측정하였다. 그 결과, 이들 구축물들이 단백질 분해 활성을 가진 프로테아제를 발현할 수 있는 것으로 나타났다.
추가적인 실험에서, 전체 MAXACAL® 프로테아제 선도자 길이 (27 개 아미노산) 를 가진 선도자 구축물의 통합을 조사하였다. 그러나, 본 발명을 임의의 특정 기작으로 제한하려는 의도는 없다.
B. 알칼로필러스 (현재는, B. 클라우시이) 염색체 중의 이종 DNA 의 안정한 통합은 여러 간행물들에 기술되어 있다(예컨대, 상기 WO 88/06623 및 Van der Laan 등 참조). 특허 WO 88/06623 에 기술된, B. 알칼로필러스 (현재는, B. 클라우시이) 의 염색체 내의 MAXACAL® 프로테아제 유전자의 1 개 또는 2 개 사분들의 통합을 위한 절차를 사용하여 B. 클라우시이 PBT142 의 염색체 내의 asp 유전자의 1 개 이상의 사본을 통합시켰다. 그러나, (MAXACAL® 프로테아제 유전자를 포함한 pMAX4 를 제조하기 위해) 통합 벡터 pE194-neo 대신에 pE194-neo: pENM#3 (도 19 참조) 의 유도체를 사용하였다. 상기 통합 벡터 pENM#3 에서, Asp 선도자 PCR 산물 27F27R 을, 상기 MAXACAL® 프로테아제 유전자의 5' 및 3' 측면 (flanking) 영역들 사이에 존재하는 유일한 평활 말단 (blunt end) 부위 HpaI 내로 클로닝하였다. 따라서, 27F27R 을 하기와 같이 평활-말단화하였다: 이를 먼저 HpaI (5' 말단) 으로 절단하고, Qiagen PCR 정제 키트로 정제한 후, HindIII (3' 말단) 으로 절단하였다. 이렇게 처리된 PCR 절편 27F27R 을 HindIII 절단 후 다시 정제하고(동일 Qiagen 키트 사용), T4 중합효소 (Invitrogen) 를 사용하여 dNTP 들로 채워넣은 후, Qiagen 키트로 다시 정제하였다. 상기 HpaI-개방 pENM#3 및 평활-말단 PCR 산물 27F27R 을 T4 리가아제 (Invitrogen) 로 연결하였다. 상기 연결 산물을 B. 클라우시이 PBT142 원형질체 내로 바로 형질전환시키고, 20 ㎎/ℓ 네오마이신을 함유한 HI 한천 플레이트 상에서 레플리카-평판한 후 선별하였다. 통합 벡터 내에서 올바른 방향의 asp 유전자를 가진 2 개의 형질전환체들을 동정하고, 이들을, 특허 WO 88/06623 에 기술된 바에 따라 통합 절차에 적용하였다. MAXACAL® 프로테아제 좌위 및 비적합 좌위에서의 통합을 위해 각각 2 ㎎/ℓ 및 20 ㎎/ℓ 네오마이신으로 선별을 실시하였다. 그 결과, B. 클라우시이 또한 Asp 프로테아제용 발현 숙주로서 적당한 것으로 나타났다.
실시예 12
B. 리체니포르미스 에서의 프로테아제 생산
이 실시예에서는, B. 리체니포르미스 내에서 프로테아제 69B4 를 생산하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 이 실험들 동안, 바실러스 리체니포르미스 내에서 프로테아제 69B4 프로테아제 (또한 "ASP 프로테아제"로도 지칭됨) 를 생산하기 위해 다양한 발현 구축물들을 생성시켰다. 구축물들을 발현 플라스미드 pHPLT (바실러스 내에서 복제) 및/또는 통합 벡터 pICatH 내로 클로닝하였다. 플라스미드 pHPLT (도 17; 및 미국 특허 제 6,562,612 호 참조 [참조로서 본원에 포함됨]) 는 pUB110 유도체이며, 선별을 위한 네오마이신 저항성 표지자를 갖고 있으며, B. 리체니포르미스 α-아밀라아제 (LAT) 프로모터 (PLAT), LAT 신호 펩티드 (preLAT) 를 인코딩하는 서열, 이어서 클로닝을 위한 PstI 및 HpaI 제한효소 인식부위 및 LAT 전사 종결자를 포함한다. pICatH 벡터 (도 20 참조) 는 온도 민감성 복제원점 (ori pE194, 바실러스 내 복제용), ori pBR322 (대장균 내 증폭용), 선별을 위한 네오마이신 저항성 유전자 및 선별, 염색체 통합 및 카세트 증폭을 위한 사본들을 가진 본래적 B. 리체니포르미스 클로람페니콜 저항성 유전자 (cat) 를 가진다.
High Fidelity 플래티넘 Taq 중합효소 (Invitrogen) 및 하기 프라이머들을 이용하여 제조자의 지시에 따라 융합 PCR 로 구축물 ASPc1 을 PstI-HpaI 절편으로서 생성시켰다:
pHPLT-BglII_FW AGTTAAGCAATCAGATCTTCTTCAGGTTA (서열번호: 184)
fusionC1_FW CATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAGAAGCAAGAAGCGAACTGTCAC (서열번호: 185)
fusionC1_RV GTGACAGTTCGCTTCTTGCTTCTCATGATTCTCCTCCCCTTTCAATG (서열번호: 186)
pHPLT-HindIII_RV CTTTACCTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAAAAACGG (서열번호: 187)
이들 프라이머들은 MWG Biotech 로부터 입수하였다. PCR 반응은 전형적으로 High Fidelity 플래티넘 Taq 중합효소 (Invitrogen) 를 제조자의 지시에 따라 이용하고, 어닐링 온도를 55 ℃ 로 하여 열 순환기 (thermocycler) 로 30 회 수행하였다. PCR-I 은, 주형 DNA 로서의 pHPLT 상에서 프라이머 pHPLT-BglII_FW 및 fusionC1_RV 를 사용하여 수행되었다. PCR-II 는 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 상에서 프라이머 fusionC1_FW 및 pHPLTHindIII_RV 를 이용하여 수행되었다. PCR-I 및 PCR-II 로부터의 절편들을 프라이머 pHPLT-BglII_FW 및 pHPLT-HindIII_RV 를 이용하여 융합 PCR 로 조립하였다. 이 최종 PCR 절편들을 Qiagen PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, BglII 및 HindIII 로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 이용하여 제조자의 지시사항에 따라 BglII 및 HindIII 절단된 pHPLT 내로 연결하였다. 연결 혼합물을 당업계에 공지된 바에 따라 B. 서브틸리스 균주 OS14 내로 형질전환시켰다(미국 특허 출원 제 US20020182734 호 및 WO 02/14490 참조; 둘 다 참조로서 본원에 포함됨). 올바른 형질전환체들은 탈지유 플레이트 상에서 할로를 생성하였고, 이들 중 하나를 선별하여 플라스미드 pHPLT-ASPc1 를 단리하였다. 이 플라스미드를 당업계에 공지된 원형질체 형질전환법으로 B. 리체니포르미스 숙주 BML780 (BRA7 유도체, cat-, amyL-, spo-, aprL-, endoGluC-) 내로 도입하였다(Pragai 등, Microbiol., 140:305-310 [1994] 참조). 네오마이신 저항성 형질전환체들은 스킴(skim) 플레이트 상에서 할로를 형성한 반면, pHPLT-ASPc1 이 없는 부모 균주는 그렇지 못했다. 이 결과는, B. 리체니포르미스가 LAT 프로모터에 의해 발현이 유도되고 하이브리드 신호 펩티드 (MRSKKRTVTRALAVATAAATLLAGGMAAQA; 서열번호: 135) 에 융합될 때 ASP 프로테아제를 발현 및 분비할 수 있음을 나타낸다.
하기 프라이머들을 이용하고 상기 기술된 바에 따라 융합 PCR 로 구축물 ASPc3 를 PstI-HpaI 절편으로서 생성시켰다(합성 asp 유전자 내의 내부 PstI 부위를 제거하는데 필요):
ASPdelPstI_FW GCGCAGGATGTAGCAGCTGGACTTGTGG (서열번호: 188)
ASPdelPstI_RV CCACAAGTCCAGCTGCTACATCCTGCGC (서열번호: 189)
AspPstI_FW GCCTCATTCTGCAGCTTCAGCAAACGAACCGGCTCCTCCAGG (서열번호: 190)
AspHpaI_RV CGTCCTCTGTTAACTCAGTCGTCACTTCCAGAGTCAGTCGTAATC (서열번호: 191)
정제 후에, 상기 PCR 산물을 PstI-HpaI 로 절단하고, PstI 및 HpaI 절단된 pHPLT 내로 연결한 후, B. 서브틸리스 균주 OS14 내로 형질전환시켰다. 탈지유 플레이트 상에 (다른 형질전환체들과 비교하여) 상대적으로 큰 할로를 형성한 네오마이신 저항체로부터 플라스미드 pHPLT-ASPc3 를 단리하였다. 플라스미드 DNA 를 Qiagen 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리하고, BaseClear 로 서열분석하였다.
서열분석 결과, 상기 ASPc3 구축물이 가장 마지막의 C-말단 끝 (S188D, P189D) 에 2 개의 아스파르트산 잔기를 가지는 성숙 ASP 를 인코딩하는 것으로 확인되었다. 이 변이들을 PCR 로 신중하게 도입하여 단백질 가수분해적 분해 (WO 02055717 참조) 에 대하여 보다 덜 취약한 ASP 의 C-말단을 제조하였다. 또한, 두 변이들이 PCR 방법들에 의해 N-말단 전구 영역의 코딩 영역 내로 도입된 것으로 나타났다. 이들 변이들은 N-말단 전구-영역에 2 개의 아미노산 변화를 유발하였다: L42I 및 Q141P. 이들 2 개의 pro(N) 변이들을 가진 이 특정 클론이 이들 변이들을 가지지 않은 다른 클론들보다 다소 더 큰 할로를 제공하기 때문에, 바실러스 내에서의 ASP 프로테아제의 발현 및/또는 분비가 이들 N-말단 전구 변이들에 의해 명백히 영향받는 것으로 고려되었다. 그러나, 본 발명을 이들 특정 변이들에 제한하려는 의도는 없는데, 그 이유는, 추가적인 변이가 본 발명에 사용될 것으로 또한 고려되기 때문이다.
다음으로, pHPLT-ASPc3 를 상기 기술한 바와 같이 BML780 내로 형질전환시켰다. 상기 플라스미드가 없는 부모 균주와 달리, BML780(pHLPT-ASPc3) 는 탈지유 플레이트 상에서 할로를 생성하였는데, 이는 이 ASPc3 구축물 역시 B. 리체니포르미스 내에서 ASP 발현을 유도한다는 것을 나타내는 것이다. ASPc3 발현 카세트를 가진 통합된 증폭된 균주를 생성하기 위하여, 하기 프라이머들을 이용하여 pHPLT-ASPc3 로부터 상기 C3 구축물을 증폭하였다:
EBS2XhoI_FW ATCCTACTCGAGGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGG (서열번호: 192)
EBS2XhoI_RV TGGAATCTCGAGGTTTTATCCTTTACCTTGTCTCC (서열번호: 193)
상기 PCR 산물을 XhoI 로 절단하고, XhoI-절단된 pICatH (도 20 참조) 내로 연결시키고, 이를 상기 기술한 바와 같이 B. 서브틸리스 OS14 내로 형질전환시켰다. ASP 발현 클론 (탈지유 플레이트 상에서의 할로 형성으로 판단) 으로부터의 플라스미드를 단리하고, pICatH-ASPc3 로 명명하였다. BaseClear 를 이용한 DNA 서열분석 결과, pICatH-ASPC3 내의 ASPc3 카세트에 추가적인 변이가 도입되지 않은 것이 확인되었다. 그 후 상기 플라스미드를 증식 허용 온도 (37 ℃) 에서 BML780 내로 형질전환시키고, 네오마이신 저항성 (neoR) 및 클로람페니콜 저항성 (capR) 형질전환체를 선별하고 BML780(pICatH-ASPc3) 로 명명하였다. 상기 균주를 클로람페니콜을 함유한 배지 중에서 증식 불허 온도 (50 ℃) 로 배양하여 B. 리체니포르미스 게놈 상의 cat 영역 내로 BML780(pICatH-ASPc3) 내의 플라스미드를 통합시켰다. 1 개의 capR 저항성 클론을 선별하여 BML780-pICatH-ASPc3 로 명명하였다. BML780-pICatH-ASPc3 을 증식 허용 온도에서 여러 세대 동안 항생제 없이 다시 배양하여 벡터 서열들을 루프-아웃 (loop-out) 시킨 후, 1 개의 네오마이신 민감성 (neoS), capR 클론을 선별하였다. 이 클론에서, 상기 염색체 상의 pICatH 벡터 서열을 잘라내고(상기 네오마이신 저항성 유전자 포함), ASPc3-cat 카세트 만을 남겨두었다. 상기 cat 유전자는 본래적 B. 리체니포르미스 유전자이고, 상기 asp 유전자는 상기 숙주 내로 도입된 유일한 이종 DNA 조각임을 유의해야 한다. 그 후, 클로람페니콜의 농도를 증가시키면서 배지 중에서/상에서 균주를 증식시켜 상기 염색체 상의 ASPc3-cat 카세트를 증폭시켰다. 여러 회의 증폭 후에, 1 개의 클론 (75 ㎍/㎖ 클로람페니콜에 대한 저항체) 을 선별하여 "BML780-ASPc3" 으로 명명하였다. 이 클론은 탈지유 플레이트 상에서 뚜렷한 할로를 형성한 반면, 이의 부모 균주 BML780 은 그렇지 못했는데, 이는 ASP 프로테아제가 BML780-ASPc3 균주에 의해 생산 및 분비됨을 나타낸다.
구축물 ASPc4 은 ASPc3 과 유사하나, ASPc4 로부터 발현된 ASP 프로테아제는 그의 성숙 사슬의 C-말단 끝에 2 개의 아스파르트산 잔기를 갖지 않는다. MWG Biotech (독일) 으로부터의 하기의 Hypur 프라이머들을 이용하여 pHPLT-ASPc3 중의 asp 유전자를 증폭시켜 ASPc4 를 생성시켰다:
XhoPlatPRElat_FW
acccccctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaaggggaggagaatcatgaaacaacaaaaacggctttac (서열번호: 194)
ASPendTERMXhoI_RV
gtcgacctcgaggttttatcctttaccttgtctccaagcttaaaataaaaaaacggatttccttcaggaaatccgtcctctgttaactcaaggggaacttccagagtcagtcgtaatc (서열번호: 195)
상기 ASPc3 에 대하여 기술된 바와 같이 상기 ASPc4 PCR 산물을 정제하고, XhoI 로 절단한 후, XhoI-절단된 pICatH 내로 연결하고, B. 서브틸리스 OS14 내로 형질전환시켰다. neoR, capR 클론으로부터 플라스미드를 단리한 후, pICatH-ASPc4 로 명명하였다. pICatH-ASPc4 를 BML780 내로 형질전환시키고, 상기 게놈 내로 통합시킨 후, 벡터 서열들을 잘라내고, cat-ASPc4 카세트를 상기 ASPc3 구축물에 대하여 기술된 바와 같이 증폭시켰다. ASPc4 카세트를 가진 균주들은 탈지유 플레이트 상에서 AspC3 카세트를 가진 균주들보다 더 작은 할로들을 생성하지 않았는데, 이는 ASP 성숙체의 C-말단의 극성이 바실러스 내에서의 ASP 생산, 분비 및/또는 안정성에 대한 중요한 인자가 아님을 시사한다. 그러나, 본 발명을 임의의 특정 방법에 제한하려는 의도는 없다.
상기 본래적 ASP 신호 펩티드가 바실러스 내에서 외부로의 이동 (export) 을 유도할 수 있는지 조사하기 위하여, ASPc5 를 구축하였다. 프라이머 ASPendTERMXhoI_RV (상기) 및 XhoPlatPREasp_FW 를 이용하여 DNA2.0 의 합성 asp 유전자에 대하여 PCR 을 수행하였다.
XhoPlatPREasp_FW
:acccccctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaaggggaggagaatcatgacaccacgaactgtcacaag (서열번호: 196)
상기 ASPc5 PCR 산물을, 상기 ASPc3 에 대하여 기술된 바와 같이, 정제하고, XhoI 로 절단한 후, XhoI 절단된 pICatH 내로 연결하고, B. 서브틸리스 OS14 내로 형질전환시켰다. neoR, capR 클론으로부터 플라스미드를 단리하고, "pICatH-ASPc5"로 명명하였다. DNA 서열분석 결과, 상기 PCR 에 의해 asp 유전자 내로 원치 않는 변이가 전혀 도입되지 않은 것으로 확인되었다. pICatH-ASPc5 를 상기 ASPc3 구축물에 대하여 기술한 바와 같이 BML780 내로 형질전환시키고, 상기 게놈 내로 통합시키고, 벡터 서열들을 잘라내고, 상기 cat-ASPc5 카세트를 증폭시켰다. ASPc5 구축물을 가진 B. 리체니포르미스 균주 역시 탈지유 플레이트 상에서 할로를 형성하는 것으로 관찰되었는데, 이는 바실러스 종 내에서 ASP 의 본래적 신호 펩티드가 분비 신호로 기능하는 것을 확증한다.
마지막으로, 구축물 ASPc6 를 생성시켰다. 이는 최적화된 DNA2.0 유전자로부터 성숙 ASP 를 인코딩하는 DNA 서열에 프레임에 맞게 융합된 B. 리체니포르미스 서브틸리신 (aprL) 프로모터, RBS 및 신호 펩티드 서열을 갖는다. 이는 프라이머 ASPendTERMXhoI_RV 및 하기 프라이머들을 이용한 융합 PCR 로 생성되었다:
AprLupXhoI_FW attagtctcgaggatcgaccggaccgcaacctcc (서열번호: 197)
AprLAsp_FW cgatggcattcagcgattccgcttctgctaacgaaccggctcctccaggatctgc
(서열번호: 198)
AprLAsp_RV gcagatcctggaggagccggttcgttagcagaagcggaatcgctgaatgccatcg (서열번호: 199)
주형 DNA 로서의 BRA7 의 염색체 DNA에 대하여 프라이머 AprLupXhoI_FW 및 AprLAsp_RV 를 이용하여 PCR-I 을 수행하였다. DNA2.0 의 합성 asp 유전자에 대하여 프라이머 AprLAsp_FW 및 ASPendTERMXhoI_RV 를 이용하여 PCR-II 를 수행하였다. PCR-I 및 PCR-II 로부터의 절편들을 프라이머 ASPendTERMXhoI_RV 및 AprLupXhoI_FW 를 이용한 융합 PCR 로 조립하였다. 이 최종 PCR 절편을, 상기 ASPc3 에 대하여 기술된 바와 같이, Qiagen 의 PCR 정제 키트를 (제조자의 지시에 따라) 사용하여 정제하고, XhoI 로 절단한 후, pICatH 내로 연결하고, B. 서브틸리스 OS14 내로 형질전환시켰다. neoR, capR 클론으로부터 플라스미드를 단리하고, "pICatH-ASPc6"으로 명명하였다. DNA 서열분석 결과, 상기 PCR 에 의해 asp 유전자 또는 aprL 영역 내로 원치 않는 변이가 전혀 도입되지 않은 것으로 확인되었다. 상기 ASPc3 구축물에 대하여 기술된 바와 같이 pICatH-ASPc6 를 BML780 내로 형질전환하고, 상기 게놈 내로 통합시키고, 벡터 서열들을 잘라내고, cat-ASPc6 카세트를 증폭시켰다. ASPc6 구축물을 가진 B. 리체니포르미스 균주들 역시 탈지유 플레이트 상에서 할로를 형성하였는데, 이는 AprL 신호 펩티드와 조합된 aprL 프로모터가 B. 리체니포르미스 내에서 ASP 프로테아제의 발현/분비를 유도하는 것을 나타낸다.
실시예 13
T. 리이세이 에서의 프로테아제 생산
이 실시예에서는, T. 리이세이에서 프로테아제 69B4 를 생산하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 이 실험들에서는, 3 개의 상이한 진균성 구축물 (cbhl 융합물을 포함한 진균성 발현 벡터) 이 개발되었다. 하나는 ASP 5' 전구 영역, 성숙 유전자 및 3' 전구 영역을 포함하였고; 두번째 것은 ASP 5' 전구 영역 및 상기 성숙 유전자를 포함하였으며; 세번째 것은 ASP 성숙 유전자만을 포함하였다.
하기 프라이머 쌍을 사용하여 ASP 유전자를 가진 염색체 DNA K25.10 로부터의 상이한 절편들에 대하여 (10% DMSO 의 존재하에서) PCR 을 수행하고, SpeI-AscI 부위들을 도입하여 SpeI 및 AscI 제한효소들로 절단된 벡터 pTREX4 (도 21 참조) 내로 상기 절편들을 클로닝하였다.
1. ASP 5'전구 영역, 성숙 유전자 및 3'전구 영역을 가진 CBHI 융합체:
AspproF 순방향 프라이머 (SpeI-Kexin 부위-ATG-전구 서열):
5'-ACTAGTAAGCGGATGAACGAGCCCGCACCACCCGGGAGCGCGAGC (서열번호: 200)
AspproR 역방향 프라이머 (AscI 부위; TAA 정지 코돈으로부터의 C-말단 전
구 영역에서부터 상기 유전자의 끝까지):
5'-GGCGCGCC TTA GGGGAGGGTGAGCCCCATGGTGTAGGCACCG (서열번호: 201)
2. ASP 5'전구 영역 및 성숙 유전자:
AspproF 순방향 프라이머 (SpeI-Kexin 부위-ATG-전구 서열):
5'-ACTAGTAAGCGGATGAACGAGCCCGCACCACCCGGGAGCGCGAGC (서열번호: 202)
AspmatR 역방향 프라이머 (AscI 부위: TAA 정지 코돈에서부터 상기
성숙 서열의 끝까지)
5'-GGCGCGCC TTA CGGGCTGCTGCCCGAGTCCGTGGTGATCA-3' (서열번호: 203)
3. ASP 성숙 유전자 유일:
AspmatF 순방향 프라이머 SpeI-Kexin 부위-ATG-성숙체:
5'-ACTAGT AAGCGG ATG TTCGACGTGATCGGCGGCAACGCCTACACCAT (서열번호:
204)
AspmatR 역방향 프라이머 (AscI 부위: TAA 정지 코돈에서부터 상기
서열의 끝까지)
5'-GGCGCGCC TTA CGGGCTGCTGCCCGAGTCCGTGGTGATCA-3' (서열번호: 205)
구축 후에, 당업계에 공지된 생탄도 (biolistic) 형질전환 방법을 사용하여 상기 상이한 플라스미드들을 cbh1, cbh2, egl1, 및 egl2 유전자들이 파괴(disruption)된 트리코더마 리이세이 균주 내로 형질전환시켰다. 형태학에 기초하여 안정한 형질전환체들을 스크리닝하였다. 각 구축물에 대하여 10 개의 안정한 형질전환체들을 진탕 플라스크 중에서 스크리닝하였다. 사용된 초기 접종원 배지는 30 g/ℓ α-락토오스, 6.5 g/ℓ (NH4)2SO4, 2 g/ℓ KH2PO4, 0.3 g/ℓ MgSO4*7H2O, 0.2 g/ℓ CACl2, 1 ㎖/ℓ 1000X T. 리이세이 Trace Salts, 2 ㎖/ℓ 10% TWEEN®-80, 22.5 g/ℓ Proflo 및 0.72 g/ℓ CaCO3 을 함유하였는데, 상기 형질전환체를 상기 배지 중에서 대략 48 시간동안 배양하였다. 이 인큐베이션 기간 후에, 배양물 10% 를 당업계에 공지된 최소 배지를 함유한 플라스크 내로 옮기고(Foreman 등, J. Biol. Chem., 278:31988-31997 [2003] 참조), 16 g/ℓ 의 락토오스로 발현을 유도하였다. 상기 플라스크들을 28 ℃ 진탕기 내에 두었다. 4 일된 시료들을 NuPAGE 4 ~ 12% 겔 상에 진행시키고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 4 일 후에 상청액 10 ㎕ 를 190 ㎕ AAPF 기질 용액 (0.1 M Tris/0.005% TWEEN 중 진한 1 ㎎/㎖, pH 8.6) 에 첨가하여 프로테아제 활성을 측정하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다(25 ℃).
상기 활성 자료는, 대조군 균주 (즉, 부모 균주) 에 비하여 5 배 더 높은 생산이 있었음을 보여주었는데, 이는 T. 리이세이가 ASP 프로테아제의 발현에 적당함을 나타낸다.
실시예 14
A. 니게르 에서의 프로테아제 생산
이 실시예에서는, 아스퍼질러스 니게르 변종(var.) 아와모리 (awamori) (PCT WO90/00192) 내에서 프로테아제 69B4 를 생산하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 이 실험들에서는, 4 개의 상이한 진균성 구축물 (glaA 융합물들을 포함한 진균성 발현 벡터) 이 개발되었다. 하나는 ASP 예비-영역 (pre-region), 5' 전구-영역, 성숙 유전자 및 3' 전구-영역을 포함하였고: 두번째 것은 ASP 예비-영역, 5' 전구-영역 및 성숙 유전자를 포함하였고; 세번째 것은 ASP 5' 전구-영역, 성숙 유전자 및 3' 전구-영역을 포함하였고; 네번째 것은 ASP 5' 전구-영역 및 성숙 유전자를 포함하였다.
프라이머들을 하기 프라이머 쌍들로부터 선택하여, 상기 asp 유전자를 가진 염색체 DNA 69B4 로부터의 상이한 절편들을 (10% DMSO 의 존재하에서) PCR 하고, Nhe1-BstEII 부위들을 도입하여 상기 절편들을 Nhe1 및 BstEII 제한효소들로 절단된 벡터 pSLGAMpR2 (도 22 참조) 내로 클로닝하였다.
프라이머들인 Anforward 01 및 Anforward 02 는 5' 말단에 서열들을 클로닝하는 attB1 Gateway (Invitrogen) 를 포함하였다. 프라이머들인 Anreversed 01 및 Anreversed 02 는 5' 말단에 서열들을 클로닝하는 attB2 Gateway (Invitrogen) 를 포함하였다. 이들 프라이머들을 사용하여 ASP 유전자들을 가진 염색체 DNA 69B4 로부터의 상이한 절편들을 (10% DMSO 의 존재하에서) PCR 하였다.
상기 상이한 구축물들을 A. 니게르 Gateway 친화성 (compatible) 목적 (destination) 벡터 pRAXdes2 로 옮겼다(도 23 참조; 또한 미국 특허출원 일련번호 제 10/804,785 호 및 PCT 출원 제 US04/08520 호 참조; 상기 문헌 둘 다 참조로서 본원에 포함됨).
Anforward 01 (attB1 서열 부재)
5'- ATGACACCACGAACTGTCACAAGAGCTCTG-3' (서열번호: 206)
Anforward 02 (attB1 서열 부재)
5'- AACGAACCGGCTCCTCCAGGATCTGCATCA-3' (서열번호: 207)
Anreversed 01 (attB2 서열 부재)
5'- AGGGGAACTTCCAGAGTCAGTCGTAATCATTCTCAGGCC-3' (서열번호: 208)
Anreversed 02 (attB1 서열 부재)
5'- GGGGAGGGTGAGTCCCATTGTGTAAGCTCCTGA-3' (서열번호: 209)
pSLGAM-NT_FW
5'-ACCGCGACTGCTAGCAACGTCATCTCCAAGCGCGGCGGTGGCAACGAACCGGCTCCTCCAGGATCt-3' (서열번호: 210)
pSLGAM-MAT_FW
5'-ACCGCGACTGCTAGCAACGTCATCTCCAAGCGCGGCGGTGGCAACGAACCGGCTCCTCCAGGATCT-3' (서열번호: 211)
pSLGAM-MAT_RV
5'-CCGCCAGGTGTCGGTCACCTAAGGGGAACTTCCAGAGTCAGTCGTAATCATTCT-3' (서열번호: 212)
PCR 조건은 하기와 같았다: 5 ㎕ 의 10X PCR 반응 완충액 (Invitrogen); 20 mM MgSO4; 각각 0.2 mM 의 dATP, dTTP, dGTP, dCTP (최종 농도), 1 ㎕ 의 10 ng/㎕ 게놈 DNA, ㎕ 당 1 유닛의 High Fidelity Taq 중합효소 1 ㎕ (Invitrogen), 각 프라이머 0.2 μM (최종 농도), 5 ㎕ DMSO 및 50 ㎕ 까지의 물. PCR 프로토콜은 하기와 같았다: 94 ℃ 5 분간; 그 후 94 ℃ 에서 30 초간, 55 ℃ 에서 30 초간 및 68 ℃ 에서 3 분간을 30 회; 그 후 68 ℃ 에서 10 분간 및 15 ℃ 에서 1 분간.
구축 후, 상기 상이한 플라스미드들 및 헬퍼 (helper) 플라스미드 (HM 396 pAPDI) 를, 당업계에 공지된 원형질체 형질전환 방법들을 사용하여 아스퍼질러스 니게르 변종 아와모리 (Delta Ap4 균주) 내로 형질전환시켰다. 형태학에 기초하여 안정한 형질전환체들을 스크리닝하였다. 진탕 플라스크 중에서 각 구축물에 대한 10 개의 안정한 형질전환체들을 스크리닝하였다. 이 기간 후, 상기 균주를 포함한 한천 조각을 RoboSoy 배지 또는 12 g/ℓ 트립톤, 8 g/ℓ 소이톤, 15 g/ℓ 황산암모늄, 12.1 g/ℓ NaH2PO4.H2O, 2.19 g/ℓ Na2HPO4, 5 ㎖ 20% MgSO4.7H2O, 10 ㎖ 10% Tween 80, 500 ㎖ 30% 말토오스 및 50 ㎖ 1M 인산염 완충액 pH 5.8 및 2 g/ℓ 우리딘 (uridine) 의 제형물을 포함한 플라스크 내로 옮겨 발현을 유도하였다. 상기 플라스크들을 28 ℃ 진탕기에 두었다. 4 일된 시료들을 NuPAGE 10% Bis Tris 단백질 겔 상에 진행시키고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 4 일된 시료들을 AAPF 방법을 사용하여 프로테아제 활성에 대하여 검정을 실시하였다.
발현된 ASP 의 양은, Coomassie 염색된 겔 중에서 검출불가능한 정도로 낮은 것으로 나타났다. 그러나 플레이트 상의 콜로니는 탈지유 플레이트 한천 플레이트 상에서 대조군 균주보다 상당히 더 큰 맑은 할로 형성을 나타내었다. 따라서, 발현은 낮았지만, 이 결과들은, A. 니게르가 ASP 프로테아제의 발현에 적당한 것을 명확히 보여준다.
실시예 15
Asp 부위-포화 돌연변이유발 (SSM) 라이브러리 생성
이 실시예에서는, asp 에 대한 자리-집중 돌연변이유발 라이브러리들을 개발하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 부위 포화 Asp 라이브러리들은 각각 pHPLT-ASP-c1-2 발현 벡터를 가진 96 개 B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00127
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00128
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00129
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00130
amyE::(xylR,pxylA-comK)) 클론들을 포함하였다. 이 벡터는 Asp 하이브리드 신호 펩티드 및 Asp N-말단 전구 및 성숙 단백질을 인코딩하는 합성 DNA 서열 (실시예 10 참조) 로 구성된 Asp 발현 카세트를 포함한 것으로서, 하기 표시된 단백질 (신호 펩티드 및 전구체 프로테아제) 의 발현 및 상기 성숙 Asp 프로테아제의 분비를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
합성 Asp 하이브리드 신호 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열:
ATGAGAAGCAAGAAGCGAACTGTCACAAGAGCTCTGGCTGTGGCAACAGCAGCTGCTACACTCTTGGCTGGGGGTATGGCAGCACAAGCT (서열번호: 213)
상기 신호 펩티드 및 전구체 프로테아제는 하기 서열 (서열번호: 214) 에서 제시된다(이 서열에서, 볼드체는 성숙한 프로테아제를 나타내며, 밑줄친 부분은 N-말단 전구서열을 나타내고, 표준 폰트는 신호 펩티드를 나타낸다):
Figure 112006042880563-PCT00131
주형으로서 pHPLT-ASP-C1-2 발현 벡터 및 표 15-1 에 나열된 프라이머들을 사용하여 189 개 asp 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리들의 구축을 완성하였다. 이 실험에서 사용된 돌연변이유발 프라이머들은 모두, 뉴클레오티드들의 무작위 편입이 보증된 변이 예정의 Asp 성숙 서열의 코돈에 대응되는 위치에 3 개로 이루어진 DNA 서열 코드 NNS (N = A, C, T 또는 G 및 S = C 또는 G) 를 포함한다. 각 SSM 라이브러리의 구축은 각각 pHPLT-BglII-FW 프라이머 및 특이적 역방향 돌연변이유발 프라이머, 및 pHPLT-BglII-RV 프라이머 및 특이적 순방향 돌연변이유발 프라이머 (상기 돌연변이유발 프라이머들과 동일한 위치) 를 사용한 2 번의 PCR 증폭으로 시작되었다. Invitrogen 에 의해 제공된 프로토콜에 따라 플래티넘 Taq DNA 중합효소 High Fidelity (카탈로그 번호: 11304-029; Invitrogen) 를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다(0.2 μM 프라이머, 20 내지 30 회까지 수행). 간단히 말해, 둘 다 동일 코돈이 표적이 된 두 특이적 PCR 혼합물의 증폭된 DNA 절편 1 ㎕ 를 프라이머들인 pHPLT-BglII-FW 및 pHPLT-BglII-RV 와 함께 48 ㎕ 의 새 PCR 반응 용액에 첨가하였다. 이 융합 PCR 증폭 (22 회) 의 결과, 무작위 변이된 특이적 Asp 성숙 코돈 및 양 말단에 유일무이한 BglII 제한효소 인식부위를 가진 선형의 pHPLT-ASP-c1-2 DNA 절편이 생성되었다. 이 DNA 절편을 정제하고(Qiagen PCR 정제 키트, 카탈로그 번호: 28106), 이를 BglII 로 절단하고, 부가적인 정제 단계를 수행하고, 연결 반응 (Invitrogen T4 DNA 리가아제 (카탈로그 번호: 15224-025)) 하여 환형 및 다합체 (multimeric) DNA 를 수득하였고, 이를 이어서 B. 서브틸리스 (
Figure 112006042880563-PCT00132
aprE,
Figure 112006042880563-PCT00133
nprE, oppA,
Figure 112006042880563-PCT00134
spoIIE, degUHy32,
Figure 112006042880563-PCT00135
amyE ::(xylR,pxylA-comK)) 내로 형질전환시켰다. 각 라이브러리에 대하여, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션 후에, 20 ㎎/ℓ 네오마이신을 함유한 Heart Infusion 한천 플레이트로부터 96 개의 단일 콜로니들을 골라낸 후, 스크리닝 목적을 위한 서열 분석 (BaseClear) 및 프로테아제 발현을 위해, 20 ㎎/㎖ 네오마이신 및 1.25 g/ℓ 효모 추출물을 함유한 MOPS 배지 (WO 03/062380 참조; 이는 참조로서 본원에 포함됨, 본원에 사용된 정확한 배지 제형물용) 중에서 37 ℃ 에서 4 일간 배양하였다. 라이브러리의 번호는 1 내지 189 개 범위이고, 각 번호는 무작위 변이된 성숙 asp 서열의 코돈을 나타낸다. 선별 후, 각 라이브러리에는 최대 20 개의 Asp 프로테아제 변형체들이 포함되었다.
Figure 112006042880563-PCT00136
Figure 112006042880563-PCT00137
Figure 112006042880563-PCT00138
Figure 112006042880563-PCT00139
Figure 112006042880563-PCT00140
Figure 112006042880563-PCT00141
Figure 112006042880563-PCT00142
Figure 112006042880563-PCT00143
Figure 112006042880563-PCT00144
Figure 112006042880563-PCT00145
Figure 112006042880563-PCT00146
Figure 112006042880563-PCT00147
Figure 112006042880563-PCT00148
Figure 112006042880563-PCT00149
Figure 112006042880563-PCT00150
Figure 112006042880563-PCT00151
Figure 112006042880563-PCT00152
Figure 112006042880563-PCT00153
실시예 16
아르기닌 및 시스테인 조합적 변이체들의 구축
이 실시예에서는, 다수의 ASP 의 아르기닌 및 시스테인 변이체들을 구축하는 것이 기술된다. 표면 아르기닌 및 시스테인 조합적 라이브러리들에 대한 사용으로 단백질 수준에서 발현이 증가된 변이체들이 생성되는지 결정하기 위하여 이 실험들을 수행하였다.
QuikChange® 다중 부위 (multi site-directed) 돌연변이유발 (QCMS) 키트 (Stratagene) 를 이용하여 2 개의 라이브러리를 구축하였다. 상기 2 개의 라이브러리를 생성하는데 사용된 5' 인산화된 프라이머들이 표 16-1 에 나와있다. HPLC, PAGE 또는 기타 임의 형태의 정제된 프라이머들은 전체 길이 프라이머들의 통합의 면에서 훨씬 더 우수한 결과를 가져왔을 뿐 아니라, 프라이머-함유의 실수들도 상당히 감소된 것으로 나타났다. 그러나, 이 실험들에서, 정제된 프라이머는 사용하지 않았는데, 아마도 원치않는 변이를 가진 클론이 12 % 생성된 것은 그 결과인 것 같다.
Figure 112006042880563-PCT00154
pHPLT-ASP-C1-2 플라스미드 제조 및 시험관 내 메틸화
상기 QCMS 키트를 사용하여 상기 시스테인 및 아르기닌 라이브러리들을 구축하기 위하여, 먼저 주형 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 를 시험관 내 메틸화하였는데, 이는 이것이 GATC 부위들에서 DNA 를 메틸화하지 않는 바실러스 균주로부터 유래하였기 때문이다. 이 방법을 사용한 이유는, dam+ 대장균 균주로부터 DNA 를 이끌어내는 것을 포함하는, QCMS 프로토콜에 사용되는 플라스미드 내 메틸화를 보장하는 보다 흔한 접근법을 여기에서 선택하지 않았기 때문인데, 이는 상기 플라스미드 pHPLT-ASP-C1-2 가 대장균 내에서 증식하지 않기 때문이다.
pHPLT-ASP-C1-2 플라스미드를 가진 바실러스 세포로부터 미니프렙 (miniprep) DNA 를 준비하였다. 구체적으로, 상기 균주를 10ppm 의 네오마이신을 함유한 5 mL 의 LB 에서 하룻밤 배양한 후, 상기 세포를 스핀-다운 (spin down) 하였다. 추가적인 단계로 상기 플라스미드 DNA 를 제조하는데에 상기 Qiagen 스핀 미니프렙 DNA 키트를 사용하였는데, 상기 단계에서는 상기 키트로부터의 P1 완충액 250 ㎕ 를 첨가한 후 10 ㎎/㎖ 리소자임 100 ㎕ 를 첨가하였다. 상기 시료를 진탕하면서 37 ℃ 에서 15 분간 인큐베이션한 후, Qiagen 미니프렙 키트 매뉴얼에 개략된 나머지 단계들을 수행하였다. 상기 미니프렙 DNA 를 상기 키트에 제공된 Qiagen 완충액 EB 30 ㎕ 로 용출하였다.
다음으로, NEB 로부터의 dam 메틸화효소 키트 (NEB 카탈로그 번호: MO222S) 를 사용하여 pHPLT-ASP-C1-2 플라스미드 DNA 를 시험관 내 메틸화하였다. 간단히 말해, 25 ㎕ 의 미니프렙 DNA (약 1-2 ㎍) 을, 20 ㎕ 의 10x NEB dam 메틸화효소 완충액, 0.5 ㎕ 의 S-아데노실메티오닌 (80 μM), 상기 dam 메틸화효소 4 ㎕ 및 150.5 ㎕ 의 무균 증류수와 함께 인큐베이션하였다. 상기 반응을 37 ℃ 에서 4 시간동안 인큐베이션한 후, 상기 DNA 를 Qiagen PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 메틸화된 DNA 를 상기 키트에서 제공된 40 ㎕ 의 완충액 EB 로 용출하였다. 상기 DNA 의 메틸화를 확인하기 위해서, 4 ㎕ 의 상기 정제된 메틸화 DNA 를 MboI (NEB; 이 효소는 비메틸화된 GATC 부위를 절단함) 또는 DpnI (Roche; 이 효소는 메틸화된 GATC 부위를 절단함) 로 절단하였는데, 각 효소를 2 ㎕ 씩 사용하고 20 ㎕ 의 반응액 중에서 실시하였다. 상기 반응물을 37 ℃ 에서 2 시간동안 인큐베이션하고, 이들을 1.2% E-겔 (Invitrogen) 상에서 분석하였다. DpnI 절단에 있어서는 작은 분자량의 DNA 얼룩(smear)/사다리 패턴(ladder)이 관찰된 반면, MboI 절단으로는 무손상의 DNA 가 나타났는데, 이는 상기 pHPLT-ASP-C1-2 플라스미드가 성공적으로 메틸화되었음을 나타낸다.
라이브러리 구축
반응에 사용된 프라이머 농도를 제외하고는 Stratagene QCMS 키트에 개략된 바와 같이 상기 시스테인 (cys) 및 아르기닌 (arg) 조합적 라이브러리를 구축하였다. 구체적으로, 4 ㎕ 의 상기 메틸화된, 정제된 pHPLT-ASP-C1-2 플라스미드 (약 25 내지 50 ng) 를 15 ㎕ 의 무균 증류수, 1.5 ㎕ 의 dNTP, 2.5 ㎕ 의 10x 완충액, 1 ㎕ 의 효소 블렌드 및 1.0 ㎕ 아르기닌 또는 시스테인 변이체 프라이머 혼합물 (즉, 총 100 ng 의 프라이머에 대하여) 과 함께 혼합하였다. 상기 프라이머 혼합물은 9 개 아르기닌 프라이머 (100ng/μL) 각각 또는 6 개 시스테인 프라이머 (100ng/μL) 각각 10 ㎕ 씩을 사용하여 제조되었는데; Stratagene 매뉴얼에서 추천한 대로 상기 arg 및 cys 라이브러리 모두에 대한 각 프라이머 50 ng 씩을 첨가한 결과 이전의 돌연변이유발 단계에서의 변이들을 포함한 클론들이 50% 미만으로 생성되었다. 따라서, 상기 프로토콜은 본 단계의 돌연변이 유발에서, 각 반응에서 총 100 ng 의 프라이머들이 포함되도록 변형되었다. 순환 단계 조건은, 두께가 얇은 0.2 mL PCR 관을 사용한 MJ Research 열 순환기 중에서 95 ℃에서 1 분간, 그 후 95 ℃ 에서 1 분간, 55 ℃ 에서 1 분간 및 65 ℃ 에서 9 분간을 30 회이었다. 반응 산물을 상기 QCMS 키트로부터의 1 ㎕ 의 DpnI 로 절단하고 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 부가적인 0.5 ㎕ 의 DpnI 를 첨가하고, 상기 반응물을 1 시간동안 인큐베이션하였다.
상기 라이브러리 DNA 를 대장균을 통하지 않고 바실러스 세포 내로 직접 형질전환시키기 위하여, 상기 라이브러리 DNA (단일 가닥 QCMS 산물) 를 TempliPhi 키트 (Amersham cat. #25-6400) 를 사용하여 증폭시켰는데, 그 이유는 바실러스가 형질전환을 위해서 이중가닥 다합체 DNA 를 필요로 하기 때문이다. 이 목적을 위하여, 1 ㎕ 의 아르기닌 또는 시스테인 QCMS 반응물을 TempliPhi 키트로부터의 5 ㎕ 의 시료 완충액과 혼합하고 95 ℃ 에서 3 분간 가열하여 상기 DNA 를 변성시켰다. 상기 반응물을 얼음 상에 두어 2 분간 냉각시킨 후, 간단히 스핀 다운하였다. 다음으로, TempliPhi 키트로부터의 5 ㎕ 의 반응 완충액 및 0.2 ㎕ 의 phi29 중합효소를 첨가하고, 반응물을 MJ Research PCR 기계로 30 ℃ 에서 4 시간동안 인큐베이션하였다. 상기 PCR 기계에서 65 ℃에서 10 분간 인큐베이션하여 상기 반응물 중의 상기 phi29 효소를 열 불활성화하였다.
상기 라이브러리들의 바실러스 내로의 형질전환을 위해, TempliPhi 증폭 반응 산물 0.5 ㎕ 를 comK 적격 세포 100 ㎕ 와 혼합한 후 37 ℃ 에서 1 시간동안 격렬히 진탕하였다. 상기 형질전환물을 105 배까지 순차적으로 희석한 후, 각 희석액 50 ㎕ 를 10 ppm 네오마이신 및 1.6% 탈지유가 담긴 LA 플레이트에 플레이팅하였다. 각 라이브러리로부터의 24 개의 클론들을 서열분석을 위해 골라내었다. 간단히 말해, 상기 콜로니들을 20 ㎕ 의 무균 증류수에 재현탁시키고, 그 후 2 ㎕ 를, 총 부피 25 ㎕ 중에서 ReadyTaq 비드 (bead) (Amersham) 를 이용한 PCR 에 사용하였다. 프라이머들인 ASPF1 및 ASPR4 를 0.5 μM 의 농도로 첨가하였다. 순환 조건은, 94 ℃ 에서 4 분간 1 회, 그 후 94 ℃ 에서 1 분간, 55 ℃ 에서 1 분간 및 72 ℃ 에서 1 분간을 30 회, 그 후 72 ℃ 에서 7 분간 1 회이었다. 각 경우 1.5kb 절편이 수득되었고, 상기 산물을 Qiagen PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 PCR 산물을 ASPF4 및 ASPR4 프라이머들로 서열분석하였다.
총 48 개 클론들을 서열분석하였다(각 라이브러리로부터 24 개씩). 상기 클론들 중 약 15% 만이 WT 였다는 점에서 돌연변이 유발은 상당히 잘 일어났다. 그러나 20% 의 클론들은 혼합 서열이었는데, 이는 상기 플레이트에 콜로니가 많았거나 또는 TempliPhi 증폭의 결과로서 형질전환용 DNA 가 매우 농축되었기 때문이다. 또한, 상기 언급한 바와 같이, 약 12% 의 클론들은 별도의 변이를 가졌다. 나머지 클론들은 모두 변이체였고, 이들 중 약 60 ~ 80% 는 유일무이한 변이체들이었다. 상기 아르기닌 및 시스테인 라이브러리들에 대한 서열분석 결과는 하기 표 16-2 및 16-3 에 제시되어 있다.
아르기닌 라이브러리 서열분석 및 탈지유 플레이트 결과
콜로니 할로 R14L R16Q R35F R61S R79T R123L R127Q R159Q R179Q
R1 배지 　 X X 　 　 　 　 X 　
R2 형성 　 　 　 　 　 　 　 X 　
R3 형성 　 X 　 　 　 X 　 　 　
R4 형성 　 X 　 　 　 X 　 　 　
R5 형성 　 X 　 　 　 X 　 　 　
R6 형성 　 X 　 　 　 X 　 　 　
R7 형성 X 　 　 　 　 　 X X 　
R8 형성 　 X 　 　 　 X 　 　 　
R9 형성 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R10 형성 X 　 　 　 　 　 　 　 X
R11 형성 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R12 배지 　 X X 　 　 　 　 X 　
R13 형성 　 　 　 　 X 　 　 　 　
R14 형성 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R15 형성 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R16 배지 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R17 무(無) 　 　 　 X 　 X X 　 　
R18 배지 　 　 　 　 　 X X 　 X
R19 배지 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R20 형성 X 　 　 　 　 　 X X 　
R21 배지 　 X 　 　 X 　 X 　 　
R22 작음 　 　 　 　 　 　 　 　 　
R23 형성 　 X 　 　 X 　 　 　 　
R24 형성 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Figure 112006042880563-PCT00155
서열분석에서 동정된 상기 변이체들 중, 아르기닌 라이브러리로부터의 하기 변이체들 (표 16-4 참조) 이 관심 대상인 것으로 나타났다. 이들 변이체들의 특성에 관한 부가적인 자료를 위해서는 하기 실시예들 참조.
관심 아르기닌 변이체들
변이체 서열
R1 R16Q R35F R159Q
R2 R159Q
R3 R16Q R123L
R7 R14L R127Q R159Q
R10B R14L R179Q
R18 R123L R127Q R179Q
R21 R16Q R79T R127Q
R23 R16Q R79T
R10 R14L R79T
중요하게도, 상기 활성 결과는, 시스테인 잔기 내의 변이들은 활성이 매우 낮거나 또는 없는 ASP 프로테아제를 생성하는 것으로 나타났는데, 이는 상기 이황화교들이 상기 분자의 안정성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 그러나, 본 발명을 임의의 특정 기작(들)에 제한하려는 의도는 없다.
실시예 17
S. 리비단스 내에서의 상동 O. 투르바타 프로테아제 발현
이 실시예에서는, 상기 프로테아제 69B4 와 상동인 O. 투르바타에 의해 생산되는 프로테아제의 S. 리비단스 내에서의 발현이 기술된다. 따라서, 이 실시예는 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한 플라스미드 및 이러한 벡터를 사용하여 스트렙토마이세스 리비단스 숙주 세포를 형질전환하는 것을 기술한다. 본원에서 사용된 형질전환 방법들은 당업계에 공지된 것이다(예컨대, 미국 특허 제 6,287,839 호; 및 WO 02/50245 참조; 이들은 참조로서 본원에 포함됨).
이 실험에서 사용된 벡터 (즉, 플라스미드) 는 오엘스코비아 투르바타 DSM 20577 로부터 수득된 본 발명의 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다. 이 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 리비단스를 형질전환하였다. 상기 최종 플라스미드 벡터는 본원에서 "pSEA4CT-O.투르바타"로 지칭된다.
이전의 벡터들에서와 같이, pSEA4CT-O.투르바타는 pSEGCT 플라스미드 벡터를 사용하여 구축되었다(상기 참조).
오엘스코비아 투르바타 프로테아제 (Otp) 를 인코딩하는 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 아스퍼질러스 니게르 ("A4") 조절 서열을 사용하여 상기 프로테아제의 발현을 유도하였다. 당업계에 공지된 융합-PCR 방법으로, 상기 A4-조절 서열 및 오엘스코비아 투르바타 신호-서열, N-말단 전구서열 및 성숙한 프로테아제 서열 (즉, C-말단 전구서열 부재) 간의 융합물을 XbaI-BamHI 절편으로서 구축하였다. pSEA4CT 에서의 오엘스코비아 투르바타 프로테아제 (Otp) 의 클로닝을 위한 폴리뉴클레오티드 프라이머는 서열번호: 67 에 기초한 것이었다. 사용된 프라이머 서열은 하기이다:
A4-turb Fw
5'-CAGAGACAGACCCCCGGAGGTAACCATGGCACGATCATTCTGGAGGACGC-3' (서열번호: 613)
A4- turb RV
5'-GCGTCCTCCAGAATGATCGTGCCATGGTTACCTCCGGGGGTCTGTCTCTG-3' (서열번호: 614)
A4- turb Bam Rv
5'-ATCCGCTCGCGGATCCCCATTGTCAGCTCGGGCCCCCACCGTCAGAGGTCACGAG-3' (서열번호: 615)
A4- Xba1-FW
5'-GCAGCCTGAACTAGTTGCGATCCTCTAGAGATCGAACTTCAT-3' (서열번호: 616)
상기 절편을 XbaI 및 BamHI 로 절단된 플라스미드 pSEA4CT 내로 연결하여, 플라스미드 pSEA4CT-O.투르바타를 생성하였다.
이전의 실시예들에서 기술한 원형질체 방법을 이용하여 숙주 스트렙토마이세스 리비단스 TK23 를 플라스미드 벡터 pSEA4CT-O.투르바타로 형질전환하였다(즉, 상기 Hopwood 등의 방법 사용).
상기 형질전환된 배양물을 증식시켜 TS* 배지 중의 2 개의 발효 배양물을 생성하였다. TS* 배지의 조성은 (g/ℓ) 트립톤 (Difco) 16, 소이톤 (Difco) 4, 카제인 가수분해물 (Merck) 20, K2HPO4 10, 글루코오스 15, Basildon 소포제 0.6, pH 7.0 이었다. 다양한 시점에서, 상기 발효 브로스들의 시료들을 분석을 위해 채취하였다. 이 실험의 목적을 위해, 탈지유 방법을 사용하여 성공적인 클로닝을 확인하였다. 30 ㎕ 의 진탕 플라스크 상청액을 탈지유 한천 플레이트들 내의 천공된 구멍들 내로 피펫팅하고 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다.
상기 인큐베이션된 플레이트들을 하룻밤 인큐베이션한 후, 단백질 분해 효소의 발현을 나타내는 맑은 지대 (할로) 가 존재하는지를 시각적으로 관찰하였다. 이 실험의 목적상, 프로테아제 활성 및 분자량 (SDS-PAGE) 에 대해서도 상기 시료들을 검정하였다. 발효의 종료 시점에, SDS-PAGE 에 의해 전체 길이 프로테아제가 관찰되었다.
상기 발효 브로스의 시료를 하기와 같이 검정하였다: 10 ㎕ 의 상기 희석된 상청액을 수집하고, 실시예 1 에 기술된 디메틸카제인 가수분해 검정을 사용하여 분석하였다. 2 개 클론들의 발효 브로스에 대한 검정 결과는, 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 오엘스코비아 투르바타로부터의 폴리뉴클레오티드가 스트렙토마이세스 리비단스에서 발현되었음을 명확히 보여준다.
실시예 18
S. 리비단스 에서의 상동 셀룰로모나스 및 셀룰로시미크로비움 프로테아제들의 발현
이 실시예에서는, 프로테아제 69B4 에 상동인 셀룰로모나스 셀라세아 DSM 20118 및 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 DSM 204244에 의해 생산되는 프로테아제들의 S. 리비단스에서의 발현이 기술된다. 따라서, 이 실시예는 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한 플라스미드를 기술하고, 이러한 벡터들을 사용하여 스트렙토마이세스 리비단스 숙주 세포를 형질전환하였다. 여기에서 사용된 형질전환 방법들은 당업계에 공지된 것이다(예컨대, 미국 특허 제 6,287,839 호; 및 WO 02/50245 참조; 이들은 참조로서 본원에 포함됨).
상기 최종 플라스미드 벡터들은 pSEA4CT-C.셀라세아 및 pSEA4CT-Cm.셀룰란스로 지칭된다. pSEA4CT-C.셀라세아 및 pSEA4CT-Cm.셀룰란스는 상기 기술된 pSEGCT 플라스미드 벡터를 이용하여 구축되었다.
셀룰로모나스 셀라세아 성숙 프로테아제 (Ccp) 를 인코딩하는 구조 유전자 또는 대안적으로는, 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 성숙 프로테아제 (Cmcp) 를 인코딩하는 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 아스퍼질러스 니게르 ("A4") 조절 서열을 사용하여 프로테아제의 발현을 유도하였다. 융합-PCR 방법으로, 상기 A4-조절 서열 및 69B4 프로테아제 신호-서열, 69B4 프로테아제 유전자의 N-말단 전구서열 및 미크로코시니애 (본원에서, 셀룰로모나스 셀라세아 또는 셀룰로시미크로비움 셀룰란스) 의 균주의 게놈 DNA 로부터 수득한 본래적 프로테아제 유전자의 성숙 서열 간의 융합물을, XbaI-BamHI 절편으로서 구축하였다. 셀룰로모나스 셀라세아 프로테아제 (Ccp) 의 pSEA4CT 에서의 클로닝을 위한 폴리뉴클레오티드 프라이머들은 서열번호: 63 을 기초로 한 것이었으며, 하기와 같다:
Asp-npro fw-cell
5'-AGACCGACGAGACCCCGCGGACCATGGTCGACGTCATCGGCGGCAACGCGTACTAC-3'(서열번호: 617)
Cell-BH1-rv
5'-TCAGCCGATCCGCTCGCGGATCCCCATTGTCAGCCCAGGACGAGACGCAGACCGTA-3' (서열번호: 618)
Asp-npro rv-cell
5'-GTAGTACGCGTTGCCGCCGATGACGTCGACCATGGTCCGCGGGGTCTCGTCGGTCT-3' (서열번호: 619)
Xba-1 fw A4
5'-GCAGCCTGAACTAGTTGCGATCCTCTAGAGATCGAACTTCATGTTCGA-3' (서열번호: 620)
pSEA4CT에서의 셀룰로시미크로비움 셀룰란스 프로테아제 (Cmcp) 의 클로닝을 위한 폴리뉴클레오티드 프라이머들은 서열번호: 71 에 기초한 것이었으며, 하기와 같다:
ASP-npro fw cellu
5'-ACCGACGAGACCCCGCGGACCATGCACGGCGACGTGCGCGGCGGCGACCGCTA-3' (서열번호: 621)
ASP-npro rv cellu
5'-TAGCGGTCGCCGCCGCGCACGTCGCCGTGCATGGTCCGCGGGGTCTCGTCGGT-3' (서열번호: 622)
Cellu-BH1-rv
5'-TCAGCCGATCCGCTCGCGGATCCCCATTGTCAGCGAGCCCGACGAGCGCGCTGCCCGAC-3' (서열번호: 623)
Xba-1 fw A4
5'-GCAGCCTGAACTAGTTGCGATCCTCTAGAGATCGAACTTCATGTTCGA-3' (서열번호: 620)
상기 기술한 원형질체 방법을 사용하여 숙주 스트렙토마이세스 리비단스 TK23 을 플라스미드 벡터 pSEA4CT 로 형질전환하였다(즉, 상기 Hopwood 등). 상기 형질전환된 배양물을 증식시켜 TS* 배지 중의 2 개의 발효 배양물을 생성하였다. TS* 배지의 조성은, (g/ℓ) 트립톤 (Difco) 16, 소이톤 (Difco) 4, 카제인 가수분해물 (Merck) 20, K2HPO4 10, 글루코오스 15, Basildon 소포제 0.6, pH 7.0 이었다. 다양한 시점에서, 분석을 위해 상기 발효 브로스들의 시료를 채취하였다. 이 실험의 목적상, 탈지유 방법을 사용하여 성공적인 클로닝을 확인하였다. 30 ㎕ 의 진탕 플라스크 상청액을 탈지유 한천 플레이트 내의 천공된 구멍들 내로 피펫팅하고, 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다.
상기 인큐베이션한 플레이트들을 하룻밤 인큐베이션한 후, 단백질 분해 효소의 발현을 나타내는 맑은 지대 (할로) 가 존재하는지에 대해 시각적으로 관찰하였다. 이 실험의 목적상, 프로테아제 활성 및 분자량 (SDS-PAGE) 에 대해서도 상기 시료들을 검정하였다. 상기 발효의 종료 시점에서, SDS-PAGE에 의해 전체 길이 프로테아제가 관찰되었다.
상기 발효 브로스의 시료를 하기와 같이 검정하였다: 상기 희석된 상청액 10 ㎕ 를 취하여 190 ㎕ 의 AAPF 기질 용액(0.1 M Tris/0.005% Tween 80 중 진한 1 ㎎/㎖, pH 8.6) 에 첨가하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다(25 ℃).
이전의 실시예들에서와 같이, 수득된 결과는, 둘 다 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드들을 인코딩하는 셀룰로모나스 셀라세아 또는 셀룰로시미크로비움 셀룰란스로부터의 폴리뉴클레오티드가 스트렙토마이세스 리비단스에서 발현된 것을 명확히 나타내었다.
실시예 19
ASP 프로테아제의 결정 구조 결정
이 실시예에서는, ASP 프로테아제의 결정 구조를 결정하는데 사용된 방법들이 기술된다. 실제로, 정제된 ASP 프로테아제로부터 고품질의 단일 결정들이 수득되었다. 결정화 조건은 하기와 같았다: 25% PEG 8000, 0.2M 황산암모늄, 및 15% 글리세롤. 이들 결정화 조건들은 동결-방지적인 것이어서, 동결방지제로의 이동이 필요하지 않았다. 상기 결정체들을 액체 질소 중에 냉동시키고, Xstream (Molecular Structure) 을 사용한 자료 수집 동안에 냉동 상태로 유지시켰다. 초점 거울이 장치된 R-axis IV (Molecular Structure) 로 자료를 수집하였다. 1.9 Å 해상도로 X-선 반사 자료를 수득하였다. 공간 군 (space group) 은 셀 (cell) 크기가 a=35.65Å, b=51.82Å 및 c=76.86Å 인 P212121 이었다. 비대칭 단위 당 1 개의 분자가 존재하였다.
상기 결정 구조는 분자 치환 방법을 사용하여 해결되었다. 사용된 프로그램은 X-MR (Accelrys Inc.) 이었다. 상기 분자 치환 계산에 대한 출발 모델은 스트렙토그리신이었다. X-MR로부터 수득한 전자 밀도 지도로부터, 상기 분자 치환 해석이 올바르다는 것은 분명하다. 따라서, 상기 모델 중 98% 는 올바르게 형성된 것이며, 일부 사소한 오차는 수동으로 수정되었다. 1.9 Å 에 대한 자료용 R-인자는 0.23 이었다.
상기 구조는 크게 2 개의 매우 짧은 α-나선을 가진 β-병풍구조 (β-sheet) 및 C-말단 끝쪽으로의 더 긴 나선으로 이루어진 것으로 나타났다. 2 세트의 β-병풍구조가 존재하는데, 이들 간에는 상당한 경계면이 존재한다. 활성 부위는 이 경계면에 형성된 홈 (cleft) 에서 발견된다. 3 작용기 촉매는 His 32, Asp 56 및 Ser 137 로 형성된다. 표 19-1 는 ASP 에 대하여 밝혀진 원자 좌표 (atomic coordinate) 를 제공한다.
Figure 112006042880563-PCT00156
Figure 112006042880563-PCT00157
Figure 112006042880563-PCT00158
Figure 112006042880563-PCT00159
Figure 112006042880563-PCT00160
Figure 112006042880563-PCT00161
Figure 112006042880563-PCT00162
Figure 112006042880563-PCT00163
Figure 112006042880563-PCT00164
Figure 112006042880563-PCT00165
Figure 112006042880563-PCT00166
Figure 112006042880563-PCT00167
Figure 112006042880563-PCT00168
Figure 112006042880563-PCT00169
Figure 112006042880563-PCT00170
Figure 112006042880563-PCT00171
Figure 112006042880563-PCT00172
Figure 112006042880563-PCT00173
Figure 112006042880563-PCT00174
Figure 112006042880563-PCT00175
디폴트 설정을 사용한 DS 모델링 프로그램 (Accelrys) 을 사용하여, 상기 제공된 결정학상의 좌표들로부터 ASP 의 표면 접근가능 잔기들을 결정하였다. ASP 에 대한 총 표면 접근가능도 (surface accessibility, SA) 는 8044.777 옹스트롬인 것으로 나타났다. 표 19-2 는 총 SA, 측쇄 SA 및 퍼센트 SAS 를 제공하는데, 이때 퍼센트 SAS 는 용매에 접근가능한 아미노산의 총 표면의 백분율이다.
Figure 112006042880563-PCT00176
Figure 112006042880563-PCT00177
Figure 112006042880563-PCT00178
상기 ASP 좌표들 및 상동 구조들의 좌표들을 MOE (Chemical Computing Group) 에 입력하였다. 물 및 리간드들에 대한 좌표들은 제거하였다. MOE 정렬을 사용하여, 상기 구조를, 구조적 정렬이 가능하고 사슬 중첩이 가능한 실제의 2 차 구조를 사용하여 정렬하였다. 이 결과, 하기 구조적 정렬이 생성되었다. 표시된 숫자는 상기 성숙 ASP 프로테아제 아미노산 서열을 지칭한다.
Figure 112006042880563-PCT00179
상기 정렬에서, 상기 암호들은 하기와 같다:
1HPG = 스트렙토마이세스 그리세우스 글루탐산 특이적 프로테아제.
1SGP = 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테이나제 B
1SGT = 스트렙토마이세스 그리세우스 균주 K1 트립신
1TAL = 리소박터 엔자이모게네스 알파-용균성 프로테아제
2SFA = 스트렙토마이세스 프라디애 세린 프로테이나제
2SGA = 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 A
실시예 20
ASP 활성 부위에 대한 효소 기질 모델링 (modeling) 및 매핑
이 실시예에서는, ASP 활성 부위에 대한 효소-기질 모델링 및 매핑 방법이 기술된다. 상기 활성 부위에 대한 예비 조사로, Trp, Tyr 및 Phe 측쇄 등의 큰 소수성 기를 수용하기에 충분히 큰 P1 결합 포켓이 드러났다.
오보뮤코이드 (ovomucoid) 저해제 (pdb 코드 2SGB) 의 칠면조 제 3 도메인을 가진 스트렙토그리신 A 의 결정 구조가 결정되었다. MOE (Chemical Computing Corp) 를 사용하여 SGB 를 ASP 에 대하여 구조적으로 정렬하였는데, 상기 MOE 는 상기 저해제를 ASP 의 활성 부위에 위치시킨다. S4 내지 S2' 결합 부위에서의 결합에 대응되는, ASP 활성 부위에서 결합된 헥사-펩티드를 정의하는 것들을 제외하고는 2SGB 좌표들을 모두 제거하였다. 상기 전구-ASP 단백질은 상기 전구 도메인-성숙 도메인 연결부를 자가-절단하여, 성숙한 프로테아제 효소를 방출한다. 상기 전구 도메인의 마지막 4 개 잔기들이 상기 S1 ~ S4 부위들을 점유하는 것으로 예상되며, 상기 성숙한 프로테아제의 처음 2 개 잔기들은 S1' 및 S2' 부위를 점유한다. 따라서 상기 활성 부위 내 헥사펩티드는 서열 PRTMFD (서열번호: 630) 로 컴퓨터로 가상 변이되었다.
초기 기질 결합된 모델의 구조에 대한 조사로부터는, Gly135 및 Asp136 아미드 골격이 옥시-음이온 구멍을 형성할 것으로 예측되었다. 그러나, Gly135 의 아미드 질소는 그릇된 방향을 향하고 있는 것으로 보인다. 스트렙토그리신 A 와의 비교는 이를 확증한다. 따라서, ASP 에서 입체배위 변화에는 상기 옥시-음이온 구멍을 형성하는 것이 필요하리라 추정된다. 그러나, 본 발명을 임의의 특정 기작 또는 가설에 제한하려는 의도는 없다. 잔기 134 및 135 간의 펩티드 골격은, 스트렙토그리신 A 구조 내의 구조적으로 등가인 원자들의 것과 유사한 배향의 것으로 변경되었다. 상기 효소 기질 모델은 그 후 에너지가 최소화되었다.
QUANTA 프로그램 내의 근접성 툴을 사용하여 상기 모델링된 기질의 6 Å 내에 있는 잔기들을 결정하였다. 이들 잔기들은 하기로 동정되었다: Arg14, Ser15, Arg16, Cys17, His32, Cys33, Phe52, Asp56, Thr100, Val115, Thr116, Tyr117, Pro118, Glu119, Ala132, Glu133, Pro134, Gly135, Asp136, Ser137, Thr151, Ser152, Gly153, Gly154, Ser155, Gly156, Asn157, Thr164, Phe165. 이들 중, His 32, Asp56 및 Ser137 은 3 작용기 촉매를 형성한다.
상기 P1 포켓은 Cys131, Ala132, Glu133, Pro134, Gly135, Thr151, Ser152, Gly153, Gly154, Ser155, Gly156, Asn157 및 Gly 162, Thr 163, Thr164 로 형성된다. P2 포켓은 Phe52, Tyr117, Pro118 및 Glu119 로 정의된다. P3 포켓은 Gly 154 에서부터 기질 주쇄까지 주쇄 대 주쇄 수소결합을 가진다. 상기 P1' 포켓은 Arg16 및 His32 로 정의된다. 상기 P2' 포켓은 Thr100 및 Pro134 로 정의된다. 모델링된 옥타펩티드 기질을 이용한 원자 좌표는 하기 표 20-1 에 제시되어 있다.
Figure 112006042880563-PCT00180
Figure 112006042880563-PCT00181
Figure 112006042880563-PCT00182
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Figure 112006042880563-PCT00196
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실시예 21
ASP 의 산화적 안정성
이 실시예는 ASP 프로테아제 및 변이 프로테아제들의 산화적 안정성을 측정하기 위해 수행된 실험들을 기술한다. 셀룰로모나스 69B4 프로테아제의 산화에 대한 저항성을 하기 프로테아제들과 비교하였다: BPN'-변형 프로테아제 (BPN'-변형 1; Genencor; 이 효소에 대한 설명을 위하여는 RE 34,606 [참조로서 본원에 포함됨] 참조); GG36 변형 프로테아제 (GG36-변형체 1; Genencor; 예컨대, 미국 특허 제 5,955,340 호 및 제 5,700,676 호 참조; 이들은 참조로서 본원에 포함됨); 및 PURAFECT 프로테아제 (Genencor).
상기 프로테아제의 시료를 0.1 M H2O2 를 함유한 pH 9.45 의 0.1 M H2O2. A 2.0 ㎖ 부피의 0.1 M 붕산염 완충액 (45.4 gm NaB4O7 10 H2O) 과 함께 인큐베이션하여 상기 검정을 수행하고, 100 ppm 프로테아제를 25 ℃ 에서 20 분간 인큐베이션하고 효소 활성에 대해 검정을 실시하였다.
효소 활성은 하기와 같이 측정하였다: 50 ㎕ 의 인큐베이션 혼합물을 pH 8.6 의 0.1 M Tris 완충액 950 ㎕ 와 혼합하고, 시료 10 ㎕ 를 취하여 0.1 M Tris / 0.005% TWEEN® 중의 진한 1 ㎎/㎖의 AAPF 기질 용액 990 ㎕, pH 8.6 에 첨가하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다. 이들 프로테아제들에 대하여 수득된 결과는 도 31에 제시되어 있다. 이 그래프에서 나타난 바와 같이, 프로테아제 69B4 는 서브틸리신 프로테아제들에 비하여 산화적 환경하에서 크게 향상된 안정성을 보였다.
실시예 22
ASP 의 킬레이트 안정성
이 실시예에서는, ASP 의 킬레이트 안정성을 측정하는 실험들이 기술된다. 69B4 프로테아제의 분취량을 50 mM Tris 중의 10 mM EDTA, pH 8.2 와 함께 인큐베이션하여 상기 효소의 킬레이트제의 존재에 대한 저항성을 검정하였다. 실시예 21 에서 사용된 바와 동일한 효소 제조물을 이 실험들에서 사용하였다.
구체적으로, 10 mM EDTA 및 100 ppm 프로테아제를 함유한 2.0 ㎖ 양의 50 mM Tris 완충액, pH 8.2 을 45 ℃ 에서 100 분간 인큐베이션하고, 하기와 같이 효소 활성에 대한 검정을 실시하였다: 상기 인큐베이션 혼합물 50 ㎕ 를 950 ㎕ 0.1 M Tris 완충액, pH 8.6 과 혼합하고, 시료 10 ㎕ 를 취하여 0.1 M Tris / 0.005% TWEEN® 중의 진한 1 ㎎/㎖ AAPF 기질 용액 990 ㎕, pH 8.6 에 첨가하였다.
p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다. 이들 4 개 프로테아제들에 대하여 수득된 결과는 도 32 에 나타내었다. 이들 결과에 의해 나타난 바와 같이, 프로테아제 69B4 는 BPN' 변형체-1, PURAFECT® 또는 GG36 변형체-1 보다 킬레이트제의 존재하에서 크게 향상된 안정성을 보였다.
실시예 23
ASP 의 열 안정성
이 실시예에서는, ASP 프로테아제의 열안정성을 측정하는데 수행된 실험들이 기술된다. 한 가지 실험 세트에서는, 69B4 프로테아제에 대하여 용액 중의 열 불활성화에 대한 저항성을 테스트하였다. 실시예 21 및 22 에서와 같이, BPN' 변형체 (BPN'-변형체-1), PURAFECT® 및 GG36 변형체 (GG36-변형체-1) 또한 테스트한 후, ASP 와 비교하였다.
100 ppm 프로테아제를 함유한 2.0 ㎖ 양의 50 mM Tris 완충액, pH 8.0 을 45 ℃ 에서 300 분간 인큐베이션하여 열 불활성화를 수행하고 하기와 같이 효소 활성에 대해 검정하였다: 50 ㎕ 의 상기 인큐베이션 혼합물을 950 ㎕ 0.1 M Tris 완충액, pH 8.6 과 혼합하고, 시료 10 ㎕ 를 취하여 0.1 M Tris / 0.005% TWEEN® 중의 진한 1 ㎎/㎖ AAPF 기질 용액 990 μL, pH 8.6 에 첨가하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다. 이들 4 개 프로테아제들에 대한 결과는 도 33 에 제시되어 있다. 이들 결과로 나타난 바와 같이, 프로테아제 69B4 는 BPN' 변형체, PURAFECT® 또는 GG36 변형체보다 섭씨 45 도에서 향상된 또는 상당한 열 안정성을 보였다.
상기 실험들 외에, ASP 의 열안정성을 측정하는 또 다른 방법 역시 테스트되었다. 이 실험들에서, 57 °~ 62 ℃ 의 온도 구배가 사용되었다. 1 mM CaCl2 및 5 ppm 프로테아제를 함유한 180 ㎕ 부피의 100 mM Tris 완충액, pH 8.6 을 60 분간 인큐베이션하여 열 불활성화 (열 순환기 - MTP 플레이트 DNA Engine Tetad 사용; MJ Research) 를 수행하고, 하기와 같이 효소 활성에 대한 검정을 실시하였다: 10 ㎕ 를 취하여 0.1 M Tris / 0.005% TWEEN® 중의 진한 1 ㎎/㎖ AAPF 기질 용액 190 ㎕, pH 8.6 에 첨가하였다. p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm 에서의 흡광도 증가율을 모니터하였다(25 ℃ 에서). 4 개 프로테아제들에 대한 결과는 도 34 에 제시되어 있다.
실시예 24
DMC 기질 상에서의 ASP 프로테아제의 pH 프로필
이 실시예에서는, ASP 프로테아제의 pH 프로필을 결정하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 본원에 기술된 방법들로 단리 및 정제된 본 발명의 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 및 실시예 21 ~ 23 에 기술된 현재 사용되는 3 개의 서브틸리신 프로테아제들 (PURAFECT®, BPN' 변형체-1, GG36-변형체-1) 에 대하여, 4 내지 12 의 pH 범위에서 시판되는 합성 기질인 디-메틸 카제인 ("DMC"/ Sigma C-9801) 을 가수분해하는 능력을 분석하였다.
실험 섹션의 시작부에 기술된 DMC 방법을 하기 나타낸 바와 같은 변형을 가하여 사용하였다. 간단히 말해, 적절한 완충액 (5 ㎎/㎖ DMC, 0.005% (w/w) TWEEN-80® (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올리에이트, Sigma P-1754)) 중의 5 ㎎/㎖ DMC 기질 용액을 제조하였다. 상기 적절한 DMC 완충액은 하기와 같이 구성되었다: pH 4 및 5 용 40 mM MES ; pH 6 및 7 용 40 mM HEPES , pH 8 및 9 용 40 mM TRIS ; 및 pH 10, 11 및 12 용 40 mM 탄산염.
상기 측정을 위하여, 각 pH-기질 용액 180 ㎕ 씩을 96 웰 마이크로티터 플레이트 내로 옮기고, 효소 첨가 전에 37 ℃ 에서 20 분간 예비-인큐베이션하였다. 이들 효소 용액들을 약 25 ppm 및 20 ㎕ 함유한 각 효소 용액들 (BPN'-변형체-1; GG36-변형체-1; PURAFECT® 및 69B4 프로테아제) 을 제조하였다. 이들 효소 용액들을 상기 기질 함유 웰들 내로 피펫팅하여 각 웰 중 최종 효소 농도가 2.5 ppm 이 되게 하였다. 효소-기질 혼합물이 담긴 96 웰 플레이트를 IKS-Multitron 인큐베이터/진탕기로 37 ℃ 및 300 rpm 에서 1 시간동안 인큐베이션하였다.
2,4,6-트리니트로벤젠 술포네이트 ("TNBS") 발색 반응 방법을 사용하여 DMC 기질로부터의 펩티드 및 아미노산 방출량을 측정하였다. (펩티드 및 아미노산의) 유리 아미노기는 2,4,6-트리니트로-벤젠 술폰산과 반응하여 황색 착물을 형성한다. SpectraMax 250 MTP 판독기로 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.
TNBS 검정을 하기와 같이 수행하였다. 시약 완충액 (1000 ㎖ 중 가열로 용해된 2.4 g NaOH, 45.4 g Na2B4O7.10H2O) 중에서 TNBS 의 1 ㎎/㎖ 용액 (5% 2,4,6 트리니트로벤젠 술폰산/Sigma-P2297) 을 제조하였다. 그 후, 웰 당 60 ㎕ 를 96-웰 플레이트 내로 분취하고, 상기 기술한 인큐베이션 혼합물 10 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 20 분간 혼합하였다. 그 후, 200 ㎕ 의 시약 B (2000 ㎖ 중 70.4 g NaH2PO4ㆍH2O 및 1.2 g Na2SO3) 를 각 웰에 첨가하고 혼합하여 반응을 중지시켰다. SpectraMax 250 MTP 판독기로 405 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값을 바닥값에 대하여 보정하였다(효소 부재). 표 24-1 의 자료는 공지된 변이 변형체들 (BPN' 변형체-1 및 GG36 변형체-1) 로부터의 프로테아제들 대 69B4 프로테아제의, 상기 기질을 가수분해하는 능력을 비교한 것을 보여준다.
또한, 도 35 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세린 프로테아제는 7 내지 12 의 넓은 pH 범위에 걸쳐 최적의 DMC-가수분해 활성을 가져 DMC 기질에 대하여 상당한 또는 증가된 가수분해를 보였다.
Figure 112006042880563-PCT00199
실시예 25
ASP 프로테아제의 pH 안정성
이 실시예에서는, ASP 프로테아제의 pH 안정성을 측정하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 실시예 21 ~ 24 에서와 같이, 2 개의 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제 (PURAFECT® 및 BPN'-변형체-1) 또한 테스트하였다.
pH 3, 4, 5 및 6 의 0.1 M 시트르산 완충액 중에 90 ppm 프로테아제를 함유한 각 효소 용액들 (즉, BPN'-변형체-1, PURAFECT® 및 69B4 프로테아제) 을 제조하였다. 그 후, 완충된 효소 용액 1 ㎖ 가 담긴 10 ㎖ 튜브들을 각각 25 ℃, 35 ℃ 및 45 ℃ 로 설정된 GFL 1083 수조에 60 분간 두었다. 각 효소 시료에 대하여 0 및 60 분에 상기 기술한 바와 같이 AAPF 활성을 측정하였다. 잔류 효소 활성을 계산하고, 그 결과를 하기 표 25-1 에 제시하였고, 이를 도 25 ~ 28 에 나타내었다.
표 25-1 의 자료에 의해 나타난 바와 같이, 상기 ASP 프로테아제는, BPN' 변형체-1 및 PURAFECT® 과 비교시, 25 ℃ 내지 45 ℃ 의 온도에서 pH 3, 4, 5 및 6 에서 특별히 안정하다.
Figure 112006042880563-PCT00200
실시예 26
ASP 의 안정성 및 특이성
이 실시예에서는, ASP, ASP 변이체들 및 FNA 간의 안정성 및 특이성 차이를 측정하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 이 실험들은, 액체 TIDE® 세제 (Procter & Gamble) 를 포름산 칼슘 (음이온성 계면활성제 적정액 (titrant)), 붕산염 (P1 결합제/저해제) 및 글리세롤 (물 배열) 과 서로 독립적으로 또는 조합하여 제형화하여 수행하였다. 상기 효소를 이들 조건하에서 테스트하고, 고정된 온도에서 시간에 따른 잔류 효소 활성을 측정하였다.
상기 실험은 하기에서 더욱 상세히 기술된다. 제형화되지 않은 액체 TIDE® 세제 (즉, 효소 안정화 화학 물질이 무첨가된) 를 11 개 분취물로 나누었다. 그 후, 글리세롤, 붕사 또는 포름산 칼슘을 표 26-1 에 나타난 비율로 상기 세제 분취물에 첨가하였다.
Figure 112006042880563-PCT00201
각 분취물을 예비-가온하여 90 ℉ 가 되게 하고, FNA, ASP (야생형) 또는 ASP R18 변이체 중 하나를 프로테아제 1 리터당 대략 1 그램으로 첨가하였다. 철저히 혼합한 후, 일부를 취하여 상기 기술한 바와 같이, 합성 AAPF-pNA 기질에 대한 활성을 검정하였다. 상기 검정 후, 각 분취물을 다시 90 ℉ 오븐에 두었다. 상기 검정 과정을 시간에 따라 반복하였고, 및 T0 에서의 활성 감소를 잔류 % T0 활성으로 도표화하였다.
놀랍게도, ASP 가 FNA 와 동일한 포름산 칼슘 또는 글리세롤 의존성을 갖지 않는 것으로 나타났다. 나아가, 붕산염 (단독) 은 ASP 를 안정화하는데 가장 극적인 효과를 가진 것으로 측정되었다. 또한 안정화 화학 물질의 첨가는 야생형 ASP, 뿐 아니라 ASP R18 변이체에도 상당한 이득을 제공하는 것으로 나타났는데, 이는, 변이 부위가 상기 붕산염-활성화 부위와는 무관함을 나타낸다.
실시예 27
ASP 의 LAS 안정성
이 실시예에서는, 음이온성 계면활성제에 대한 ASP 의 안정성을 측정하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. 음이온성 계면활성제인 LAS (선형 알킬 술포네이트) 는 효소들을 불활성화시키는 것으로 공지된 HDL 세제의 구성요소이다. 사용된 방법들은 상기 기술되어 있다.
Tris HCl pH 8.6 중에 용해된 LAS 중에서 인큐베이션된 야생형 ASP 가 불활성화되는 것을 측정하였다(하기 표 27-1 참조). 추가적인 연구는, 불활성화가 신속하다는 것을 드러내었다(표 27-2 참조). LAS 가 음으로 하전된 분자이기 때문에, 양으로 하전된 ASP 의 아미노산 측쇄에 대한 LAS 의 정전기적 인력이 LAS 민감성의 원인이라는 가설이 발전하였다. 이 가설을 테스트하기 위하여, 아르기닌 잔기 (야생형 ASP 에는 리신 잔기가 없다) 를 다른 아미노산들로 변이시켰다.
이들 변이체들을 Tris HCl pH 8.6 중의 0.05%(w/v) LAS 에서 1 시간동안 인큐베이션한 결과, 모든 아르기닌 치환 변이체들이 야생형 ASP 보다 안정한 것으로 나타났다. 반대로, 역시 LAS 안정성에 대해 테스트된 비-아르기닌 치환 변이들은 야생형과 비교할 때 일반적으로 향상되지 않았다(표 27-3 참조). 이후의 다중 아르기닌 치환 변이 결과, 상기 효소가 야생형 효소보다 실질적으로 더욱 안정하고, 단일 아르기닌 치환 변이보다 더 안정한 것으로 나타났다(표 27-4 참조).
HDL 세제 중에 사용되는 또 다른 음이온성 계면활성제는 AES 이다. 야생형 ASP 는 고농도의 AES 중에서는 불안정한 것으로 나타났다(표 27-5 참조). 상기 변이 ASP R18 은 AES 중에서 야생형보다 더 안정한 것으로 나타났다(표 27-5 참조). 또한, 5% AES 에 의한 활성의 불활성화율은 ASP R18 변이체보다 야생형에서 더 높은 것으로 나타났다(표 27-6 참조). 이 결과는, ASP 의 아르기닌 잔기들의 치환이 일반적으로 음이온성 세제 중의 ASP 의 안정성을 향상시키는 것을 확증한다. 본 발명을 임의의 특이적 음이온성 세제 또는 변이들에 제한하려는 의도는 없다. 실제로는, 다양한 ASP 변이체들처럼 다양한 음이온성 세제들 (및 기타 세제들) 이 본 발명에 사용되리라 고려된다.
Tris HCl pH 8.6 중 LAS 에 의한 ASP 의 불활성화
%LAS (w/v) % 대조군 활성
대조군 (0 LAS) 100
0.01 87
0.03 77
0.06 59
0.10 47
0.30 31
0.60 20
1.00 12
Figure 112006042880563-PCT00202
Figure 112006042880563-PCT00203
Figure 112006042880563-PCT00204
이 표에서,
R-1=R16Q/R35F/R159Q
R-2=R159Q
R-3=R16Q/R123L
R-7=R14L/R127Q/R159Q
R-10B=R14L/R179Q
R-18=R123L/R127Q/R179Q.
R-21=R16Q/R79T/R127Q
R-23=R16Q/R79T
Tris HCl pH 8.6 중의 AES 에 의한 ASP 및 ASP 변이체 R-18 의 불활성화
0% AES 대조군의 % 잔류 활성
% AES (v/w) 야생형 ASP ASP R-18
0 100 100
1 70 94
5 32 57
Tris HCl pH 8.6 중의 5% AES 에 의한 ASP 및 변이체 R-18 의 불활성화에 대한 시간추이
0% AES 대조군의 % 잔류 활성
시간 (분) 야생형 ASP ASP R-128
0 100 100
90 99 105
4020 15 83
실시예 28
LAS 세제의 존재 및 부재하의 ASP 자가융해 부위 측정
이 실시예에서는, LAS 의 존재 및 부재하에서의 ASP 자가융해를 측정하기 위해 수행된 실험들이 기술된다. LAS (도데실벤젠-술폰산) 를 함유한 및 함유하지 않은 완충액 중에서 ASP 자가융해를 평가하였다. 자가융해 펩티드 지정은 각 펩티드의 분자량 및 서열 (각각 MS 및 MS/MS 자료로부터) 을 기준으로 만들어졌다.
ASP (0.35 ㎍/μL 의 농도) 를, 0.1 % LAS (도데실벤젠-술폰산) 을 함유한 및 함유하지 않은 100mM Tris pH 8.6 중에서 (4 ℃ 에서) 인큐베이션하였다. 0 내지 30 분의 인큐베이션 기간에 분취물을 취하고, TFA (최종 농도 1%) 를 첨가하여 자가융해를 종결시켰다. 분취물들 (10 μL) 을 전자분무 텐덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS/MS) 이 결합된 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 역상 컬럼 (Vydac C4, 0.3mmID x 150mm) 및 5 μL/분의 유속 (펌프 유속 250 μL/분으로부터의 정적 분할을 사용하여 생성) 으로의 60 분 중의 0 내지 100% 용매 B (아세토니트릴 중 0.1 % 포름산) 구배를 사용한 HPLC 시스템 (모델 1100, Agilent Technologies) 을 사용하여 펩티드들을 분석하였다. 용매는 수 중의 0.1% 포름산으로 이루어졌고; 용매 B 는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다.
이온 포집 질량 분석기 (모델 LCQ Classic, Thermo) 를 사용하여 질량 스펙트럼을 획득하였다. 상기 질량 분석기를 785 의 m/z 의 최적 검출로 조정하고, 스프레이 전압 2.5kV 로 가동시킨 후, 모세관을 250 ℃ 에서 가열하였다. 주입 시간 500 msec 및 5 개 미세스캔 (microscan) 으로 질량 스펙트럼을 획득하였다. 자료-의존 모드에서 텐덤 MS 스펙트럼을 수득하였는데, 최고 강도의 피크는 35% 의 표준화된 충돌 에너지로 선택 및 절편화되었다. 상대적인 펩티드 정량을 위해서, 공급자 소프트웨어 (vendor software) 를 사용하여 피크 면적을 측정하였다. ASP 서열을 포함한 데이터베이스를 대상으로 가동되는 데이터베이스 검색 프로그램 (TurboSequest, Thermo) 을 사용하여 상기 자가융해 펩티드들의 동일성을 결정하였다. 효소 선택 없이, 임계 10000, dta 파일 매개변수 (펩티드 m/z 오차 1.7, 그룹 11, 최소 이온수 15) 및 데이터베이스 매개변수 (펩티드 오차 2.2, MS/MS 이온 오차 0.0, B,Y 이온 모두) 를 가지고 데이터베이스 검색을 수행하였다.
시료 완충액 중에 LAS 가 없는 상태에서, ASP 의 절단은 상기 분자의 말단 및 가운데에서 주로 관찰되었다(Y9, F47, Y59, F165, Q174, Y176 위치; 하기 표 28-1 참조). 관찰된 펩티드 및 무손상의 ASP 에 대한 상대적인 정량 자료를 상기 실험의 추이에 대해 도표화하였다(도 25, 패널 A 참조). 상기 ASP 의 대다수는 손상되지 않은 채로 남아있었고, 1% 만이 절단된 펩티드 형태로 존재하였다(단백질:펩티드 비 99:1). 이 자료는, 대다수의 ASP 가 추가적인 자가융해성 절단에 대한 저항성을 가진 상태로 무손상의 접힌 상태로 잔존한다는 것을 나타내었다.
시료 완충액 중에 0.1% LAS 이 존재하는 경우, ASP 단백질 전체적으로 절단이 관찰되었다(Y9, T40, F47, Y57, F59, R61, L69, F165, Q174, Y176 위치). 상기 ASP 의 대부분은 10 분 후 펩티드 형태로 존재하였다(도 25, 패널 B 참조). 60 분 후에, 상기 단백질:펩티드 비는 < 1:99 이었다. 이 자료는, LAS 세제의 존재하에서 ASP 가 전적으로 풀린 (unfolded) 상태가 된 것을 나타내고, 따라서 상기 서열 전체적으로 광범위한 절단이 관찰되었다. 상기 2 개 조건하에서 관찰된 자가융해 절단 부위는 하기 표에 요약되어 있다. 이 표에서, 상기 기간 전ㆍ후의 아미노산은 상기 자가융해 펩티드 직전 및 직후의 아미노산이다. 상기 기간들 사이의 서열은 관찰된 자가융해 펩티드들의 서열을 나타낸다.
Figure 112006042880563-PCT00205
실시예 29
LAS-유도된 ASP 분해를 감소시키는 가역적 저해제의 사용
이 실시예에서는, LAS-유도된 ASP 분해를 감소시키는 가역적 저해제의 사용을 평가하기 위하여 수행된 실험들이 기술된다. 벤즈아미딘 (BZA) 은 세린 프로테아제들에 대한 가역적 저해제로 공지되어 있다. 상기 기술된 바와 같은 표준 succ-AAPF-pNA 검정을 사용한 결과, 하기 표 29-1 에 나타난 바와 같이 BZA 가 대략 2 ㎍/㎖ ASP 의 활성을 저해하며 1000mM (1M) 에서 저해가 완료되는 것으로 나타났다:
ASP 에 대한 저해
BZA 농도 mM 검정율 (assay rate)
0 0.83
1 0.85
10 0.82
100 0.42
1000 0.02
그 후 대략 200 ㎍/㎖ ASP 를, 4 일 이하로 1M BZA 와 함께 또는 이것 없이 및 0.1% LAS 와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 시료 10 ㎕ 를 990 ㎕ 의 검정 용액에 첨가하여 상이한 시점들에서 효소 활성을 측정하였다. 이는 상기 BZA 농도를 10mM 로 감소시키는데, 상기 표를 참조하면 이는 저해성을 나타내는 양이 아니다. 따라서, 임의의 활성 손실은 효소 분해에 기인한 것일 것이다. 하기 결과에 나타난 바와 같이, BZA 없이 0.1% LAS 와 함께 인큐베이션된 효소는 모든 활성을 소실한 반면(즉, 이는 분해되었음), 0.1% LAS 및 1M BZA 와 함께 인큐베이션된 효소는 4 일간의 상기 연구의 시간 추이에 걸쳐 활성을 보유하였는데, 이는 ASP 활성 저해가 LAS 에 의한 분해를 방지한다는 것을 증명한다.
BZA 존재/부재하 및 0.1% LAS 와 함께 인큐베이션된 효소에 대한 검정율 결과
시간 ASP+0.1%LAS ASP+0.1%LAS+1M BZA
30 초 0.755 0.761
30 분 0.685 0.781
18 시간 0.067 0.761
4 일 0.004 0.853
실시예 30
변이체 ASP 에 대한 테스트
상기 기술된 테스트에 더하여, ASP 의 다양한 변이체에 대한 테스트를 수행하였다. 상기 실시예 1 에서 기술된 방법들을 사용하였다. 하기 표들에서, "변이 코드" 는 야생형 아미노산, 아미노산 서열 중의 위치 및 치환된 아미노산 (즉, "F001A" 는 아미노산 서열 중 위치 1 에서의 페닐알라닌이 이 특정 변이체에서 알라닌으로 치환된 것을 나타낸다).
케라틴 가수분해
하기 표 (표 30-1) 는 상기 기술된 케라틴 검정 ("마이크로티터 플레이트에서 케라틴을 이용한 프로테아제 검정") 에서 이 기질에 대한 활성을 보이는 ASP 변형체들에 대하여 수득한 케라틴 가수분해 자료를 제공한다. 이 값들은 야생형 (WT) 에 관련된 것으로, 상기 검정 절차에서 기술된 바와 같이 계산된다. 1 초과의 값은 WT ASP 보다 더 우수한 활성을 나타내는 것이다.
Figure 112006042880563-PCT00206
Figure 112006042880563-PCT00207
Figure 112006042880563-PCT00208
Figure 112006042880563-PCT00209
DMC 검정
하기 표 (표 30-2) 는 카제인에 대한 특이적 활성이 향상된 변형체들을 제공한다. 모든 변형체들에 대하여 상기 기술된 바와 같이 기질로서의 카제인에 대한 활성을 측정하였다("활성 및 열안정성 검정을 위한 프로테아제의 예열 수행과 함께 또는 예열 없이 디메틸카제인을 이용한 프로테아제 검정(96 웰)"). 하기 표의 값들은 WT 효소의 활성과 비교한 각 변형체의 상대치를 제공한다(즉, 각 값은 (변형체 활성)/(야생형 활성) 의 몫이다). 1을 초과하는 값을 가진 모든 변형체는 WT 보다 우수한 것이다.
Figure 112006042880563-PCT00210
Figure 112006042880563-PCT00211
Figure 112006042880563-PCT00212
Figure 112006042880563-PCT00213
열안정성 검정
하기 표 (표 30-3) 중의 자료는 이들 조건 하에서의 WT ASP 안정성에 대한 ASP 변형체들의 상대적인 열안정성 자료를 제공한다. 상기 안정성은 증가된 온도에서의 인큐베이션 전ㆍ후의 카제인 활성을 결정함으로써 측정되었다(상기 "열안정성 검정" 참조). 하기 표는 이들 조건 하에서 WT 와 비교한 상대적인 열안정성 수치를 포함한다. 이는 (변이체 잔류 활성/WT 잔류 활성)의 몫이다. 1 초과의 값은 더 높은 열안정성을 나타낸다.
Figure 112006042880563-PCT00214
Figure 112006042880563-PCT00215
Figure 112006042880563-PCT00216
Figure 112006042880563-PCT00217
BMI-LVJ 1 성능 검정
하기 표 (표 30-4) 는 BMI-LVJ 1 성능 검정에서 선별된 변형체들에 대하여 수득된 자료를 제공한다("프로테아제 성능을 테스트하기 위한 마이크로스와치 검정" 참조). 하기 표는 성능 지수를 보여주는데, 이는 상기 변형체들에 대하여 상기 기술된 바와 같이 계산되었으며, 상기 변형체들은 WT 효소와 비교시 향상된 성능을 보인다. 성능 지수가 1 을 초과하는 변형체들은 향상된 성능을 가진다.
Figure 112006042880563-PCT00219
Figure 112006042880563-PCT00220
Figure 112006042880563-PCT00221
BMI-낮은 pH 성능 검정
하기 표 (표 30-5) 는, TIDE® 를 사용한 낮은 pH 조건 하에서의 마이크로스와치 검정에서 이 기질에 대한 활성을 나타내는 ASP 변형체들에 대하여 수득한 자료를 제공한다(프로테아제 성능을 테스트하기 위한 마이크로스와치 검정 참조). 하기 표는 성능 지수를 제공하는데, 이는 WT 효소와 비교시 향상된 성능을 보이는 변형체들에 대하여 상기 기술된 바와 같이 계산되었다. 성능 지수가 1 을 초과하는 변형체들은 향상된 성능을 가진 것이다.
Figure 112006042880563-PCT00222
Figure 112006042880563-PCT00223
Figure 112006042880563-PCT00224
Figure 112006042880563-PCT00225
스크램블 에그 검정 (ADW) 성능
하기 표 (표 30-6) 는, 세제 조성물 I 을 사용한 스크램블 에그 성능 검정에서 선택된 변형체들에 대하여 수득한 자료를 제공한다("스크램블 에그 검정"). 하기 표는 성능 지수를 제공하는데, 이는 WT 효소와 비교시 향상된 성능을 보이는 변형체들에 대하여 상기 기술된 바와 같이 계산되었다. 성능 지수가 1 을 초과하는 변형체들은 향상된 성능을 가진 것이다.
Figure 112006042880563-PCT00226
Figure 112006042880563-PCT00227
Figure 112006042880563-PCT00228
Las 안정성
하기 표 (표 30-7) 는 WT-ASP 와 비교시 향상된 안정성을 가지는 모든 변형체들을 나타낸다. 모든 변형체들을 테스트하였고, 계산치는 상기 보여진 프로토콜에 따라 결정되었다("LAS 안정성 검정" 참조). 하기 표는 상기 변형체들에 대한 인큐베이션 후의 잔류 활성을 제공한다. 이들 조건 하에서, WT 값의 평균은 10.59% 의 잔류 활성으로 나타났다. 더 높은 활성을 가진 모든 변형체들은 WT 분자에 대하여 향상된 것이다.
Figure 112006042880563-PCT00229
Figure 112006042880563-PCT00230
Figure 112006042880563-PCT00231
Figure 112006042880563-PCT00232
실시예 31
ASP 세정 활성 측정
이 실시예에서는, 다양한 조건 하에서의 ASP 의 세정 활성, 뿐 아니라 다양한 세척 조건들의 특성을 측정하기 위해 수행된 실험들이 기술된다.
다양한 세제 제형물, 세척수 부피, 세척수 온도 및 세척 시간의 길이를 포함하는 광범위한 세척 조건들이 있다. 따라서, 프로테아제 등의 세제 구성요소들은 불리한 환경적 조건하에서 견디고 기능할 수 있어야 한다. 예를 들어, 상이한 지역들에서 사용하는 세제 제형물들은 세척수 중에 존재하는 관련 구성요소들의 농도가 상이하다. 예를 들어, 유럽의 세제는 세척수 중에 전형적으로 약 3000 ~ 8000 ppm 의 세제 구성요소를 가지는 반면, 일본의 세제는 세척수 중에 전형적으로 800 미만 (예컨대, 667 ppm) 의 세제 구성요소를 가진다. 북아메리카, 특히 미국에서의 세제는 전형적으로 세척수 중에 약 800 내지 2000 (예컨대, 975 ppm) 의 세제 구성요소들이 존재한다.
라틴 아메리카의 세제들은 일반적으로 고 거품의 인산염 세척력 증강제 세제들이며, 라틴 아메리카에서 사용되는 세제는 세척수 중 세제 구성요소들을 1500 ppm 내지 6000 ppm 범위로 포함하므로 이들 세제의 범위는 중간 및 고 세제 농도 둘 다에 속할 수 있다. 브라질의 세제들은 세척수 중에 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 구성요소들이 존재한다. 그러나, 기타 라틴 아메리카 국가들에 한정되지 않는 기타 고 거품 인산염 세척력 증강제 세제 지역들은, 세척수 중에 약 6000 ppm 까지의 세제 구성요소들이 존재하는 고 세제 농도 시스템을 가질 수 있다.
상기의 관점에서, 전세계적으로 전형적인 세척 용액 중의 세제 조성물의 농도는, 예를 들어 일본에서의 약 667 ppm 등의 약 800 ppm 미만의 세제 조성물 ("저 세제 농도 지역") 부터, 예를 들어 미국의 약 975 ppm 및 브라질의 약 1500 ppm 등의 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm ("중 세제 농도 지역"), 예를 들어 유럽의 약 3000 ppm 내지 약 8000 ppm 및 고 거품의 인산염 세척력 증강제 지역들의 약 6000 ppm 등의 약 2000 ppm 초과 ("고 세제 농도 지역") 까지 다양하다는 것이 명백하다.
상기 전형적인 세척 용액의 농도는 경험적으로 결정된다. 예를 들어, 미국에서, 전형적인 세탁기는 약 64.4 L 부피의 세척 용액을 담는다. 따라서, 상기 세척 용액 중에 약 975 ppm 의 세제 농도를 수득하기 위해서는, 상기 64.4 L 의 세척 용액에 약 62.79 g 의 세제 조성물을 첨가하여야 한다. 이 양은 소비자가 세제와 함께 제공되는 계량컵을 사용하여 상기 세척수 내로 측량하는 전형적인 양이다.
추가적인 예로서, 상이한 지역들은 상이한 세척 온도를 이용한다. 일본에서 세척수의 온도는 전형적으로 유럽에서 사용되는 것보다 낮다. 예를 들어, 북아메리카 및 일본에서의 세척수의 온도는 10 내지 30 ℃ (예컨대, 약 20 ℃) 인 반면, 유럽에서의 세척수의 온도는 전형적으로 30 내지 50 ℃ (예컨대, 약 40 ℃) 이다.
추가적인 예로서, 상이한 지역들에서는 물의 경도도 상이할 수 있다. 물의 경도는 전형적으로 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 그레인으로 기술된다. 경도는 수 중에 존재하는 칼슘 (Ca2+) 및 마그네슘 (Mg2+) 의 양의 척도이다. 미국에서 대부분의 물은 경수이나, 경도의 정도는 지역마다 다르다. 중경수 (60-120 ppm) 내지 경수 (121-181 ppm) 는 60 내지 181 백만분율 (즉, 백만분율을 U.S. 갤런당 그레인으로 환산하자면 ppm # 을 17.1 로 나눈 것이 갤런 당 그레인과 같다) 의 경질 광물을 가진다. 표 31-1 은 물의 경도의 범위를 제공한다.
물의 경도 범위
물 갤런 당 그레인 백만분율
연수 1.0 미만 17 미만
약경수 1.0 내지 3.5 17 내지 60
중경수 3.5 내지 7.0 60 내지 120
경수 7.0 내지 10.5 120 내지 180
고경수 10.5 초과 180 초과
유럽의 물의 경도는 전형적으로 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 10.5 초과 (예컨대 10.5 ~ 20.0) 그레인 (예컨대, 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 약 15 그레인) 이다. 북아메리카의 물의 경도는 전형적으로 일본의 물의 경도보다 크나, 유럽의 물의 경도보다는 작다. 예를 들어, 북아메리카의 물의 경도는 3 내지 10 그레인, 3 ~ 8 그레인 또는 약 6 그레인일 수 있다. 일본의 물의 경도는 전형적으로 북아메리카 물의 경도보다 작은데, 보통 4 미만, 예를 들어 혼합 Ca2+/Mg2+ 갤런 당 3 그레인이다.
본 발명은 하나 이상의 세트의 세척 조건들 및 전형적으로 다중의 세척 조건들에서 향상된 세척 성능을 제공하는 프로테아제 변형체들을 제공한다.
본원에 기술된 바와 같이, 마이크로스와치 검정 (상기, 및 미국 특허출원 일련번호 제 09/554,992 호; 및 WO 99/34011 참조; 둘 다 참조로서 본원에 포함됨) 을 사용하여 상기 프로테아제 변형체들의 상이한 유형의 세제 및 세척 조건에서의 성능을 테스트한다. 프로테아제 변형체들을 기타 토양 기질들에 대해서도 유사한 방식으로 테스트한다.
ASP 의 세정 활성을 측정하기 위해 수행된 실험들에서는, 하기 방법들을 사용하였다. 인큐베이터 (Innova 4330 Model 인큐베이터, New Brunswick) 를 60 분간 예열하여 "유럽의" 조건을 위해서는 40 ℃ 및 "일본의" 조건을 위해서는 20 ℃ 가 되게 하였다. Swiss Federal Laboratories for Material Testing 및 CFT Research 로부터 혈액-우유-잉크 천 조각 (EMPA 116) 들을 수득하고, 60 ℃ 에서 30 분간 0.03 % 과산화수소에 노출시켜 변형시킨 후, 건조시켰다. 상기 건조된 천 조각들에서 직경 1/4" 의 원들을 자르고 이들을 96 웰 마이크로플레이트에 웰당 하나씩 수직으로 세워놓았다.
ASP 의 프로테아제 시료들을 10 mM NaCl, 0.005% TWEEN®-80 중에 희석하여 목적하는 10 ppm 의 농도(단백질)를 수득하였다. "북아메리카의 세척 조건"을 생성하기 위하여, 리터당 1 그램의 표백제 없는 TIDE® 세탁 세제 (Procter & Gamble) 를 탈이온수 중에서 준비하고, 칼슘 및 마그네슘의 농축 스탁을 첨가하여 최종 물의 경도 값이 갤런 당 6 그레인이 되도록 하였다. "유럽의 세척 조건"을 생성하기 위하여, 리터당 7.6 그램의 표백제 없는 ARIEL® REGULAR 세탁 세제 (Procter & Gamble) 를 탈이온수 중에서 준비하고, 칼슘 및 마그네슘의 농축 스탁을 첨가하여 최종 물의 경도 값이 갤런 당 15 그레인이 되도록 하였다. "일본의 세척 조건"을 생성하기 위하여, 리터당 0.67 그램의 표백제 없는 PURE CLEAN 세탁 세제 (Procter & Gamble) 를 탈이온수 중에서 준비하고, 칼슘 및 마그네슘의 농축 스탁을 첨가하여 최종 물의 경도 값이 갤런 당 3 그레인이 되도록 하였다.
"북아메리카 세제 제형물을 가진 일본의 세척 조건"을 제공하는 또 다른 세제 조성물에서, 리터당 0.66 그램의 표백제 없는 세제 조성물 III 를 탈이온수 중에서 준비하고, 칼슘 및 마그네슘의 농축 스탁을 첨가하여 최종 물의 경도 값이 갤런 당 3 그레인이 되도록 하였다.
상기 세제 용액들을 15 분간 혼합되도록 허용하고, 그 후 0.2 미크론 셀룰로오스 아세테이트 여과기를 통해 여과하였다. 그 후, 각 세제 용액 190 ㎕ 을 마이크로플레이트의 적절한 웰들에 첨가하였다. 그 후, 상기 효소 제조물 10 ㎕ 를 상기 여과된 세제에 첨가하여, 200 ㎕ 의 총 부피에 대해 최종 농도 0.25-3.0 ppm (밀리리터당 밀리그램) 의 효소를 수득하였다. 그 후 누출 방지를 위해 상기 마이크로플레이트를 밀봉하고, 20 ℃ 및 350/400 RPM 으로 설정된 인큐베이터/진탕기 상의 홀더에 두고 1 시간동안 진탕하였다.
상기 플레이트를 그 후 상기 인큐베이터/진탕기에서 꺼내고, 각 웰에서 100 ㎕ 의 용액 분취량을 취하여 새로운 Costar 마이크로티터 플레이트 (Corning) 에 두었다. 마이크로티터 플레이트 판독기 (SpectraMax 340, Molecular Devices) 상의 각 분취물에 대하여 405 nm 에서의 흡광도 파장을 판독하고, 기록하였다. 마이크로스와치 검정에서의 세제 조성물 및 인큐베이션 조건은 표 31-2 에 개시되어 있다.
Figure 112006042880563-PCT00233
PURAFECT® (Genencor), OPTIMASETM (Genencor), RELASETM (Genencor; 상기 기술한 GG36-변형체) 및 ASP 에 대한, 농도 (웰 중의 ppm) 의 함수로서405 nm 에서의 흡광도를 나타내는 용량 반응 곡선이 도 23 ~ 27 에 제시되어 있다.
도 26 에 나타난 바와 같이, 북아메리카 조건 하에서, 액체 TIDE® 세제 중에서, ASP 프로테아제는 동일 조건들 하에서의 PURAFECT®, RELASETM 및 OPTIMASETM 프로테아제들과 비교할 때 향상된 세정 성능을 보였다. 일본의 조건 하에서, 세제 조성물 III 분말 (0.66 g/ℓ) 중에서, ASP 는 동일 조건들 하에서의 PURAFECT®, RELASETM 및 OPTIMASETM 프로테아제들과 비교할 때 향상된 또는 동일 세정 성능을 보였다(도 27 참조). 유럽의 조건들 하에서, ARIEL® REGULAR 분말 세제 중에서, 상기 ASP 프로테아제는 동일 조건들 하에서의 PURAFECT®, RELASETM 및 OPTIMASETM 프로테아제들과 비교할 때 향상된 세정 성능을 보였다(도 28 참조). 상기 두 테스트에서, ASP 및 OPTIMASETM 은 PURAFECT® 및 RELASETM 과 비교할 때 405 nm 에서의 흡광도가 2 내지 10 배인 결과를 제공하였다. 일본의 조건 하에서, PURE CLEAN 분말 세제 (도 29 참조) 중에서, 상기 ASP 프로테아제는 동일 조건들 하에서의 PURAFECT®, RELASETM 및 OPTIMASETM 프로테아제들과 비교할 때 향상된 및 상응하는 세정 성능을 보였다. 북아메리카 조건 하에서, 세제 조성물 III 분말 세제 (도 30 참조) 중에서, 상기 ASP 프로테아제는 동일 조건들 하에서의 PURAFECT®, RELASETM 및 OPTIMASETM 프로테아제들과 비교할 때 향상된 또는 상응하는 세정 성능을 보였다.
실시예 32
액체 섬유 세정 조성물
이 실시예는 본 발명과 함께 사용되는 액체 섬유 세정 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 일본의 기계 세척 조건들 하에서, 뿐 아니라 고급 (fine) 및/또는 섬세한 섬유들의 세정을 포함하는 용도에 특히 이용될 것으로 고려된다. 표 32-1 는 적당한 조성물을 제시한다. 그러나, 많은 다른 제형물들이 본 발명과 함께 사용됨에 따라, 본 발명을 이 특이적 제형물로 한정하려는 의도는 없다.
액체 섬유 세정 조성물
구성요소 양 (%)
AE2.5S 2.16
AS 3.30
N-코코일 N-메틸 글루카민 1.10
비이온성 계면활성제 10.00
시트르산 0.40
지방산 0.70
염기 0.85
모노에탄올아민 1.01
1,2-프로판디올 1.92
EtOH 0.24
HXS 2.09
프로테아제.sup.1 0.01
아밀라아제 0.06
나머지 100% 까지의 소수 물질/불활성 물질
실시예 33
액체 식기세척 조성물
이 실시예는 본 발명과 함께 사용되는 액체 식기세척 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 일본의 식기 세척 조건 하에서 특히 유용할 것으로 고려된다. 표 33-1 은 적당한 조성물들을 제시한다. 그러나, 많은 다른 제형물들이 본 발명과 함께 사용됨에 따라, 본 발명을 이 특이적 제형물로 한정하려는 의도는 없다.
액체 식기세척 조성물
구성요소 A B
AE1.4S 24.69 24.69
N-코코일 N-메틸 글루카민 3.09 3.09
아민 옥시드 2.06 2.06
베타인 (betaine) 2.06 2.06
비이온성 계면활성제 4.11 4.11
용해보조제 4.47 4.47
마그네슘 0.49 0.49
에탄올 7.2 7.2
LemonEase 0.45 0.45
제라니올(Geraniol)/BHT --- 0.60/0.02
아밀라아제 0.03 0.005
프로테아제 0.01 0.43
100% 까지의 나머지
실시예 34
액체 섬유 세정 조성물
본 발명의 프로테아제들은 특히 세정 조성물에 사용된다. 예를 들어, 일본의 기계 세척 조건하에서 특히 유용한 액체 섬유 세정 조성물이 본 발명에 따라 제조될 것으로 고려된다. 일부 바람직한 구현예들에서, 이들 조성물은 하기 표 34-1 에 나타난 구성요소들을 포함한다.
액체 섬유 세정 조성물
구성요소 양 (%)
AE2.5S 15.00
AS 5.50
N-코코일 N-메틸 글루카민 5.50
비이온성 계면활성제 4.50
시트르산 3.00
지방산 5.00
염기 0.97
모노에탄올아민 5.10
1,2-프로판디올 7.44
EtOH 5.50
HXS 1.90
붕산 3.50
에톡실화 테트라에틸렌펜타이민 3.00
SRP 0.30
프로테아제 0.069
아밀라아제 0.06
셀룰라아제 0.08
리파아제 0.18
광택제 0.10
나머지 100 % 까지의 소수 물질/불활성 물질
실시예 35
과립 섬유 세정 조성물
이 실시예에서는, 본 발명과 함께 사용되는 다양한 과립 섬유 세정 조성물이 제시된다. 하기 표들은 적당한 조성물들을 제공한다. 그러나, 많은 다른 제형물들이 본 발명과 함께 사용됨에 따라, 본 발명을 이들 특이적 제형물들에 제한하려는 의도는 없다.
과립 섬유 세정 조성물
구성요소 제형물
A B C D
프로테아제1 0.10 0.20 0.03 0.05
프로테아제2 0.2 0.15
C13 선형 알킬 벤젠 술포네이트 22.00 22.00 22.00 22.00
인산염 (소듐 트리폴리포스페이트로서) 23.00 23.00 23.00 23.00
탄산나트륨 23.00 23.00 23.00 23.00
규산나트륨 14.00 14.00 14.00 14.00
제올라이트 8.20 8.20 8.20 8.20
킬란트 (디에틸렌트리아민-펜타아세트산) 0.40 0.40 0.40 0.40
황산나트륨 5.50 5.50 5.50 5.50
물 나머지 100 % 까지
과립 섬유 세정 조성물
구성요소 제형물
A B C D
프로테아제1 0.10 0.20 0.30 0.05
프로테아제2 0.2 0.1
C12 알킬 벤젠 술포네이트 12.00 12.00 12.00 12.00
제올라이트 (1-10 마이크로미터) 26.00 26.00 26.00 26.00
C12-C14 2차 (2,3) 알킬 술페이트, Na 염 5.00 5.00 5.00 5.00
시트르산나트륨 5.00 5.00 5.00 5.00
형광증백제 0.10 0.10 0.10 0.10
황산나트륨 17.00 17.00 17.00 17.00
충진제, 물, 소수 물질 나머지 100 % 까지
하기 세탁 세제 조성물들은 유럽의 기계 세척 조건하에서 특히 유용성을 제공하는 것으로 고려된다.
과립 섬유 세정 조성물
구성요소 제형물
A B C
LAS 7.0 5.61 4.76
TAS 1.57
C45AS 6.0 2.24 3.89
C25E25 1.0 0.76 1.18
C45E7 2.0
C25E3 4.0 5.5
QAS 0.8 2.0 2.0
STPP
제올라이트 25.0 19.5 19.5
시트르산 2.0 2.0 2.0
NaSKS-6 8.0 10.6 10.6
탄산염 I 8.0 10.0 8.6
MA/AA 1.0 2.6 1.6
CMC 0.5 0.4 0.4
PB4 12.7
과탄산염 19.7
TAED 3.1 5.0
시트르산염 7.0
DTPMP 0.25 0.2 0.3
HEDP 0.3 0.3 0.3
QEA 1 0.9 1.2 1.0
프로테아제1 0.02 0.05 0.035
리파아제 0.15 0.25 0.15
셀룰라아제 0.28 0.28 0.28
아밀라아제 0.4 0.7 0.3
PVPI/PVNO 0.4 0.1
광활성화 표백제 (ppm) 15 ppm 27 ppm 27 ppm
광택제 1 0.08 0.19 0.19
광택제 2 0.04 0.04
향수 0.3 0.3 0.3
발포성 과립 (말산 40%, 중탄산나트륨 40%, 탄산나트륨 20%) 15 15 5
실리콘 소포제 0.5 2.4 2.4
나머지 100 % 까지의 소수 물질/불활성 물질 나머지 100 % 까지
실시예 36
세제 제형물
이 실시예에서는, ASP 및/또는 ASP 변형체들과 함께 사용되는 다양한 세제 제형물이 제시된다. 이 섹션에 제시된 테스트 방법들은 본 발명의 매개변수들 각각의 값을 결정하는데 사용되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
예시된 세제 조성물에서, 효소들의 수준은 전체 조성물의 중량을 기준으로 순수 효소로 표현되며, 다른 언급이 없는 한, 세제 성분들은 전체 조성물의 중량을 기준으로 표현된다. 거기에서 축약된 구성요소 명칭들은 하기 의미들을 가진다:
Figure 112006042880563-PCT00234
Figure 112006042880563-PCT00235
하기 표 (표 36-2) 는 제조되는 액체 세탁 세제 조성물을 제공한다.
Figure 112006042880563-PCT00236
하기 표 (36-3) 는 제조되는 손세척용 식기 액체 세제 조성물을 제공한다.
손세척용 식기 액체 세제 조성물
구성요소 I II III IV V VI
C 12-C15 AE1.8S 30.0 28.0 25.0 - 15.0 10.0
LAS - - - 5.0 15.0 12.0
파라핀 술포네이트 - - - 20.0 - -
C10-C18 알킬 디메틸 아민 옥시드 5.0 3.0 7.0 - - -
베타인 3.0 - 1.0 3.0 1.0 -
C12 폴리-OH 지방산 아미드 - - - 3.0 - 1.0
C14 폴리-OH 지방산 아미드 - 1.5 - - - -
C11E9 2.0 - 4.0 - - 20.0
DTPA - - - - 0.2 -
트리-시트르산나트륨 2 수화물 0.25 - - 0.7 - -
디아민 1.0 5.0 7.0 1.0 5.0 7.0
MgCl2 0.25 - - 1.0 - -
ASP 0.02 0.01 0.03 0.01 0.02 0.05
프로테아제 A - 0.01 - - - -
아밀라아제 0.001 - - 0.002 - 0.001
알도스 산화효소 0.03 - 0.02 - 0.05 -
소듐 쿠멘 술포네이트 - - - 2.0 1.5 3.0
PAAC 0.01 0.01 0.02 - - -
DETBCHD - - - 0.01 0.02 0.01
나머지 100 % 까지 향수 / 염료 및/또는 물
이들 조성물들의 pH 는 약 8 내지 약 11 이다.
표 36-4 는 제조되는 액체 자동 식기세척 세제 조성물을 제공한다.
액체 자동 식기세척 세제 조성물
구성요소 I II III IV V
STPP 16 16 18 16 16
황산칼륨 - 10 8 - 10
1,2 프로판디올 6.0 0.5 2.0 6.0 0.5
붕산 4.0 3.0 3.0 4.0 3.0
CaCl2 2 수화물 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04
비이온성 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
ASP 0.1 0.03 0.05 0.03 0.06
프로테아제 B - - - 0.01 -
아밀라아제 0.02 - 0.02 0.02 -
알도스 산화효소 - 0.15 0.02 - 0.01
갈락토오스 산화효소 - - 0.01 - 0.01
PAAC 0.01 - - 0.01 -
DETBCHD - 0.01 - - 0.01
나머지 100 % 까지 향수 / 염료 및/또는 물
표 36-5 는 제조되는, 과립 또는 정제의 형태로 제조될 수 있는 세탁 조성물을 제공한다.
세탁 조성물
기초 제품 I II III IV V
C14-C15AS 또는 TAS 8.0 5.0 3.0 3.0 3.0
LAS 8.0 - 8.0 - 7.0
C12-C15AE3S 0.5 2.0 1.0 - -
C12-C15E5 또는 E3 2.0 - 5.0 2.0 2.0
QAS - - - 1.0 1.0
제올라이트 A 20.0 18.0 11.0 - 10.0
SKS-6 (건조 부가물) - - 9.0 - -
MA/AA 2.0 2.0 2.0 - -
AA - - - - 4.0
3시트르산나트륨 2H2O - 2.0 - - -
시트르산 (무수물) 2.0 - 1.5 2.0 -
DTPA 0.2 0.2 - - -
EDDS - - 0.5 0.1 -
HEDP - - 0.2 0.1 -
PB1 3.0 4.8 - - 4.0
과탄산염 - - 3.8 5.2 -
NOBS 1.9 - - - -
NACA OBS - - 2.0 - -
TAED 0.5 2.0 2.0 5.0 1.00
BB1 0.06 - 0.34 - 0.14
BB2 - 0.14 - 0.20 -
무수 탄산나트륨 15.0 18.0 8.0 15.0 15.0
황산 5.0 12.0 2.0 17.0 3.0
규산염 - 1.0 - - 8.0
ASP 0.03 0.05 1.0 0.06 0.1
프로테아제 B - 0.01 - - -
프로테아제 C - - - 0.01 -
리파아제 - 0.008 - - -
아밀라아제 0.001 - - - 0.001
셀룰라아제 - 0.0014 - - -
펙틴 리아제 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
알도스 산화효소 0.03 - 0.05 - -
PAAC - 0.01 - - 0.05
나머지 100 % 까지 수분 및/또는 소수 물질들*
* 향수, 염료, 광택제 / SRP1 / Na 카르복시메틸셀룰로오스/ 광표백 / MgSO4 / PVPVI/ 거품 억제제 /고분자량 PEG/점토.
표 36-6 은 제조되는 액체 세탁 세제 제형물을 제공한다.
액체 세탁 세제 제형물
구성요소 I I II III IV V
LAS 11.5 11.5 9.0 - 4.0 -
C12-C15AE2.85S - - 3.0 18.0 - 16.0
C14-C15E 2.5 S 11.5 11.5 3.0 - 16.0 -
C 12-C13E9 - - 3.0 2.0 2.0 1.0
C 12-C13E7 3.2 3.2 - - - -
CFAA - - - 5.0 - 3.0
TPKFA 2.0 2.0 - 2.0 0.5 2.0
시트르산 (무수물) 3.2 3.2 0.5 1.2 2.0 1.2
Ca 포름산염 0.1 0.1 0.06 0.1 - -
Na 포름산염 0.5 0.5 0.06 0.1 0.05 0.05
Na 쿠멘 술포네이트 4.0 4.0 1.0 3.0 1.2 -
붕산염 0.6 0.6 - 3.0 2.0 3.0
수산화 Na 6.0 6.0 2.0 3.5 4.0 3.0
에탄올 2.0 2.0 1.0 4.0 4.0 3.0
1,2 프로판디올 3.0 3.0 2.0 8.0 8.0 5.0
모노-에탄올아민 3.0 3.0 1.5 1.0 2.5 1.0
TEPAE 2.0 2.0 - 1.0 1.0 1.0
ASP 0.03 0.05 0.01 0.03 0.08 0.02
프로테아제 A - - 0.01 - - -
리파아제 - - - 0.002 - -
아밀라아제 - - - - 0.002 -
셀룰라아제 - - - - - 0.0001
펙틴 리아제 0.005 0.005 - - -
알도스 산화효소 0.05 - - 0.05 - 0.02
갈락토오스 산화효소 - 0.04
PAAC 0.03 0.03 0.02 - - -
DETBCHD - - - 0.02 0.01 -
SRP 1 0.2 0.2 - 0.1 - -
DTPA - - - 0.3 - -
PVNO - - - 0.3 - 0.2
광택제 1 0.2 0.2 0.07 0.1 - -
실리콘 소포제 0.04 0.04 0.02 0.1 0.1 0.1
나머지 100 % 까지 향수/염료 및/또는 물
표 36-7 은 제조되는 조밀한 고밀도의 식기세척 세제를 제공한다.
조밀한 고밀도 식기세척 세제
구성요소 I II III IV V VI
STPP - 45.0 45.0 - - 40.0
3시트르산나트륨 2H2O 17.0 - - 50.0 40.2 -
탄산나트륨 17.5 14.0 20.0 - 8.0 33.6
중탄산염 - - - 26.0 - -
규산염 15.0 15.0 8.0 - 25.0 3.6
메타규산염 2.5 4.5 4.5 - - -
PB1 - - 4.5 - - -
PB4 - - - 5.0 - -
과탄산염 - - - - - 4.8
BB1 - 0.1 0.1 - 0.5 -
BB2 0.2 0.05 - 0.1 - 0.6
비이온성 2.0 1.5 1.5 3.0 1.9 5.9
HEDP 1.0 - - - - -
DETPMP 0.6 - - - - -
PAAC 0.03 0.05 0.02 - - -
파라핀 0.5 0.4 0.4 0.6 - -
ASP 0.072 0.053 0.053 0.026 0.059 0.01
프로테아제 B - - - - - 0.01
아밀라아제 0.012 - 0.012 - 0.021 0.006
리파아제 - 0.001 - 0.005 - -
펙틴 리아제 0.001 0.001 0.001 - - -
알도스 산화효소 0.05 0.05 0.03 0.01 0.02 0.01
BTA 0.3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3
폴리카르복실레이트 6.0 - - - 4.0 0.9
향수 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2
나머지 100 % 까지 수분 및/또는 소수 물질들*
*광택제 / 염료 / SRP1 / Na 카르복시메틸셀룰로오스/ 광표백 / MgSO4 / PVPVI/ 거품 억제제 /고분자량 PEG/점토.
상기 조성물들의 pH 는 약 9.6 내지 약 11.3 이다.
표 36-8 은 표준 12 헤드 로터리 타정기 (rotary press) 를 사용하여 13 KN/cm2 의 압력에서 과립 식기세척 세제 조성물을 압착하여 제조되는 본 발명의 정제 세제 조성물을 제공한다:
정제 세제 조성물
구성요소 I II III IV V VI VII VIII
STPP - 48.8 44.7 38.2 - 42.4 46.1 36.0
3시트르산나트륨 2H2O 20.0 - - - 35.9 - - -
탄산나트륨 20.0 5.0 14.0 15.4 8.0 23.0 20.0 28.0
규산염 15.0 14.8 15.0 12.6 23.4 2.9 4.3 4.2
리파아제 0.001 - 0.01 - 0.02 - - -
프로테아제 B 0.01 - - - - - - -
프로테아제 C - - - - - 0.01 - -
ASP 0.01 0.08 0.05 0.04 0.052 0.023 0.023 0.029
아밀라아제 0.012 0.012 0.012 - 0.015 - 0.017 0.002
펙틴 리아제 0.005 - - 0.002 - - - -
알도스 산화효소 - 0.03 - 0.02 0.02 - 0.03 -
PB1 - - 3.8 - 7.8 - - 8.5
과탄산염 6.0 - - 6.0 - 5.0 - -
BB1 0.2 - 0.5 - 0.3 0.2 - -
BB2 - 0.2 - 0.5 - - 0.1 0.2
비이온성 1.5 2.0 2.0 2.2 1.0 4.2 4.0 6.5
PAAC 0.01 0.01 0.02 - - - - -
DETBCHD - - - 0.02 0.02 - - -
TAED - - - - - 2.1 - 1.6
HEDP 1.0 - - 0.9 - 0.4 0.2 -
DETPMP 0.7 - - - - - - -
파라핀 0.4 0.5 0.5 0.5 - - 0.5 -
BTA 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 -
폴리카르복실레이트 4.0 - - - 4.9 0.6 0.8 -
PEG 400-30,000 - - - - - 2.0 - 2.0
글리세롤 - - - - - 0.4 - 0.5
향수 - - - 0.05 0.2 0.2 0.2 0.2
나머지 100 % 까지 수분 및/또는 소수 물질들*
*광택제 / SRP1 / Na 카르복시메틸셀룰로오스/ 광표백 / MgSO4 / PVPVI/ 거품 억제제 /고분자량 PEG/점토.
이들 조성물의 pH 는 약 10 내지 약 11.5 이다.
이들 조성물의 정제 중량은 약 20 그램 내지 약 30 그램이다.
표 36-9 는 제조되는 본 발명의 액상 거친 표면 세정 세제 조성물을 제공한다.
Figure 112006042880563-PCT00237
이들 조성물의 pH 는 약 7.4 내지 약 9.5 이다.
실시예 37
ASP 를 포함한 동물 사료
본 발명은 또한 ASP 및/또는 ASP 변형체들을 포함한 동물 사료 조성물을 제공한다. 이 실시예에서는, 가금류에 적당한, 사료 등의 것이 제공된다. 그러나, 본 발명의 프로테아제들이 수많은 다른 사료 제형물로서 사용되기 때문에, 본 발명을 이 특이적 제형물에 제한하려는 의도는 없다. 또한 본 발명의 사료들을 이에 제한되는 것은 아니나 가축 (예컨대, 소, 돼지, 양 등), 뿐 아니라 반려 동물 (예컨대, 개, 고양이, 말, 설치류 등) 을 포함하는 임의의 동물에 투여하기에 적당하게 하는 것을 의도하였다. 하기 표는 생후 3 주이하의 칠면조 새끼에 투여하기에 적당한 매시 (mash), 즉 옥수수-기재의 이유 사료 (starter feed) 용 제형물을 제공한다.
동물 사료 조성물
성분 양 (중량%)
옥수수 36.65
대두박 (45.6% CP) 55.4
동물-식물 지방 3.2
디칼슘 인산염 2.3
석회석 (limestone) 1.5
무기질 프리믹스 (premix) 0.3
비타민 프리믹스 0.3
염화나트륨 0.15
DL 메티오닌 0.2
일부 구현예들에서, 이 사료 제형물에 다양한 농도의 본 발명의 프로테아제(들) (예컨대, 2,000 유닛/kg, 4,000 유닛/kg 및 6,000 유닛/kg) 이 보충된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물들은 본 발명이 속하는 당업계의 숙련된 자들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물들은 각 개별 간행물이 특이적으로 및 개별적으로 참조로서 본원에 포함되는 것으로 지적된 것처럼 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다. 그러나, 어떠한 간행물에 대한 인용도 본 발명에 관한 선행 기술이라는 승인으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 바람직한 구현예들을 기술하였지만, 상기 개시된 구현예들에 대하여 다양한 변형이 이루어질 수 있으며 이러한 변형이 본 발명의 영역에 속하도록 의도한 것은 당업계의 숙련된 자들에게 자명할 것이다.
당업계의 숙련된 자들은, 본 발명이, 상기 언급된 목적 및 이점들, 뿐 아니라 그 안에 내재된 것들을 수행하기에 충분히 적합하게 되어 있음을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법들은 바람직한 구현예들을 대표하는 것으로서 예시적인 것이며, 본 발명의 영역에 대한 제한으로 의도된 것은 아니다. 본 발명의 영역 및 정신을 이탈하지 않으면서 본원에 개시된 본 발명에 대하여 다양한 대체 및 변형을 가할 수 있다는 것은 당업계의 숙련된 자에게 자명하다.
본원에 예시적으로 기술된 본 발명은 적당하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 실행될 수 있다. 사용된 용어 및 표현들은 설명을 위한 것으로 사용된 것으로서 제한을 위한 것이 아니며, 이러한 용어 및 표현들의 사용이, 나타내고 기술한 특징들의 임의 등가물 또는 이들의 일부를 배제하려는 의도는 전혀 없지만, 청구된 본 발명의 영역 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것은 인식되어야 한다. 따라서, 본 발명을 바람직한 구현예 및 선택적 특징들에 의해 특이적으로 기술하였으나, 본원에 개시된 개념들에 대한 변형 및 변화가 당업계의 숙련된 자들에 의해 강구될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항에 의해 한정된 바의 본 발명의 영역 내에 있는 것으로 간주함은 자명할 것이다.
본 발명은 본원에서 넓게 및 포괄적으로 기술되었다. 상기 포괄적인 개시에 속하는 보다 좁은 종개념 (species) 및 하위 유개념적 (subgeneric) 분류 각각 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는, 삭제되는 물질이 본원에 구체적으로 언급되는지의 여부와 관계없이 상기 유개념으로부터 임의의 주제 대상을 삭제하는 단서 또는 소극적 제한을 가진 본 발명의 유개념적 기술을 포함한다.
<110> Genencor International, Inc. The Proctor & Gamble Company Jones, Brian E. Kolkman, Marc Leeflang, Chris Oh, Hiroshi Poulose, A.J. Sadlowski, Eugene S. Shaw, Andrew van der Kleij, Wilhelmus A.H. van Marrenwijk, Leo <120> Serine Proteases, Nucleic Acids Encoding Serine Enzymes and Vectors and Host Cells Incorporating Same <130> GC819-2-PCT/B <140> PCT/US2004/039066 <141> 2004-11-19 <150> US 60/523,609 <151> 2003-11-19 <160> 656 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1680 <212> DNA <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 1 gcgcgctgcg cccacgacga cgccgtccgc cgttcgccgg cgtacctgcg ttggctcacc 60 acccaccaga tcgacctcca taacgaggcc gtatgaccag aaagggatct gccaccgccc 120 accagcacgc tcctaacctc cgagcaccgg cgaccgccgg gtgcgatgaa agggacgaac 180 cgagatgaca ccacgcacag tcacgcgggc cctggccgtg gccaccgcag ccgccacact 240 cctggcaggc ggcatggccg cccaggccaa cgagcccgca ccacccggga gcgcgagcgc 300 accgccacgc ctggccgaga agctcgaccc cgacctcctc gaggccatgg agcgcgacct 360 gggcctcgac gcggaggaag ccgccgccac cctggcgttc cagcacgacg cagccgagac 420 cggcgaggcc ctcgccgaag agctcgacga ggacttcgcc ggcacctggg tcgaggacga 480 cgtcctgtac gtcgccacca ccgacgagga cgccgtcgag gaggtcgagg gcgaaggcgc 540 cacggccgtc accgtcgagc actccctggc cgacctcgag gcctggaaga ccgtcctcga 600 cgccgccctc gagggccacg acgacgtgcc cacctggtac gtcgacgtcc cgaccaacag 660 cgtcgtcgtc gccgtcaagg ccggagccca ggacgtcgcc gccggcctcg tcgaaggtgc 720 cgacgtcccg tccgacgccg tgaccttcgt cgagaccgac gagaccccgc ggaccatgtt 780 cgacgtgatc ggcggcaacg cctacaccat cggggggcgc agccgctgct cgatcgggtt 840 cgcggtcaac ggcgggttca tcaccgccgg ccactgcggc cgcaccggcg ccaccaccgc 900 caaccccacc gggaccttcg ccgggtccag cttcccgggc aacgactacg cgttcgtccg 960 taccggggcc ggcgtgaacc tgctggccca ggtcaacaac tactccggtg gccgcgtcca 1020 ggtcgccggg cacaccgcgg cccccgtcgg ctcggccgtg tgccggtccg ggtcgaccac 1080 cgggtggcac tgcggcacca tcactgcgct caactcctcg gtcacctacc ccgagggcac 1140 cgtccgcggc ctgatccgca ccaccgtctg cgccgagccc ggcgactccg gtggctcgct 1200 gctcgccggc aaccaggccc agggcgtcac gtccggcggc tccggcaact gccgcaccgg 1260 tggcaccacg ttcttccagc cggtcaaccc catcctccag gcgtacggcc tgaggatgat 1320 caccacggac tcgggcagca gcccggcccc tgcaccgacc tcctgcaccg gctacgcccg 1380 caccttcacc gggaccctcg cggccggccg ggccgccgcc cagcccaacg ggtcctacgt 1440 gcaggtcaac cggtccggga cccacagcgt gtgcctcaac gggccctccg gtgcggactt 1500 cgacctctac gtgcagcgct ggaacggcag ctcctgggtg accgtcgccc agagcacctc 1560 ccccggctcc aacgagacca tcacctaccg cggcaacgcc ggctactacc gctacgtggt 1620 caacgccgcg tccggctccg gtgcctacac catggggctc accctcccct gacgtagcgc 1680 1680 <210> 2 <211> 1488 <212> DNA <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 2 atgacaccac gcacagtcac gcgggccctg gccgtggcca ccgcagccgc cacactcctg 60 gcaggcggca tggccgccca ggccaacgag cccgcaccac ccgggagcgc gagcgcaccg 120 ccacgcctgg ccgagaagct cgaccccgac ctcctcgagg ccatggagcg cgacctgggc 180 ctcgacgcgg aggaagccgc cgccaccctg gcgttccagc acgacgcagc cgagaccggc 240 gaggccctcg ccgaagagct cgacgaggac ttcgccggca cctgggtcga ggacgacgtc 300 ctgtacgtcg ccaccaccga cgaggacgcc gtcgaggagg tcgagggcga aggcgccacg 360 gccgtcaccg tcgagcactc cctggccgac ctcgaggcct ggaagaccgt cctcgacgcc 420 gccctcgagg gccacgacga cgtgcccacc tggtacgtcg acgtcccgac caacagcgtc 480 gtcgtcgccg tcaaggccgg agcccaggac gtcgccgccg gcctcgtcga aggtgccgac 540 gtcccgtccg acgccgtgac cttcgtcgag accgacgaga ccccgcggac catgttcgac 600 gtgatcggcg gcaacgccta caccatcggg gggcgcagcc gctgctcgat cgggttcgcg 660 gtcaacggcg ggttcatcac cgccggccac tgcggccgca ccggcgccac caccgccaac 720 cccaccggga ccttcgccgg gtccagcttc ccgggcaacg actacgcgtt cgtccgtacc 780 ggggccggcg tgaacctgct ggcccaggtc aacaactact ccggtggccg cgtccaggtc 840 gccgggcaca ccgcggcccc cgtcggctcg gccgtgtgcc ggtccgggtc gaccaccggg 900 tggcactgcg gcaccatcac tgcgctcaac tcctcggtca cctaccccga gggcaccgtc 960 cgcggcctga tccgcaccac cgtctgcgcc gagcccggcg actccggtgg ctcgctgctc 1020 gccggcaacc aggcccaggg cgtcacgtcc ggcggctccg gcaactgccg caccggtggc 1080 accacgttct tccagccggt caaccccatc ctccaggcgt acggcctgag gatgatcacc 1140 acggactcgg gcagcagccc ggcccctgca ccgacctcct gcaccggcta cgcccgcacc 1200 ttcaccggga ccctcgcggc cggccgggcc gccgcccagc ccaacgggtc ctacgtgcag 1260 gtcaaccggt ccgggaccca cagcgtgtgc ctcaacgggc cctccggtgc ggacttcgac 1320 ctctacgtgc agcgctggaa cggcagctcc tgggtgaccg tcgcccagag cacctccccc 1380 ggctccaacg agaccatcac ctaccgcggc aacgccggct actaccgcta cgtggtcaac 1440 gccgcgtccg gctccggtgc ctacaccatg gggctcaccc tcccctga 1488 <210> 3 <211> 1404 <212> DNA <213> Cellulomonas spp. <400> 3 aacgagcccg caccacccgg gagcgcgagc gcaccgccac gcctggccga gaagctcgac 60 cccgacctcc tcgaggccat ggagcgcgac ctgggcctcg acgcggagga agccgccgcc 120 accctggcgt tccagcacga cgcagccgag accggcgagg ccctcgccga agagctcgac 180 gaggacttcg ccggcacctg ggtcgaggac gacgtcctgt acgtcgccac caccgacgag 240 gacgccgtcg aggaggtcga gggcgaaggc gccacggccg tcaccgtcga gcactccctg 300 gccgacctcg aggcctggaa gaccgtcctc gacgccgccc tcgagggcca cgacgacgtg 360 cccacctggt acgtcgacgt cccgaccaac agcgtcgtcg tcgccgtcaa ggccggagcc 420 caggacgtcg ccgccggcct cgtcgaaggt gccgacgtcc cgtccgacgc cgtgaccttc 480 gtcgagaccg acgagacccc gcggaccatg ttcgacgtga tcggcggcaa cgcctacacc 540 atcggggggc gcagccgctg ctcgatcggg ttcgcggtca acggcgggtt catcaccgcc 600 ggccactgcg gccgcaccgg cgccaccacc gccaacccca ccgggacctt cgccgggtcc 660 agcttcccgg gcaacgacta cgcgttcgtc cgtaccgggg ccggcgtgaa cctgctggcc 720 caggtcaaca actactccgg tggccgcgtc caggtcgccg ggcacaccgc ggcccccgtc 780 ggctcggccg tgtgccggtc cgggtcgacc accgggtggc actgcggcac catcactgcg 840 ctcaactcct cggtcaccta ccccgagggc accgtccgcg gcctgatccg caccaccgtc 900 tgcgccgagc ccggcgactc cggtggctcg ctgctcgccg gcaaccaggc ccagggcgtc 960 acgtccggcg gctccggcaa ctgccgcacc ggtggcacca cgttcttcca gccggtcaac 1020 cccatcctcc aggcgtacgg cctgaggatg atcaccacgg actcgggcag cagcccggcc 1080 cctgcaccga cctcctgcac cggctacgcc cgcaccttca ccgggaccct cgcggccggc 1140 cgggccgccg cccagcccaa cgggtcctac gtgcaggtca accggtccgg gacccacagc 1200 gtgtgcctca acgggccctc cggtgcggac ttcgacctct acgtgcagcg ctggaacggc 1260 agctcctggg tgaccgtcgc ccagagcacc tcccccggct ccaacgagac catcacctac 1320 cgcggcaacg ccggctacta ccgctacgtg gtcaacgccg cgtccggctc cggtgcctac 1380 accatggggc tcaccctccc ctga 1404 <210> 4 <211> 567 <212> DNA <213> Cellulomonas spp. <400> 4 ttcgacgtga tcggcggcaa cgcctacacc atcggggggc gcagccgctg ctcgatcggg 60 ttcgcggtca acggcgggtt catcaccgcc ggccactgcg gccgcaccgg cgccaccacc 120 gccaacccca ccgggacctt cgccgggtcc agcttcccgg gcaacgacta cgcgttcgtc 180 cgtaccgggg ccggcgtgaa cctgctggcc caggtcaaca actactccgg tggccgcgtc 240 caggtcgccg ggcacaccgc ggcccccgtc ggctcggccg tgtgccggtc cgggtcgacc 300 accgggtggc actgcggcac catcactgcg ctcaactcct cggtcaccta ccccgagggc 360 accgtccgcg gcctgatccg caccaccgtc tgcgccgagc ccggcgactc cggtggctcg 420 ctgctcgccg gcaaccaggc ccagggcgtc acgtccggcg gctccggcaa ctgccgcacc 480 ggtggcacca cgttcttcca gccggtcaac cccatcctcc aggcgtacgg cctgaggatg 540 atcaccacgg actcgggcag cagcccg 567 <210> 5 <211> 83 <212> DNA <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 5 atgacaccac cacagtcacg cgggccctgg ccgtggccac cgcagccgcc acactcctgg 60 caggcggcat ggccgcccag gcc 83 <210> 6 <211> 495 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 6 Met Thr Pro Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu Ala Val Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gly Met Ala Ala Gln Ala Asn Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Pro Gly Ser Ala Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ala Glu Lys Leu Asp 35 40 45 Pro Asp Leu Leu Glu Ala Met Glu Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Glu 50 55 60 Glu Ala Ala Ala Thr Leu Ala Phe Gln His Asp Ala Ala Glu Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ala Leu Ala Glu Glu Leu Asp Glu Asp Phe Ala Gly Thr Trp Val 85 90 95 Glu Asp Asp Val Leu Tyr Val Ala Thr Thr Asp Glu Asp Ala Val Glu 100 105 110 Glu Val Glu Gly Glu Gly Ala Thr Ala Val Thr Val Glu His Ser Leu 115 120 125 Ala Asp Leu Glu Ala Trp Lys Thr Val Leu Asp Ala Ala Leu Glu Gly 130 135 140 His Asp Asp Val Pro Thr Trp Tyr Val Asp Val Pro Thr Asn Ser Val 145 150 155 160 Val Val Ala Val Lys Ala Gly Ala Gln Asp Val Ala Ala Gly Leu Val 165 170 175 Glu Gly Ala Asp Val Pro Ser Asp Ala Val Thr Phe Val Glu Thr Asp 180 185 190 Glu Thr Pro Arg Thr Met Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr 195 200 205 Ile Gly Gly Arg Ser Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly 210 215 220 Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn 225 230 235 240 Pro Thr Gly Thr Phe Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala 245 250 255 Phe Val Arg Thr Gly Ala Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn 260 265 270 Tyr Ser Gly Gly Arg Val Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val 275 280 285 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 290 295 300 Thr Ile Thr Ala Leu Asn Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val 305 310 315 320 Arg Gly Leu Ile Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 325 330 335 Gly Ser Leu Leu Ala Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn 355 360 365 Pro Ile Leu Gln Ala Tyr Gly Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly 370 375 380 Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Cys Thr Gly Tyr Ala Arg Thr 385 390 395 400 Phe Thr Gly Thr Leu Ala Ala Gly Arg Ala Ala Ala Gln Pro Asn Gly 405 410 415 Ser Tyr Val Gln Val Asn Arg Ser Gly Thr His Ser Val Cys Leu Asn 420 425 430 Gly Pro Ser Gly Ala Asp Phe Asp Leu Tyr Val Gln Arg Trp Asn Gly 435 440 445 Ser Ser Trp Val Thr Val Ala Gln Ser Thr Ser Pro Gly Ser Asn Glu 450 455 460 Thr Ile Thr Tyr Arg Gly Asn Ala Gly Tyr Tyr Arg Tyr Val Val Asn 465 470 475 480 Ala Ala Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Thr Met Gly Leu Thr Leu Pro 485 490 495 <210> 7 <211> 467 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 7 Asn Glu Pro Ala Pro Pro Gly Ser Ala Ser Ala Pro Pro Arg Leu Ala 1 5 10 15 Glu Lys Leu Asp Pro Asp Leu Leu Glu Ala Met Glu Arg Asp Leu Gly 20 25 30 Leu Asp Ala Glu Glu Ala Ala Ala Thr Leu Ala Phe Gln His Asp Ala 35 40 45 Ala Glu Thr Gly Glu Ala Leu Ala Glu Glu Leu Asp Glu Asp Phe Ala 50 55 60 Gly Thr Trp Val Glu Asp Asp Val Leu Tyr Val Ala Thr Thr Asp Glu 65 70 75 80 Asp Ala Val Glu Glu Val Glu Gly Glu Gly Ala Thr Ala Val Thr Val 85 90 95 Glu His Ser Leu Ala Asp Leu Glu Ala Trp Lys Thr Val Leu Asp Ala 100 105 110 Ala Leu Glu Gly His Asp Asp Val Pro Thr Trp Tyr Val Asp Val Pro 115 120 125 Thr Asn Ser Val Val Val Ala Val Lys Ala Gly Ala Gln Asp Val Ala 130 135 140 Ala Gly Leu Val Glu Gly Ala Asp Val Pro Ser Asp Ala Val Thr Phe 145 150 155 160 Val Glu Thr Asp Glu Thr Pro Arg Thr Met Phe Asp Val Ile Gly Gly 165 170 175 Asn Ala Tyr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala 180 185 190 Val Asn Gly Gly Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Thr Gly Ala 195 200 205 Thr Thr Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly 210 215 220 Asn Asp Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala Gly Val Asn Leu Leu Ala 225 230 235 240 Gln Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Arg Val Gln Val Ala Gly His Thr 245 250 255 Ala Ala Pro Val Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly 260 265 270 Trp His Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn Ser Ser Val Thr Tyr Pro 275 280 285 Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro 290 295 300 Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val 305 310 315 320 Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Phe 325 330 335 Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Gln Ala Tyr Gly Leu Arg Met Ile Thr 340 345 350 Thr Asp Ser Gly Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ser Cys Thr Gly 355 360 365 Tyr Ala Arg Thr Phe Thr Gly Thr Leu Ala Ala Gly Arg Ala Ala Ala 370 375 380 Gln Pro Asn Gly Ser Tyr Val Gln Val Asn Arg Ser Gly Thr His Ser 385 390 395 400 Val Cys Leu Asn Gly Pro Ser Gly Ala Asp Phe Asp Leu Tyr Val Gln 405 410 415 Arg Trp Asn Gly Ser Ser Trp Val Thr Val Ala Gln Ser Thr Ser Pro 420 425 430 Gly Ser Asn Glu Thr Ile Thr Tyr Arg Gly Asn Ala Gly Tyr Tyr Arg 435 440 445 Tyr Val Val Asn Ala Ala Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Thr Met Gly Leu 450 455 460 Thr Leu Pro 465 <210> 8 <211> 189 <212> PRT <213> Cellulomonas spp. <400> 8 Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly Phe Ile Thr Ala Gly His 20 25 30 Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala 35 40 45 Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Arg Val 65 70 75 80 Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val Gly Ser Ala Val Cys Arg 85 90 95 Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn 100 105 110 Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg Thr 115 120 125 Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly 130 135 140 Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Gln Ala Tyr 165 170 175 Gly Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ser Pro 180 185 <210> 9 <211> 28 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 9 Met Thr Pro Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu Ala Val Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gly Met Ala Ala Gln Ala 20 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 acnacsggst ggcrgtgcgg cac 23 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 angngccgcc ggagtcncc 19 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 12 Asp Gly Trp Asp Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn Ser Ser Val Thr 1 5 10 15 Tyr Pro Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg Thr Thr Val Cys Ala 20 25 30 Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly Asn Gln Ala Gln 35 40 45 Gly Val Thr Ser Gly Asp Ser Gly Gly Ser 50 55 <210> 13 <211> 177 <212> DNA <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 13 acgacggctg ggactgcggc accatcactg cgctcaactc ctcggtcacc taccccgagg 60 gcaccgtccg cggcctgatc cgcaccaccg tctgcgccga gcccggcgac tccggtggct 120 cgctgctcgc cggcaaccag gcccagggcg tcacgtccgg cgactccggc ggctcat 177 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cggggtaggt gaccgaggag ttgagcgcag tg 32 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gctcgccggc aaccaggccc agggcgtcac gtc 33 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aacggcgggt tcatcaccgc cggccactgc ggcc 34 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of the mature chain determined by MALDI-TOF analysis <400> 17 Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Ile Gly Gly Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 189 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 18 Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly Phe Ile Thr Ala Gly His 20 25 30 Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala 35 40 45 Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Arg Val 65 70 75 80 Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val Gly Ser Ala Val Cys Arg 85 90 95 Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn 100 105 110 Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg Thr 115 120 125 Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly 130 135 140 Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Gln Ala Tyr 165 170 175 Gly Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ser Pro 180 185 <210> 19 <211> 184 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <400> 19 Thr Pro Leu Ile Ala Gly Gly Glu Ala Ile Thr Thr Gly Gly Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Leu Gly Phe Asn Val Ser Val Asn Gly Val Ala His Ala Leu 20 25 30 Thr Ala Gly His Cys Thr Asn Ile Ser Ala Ser Trp Ser Ile Gly Thr 35 40 45 Arg Thr Gly Thr Ser Phe Pro Asn Asn Asp Tyr Gly Ile Ile Arg His 50 55 60 Ser Asn Pro Ala Ala Ala Asp Gly Arg Val Tyr Leu Tyr Asn Gly Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Asp Ile Thr Thr Ala Gly Asn Ala Phe Val Gly Gln Ala Val 85 90 95 Gln Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Leu Arg Ser Gly Ser Val Thr Gly 100 105 110 Leu Asn Ala Thr Val Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Ile Val Tyr Gly Met 115 120 125 Ile Gln Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu 130 135 140 Phe Ala Gly Ser Thr Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Pro Val Thr Glu Ala Leu 165 170 175 Ser Ala Tyr Gly Ala Thr Val Leu 180 <210> 20 <211> 174 <212> PRT <213> Streptomyces fradiae <400> 20 Ile Ala Gly Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Ala Gly Gly Gly Arg Cys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Phe Asn Val Arg Ser Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Ala Leu Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Thr Glu Ile Ala Ser Thr Trp Tyr Thr Asn Ser Gly 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Leu Gly Thr Arg Ala Gly Thr Ser Phe Pro Gly Asn 50 55 60 Asp Tyr Gly Leu Ile Arg His Ser Asn Ala Ser Ala Ala Asp Gly Arg 65 70 75 80 Val Tyr Leu Tyr Asn Gly Ser Tyr Arg Asp Ile Thr Gly Ala Gly Asn 85 90 95 Ala Tyr Val Gly Gln Thr Val Gln Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Leu 100 105 110 His Ser Gly Arg Val Thr Gly Leu Asn Ala Thr Val Asn Tyr Gly Gly 115 120 125 Gly Asp Ile Val Ser Gly Leu Ile Gln Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro 130 135 140 Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Phe Ala Gly Ser Thr Ala Leu Gly Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr 165 170 <210> 21 <211> 188 <212> PRT <213> Streptomyces lividans <400> 21 Asn Lys Leu Ile Gln Gly Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Ser Ser Trp Arg 1 5 10 15 Cys Ser Leu Gly Phe Asn Val Arg Thr Ser Ser Gly Ala Glu Tyr Phe 20 25 30 Leu Thr Ala Gly His Cys Thr Asp Gly Ala Gly Ala Trp Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Gly Gly Thr Val Ile Gly Gln Thr Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly 50 55 60 Asn Asp Tyr Gly Ile Val Gln Tyr Thr Gly Ser Val Ser Arg Pro Gly 65 70 75 80 Thr Ala Asn Gly Val Asp Ile Thr Arg Ala Ala Thr Pro Ser Val Gly 85 90 95 Thr Thr Val Ile Arg Asp Gly Ser Thr Thr Gly Thr His Ser Gly Arg 100 105 110 Val Thr Ala Leu Asn Ala Thr Val Asn Tyr Gly Gly Gly Asp Val Val 115 120 125 Gly Gly Leu Ile Gln Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Leu Tyr Gly Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val 165 170 175 Thr Glu Ala Leu Ser Ala Tyr Gly Val Ser Val Tyr 180 185 <210> 22 <211> 188 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 22 Asn Lys Leu Ile Gln Gly Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Ser 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anisopliae <400> 34 Ala Thr Val Gln Gly Gly Asp Val Tyr Tyr Ile Asn Arg Ser Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Thr Thr Gly Phe Val Ser Ala Gly His 20 25 30 Cys Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu Ala Leu 35 40 45 Gly Thr Phe Ser Gly Ser Val Phe Pro Gly Ser Ala Asp Met Ala Tyr 50 55 60 Val Arg Thr Val Ser Gly Thr Val Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Gly Tyr 65 70 75 80 Gly Gln Gly Ser Phe Pro Val Ser Gly Ser Ser Glu Ala Ala Val Gly 85 90 95 Ala Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gln Val His Cys Gly Thr 100 105 110 Ile Gly Ala Lys Gly Ala Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Ala Val Ser 115 120 125 Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly 130 135 140 Ser Phe Tyr Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Asp Cys Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Arg 165 170 175 Ile Leu Gln Thr Tyr Gly Leu Thr Leu Val Thr Ala 180 185 <210> 35 <211> 195 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <400> 35 Ala Asp Ile Arg Gly Gly Asp Ala 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primer <400> 48 acccacgcgt agtcgttgcc ggggaa 26 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gccgctgctc gatcgggttc 20 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gcagttgccg gagccgccgg acgt 24 <210> 51 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 tsggsgncrt ggtt 14 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 52 Leu Arg Met Ile Thr Thr Asp Ser Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 555 <212> DNA <213> Cellulomonas flavigena <400> 53 gtcgacgtca tcgggggcaa cgcgtactac atcgggtcgc gctcgcggtg ctcgatcggg 60 ttcgcggtcg agggcgggtt cgtcaccgcg gggcactgcg ggcgcgcggg cgcgagcacg 120 tcgtcaccgt cggggacctt ccgcggctcg tcgttccccg gcaacgacta cgcgtgggtc 180 caggtcgcct cgggcaacac gccgcgcggg ctggtgaaca accactcggg cggcacggtg 240 cgcgtcaccg gctcgcagca ggccgcggtc ggctcgtacg tgtgccgatc gggcagcacg 300 acgggatggc 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cgtcaacgag gccctcgggg ggtacgggct cacgctcgtg 1140 acctctgacg gtgggggccc gagccgccgc cgaccgggtg ccagggctat gcgcggacct 1200 accagggcag cgtctcggcc gggacgtcgg tcgcgcagcg aacggttcgt acgtcacgac 1260 cgggggcggg cgaccgggtg tgcc 1284 <210> 68 <211> 428 <212> PRT <213> Oerskovia turbata <400> 68 Met Ala Arg Ser Phe Trp Arg Thr Leu Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Leu Val Ala Gly Pro Ala Ala Leu Thr Ala Asn Ala Ala Thr Pro 20 25 30 Thr Pro Asp Thr Pro Thr Val Ser Pro Gln Thr Ser Ser Lys Val Ser 35 40 45 Pro Glu Val Leu Arg Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser Ala Lys 50 55 60 Asp Ala Thr Lys Arg Leu Ala Phe Gln Ser Asp Ala Ala Ser Thr Glu 65 70 75 80 Asp Ala Leu Ala Asp Ser Leu Asp Ala Tyr Ala Gly Ala Trp Val Asp 85 90 95 Pro Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Val Gly Val Ala Asp Arg Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Glu Val Arg Ser Ala Gly Ala Thr Pro Val Val Val Asp His Thr 115 120 125 Leu Ala Glu Leu Asp Thr Trp Lys Ala Ala Leu Asp Gly Glu Leu Asn 130 135 140 Asp Pro Ala Gly Val Pro Ser Trp Phe Val Asp 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<213> Xylanibacterium ulmi <400> 78 Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Thr Gly Gly Phe Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 His Cys Gly Arg Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ser Ala Ser Gly Thr Phe 20 25 30 Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Trp Val Arg Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Asn Thr Pro Val Gly Ala Val Asn Arg Tyr Asp Gly Ser Arg 50 55 60 Val Thr Val Ala Gly Ser Thr Asp Ala Ala Val Gly Ala Ala Val Cys 65 70 75 80 Arg Ser Gly Ser Thr Thr Ala Trp Arg Cys Gly Thr Ile Gln Ser Arg 85 90 95 Gly Ala Thr Val Thr Tyr Ala Gln Gly Thr Val Ser Gly Leu Ile Arg 100 105 110 Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Ile Ala 115 120 125 Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly 130 135 140 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 acccacgcgt agtcgttgcc 20 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 acccacgcgt agtcgtkgcc gggg 24 <210> 81 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 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<400> 99 cacccacgcg tagtcgtggc cggggaacga 30 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 gaagccgccc tggacggcgt acccgatcga gca 33 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 tgcgcggagg gcggcgactc gggcgggtcg 30 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 ttcctctacc agcccgtcaa cccgatccta 30 <210> 103 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 cgccgcgggg acgaacccgc cctcgaccgc gaa 33 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 cgcgtagtcg ttgccgggga acgacgagcc 30 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 ggcctcatcc gcacgagcgt gtgcgccgag 30 <210> 106 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 acgtcgggcg ggtccggcaa ctgccgctac gggggc 36 <210> 107 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 gagcccgtac acccggaggg cctcgttgac gggctggaa 39 <210> 108 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 cgtcacgccc tgcgcctggt tgcccgcgag 30 <210> 109 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 tccagcccgt caacgaggcc ctccgggtgt acgggctc 38 <210> 110 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 acgtcggtcg cgcagccgaa cggttcgtac gtc 33 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 cgtggtcgcg ccggtcgtgc cgcagtgccc 30 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 gacgacgacc gtgttggtag tgacgtcgac gtacca 36 <210> 113 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 tccaccacgg ggtggcgctg cgggacgatc 30 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 gtgtgcgccg agcccggcga ctccggcggc 30 <210> 115 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 gctcgggccc ccaccgtcag aggtcacgag cgtgag 36 <210> 116 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 atggcacgat cattctggag gacgctcgcc acggcg 36 <210> 117 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 tgctcgatcg ggtacgccgt ccagggcggc ttc 33 <210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 taggatcggg ttgacgggct ggtagaggaa 30 <210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 tggtacgtcg acgtcactac caacacggtc gtcgtc 36 <210> 120 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 gccgccggag tcgccgggct cggcgcacac 30 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 gtsgacgtsa tcggsggsaa cgcstactac 30 <210> 122 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 122 sgcsgtsgcs ggnganga 18 <210> 123 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 gtsgaygtsa tcggcggcga ygcstac 27 <210> 124 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 124 sgasgcgtan ccctgncc 18 <210> 125 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (4)..(19) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> VARIANT <222> (7)..(157) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> VARIANT <222> (92)..(99) <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> VARIANT <222> (112)..(156) <223> Xaa is Asn or Gly <220> <221> VARIANT <222> (21) <223> Xaa is Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (40) <223> Xaa is Thr or Val <220> <221> VARIANT <222> (59) <223> Xaa is Phe or Trp <220> <221> VARIANT <222> (65) <223> Xaa is Gly or Asp <220> <221> VARIANT <222> (68) <223> Xaa is Leu or Phe <220> <221> VARIANT <222> (74) <223> Xaa is Asn or Arg <220> <221> VARIANT <222> (75) <223> Xaa is Tyr or His <220> <221> VARIANT <222> (76) <223> Xaa is Ser or Asp <220> <221> VARIANT <222> (78) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (79) <223> Xaa is Arg or Thr <220> <221> VARIANT <222> (83) <223> Xaa is Ala or Thr <220> <221> VARIANT <222> (85) <223> Xaa is His or Ser <220> <221> VARIANT <222> (86) <223> Xaa is Thr or Gln <220> <221> VARIANT <222> (102) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> VARIANT <222> (104) <223> Xaa is His or Arg <220> <221> VARIANT <222> (107) <223> Xaa is Thr or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (114) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (118) <223> Xaa is Pro or Ala <220> <221> VARIANT <222> (119) <223> Xaa is Glu or Gln <220> <221> VARIANT <222> (121) <223> Xaa is Thr, Ser, or Asp <220> <221> VARIANT <222> (123) <223> Xaa is Arg or Ser <220> <221> VARIANT <222> (128) <223> Xaa is Thr or Gly <220> <221> VARIANT <222> (129) <223> Xaa is Thr, Asn, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (130) <223> Xaa is Val or Ala <220> <221> VARIANT <222> (134) <223> Xaa is Pro or Gly <220> <221> VARIANT <222> (141) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> VARIANT <222> (142) <223> Xaa is Leu, Val, or Ile <220> <221> VARIANT <222> (145) <223> Xaa is Asn or Thr <220> <221> VARIANT <222> (148) <223> Xaa is Gln or Arg <220> <221> VARIANT <222> (150) <223> Xaa is Val or Leu <220> <221> VARIANT <222> (154) <223> Xaa is Gly or Arg <220> <221> VARIANT <222> (155) <223> Xaa is Ser or Ile <400> 125 Xaa Asp Val Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Cys Ser Xaa Gly Xaa Ala Val Xaa Gly Gly Phe Xaa Thr Ala Gly His 20 25 30 Cys Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Thr Phe Xaa 35 40 45 Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Asn Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Val 65 70 75 80 Xaa Val Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Val Gly Xaa Xaa Val Cys Arg 85 90 95 Ser Gly Xaa Thr Thr Xaa Trp Xaa Cys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Val Xaa Tyr Xaa Xaa Gly Xaa Val Xaa Gly Leu Xaa Arg Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Gly Asp Ser Gly Gly Ser Xaa Xaa Xaa Gly 130 135 140 Xaa Gln Ala Xaa Gly Xaa Thr Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 145 150 155 160 Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 <210> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Cellulomonas cellasea <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is Ile or Tyr <400> 126 Xaa Ala Trp Asp Ala Phe Ala Glu Asn Val Val Asp Trp Ser Ser Arg 1 5 10 15 <210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> Cellulomonas cellasea <400> 127 Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala 1 5 10 15 Tyr <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> Cellulomonas flavigena <220> <221> VARIANT <222> (4)..(11) <223> Xaa is Ile or Tyr <400> 128 Val Asp Val Xaa Gly Gly Asn Ala Tyr Tyr Xaa 1 5 10 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Cellulomonas fimi <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa is Ile or Tyr <400> 129 Val Asp Val Xaa Gly Gly 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gctgtgactg ttgagcattc tcttgctgat ttagaggcgt ggaagacggt tttggatgct 420 gcgctggagg gtcatgatga tgtgcctacg tggtacgtcg acgtgcctac gaattcggta 480 gtcgttgctg taaaggcagg agcgcaggat gtagctgcag gacttgtgga aggcgctgat 540 gtgccatcag atgcggtcac ttttgtagaa acggacgaaa cgcctagaac gatgttcgac 600 gtaattggag gcaacgcata tactattggc ggccggtcta gatgttctat cggattcgca 660 gtaaacggtg gcttcattac tgccggtcac tgcggaagaa caggagccac tactgccaat 720 ccgactggca catttgcagg tagctcgttt ccgggaaatg attatgcatt cgtccgaaca 780 ggggcaggag taaatttgct tgcccaagtc aataactact cgggcggcag agtccaagta 840 gcaggacata cggccgcacc agttggatct gctgtatgcc gctcaggtag cactacaggt 900 tggcattgcg gaactatcac ggcgctgaat tcgtctgtca cgtatccaga gggaacagtc 960 cgaggactta tccgcacgac ggtttgtgcc gaaccaggtg atagcggagg tagcctttta 1020 gcgggaaatc aagcccaagg tgtcacgtca ggtggttctg gaaattgtcg gacgggggga 1080 acaacattct ttcaaccagt caacccgatt ttgcaggctt acggcctgag aatgattacg 1140 actgactctg gaagttcccc tgctccagca cctacatcat gtacaggcta cgcaagaacg 1200 ttcacaggaa ccctcgcagc aggaagagca gcagctcaac cgaacggtag ctatgttcag 1260 gtcaaccgga gcggtacaca ttccgtctgt ctcaatggac ctagcggtgc ggactttgat 1320 ttgtatgtgc agcgatggaa tggcagtagc tgggtaaccg tcgctcaatc gacatcgccg 1380 ggaagcaatg aaaccattac gtaccgcgga aatgctggat attatcgcta cgtggttaac 1440 gctgcgtcag gatcaggagc ttacacaatg ggactcaccc tcccctga 1488 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 132 Asp Asp Asn Asp Pro Ile 1 5 <210> 133 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 133 gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60 gcgttcagca acatgagcgc gcaggctgat gattattcag ttgtagagga acatgggcaa 120 ctaagtatta gtaacggtga attagtcaat gaacgaggcg aacaagttca gttaaaaggg 180 atgagttccc atggtttgca atggtacggt caatttgtaa actatgaaag catgaaatgg 240 ctaagagatg attggggaat aactgtattc cgagcagcaa tgtatacctc ttcaggagga 300 tatattgacg atccatcagt aaaggaaaaa gtaaaagaga ctgttgaggc tgcgatagac 360 cttggcatat atgtgatcat tgattggcat atcctttcag acaatgaccc gaatatatat 420 aaagaagaag cgaaggattt ctttgatgaa atgtcagagt tgtatggaga ctatccgaat 480 gtgatatacg aaattgcaaa tgaaccgaat ggtagtgatg ttacgtggga caatcaaata 540 aaaccgtatg cagaagaagt gattccggtt attcgtgaca atgaccctaa taacattgtt 600 attgtaggta caggtacatg gagtcaggat gtccatcatg cagccgataa tcagcttgca 660 gatcctaacg tcatgtatgc atttcatttt tatgcaggaa cacatggaca aaatttacga 720 gaccaagtag attatgcatt agatcaagga gcagcgatat ttgttagtga atgggggaca 780 agtgcagcta caggtgatgg tggtgtgttt ttagatgaag cacaagtgtg gattgacttt 840 atggatgaaa gaaatttaag ctgggccaac tggtctctaa cgcataagga tgagtcatct 900 gcagcgttaa tgccaggtgc aaatccaact ggtggttgga cagaggctga actatctcca 960 tctggtacat ttgtgaggga aaaaataaga gaatcagcat ctgacaacaa tgatcccata 1020 1020 <210> 134 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 134 Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Asp Asp Tyr 20 25 30 Ser Val Val Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu 35 40 45 Val Asn Glu Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His 50 55 60 Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser Met Lys Trp 65 70 75 80 Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr 85 90 95 Ser Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser Val Lys Glu Lys Val Lys 100 105 110 Glu Thr Val Glu Ala Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp 115 120 125 Trp His Ile Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala 130 135 140 Lys Asp Phe Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Tyr Pro Asn 145 150 155 160 Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp Val Thr Trp 165 170 175 Asp Asn Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Val Ile Arg 180 185 190 Asp Asn Asp Pro Asn Asn Ile Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser 195 200 205 Gln Asp Val His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp Pro Asn Val 210 215 220 Met Tyr Ala Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Asn Leu Arg 225 230 235 240 Asp Gln Val Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser 245 250 255 Glu Trp Gly Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asp 260 265 270 Glu Ala Gln Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp 275 280 285 Ala Asn Trp Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala Ala Leu Met 290 295 300 Pro Gly Ala Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu Leu Ser Pro 305 310 315 320 Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala Ser Asp Asn 325 330 335 Asn Asp Pro Ile 340 <210> 135 <211> 30 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 135 Met Arg Ser Lys Lys Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu Ala Val Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gly Met Ala Ala Gln Ala 20 25 30 <210> 136 <211> 30 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 136 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gly Met Ala Ala Gln Ala 20 25 30 <210> 137 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 ctagctaggt accatgacac cacgaactgt cacaagagct 40 <210> 138 <211> 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<400> 145 tcatgcaggg taccatgaga agcaagaagt tgtggatcag tttgctgctg gctgtggcaa 60 cagcagctgc taca 74 <210> 146 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 gtgtgcaagc tttcagggga gggtgagtcc cattgtgtaa 40 <210> 147 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 147 tcatgcaggg taccatgaga agcaagaagt tgtggatcag tttgctgctg gctgtggcaa 60 cagcagctgc taca 74 <210> 148 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 148 gtgtgcaagc tttcaagggg aacttccaga gtcagtc 37 <210> 149 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 149 ccataccgga tccaaacgaa ccggctcctc caggatct 38 <210> 150 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 150 ctcgagttaa gcttttaagg ggaacttcca gagtcagtc 39 <210> 151 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 151 tgagctgcta gcaaaaggag agggtaaaga atgacaccac gaactgtc 48 <210> 152 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ala Ala Thr Leu Ala Phe Gln His Asp Ala Ala Glu 65 70 75 80 Thr Gly Glu Ala Leu Ala Glu Glu Leu Asp Glu Asp Phe Ala Gly Thr 85 90 95 Trp Val Glu Asp Asp Val Leu Tyr Val Ala Thr Thr Asp Glu Asp Ala 100 105 110 Val Glu Glu Val Glu Gly Glu Gly Ala Thr Ala Val Thr Val Glu His 115 120 125 Ser Leu Ala Asp Leu Glu Ala Trp Lys Thr Val Leu Asp Ala Ala Leu 130 135 140 Glu Gly His Asp Asp Val Pro Thr Trp Tyr Val Asp Val Pro Thr Asn 145 150 155 160 Ser Val Val Val Ala Val Lys Ala Gly Ala Gln Asp Val Ala Ala Gly 165 170 175 Leu Val Glu Gly Ala Asp Val Pro Ser Asp Ala Val Thr Phe Val Glu 180 185 190 Thr Asp Glu Thr Pro Arg Thr Met Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala 195 200 205 Tyr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn 210 215 220 Gly Gly Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr 225 230 235 240 Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp 245 250 255 Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val 260 265 270 Asn Asn Tyr Ser Gly Gly 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 218 acgcctagaa cgatgttcnn sgtaattgga ggcaacgca 39 <210> 219 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 219 cctagaacga tgttcgacnn sattggaggc aacgcatat 39 <210> 220 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 220 agaacgatgt tcgacgtann sggaggcaac gcatatact 39 <210> 221 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 221 acgatgttcg acgtaattnn sggcaacgca tatactatt 39 <210> 222 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 222 atgttcgacg taattggann saacgcatat actattggc 39 <210> 223 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 223 ttcgacgtaa ttggaggcnn sgcatatact attggcggc 39 <210> 224 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 224 gacgtaattg gaggcaacnn statactatt ggcggccgg 39 <210> 225 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 225 gtaattggag gcaacgcann sactattggc ggccggtct 39 <210> 226 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 226 attggaggca acgcatatnn sattggcggc cggtctaga 39 <210> 227 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 227 ggaggcaacg catatactnn sggcggccgg tctagatgt 39 <210> 228 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 228 ggcaacgcat atactattnn sggccggtct agatgttct 39 <210> 229 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 229 aacgcatata ctattggcnn scggtctaga tgttctatc 39 <210> 230 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 230 gcatatacta ttggcggcnn stctagatgt tctatcgga 39 <210> 231 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 231 tatactattg gcggccggnn sagatgttct atcggattc 39 <210> 232 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 232 actattggcg gccggtctnn stgttctatc ggattcgca 39 <210> 233 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 238 agatgttcta tcggattcnn sgtaaacggt ggcttcatt 39 <210> 239 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 239 tgttctatcg gattcgcann saacggtggc ttcattact 39 <210> 240 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 240 tctatcggat tcgcagtann sggtggcttc attactgcc 39 <210> 241 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 241 atcggattcg cagtaaacnn sggcttcatt actgccggt 39 <210> 242 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 242 ggattcgcag taaacggtnn sttcattact gccggtcac 39 <210> 243 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 243 ttcgcagtaa acggtggcnn sattactgcc ggtcactgc 39 <210> 244 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 244 gcagtaaacg gtggcttcnn sactgccggt cactgcgga 39 <210> 245 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 245 gtaaacggtg gcttcattnn sgccggtcac tgcggaaga 39 <210> 246 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 246 aacggtggct tcattactnn sggtcactgc ggaagaaca 39 <210> 247 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 247 ggtggcttca ttactgccnn scactgcgga agaacagga 39 <210> 248 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 248 ggcttcatta ctgccggtnn stgcggaaga acaggagcc 39 <210> 249 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 249 ttcattactg ccggtcacnn sggaagaaca ggagccact 39 <210> 250 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 250 attactgccg gtcactgcnn sagaacagga gccactact 39 <210> 251 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 251 actgccggtc actgcggann sacaggagcc actactgcc 39 <210> 252 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 252 gccggtcact gcggaagann sggagccact actgccaat 39 <210> 253 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 253 ggtcactgcg gaagaacann sgccactact gccaatccg 39 <210> 254 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 254 cactgcggaa gaacaggann sactactgcc aatccgact 39 <210> 255 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 255 tgcggaagaa caggagccnn sactgccaat ccgactggc 39 <210> 256 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 256 ggaagaacag gagccactnn sgccaatccg actggcaca 39 <210> 257 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 257 agaacaggag ccactactnn saatccgact ggcacattt 39 <210> 258 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 258 acaggagcca ctactgccnn sccgactggc acatttgca 39 <210> 259 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 259 ggagccacta ctgccaatnn sactggcaca tttgcaggt 39 <210> 260 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 260 gccactactg ccaatccgnn sggcacattt gcaggtagc 39 <210> 261 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 261 actactgcca atccgactnn sacatttgca ggtagctcg 39 <210> 262 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 262 actgccaatc cgactggcnn stttgcaggt agctcgttt 39 <210> 263 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 263 gccaatccga ctggcacann sgcaggtagc tcgtttccg 39 <210> 264 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 264 aatccgactg gcacatttnn sggtagctcg tttccggga 39 <210> 265 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 265 ccgactggca catttgcann sagctcgttt ccgggaaat 39 <210> 266 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 266 actggcacat ttgcaggtnn stcgtttccg ggaaatgat 39 <210> 267 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 267 ggcacatttg caggtagcnn stttccggga aatgattat 39 <210> 268 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 268 acatttgcag gtagctcgnn sccgggaaat gattatgca 39 <210> 269 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 269 tttgcaggta gctcgtttnn sggaaatgat tatgcattc 39 <210> 270 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 270 gcaggtagct cgtttccgnn saatgattat gcattcgtc 39 <210> 271 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 271 ggtagctcgt ttccgggann sgattatgca ttcgtccga 39 <210> 272 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 272 agctcgtttc cgggaaatnn statgcattc gtccgaaca 39 <210> 273 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 273 tcgtttccgg gaaatgatnn sgcattcgtc cgaacaggg 39 <210> 274 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 274 tttccgggaa atgattatnn sttcgtccga acaggggca 39 <210> 275 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 275 ccgggaaatg attatgcann sgtccgaaca ggggcagga 39 <210> 276 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 276 ggaaatgatt atgcattcnn scgaacaggg gcaggagta 39 <210> 277 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 277 aatgattatg cattcgtcnn sacaggggca ggagtaaat 39 <210> 278 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 278 gattatgcat 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<210> 294 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 294 gtcaataact actcgggcnn sagagtccaa gtagcagga 39 <210> 295 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 295 aataactact cgggcggcnn sgtccaagta gcaggacat 39 <210> 296 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 296 aactactcgg gcggcagann scaagtagca ggacatacg 39 <210> 297 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 297 tactcgggcg gcagagtcnn sgtagcagga catacggcc 39 <210> 298 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 298 tcgggcggca gagtccaann sgcaggacat acggccgca 39 <210> 299 <211> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 304 gtagcaggac atacggccnn sccagttgga tctgctgta 39 <210> 305 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 305 gcaggacata cggccgcann sgttggatct gctgtatgc 39 <210> 306 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 306 ggacatacgg ccgcaccann sggatctgct gtatgccgc 39 <210> 307 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 307 catacggccg caccagttnn stctgctgta tgccgctca 39 <210> 308 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 308 acggccgcac cagttggann sgctgtatgc cgctcaggt 39 <210> 309 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 309 gccgcaccag ttggatctnn sgtatgccgc tcaggtagc 39 <210> 310 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 310 gcaccagttg gatctgctnn stgccgctca ggtagcact 39 <210> 311 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 311 ccagttggat ctgctgtann scgctcaggt agcactaca 39 <210> 312 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 312 gttggatctg ctgtatgcnn stcaggtagc actacaggt 39 <210> 313 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 313 ggatctgctg tatgccgcnn sggtagcact acaggttgg 39 <210> 314 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 314 tctgctgtat gccgctcann sagcactaca ggttggcat 39 <210> 315 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 315 gctgtatgcc gctcaggtnn sactacaggt tggcattgc 39 <210> 316 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 316 gtatgccgct caggtagcnn sacaggttgg cattgcgga 39 <210> 317 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 317 tgccgctcag gtagcactnn sggttggcat tgcggaact 39 <210> 318 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 318 cgctcaggta gcactacann stggcattgc ggaactatc 39 <210> 319 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 319 tcaggtagca ctacaggtnn scattgcgga actatcacg 39 <210> 320 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 320 ggtagcacta caggttggnn stgcggaact atcacggcg 39 <210> 321 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 321 agcactacag gttggcatnn sggaactatc acggcgctg 39 <210> 322 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 322 actacaggtt ggcattgcnn sactatcacg gcgctgaat 39 <210> 323 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 323 acaggttggc attgcggann satcacggcg ctgaattcg 39 <210> 324 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 324 ggttggcatt gcggaactnn sacggcgctg aattcgtct 39 <210> 325 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 325 tggcattgcg gaactatcnn sgcgctgaat tcgtctgtc 39 <210> 326 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 326 cattgcggaa ctatcacgnn sctgaattcg tctgtcacg 39 <210> 327 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 327 tgcggaacta tcacggcgnn saattcgtct gtcacgtat 39 <210> 328 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 328 ggaactatca cggcgctgnn stcgtctgtc acgtatcca 39 <210> 329 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 329 actatcacgg cgctgaatnn stctgtcacg tatccagag 39 <210> 330 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 330 atcacggcgc tgaattcgnn sgtcacgtat ccagaggga 39 <210> 331 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 331 acggcgctga attcgtctnn sacgtatcca gagggaaca 39 <210> 332 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 332 gcgctgaatt cgtctgtcnn statccagag ggaacagtc 39 <210> 333 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 333 ctgaattcgt ctgtcacgnn sccagaggga acagtccga 39 <210> 334 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 334 aattcgtctg tcacgtatnn sgagggaaca gtccgagga 39 <210> 335 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 335 tcgtctgtca cgtatccann sggaacagtc cgaggactt 39 <210> 336 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 336 tctgtcacgt atccagagnn sacagtccga ggacttatc 39 <210> 337 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 337 gtcacgtatc cagagggann sgtccgagga cttatccgc 39 <210> 338 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 338 acgtatccag agggaacann scgaggactt atccgcacg 39 <210> 339 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 339 tatccagagg gaacagtcnn sggacttatc cgcacgacg 39 <210> 340 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 340 ccagagggaa cagtccgann scttatccgc acgacggtt 39 <210> 341 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 341 gagggaacag tccgaggann satccgcacg acggtttgt 39 <210> 342 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 342 ggaacagtcc gaggacttnn scgcacgacg gtttgtgcc 39 <210> 343 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 343 acagtccgag gacttatcnn sacgacggtt tgtgccgaa 39 <210> 344 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 344 gtccgaggac ttatccgcnn sacggtttgt gccgaacca 39 <210> 345 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 345 cgaggactta tccgcacgnn sgtttgtgcc gaaccaggt 39 <210> 346 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 346 ggacttatcc gcacgacgnn stgtgccgaa ccaggtgat 39 <210> 347 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 347 cttatccgca cgacggttnn sgccgaacca ggtgatagc 39 <210> 348 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 348 atccgcacga cggtttgtnn sgaaccaggt gatagcgga 39 <210> 349 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 349 cgcacgacgg tttgtgccnn sccaggtgat agcggaggt 39 <210> 350 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 350 acgacggttt gtgccgaann sggtgatagc ggaggtagc 39 <210> 351 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 351 acggtttgtg ccgaaccann sgatagcgga ggtagcctt 39 <210> 352 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 352 gtttgtgccg aaccaggtnn sagcggaggt agcctttta 39 <210> 353 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 353 tgtgccgaac caggtgatnn sggaggtagc cttttagcg 39 <210> 354 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 354 gccgaaccag gtgatagcnn sggtagcctt ttagcggga 39 <210> 355 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 355 gaaccaggtg atagcggann sagcctttta gcgggaaat 39 <210> 356 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 356 ccaggtgata gcggaggtnn scttttagcg ggaaatcaa 39 <210> 357 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 357 ggtgatagcg gaggtagcnn sttagcggga aatcaagcc 39 <210> 358 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 358 gatagcggag gtagccttnn sgcgggaaat caagcccaa 39 <210> 359 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 359 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atcaagccnn sggtgtcacg tcaggtggt 39 <210> 365 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 365 gcgggaaatc aagcccaann sgtcacgtca ggtggttct 39 <210> 366 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 366 ggaaatcaag cccaaggtnn sacgtcaggt ggttctgga 39 <210> 367 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 367 aatcaagccc aaggtgtcnn stcaggtggt tctggaaat 39 <210> 368 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 368 caagcccaag gtgtcacgnn sggtggttct ggaaattgt 39 <210> 369 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 369 gcccaaggtg tcacgtcann 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ggaacaaca 39 <210> 375 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 375 ggtggttctg gaaattgtnn sacgggggga acaacattc 39 <210> 376 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 376 ggttctggaa attgtcggnn sgggggaaca acattcttt 39 <210> 377 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 377 tctggaaatt gtcggacgnn sggaacaaca ttctttcaa 39 <210> 378 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 378 ggaaattgtc ggacggggnn sacaacattc tttcaacca 39 <210> 379 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 379 aattgtcgga cggggggann sacattcttt caaccagtc 39 <210> 380 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 380 tgtcggacgg ggggaacann sttctttcaa ccagtcaac 39 <210> 381 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 381 cggacggggg gaacaacann stttcaacca gtcaacccg 39 <210> 382 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 382 acggggggaa caacattcnn scaaccagtc aacccgatt 39 <210> 383 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 383 gggggaacaa cattctttnn sccagtcaac ccgattttg 39 <210> 384 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 384 ggaacaacat tctttcaann sgtcaacccg attttgcag 39 <210> 385 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 385 acaacattct ttcaaccann saacccgatt ttgcaggct 39 <210> 386 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 386 acattctttc aaccagtcnn sccgattttg caggcttac 39 <210> 387 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 387 ttctttcaac cagtcaacnn sattttgcag gcttacggc 39 <210> 388 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 388 tttcaaccag tcaacccgnn sttgcaggct tacggcctg 39 <210> 389 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 389 caaccagtca acccgattnn scaggcttac ggcctgaga 39 <210> 390 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 390 ccagtcaacc cgattttgnn sgcttacggc ctgagaatg 39 <210> 391 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 391 gtcaacccga ttttgcagnn stacggcctg agaatgatt 39 <210> 392 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 392 aacccgattt tgcaggctnn sggcctgaga atgattacg 39 <210> 393 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 393 ccgattttgc aggcttacnn sctgagaatg attacgact 39 <210> 394 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 394 attttgcagg cttacggcnn sagaatgatt acgactgac 39 <210> 395 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 395 ttgcaggctt acggcctgnn satgattacg actgactct 39 <210> 396 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 396 caggcttacg gcctgagann sattacgact gactctgga 39 <210> 397 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 397 gcttacggcc tgagaatgnn sacgactgac tctggaagt 39 <210> 398 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 398 tacggcctga gaatgattnn sactgactct ggaagttcc 39 <210> 399 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 399 ggcctgagaa tgattacgnn sgactctgga agttcccct 39 <210> 400 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 400 ctgagaatga ttacgactnn stctggaagt tccccttaa 39 <210> 401 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 401 agaatgatta cgactgacnn sggaagttcc ccttaaccc 39 <210> 402 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 402 atgattacga ctgactctnn sagttcccct taacccaac 39 <210> 403 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 403 attacgactg actctggann stccccttaa cccaacaga 39 <210> 404 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 404 acgactgact ctggaagtnn sccttaaccc aacagagga 39 <210> 405 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 405 actgactctg gaagttccnn staacccaac agaggacgg 39 <210> 406 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 406 gttgcctcca attacgtcsn ncatcgttct aggcgtttc 39 <210> 407 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 407 tgcgttgcct ccaattacsn ngaacatcgt tctaggcgt 39 <210> 408 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 408 atatgcgttg cctccaatsn ngtcgaacat cgttctagg 39 <210> 409 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 409 agtatatgcg ttgcctccsn ntacgtcgaa catcgttct 39 <210> 410 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 410 aatagtatat gcgttgccsn naattacgtc gaacatcgt 39 <210> 411 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 411 gccaatagta tatgcgttsn ntccaattac gtcgaacat 39 <210> 412 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 412 gccgccaata gtatatgcsn ngcctccaat tacgtcgaa 39 <210> 413 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 413 ccggccgcca atagtatasn ngttgcctcc aattacgtc 39 <210> 414 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 414 agaccggccg ccaatagtsn ntgcgttgcc tccaattac 39 <210> 415 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 415 tctagaccgg ccgccaatsn natatgcgtt gcctccaat 39 <210> 416 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 416 acatctagac cggccgccsn nagtatatgc gttgcctcc 39 <210> 417 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 417 agaacatcta gaccggccsn naatagtata tgcgttgcc 39 <210> 418 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 418 gatagaacat ctagaccgsn ngccaatagt atatgcgtt 39 <210> 419 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 419 tccgatagaa catctagasn ngccgccaat agtatatgc 39 <210> 420 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 420 gaatccgata gaacatctsn nccggccgcc aatagtata 39 <210> 421 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 421 tgcgaatccg atagaacasn nagaccggcc gccaatagt 39 <210> 422 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 422 tactgcgaat ccgatagasn ntctagaccg gccgccaat 39 <210> 423 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 423 gtttactgcg aatccgatsn nacatctaga ccggccgcc 39 <210> 424 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 424 accgtttact gcgaatccsn nagaacatct agaccggcc 39 <210> 425 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 425 gccaccgttt actgcgaasn ngatagaaca tctagaccg 39 <210> 426 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 426 gaagccaccg tttactgcsn ntccgataga acatctaga 39 <210> 427 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 427 aatgaagcca ccgtttacsn ngaatccgat agaacatct 39 <210> 428 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 428 agtaatgaag ccaccgttsn ntgcgaatcc gatagaaca 39 <210> 429 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 429 ggcagtaatg aagccaccsn ntactgcgaa tccgataga 39 <210> 430 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 430 accggcagta atgaagccsn ngtttactgc gaatccgat 39 <210> 431 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 431 gtgaccggca gtaatgaasn naccgtttac tgcgaatcc 39 <210> 432 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 432 gcagtgaccg gcagtaatsn ngccaccgtt tactgcgaa 39 <210> 433 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 433 tccgcagtga ccggcagtsn ngaagccacc gtttactgc 39 <210> 434 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 434 tcttccgcag tgaccggcsn naatgaagcc accgtttac 39 <210> 435 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 435 tgttcttccg cagtgaccsn nagtaatgaa gccaccgtt 39 <210> 436 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 436 tcctgttctt ccgcagtgsn nggcagtaat gaagccacc 39 <210> 437 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 437 ggctcctgtt cttccgcasn naccggcagt aatgaagcc 39 <210> 438 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 438 agtggctcct gttcttccsn ngtgaccggc agtaatgaa 39 <210> 439 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 439 agtagtggct cctgttctsn ngcagtgacc ggcagtaat 39 <210> 440 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 440 ggcagtagtg gctcctgtsn ntccgcagtg accggcagt 39 <210> 441 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 441 attggcagta gtggctccsn ntcttccgca gtgaccggc 39 <210> 442 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 442 cggattggca gtagtggcsn ntgttcttcc gcagtgacc 39 <210> 443 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 443 agtcggattg gcagtagtsn ntcctgttct tccgcagtg 39 <210> 444 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 444 gccagtcgga ttggcagtsn nggctcctgt tcttccgca 39 <210> 445 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 445 tgtgccagtc ggattggcsn nagtggctcc tgttcttcc 39 <210> 446 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 446 aaatgtgcca gtcggattsn nagtagtggc tcctgttct 39 <210> 447 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 447 tgcaaatgtg ccagtcggsn nggcagtagt ggctcctgt 39 <210> 448 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 448 acctgcaaat gtgccagtsn nattggcagt agtggctcc 39 <210> 449 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 449 gctacctgca aatgtgccsn ncggattggc agtagtggc 39 <210> 450 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 450 cgagctacct gcaaatgtsn nagtcggatt ggcagtagt 39 <210> 451 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 451 aaacgagcta cctgcaaasn ngccagtcgg attggcagt 39 <210> 452 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 452 cggaaacgag ctacctgcsn ntgtgccagt cggattggc 39 <210> 453 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 453 tcccggaaac gagctaccsn naaatgtgcc agtcggatt 39 <210> 454 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 454 atttcccgga aacgagctsn ntgcaaatgt gccagtcgg 39 <210> 455 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 455 atcatttccc ggaaacgasn nacctgcaaa tgtgccagt 39 <210> 456 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 456 ataatcattt cccggaaasn ngctacctgc aaatgtgcc 39 <210> 457 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 457 tgcataatca tttcccggsn ncgagctacc tgcaaatgt 39 <210> 458 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 458 gaatgcataa tcatttccsn naaacgagct acctgcaaa 39 <210> 459 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 459 gacgaatgca taatcattsn ncggaaacga gctacctgc 39 <210> 460 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 460 tcggacgaat gcataatcsn ntcccggaaa 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<222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 506 agttccgcaa tgccaaccsn nagtgctacc tgagcggca 39 <210> 507 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 507 gatagttccg caatgccasn ntgtagtgct acctgagcg 39 <210> 508 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 508 cgtgatagtt ccgcaatgsn nacctgtagt gctacctga 39 <210> 509 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 509 cgccgtgata gttccgcasn nccaacctgt agtgctacc 39 <210> 510 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 510 cagcgccgtg atagttccsn natgccaacc tgtagtgct 39 <210> 511 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 511 attcagcgcc gtgatagtsn ngcaatgcca acctgtagt 39 <210> 512 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 512 cgaattcagc gccgtgatsn ntccgcaatg ccaacctgt 39 <210> 513 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 513 agacgaattc agcgccgtsn nagttccgca atgccaacc 39 <210> 514 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 514 gacagacgaa ttcagcgcsn ngatagttcc gcaatgcca 39 <210> 515 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 515 cgtgacagac gaattcagsn ncgtgatagt tccgcaatg 39 <210> 516 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 516 atacgtgaca gacgaattsn ncgccgtgat agttccgca 39 <210> 517 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 517 tggatacgtg acagacgasn ncagcgccgt gatagttcc 39 <210> 518 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 518 ctctggatac gtgacagasn nattcagcgc cgtgatagt 39 <210> 519 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 519 tccctctgga tacgtgacsn ncgaattcag cgccgtgat 39 <210> 520 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 520 tgttccctct ggatacgtsn nagacgaatt cagcgccgt 39 <210> 521 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, 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Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 567 tggttgaaag aatgttgtsn nccccgtccg acaatttcc 39 <210> 568 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 568 gactggttga aagaatgtsn ntccccccgt ccgacaatt 39 <210> 569 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 569 gttgactggt tgaaagaasn ntgttccccc cgtccgaca 39 <210> 570 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 570 cgggttgact ggttgaaasn ntgttgttcc ccccgtccg 39 <210> 571 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 571 aatcgggttg actggttgsn ngaatgttgt tccccccgt 39 <210> 572 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 572 caaaatcggg ttgactggsn naaagaatgt tgttccccc 39 <210> 573 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 573 ctgcaaaatc gggttgacsn nttgaaagaa tgttgttcc 39 <210> 574 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 574 agcctgcaaa atcgggttsn ntggttgaaa gaatgttgt 39 <210> 575 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 575 gtaagcctgc aaaatcggsn ngactggttg aaagaatgt 39 <210> 576 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 576 gccgtaagcc tgcaaaatsn ngttgactgg ttgaaagaa 39 <210> 577 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 577 caggccgtaa gcctgcaasn ncgggttgac tggttgaaa 39 <210> 578 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 578 tctcaggccg taagcctgsn naatcgggtt gactggttg 39 <210> 579 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 579 cattctcagg ccgtaagcsn ncaaaatcgg gttgactgg 39 <210> 580 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 580 aatcattctc aggccgtasn nctgcaaaat cgggttgac 39 <210> 581 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 581 cgtaatcatt ctcaggccsn nagcctgcaa aatcgggtt 39 <210> 582 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 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misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 587 ggaacttcca gagtcagtsn naatcattct caggccgta 39 <210> 588 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 588 aggggaactt ccagagtcsn ncgtaatcat tctcaggcc 39 <210> 589 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 589 ttaaggggaa cttccagasn nagtcgtaat cattctcag 39 <210> 590 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 590 gggttaaggg gaacttccsn ngtcagtcgt aatcattct 39 <210> 591 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 591 gttgggttaa ggggaactsn nagagtcagt cgtaatcat 39 <210> 592 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 592 tctgttgggt taaggggasn ntccagagtc agtcgtaat 39 <210> 593 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 593 tcctctgttg ggttaaggsn nacttccaga gtcagtcgt 39 <210> 594 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 594 ccgtcctctg ttgggttasn nggaacttcc agagtcagt 39 <210> 595 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 595 gcatatacta ttggcggcct gtctagatgt tctatcgga 39 <210> 596 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 596 actattggcg gccggtctca gtgttctatc ggattcgc 38 <210> 597 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 597 ctgccggtca ctgcggattt acaggagcca ctactgc 37 <210> 598 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 598 atgattatgc attcgtctca acaggggcag gagtaaat 38 <210> 599 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 599 ataactactc gggcggcaca gtccaagtag caggacatac 40 <210> 600 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 600 atccagaggg aacagtcctg ggacttatcc gcacgac 37 <210> 601 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 601 cagtccgagg acttatccag acgacggttt gtgccgaac 39 <210> 602 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 602 gtggttctgg aaattgtcag acggggggaa caacattc 38 <210> 603 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 603 tgcaggctta cggcctgcag atgattacga ctgactc 37 <210> 604 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 604 ttggcggccg gtctagatca tctatcggat tcgcagta 38 <210> 605 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 605 tcattactgc cggtcactca ggaagaacag gagccact 38 <210> 606 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 606 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ccccgcggac catgcacggc gacgtgcgcg gcggcgaccg cta 53 <210> 622 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 622 tagcggtcgc cgccgcgcac gtcgccgtgc atggtccgcg gggtctcgtc ggt 53 <210> 623 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 623 tcagccgatc cgctcgcgga tccccattgt cagcgagccc gacgagcgcg ctgcccgac 59 <210> 624 <211> 184 <212> PRT <213> Cellulomonas strain 69B4 <400> 624 Phe Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Arg 1 5 10 15 Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Asn Gly Gly Phe Ile Thr Ala Gly His 20 25 30 Cys Gly Arg Thr Gly Ala Thr Thr Ala Asn Pro Thr Gly Thr Phe Ala 35 40 45 Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Val Arg Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Val Asn Leu Leu Ala Gln Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Arg Val 65 70 75 80 Gln Val Ala Gly His Thr Ala Ala Pro Val Gly Ser Ala Val Cys Arg 85 90 95 Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Thr Ala Leu Asn 100 105 110 Ser Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val Arg Gly Leu Ile Arg 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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (86)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (89) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (92) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (95) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (127) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (129) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (132) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (155) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (179) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (191)..(198) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 643 Ile Ala Gly Gly Asp Ala Ile Tyr Xaa Xaa Gly Xaa Ser Arg Cys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Phe Asn Val Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Leu Thr Ala 20 25 30 Gly His Cys Thr Xaa Xaa Gly Thr Thr Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Ile Gly Thr Xaa Xaa Gly Ser Ser Phe Pro Xaa Asn Asp 50 55 60 Tyr Gly Ile Val Arg Tyr Thr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val 65 70 75 80 Asn Xaa Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Gln Xaa Ile Thr Xaa Ala Gly Xaa Ala 85 90 95 Xaa Val Gly Xaa Ala Val Xaa Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Xaa His 100 105 110 Xaa Gly Ser Val Thr Ala Leu Asn Ala Thr Val Asn Tyr Gly Xaa Gly 115 120 125 Xaa Ile Val Xaa Gly Leu Ile Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly 130 135 140 Asp Ser Gly Gly Ser Leu Phe Ala Gly Ser Xaa Ala Leu Gly Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln 165 170 175 Pro Val Xaa Glu Ala Leu Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Val Ile Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 <210> 644 <211> 513 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 644 Met Arg Lys Thr Tyr Trp Leu Met Ala Leu Phe Ala Val Leu Val Leu 1 5 10 15 Gly Gly Cys Gln Met Ala Ser Arg Ser Asp Pro Thr Pro Thr Leu Ala 20 25 30 Glu Ala Phe Trp Pro Lys Glu Ala Pro Val Tyr Gly Leu Asp Asp Pro 35 40 45 Glu Ala Ile Pro Gly Arg Tyr Ile Val Val Phe Lys Lys Gly Lys Gly 50 55 60 Gln Ser Leu Leu Gln Gly Gly Ile Thr Thr Leu Gln Ala Arg Leu Ala 65 70 75 80 Pro Gln Gly Val Val Val Thr Gln Ala Tyr Thr Gly Ala Leu Gln Gly 85 90 95 Phe Ala Ala Glu Met Ala Pro Gln Ala Leu Glu Ala Phe Arg Gln Ser 100 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Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Ala Xaa Xaa Val Xaa Xaa Ala Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Leu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Ile Xaa Xaa 145 150 155 160 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Val Xaa 165 170 175 Xaa Asp Ala Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Met Xaa Xaa Xaa Ile Gly Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Ile Ala Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 210 215 220 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ala Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 245 250 255 Xaa Asp Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Ala Asn Xaa Xaa Asn Tyr Ser Xaa Ala 275 280 285 Arg Val Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Ala Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Ile Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala Xaa Pro Xaa Xaa Ala Gly Xaa Ala 340 345 350 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Ala Xaa Xaa Ala 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ser Xaa Xaa Ser Xaa Gly Ser 385 390 395 400 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ser Cys Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa 405 410 415 Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Pro Asn Gly Ser 420 425 430 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Gly Thr His Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Gly 435 440 445 Pro Ala Gly Xaa Asp Phe Asp Leu Tyr Leu Xaa Arg Trp Xaa Gly Ser 450 455 460 Xaa Trp Leu Thr Val Ala Xaa Ser Thr Xaa Pro Xaa Ser Xaa Glu Ser 465 470 475 480 Ile Ser Tyr Xaa Gly Xaa Ala Gly Tyr Tyr Xaa Trp Xaa Ile Xaa Ala 485 490 495 Xaa Ser Gly Ser Gly Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro 500 505 510 <210> 647 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (6)..(188) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 647 Asp Val Ile Gly Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Xaa Gly Gly Phe Val 20 25 30 Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Xaa Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Thr Ser Xaa Pro Xaa Gly Thr Phe Xaa Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn 50 55 60 Asp Tyr Ala Trp Val Gln Val Ala Ser Gly Asn Thr Pro Val Gly Ala 65 70 75 80 Val Asn Asn Tyr Ser Gly Gly Thr Val Xaa Val Ala Gly Ser Thr Xaa 85 90 95 Ala Ala Val Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp 100 105 110 Arg Cys Gly Thr Ile Xaa Ala Tyr Asn Ala Ser Val Xaa Tyr Ala Glu 115 120 125 Gly Thr Val Ser Gly Leu Ile Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly 130 135 140 Asp Ser Gly Gly Ser Leu Leu Ala Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Xaa Xaa Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln 165 170 175 Pro Val Asn Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Tyr Gly Leu Xaa Leu Val 180 185 190 <210> 648 <211> 368 <212> PRT <213> Thermobifida fusca <400> 648 Met Asn His Ser Ser Arg Arg Thr Thr Ser Leu Leu Phe Thr Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Thr Ala Leu Val Ala Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ala Gln 20 25 30 Glu Leu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Gly Leu Ser Asp Ala Glu Val Ala 35 40 45 Glu Leu Arg Ala Ala Glu Ala Glu Ala Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Arg Asp Ser Leu Gly Ser Asp Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Ala Asp 65 70 75 80 Thr Thr Glu Ile Thr Val Ala Val Thr Asp Pro Ala Ala Val Ser Arg 85 90 95 Val Asp Ala Asp Asp Val Thr Val Asp Val Val Asp Phe Gly Glu Thr 100 105 110 Ala Leu Asn Asp Phe Val Ala Ser Leu Asn Ala Ile Ala Asp Thr Ala 115 120 125 Asp Pro Lys Val Thr Gly Trp Tyr Thr Asp Leu Glu Ser Asp Ala Val 130 135 140 Val Ile Thr Thr Leu Arg Gly Gly Thr Pro Ala Ala Glu Glu Leu Ala 145 150 155 160 Glu Arg Ala Gly Leu Asp Glu Arg Ala Val Arg Ile Val Glu Glu Asp 165 170 175 Glu Glu Pro Gln Ser Leu Ala Ala Ile Ile Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gln Gly Ser 195 200 205 Gln Thr Gly Phe Ala Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Thr Gly Thr Arg 210 215 220 Val Ser Ser Pro Ser Gly Thr Val Ala Gly Ser Tyr Phe Pro Gly Arg 225 230 235 240 Asp Met Gly Trp Val Arg Ile Thr Ser Ala Asp Thr Val Thr Pro Leu 245 250 255 Val Asn Arg Tyr Asn Gly Gly Thr Val Thr Val Thr Gly Ser Gln Glu 260 265 270 Ala Ala Thr Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ala Thr Thr Gly Trp 275 280 285 Arg Cys Gly Thr Ile Gln Ser Lys Asn Gln Thr Val Arg Tyr Ala Glu 290 295 300 Gly Thr Val Thr Gly Leu Thr Arg Thr Thr Ala Cys Ala Glu Gly Gly 305 310 315 320 Asp Ser Gly Gly Pro Trp Leu Thr Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr 325 330 335 Ser Gly Gly Thr Gly Asp Cys Arg Ser Gly Gly Ile Thr Phe Phe Gln 340 345 350 Pro Ile Asn Pro Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Gln Leu Val Thr Gly 355 360 365 <210> 649 <211> 382 <212> PRT <213> Streptomyces spp. <400> 649 Met Arg His Thr Gly Arg Asn Ala Ile Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Ser Gln Ala Ala Ala Asn Asp Thr 20 25 30 Leu Thr Glu Arg Ala Glu Ala Ala Val Ala Asp Leu Pro Ala Gly Val 35 40 45 Leu Asp Ala Met Glu Arg Asp Leu Gly Leu Ser Glu Gln Glu Ala Gly 50 55 60 Leu Lys Leu Val Ala Glu His Asp Ala Ala Leu Leu Gly Glu Thr Leu 65 70 75 80 Ser Ala Asp Leu Asp Ala Phe Ala Gly Ser Trp Leu Ala Glu Gly Thr 85 90 95 Glu Leu Val Val Ala Thr Thr Ser Glu Ala Glu Ala Ala Glu Ile Thr 100 105 110 Glu Ala Gly Ala Thr Ala Glu Val Val Asp His Thr Leu Ala Glu Leu 115 120 125 Asp Ser Val Lys Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ala Glu Ser Tyr Asp Thr 130 135 140 Thr Asp Ala Pro Val Trp Tyr Val Asp Val Thr Thr Asn Gly Val Val 145 150 155 160 Leu Leu Thr Ser Asp Val Thr Glu Ala Glu Gly Phe Val Glu Ala Ala 165 170 175 Gly Val Asn Ala Ala Ala Val Asp Ile Gln Thr Ser Asp Glu Gln Pro 180 185 190 Gln Ala Phe Tyr Asp Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met Gly Gly 195 200 205 Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ser Val Thr Gln Gly Ser Thr Pro Gly 210 215 220 Phe Ala Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser Thr Thr Gly 225 230 235 240 Tyr Asn Gln Ala Ala Gln Gly Thr Phe Glu Glu Ser Ser Phe Pro Gly 245 250 255 Asp Asp Met Ala Trp Val Ser Val Asn Ser Asp Trp Asn Thr Thr Pro 260 265 270 Thr Val Asn Glu Gly Glu Val Thr Val Ser Gly Ser Thr Glu Ala Ala 275 280 285 Val Gly Ala Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys 290 295 300 Gly Thr Ile Gln Gln His Asn Thr Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr 305 310 315 320 Ile Thr Gly Val Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser 325 330 335 Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly 340 345 350 Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr His Gln Pro Ile 355 360 365 Asn Pro Leu Leu Ser Ala Tyr Gly Leu Asp Leu Val Thr Gly 370 375 380 <210> 650 <211> 388 <212> PRT <213> Streptomyces spp. <400> 650 Met Arg Leu Lys Gly Arg Thr Val Ala Ile Gly Ser Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ser Ala Leu Ala Leu Ser Leu Val Pro Ala Asn Ala Ser Ser Glu Leu 20 25 30 Pro Ser Ala Glu Thr Ala Lys Ala Asp Ala Leu Val Glu Gln Leu Pro 35 40 45 Ala Gly Met Val Asp Ala Met Glu Arg Asp Leu Gly Val Pro Ala Ala 50 55 60 Glu Val Gly Asn Gln Leu Val Ala Glu His Glu Ala Ala Val Leu Glu 65 70 75 80 Glu Ser Leu Ser Glu Asp Leu Ser Gly Tyr Ala Gly Ser Trp Ile Val 85 90 95 Glu Gly Thr Ser Glu His Val Val Ala Thr Thr Asp Arg Ala Glu Ala 100 105 110 Ala Glu Ile Thr Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Val Val Glu His Ser 115 120 125 Leu Ala Glu Leu Glu Ala Val Lys Asp Ile Leu Asp Glu Ala Ala Thr 130 135 140 Ala Asn Pro Glu Asp Ala Ala Pro Val Trp Tyr Val Asp Val Thr Thr 145 150 155 160 Asn Glu Val Val Val Leu Ala Ser Asp Val Pro Ala Ala Glu Ala Phe 165 170 175 Val Ala Ala Ser Gly Ala Asp Ala Ser Thr Val Arg Val Glu Arg Ser 180 185 190 Asp Glu Ser Pro Gln Pro Phe Tyr Asp Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr 195 200 205 Tyr Ile Gly Asn Gly Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gln Gly 210 215 220 Ser Thr Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val Gly Asn 225 230 235 240 Ala Thr Thr Gly Phe Asn Arg Val Ser Gln Gly Thr Phe Arg Gly Ser 245 250 255 Trp Phe Pro Gly Arg Asp Met Ala Trp Val Ala Val Asn Ser Asn Trp 260 265 270 Thr Pro Thr Ser Leu Val Arg Asn Ser Gly Ser Gly Val Arg Val Thr 275 280 285 Gly Ser Thr Gln Ala Thr Val Gly Ser Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser 290 295 300 Thr Thr Gly Trp Arg Cys Gly Thr Ile Gln Gln His Asn Thr Ser Val 305 310 315 320 Thr Tyr Pro Gln Gly Thr Ile Thr Gly Val Thr Arg Thr Ser Ala Cys 325 330 335 Ala Gln Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr Gln Ala 340 345 350 Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ile Gly Gly Thr 355 360 365 Thr Phe His Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Ser Gln Tyr Gly Leu Thr 370 375 380 Leu Val Arg Ser 385 <210> 651 <211> 458 <212> PRT <213> Streptomyces lividans <400> 651 Met Val Gly Arg His Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ala Ala Leu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ala Leu Val Leu Thr Ala Leu Pro Ser Ala Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Pro Pro Val Pro Gly Pro Arg Pro Ala Val Ala Arg Thr Pro Asp 35 40 45 Ala Ala Thr Ala Pro Ala Arg Met Leu Ser Ala Met Glu Arg Asp Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Pro Gly Gln Ala Ala Ala Arg Pro Val Asn Glu Ala Glu 65 70 75 80 Ala Gly Thr Arg Ala Gly Met Leu Arg Asn Thr Leu Gly Asp Arg Phe 85 90 95 Ala Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Thr Ser Ala Glu Leu Thr Val Ala 100 105 110 Thr Thr Asp Ala Ala Asp Thr Ala Ala Ile Glu Ala Gln Gly Ala Lys 115 120 125 Ala Ala Val Val Gly Arg Asn Leu Ala Glu Leu Arg Ala Val Lys Glu 130 135 140 Lys Leu Asp Ala Ala Ala Val Arg Thr Arg Thr Arg Gln Thr Pro Val 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Val Lys Thr Asn Arg Val Thr Val Gln Ala Thr Gly 165 170 175 Ala Ser Ala Ala Ala Ala Phe Val Glu Ala Ala Gly Val Pro Ala Ala 180 185 190 Asp Val Gly Val Arg Val Ser Pro Asp Gln Pro Arg Val Leu Glu Asp 195 200 205 Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ile Asp Asp Gln Ala Arg Cys Ser 210 215 220 Ile Gly Phe Ser Val Thr Lys Asp Asp Gln Glu Gly Phe Ala Thr Ala 225 230 235 240 Gly His Cys Gly Asp Pro Gly Ala Thr Thr Thr Gly Tyr Asn Glu Ala 245 250 255 Asp Gln Gly Thr Phe Gln Ala Ser Thr Phe Pro Gly Lys Asp Met Ala 260 265 270 Trp Val Gly Val Asn Ser Asp Trp Thr Ala Thr Pro Asp Val Lys Ala 275 280 285 Glu Gly Gly Glu Lys Ile Gln Leu Ala Gly Ser Val Glu Ala Leu Val 290 295 300 Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 305 310 315 320 Thr Ile Gln Gln His Asp Thr Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val 325 330 335 Asp Gly Leu Thr Gly Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 340 345 350 Gly Pro Phe Val Ser Gly Val Gln Ala Gln Gly Thr Thr Ser Gly Gly 355 360 365 Ser Gly Asp Cys Thr Asn Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Pro Val Asn 370 375 380 Pro Leu Leu Ser Asp Phe Gly Leu Thr Leu Lys Thr Thr Ser Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gln Thr Pro Ala Pro Gln Asp Asn Ala Ala Ala Asp Ala Trp Thr 405 410 415 Ala Gly Arg Val Tyr Glu Val Gly Thr Thr Val Ser Tyr Asp Gly Val 420 425 430 Arg Tyr Arg Cys Leu Gln Ser His Gln Ala Gln Gly Val Gly Ser Pro 435 440 445 Ala Ser Val Pro Ala Leu Trp Gln Arg Val 450 455 <210> 652 <211> 458 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor A3(2) <400> 652 Met Val Gly Arg His Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ala Ala Leu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ala Leu Val Leu Thr Ala Leu Pro Ser Ala Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Pro Pro Val Pro Gly Pro Arg Pro Ala Val Ala Arg Thr Pro Asp 35 40 45 Ala Ala Thr Ala Pro Ala Arg Met Leu Ser Ala Met Glu Arg Asp Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Pro Gly Gln Ala Ala Ala Arg Leu Val Asn Glu Ala Glu 65 70 75 80 Ala Gly Thr Arg Ala Gly Met Leu Arg Asn Thr Leu Gly Asp Arg Phe 85 90 95 Ala Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Thr Ser Ala Glu Leu Thr Val Ala 100 105 110 Thr Thr Asp Ala Ala Asp Thr Ala Ala Ile Glu Ala Gln Gly Ala Lys 115 120 125 Ala Ala Val Val Gly Arg Asn Leu Ala Glu Leu Arg Ala Val Lys Glu 130 135 140 Lys Leu Asp Ala Ala Ala Val Arg Thr Arg Thr Arg Gln Thr Pro Val 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Val Lys Thr Asn Arg Val Thr Val Gln Ala Thr Gly 165 170 175 Ala Ser Ala Ala Ala Ala Phe Val Glu Ala Ala Gly Val Pro Ala Ala 180 185 190 Asp Val Gly Val Arg Val Ser Pro Asp Gln Pro Arg Val Leu Glu Asp 195 200 205 Leu Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ile Asp Asp Gln Ala Arg Cys Ser 210 215 220 Ile Gly Phe Ser Val Thr Lys Asp Asp Gln Glu Gly Phe Ala Thr Ala 225 230 235 240 Gly His Cys Gly Asp Pro Gly Ala Thr Thr Thr Gly Tyr Asn Glu Ala 245 250 255 Asp Gln Gly Thr Phe Gln Ala Ser Thr Phe Pro Gly Lys Asp Met Ala 260 265 270 Trp Val Gly Val Asn Ser Asp Trp Thr Ala Thr Pro Asp Val Lys Ala 275 280 285 Glu Gly Gly Glu Lys Ile Gln Leu Ala Gly Ser Val Glu Ala Leu Val 290 295 300 Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 305 310 315 320 Thr Ile Gln Gln His Asp Thr Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Val 325 330 335 Asp Gly Leu Thr Glu Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 340 345 350 Gly Pro Phe Val Ser Gly Val Gln Ala Gln Gly Thr Thr Ser Gly Gly 355 360 365 Ser Gly Asp Cys Thr Asn Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Pro Val Asn 370 375 380 Pro Leu Leu Ser Asp Phe Gly Leu Thr Leu Lys Thr Thr Ser Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gln Thr Pro Ala Pro Gln Asp Asn Ala Ala Ala Asp Ala Trp Thr 405 410 415 Ala Gly Arg Val Tyr Glu Val Gly Thr Thr Val Ser Tyr Asp Gly Val 420 425 430 Arg Tyr Arg Cys Leu Gln Ser His Gln Ala Gln Gly Val Gly Ser Pro 435 440 445 Ala Ser Val Pro Ala Leu Trp Gln Arg Val 450 455 <210> 653 <211> 456 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis MA-4680 <400> 653 Met Val His Arg His Val Gly Ala Gly Cys Ala Gly Leu Ser Val Leu 1 5 10 15 Ala Thr Leu Val Leu Thr Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ala Ile Glu Pro 20 25 30 Pro Gly Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ala Val Gln Pro Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Asn Pro Ser Thr Ala Val Leu Gly Ala Leu Gln Arg Asp Leu His Leu 50 55 60 Thr Asp Thr Gln Ala Lys Thr Arg Leu Val Asn Glu Met Glu Ala Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ala Gly Arg Leu Gln Asn Ala Leu Gly Lys His Phe Ala Gly 85 90 95 Ala Trp Val His Gly Ala Ala Ser Ala Asp Leu Thr Val Ala Thr Thr 100 105 110 His Ala Thr Asp Ile Pro Ala Ile Thr Ala Gly Gly Ala Thr Ala Val 115 120 125 Val Val Lys Thr Gly Leu Asp Asp Leu Lys Gly Ala Lys Lys Lys Leu 130 135 140 Asp Ser Ala Val Ala His Gly Gly Thr Ala Val Asn Thr Pro Val Arg 145 150 155 160 Tyr Val Asp Val Arg Thr Asn Arg Val Thr Leu Gln Ala Arg Ser Arg 165 170 175 Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ile Ala Ala Ala Gly Val Asp Ser Gly Leu 180 185 190 Val Asp Val Lys Val Ser Glu Asp Arg Pro Arg Ala Leu Phe Asp Ile 195 200 205 Arg Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ile Asp Asn Thr Ala Arg Cys Ser Val 210 215 220 Gly Phe Ser Val Thr Lys Gly Asn Gln Gln Gly Phe Ala Thr Ala Gly 225 230 235 240 His Cys Gly Arg Ala Gly Ala Pro Thr Ala Gly Phe Asn Glu Val Ala 245 250 255 Gln Gly Thr Val Gln Ala Ser Val Phe Pro Gly His Asp Met Ala Trp 260 265 270 Val Gly Val Asn Ser Asp Trp Thr Ala Thr Pro Asp Val Ala Gly Ala 275 280 285 Ala Gly Gln Asn Val Ser Ile Ala Gly Ser Val Gln Ala Ile Val Gly 290 295 300 Ala Ala Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr 305 310 315 320 Val Glu Glu His Asp Thr Ser Val Thr Tyr Glu Glu Gly Thr Val Asp 325 330 335 Gly Leu Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly 340 345 350 Ser Phe Val Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser 355 360 365 Gly Asp Cys Thr Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Pro Val Asn Pro 370 375 380 Ile Leu Ser Thr Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ser Thr Ala Pro Thr 385 390 395 400 Asp Thr Pro Ser Asp Pro Val Asp Gln Ser Gly Val Trp Ala Ala Gly 405 410 415 Arg Val Tyr Glu Val Gly Ala Gln Val Thr Tyr Ala Gly Val Thr Tyr 420 425 430 Gln Cys Leu Gln Ser His Gln Ala Gln Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala 435 440 445 Thr Pro Ala Leu Trp Gln Arg Leu 450 455 <210> 654 <211> 458 <212> PRT <213> Streptomyces lividans <400> 654 Met Pro His Arg His Arg His His Arg Ala Val Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala 20 25 30 Gly Thr Ala Pro Ala Gly Ser Ala Pro Thr Ala Ala Glu Thr Leu Arg 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Pro Pro Ala Leu Leu Lys Ala Met Gln Arg Asp Leu 50 55 60 Gly Ile Asp Arg Arg Gln Ala Glu Arg Arg Leu Val Asn Glu Ala Glu 65 70 75 80 Ala Gly Ala Thr Ala Gly Arg Leu Arg Ala Ala Leu Gly Gly Asp Phe 85 90 95 Ala Gly Ala Trp Val Arg Gly Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr Val Ala 100 105 110 Thr Thr Asp Ala Gly Asp Val Ala Ala Val Glu Ala Arg Gly Ala Glu 115 120 125 Ala Lys Val Val Arg His Ser Leu Ala Asp Leu Asp Ala Ala Lys Ala 130 135 140 Arg Leu Asp Thr Ala Ala Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asp Ala Pro Val 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Thr Arg Thr Asn Thr Val Val Val Glu Ala Ile Arg 165 170 175 Pro Ala Ala Ala Arg Ser Leu Leu Thr Ala Ala Gly Val Asp Gly Ser 180 185 190 Leu Ala His Val Lys Asn Arg Thr Glu Arg Pro Arg Thr Phe Tyr Asp 195 200 205 Leu Arg Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ile Asn Asn Ser Ser Arg Cys Ser 210 215 220 Ile Gly Phe Pro Ile Thr Lys Gly Thr Gln Gln Gly Phe Ala Thr Ala 225 230 235 240 Gly His Cys Asp Arg Ala Gly Ser Ser Thr Thr Gly Ala Asn Arg Val 245 250 255 Ala Gln Gly Thr Phe Gln Gly Ser Ile Phe Pro Gly Arg Asp Met Ala 260 265 270 Trp Val Ala Thr Asn Ser Ser Trp Thr Ala Thr Pro Tyr Val Leu Gly 275 280 285 Ala Gly Gly Gln Asn Val Gln Val Thr Gly Ser Thr Ala Ser Pro Val 290 295 300 Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 305 310 315 320 Thr Val Thr Gln Leu Asn Thr Ser Val Thr Tyr Gln Glu Gly Thr Ile 325 330 335 Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 340 345 350 Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 355 360 365 Ser Gly Asp Cys Arg Thr Gly Gly Gly Thr Phe Phe Gln Pro Ile Asn 370 375 380 Ala Leu Leu Gln Asn Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Thr Gly Gly Asp 385 390 395 400 Asp Gly Gly Gly Asp Asp Gly Gly Glu Glu Pro Gly Gly Thr Trp Ala 405 410 415 Ala Gly Thr Val Tyr Gln Pro Gly Asp Thr Val Thr Tyr Gly Gly Ala 420 425 430 Thr Phe Arg Cys Leu Gln Gly His Gln Ala Tyr Ala Gly Trp Glu Pro 435 440 445 Pro Asn Val Pro Ala Leu Trp Gln Arg Val 450 455 <210> 655 <211> 463 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor A3(2) <400> 655 Met Pro His Arg His Arg His His Arg Ala Val Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Ser Gly Ser Ala Ser Ala 20 25 30 Gly Thr Ala Pro Ala Gly Ser Ala Pro Thr Ala Ala Glu Thr Leu Arg 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Pro Pro Ala Leu Leu Lys Ala Met Gln Arg Asp Leu 50 55 60 Gly Leu Asp Arg Arg Gln Ala Glu Arg Arg Leu Val Asn Glu Ala Glu 65 70 75 80 Ala Gly Ala Thr Ala Gly Arg Leu Arg Ala Ala Leu Gly Gly Asp Phe 85 90 95 Ala Gly Ala Trp Val Arg Gly Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr Val Ala 100 105 110 Thr Thr Asp Ala Gly Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Arg Gly Ala Glu 115 120 125 Ala Lys Val Val Arg His Ser Leu Ala Asp Leu Asp Ala Ala Lys Ala 130 135 140 Arg Leu Asp Thr Ala Ala Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asp Ala Pro Val 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Thr Arg Thr Asn Thr Val Val Val Glu Ala Ile Arg 165 170 175 Pro Ala Ala Ala Arg Ser Leu Leu Thr Ala Ala Gly Val Asp Gly Ser 180 185 190 Leu Ala His Val Lys Asn Arg Thr Glu Arg Pro Arg Thr Phe Tyr Asp 195 200 205 Leu Arg Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ile Asn Asn Ser Ser Arg Cys Ser 210 215 220 Ile Gly Phe Pro Ile Thr Lys Gly Thr Gln Gln Gly Phe Ala Thr Ala 225 230 235 240 Gly His Cys Gly Arg Ala Gly Ser Ser Thr Thr Gly Ala Asn Arg Val 245 250 255 Ala Gln Gly Thr Phe Gln Gly Ser Ile Phe Pro Gly Arg Asp Met Ala 260 265 270 Trp Val Ala Thr Asn Ser Ser Trp Thr Ala Thr Pro Tyr Val Leu Gly 275 280 285 Ala Gly Gly Gln Asn Val Gln Val Thr Gly Ser Thr Ala Ser Pro Val 290 295 300 Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 305 310 315 320 Thr Val Thr Gln Leu Asn Thr Ser Val Thr Tyr Gln Glu Gly Thr Ile 325 330 335 Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 340 345 350 Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 355 360 365 Ser Gly Asp Cys Arg Thr Gly Gly Glu Thr Phe Phe Gln Pro Ile Asn 370 375 380 Ala Leu Leu Gln Asn Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Thr Gly Gly Asp 385 390 395 400 Asp Gly Gly Gly Asp Asp Gly Gly Gly Asp Asp Gly Gly Glu Glu Pro 405 410 415 Gly Gly Thr Trp Ala Ala Gly Thr Val Tyr Gln Pro Gly Asp Thr Val 420 425 430 Thr Tyr Gly Gly Ala Thr Phe Arg Cys Leu Gln Gly His Gln Ala Tyr 435 440 445 Ala Gly Trp Glu Pro Pro Asn Val Pro Ala Leu Trp Gln Arg Val 450 455 460 <210> 656 <211> 457 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <400> 656 Met Glu Arg Thr Thr Leu Arg Arg Arg Ala Leu Val Ala Gly Thr Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Val Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Thr Gly Val Ala 20 25 30 Ser Ala Asp Pro Ala Ala Thr Ala Ala Pro Pro Val Ser Ala Asp Ser 35 40 45 Leu Ser Pro Gly Met Leu Ala Ala Leu Glu Arg Asp Leu Gly Leu Asp 50 55 60 Glu Asp Ala Ala Arg Ser Arg Ile Ala Asn Glu Tyr Arg Ala Ala Ala 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Leu Glu Lys Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Ala Gly Ala 85 90 95 Arg Val Ser Gly Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Thr Thr Asp Ala 100 105 110 Ser Glu Ala Ala Arg Ile Thr Glu Ala Gly Ala Arg Ala Glu Val Val 115 120 125 Gly His Ser Leu Asp Arg Phe Glu Gly Val Lys Lys Ser Leu Asp Lys 130 135 140 Ala Ala Leu Asp Lys Ala Pro Lys Asn Val Pro Val Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Val Ala Ala Asn Arg Val Val Val Asn Ala Ala Ser Pro Ala Ala Gly 165 170 175 Gln Ala Phe Leu Lys Val Ala Gly Val Asp Arg Gly Leu Val Thr Val 180 185 190 Ala Arg Ser Ala Glu Gln Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ile Arg Gly Gly 195 200 205 Asp Ala Tyr Tyr Met Asn Gly Ser Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ser 210 215 220 Val Thr Arg Gly Thr Gln Asn Gly Phe Ala Thr Ala Gly His Cys Gly 225 230 235 240 Arg Val Gly Thr Thr Thr Asn Gly Val Asn Gln Gln Ala Gln Gly Thr 245 250 255 Phe Gln Gly Ser Thr Phe Pro Gly Arg Asp Ile Ala Trp Val Ala Thr 260 265 270 Asn Ala Asn Trp Thr Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Tyr Gly Arg Gly 275 280 285 Asp Val Thr Val Ala Gly Ser Thr Ala Ser Val Val Gly Ala Ser Val 290 295 300 Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Gln 305 310 315 320 Leu Asn Thr Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Ile Ser Gly Val Thr 325 330 335 Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile 340 345 350 Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys 355 360 365 Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Ile Asn Pro Leu Leu Gln 370 375 380 Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Val Thr Ser Gly Gly Gly Thr Pro Thr Asp 385 390 395 400 Pro Pro Thr Thr Pro Pro Thr Asp Ser Pro Gly Gly Thr Trp Ala Val 405 410 415 Gly Thr Ala Tyr Ala Ala Gly Ala Thr Val Thr Tyr Gly Gly Ala Thr 420 425 430 Tyr Arg Cys Leu Gln Ala His Thr Ala Gln Pro Gly Trp Thr Pro Ala 435 440 445 Asp Val Pro Ala Leu Trp Gln Arg Val 450 455

Claims (109)

  1. 미크로코시니애 (Micrococcineae) 의 일원으로부터 수득되는 단리된 세린 프로테아제 (protease).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로테아제가 셀룰로모나딘 (cellulomonadin) 인 세린 프로테아제.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 프로테아제가 셀룰로모나스 (Cellulomonas), 오엘스코비아 (Oerskovia), 셀룰로시미크로비움 (Cellulosimicrobium), 자일라니박테리움 (Xylanibacterium) 및 프로미크로모노스포라 (Promicromonospora) 로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득되는 세린 프로테아제.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 프로테아제가 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득되는 세린 프로테아제.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 프로테아제가 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 세린 프로테아제.
  6. 제 4 항의 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가지는 단리된 세린 프로테아제를 포함한 조성물.
  7. 제 1 항의 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가지는 단리된 세린 프로테아제를 포함한 조성물.
  8. 제 5 항의 세린 프로테아제에 대한 아미노산 동일성이 60% 이상인 단리된 세린 프로테아제.
  9. 제 4 항의 아미노산 서열로서, 상기 서열이 하기 위치들을 포함한 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함한 아미노산 서열: 2, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 43, 46, 49, 51, 54, 61, 64, 65, 67, 70, 71, 76, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 90, 93, 99, 100, 105, 107, 109, 112, 113, 116, 118, 119, 121, 123, 127, 145, 155, 159, 160, 163, 165, 170, 174, 179, 183, 184, 185, 186, 187 및 188.
  10. 제 4 항의 아미노산 서열로서, 상기 서열이 하기 위치들을 포함한 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함한 아미노산 서열: 1, 4, 22, 27, 28, 30, 32, 41, 47, 48, 55, 59, 63, 66, 69, 75, 77, 80, 84, 87, 88, 89, 92, 96, 110, 111, 114, 115, 117, 128, 134, 144, 143, 146, 151, 154, 156, 158, 161, 166, 176, 177, 181, 182, 187 및 189.
  11. 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 서열을 가진 단리된 프로테아제 변형체 (variant).
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 치환들이 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어지는, 단리된 프로테아제: 2, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 43, 46, 49, 51, 54, 61, 64, 65, 67, 70, 71, 76, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 90, 93, 99, 100, 105, 107, 109, 112, 113, 116, 118, 119, 121, 123, 127, 145, 155, 159, 160, 163, 165, 170, 174, 179, 183, 184, 185, 186, 187 및 188.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 치환이 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어지는, 단리된 프로테아제: 1, 4, 22, 27, 28, 30, 32, 41, 47, 48, 55, 59, 63, 66, 69, 75, 77, 80, 84, 87, 88, 89, 92, 96, 110, 111, 114, 115, 117, 128, 134, 144, 143, 146, 151, 154, 156, 158, 161, 166, 176, 177, 181, 182, 187 및 189.
  14. 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 단리된 프로테아제로서, 이때 14, 16, 35, 36, 65, 75, 76, 79, 123, 127, 159 및 179 로 이루어진 군에서 선택되는 위치들 중의 하나 이상의 아미노산 위치가 또 다른 아미노산으로 치환되는, 단리된 프로테아제.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 프로테아제가 R14L, R16I, R16L, R16Q, R35F, T36S, G65Q, Y75G, N76L, N76V, R79T, R123L, R123Q, R127A, R127K, R127Q, R159K, R159Q 및 R179Q 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이 (mutation) 를 포함한 프로테아제.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 프로테아제가 R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q 및 R16Q/R79T 로 이루어진 군에서 선택되는 다중 변이를 포함한 프로테아제.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 프로테아제가 하기 변이들 R123L, R127Q 및 R179Q 를 포함한 프로테아제.
  18. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: T36I, A38R, N170Y, N73T, G77T, N24A, T36G, N24E, L69S, T36N, T36S, E119R, N74G, T36W, S76W, N24T, N24Q, T36P, S76Y, T36H, G54D, G78A, S187P, R179V, N24V, V90P, T36D, L69H, G65P, G65R, N7L, W103M, N55F, G186E, A70H, S76V, G186V, R159F, T36Y, T36V, G65V, N24M, S51A, G65Y, Q71I, V66H, P118A, T116F, A38F, N24H, V66D, S76L, G177M, G186I, H85Q, Q71K, Q71G, G65S, A38D, P118F, A38S, G65T, N67G, T36R, P118R, S114G, Y75I, I181H, G65Q, Y75G, T36F, A38H, R179M, T183I, G78S, A64W, Y75F, G77S, N24L, W103I, V3L, Q81V, R179D, G54R, T36L, Q71M, A70S, G49F, G54L, G54H, G78H, R179I, Q81K, V90I, A38L, N67L, T109I, R179N, V66I, G78T, R179Y, S187T, N67K, N73S, E119K, V3I, Q71H, I11Q, A64H, R14E, R179T, L69V, V150L, Q71A, G65L, Q71N, V90S, A64N, I11A, N145I, H85T, A64Y, N145Q, V66L, S92G, S188M, G78D, N67A, N7S, V80H, G54K, A70D, P118H, D2G, G54M, Q81H, D2Q, V66E, R79P, A38N, N145E, R179L, T109H, R179K, V66A, G54A, G78N, T109A, R179A, N7A, R179E, H104K, A64R 및 V80L.
  19. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: H85R, H85L, T62I, N67H, G54I, N24F, T40V, T86A, G63V, G54Q, A64F, G77Y, R35F, T129S, R61M, I126L, S76N, T182V, R79G, T109P, R127F, R123E, P118I, T109R, 171S, T183K, N67T, P89N, F1T, A64K, G78I, T109L, G78V, A64M, A64S, T10G, G77N, A64L, N67D, S76T, N42H, D184F, D184R, S76I, S78R, A38K, V72I, V3T, T107S, A38V, F47I, N55Q, S76E, P118Q, T109G, Q71D, P118K, N67S, Q167N, N145G, I28L, I11T, A64I, G49K, G49A, G65A, N170D, H85K, S185I, I181N, V80F, L69W, S76R, D184H, V150M, T183M, N67Q, S51Q, A38Y, T107V, N145T, Q71F, A83N, S76A, N67R, T151L, T163L, S51F, Q81I, F47M, A41N, P118E, N67Y, T107M, N73H, 67V, G63W, T10K, I181G, S187E, T107H, D2A, L142V, A143N, A8G, S187L, V90A, G49L, N170L, G65H, T36C, G12W, S76Q, A143S, F1A, N7H, S185V, A110T, N55K, N67F, N7I, A110S, N170A, Q81D, A64Q, Q71L, A38I, N112I, V90T, N145L, A64T, I11S, A30S, R123I, D2H, V66M, Q71R, V90L, L68W, N24S, R159E, V66N, D184Q, E133Q, A64V, D2N, G13M, T40S, S76K, G177S, G63Q, S15F, A8K, A70G 및 A38G.
  20. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: R35E, R35D, R14E, R14D, Q167E, G49C, S15R, S15H, I11W, S15C, G49Q, R35Q, R35V, G49E, R123D, R123Y, G49H, A38D, R35S, F47R, R123C, T151L, R14T, R35T, R123E, G49A, G49V, D56L, R35N, R35A, G12D, R35C, R123N, T46V, R123H, S155C, T121E, R127E, S113C, R123T, R16E, T46F, T121L, A38C, T46E, R123W, T44E, N55G, A8G, E119G, R35P, R14G, F59W, R127S, R61E, R14S, S155W, R123F, R123S, G49N, R127D, E119Y, A48E, N170D, R159T, S99A, G12Q, P118R, F165W, R127Q, R35H, G12N, A22C, G12V, R16T, Y57G, T100A, T46Y, R159E, E119R, T107R, T151C, G54C, E119T, R61V, I11E, R14I, R61M, S15E, A22S, R16C, T36C, R16V, L125Q, M180L, R123Q, R14A, R14Q, R35M, R127K, R159Q, N112P, G124D, R179E, G49L, A41D, G177D, R123V, E119V, T10L, T109E, R179D, G12S, T10C, G91Q, S15Y, S155Y, R14C, T163D, T121F, R14N, F165E, N24E, A41C, R61T, G12I, P118K, T46C, I11T, R159D, N170C, R159V, S155I, I11Q, D2P, T100R, R159S, S114C, R16D 및 P134R.
  21. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: S99G, T100K, R127A, F1P, S155V, T128A, F165H, G177E, A70M, S140P, A87E, D2I, R159K, T36V, R179C, E119N, T10Y, I172A, A8T, F47V, W103L, R61K, D2V, R179V, D2T, R159N, E119A, G54E, R16Q, G49S, R16I, S51L, S155E, S15M, R179I, T10Q, G12H, R159C, R179T, T163C, R159A, A132S, N157D, G13E, L141M, A41T, R123M, R14M, A8R, Q81P, N24T, T10D, A88F, R61Q, S99K, R179Y, T121A, N112E, S155T, T151V, S99Q, T10E, S92T, T109K, T44C, R123A, A87C, S15F, S155F, D56F, T10F, A83H, R179M, T121D, G13D, P118C, G49F, Q174C, S114E, T86E, F1N, T115C, R127C, R123K, V66N, G12Y, S113A, S15N, A175T, R79T, R123G, R179S, R179N, R123I, P118A, S187E, N112D, A70G, E119L, E119S, R159M, R14H, R179F, A64C, A41S, R179W, N24G, T100Q, P118W, Q81G, G49K, R14L, N55A, R35K, R79V, D2M, T160D, A83D, R179L, S51A, G12P, S99H, N42D, S188E, T10M, L125M, T116N, A70P, Q174S, G65D, S113D, E119Q, A83E, N170L, Q81A, S51C, P118G, Q174T, I28V, S15G 및 T116G.
  22. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군 에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: G26I, G26K, G26Q, G26V, G26W, F27V, F27W, I28P, T29E, T129W, T40D, T40Q, R43D, P43H, P43K, P43L, A22C, T40H, P89W, G91L, S18E, F59K, A30M, A30N, G31M, C33M, G161L, G161V, P43N, G26E, N73P, G84C, G84P, G45V, C33L, Y9E, Y9P, A147E, C158H, I28W, A48P, A22S, T62R, S137R, S155P, S155R, G156I, G156L, Q81A, R96C, I4D, I4P, A70P, C105E, C105G, C105K, C105M, C105N, C105S, T128A, T128V, T128G, S140P, G12D, C33N, C33E, T164G, G45A, G156P, S99A, Q167L, S155W, I28T, R96F, A30P, R123W, T40P, T39R, C105P, T100A, C105W, S155K, T46Y, R123F, I4G, S155Y, T46V, A93S, Y57N, Q81S, G186S, G31H, T10Y, G31V, A83H, A38D, R123Y, R79T, C158G, G31Y, Q81P, R96E, A30Y, R159K, A22T, T40N, Y57M, G31N, Q81G, T164L, T121E, T10F, Q146P, R123N, V3R, P43G, Q81H, Q81D, G161I, C158M, N24T, T10W, T128S, T160I, Y176P, S155F, T128C, L125A, P168Y, T62G, F166S, S188A, Q81F, T46W, A70G 및 A38G.
  23. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: S188E, S188V, Y117K, Y117Q, Y117R, Y117V, R127K, R127Q, R123L, T86S, R123I, Q81E, L125M, H32A, S188T, N74F, C33D, F27I, A83M, Q71Y, R123T, V90A, F59W, L141C, N170E, T46F, S51V, G162P, S185R, A41S, R79V, T151C, T107S, T129Y, M180L, F166C, C105T, T160E, P89A, R159T, T183P, S188M, T10L, G25S, N24S, E119L, T107L, T107Q, G161K, G15Q, S15R, G153K, G153V, S188G, A83E, G186P, T121D, G49A, S15C, C105Y, C105A, R127F, Q71A, T10C, R179K, T86I, W103N, A87S, F166A, A83F, R123Q, A132C, A143H, T163I, T39V, A93D, V90M, R123K, P134W, G177N, V115I, S155T, T110D, G105L, N170D, T107A, G84V, G84M, L111K, P168I, G154L, T183I, S99G, S15T, A8G, S15N, P189S, S188C, T100Q, A110G, A121A, G12A, R159V, G31A, G154R, T182L, V115L, T160Q, T107F, R159Q, G144A, S92T, T101S, A83R, G12HM S15H, T116Q, T36V, G154, Q81C, V130T, T183A, P118T, A87E, T86M, V150N 및 N24E.
  24. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: T36I, I172T, N24E, N170Y, G77T, G186N, I181L, N73T, A38R, N74G, N24A, G54D, S76D, R123E, 159E, N112E, R35E, R179V, R123D, N24T, R179T, R14L, A38D, V90P, R14Q, R123I, R179D, S76V, R79G, R35L, S76E, S76Y, R79D, R79P, R35Q, R179N, N112D, R179E, G65P, Y75G, V90S, R179M, R35F, R123F, A64I, N24Q, R14I, R179A, R127A, R179I, N170D, R35A, R159F, T109E, R14D, N67D, G49A, N112Q, G78D, T121E, L69S, T116E, V90I, T36S, T36G, N145E, T86D, S51D, R179K, T107E, T129S, L142V, R79A, R79E, A38H, T107S, R123A, N55E, R123L, R159N, G65D, R14N, G65Q, R123Q, N24V, R14G, T116Q, A38N, R159Q, R179Y, A83E, N112L, S99N, G78A, T10N, H85Q, R35Q, N24L, N24H, G49S, R79L, S76T, S76L, G65S, N55F, R79V, G65T, R123N, T86E, Y75F, F1T, S76N, S99V, R79T, N112V, R79M, T107V, R79S, G54E, G65V, R127Q, R159D, T107H, H85T, R35T, T36N, Q81E, R123H, S76I, A38F, V90T 및 R14T.
  25. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: G65L, S99D, T107M, S113T, S99T, G77S, R14M, A64N, R61M, A70D, Q71G, A93D, S92G, N112Y, S15W, R159K, N67G, T10E, R127H, A64Y, R159C, A38L, T160E, T183E, R127S, A8E, S51Q, N7L, G63D, A38S, R35H, R14K, T107I, G12D, A64L, S76W, A41N, R35M, A64V, A38Y, T183I, W103M, A41D, R127K, T36D, R61T, G65Y, G13S, R35Y, R123T, A64H, G49H, A70H, A64F, R127Y, R61E, A64P, T121D, V115A, R123Y, T101S, T182V, H85L, N24M, R127E, N145D, Q71H, S76Q, A64T, G49F, A64Q, T10D, F1D, A70G, R35W, Q71D, N121I, A64M, T36H, A8G, T107N, R35S, N67T, S92A, N170L, N67E, S114A, R14A, R14S, Q81D, S51H, R123S, A93S, R127F, I19V, T40V, S185N, R123G, R179L, S51V, T163D, T109I, A64S, V72I, N67S, R159S, H85M, T109G, Q71S, R61H, T107A, Q81V, V90N, T109A, A38T, N145T, R159A, A110S, Q81H, A48E, S51T, A64W, R159L, N67H, A93E, T116F, R61S, R123V, V3L 및 R159Y.
  26. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: T36I, P89D, A93T, A93S, T36N, N73T, T36G, R159F, T36S, A38R, S99W, S76W, T36P, G77T, G54D, R127A, R159E, H85Q, T36D, S76L, S99N, Y75G, S76Y, R127S, N24E, R127Q, D184F, N170Y, N24A, S76T, H85L, Y75F, S76V, L69S, R159K, R127K, G65P, N74G, R159H, G65Q, G186V, A48Q, T36H, N67L, R14I, R127L, T36Y, S76I, S114G, R127H, S187P, V3L, G78D, R123I, I181Q, R35F, H85R, R127Y, N67S, Q81P, R123F, R159N, S99A, S76D, A132V, R127F, A143N, S92A, N24T, R79P, S76N, R14M, G186E, N24Q, N67A, R127T, H85K, G65T, G65Y, R179V, Y75I, I11Q, A38L, T36L, R159Y, R159D, N24V, G65S, N157D, G186I, G54Q, N67Y, R127G, S76A, A38S, T109E, V66H, T116F, R123L, G49A, A64H, T36W, D184H, S99D, G161K, P134E, A64F, N67G, S99T, D2Q, S76E, R16Q, G54N, N67V, R35L, Q71I, N7L, N112E, L69H, N24H, G54I, R16L, N24M, A64Y, S113A, H85F, R79G, I11A, T121D, R61V 및 G65L.
  27. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: N67Q, S187Q, Q71H, T163D, R61K, R159V, Q71F, V31F, V90I, R79D, T160E, R123Q, A38Y, S113G, A88F, A70G, I11T, G78A, N24L, S92G, R14L, D184R, G54L, N112L, H85Y, R16N, G77S, R179T, V80L, G65V, T121E, Q71D, R16G, P89N, N42H, G49F, I11S, R61M, R159C, G65R, T183I, A93D, L111E, S51Q, G78N, N67T, A38N, T40V, A64W, R159L, T10E, R179K, R123E, V90P, A64N, G161E, H85T, A8G, L142V, A41N, S185I, Q71L, A64T, R16I, A38D, G54M, N112Q, R16A, R14E, V80H, N170D, S99G, R179N, S15E, G49H, A70P, A64S, G54A, S185W, R61H, T10Q, A38F, N170L, T10L, N67F, G12D, D184T, R14N, S187E, R14P, N112D, S140A, N112G, G49S, L111D, N67M, V150L, G12Y, R123K, P89V, V66D, G77N, S51T, A8D, I181H, T86N, R179D, N55F, N24S, D184L, R61S, N67K, G186L, F1T, R159A, I11L, R61T, D184Q, A93E, Q71T, R179E, L69W, T163I, S188Q, L125V, A38V, R35A, P134G, A64V, N145D, V90T 및 A143S.
  28. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: T36I, N170Y, A38R, R79P, G77T, L69S, N73T, S76V, S76Y, R179V, T36N, N55F, R159F, G54D, G65P, L69H, T36G, G177M, N24E, N74G, R159E, T36S, Y75G, S76I, S76D, A8R, A24A, V90P, R159C, G65Q, T121E, A8V, S76L, T109E, R179M, A8T, T107N, G186E, S76W, R123E, A38F, T36P, N67G, Y75F, S76N, R179I, S187P, N67V, V90S, R127A, R179Y, R35F, N145S, G65S, R61M, S51A, R179N, R123D, N24T, N55E, R79C, G186V, R123I, G161E, G65Y, A38S, R14L, V90I, R79G, N145E, N67L, R127S, R150Y, M180D, N67T, A93D, T121D, Q81V, T109I, A93E, T107S, R179T, R179L, R179K, R159D, R179A, R79E, R123F, R79D, T36D, A64N, L142V, T109A, I172V, A83N, T85A, R179D, A38L, I126L, R127Q, R127L, L69W, R127K, G65T, R127H, P134A, N67D, R14M, N24Q, A143N, N55S, N67M, S51D, S76E, T163D, A38D, R159K, T183I, G63V, A8S, T107M, H85Q, N112E, N67F, N67S, A64H, T86I, P134E, T182V, N67Y, A64S, G78D, V90T, R61T, R16Q, G65R, T86L, V90N, R159Q, G54I, S76C, R179E, V66D, L69V, R127Y, R35L, R14E 및 T86F.
  29. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: G186I, A64Q, T109G, G64L, N24L, A8E, N112D, A38H, R179W, S114G, R123L, A8L, T129S, N170D, R159N, N67C, S92C, T107A, G54E, T107E, T36V, R127T, A8N, H85L, A110S, N170C, A64R, A132V, T36Y, G63D, W103M, T151V, R123P, W103Y, S76T, S187T, R127F, N67A, P171M, A70S, R159H, S76Q, L125V, G54Q, G49L, R14I, R14Q, A83I, V90L, T183E, R159A, T101S, G65D, G54A, T107Q, Q71M, T86E, N24M, N55Q, R61V, P134D, R96K, A88F, N145Q, A64M, A64T, N24V, S140A, A8H, A64I, R123Q, T183Q, N24H, A64W, T62I, T129G, R35A, T40V, I11T, A38N, N145G, A175T, G77Q, T109H, A8P, R35E, T109N, A110T, N67Q, G63P, H85R, S92G, A175V, S51Q, G63Q, T116F, G65A, R79L, N145P, L69Q, Q146D, A83D, F166Y, R123A, T121L, R123H, A70P, T182W, S76A, A64F, T107H, G186L, Q81I, R123K, A64L, N67R, V3L, S187E, S161K, T86M, I4M, G77N, G49A, A41N, G54M, T107V, Q81E, A38I, T109L, T183K, A70G, Q71D, T183L, Q81H, A64V, A93Q, S188E, S51F, G186P, G186T, R159L, P134G, N145T, N55V, V66E, R159V, Y176L 및 R16L.
  30. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한 프로테아제: T36I, N73T, P134R, G77T, N24E, P134E, P134L, N24T, 159F, L69S, T10G, G186S, S140A, T36S, N112S, N24Q, T36G, P134H, G34A, N24A, A38T, E119R, G186E, R14M, S76W, T10A, A38F, L142V, N170Y, P134V, A22V, S76V, T182V, S76Y, I11A, I11S, S118A, G186V, L69H, I11T, T36N, G65V, G49F, V90I, R179V, R16K, T163I, R127F, R159K, N24L, Q71I, S15G, S15F, R14G, S99N, T10L, S15E, T107R, F166Y, G49A, V90P, P134D, Q167N, S76D, S51A, V80A, V150L, N74G, T107K, S76L, N24V, G12I, S99V 및 R16N.
  31. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산이 하기를 포함한 프로테아제: Arg14, Ser15, Arg16, Cys17, His32, Cys33, Phe52, Asp56, Thr100, Val115, Thr116, Tyr117, Pro118, Glu119, Ala132, Glu133, Pro134, Gly135, Asp136, Ser137, Thr151, Ser152, Gly153, Gly154, Ser155, Gly156, Asn157, Thr164 및 Phe165.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 프로테아제의 3 작용기 촉매 (catalytic triad) 가 His 32, Asp56 및 Ser137 을 포함한 프로테아제.
  33. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 Cys131, Ala132, Glu133, Pro134, Gly135, Thr151, Ser152, Gly153, Gly154, Ser155, Gly156, Asn157 및 Gly162, Thr163 및 Thr164 를 포함한 프로테아제.
  34. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 Phe52, Tyr117, Pro118 및 Glu119 를 포함한 프로테아제.
  35. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제의 아미노산 서열이 Gly 154 부터 기질 주쇄까지 주쇄 대 주쇄 수소결합을 가지는 프로테아제.
  36. 제 11 항에 있어서, 상기 프로테아제가 3 개의 이황화 결합을 포함한 프로테아제.
  37. 제 11 항에 있어서, 상기 변형체가 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 변경된 기질 특이성들을 가지는 프로테아제.
  38. 제 11 항에 있어서, 상기 변형체가 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 변경된 pI 를 가지는 프로테아제.
  39. 제 11 항에 있어서, 상기 변형체가 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시 향상된 안정성을 가지는 프로테아제.
  40. 제 11 항에 있어서, 상기 변형체가 변경된 표면 특성들을 나타내는 프로테아제.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 변형체가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 부위들에서의 하나 이상의 치환 변이들을 포함한 프로테아제: 1, 2, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 22, 24, 25, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 및 184.
  42. 제 1 항에 있어서, 야생형 프로테아제와 비교시 하나 이상의 향상된 특성을 가지는 변형 프로테아제인 프로테아제.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 하나 이상의 향상된 특성이 산 안정성, 열안정성, 카제인 가수분해, 케라틴 가수분해, 세정 성능 및 LAS 안정성으로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제.
  44. 제 11 항의 프로테아제 변형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함 한 발현 벡터.
  45. 제 44 항의 발현 벡터를 포함한 숙주 세포.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 숙주가 바실러스 (Bacillus sp.), 스트렙토마이세스 (Streptomyces sp.), 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) 및 트리코더마 (Trichoderma sp.) 로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포.
  47. 제 46 항의 숙주 세포에 의해 생산되는 세린 프로테아제.
  48. 서열번호: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 및 78 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한 변형 프로테아제.
  49. 제 42 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호: 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 77 로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 변형 프로테아제.
  50. 제 49 항의 프로테아제 변형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 발현 벡터.
  51. 제 50 항의 발현 벡터를 포함한 숙주 세포.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 숙주가 바실러스, 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스 및 트리코더마로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포.
  53. 제 52 항의 숙주 세포에 의해 생산되는 세린 프로테아제.
  54. 제 1 항의 단리된 세린 프로테아제의 적어도 일부를 포함한 조성물로서, 상기 프로테아제가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 및 서열번호: 4 로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 조성물.
  55. 서열번호: 1 의 적어도 일부를 포함한, 제 54 항의 폴리뉴클레오티드 서열.
  56. 제 55 항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 발현 벡터.
  57. 제 56 항의 발현 벡터를 포함한 숙주 세포.
  58. 제 57 항에 있어서, 바실러스, 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스 및 트리코더마로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포.
  59. 제 58 항의 숙주 세포에 의해 생산되는 세린 프로테아제.
  60. 서열번호: 8 내의 아미노산 위치들에 대응되는 하나 이상의 치환을 포함하고, 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시, 케라틴 가수분해, 열안정성, 카제인 활성, LAS 안정성 및 세정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성의 성능이 보다 우수한, 변형 세린 프로테아제.
  61. 하기 특징의 뉴클레오티드 서열을 포함한 단리된 폴리뉴클레오티드: (i) 서열번호: 4 에 대한 동일성이 70% 이상이거나, (ii) 중간 내지 고도의 엄격한 조건하에서 서열번호: 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 유래한 탐침자에 혼성화할 수 있거나, 또는 (iii) 서열번호: 4 에 개시된 뉴클레오티드 서열에 상보적임.
  62. 제 61 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
  63. 제 62 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  64. 서열번호: 4 에 개시된 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드.
  65. 하기 단계를 포함하는, 프로테아제 활성을 가진 효소를 생산하는 방법:
    (a) 숙주 세포를 서열번호: 4 와의 서열 동일성이 70% 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 숙주 세포에 적합한 조건하에서 배양하여 상기 프로테아제를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 프로테아제를 회수하는 단계.
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스, 트리코더마 또는 바실러스 종인 방법.
  67. 단백질 분해 활성을 가진 효소를 코딩하는 핵산 서열을 검출하는데 사용되고, 상기 핵산 서열은 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는, 서열번호: 4 의 대응 절편과 실질적으로 동일한 4 내지 150 개 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 탐침자.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 미크로코시니애가 셀룰로모나스 종인 탐침자.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 셀룰로모나스가 셀룰로모나스 균주 69B4 인 탐침자.
  70. 미크로코시니애의 일원으로부터 수득되는 하나 이상의 세린 프로테아제를 포 함한 세정 조성물.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 프로테아제가 셀룰로모나스, 오엘스코비아, 셀룰로시미크로비움, 자일라니박테리움 및 프로미크로모노스포라로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 수득되는 세린 프로테아제인 세정 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 프로테아제가 셀룰로모나스 69B4 로부터 수득되는 세정 조성물.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 프로테아제가 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 세정 조성물.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제가 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열에 대하여 60% 이상의 아미노산 동일성을 가지는 세정 조성물.
  75. 제 70 항의 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가지는 세린 프로테아제를 포함한 세정 조성물.
  76. 제 72 항의 세린 프로테아제와의 면역학적 교차반응성을 가지는 세린 프로테아제를 포함한 세정 조성물.
  77. 제 70 항에 있어서, 상기 프로테아제가 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 위치와 등가인 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 서열을 가진 변형 프로테아제인, 세정 조성물.
  78. 제 77 항에 있어서, 상기 치환들이 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어지는 세정 조성물: 2, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 43, 46, 49, 51, 54, 61, 64, 65, 67, 70, 71, 76, 78, 79, 81, 83, 85, 86, 90, 93, 99, 100, 105, 107, 109, 112, 113, 116, 118, 119, 121, 123, 127, 145, 155, 159, 160, 163, 165, 170, 174, 179, 183, 184, 185, 186, 187 및 188.
  79. 제 77 항에 있어서, 상기 치환들이 서열번호: 8 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 셀룰로모나스 69B4 프로테아제 내의 하기 위치들과 등가인 위치들에서 이루어지는 세정 조성물: 1, 4, 22, 27, 28, 30, 32, 41, 47, 48, 55, 59, 63, 66, 69, 75, 77, 80, 84, 87, 88, 89, 92, 96, 110, 111, 114, 115, 117, 128, 134, 144, 143, 146, 151, 154, 156, 158, 161, 166, 176, 177, 181, 182, 187 및 189.
  80. 제 77 항에 있어서, 상기 프로테아제가 서열번호: 8 에 개시된 것과 등가인 아미노산 서열 내의 하기 위치들에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 세정 조성물: 14, 16, 35, 36, 65, 75, 76, 79, 123, 127, 159 및 179.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 프로테아제가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함한 세정 조성물: R14L, R16I, R16L, R16Q, R35F, T36S, G65Q, Y75G, N76L, N76V, R79T, R123L, R123Q, R127A, R127K, R127Q, R159K, R159Q 및 R179Q.
  82. 제 81 항에 있어서, 상기 프로테아제가 R16Q/R35F/R159Q, R16Q/R123L, R14L/R127Q/R159Q, R14L/R179Q, R123L/R127Q/R179Q, R16Q/R79T/R127Q 및 R16Q/R79T 의 집합들로 이루어진 군에서 선택되는 변이들의 집합을 포함한 세정 조성물.
  83. 제 81 항에 있어서, 상기 프로테아제가 하기 변이들 R123L, R127Q 및 R179Q 를 포함한 세정 조성물.
  84. 제 80 항에 있어서, 상기 변형 세린 프로테아제가 서열번호: 8 내의 아미노산 위치들에 대응되는 하나 이상의 치환을 포함하며, 상기 변형 프로테아제가 야생형 셀룰로모나스 69B4 프로테아제와 비교시, 케라틴 가수분해, 열안정성, 카제인 활성, LAS 안정성 및 세정으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성의 성능 이 보다 우수한 세정 조성물.
  85. 제 70 항에 있어서, 상기 변형 프로테아제가 서열번호: 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 및 78 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한 세정 조성물.
  86. 제 70 항에 있어서, 상기 변형 프로테아제 아미노산 서열이 서열번호: 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 77 로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 세정 조성물.
  87. 서열번호: 4 에 대한 서열 동일성이 70 % 이상인 아미노산 서열을 포함한 단백질 분해 효소를 세정 유효량으로 포함하고 적당한 세정 제형물을 포함한 세정 조성물.
  88. 제 87 항에 있어서, 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난아제 (mannanase), 펙티나제 (pectinase), 큐티나아제 (cutinase), 산화환원효소 (oxidoreductase), 헤미셀룰라아제 (hemicellulase) 및 셀룰라아제 (cellulase) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소 또는 효소 유도체들을 추가로 포함하는 세정 조성물.
  89. 제 1 항의 세린 프로테아제 및 하나 이상의 안정화제를 포함한 조성물.
  90. 제 89 항에 있어서, 상기 안정화제가 붕사 (borax), 글리세롤 및 경쟁적 저해제들로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  91. 제 90 항에 있어서, 상기 경쟁적 저해제들이 상기 세린 프로테아제를 음이온성 계면활성제들에 대해 안정화시키는 조성물.
  92. 제 1 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제가 자가융해상으로 안정한 변형체인 조성물.
  93. 제 1 항의 세린 프로테아제를 0.0001 중량% 이상 포함하고, 임의로 부속 성분을 포함한 세정 조성물.
  94. 제 93 항에 있어서, 부속 성분을 포함한 세정 조성물.
  95. 제 93 항에 있어서, 충분한 양의 pH 조절제를 포함하여 상기 조성물의 순(neat) pH 가 약 3 내지 약 5 가 되도록 하고, 이때 상기 조성물에는 약 3 내지 약 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질이 본질적으로 부재하는 세정 조성물.
  96. 제 95 항에 있어서, 상기 가수분해되는 물질이 계면활성제 물질을 포함한 세정 조성물.
  97. 제 95 항에 있어서, 상기 세정 조성물이 액체 조성물인 세정 조성물.
  98. 제 96 항에 있어서, 상기 계면활성제 물질이 산화에틸렌 부분을 포함한 소듐 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한 세정 조성물.
  99. 충분한 양의 pH 조절제를 포함하여 상기 조성물의 순 pH 가 약 3 내지 약 5 가 되게 하고 이때 상기 조성물에는 약 3 내지 약 5 의 pH 에서 가수분해되는 물질이 본질적으로 부재하는, 하나 이상의 산 안정성 효소를 포함한 세정 조성물.
  100. 제 99 항에 있어서, 상기 가수분해되는 물질이 계면활성제 물질을 포함한 세정 조성물.
  101. 제 99 항에 있어서, 액체 조성물인 세정 조성물.
  102. 제 99 항에 있어서, 상기 계면활성제 물질이 산화에틸렌 부분을 포함한 소듐 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한 세정 조성물.
  103. 제 95 항에 있어서, 적당한 부속 성분을 포함한 세정 조성물.
  104. 제 99 항에 있어서, 적당한 부속 성분을 포함한 세정 조성물.
  105. 제 95 항에 있어서, 약 0.001 내지 약 0.5 중량% 의 ASP 를 포함한 조성물.
  106. 제 105 항에 있어서, 약 0.01 내지 약 0.1 중량% 의 ASP 를 포함한 조성물.
  107. 하기 단계들을 포함한 세정 방법:
    a) 표면 및/또는 직물을 포함한 물품을 제 94 항의 세정 조성물 및/또는 제 98 항의 세정 조성물을 포함한 조성물에 접촉시키는 단계; 및
    b) 임의로, 상기 표면 또는 물질을 세척 및/또는 헹구는 단계.
  108. 하기 단계들을 포함한 세정 방법:
    a) 표면 및/또는 직물을 포함한 물품을 제 99 항의 세정 조성물 및/또는 제 100 항의 세정 조성물을 포함한 조성물에 접촉시키는 단계; 및
    b) 임의로, 상기 표면 또는 물질을 세척 및/또는 헹구는 단계.
  109. 제 1 항의 세린 프로테아제를 포함한 동물 사료.
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