KR20020057951A - 사상균에서 기능하는 제어서열 및 발현계 - Google Patents

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Abstract

아고노마이세탈스(Agonomycetales)(특히, 마이셀리아 스테릴리아)에 속하는 사상균에서 내인성 유전자의 발현과 동조해서 기능하는 프로모터 및 터미네이터. 상기 프로모터는 서열번호:1로 나타내는 뉴클레오티드 서열과 그의 동류체를 함유한다. 상기 터미네이터는 서열번호:2로 나타내는 뉴클레오티드 서열과 그의 동류체를 함유한다. 또한, 사상균에서 목적 단백질을 고도로 발현시키는 발현 벡터, 목적 단백질을 고수율로 생성할 수 있는 형질전환된 사상균; 및 형질 전환된 사상균에서 목적 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

사상균에서 기능하는 제어서열 및 발현계{REGULATORY SEQUENCES FUNCTIONING IN FILAMENTOUS FUNGI}
사상균인 PF 1022균주(Mycelia sterilia)는 구충활성을 갖는 24원 환상 뎁시 펩티드인 PF 1022물질을 생산한다(FERM BP-2671). 이 균주는 유성 및 무성의 생식기를 형성하지 않기 때문에, 무포자 불완전균으로 분류된다(특개평 3-35796호).
한편, 약제내성과 함께 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae)유래의 타카아밀라제 유전자를 연결한 플라스미드를 PF 1022균주에 도입함으로써, PF 1022균주의 형질전환체가 얻어지고 있다(WO 97/00944호).
그러나, WO 97/00944호 공보에 기재되어 있는 아스페르길루스 오리재 유래의 타카아밀라제 유전자의 제어 DNA서열은, 이종 균주 유래의 제어 DNA서열이다. 게다가, 마이셀리아 스테릴리아(Mycelia sterilia)는 유전학적 특성은 아직 충분히 밝혀지지 않고, 발현 벡터가 만족할 조건도 명확하지 않다. 따라서, 이종 균주 유래의 제어서열을 사용한 형질전환체에 대해서는, PF 1022균주에 내재하는 유전자의발현과 동조한 발현제어가 행해지는가 아닌가가 불명확하다. 또, PF 1022균주는 무포자 불완전균에 속하기 때문에, 아스페루길루스속 이외의, 트리코데르마 (Trichoderma)속, 푸자륨(Fusarium)속, 및 뉴로스포라(Neurospora)속 등에서 사용되고 있는 종래의 제어 DNA서열이 합목적으로 발현하는지 아닌지도 동일하게 불명하다.
이 사실에서, 마이셀리아 스테릴리아에서 안정해서 기능하는 제어서열 및 발현 벡터계, 또한 이 것을 이용한 마이셀리아 스테릴리아에서 유용물질의 생산기술의 확립이 요망되고 있다.
본 발명은 사상균에서 기능하는 프로모터(promoter) 및 터미네이터 (terminator), 이들을 함유해서 되는 발현 벡터, 및 이 것에 의해 형질전환된 숙주에 관한 것이다.
도 1은Abp1유전자를 함유하는 6kb의HindⅢ 단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 pABPd의 구성 및 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
본 발명은, 무포자 불완전균에 속하는 사상균, 특히 마이셀리아 스테릴리아에서 내재하는 유전자의 발현과 동조(同調)해서 기능하는 제어서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 또, 무포자 불완전 균에 속하는 사상균, 특히 마이셀리아 스테릴리아에 있어서 목적 단백질을 고발현하는 발현 벡터의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은, 또한, 목적 단백질을 많이 생산하는, 형질전환된 무포자 불완전균에 속하는 사상균, 특히 마이셀리아 스테릴리아의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은, 또, 무포자 불완전균에 속하는 사상균, 특히 마이셀리아 스테릴리아에 있어서 목적 단백질을 제조하는 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명자들은, PF 1022균주에 있어서, 고수율로 발현하고 있는 유전자(Abp1유전자)와 그의 제어DNA서열을 단리, 동정하는 것에 성공했다.
본 발명자들은, 또, 얻어진 제어DNA서열을 사용해서 유전자 발현용의 발현 벡터를 제작하고, 이 것을 PF 1022물질 생산균에 도입하여 형질전환체를 얻고, 이 프로모터의 하류에 연결한 목적 유전자를 그의 기능이 손상되는 것이 없이 효율적으로 발현시키는 것에 성공했다.
본 발명에 의한 프로모터는, 하기로부터 되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유해서 되는 것, 및 프로모터 활성을 갖는 그의 단편이다:
(a) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열,
(b) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖고, 또한, 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열,
(c) 치환, 결실, 부가 및 삽입에서 선택되는 1 이상의 개변을 갖고, 또한 프로모터 활성을 갖는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 개변체, 및
(d) 스트린전트 조건(stringent condition)하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 하이브리다이즈(hybridize)하고, 또한 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열.
본 발명에 의한 터미네이터는, 하기에서 되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유해서 되는 것, 및 터미네이터 활성을 갖는 그의 단편이다:
(e) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열,
(f) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖고, 또한 터미네이터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열,
(g) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1 이상의 개변을 갖고, 또한,터미네이터 활성을 갖는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 개변체, 및
(h) 스트린전트 조건하에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 하이브리다이즈하고, 또한 터미네이터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열.
본 발명에 의한 발현 벡터는 상기 프로모터 또는 그의 단편과 상기 터미네이터 또는 그의 단편을 어느 것 또는 양쪽 함유해서 되는 것이다.
본 발명에 의한 형질전환된 숙주는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 것이다.
본 발명에 의한 목적물질의 제조법은, 상기 형질전환된 숙주를 배양하고, 이어서 배양물에서 목적 단백질을 채취하는 것을 포함해서 되는 것이다.
미생물의 기탁
PE 1022균주는, 1989년 1월 24일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반 3고)에 기탁되었다. 수탁번호는 FERM BP-2671이다.
제어서열
본 발명에 의하면 PF 1022생산균에서 기능하는 제어서열, 즉, 프로모터 및터미네이터가 제공된다.
서열(b)에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과의 동일성은, 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%, 가장 바람직하기는 적어도 95%일 수 있다.
서열(f)에 있어서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과의 동일성은, 바람직하기는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하기는 적어도 90% 이상, 가장 바람직하기는 적어도 95%일 수 있다.
서열(c) 및 서열(g)에 있어서, 개변의 수는, 예를 들면 1~수십개일 수 있다.
서열(c) 및 서열(g)에 있어서, 개변이 복수개 존재하는 경우, 도입된 개변의 종류는 동일하거나 또는 상이해도 좋다.
서열(d) 및 서열(h)에 있어서, 「스트린전트 조건」이라 함은, 하이브리다이제이션(hybridization)후의 멤브레인(membrane)의 세정조작을, 고온하에 저염농도 용액 중에서 행하는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.5 x SSC농도(1 x SSC:15mM 구연산3나트륨, 150mM 염화나트륨), 60℃, 15분간의 세정조건, 바람직하기는 0.5 x SSC농도, 0.1% SDS 용액 중에서 60℃, 15분간의 세정조건을 의미한다.
프로모터 활성을 갖는 단편은, 적어도 600염기쌍, 바람직하기는 적어도 800염기쌍, 더욱 바람작하기는 적어도 1000염기쌍, 가장 바람직하기는 적어도 1200 염기쌍의 길이일 수 있다.
터미네이터 활성을 갖는 단편은, 적어도 400염기쌍, 바람직하기는 적어도 600염기쌍, 더욱 바람직하기는 적어도 800염기쌍, 가장 바람직하기는 1000염기쌍의길이일 수 있다.
서열 (b), (c), 및 (d), 및 프로모터 활성을 갖는 단편에 관해서, 「프로모터 활성을 갖는다」아닌가 여부는, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 발현 벡터를 작성하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 이종 유전자를 숙주에서 발현시키고, 이종 단백질의 생산을 검출해서 평가할 수 있다.
서열 (f), (g) 및 (h), 및 터미네이터 활성을 갖는 단편에 관해서, 「터미네이터 활성을 갖는다」아닌가 여부는, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 발현 벡터를 작성하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 이종 유전자를 숙주에서 발현시키고, 이종 단백질의 생산을 검출해서 평가할 수 있다.
본 발명에 의한 프로모터 및 터미네이터는 무포자 불완전균으로 분류되는 사상균, 특히 마이셀리아속에 속하는 미생물, 더욱 구체적으로는 마이셀리아 스테릴리아에 속하는 미생물에서 기능할 수 있다.
본 발명에 의한 프로모터 및 터미네이터는 PF 1022 생산균에 있어서 기능할 수가 있다. PF 1022 생산균으로서는 PF 1022 물질을 생산하는 무포자 불완전균으로 분류되는 사상균을 들 수가 있다.
본 발명에 의한 프로모터 및 터미네이터는, 예를 들면, 이하와 같이해서 얻을 수가 있다.
PF 1022균주의 mRNA를 PF 1022물질 생산시의 세포에서 단리하여, 그 것을 주형에 사용해서 cDNA를 합성한다. 그 것을 무작위로 선발하여, 염기서열해석을 행하여, 높은 빈도로 발현하고 있는 유전자, 즉Abp1유전자에 유래하는 cDNA를 단리한다.
PF 1022균주에서 게놈 DNA를 추출하여, 적당한 제한효소로 절단한 후, 파아지 벡터 또는 플라스미드 벡터를 사용해서, PF 1022물질 생산균의 게놈 DNA으로부터 되는 라이브라리(library)를 제작한다.
이와 같이 제작한 PF 1022균주 유래의 게놈 DNA 라이브라리에서,Abp1유전자를 코드하는 번역영역을 프로브(probe)로서 사용해서,Abp1유전자 전장(全長)의 클로닝을 행한다. 단리된 게놈 DNA 및 상기 cDNA의 염기서열을 비교 검토하여, 이 유전자의 프로모터 및 터미네이터 부위를 결정하여, 프로모터 및 터미네이터로 할 수가 있다.
발현 벡터
본 발명에 의하면, PF 1022물질 생산균에서 기능하는 제어배열을 함유해서 되는 발현 벡터가 제공된다.
본 발명에 의한 발현 벡터의 구축의 순서 및 방법은, 유전자공학의 분야에서 관용되고 있는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 발현 벡터로서는, 숙주 염색체 DNA에 병합되는 것이나 자기복제가능한 자율적 복제배열을 갖는 벡터를 숙주 세포내에서 플라스미드 상태로 존재시키는 것을 들 수가 있고, 예를 들면, pUC계 (pUC18 또는 pUC118 등), pBluescript계 (pBluescriptⅡ KS+ 등), 및 pBR322 등의 플라스미드를 들 수가 있다. 숙주 세포내에 존재하는 유전자의 카피수는, 1카피이어도 또는 복수이어도 좋다.
본 발명에 의한 발현 벡터는, 그의 제1 태양에 있어서, 본 발명에 의한 프로모터 및/또는 터미네이터와, 경우에 따라서는, 유전자 카피 및/또는 다른 제어서열을 함유해서 되는 것이다. 따라서, 본 발명에 의한 프로모터 및 터미네이터의 어느 것 또는 양쪽을 함유해서 되는 발현 벡터는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 의한 프로모터를 적어도 함유해서 되는 발현 벡터에 있어서는, 터미네이터는 본 발명에 의한 터미네이터 이외의 것이어도 좋다.
본 발명에 의한 터미네이터를 적어도 함유해서 되는 발현 벡터에 있어서는, 프로모터는 본 발명에 의한 프로모터 이외의 것이어도 좋다.
유전자 마커(marker)의 도입은, 예를 들면, 본 발명에 의한 제어서열에 PCR법에 의해 적당한 제한효소 절단부위를 도입하고, 이 것을 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 약제내성 유전자 및/또는 영양요구성 상보 유전자 등의 선택마커 유전자를 연결해서 행할 수 있다.
유전자 마커는 형질전환체의 선택방법에 응해서 적당히 선택할 수 있으나, 예를 들면, 약제내성을 코드하는 유전자나 영양요구성을 상보하는 유전자를 사용할 수 있다. 약제내성 유전자로서는, 데스토마이신, 베노밀, 올리고마이신, 하이그로마이신, G418, 브레오마이신, 비아라포스, 블라스트사이진S, 플레오마이신, 포스피노슬리신, 암피실린, 가나마이신 등의 약제에 대한 유전자를 들 수가 있다. 영양요구성을 상보하는 유전자로서는,amdS,pyrG,argB,trpC,niaD,TRP1,LEU2,URA3등의 유전자를 들 수가 있다.
본 발명에 의한 발현 벡터는, 그의 제 2 태양에 있어서, 또한, 그의 제어서열에 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 함유해도 좋다.
제어서열으로의 연결은, 예를 들면, 통상의 방법에 따라서, 목적 단백질을 코드하는 유전자(목적 유전자)의 번역영역을 프로모터의 하류에 따른 방향으로 삽입해서 행할 수 있다. 이 경우, 목적 유전자를 다른 단백질의 번역영역을 코드하는 외래유전자와 연결시켜서 융합 단백질로서 발현시키는 것도 가능하다. 본 명세서에 있어서, 「목적유전자」라 함은, 발현의 대상으로 되는 임의의 유전자를 의미하고, 이종 유전자 또는 동종 유전자의 어느 것이라도 좋다. 목적 유전자는, 예를 들면, PF 1022물질 생산관련 유전자군에서 선택되는 유전자일 수 있다.
형질전환체 및 목적 단백질의 생산
본 발명에 의하면, 상기 발현 벡타에 의해 형질전환된 숙주가 제공된다. 본 발명에서 사용할 수 있는 숙주로서는, 유전자 재조합의 숙주로서 사용가능한 미생물이면 특히 한정되는 것은 아니지만, 사상균, 바람직하기는 무포자 불완전균으로 분류되는 사상균, 더욱 바람직하기는 마이셀리아에 속하는 미생물, 가장 바람직하기는 마이셀리아 스테릴리아에 속하는 미생물을 들 수가 있다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 숙주로서는, 또, PF 1022물질 생산균, 바람직하기는 PF 1022물질을 생산하는 사상균, 더욱 바람직하기는 PF 1022물질을 생산하는 PF 1022균주 (FERM BP-2671)를 들 수가 있다.
숙주로의 유전자 발현용의 재조합 벡터의 도입은, 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다. 도입방법으로서는, 예를 들면, 일렉트로포레이션법, 폴리에틸렌글리콜법, 아그로박테륨법, 리튬법 또는 염화칼슘법 등을 들 수가 있고, 숙주세포에 있어서 효율이 좋은 방법이 선택된다. PF 1022물질 생산균을 숙주로서 사용하는 경우, 바람직하기는 폴리에틸렌글리콜법이다.
본 발명에 의하면, 상기 형질전환체를 배양하는 공정을 포함하는 목적 단백질의 제조법이 제공된다.
형질전환체의 배양은 통상의 방법에 따라서, 배양조건 등을 적당히 선택해서 행할 수 있다. 배지로서는 관용의 성분, 예를 들면, 탄소원으로서는, 글루코스, 슈크로스, 셀룰로스, 물엿, 텍스트린, 전분, 글리세롤, 당밀, 동·식물유 등을 사용할 수 있다. 또, 질소원으로서는, 대두분, 소맥배아, 파마메디아, 콘·스팁·리카, 면실유, 뷔욘, 펩톤, 폴리펩톤, 말토엑스, 이스트엑스, 황산암모늄, 질산나트륨, 요소 등을 들 수가 있다. 기타 필요에 따라서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온을 생성할 수 있는 무기염류, 예를 들면, 염화칼륨, 탄산칼슘, 인산수소2칼륨, 황산마그네슘, 인산1칼륨, 황산아연, 황산망간, 황산구리를 첨가하는 것도 유효하다. 또, 필요에 따라서 티아민(티아민염산염 등) 등의 각종 비타민, 글루타민산(글루타민산나트륨 등), 아스파라긴(DL-아스파라긴 등) 등의 아민산, 뉴클레오티드 등의 미량영양소, 항생물질 등의 선발약제를 첨가할 수도 있다. 또한, 균의 발육을 돕고, 환상 뎁시펩티드의 생산을 촉진하는 유기물 및 무기물을 적당히 첨가할 수 있다.
배양방법은, 액체배지에서는 호기적 조건에서의 배양법, 진탕배양법, 통기교반배양법 또는 심부배양법(深部培養法)에 의해 행할 수 있다. 배지의 pH는, 예를들면, pH6 ~ pH8 정도이다. 배양온도는 통상의 조건, 예를 들면, 온도 14 ~ 40℃, 바람직하기는 26 ~ 37℃, 배양일수는 2 ~ 25일 정도의 조건으로 행할 수가 있다.
또, 본 발명에 의한 목적 단백질의 제조법에 있어서는, 형질전환된 세포의 배양물에서 목적하는 유전자 산물인 단백질을 얻을 수가 있다. 배양물에서 목적 단백질을 추출(마쇄처리, 가압파쇄 등)하고, 회수(여과, 원심분리 등)하고, 및 정제(염석법, 용매침전법 등)할 수가 있다. 또, 이들의 과정에 있어서, 필요에 따라서, 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF), 벤즈아미딘 또는 로이펩틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수도 있다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 상술하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: cDNA의 랜덤 시퀀스에 의한 고발현 유전자의 검색
PF 1022물질 생산균 중에서 고수율로 발현하고 있는 유전자를 검색하기 위하여, PF 1022물질 생산균 유래의 cDNA를 무작위로 클로닝하고, 그의 DNA서열의 비교를 행하여, 대량으로 발현하고 있는 유전자를 분리동정했다.
(1) PF 1022물질 생산균 유래 cDNA의 조제
PF 1022균주(FERM BP-2671)를 생산배지(글루코스 2.0%, 전분 5.0%, 소맥배아 0.8%, 대두박 1.3%, 육엑스 0.38%, 염화나트륨 0.13%, 및 탄산칼슘 0.15%; 살균전 pH7.0 ; WO97/00944호 실시예 4 참조)에서 26℃, 4일간 배양하고, 원심분리 (3000rpm, 10분)에 의해 균체를 회수했다. 이 것을 정제수로 세정하고, -80℃에서 동결한 후, 액체 질소 존재하에, 블랜더(일본정기사제 AM-3)로 분쇄했다. 이 것을변성액(4M 구아니딘티오시안산, 25mM 구연산3나트륨, 0.5% N-라우릴살코신산나트륨, 0.1M 머캅토에타놀)에 현탁시킨 후, 실온에서 5분간 교반한 후, 2M 아세트산나트륨(pH4.5)으로 중화하고, TE 포화 페놀을 첨가하고 더욱 교반했다. 여기에, 클로로포름-이소아밀알콜(24:1)을 첨가하고, 교반한 후, 원심분리에 의해 페놀로 변성한 균체성분을 분리했다. 상층(수층)을 회수하여, 이소프로파놀로 핵산을 침전화했다. 이 침전은 핵산농도 1㎎/㎖가 되도록 TE(10mM 트리스-염산 (pH8.0), 1mM EDTA)에 용해하고, 2.5M 염화리튬으로 침전화(5℃, 2시간)했다. 이 것을 원심분리에 의해 회수하고, 70% 에타놀로 세정한 후, TE에 다시 용해하여, 이 것을 전RNA획분으로 했다.
전RNA획분은 mRNA 정제킷트(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 사용해서, mRNA를 정제했다. 또한, 이 mRNA를 주형에 타임세바 cDNA 합성킷트(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 사용해서 cDNA를 합성했다.
(2) cDNA의 랜덤 시퀀스
실시예 1(1)과 같이 조제한 cDNA를,EcoRI 절단 후, 알카리 포스파타제 처리한 pUC18에 DNA 라이게이션 킷트(ligation kit) Ver.2(寶酒造社제)를 사용해서 연결했다. 이 것을 대장균 JM109주에 도입하고, 형질전환한 각종 클로니를 암피실린을 함유하는 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 이스트엑스, 1% 염화나트륨)에서 배양했다. 이들의 형질전환체로부터 플라스미드의 정제는 플렉시플렙킷트(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 사용했다.
상기와 같이 조제한 40종의 플라스미드를 ALF DNA 시퀀서Ⅱ(AmershamPharmacia Biotech사제)에 제공하여, 삽입단편의 DNA서열을 해독했다. 시퀀스 겔은 롱글렌쟈(FMC사제), 시퀀스 반응은 오토리드시퀀싱 킷트(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 사용했다.
그 결과, 10종의 클론이 동일한 DNA염기서열을 나타냈다. 거기서 클론화된 유전자를Abp1로 명명하고, 이 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 게놈 DNA에서 클로닝하는 것으로 했다.
(3) PF 1022물질 멍산균의 게놈 DNA의 단리
Pf 1022균주(FERM BP-2671)의 게놈 DNA의 단리는 (H. Horiuchi et. al., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988))에 기재된 방법에 따랐다. 구체적으로는, 우선 PF 1022물질 생산균(FERM BP-2671)을 종배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤 0.5%, 소맥배아 0.6%, 효소엑스 0.3%, 대두박 0.2% 및 탄산칼슘 0.2% ; 살균전 pH7.0 : WO97/00944호, 실시예 1 참조)에서 2일간 배양하고, 원심분리 (3500rpm, 10분)에 의해서 균체를 회수했다. 이어서, 얻어진 균체를 동결건조 후, TE에 현탁하고, 3% SDS용액 중에서, 60℃, 30분간 처리한 후, TE 포화 페놀추출에 의해 균체잔사를 제거했다. 추출액은 에타놀 침전화 후, 리보뉴클레아제A (Sigma사제) 및 프로테이나제K (和光純藥社제)처리하고, 또한, 12% 폴리에틸렌 글리콜 6000에 의해 핵산을 침전화시켰다. 이 것을 TE 포화 페놀추출, 에타놀 침전화를 행하고, 이 침전을 TE에 용해하여, 이 것을 게놈 DNA로 했다.
(4) PF 1022물질 생산균의 게놈 라이브라리의 제작
실시예 1(3)과 같이 조제한 PF 1022물질 생산균 유래 게놈 DNA를Sau3AI에의해 부분소화했다. 이 것을 파아지 벡터, λEMBL3 클로닝킷트(스트라다진사제)의BamHI 아암에 T4리가제(寶酒造社제 라이게이션 킷트 Ver.2)를 사용해서 연결시켰다. 이 것을 에타놀 침전 후, TE에 용해했다. 연결 혼합물의 전량을 기가팩Ⅲ플라스 팩케이징 킷트(스트라다진사제)를 사용해서, 대장균 LE392주에 감염시켜 파아지 플라크를 형성시켰다. 이 방법에 의해 얻어진 1.3 x 104개 (2.6 x 104PFU/㎖)의 파아지 라이브라리를 사용해서Abp1 유전자의 클로닝을 행했다.
(5) PF 1022물질 생산균 유래의 게놈 DNA에서Abp1유전자 클로닝 프로브는Abp1유전자의 번역영역을 PCR법에 의해 증폭하여 사용했다. 실시예 1(3)과 같이 조제한 게놈 DNA를 주형에, 8-73U 및 8-73R로 되는 합성 프라이머를 사용해서, 렛쓰고-PCR 킷트 (사와디 테크놀로지사제)에 따라 PCR를 행했다. PCR의 반응조건은, 94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 72℃ 90초간의 스텝을 25회 반복해서 증폭했다. 이하에 8-73U 및 8-73R의 DNA서열을 나타냈다.
8-73U: CTCAAACCAGGAACTCTTTC (서열번호 7)
8-73R: GACATGTGGAAACCACATTTTG (서열번호 8)
이와 같이해서 얻어진 PCR 산물은 ECL다이렉트 시스템(Amersham Pharmacia Biotech사제)을 사용해서, 표지화했다. 실시예 1(4)와 같이 작성한 파아지 플라크는 하이본드N+나일론 트란스피멘브란(Amersham Pharmacia Biotech사제)에 전사하고, 알카리 변성 후, 5배 농도 SSC (SSC: 15mM 구연산 3 나트륨, 150mM 염화나트륨)으로 세정하고, 건조시켜 DNA를 고정했다. 킷트에 기재된 방법에 따라서, 1시간의 프레하이브리다이제이션(42℃) 후, 먼저 표지화한 프로브를 첨가하고, 16시간(42℃) 하이브리다이제이션을 행했다. 프로브의 세정은 전술한 킷트에 기재된 방법에 따랐다. 프로브의 세정을 행한 나일론막은, 검출용액에 1분간 침지한 후, 메디칼 X선 필름(후지샤신 필름사(富士寫眞フイルム社)제)에 감광시켜, 1개의 양성 클론을 얻었다. 이 클론은 사잔해석의 결과, 적어도 6kb의HindⅢ 단편이 게놈 DNA의 제한효소단편 길이와 일치했다. 이HindⅢ 단편의 제한효소 지도를 도 1에 나타냈다.HindⅢ 단편은 pUC119에 서브클로닝하고(pRQHin/119), 이하의 실험에 제공했다.
실시예 2.Abp1 유전자의 프로모터 및 터미네이터의 DNA서열 결정
DNA서열 해석용 주형으로서 pRQHin/119를SalI 및SmaI로 소화하고, 동일한 제한효소로 소화해 놓은 pUC18에 연결하고, 이 것을 DNA서열 해석용 주형으로 했다. DNA서열 해석은 실시예 1(2)과 동일하게 행했다. 다음에, 실시예 1(2)에서 얻어진 cDNA의 염기서열과 비교해서,Abp1유전자의 프로모터 및 터미네이터 영역을 결정하고, 그의 DNA서열을 각각 서열표의 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타냈다.
실시예 3.Abp1유전자의 발현 제어 영역을 사용한 발현 벡터의 구축
pRQHin/119를 주형에Abp1유전자의 프로모터 영역 및 터미네이터 영역을 PCR법을 사용해서 증폭했다. 프로모터의 증폭은 ABP-Neco 및 ABP-Nbam, 한편, 터미네이터의 증폭은 ABP-Cbam 및 ABP-Cxba로 되는 프라이머를 사용하고, PCR 스파믹스하이피델리티 (라이프텍 오리엔탈사제)에 의해 PCR법을 행했다. 반응조건은, 94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 72℃ 90초간의 스텝을 25회 반복해서 증폭을 행했다. 이하에, ABP-Neco, ABP-Nbam, ABP-Cbam 및 ABP-Cxba의 DNA의 서열을 나타냈다.
ABP-Neco: GGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC (서열번호 3)
ABP-Nbam: GGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG (서열번호 4)
ABP-Cbam: GGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC (서열번호 5)
ABP-Cxba: GGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG (서열번호 6)
각 PCR산물은 마이크로스핀 S-400칼럼(Amersham Pharmacia Biotech사제)로 정제하고, 에타놀 침전화 후, 프로모터는EcoRI 및BamHI, 터미네이터는BamHI 및XbaI로 소화하고, 동일한 효소로 소화한 pBluescriptⅡKS+에 순차 연결했다. 이 것을XbaI로 소화하고, pMKD01(WO98/03667호)유래 데스토마이신내성 카세트를 삽입하여 pABPα를 구축했다.(도 2).
실시예 4. β-글루크로니다제 유전자를 사용한 발현 벡터의 능력 확인
레포타 유전자로서 사용한 β-글루크로니다제(GUS)유전자의 번역영역은 pLC-GUS (K. Yanai, et. al., Biosci. Biotech. Biochem., 60, 472-475, (1966))를BamHI로 절단해서 얻었다. 이 것을 미리BamHI 소화, 알카리포스파타제 처리해 놓은 pABPd에 연결하고,Abp1프로모터의 하류에GUS유전자가 삽입된 플라스미드, pABPd-G를 구축했다.
pABPd-G에 의한 PF 1022물질 생산균(FERM BP-2671)의 형질전환은 WO 97/00944호의 실시예 1에 기재되어 있는 방법에 따라서 행했다. 그 결과, 1㎍의 DNA당 약 3개의 형질전환체가 얻어졌다.
이와 같이해서 얻어진 형질전환체는 실시예 1(1)의 생산배지를 사용해서 액체배양하고, 원심분리에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체는 미니비드비타(바이오스펙 프로닥스사제)를 사용해서 세포를 파쇄했다. 이 것을 원심분리하고, 균체잔사를 제거하여, 상징액의 GUS활성을 측정했다. 활성측정은 (K. Yanai, et. al., Biosci. Biotech. Biochem., 60, 472-475, (1966))에 기재된 방법에 따랐다.
그 결과, 하기 표1에서 명백한 바와 같이, pABPd-G형질전환체만에 현저한 GUS활성이 확인되었다. 즉, 이 발현벡타인 pABPd는 PF 1022물질 생산균에 유효하게 기능하는 것이 확인되었다.
표 1: 형질전환체의 GUS 활성
발현벡터 GUS활성(A405/㎍단백질)
형질전환체 pABPd-G 756.9
형질전환체 pABPd-G 832.5
형질전환체 pABPd 0.0
숙주 - 0.0

Claims (18)

  1. 하기로부터 되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유해서 되는 프로모터 및 프로모터 활성을 갖는 그의 단편:
    (a) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열,
    (b) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖고, 또한 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열,
    (c) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한 프로모터 활성을 갖는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 개변체, 및
    (d) 스트린전트 조건하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 하이브리다이즈하고, 또한, 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열.
  2. 제 1항에 있어서, (b)가 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열인 프로모터.
  3. 제 1항에 있어서, (b)가 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열인 프로모터.
  4. 제 1항에 있어서, 무포자 불완전 균으로 분류되는 사상균에서 기능하는 프로모터.
  5. 제 1항에 있어서, 프로모터 활성을 갖는 단편이, 적어도 600염기쌍의 길이인 프로모터.
  6. 하기로부터 되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유해서 되는 터미네이터 및 터미네이터 활성을 갖는 그의 단편
    (e) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열,
    (f) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖고, 또한 터미네이터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열,
    (g) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한 터미네이터 활성을 갖는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 개변체, 및
    (h) 스트린전트 조건하에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 하이브리다이즈하고, 또한, 터미네이터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열.
  7. 제 6항에 있어서, (f)가 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열인 터미네이터.
  8. 제 6항에 있어서, (f)가 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열인 터미네이터.
  9. 제 6항에 있어서, 무포자 불완전 균으로 분류되는 사상균에서 기능하는 터미네이터.
  10. 제 6항에 있어서, 터미네이터 활성을 갖는 단편이 적어도 400염기쌍의 길이인 터미네이터.
  11. 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 기재된 프로모터 또는 그의 단편을 함유해서 되는 발현 벡터.
  12. 제 6항 내지 10항 중 어느 하나의 항에 기재된 터미네이터 또는 그의 단편을 함유해서 되는 발현 벡터.
  13. 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 기재된 프로모터 또는 그의 단편과 제 6항 내지 10항 중 어느 하나의 항에 기재된 터미네이터 또는 그의 단편을 함유해서 되는 발현 벡터.
  14. 제 13항에 있어서, 발현 벡터가 pABPd인 발현 벡터.
  15. 제 11항 내지 14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 목적 단백질을 코드하는 뉴클레오티드서열을 더욱 함유해서 되고, 또한 뉴클레오티드서열이 프로모터 및/또는터미네이터와 작동 가능하게 연결된 발현 벡터.
  16. 제 11항 내지 15항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주.
  17. 제 16항에 있어서, 숙주가 마이셀리아 스테릴리아(Mycelia sterilia)인 숙주.
  18. 제 16항 또는 17항에 기재된 숙주를 배양하고, 이어서 배양물에서 목적 단백질을 채취하는 것을 포함해서 되는 목적 단백질의 제조법.
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