CN111329830B - 一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法，将微球菌属细菌在完全培养基中进行生物培养以获取大量微球菌属类细菌的生物质，然后通过热解和蛋白水解微球菌属细菌的生物质以获得溶胞液，将溶胞液进行澄清以获得澄清溶胞液，再纯化澄清溶胞液以获得微球菌属细菌发酵溶胞液。具有良好的抗衰老效果以及在应用于抗衰老组合物时具有良好的安全性。

Description

一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的 应用

技术领域

本发明涉及微球菌属细菌发酵技术领域，具体涉及一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的应用。

背景技术

随着年龄的增加，皮肤和头发等含有角蛋白的物质都会衰老，特别是通过它们的结构和功能的改变而反映出来。

内源性地，角蛋白物质受到超氧化物离子的攻击，超氧化物离子在生理细胞代谢过程中自然产生。

外源地，角蛋白物质在暴露于参与其衰老的环境因素包括紫外线辐射，或者大气污染等。

受环境影响的皮肤的外在衰老补充了与年龄相关的内在衰老，引起特征性皮肤损伤和变化。

从细胞和分子的角度来看，皮肤衰老反映在以下方面：角质形成细胞和成纤维细胞增殖能力丧失，分化标志物减少；真皮成分(例如胶原蛋白和原纤蛋白)的产生与其被不同金属蛋白酶(MMP)的破坏之间的不平衡，使天平偏向细胞外基质的降解和组织破坏；功能是参与连接和将表皮固定到真皮上的分子的损失，例如纤连蛋白和整联蛋白，这导致真皮表皮连接的弱化。

从宏观的角度来看，皮肤衰老明显伴随皱纹和松弛的出现。衰老的皮肤比年轻的皮肤更细，更脆弱。最后，衰老的皮肤往往失去其弹性、其抵抗外部攻击的屏障功能以及其修复能力减弱。

用于预防和/或治疗皮肤衰老迹象的几种组合物或方法在现有技术中是已知的。

通过诱导超氧化物歧化酶的内源性合成的增加，用含有脂多糖的微球菌属提取物特别地获得皮肤衰老迹象的预防和/或治疗。

从降低和/或延迟皮肤衰老的角度来看，微球菌属的细菌的生物质获得的澄清溶胞液包括其发酵培养基具有有益的性质。

因此，此种新的活性剂或新的治疗方法，用于预防和/或治疗皮肤损伤，更具体地说，用于衰老的皮肤。能够通过诱导角质形成细胞增殖来重新激活表皮再生。能够通过修复皮肤损伤来维持或甚至增强皮肤的屏障性能。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的应用，从护理皮肤、粘膜角度来看，从属于微球菌属的细菌的溶胞液中分离的发酵溶胞液部分具有有益的性质。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的应用，具体的，该获取方法包括以下步骤：将微球菌属细菌在完全培养基中进行生物培养以获取大量微球菌属类细菌的生物质，然后通过热解和蛋白水解微球菌属细菌的生物质以获得溶胞液，将溶胞液进行澄清以获得澄清溶胞液，再纯化澄清溶胞液以获得微球菌属细菌发酵溶胞液。

本发明中，所述完全培养基至少包含碳和能量源、钾和磷源、氮源、镁源、钙源、铁源、微量元素源、水源和pH缓冲剂。

在本发明中，微球菌属细菌发酵溶胞液中包含完全发酵培养基。

在本发明中，微球菌属细菌发酵溶胞液中还包含溶解在完全发酵培养基中的多糖，以及细胞内多糖与细菌细胞膜多糖的混合物。

在本发明中，作为优选的，所述微球菌属细菌为菌株线状微球菌属。

在本发明中，作为优选的，所述菌株线状微球菌属中优选溶壁微球菌ATCC 4698 。

在本发明中，作为优选的，热解在蛋白水解之前进行。

一种抗衰老组合物，其包括上述发酵溶胞液或澄清溶胞液，或者包含发酵溶胞液和/或澄清溶胞液的组合物。

本发明的有益效果是：本发明公开了一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的应用，从护理皮肤、粘膜角度来看，从属于微球菌属的细菌的溶胞液中分离的发酵溶胞液部分具有有益的性质。将发酵溶胞液部分施用于角蛋白物质后，它在角蛋白物质上形成附着物，其具有明显美容效果。当施用于表皮时，发酵后处理得到的溶胞液部分可刺激抗衰老基因的表达。发酵溶胞液部分几乎完全由多糖组成，在胞溶液的固形物中比例不低于80%。因此，发酵溶胞液具有良好的抗衰老作用，安全性高。

附图说明

图1为本发明显微镜观察成纤维细胞染色形态示意图；

图2为本发明微球菌溶胞液对H2O2刺激人皮肤成纤维细胞衰老的影响的示意图。

图3为本发明微球菌溶胞液对对人皮肤成纤维细胞存活率的影响的示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如图1至图3所示，本实施例公开了一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法及其在抗衰老中的应用，具体的，所述获取方法包括以下步骤：将微球菌属细菌在完全培养基中进行生物培养以获取大量微球菌属类细菌的生物质，然后通过热解和蛋白水解微球菌属细菌的生物质以获得溶胞液，将溶胞液进行澄清以获得澄清溶胞液，再将澄清溶胞液纯化以获得微球菌属细菌发酵溶胞液。

本实施例中，“发酵溶胞液部分”是指最初包含在细菌溶胞液中的多糖。

“多糖”是指通过糖苷键彼此键合的至少两个单糖的链，多糖可具有直链或支链结构；多糖尤其包含含有4至11个碳原子的亚单位，例如选自包含以下的组的亚单位：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和果糖；多糖的分子量为5kDa至150kDa。

在一个具体实施方案中，多糖的分子量约为10kDa至约100kDa。

在某些实施方案中，发酵溶胞液部分对应于所述细菌溶胞液的总发酵溶胞液部分，即包含细菌细胞膜多糖，细胞内多糖以及溶解在细菌培养基，即完全发酵培养基的水性部分中的多糖。

在某些实施方案中，发酵溶胞液部分基本上包含或者仅包含细菌细胞膜多糖，细胞内多糖或溶解在完全发酵培养基的水性部分中的多糖。

在某些实施方案中，发酵溶胞液部分基本上包含或者仅包含细菌细胞膜多糖和细胞内多糖的混合物。

在某些实施方案中，发酵溶胞液部分对应于细菌细胞膜多糖和溶解在完全发酵培养基的水性部分中的多糖的混合物。

在某些实施方案中，发酵溶胞液部分基本上包含或者仅包含细胞内多糖和溶解在完全发酵培养基的水性部分中的多糖的混合物。

在一个具体实施方案中，发酵溶胞液部分包含选自包含以下的组的多糖：溶解在完全发酵培养基中的多糖，以及细胞内多糖与细菌细胞膜多糖的混合物。

这种细菌的生物质发酵溶胞液部分，任选地在完全发酵培养基中配制，具有显著的美容和/或皮肤病学特性。

根据本发明的优选变体，它是溶壁状微球菌属。

在一个具体实施方案中，细菌是微球菌，优选微球菌属菌株ATCC 15551。

完全发酵培养基：

在一个具体实施方案中，属于微球菌属的细菌的溶胞液还包含完整发酵培养基。

在本发明的含义内，表述“完全发酵培养基中的溶胞液”是指将溶胞液配制在培养细菌的完全培养基中，直到微生物生长期后，这导致使用最初存在于培养基中的营养底物。

在本发明的含义中，表述“完全发酵培养基”旨在表示源自用于微生物的生长和细胞裂解的培养方法的培养基，此外，所述培养基没有为了分离和/或消除其全部或部分非水性成分而进行过任何额外处理。

更具体地，根据本发明考虑的活性剂由微生物溶胞液的发酵溶胞液部分和用于发酵所述细菌的全部或一些培养基形成，并且在培养基中细胞裂解连续进行(即完全发酵培养基)。

因此，根据本发明的活性剂，即从属于微球菌属的细菌的溶胞液的发酵溶胞液部分中获得的活性剂，任选地在完全发酵培养基中，明显不同于属于微球菌属的细菌的发酵培养基的总溶胞液或上清液。

此外，根据本发明考虑的活性剂不同于肽/蛋白质部分，不同于脂质部分，不同于核酸部分，并且不同于其混合物，其将从属于微球菌属的细菌的溶胞液中分离或获得，任选地在完全发酵培养基中。

实际上，根据本发明考虑的活性剂，与不同于发酵溶胞液部分的活性物质，不同于发酵溶胞液部分的该溶胞液或溶胞液部分，含有大量的水溶性细胞多糖，也就是说包含在所述细菌中，或水溶性细胞外多糖，该多糖在所述细菌增殖期间天然释放到培养基中。

因此，表述“完全培养基”还扩展到“浓缩”的完全培养基的形式，就以下事实而言：它是在构成发酵培养基的水部分失去后获得的，在该发酵培养基中已经连续地进行相应微生物的培养和其细胞裂解。

在一个具体实施方式中，发酵培养基是能够培养，并因此根据情况，使细胞、细菌或酵母生长的载体。原则上，细胞在这种培养基中寻得大量用于其快速繁殖的必要成分，在这种情况下，细菌属于微球菌属属，特别是溶壁微球菌属。因此，其组成必须满足所考虑的微生物的营养需求并且是后者增殖所必需的。更具体地说，该培养基的组成必须：满足矿物离子和生长因子的需求并提供碳和能量源；pH值接近最佳pH值,以KOH为优选ph调节剂；具有最佳离子强度(培养基可以是等渗的，但这不是强制性的)。

因此，适用于本发明的发酵培养基的组成至少包括：

碳和能量源，优选丙三醇、葡萄糖；钾和磷源，例如K2HPO4；氮源，其可以由化合物NH3.H2O代表；

其可以由化合物NH3.H2O代表；镁源，例如，MgCl2；钙源，例如CaCl2；铁源，更具体地是柠檬酸铁，柠檬酸盐具有将铁保持在溶液中的作用；微量元素源，尤其选自Cu，Zn，Co，Ni，B或Ti盐；水源，通常是无菌的，对所有生命形态都是必不可少的；pH缓冲剂，可以用KH2PO4代表。

本发明含义内的发酵溶胞液部分表示源自所述生物质的热解和蛋白水解的多糖。

为了在完全发酵培养基中获得属于微球菌属的细菌生物质的溶胞液，可以在60-80℃的温度下，保持3-5小时，然后可以通过高压匀浆，以得到更多细菌溶胞物。如前文所述，在所述微生物培养之后，后者直接在用于其培养的发酵培养基中转化为溶胞液状态。

在一个具体实施方案中，所述溶胞液通过所述生物质的热解步骤和蛋白水解步骤而获得。所述溶胞液通过热解步骤和蛋白水解步骤后，继续使用高压匀浆的物理方法破碎细菌体。

在优选的实施方案中，热解在蛋白水解之前进行。

一种抗衰老的组合物，其包含上述发酵溶胞液。根据本发明的发酵溶胞液部分易于配制在组合物中，所述组合物包含至少一种常用于美容和/或皮肤病学中的成分。这是因为它是接近于无味的，因此可不需要同时存在香料，特别是为了掩盖令人不快的气味。

此外，根据本发明的发酵溶胞液部分是微黄色或者淡黄色的，因此，一旦将其引入化美容和/或皮肤病学组合物中，不会引起任何不合时宜或不希望的着色。

因此，本发明还涉及组合物，尤其是美容和/或皮肤病学组合物，其在生理学上可接受的介质中包含如本发明所述的发酵溶胞液部分。术语“生理学上可接受的介质”是指与人角蛋白物质，特别是与皮肤和头发相容的介质。

在一个具体实施方案中，美容和/或皮肤病学组合物包含从通过热解和蛋白水解属于微球菌属的细菌的生物质获得的澄清溶胞液中分离的发酵溶胞液部分，所述溶胞液还包含完整发酵培养基。含有根据本发明的活性液的组合物可以局部应用。因此，根据本发明的组合物用于纯个人皮肤或者毛发护理目的，即为了改善皮肤、粘膜、头皮和角蛋白物质的外观和质地。

根据本发明的组合物有利地，任选地在完全发酵培养基中包含一定量的从通过热解和蛋白水解属于微球菌属的细菌的活性物获得的澄清溶胞液中分离的发酵溶胞液部分，相对于所述组合物的干提取物的总重量，范围为0 .1重量％至15重量％。

在某些实施方案中，根据本发明的组合物有利地包含相对于所述组合物的干提取物的总重量，量为0 .5重量％至5重量％的发酵溶胞液部分。

在某些实施方案中，根据本发明的组合物有利地包含相对于所述组合物的干提取物的总重量，量为1重量％至5重量％的发酵溶胞液部分。

因此，根据本发明的组合物可以是通常可用于特定选定施用方式的任意常规制剂形式。根据所考虑的组合物类型，载体可以是多种性质的。更具体地，关于用于外部局部施用的组合物，它们可以是水性，水性-醇或油性溶液，洗剂或分散液，乳液类型的液体或半液体稠度的乳液，通过将脂肪相分散在水相中(O/W)或反之亦然(W/O)而获得，或乳膏类型的软、半固体或固体稠度的悬浮液或乳液，水性或无水凝胶，微乳液，微胶囊，微粒或离子和/或非离子类型的泡囊分散体。

这些组合物根据常规方法制备，且这些组合物可特别构成清洁，保护，治疗或护理霜，乳液，凝胶，用于护理皮肤，粘膜，头皮和/或角蛋白物质。它们可以用于皮肤，粘膜，头皮和/或角蛋白物质的美容和/或皮肤病学治疗，以溶液，乳膏，凝胶，乳液的形式均可。以已知的方式，用于局部施用的制剂形式可含有在美容和/或皮肤病学领域中常见的佐剂，例如增稠剂，油，蜡，防腐剂，抗氧化剂，溶剂，芳香剂，填充剂，UV屏蔽剂。这些各种佐剂的量是在所考虑的领域中常规使用的量，例如占组合物总重量的0 .01％至20％。取决于它们的性质，可以将这些佐剂引入脂肪相和/或水相中。

本发明的组合物还可以有利地含有水。水可以是纯水、泉水或矿泉水。

相对于组合物的总重量，水的含量的范围可以为5至99重量％，优选范围为20至95重量％。

关于上述组合物的使用和方法

本发明涉及能够通过本发明的方法获得的发酵溶胞液部分作为美容和/或皮肤病学活性剂，优选作为抗衰老活性剂的用途。

“美容和/或皮肤病学活性剂”是指在施用于角蛋白物质后具有有益性质的活性剂。

例如，有益性质可以是刺激年轻皮肤中存在的并且在衰老的皮肤中具有降低的表达的蛋白质的表达，例如转谷氨酰胺酶。

本发明还涉及用于处理角蛋白物质的非治疗性美容方法，其包括以下步骤：向角蛋白物质局部施用从属于微球菌属的细菌的生物质的溶胞液中分离的发酵溶胞液部分，或者包含这种发酵溶胞液部分的组合物，应理解，所述发酵溶胞液部分是在澄清通过热解和蛋白水解属于微球菌属的细菌的生物质获得的溶胞液后获得的。在本发明的上下文中，“处理角蛋白物质”是指局部施用根据本发明的发酵溶胞液部分用于护理皮肤，粘膜，头皮和头发。

本发明还涉及用于治疗和/或防止皮肤衰老的迹象的非治疗性美容方法，其包括以下步骤：向皮肤局部施用从属于微球菌属的细菌的溶胞液中分离的化合物部分，或者包含这种部分的组合物，应理解，所述发酵溶胞液部分是在澄清通过热解和蛋白水解属于微球菌属的细菌后获得的溶胞液。

在本发明的上下文中，“治疗皮肤衰老迹象”意指减少或缓解皱纹，细皱纹，皮肤萎缩，皮肤弹性丧失，皮肤张力丧失，真皮变薄，胶原纤维降解，皮肤紧致丧失，皮肤干燥。在本发明的上下文中，“防止皮肤衰老的迹象”意指不出现或延迟出现皱纹，细皱纹，皮肤萎缩，皮肤张力丧失，皮肤张力丧失，真皮变薄，胶原纤维降解，皮肤紧致丧失，皮肤干燥。

本发明还涉及一种制备从属于微球菌属的细菌的溶胞液中分离的碳水化合物部分的方法，所述方法包括以下步骤：

提供属于微球菌属的细菌的生物质；热解和蛋白水解所述生物质，以获得溶胞液；澄清溶胞液，以获得澄清的溶胞液；纯化澄清的溶胞液的多糖。“溶胞物或者溶胞液”是指完全培养物中包含的活生物体或死生物体的所有或一些裂解或者破裂后状态。

在一个优选的实施方案中，热解在蛋白水解之前进行。属于微球菌属的细菌的溶胞液还包含完全发酵培养基。根据一个具体实施方案，热解可以在60℃至110℃的温度下进行，优选70℃至90 ℃的温度，具体优选约80℃的温度。约80℃意味着80℃±5℃的温度。根据一个具体实施方案，热解可以持续进行30分钟至240分钟，优选持续60分钟至100分钟，约持续80分钟。本文所陈述的约80分钟意味着持续80分钟±10分钟。

根据一个具体实施方案，蛋白质水解可以通过现有技术中已知的任何蛋白水解酶进行，其中可以提及的是地衣芽孢杆菌、木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶及其混合物。

在一个具体实施方案中，蛋白水解可以通过碱性蛋白酶进行，特别是通过地衣芽孢杆菌或者枯草杆菌蛋白酶。

当蛋白水解通过市售的蛋白水解酶进行时，关于使用的蛋白酶的量，裂解物与蛋白酶的酶解持续时间和温度以及反应介质的pH根据参考制造商的说明书。

“反应介质”是指包含属于微球菌属的细菌的溶胞液的水溶液，任选地在完全发酵培养基中，蛋白酶，任选地对于蛋白水解所必需的任何其他成分，例如能够调节盐浓度和调节pH的缓冲液。本领域技术人员能够确定任选地在其完全发酵培养基中进行溶胞液蛋白水解的最佳条件。

通常，蛋白质水解可以用一定量的酶进行，相对于反应介质的总重量，反应介质中酶的量为0 .01重量％至0.5重量％，优选0 .05重量％至0 .25重量％。

此外，蛋白质水解的持续时间在30分钟至12小时之间，作为所用蛋白酶的量和最终培养基的蛋白质含量有关系。

在一个具体实施方案中，反应介质保持在30℃至80℃的恒定温度，优选50℃至55℃的温度。

在一个具体实施方案中，反应介质的pH在8至10之间，优选为约8.5。

在一个具体实施方案中，当在枯草杆菌蛋白酶存在下进行蛋白质水解时，反应介质的pH值为约8.5。

根据本发明进行的热解和蛋白质水解，在相同的反应介质中进行，以保留溶胞液中所含的所有发酵溶胞液部分，同时减少多糖的处理操作次数，从而在各种纯化步骤中避免其损失。

根据一个具体实施方案，蛋白水解之后可以进行蛋白水解失活步骤，例如通过所用蛋白酶的抑制剂或抑制剂混合物；通过将反应介质在70℃至90℃的温度下孵育，优选在约85℃的温度下进行。

在一个具体实施方案中，蛋白水解失活步骤持续进行几分钟至几小时，例如持续5分钟至2小时，优选持续15分钟至30分钟。

本领域技术人员可以调整蛋白水解失活步骤的条件。

根据一个具体实施方案，制备根据本发明的发酵溶胞液部分的方法还可以包括酸化培养基的步骤，通常在生物质的热分解和/或蛋白水解步骤之后。可以使用适合于该步骤的任何酸，例如选自包含以下的组的酸：柠檬酸、乳酸、磷酸及其混合物。

根据一个具体实施方案，制备根据本发明的发酵溶胞液部分的方法还可以包括澄清任选酸化的溶胞液的步骤，例如通过一系列深度过滤，借助于合适的过滤器，例如具有直径在约0 .4μm和20μm之间的孔的过滤器。

实施本发明包括纯化多糖的步骤，这可以通过现有技术中已知的任何方法进行。

例如，多糖尤其可以通过醇沉淀，特别是通过乙醇沉淀来纯化；更优选通过膜过滤分离。

在一个具体实施方案中，制备根据本发明的发酵溶胞液部分的方法还可以包括以下步骤：通过膜超滤浓缩多糖，然后通过膜渗滤纯化。从现有技术中已知，渗滤体积决定了所需的纯度等级。

在该具体实施方案中，该方法可采用膜超滤的步骤，尤其是借助具有合适截留阈值的过滤器。在实践中，合适的过滤器是例如，阈值为200000Da的过滤器。

在一个具体实施方案中，适用于膜超滤的过滤器基于再生的羟乙基纤维素。

在一个具体实施方案中，适合于膜超滤的过滤器优选具有20 ,000Da的截留阈值并且基于再生的羟乙基纤维素。

在该具体实施方案中，相对于所述部分的总重量，最终多糖浓度可以为0 .1重量％至10重量％，优选0 .5重量％至5重量％，优选1重量％至2重量％。

在一个具体实施方案中，可以加入一种或多种常用于美容和/或皮肤病学领域的美容防腐剂，例如1,3丁二醇，以增强活性剂在其储存期间的稳定性。

实施例

本发明的发酵溶胞液部分的获取方法具体步骤如下：

将微球菌属在500升工业发酵罐中培养。在培养结束时，自然的pH 值为6.0，菌体含量为1.0-1.5％。

将菌株线状微球菌属在其完全培养基中发酵。

为了获得根据本发明的美容活性物，进行以下过程：

微球菌属的初始菌株获自溶壁微球菌ATCC 4698 。通过在500L有效升的工业生物反应器中发酵获得生物质；上面给出了培养基的组成。在培养期间，pH保持恒定(7 .00)，温度(30℃)和溶解氧(0 .6)也保持恒定。当固体含量达到1 .5％时停止培养。

为了从培养物中提取多糖，首先在80℃的温度下进行热解循环15分钟。

在将培养基冷却至55℃的温度后，通过加入2M氢氧化钾水溶液调节pH并保持p＝8.5。然后通过添加0 .25％(w/w)的从地衣杆菌分离的蛋白酶，进行蛋白水解。

在4小时的蛋白水解结束时，通过柠檬酸酸水溶液将培养基中和至pH 6。通过在85℃的温度下加热培养基15分钟使酶失活。

为了避免堵塞，在培养基中加入5%硅藻土(助滤剂)进行渗滤，温度维持在4-8℃，时间不超过48h。

然后在再生纤维素膜上进行浓缩步骤，截留阈值为20kDa。

最后将化妆品目录里允许添加的抑菌剂加入到浓缩后得到的保留物中。

根据本发明的发酵溶胞液部分用于通过建立人皮肤成纤维细胞氧化应激衰老模型，将微球菌溶胞液作用于细胞，观察细胞生长状况，测定细胞存活率、Ｐ－半乳搪巧酶细胞阳性率，判断其抵抗衰老作用。

过氧化氢刺激人皮肤成纤维细胞衰老实验：

通过H2O２诱导人皮肤成纤维细胞衰老，建立氧化应激衰老模型，对微球菌溶胞液的抗衰老效果进行评价。

人皮肤成纤维细胞株（ＨＳＦ）来自中国医学科学院昆明细胞库，根据其提供培养方法培养成纤维细胞，通过组织学对照验证其质量。

测试方法

接种24孔板，24ｈ后用终浓度为500umo/l H2O2刺激２ｈ，直接将H2O2打入孔中，空白对照组不刺激。２ｈ后吸除旧的培养基，空白对照组和H2O2组直接换成新鲜培养基，实验组用新鲜培养基稀释成不同浓度样品，将样品培养基以每孔1ml打入孔中，每个浓度设置４个平行，轻放入CO2培养箱孵育２-４ｄ；细胞生长至８０％融合状态时，进行β-半乳糖苷酶染色，在３７℃培养箱中孵育２４ｈ，用中性红复染，显微镜下拍照并统计染色数，计算细胞阳性率。

皮肤成纤维细胞形态学观察：

用倒置显微镜观察成纤维细胞染色形态（*20）如图1所示。空白对照組细胞梭形，细胞之间紧密相连，有明显的方向性，细胞通透性强，细胞碎片较少，染色阳性率低；H2O2刺激后细胞数量明显减少，细胞形态收缩发生不规则变形，细胞之间无接触，细胞排列混乱乳无明显方向，细胞通透性差，细胞碎片多，染色阳性率高；H2O2＋微球菌溶胞液（10ug／ml）组细胞数量介于对照组和H2O2组之间，细胞形态规则且接触生长，细胞通透性较好，细胞生长方向有规律，H2O2＋微球菌溶胞液（50ug/ml）组细胞与空白对照组细胞相比，细胞形态与数量均没有显著性差异；H2O2＋微球菌溶胞液（100ug/ml）组细胞与空白对照组细胞相比，细胞数量介于对照组和H2O2组之间细胞形态与数量均没有显著性差异,图2所示。

微球菌溶胞液对H2O2刺激人皮肤成纤维细胞衰老的影响：

根据β－半乳糖昔酶染色、中性红染色，统计计算细胞阳性率，得出不同浓度微球菌细胞液浓度对细胞阳性率的影响结果。如图2所示，由图2可知，微球菌溶胞液可明显降低H2O2刺激细胞阳性率，抵抗由H2O2刺激引起的细胞衰老。且随着浓度的升高其抵抗能力越强，当浓度为50ug/ml时其阳性率与空白组相比有显著性差异，当浓度为200ug/ml或者大于此浓度时其阳性率为零，说明微球菌溶胞液具有显著抵抗H2O2刺激引起的细胞衰老能力，且随着浓度增大，其抗衰老效果更好。

微球菌溶胞液对对人皮肤成纤维细胞存活率的影响：

由图3可知，开始随着微球菌溶胞液浓度的增大，ＨＳＦ细胞存活率上升之后浓度增大细胞存活率降低，说明微球菌溶胞液在一定的低浓度条件下，对ＨＳＦ细胞增殖没有效果，随着浓度的增加促进ＨＳＦ细胞增殖，在高浓度时则抑制ＨＳＦ生长，由此表明微球菌细胞液对ＨＳＦ细胞没有明显的细胞毒性，在2.0%范围内可促进细胞增殖，具有很好的安全性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法，其特征在于，将微球菌属细菌在完全培养基中进行生物培养以获取大量微球菌属类细菌的生物质，然后通过热解和蛋白水解微球菌属细菌的生物质以获得溶胞液，将溶胞液进行澄清以获得澄清溶胞液，再纯化澄清溶胞液以获得微球菌属细菌发酵溶胞液；微球菌属细菌发酵溶胞液中包含完全发酵培养基；所述微球菌属细菌为 菌株线状微球菌属中的 溶壁微球菌 ATCC 4698 。

2.根据权利要求 1 所述的一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法，其特征在于，所述完全培养基至少包含碳和能量源、钾和磷源、氮源、镁源、钙源、铁源、微量元素源、水源和pH 缓冲剂。

3.根据权利要求 2所述的一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法，其特征在于，微球菌属细菌发酵溶胞液中还包含溶解在完全发酵培养基中的多糖，以及细胞内多糖与细菌细胞膜多糖的混合物。

4.根据权利要求 1 所述的一种微球菌属细菌发酵溶胞液的获取方法，其特征在于，热解在蛋白水解之前进行。

5.一种抗衰老组合物，其特征在于，其包含权利要求 1-4任一所述的发酵溶胞液或澄清溶胞液，或者包含发酵溶胞液和/或澄清溶胞液的组合物。

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