KR0132051B1

KR0132051B1 - Pf1022 물질, 그 생산방법 및 그 물질을 포함한 구충제 조성물

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Publication number: KR0132051B1
Application number: KR1019900001460A
Authority: KR
Inventors: 마사유키 타카기; 타다아키 오카다; 나오토시 아카이; 타카시 유구지; 신지 미야도; 타카시 쇼무라; 토루 사사키; 마사지 세자키; 타카오 시미즈; 마사지 니이다
Original assignee: 사사이 아키라; 메이지세이카 가부시키가이샤
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-07
Publication date: 1998-04-11
Also published as: US5116815A; DE69023934D1; ATE131161T1; NO176766C; CN1046940A; EP0382173A2; CA2009508C; NO900528D0; JPH0335796A; NO176766B; NO900528L; AU620689B2; EP0382173B1; DK0382173T3; AU4921590A; JP2608479B2; KR900013082A; CA2009508A1; NZ232408A; ES2083392T3

Abstract

내용없음.

Description

PF1022 물질, 그 생산방법 및 그 물질을 포함한 구충제 조성물

제1도는 메타놀중에서 (100㎍/㎖) PF1022 물질의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도면.

제2도는 포타슘브로미드 원판방법에 의해 기록된 바와같이 PF1022물질의 적외선 흡수스펙트럼을 나타낸 도면.

제3도는 400MHZ에서의 듀테리오클로로포름용액중에서 기록된 바와같이 PF1022 물질의 양자핵자기공명스펙트럼을 나타낸 도면.

제4도는 100MHZ에서의 듀테리오클로로포름용액에서 기록된 바와같이 PF1022 물질의 탄소 13핵자기공명스펙트럼을 나타낸 도면이다.

본 발명은 구충력을 가진 새로운 물질, 즉 PF1022물질, 그 생산방법, 그 물질을 함유한 구충제조성물 및 그 물질을 사용하여 처리 및 방제하는 방법에 관한 것이다.

종래에는 미생물이 발생되는 다수의 생리활성이 있는 물질은 널리 공지되어 있다. 그러나, 이들 물질중 어느 것이나 본 발명에 의한 PF1022물질의 물리화학적 특성과 동일한 특성을 가진 물질로서써 공지된바 없다.

또 다수의 화합물이 구충력을 갖고 있는 것도 공지되어 있다. 미생물에 의해 생산되며, 구충력이 있는 상기 물질, 즉 PF1022물질은 데스토마이신(destomycin)A, 하이그로마이신(Higromycin)B 및 아버멕틴(avermectin)을 합하여 극소수에 불과하다.

또 화학구조에 있어서 본 발명의 물질과 유사한 물질은 바시아놀리드(bassianolide){Agri.Biol. chem,42(3), 629∼635(1978)}로서 공지되었다.

그러나 이 물질은 구충력이 없다.

숙주동물의 기생충침입(parasitic infestation) 또는 감염에 의해 일반적으로 발생하는 기생충질병은 사람 및 동물의 건강에 큰 피해를 주며, 또 농업에 중대한 피해를 입힌다.

따라서, 새로운 구충제의 출현을 항상 필요로 하고 있다.

이와같은 관점에서, 본 발명의 목적은 구충력이 있는 새로운 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 그 새로운 화합물을 생산하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 하나의 다른 목적은 활성성분으로서 상기 화합물을 포함하는 구충제 조성물과, 그 구충제조성물을 사용하여 기생충감염을 처리 및 방지하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 구충력이 있는 물질을 다년간 계속해서 연구하였다. 그 결과, 균배양물에는 구충물질이 함유되어 있다는 것을 연구결과 확인하였다. 본 발명자들은 그 활성물질을 분리시켜 물리화학적특성을 정하였다.

이와같이 본 발명은 첫째로 다음 특성을 가진 PF1022 물질을 제공한다.

(1) 외관 : 무색결정

(2) 융점 : 104∼106℃

(3) 분자식 : C₅₂H₇₆N₄O₁₂

(4) 원소분석치

계산치 (%) : C, 65.80 : H, 0.07 : N, 5.90

실측치 (%) : C, 65.46 ; H, 8.25 : N, 6.10

(5) 질량 스펙트럼(EI-MS) : m/z 984(M+):

(6) 비선광도 [α]²²:-102⁰(c=0.1, 메타놀):

(7) 자외선 흡수스펙트럼 : 제1도에서와 같음

(8) 적외선 흡수스펙트럼 :제2도에서와 같음

(9)¹H NMR 스펙트럼 :제3도에서와 같음

(10)¹³C NMR 스펙트럼 :제4도에서와 같음

(11) 용해도 : 메타놀, 에틸아세테이트 아세톤, 클로포름 및 디메틸 설폭사이드에 용해, 물에 불용

(12) 염기성, 산성 및 중성에 의한 분류 : 중성물질

X레이 분석데이터에 의해 상기 PF1022 물질은 다음의 화학구조를 가짐을 나타낸다.

본 발명은 둘째로 상기 PF1022 물질을 생산할 수 있는 균을 배양시켜 그 PF1022물질을 그 배양물에서 채취하는 것을 특징으로 하는 PF1022 물질의 생산방법을 제공하는데 있다.

또 발명은 상기 PF1022 물질을 포함하는 구충제조성물을 제공하는데 있다. 따라서 상기 PF1022물질은 생산할 수 있는 미생물균주, 즉 PF1022 균주는 1988년 일본 이바라키현에서 채취한 하나의 식물시료(plant sample)에서 새로 분리시킨 일종의 균으로, 다음과 같은 균학적 특성을 가진다.

PF1022 균주의 균 특성

상기 균주는 25℃에서, 다음의 4종배지상에서 다량으로 성장한다. 감자텍스트로오스 한천배지(potato dextrose agar)(PDA), 감자당근한천배지(potato carrot agar : PCA), 맥아엑스한천배지(malt extract agar :MEA) 및 오우트밀 한천배지(oatmeal agar :OA)에서 잘 생육된다.

백색의 방사상균사(fluffy hyphae)는 7일간 페트리디쉬(petri dish)(85㎜)상에서 배양한다. 집략(colony)의 이면은 그 칼라가 초기에는 백색내지 담황색이다. 약 3주정도 배양한 후에는 흑갈색 스폿(spor, 직경 2~3㎜)을 그 이면에서 관찰할 수 있다.

무성아포(condinium)생성 등의 다른 형태학적특성은 관찰할 수 없다. 현저한 가용성색소는 생성하지 않는다. PH5∼7 범위에서의 성육은 양호하다. 상기 균주의 다음 배지에서는 25℃에서 그 성육이 불량하다. 짜펙독스한천(czapk Dox agar : CZA), 미우라한천(miura agar : LCA), 옥수수 분말한천(corn meal agar : CMA)배지상에서 성육이 나쁘다. 그 집락(colony)(백색의 방사상)크기는 7일간 성장후에 직경이 약 10∼20㎜의 범위를 가진다. 무성아포(conidium) 등의 형성은 관찰할 수 없다. 온도 37℃에서는 생육되지 않는다. 온도 15℃에서는 배지 PCA,PDA,MEA 및 OA에서 크기 약 35∼50㎜의 범위로 생육하고 그 배양특성은 25℃에서 관찰할 수 있는 특성과 거의 동일하다. 밀짚, 바나나잎, 카네이션잎 등으로 덮은 평한천배지(plain agar)를 25℃에서 배양하여 1개월간 관찰한 결과 무성아포(conium)형성 등 어떠한 형태학적 특징을 나타내지 않는다. 위에서와 같이, 이 균주를 목(order)아고노미세탈레스(Agonomycetales)(Mycelia Starilia)에 속하는 균주 PF1022로 명명하였다. 이 균주는 부다베스트조약에 따라 기탁번호 FERM BP-2671로 일본국 통산성 공업기술원 미생물공업기술연구소에 기탁되었다. 다른 균주와 같이 그 균주 PF1022는 그 성상이 불안정하다. 따라서, 예로서 이 균주로부터 유래하는 페노지고트(Phenozygote) 또는 유전자조합형(genetic recombinant)돌연변이체(mutant)(자연발생 또는 인공유발성 돌연변이로부터 얻어짐)는 상기 PF1022 물질을 생산할 수 있는 경우 본 발명을 실시하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방법을 사용할 때 상기에 언급한 균주 또는 다른 PF1022 물질발생균주를 통상의 미생물이 이용할 수 있는 통상의 영양분을 함유한 배지에서 배양한다. 균성장에 유용한 이 분야에서 공지된 영양원을 사용할 수 있다.

PF1022 균주 배양방법

탄소원으로 글루코오스, 뉴크로오스, 전분시럽, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 당밀, 동식물유 등이 유용하며, 질소원으로 콩깻묵(soybean cake), 밀씨눈(wheat germ), 옥수수침지액(corm steep liquor), 목화씨깻묵(cottonseed cake), 고기추출물(meat extract), 펩톤, 효모추출물(yeast extract), 암모늄설페이트, 소듐니트레이트 및 뇨소가 유용하다.

소듐, 포타슘 칼슘, 마그네슘, 코발트, 클로라이드, 포스페이트, 설페이트를 제공할 수 있는 무기질염류와 기타 다른 이온을 필요에 따라 그 배지에 효과적으로 추가시킬수 있다. 또 균주성장고 PF1022물질생산을 촉진시킬 수 있는 유기물질 및 무기물질을 알맞게 첨가시킬 수 있다. 배양법으로서는 호기성 상태에서의 배양법, 특히 심부배양법(submerged culture)이 가장 적합하다. 그 배양에 알맞은 온도 범위는 15∼30℃이며, 최적생육온도는 약 26℃이다. 진탕배양 또는 탱크배양에서, PF1022물질의 생산은 일반적으로 필요한 기간이 사용배지와 배양조건에 따라 변화되나 2일 내지 10일내에 축적이 최고로 된다. PF1022 물질의 축적량이 피이크로 된 때 배양처리를 정지하고 필요한 생성물을 분리시켜 배양액에서 정제한다.

PF1022물질의 정제

상기 방법으로 하여 생산된 PF1022물질은 그 물리화학적 특성을 이용하는 통상의 분리방법, 예로서 용매추출(solvent extraction), 이온교환수지처리, 흡착 또는 분배컬럼크로마토그라피, 겔여과, 투석(dialysis), 침전 등의 방법을 단독으로 또는 알맞게 조합시켜 그 배양물으로부터 채취할 수 있다.

예로서, PF1022물질은 배양균체로부터 아세톤-물 또는 메타놀-물로 추출할 수 있다. 또, 배양성장액에 축적한 PF1022물질은 예로서 합성흡착제인 다이어이온(Diaion)HP-20(미쓰비시카세이(주)제품)에 흡착시킬 수 있으며, 또 부타놀 또는 에틸아세테이트 등 물과 혼합되지 않는 유기용매로 추출시킬 수 있다. 또다른 정제방법으로, PF1022물질은 실리카겔(즉, 와코겔 C-200, 와코퓨어케미컬인더스트리스제품) 또는 알루미나 등의 흡착제 또는 세파덱스(Sephadex)LH-20(Pharmacia 제품)등의 겔여과제를 사용하여 크로마토그라피 처리를 할 수 있다.

정제공정시에 PF1022물질은 실리카겔막층코로마토그라피 또는 고성능액체크로마토그라피로 검출할 수 있다.

박층크로마토그라피의 경우, 샘플을 실리카겔판(즉, Merck, art. 5715)에 적용시켜 클로로포름-에틸아세테이트(용량비 2:1)로 전개하였다. 상기 PF1022물질은 발색시약으로 몰리브덴시약을 사용하여 Rf 치 0.57에서 청색스폿(bule spot)으로 검출할 수 있다.

고성능 액체크로마토그라피의 경우, 샘플을 컬럼(column)(즉, ODS-H 제품 ; 시마즈테크노-리서치 인코포레이티드사제품 ; 내경 4㎜×150㎜)에 적용시켜 유량 0.75ml/min에서 80%아세트니트릴용액으로 전개하였다. PF1022 물질은 220nm에서 흡광도(absorbance)를 측정함으로써 체유시간 (retention time) 7.1분에서 나타낸 피이크로 검출할 수 있다. 본 발명은 셋째로, 활성성분으로 PF1022 물질을 함유하는 구충력을 가진 조성물을 제공하는데 있다. 상기 PF1022물질을 구충제로 적용할 수 있는 동물에는 돼지(swine), 소(cattle), 말, 토끼, 양, 염소, 병아리, 오리, 칠면조, 마우스 랫(rate), 기니아픽(guinea pigs)(속칭 모르모토), 원숭이, 개, 고양이, 새(swall birds) 및 기타 가축동물, 닭(domestic fowls), 실험용동물 및 애완동물을 들 수 있다.

또 상기 PF1022물질은 사람에게도 적용할 수 있다. 동물에서 PF1022물질을 사용하여 제거할 수 있는 기생충에는 꼬임털선충(Haemonchus Contortus), 싸상선충(Ostertagia Ostertagi), 털 선충속(Thichostrongylus)(즉, T.Colubriformis)에 속하는 모양선충(small hairworms), 코오페리아 커티세이(Cooperia Curticei)속에 속하는 요충,요에소파고 스토뮴 속(genus Oesophagostormum)(Oesorhagostomum radiatum, Oesophagostomum Columbianum, Oesophagostomum Venulosum)에 속하는 결절상선충(Nodular worms), 쌍구흡충(amphistomes)(즉, Paramphistomu m cervi), 장촌충(intestinal tapewoms)(Moniezia benedeni), 페충(lung worms) (Dictyocaulus filaria, Dictyocaulus Viviparus) 및 간디스토마(liver flukes) (Fasciola hepatica), 대장회충(large intestinal roundworms)(Ascaris suum), 편충(whipworms)(Thichuris Suis) 및 결절상편충(Oesophagostomum dentaturm)등의 돼지기생충, 크기가 큰 회충(parascaris equorum)요충(Pinworms)(oxyuris equi), 하브로네마 속(genus Habronema)(즉, Habronema megastoma)에 속하는 위충(stomachworms), 원충속(genus strogylus)(즉, S.equiness)에 속하는 크기가 큰 원충(strongyle)트리오돈로포러스속(genus Triodontophorus)(즉, T. Serratus)에 속하는 크기가 작은 원충(small strongyles)등의 말(馬)의 기생충, 회충(round worms)(Toxocara canis)십이지장충(hook worms)(ancylostoma canium), 편충(Thichuris wuepis) 및 필라리아(heart worms)(Dirofilaria immitus)등의 개 기생충, 회충(Toxocara cati) 및 촌충(tape worms)(Diphyllobothrium erinacei)등의 고양이 기생충, 회충(Ascaridia gerlli)모두충(capillarid worms)또는 캐필라리아 속(Capillaria)(즉, C. annulate)에 속하는 모양선충(hair worms) 및 맹장충(caecal worms)(Heterakis gallinae)등의 병아리 기생충, 회충(Ascaris lumbricoides), 요충(pinworms)(Enterobius Vermicularis), 십이지장충(hookworms)(Ancylostoma duodenale, Ancylostoma ceylanicum, Nacator americanus), 유방향성 모양선충(ofiental hairworms)(Thichostrongylus orientalis), 간충(strongloid-esworms)(Strongyloides Stercoralis) 및 편충(whipworms)(Prichuris trichirura) 등 사람의 소화관생충을 열거할 수 있다. 상기 PF1022물질은 기생충감염을 예방 및 처리하는데 사용할 수 있다. 치료에 있어서 상기 PF1022물질을 경구 또는 비경구 투여를 할 수 있다. 경구투여에 있어서, 상기 PF1022물질은 위 카테테르(Stomach Catheter)등에 의한 강제투여용 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜 용액 땅콩기름, 콩기름 등의 기름현탁액 또는 에멀젼형태, 음료수 또는 통상의 먹이(ordinary feed)를 사용한 혼합물 또는 희석물 형태, 또는 정제, 캡술제, 펠릿, 거환(boluses), 분말 또는 연질캡슐제 등 경구투여용에 적합한 통상의 투여량형태로 투여할 수 있다.

비경구투여용으로, 상기 물질은 땅콩기름, 콩기름 등에서 조제한 물-불용성제제형태 또는 글리세롤, 폴리에틸렌글리콩 등에서 조제한 물-수용성제제 형태로, 피하투여, 근육내투여, 정맥내투여, 복강내투여 또는 주사에 의한 상기 경로로 투여할 수 있다. 예방제용(prophylactic)으로, 상기 물질은 일반적으로, 통상의 사용에 있어, 먹이로 서의 혼합물형태로 경구투여를 한다. 예방제 사용의 경우, 투여기간은 한정되지 않으나 대부분의 실시예에 있어서 육계용 병아리는 약 2개월의 기간이면 충분하며 돼지는 약5개월의 기간이면 충분하다. 상기 PF1022물질의 사용량은 처리되는 동물, 기생충 및 투여방법에 따라 다르게 할 수 있다. 예로서, 위 카케테르(stomach catteter)를 사용하여 용액제제의 경구투여에 의해 병아리회충을 제거시킬 경우 사용량은 1일 1회 또는 2∼5회 0.05㎎/㎏이상, 바람직하게는 0.2∼3㎎/㎏이다.

예방용으로, 1일 1회 또는 2∼5회 1ppm/feed 이상 5∼10ppm/feed 의 농도로 먹이에 첨가시켜 계속 투여한다. 또 액상담체에 함유되어 있는 PF1022 물질의 용액 또는 현탁액은 예로서 피하주사 또는 근육내주사에 의해 동물에 비경구투여를 할 수 있다. 땅콩기름 및 콩기름등의 식물성기름을 사용하는 비수용성제제와 물-수용성부형제를 포함한 수용성 비경구용제제를 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜 등의 비경구투여용으로 사용할 수 있다. 이들의 제제에는 일반적으로 상기 PF1022물질을 0.1∼10wt% 포함되어 있다. 비경구 1일 사용량은 일반적으로 0.01㎎/㎏이상이고, 바람직하게는 0.1∼10㎎/㎏의 범위이다. 상기 PF1022물질을 마우스에 300㎎/㎏의 사용량으로 하여 경구투여할 경우에도 정상적인 체증증가가 어떤 이상(abnormalities)도 없이 얻어진다. 이것은 곤 상기 물질의 독성이 극히 낮음을 나타낸 것이다. 상기 PF1022 물질은 아메스시험(Ames test)과 포유동물세포염색체수차 시험(mannalian cell chromosormal aberration test)에서 음성성적(negative results)을 나타내며, 따라서, 돌연변이유발성(mutagenicity)문제가 없음을 나타내고 있다. 다음 실시예는 본 발명을 나타낸 목적만을 기술한 것이며 본 발명의 범위를 한정한 것은 아니다. 물론, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 여러가지로 변형 및 변경시킬 수 있다.

실시예 1

다음 조성을 가진 배지를 종자배양배지로 사용하였다.

배지 : 전부 1.0%, 글루코오스 1.0%, 목화씨깻묵 0.5%, 밀씨눈(wheat germ) 0.5%, 콩깻묵 0.5%, 효모추출물 0.5%, 마그네숨 설페이트(헵타히드레이트) 0.1%, 칼슘카보네이트 0.2% 및 소듐클로리드 0.2% 또 생산배지로서는 다음 조성물 가졌다: 전분시럽 3.1%, 콩기름 1.0%, 밀씨눈 0.8%, 콩깻묵 1.0%, 말린효모 1.0%, 칼슘카보네이트 0.3%, 마그네슘설페이트(헵타히드레이트) 0.2%, 소듐클로리드 0.2%.

그 배지를 살균전 PH7로 항상 조정하였다.

상기 종자배양배지를 100ml용 어렌메이어플라스크(erlenmeyer flasks)에 20ml씩 분배시켜 15분간 120℃에서 살균하고 불안전균 PF1022(FERM BP-2671)의 사면한천배양을 한1개의 플라스크당 2∼3백금이량(loopfuls)으로 접종시켰다. 진탕배양을 7일간 26℃에서 실시하여 1차종자배양물을 얻었다. 그 다음, 그 종자배양물의 배지를 500ml용 에렌메이어플라스크에 80㎖씩 분배시켜 15분간 120℃에서 살균하고 상기 1차종자배양물의 플라스크 1개당 4㎖씩 접종시켰다. 진탕배양은 2일간 26에서 실시하여 2차종자배양을 얻었다. 그 생산배지를 2개의 50ℓ용 자발효조(jar fermenters)에 35ℓ씩 분배하여 120에서 30분간 살균하고 상기 2차종자배양물(1개의 자발효조에 대하여 5개의 500㎖용 플라스크에서의 총합계량)로 접종하였다.

배양은 통기(aeration)(20ℓ/min)와 교반(1차로 65시간동안 250rpm, 그다음에 400rpm)을 하면서 5일간 26℃에서 실시하였다. 배양을 완료한 다음 규조토(여과조제)를 그 배양물에 첨가시켜 그 혼합물을 여과시켰다. 그리고 60% 아세톤수(62ℓ)를 이와같이 하여 얻어진 세포함유고형질에 첨가하였다. 이 혼합물을 1시간 교반시켜 그 세포를 여과시켜 분리하였다. 아세톤을 상기와 같이하여 얻어진 세포추출물에서 증발제거시켜 농축액(11.7ℓ)을 얻었다 상기 PF1022물질은 에틸아세테이트(23ℓ)를 써서 이농축액에 추출하였다. 에틸아세테이트층을 농축하면 유상물지(oily substance)(19.8g)이 얻어졌다. 이 유상물질은 실리카겔(와코겔 C-200, 250g)을 사용한 컬럼크로마토그라피에 전개용매로서 클로로포름(2g)과, 클로로포름 및 메타놀(100:1, 1.5ℓ)로 구성된 혼합용매로 처리하였다.

상기 PF1022 물질의 검출은 실리카겔 TCL판(Merck, Art. 5715), 전개용매로서 클로로포름과 에틸아세테이트(용량비 2:1)의 혼합용매 및 발색시약으로 몰리브덴시약을 사용하여 실리카겔박층크로마토그라피에 의해 실시하였다. 그 PF1022물질은 Rf치 0.57에서 청색스폿(blue spot)으로 검출되었다.

상기 PF1022물질함유프랙션을 혼합하고 농축건조시켜 갈색오일(4.25g)을 얻었다. 이와 같이하여 얻어진 조제(粗製)의 PF1022 물질을 소량의 메타놀에 용해시키고, 사전에 메탄놀과 평형을 이룬 세파덱스 LH-20(1ℓ)컬럼과 전개용매로서 메타놀을 사용하여 컬럼크로마토그라피처리를 하였다.

상기 PF1022 물질함유프랙선을 혼합하여 농축건조시켜 담황색분말(594㎎)을 얻었다. 이 분말 100mg은 전개용매로서 아세토니트릴과 물(85:15)로 구성된 혼합용매를 사용하여 고성능 액체크로마토그라피(YMC, D-ODS-5)로 정제시켰다. 이 PF1022 물질함유프랙션을 혼합하고 용매를 증발제거하여 무색분말(65.5㎎)을 얻었다. 이 분말을 아세톤 0.5ml에 용해시키며, 이용액에 헥산 5ml로 첨가시켜 얻어진 혼합물은 실온에서 하루밤 방치시켰다. 상기 PF1022물질은 무색의 주상(pillars)(24.9㎎)으로 얻어졌다. 이와같이 하여 얻어진PF1022물질은 다음 실시예에 사용하였다.

실시예 2

분변검사법(糞便檢査法:Scatoscopy)에 의해 대장회충(Ascaridia galli)에 인공감염시켜 검증한 병아리를 1군 3마리로 하여 사용하였다. 상기 PF1022물질을 0.2∼3㎎/㎏의 범위에서 5단계의 사용량으로 하여 사용하였다. 총 18마리의 병아리는 처리하지 아니한 무처리표준군을 포함한 6군으로 하여 사용하였다. 경구용으로, 각 병아리의

체중을 기준으로 하여 산출한 사용량과 정확하게 동일한 PF1022물질의 량을 계량하여 카복시메틸셀룰로오스(CMC)가 함유된 물에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액은 위튜브(stomach tube)를 사용하고 1회 사용량으로 하여 경구투여하였다. 투여후 제거한 충류(worms) 수를 각 병아리에 대하여 매일 산출하고, 7일 후에 각 병아리를 도살시켜 검시하여 장관(intestinal tract)내에 잔류한 층류(worms)를 계산하였다. 제거율(%)(percent elimination)은 다음과 같이 산출하였다.

또, 투여 바로전의 체중과 7일 후의 체중을 각 병아리에 대하여 측정하여 체중증가율 %을 아래와 같이 산출하였다.

상기 시험결과를 표 1에 나타낸다.

표 1에서와 같이, 상기 PF1022물질은 사용량 0.2㎎/㎏에서 구충력을 나타내고 있으며, 구충효과는 사용량증가에 따라 증가되어 사용량 3㎎/㎏에서 약 100%에 달하였다.

100% 제거율을 나타낸 사용량에서 체중증가율(%)은 처리하지 않은 표준체중증가율(%)과 비교할 때 상기 PF1022 물질은 대단히 안전한 물질임을 나타내고 있다.

실시예 3

돼지에서의 PF1022물질의 구충효과는 분변검사법(Scatoscopy)에 의해, 대장회충(Ascaris Suum)으로 감염시킨 것으로 확인된 돼지에 상기물질을 경구투여시켜 펑가하였다.

상기 PF1022물질은 각 사용량과 동일한 상기 물질량을 소량의 통상먹이(feed)와 혼합시켜 1회에 5㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏으로 투여하거나 1일 사용량 1.25㎎/㎏, 2.5㎎/㎏ 또는 5㎎/㎏을 1일에 1회로 하여 연속 2일간 투여하였다.

투여 후, 제거한 회충을 계산하고, 분변(feces)은 1g의 분변당회충알(EPG)의 수를 매일 조사하였다(EPG : egg per gram of frces).

투여실시 1주일 후 그 돼지를 도살시켜 검시하고 장관(intestinal tract)에 잔류되는 회충을 계산하였다. 얻어지 결과는 표 2에서와 같다

표2에서와 같이 2일간 투여할때 상기 물질은 사용량 1.25㎎/㎏에서 이미 구충력을 나타내었다.

회충게거율%은 사용량 2.5㎎/㎏으로 2일 투여에서 그리고 사용량 5㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏으로 1회 투여에서 50%이상이었다.

상기 PF1022물질은 돼지대장회충에 대하여 강력한 구충효과를 나타내었다.

실시예 4

상기 PF1022 물질을 분변겸사법(Scatoscopy)에 의해 편충(Trichuris Suis)으로 감염시킨 것으로 확인된 돼지에 경구투여시켜 돼지편충에 대한 구충효과를 평가하였다.

상기 PF1022물질은 각 사용량과 동일한 상기 물질의 량은 소량의 통상의 먹이와 혼합시켜 사용량 1㎎/㎏, 5㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏에서 1회 투여하거나 사용량 2.5㎎/㎏ 또는 5㎎/㎏에서 매일 1회 계속해서 2일간 투여하였다.

투여후 각 돼지의 분변(feces)내에 있는 편충알수를 EPG로 매일 측정하였다. 3마리의 돼지에서 제거한 편충을 또 계산하였다. 투여개시 일주일 후 돼지전부를 도살시켜 검시하고 그 장관에 남았있는 편충을 계산하였다. 그 결과 얻어진 성적은 표 3에서와 같다.

표 3에서와 같이, 상기 물질은 사용량 1㎎/㎏으로 1회 투여할 때 근소한 구충력을 나타내었다. 사용량 5㎎/㎏으로 1회 투여할 때 상기 물질은 약 80% 내지 100%의 편충제거율을 나타내었다.

상기 물질을 사용량10㎎/㎏으로 1회 또는 사용량 5㎎/㎏으로 2일간 투여하였을 때 그 편충은 그 돼지에서 100%제거되어 잔류되지 않았다.

상기 물질을 사용량 2.5㎎/㎏으로 2일간 투여할 때 하나의 돼지에서 편충 하나가 잔류돼었고 다른 돼지에서는 편충이 잔류되지 않았다. 이와 같이 상기 PF 물질은 돼지편충에 대한 유효한 구충효과가 있음이 확인되었다.

실시예 5

분변검사법에 의해 회충으로 감염된 것을 확인환 12마리의 고양이에 상기 물질을 1회 경구투여하여 고양이회충(feline round worms)에 대한 상기 물질의 구충효과를 평가하였다.

감염된 고양이를 4마리씩 3군으로 사용하고 상기 물질을 각각 0.2㎎/㎏, 1㎎/㎏, 5㎎/㎏으로 하여 소량의 통상의 먹이(feed)와 혼합하였다.

관찰항목은 투여 후 7일간의 관찰기간동안에 제거한 회충수와, 투여 7일 후 검시할 때 확인된 바와같이 잔류된 회충수이다.

그 결과 얻어진 성적은 표 4에서와 같다.

표 4에서와 같이, 사용량 0.2㎎/㎏에서 제거율은 4마리고양이중 3마리가 100%이었다.

사용량 5㎎/㎏에서 제거율은 고양이 모두 100%이었다.

이와같이 PF1022물질은 고양이 회충에 대한 유효한 구충효과가 있음이 확인되었다.

실시예 6

분변검사법에 의해 고양이 십이지장충(Ancylostoma tubaeforme)으로 감염되었음을 확인한 12마리 고양이에 대하여 1회 경구투여하여 고양이 십이지장충에 대한 PF1022물질의 구충효과를 평가하였다.

감염고양이를 4마리씩 3군으로 나누어 상기 물질 0.2㎎/㎏, 1㎎/㎏, 5㎎/㎏을 각각 소량의 통상의 먹이와 혼합하여 사용하였다.

관찰항목은 투여 후 7일간 제거한 십이지장충수와 투여 7일 후 검시할 때 확인된 잔류십이지장충수이다. 그 결과 얻어진 성적은 표 5와 같다.

표 5에서와 같이, 사용량 0.2㎎/㎏에서 제거율은 고양이한마리에 있어서 100%이었다.

제거율 %는 사용량의 증가에 따라 증가되며 사용량 5㎎/㎏에서 제거율은 고양이전체가 100%이었다.

이와같이 상기 PF1022물질은 고양이십이지장충에 대한 유효한 구충효과가 있음을 나타내었다.

실시예 7

제4위충(fouth stomach worms)(Ostertagia Circumcincta)과 소장모양 선층(small intestinal hair worms(Thichostrongylus Colubriformis)으로 인공감염시킨 24마리의 양에 대하여 경구투여시켜 상기 제4위충과 소장모양선충이 혼선으로 감염된 양에 대한 PF1022 물질의 구충효과를 평가하였다.

그 감염양은 6마리씩 4군으로 나누어 위 카테테르(stomach catheter)에 의해, 0.5% CMC를 현탁시킨 상기물질을 각각 1㎎/㎏, 5㎎/㎏, 10㎎/㎏ 및 0㎎/㎏(표준)으로 하여 처리하였다.

관찰항목은 투여전, 투여 7일 후 분변 1gr 당 기생충알수와, 제4위에 잔류된 기생충수 및 투여 7일 후 검시할 때 확인된 장관내 잔류기생충수이다.

처리결과 성적은 표 6에서와 같다.

주어진 각 숫치는 양 6마리의 평균치이다.

표 6에서와 같이, 사용량 10㎎/㎏조에서 제4위에 잔류된 선충수와 장관내에 잔류된 선충수는 표준감염군에서 각각의 수에 약 반이 되었다.

이와같이, PF1022물질은 상기 위충과 모양선충에 대한 구충효과가 있음이 확인되었다.

실시예 8

분변검사법에 의해 소의 소화관에 기생하는 선충(Haemouchus controtus, Ostertagia ostertagi, 모양선충, 코오퍼리드 : Cooperids 등)으로 감염된 것을 확인한 3마리 소에 상기 PF1022물질을 경구투여시켜 소화관 선충이 기생하는 소에 대한 PF1022물질의 구충효과를 평가하였다.

상기 PF1022물질은 위 카테테르를 사용하여 물에 현탁시킨 현탁액 형태로 하여 1회에 사용량 5㎎/㎏ 또는 1일 1회에 사용량 12.5㎎/㎏으로 2일간 투여하였다. 분변(feces)내 기생충알(EPG)은 투여전 3일과 투여 후 7일간 매일 측정하였다.

그 결과 얻어진 성적은 표 7에서와 같다.

표 7에서와 같이 사용량 5㎎/㎏에서 선충알수는 데이터범위의 변화가 광범위하나 점진적인 감소경향을 나타내었으며, 사용량 12.5㎎/㎏에서 2일 투여 후 2차투여일후 일별선충알수는 투여전에 확인된 수의 약 반이 되었다.

이와같이 PF1022 물질은 소화관선충에 대한 구충효과가 있음이 확인되었다.

실시예 9

상기 PF1022 물질을 말에 경구투여시켜, 회충(parascaris equorum)과 원충(Strongyles)(Stronglus Spp.)에 감염된 것을 분변검사법에 의해 확인한 말(馬)에 대한 PF1022물질의 구충효과를 평가하였다. 상기 PF1022물질을 물에 현탁시켜 첫날에 사용량 5㎎/㎏, 둘째날에 2.5㎎/㎏으로 위 카테테르(stomach catheter)에 의해 투여하였다.

상기 회충과 원충에 대하여 분변 각 g당 기생충알(EPG)과 제거기생충알의 수를 1차투여 후 1주일간 매일 측정하였다. 선충에 있어서, 분변 100g에서 선충수를 측정하였다.

그 결과 얻어진 성적은 표 8에서와 같다.

표 8에서와 같이, EPG는 둘째투여일에 감소하기 시작하였고, 그 다음날에 현저한 감소를 나탄내었다.

회충제거율은 둘째투여일과 그 다음날에 관찰하였다. 회충제거율은 그 다음날에는 확인되지 않았다. 원충제거율은 둘째투여일에만 확인되었다(분변 100g당 82마리의 원충). 원충은 그 다음날에는 제거되지 않았다.

이와같이 PF1022 물질은 말의 회충과 요충에 대한 강력한 구충효과를 가짐을 나타내었다.

실시예 10.

혼합물형태의 PF1022물질을 먹이와 같이 투여시켜 분변검사법에 의해 대장회충(Ascarida galli)으로 감염된 것을 확인한 9마리의 병아리에 대한 PF1022 물질의 구충효과를 평가하였다.

그 병아리는 3마리씩 3군으로 나누어 1ppm, 5ppm 및 10ppm 군으로 처리하였다. 상기 각 농도의 PF1022물질을 포함한 먹이는 3주간 병아리에 투여하였다. 분변의 기생충알은 EPG에 있어서 1주간 측정하였고 그 제거된 기생충을 매일 측정하였다.

투여기간에 종료할 때 그 병아리를 도살시켜 검시하여 잔류된 기생충을 측정하였다.

그 결과 얻어진 성적은 표 9에서와 같다.

표 9에서와 같이, 1ppm군에서 기생충제거율은 병아리두마리에만 측정하였다. 5ppm 군에서, 분변내 기생충알수는 초기투여 2주일후에 병아리전체는 0이었으나 그 병아리에 잔류되어 있는 기생충이 약간 있었다. 10ppm 군에서, 기생충제거율은 병아리 두 마리에서 100%이었다. 이와같이 PF1022물질은 병아리대장회충에 대한 유효한 구충효과가 있음이 확인되었다.

실시예 11

소의 제4위(fourth stomach)에서 분리한 소의 꼬임털선층(Haemonchus contortus)이 유영(swin)하고 있는 시험관에 PF1022물질을 첨가시켜 PF1022물질의 구충력에 대하여 평가하였다.

4개의 시험관에 생리적식염용액을 분배시켜 39∼40℃로 가열하였다. 소의 제4위에서 수집한 3∼4마리의 꼬임털선충을 각 시험관내 배지에 넣었다. 그 다음 유영하도록 하였다. 적당량의 PF1022물질을 소량의 디메틸설폭시드에 용해시켜, 그 얻어진 용액을 그 배지에 적가시켰다.

혼합하기 위하여 교반시킨다음 각 상기 선층의 행동을 관찰하였다.

3개의 시험관에 있는 배양배지의 회충농도가 각각 2ppm, 8ppm 및 40ppm으로 되도록 PF1022 물질의 량을 조정하였다.

디메틸설폭시드만을 그 나머지 시험관내 적가시켜 표준(기준)으로 하여 처리하였다.

상기 선층은 40ppm의 PF1022 물질농도에서 10분간, 8ppm의 PF1022 물질농도에서 15분간, 2ppm에서 PF1022물질농도에서 25분간 운동이 정지되었다. 표준시험관에서(디메틸설폭시드만을 적가) 상기 선충의 운동이 약화되었으나 1시간 경과후에도 이동은 계속관찰되었다.

이와같이 PF1022물질은 꼬임털선충에 대한 유효한 마비력이 있음이 확인되었다.

실시예 12

분변검사법에 의해 회충(Toxocara conis), 십이지장충(hoohworms)(Ancylostoma Caninum), 편충(whipworms)(Thichuris Vulpis)으로 각각 감염된 것을 확인한 개에 PF1022물질의 구충효과를 평가하였다. 상기 PF1022 물질은 소량의 통상의 먹이와 혼합시켜 회충 또는 십이지장충으로 감염한 개에 1회 사용량 5㎎/㎏을 경구투여하였다.

제거기생충과 개에 투여 7일 후 잔류기생충을 측정하였다. 개에서 6마리의 회충이 제거되었으나 잔류된 회충은 확인되지 않았다. 12마리의 십이지장충이 제거되었으나 잔류된 십이지장충은 확인되지 않았다. 이와같이 제거율은 두 경우 100%이었다.

반면에, 상기 편충은 감염시킨 두 마리 개중 한 마리는 1회에 사용량 5㎎/㎏를 경구투여하였고, 다른 한 마리는 1회 10㎎/㎏을 투여하였다.

제거기생충과 투여 7일 후 잔류기생충을 측정하였다. 사용량 5㎎/㎏에서 327마리의 편충은 제거되었으나 504마리의 편충이 잔류전으로 확인되었다.

따라서 제거율%는 39.4%이었다. 사용량 10㎎/㎏에서 22마리의 편충이 제거되었으나 제거되지 않고 잔류된 것은 확인되지 않았다. 이와같이 제거율은 100%이었다. 상기 성적 데이터에 의해 PF1022물질이 개의 회충, 십이지장충 및 편충에 대한 유효한 구충효과가 있다는 것을 나타난다.

Claims

다음 구조식으로 나타낸 것을 특징으로 하는 PF1022물질.
제1항의 PF1022물질의 생산방법에 있어서, 상기 PF1022물질을 생산할 수 있고 목(order)아고노미세탈레스(Agonomycetales)에 속하는 균(fungal strain)을 배양시켜, 그 배양물에서 상기 PF1022물질을 생산 및 축적시키고, 그 배양물에서 상기 PF1022물질을 회수시킴을 특징으로 하는 생산 방법.
제2항에 있어서, 상기 균은 부타베스트조약에 따라 기탁번호 PERM BP-2671로 일본국 통산성 공업기술원 미생물연구소에 기탁된 균 PF1022임을 특징으로 하는 생산방법.
활성성분 및 그 담체로서 제1항의 PF1022물질을 포함하는 구충제조성물.
제1항의 PF1022물질의 처리유효량을 기생충감염을 받은 사람이외의 동물에 대하여 투여시킴을 특징으로 하는 기생충감염처리방법.
제1항의 PF1022 물질의 기생충감염방지유효량을 사람이외의 동물에 투여시킴을 특징으로 하는 기생충 감염방지방법.