JP2013524987A - 細胞間相互作用を強化させたナノパターンド医療デバイス - Google Patents

Abstract

【課題】薬剤送達を効率的に行うと同時に免疫反応及び異物反応を減少させる医療デバイスを提供する。
【解決手段】皮膚結合組織の成分と相互作用するためのナノトポグラフィベースの方法及びデバイスが提供される。本発明のデバイスは、ナノトポグラフィを形成するように表面上に作製された構造体を含む。サイズ及び／または形状の異なる構造体を含む複雑なパターンなど、構造体のランダムまたは非ランダムなパターンを作製することができる。細胞または組織への薬剤の送達にマイクロニードルを有効に利用することができる。作製されたナノトポグラフィと、細胞の細胞膜及び／または細胞外マトリックス成分との相互作用により、本発明のデバイスを用いて、細胞挙動を直接または間接的に変化させることができる。
【選択図】図３

Description

本発明は、ナノパターンド（ナノパターニングされた）医療デバイスに関する。

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年４月２８日出願の米国仮特許出願第６１／３２８，７２３号、２０１０年１１月８日出願の米国仮特許出願第６１／４１１，０７１号及び２０１１年１月２５日出願の米国仮特許出願第６１／４３５，９３９号に基づく優先権を主張する。上記特許出願は全て、全文を引用することを以て本明細書の一部となす。

薬剤（例えば薬物や治療薬）が活性状態で特定の種類の細胞または組織に有効濃度で提供される標的薬剤送達は、念願の目標である。この目標に到達するために、多くの困難を克服しなければならない。例えば、薬剤は最初に所望の標的に首尾よく送達されなければならない。現在用いられている主な送達方法には、経口送達及び注射が含まれる。しかし、注射は痛みを伴い、経口送達も注射も好適な定常状態の送達ではなく薬剤のバーストを起こしやすい。さらに、人体は、異物の流入を防止するための多くのシステム、例えば、消化管内での酵素分解、上皮を透過しての吸収を防止する構成成分、肝クリアランス並びに、免疫反応（免疫応答）及び異物反応を発達させてきた。

或る徐放期間にわたって活性薬剤を送達するための無痛経路を提供しようと、種々の経皮送達物質が開発されてきた。好結果を得るために、経皮方式は、異物の侵入を阻止するという基本的な機能を有する表皮を透過して薬剤を送達しなければならない。表皮の最外層である角質層は、コルネオデスモソーム（coreodesmosomes）によって結合されかつ脂質マトリックスに埋め込まれた幾重にも重なった層を構成する角質細胞と架橋ケラチン繊維とによって提供される構造的安定性を有しており、これらは全て優れたバリア機能を提供する。角質層の真下には顆粒層があり、その内部では、ケラチノサイト間にタイトジャンクションが形成されている。タイトジャンクションは、隣接する細胞膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質（例えば、クローディン、オクルディン、結合部接着分子）と複数のプラーク・タンパク質（例えば、ＺＯ−１、ＺＯ−２、ＺＯ−３、シングリン（cingulin）、シンプレキン（symplekin））とのネットワークを含むバリア構造である。角質層及び顆粒層の真下には、有棘層がある。有棘層にはランゲルハンス細胞が含まれており、ランゲルハンス細胞は、十分に機能する抗原提示細胞になることができかつ体内に侵入してきた病原体に対する免疫反応及び／または異物反応を誘導することができる樹状細胞である。

天然の境界（表皮）を通過することは困難であるにもかかわらず、活性薬剤の送達、例えば経皮送達の実現に進展があった。残念ながら、経皮送達方法は現在、親脂性が中程度で電荷を帯びていない低分子量薬剤の送達に限られている。天然の境界を通過するのに成功したとしても、送達される薬剤の活性レベルの維持、並びに異物反応及び免疫反応の回避に関する問題が尚も残る。

この送達経路は、活性薬剤の経皮送達を促進する追加的な方法の利用によって改善された。例えば、マイクロニードルデバイスは、皮膚内へまたは皮膚を透過して物質を輸送するのに有用であることが分かっている。一般に、マイクロニードルデバイスは、皮膚の角質層を貫通して下層に到達することができるニードルのアレイを含む。マイクロニードルデバイスの例は米国特許第６，３３４，８５６号明細書（特許文献１）及び米国特許第７，２２６，４３９号明細書（特許文献２）に記載されており、両文献は引用を以て本明細書の一部となす。しかし、上記したように、経皮送達は、角質層のバリアを越えて送達することのさらなる困難さを示している。具体的には、或る薬剤が標的領域に送達された時点で、薬剤を破壊したり免疫反応を引き起こしたりすることなく、適切な利用がなされる必要が尚もある。例えば、細胞内部を標的としている活性薬剤のエンドサイトーシスの促進は、困難さを呈している。

研究者たちは、そのような問題を克服するために、送達活動が生じる分子の世界の理解を得た。例えば、腸上皮におけるタイトジャンクションの開口にキトサンが有効であることが分かっており（例えば、非特許文献１、２を参照）、標識されたナノ粒子のエンドサイトーシスによる活性薬剤の送達について既に説明がなされている（例えば、米国特許第７，５６３，４５１号明細書（特許文献３）及び米国特許第７，５４４，７７０号明細書（特許文献４）を参照）。さらに、細胞に隣接する表面のナノトポグラフィは、両者間の接着特性に影響を及ぼすこと並びに、形態、運動性、細胞骨格構造、増殖及び分化を含む細胞挙動をもたらすことが分かっている（例えば、非特許文献３〜５を参照）。この最初の調査の延長上として、生体組織工学で用いるために支持基板のナノトポグラフィが既に調べられている（例えば、米国特許出願公開第２００８／００２６４６４号明細書（特許文献５）及び米国特許出願公開第２００８／０３１１１７２号明細書（特許文献６）を参照）。

米国特許第６，３３４，８５６号明細書 米国特許第７，２２６，４３９号明細書 米国特許第７，５６３，４５１号明細書 米国特許第７，５４４，７７０号明細書 米国特許出願公開第２００８／００２６４６４号明細書 米国特許出願公開第２００８／０３１１１７２号明細書 米国特許第６，９９５，３３６号明細書 米国特許第７，３７４，８６４号明細書 米国特許第７，１８９，４３５号明細書 米国特許第６，９２６，９５３号明細書 米国特許第３，７９７，４９４号明細書 米国特許第４，０３１，８９４号明細書 米国特許第４，２０１，２１１号明細書 米国特許第４，３７９，４５４号明細書 米国特許第４，４３６，７４１号明細書 米国特許第４，５８８，５８０号明細書 米国特許第４，６１５，６９９号明細書 米国特許第４，６６１，１０５号明細書 米国特許第４，６８１，５８４号明細書 米国特許第４，６９８，０６２号明細書 米国特許第４，７２５，２７２号明細書 米国特許第４，８３２，９５３号明細書 米国特許第４，９０８，０２７号明細書 米国特許第５，００４，６１０号明細書 米国特許第５，３１０，５５９号明細書 米国特許第５，３４２，６２３号明細書 米国特許第５，３４４，６５６号明細書 米国特許第５，３６４，６３０号明細書 米国特許第６，３７５，９７８号明細書 米国特許第７，２５０，０３７号明細書 米国特許第７，３１５，７５８号明細書 米国特許第７，４２９，２５８号明細書 米国特許第７，５８２，０６９号明細書 米国特許第７，６１１，４８１号明細書 米国特許第６，５６９，１４３号明細書

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上記では当分野における改善を説明しているが、さらなる改善の余地がある。例えば、活性薬剤の効率的に送達すると同時に薬剤送達デバイス及び送達される薬剤の両者への起こり得る免疫反応及び異物反応を減少させるデバイス及び方法があれば有益であろう。

本発明の一実施形態によれば、支持体から外向きに延出するマイクロニードルのアレイを含む医療デバイスが開示される。マイクロニードルのアレイのうちの少なくとも１本のマイクロニードルは、表面上に形成されかつ或る所定のパターンで配列された複数のナノ構造体を含む。

本発明の別の実施形態によれば、薬剤化合物を皮下位置に送達する方法が開示される。本方法は、表面上に形成されかつ或るパターンで配列された複数のナノ構造体を含みかつ前記薬剤化合物に流体連通しているマイクロニードルにより、角質層を穿刺するステップと、マイクロニードルを介して角質層を透過させて薬剤化合物を輸送するステップとを含む。

本発明のさらに別の実施形態では、医療デバイスであって、その表面に形成されかつ作製されたナノトポグラフィを画定する複数のナノサイズ構造体のパターンを含む医療デバイスが開示されている。医療デバイスを形成する方法であって、マイクロニードルの表面上にナノ構造体のパターンを作製するステップを含む方法も開示される。

当業者に向けられた本発明の全面的かつ実施可能な程度の開示（ベストモード開示を含む）については、より詳細には本明細書の残りの部分において、添付の図面に言及しながら説明する。

マイクロニードルデバイスの一実施形態を示す。 マイクロニードルデバイスの別の実施形態を示す。 細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と相互作用し得るナノトポグラフィを画定する表面を含むマイクロニードルの一実施形態を示す。 マイクロニードル表面上に形成され得る複雑なパターンの一実施形態を示す。 図４の複雑なパターンの複数の繰り返しを含むパターンを示す。 シェルピンスキーの三角形のフラクタルを示す。 ７Ａ〜７Ｄからなり、複雑なフラクタル及びフラクタル様のナノトポグラフィを示す。 マイクロニードル表面上に形成され得る別の複雑なパターンを示す。 （Ａ）〜（Ｃ）からなり、本明細書で説明されるナノサイズ構造体に使用され得る例示的な充填密度を示し、それぞれ、正方充填（Ａ）、六方充填（Ｂ）、円充填（Ｃ）の各デザインを示す。 細胞層のＴＥＥＲを測定する方法を説明する。 （Ａ）〜（Ｃ）からなり、本デバイスの作製の一実施形態に用いられ得るナノインプリント法を概略的に示す。 本発明のデバイスの一実施形態を概略的に示す。 薬剤化合物の送達前の経皮パッチの一実施形態の斜視図である。 図１３のパッチの正面図である。 リリース部材を部分的に除去した後の図１３のパッチの斜視図である。 図１３のパッチの正面図である。 リリース部材の除去後及び使用中の図１３の経皮パッチの斜視図である。 図１７のパッチの正面図である。 薬剤化合物の送達前の経皮パッチの別の実施形態の斜視図である。 図１９のパッチの正面図である。 リリース部材が部分的に剥がされた後の図１９のパッチの斜視図である。 図２１のパッチの正面図である。 リリース部材が完全に剥がされた後の図１９のパッチの斜視図である。 リリース部材の除去後及び使用中の図１９の経皮パッチの斜視図である。 本明細書に記載の幾つかのナノトポグラフィパターンのうちの１つを示す。 本明細書に記載の幾つかのナノトポグラフィパターンのうちの１つを示す。 本明細書に記載の幾つかのナノトポグラフィパターンのうちの１つを示す。 本明細書に記載の幾つかのナノトポグラフィパターンのうちの１つを示す。 本明細書に記載の幾つかのナノトポグラフィパターンのうちの１つを示す。 ナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 別のナノパターニングされた表面を含むフィルムのＳＥＭである。 本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の透過率に対する効果をグラフで示す。 本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の透過率に対する効果をグラフで示す。 本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の透過率に対する効果をグラフで示す。 本明細書に記載のパターニングされたポリスチレン表面上の細胞単層内外のＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色像である。 本明細書に記載のパターニングされたポリスチレン表面上の細胞単層内外のＩｇＧの経細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色像である。 本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層におけるＢＳＡの透過率に対する効果をグラフで示す。 本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層におけるＩｇＧの透過率に対する効果をグラフで示す。 本明細書に記載のパターニングされたポリプロピレン上の細胞単層内外のＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色像である。 本明細書に記載のパターニングされたポリプロピレン上の細胞単層内外のＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色像である。 （Ａ）〜（Ｆ）からなり、本明細書に記載のナノパターニングされた表面上で培養された細胞の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。 本明細書に記載のナノパターンを持つポリプロピレンまたはポリスチレンフィルムパターン上の細胞単層におけるエタネルセプトの透過率に対する効果を示す。 本明細書に記載のナノパターンを持つポリプロピレンまたはポリスチレンフィルムパターンに２時間接触させた後の細胞層のエタネルセプトの透過率の増加を示す。 表面層を含み、該表面層上にナノ構造体のパターンを画定するマイクロニードルのアレイである。 図４４のアレイのうちの１本のマイクロニードルである。 本明細書に記載のデバイスにより送達されたタンパク質治療薬のＰＫプロファイルをグラフで示す。 皮膚内外のタンパク質治療薬の経皮送達後の、表面上にナノトポグラフィを画定する経皮デバイスに接触していた皮膚の断面像である。 皮膚内外のタンパク質治療薬の経皮送達後の、表面上にナノトポグラフィのパターンが形成されていない経皮デバイスに接触していた皮膚の断面像である。 本明細書に記載のデバイスにより送達されたタンパク質治療薬の血清濃度をグラフで示す。

以下、本発明の様々な実施形態について詳細に説明し、１以上の実施例を以下に示す。各実施例は、説明のために与えられるものであり、本発明を限定するためのものではない。事実、本発明の様々な変更及び変形が、本発明の範囲及び要旨から逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明らかであろう。例えば、或る実施形態の一部として説明または図示された特徴を別の実施形態に適用することにより、さらなる別の実施形態を創出することができる。したがって、本発明は、このような変更形態及び変形形態を包含することを意図している。

医療デバイスであって、その表面に形成された構造体のパターンを含み、該構造体の少なくとも一部は、ナノメータスケールで形成されているような医療デバイスが開示されている。本明細書で使用される「形成される（fabricated）」なる用語は概して、本発明の医療デバイスの表面に存在するように特別に設計、加工、及び／または構成された構造を指し、デバイスの製造時に偶発的に形成されたにすぎない表面特徴と同じではない。つまり、マイクロニードルの表面には、ナノ構造体の所定のパターンが存在し得る。

本発明の医療デバイスは、金属、セラミック、半導体、有機体、ポリマー等、またはそれらの複合材料など、様々な材料から作製され得る。例として、医薬品グレードのステンレス鋼、チタン、ニッケル、鉄、金、スズ、クロム、銅、それらのまたは他の金属の合金、シリコン、二酸化ケイ素、またはポリマーが本発明のデバイスの作製に用いられ得る。一般的に、本発明のデバイスは、本明細書に記載のナノサイズの構造体のパターンを表面上に有することが可能な生体適合性材料から作製される。「生体適合性」なる用語は、一般的に、本発明のデバイスが適用される領域内の細胞または組織に対して実質的に悪影響を及ぼさない材料を指す。また、生体適合性材料は、本発明のデバイスが使用される生物の他の領域において、医療的に望ましくない影響を実質的に引き起こさないという意図もある。生体適合性材料は、合成材料または天然材料であり得る。生分解性材料でもある好適な生体適合性材料のいくつかの例には、乳酸やグリコール酸ポリラクチドなどのヒドロキシ酸のポリマー、ポリグリコリド、ポリラクチド−コ−グリコリド、ポリエチレングリコールを有するコポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（バレリアン酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）が含まれる。他の適切な材料には、これらに限定しないが、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレン酢酸ビニール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルが含まれ得る。本発明のデバイスは、同様に実質的に無孔性または有孔性であり得、デバイスの全体に渡って材料、形状、硬さなどが同一または互いに異なり得、かつ硬い固定または半固定形状を有し得る。

使用される物質（材料）にかかわらず、本発明の医療デバイスは、組織との相互作用のために、例えば細胞への生理活性薬剤の送達などに用いられ得る。例えば、組織を構造的に支持するため、組織の一部分または成分を除去するため、その他のために、組織または組織の１若しくは複数の細胞型に薬剤を送達するために本発明の医療デバイスを使用することができる。一実施形態においては、１若しくは複数の皮膚層を透過して物質を輸送するために本発明の医療デバイスを使用することができる。使用中は、本発明のデバイスは、周囲の生物学的成分と相互作用し、細胞間相互作用、エンドサイトーシス、炎症反応などに関連する細胞内及び／または細胞間シグナル伝達を調整または調節（すなわち改変）し得る。例えば、医療デバイス表面のナノトポグラフィと、その周囲の生物学的物質または構造との間の相互作用により、本発明のデバイスは、膜電位、膜タンパク質、及び／または細胞間結合（例えば、タイトジャンクション（密着結合）、ギャップ結合、及び／またはデスモソーム（接着斑））を調整及び／または調節することができる。異物反応や免疫反応を引き起こすことなく、本発明のデバイスを薬剤の経皮送達や物質の取出しに利用することができる。

一実施形態では、本発明のデバイスは、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイであるが、当然のことながら、本発明のデバイスはマイクロニードルに限定されるものではない。マイクロニードルは、皮膚、血液脳関門、粘膜組織、血管及びリンパ管、その他などの生物学的バリアを透過して物質を輸送するのに有用であり得る。図１は、一般的なマイクロニードル経皮デバイス１０を示す。図に示すように、デバイス１０は、個々のマイクロニードル１２のアレイを含む。各マイクロニードル１２は、個々のマイクロニードルが破損することなく、生物学的バリアの全体または一部を貫通することができるようなサイズ及び形状に形成されている。マイクロニードルは、図１のような中実であり得、多孔質であるかまたは中空部分を含み得る。マイクロニードルは、マイクロニードルの方向と平行に延在し、必要に応じて分岐するかまたはマイクロニードルの側部へ出る中空部分、例えばマイクロニードルの全体または一部に渡って延在する円形ボアを含み得る。例えば、図２は、マイクロニードル１４のアレイを示す。各マイクロニードル１４は、その側部に、薬剤の皮下位置への送達のために用いられるチャンネル１６を有している。例えば、チャンネル１６は、チャンネル１６を介した薬剤の通過を可能にする接続部を基材１５の開口部とチャンネル１６との間に形成するように、基材１５の開口部と少なくとも部分的に整合されている。

チャンネル１６（存在する場合）の寸法は、薬剤化合物の毛細管流動を誘起するように特に選択されることができる。毛細管流動は一般的に、流体のチャンネル壁部に対する接着力が液体分子間の凝集力よりも大きい場合に生じる。具体的には、毛細管圧は、チャンネル１６の断面寸法に反比例し、かつ、液体の表面張力に該液体のチャンネル形成材料との接触角度の余弦を乗じた値に正比例する。したがって、パッチにおける毛細管流動を促進するために、チャンネル１６の断面寸法（例えば、幅や直径など）を選択的に調節することができる。チャンネルの断面寸法を小さくすると、毛細管圧力は大きくなる。例えば、いくつかの実施形態では、チャンネルの断面寸法は約１〜１００μｍ、いくつかの実施形態では約５〜５０μｍ、いくつかの実施形態では約１０〜３０μｍである。チャンネルの断面寸法は、一定であってもよいし、またはチャンネル１６の長さに応じて変化してもよい。また、チャンネルの長さも、薬剤化合物の体積、流速、ドウェル時間に応じて変更可能である。例えば、チャンネルの長さは、約１０〜８００μｍ、いくつかの実施形態では約５０〜５００μｍ、いくつかの実施形態では約１００〜３００μｍであり得る。また、チャンネルの断面積も変更可能である。例えば、チャンネルの断面積は、約５０〜１０００μｍ^２、いくつかの実施形態では約１００〜５００μｍ^２、いくつかの実施形態では約１５０〜３５０μｍ^２であり得る。さらに、チャンネルのアスペクト比（長さ／断面寸法）は、約１〜５０、いくつかの実施形態では約５〜４０、いくつかの実施形態では約１０〜２０の範囲で有り得る。チャンネルの断面寸法（例えば、幅や直径など）及び／または長さがチャンネルの長さに応じて変化する場合、チャンネルのアスペクト比はチャンネルの断面寸法及び／または長さの平均から求めることができる。

図示したマイクロニードルの数は、例示目的にすぎないことを理解されたい。マイクロニードルアセンブリに使用されるマイクロニードルの実際の数は、例えば、約５００〜１００００本、いくつかの実施形態では約２０００〜８０００本、いくつかの実施形態では約４０００〜６０００本の範囲であり得る。

個々のマイクロニードルは、直線状またはテーパ状のシャフトを有し得る。一実施形態では、マイクロニードルの直径は、マイクロニードルの基部において最大であり、マイクロニードルの先端（遠位端）に向かって先細のテーパをなす。マイクロニードルは、直線状（非テーパ状）部分とテーパ状部分の両方を含むシャフトを有するように作製してもよい。

マイクロニードルは、断面が円形または非円形のシャフトを有するように形成してもよい。例えば、マイクロニードルの断面は、多角形（例えば、星形、正方形、三角形）、楕円形、または任意の他の形状であり得る。シャフトは、１若しくは複数のボア及び／またはチャンネルを有し得る。

個々のマイクロニードルのサイズは、所望する目標深さや、マイクロニードルが特定種類の組織において破損するのを避けるためのマイクロニードルの強度条件などに応じて最適化され得る。例えば、経皮マイクロニードルの断面寸法は、約１０ｎｍ〜１ｍｍ、または約１〜２００μｍ、または約１０〜１００μｍであり得る。中空ニードルの外径は約１０〜１００μｍで有り得、内径は約３〜８０μｍで有り得る。ニードルの先端は、一般的に、約１μｍ以下の半径を有し得る。

マイクロニードルの長さは、一般的に、所望用途に依存する。例えば、マイクロニードルは、約１μｍ〜１ｍｍであり得、例えば、約５００μｍ以下、または約１０〜５００μｍ、または約３０〜２００μｍであり得る。

マイクロニードルアレイに含まれるマイクロニードルは互いに全て同一である必要はない。マイクロニードルアレイは、長さ、外径、内径、断面形状、ナノ構造化表面、及び／またはマイクロニードル間の間隔が互いに異なる様々なマイクロニードルの組み合わせを含み得る。例えば、マイクロニードルは、長方形または正方形グリッドまたは同心円などの一様な態様で、互いに離間配置され得る。マイクロニードル間の間隔は、マイクロニードルの高さまたは幅や、マイクロニードルを介して送達する薬剤の量または種類などの様々な因子に依存し得る。マイクロニードルの様々な配置を有用であるが、マイクロニードル間の「先端間」間隔が約５０μｍ以上、いくつかの実施形態では約１００〜８００μｍ、いくつかの実施形態では約２００〜６００μｍとなる配置が特に有用である。

図１を再び参照すると、マイクロニードル１２は、基板２０上に、該基板に対して垂直にまたは所定の角度をなして保持される（すなわち、マイクロニードルは基板に取り付けられるか、または基板と一体的に形成される）ことができる。一実施形態では、マイクロニードルは、基板に対して垂直に配向されており、かつ基板の単位面積あたり高密度で設けられている。なお、マイクロニードルアレイは、配向方向、高さ、材料、または他のパラメータが互いに異なる様々なマイクロニードルの組み合わせを含み得る。基板２０は、金属、セラミック、プラスチックまたは他の材料からなる硬いかまたは柔軟なシートから作製され得る。基板２０の厚さは、デバイス１０の要求を満たすために様々であり得、例えば、約１０００μｍ以下、いくつかの実施形態では約１〜５００μｍ、いくつかの実施形態では約１０〜２００μｍであり得る。

本発明によれば、マイクロニードル表面上に、ナノトポグラフィをランダムまたは規則的なパターンを画定し得る。図３は、２つの代表的なマイクロニードル２２の端部を概略的に示す。マイクロニードル２２は、マイクロニードル２２を介して薬剤を送達するために用いられる中央ボア２４を画定する。マイクロニードル２２は、その表面２５にナノトポグラフィ２６を画定し得る。この特定の実施形態では、ナノトポグラフィ２６は、マイクロニードル２２の表面２５上にランダムなパターンを画定する。

マイクロニードルの表面に形成された複数の構造体は、互いに同一であるか、またはサイズ、形状またはそれらの組み合わせが互いに異なり得る。構造体の所定のパターンは、長さ、直径、断面形状及び／または構造体間の間隔が互いに異なる様々な構造体の組み合わせを含み得る。例えば、構造体は、長方形または正方形グリッドまたは同心円などの一様な態様で、互いに離間配置され得る。一実施形態では、構造体はサイズ及び／または形状が互いに異なり、それにより複雑なナノトポグラフィが形成され得る。例えば、複雑なナノトポグラフィは、フラクタルまたはフラクタル様形状を画定し得る。

本明細書で用いられる「フラクタル」なる用語は、一般的に、最大スケール（尺度）と最小スケールとの間の全ての測定スケールで或る断片形状を有する幾何学的または物理的構造体であって、該構造体の特定の数学的または物理的性質、すなわち該構造体の次元が、空間次元よりも大きくなるようなものを指す。前記数学的または物理的性質には、例えば、カーブの周長または多孔性媒体における流速が含まれ得る。フラクタルの幾何学的形状は、各々が自己相似性を画定する複数の部分に分割され得る。加えて、フラクタルは、再帰的定義（recursive definition）を有し、任意の小さいスケールにおいて微細構造を含む。

本明細書で用いられる「フラクタル様」なる用語は、一般的に、フラクタルの種々の特徴のうちの１若しくは複数を有するが、全ては有していない幾何学的または物理的構造を指す。例えば、フラクタル様構造は、自己相似的である複数の部分を有する幾何学的形状を含み得るが、任意の小さいスケールにおいて微細構造は含まない。別の例では、フラクタル様の幾何学的形状または物理的構造体は、パターンの幾何学的形状を再帰的に繰り返す際にスケールを拡大または縮小するが、フラクタルのように該構造体のスケールを均等に縮小（または拡大）しない。フラクタル様パターンは、フラクタルよりもより単純であり得る。例えば、フラクタル様パターンは、規則的であり、従来のユークリッド幾何学言語で比較的容易に記述され得るが、フラクタルはそうではない。

複雑なナノトポグラフィを画定するマイクロニードルの表面は、互いに同じ全体形状を有する構造体（例えば、ピラー）を含むことができ、該ピラーは互いに異なるスケール寸法で形成され得る（例えば、ナノスケールのピラーと、マイクロスケールのピラーが形成され得る）。別の実施形態では、マイクロニードルはその表面に、スケールサイズ及び形状がともに異なるか、または同一のナノサイズスケールに形成されるが形状だけが異なる構造体を含み得る。加えて、構造体は、規則的な配列またはランダムな分布で形成され得る。通常、構造体の少なくとも一部は、例えば約５００ｎｍ以下、例えば、４００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の断面寸法を画定するナノサイズスケールで形成されたナノ構造体であり得る。ナノ構造体の断面寸法は、通常、約５ｎｍ以上、例えば、約１０ｎｍ以上、または約２０ｎｍ以上であり得る。例えば、ナノ構造体は、約５〜５００ｎｍ、約２０〜４００ｎｍ、または約１００〜３００ｎｍの断面寸法を画定し得る。ナノ構造体の断面寸法が長さに応じて異なる場合、断面寸法は、ナノ構造体の基部から先端までの間の平均として、あるいは構造体の最大断面寸法（例えば、円錐状ナノ構造体の基部の断面寸法）として求めることができる。ナノ構造体の断面寸法がナノ構造体の高さに応じて異なる場合、該断面寸法は、ナノ構造体の基部から先端までの間の平均として、あるいは構造体の最大断面寸法（例えば、円錐状ナノ構造体の基部の断面寸法）として求めることができる。

図４は、表面上に形成され得る複雑なナノトポグラフィの一実施形態である。この特定のパターンは、中央の大型ピラー１００と、それを取り囲むピラー１０２、１０４とを含み、ピラー１０２、１０４は、中央大型ピラー１００よりも小型であり、規則的なパターンで配置されている。図に示すように、このパターンは、各々互いに同じ全体形状を有するが、水平寸法が互いに異なる、複数のピラーの繰り返しを含む。この特定の複雑なパターンは、連続的に再帰的に繰り返す際にスケールの同一変更を含まないフラクタル様パターンの一例である。例えば、ピラー１０２は、マイクロ構造体（微細構造体）である大型ピラー１００の約３分の１の水平寸法を画定する第１のナノ構造体であるが、ピラー１０４は、ピラー１０２の約半分の水平寸法を画定する第２のナノ構造体である。

サイズが互いに異なる複数の構造体を含むパターンは、より大きい断面寸法を有するより大型の構造体（例えば、約５００ｎｍ以上の断面寸法を有するマイクロ構造体）と、より小型の構造体とを含み得る。一実施形態では、複雑なナノトポグラフィのマイクロ構造体は、約５００ｎｍ〜１０μｍ、約６００ｎｍ〜１．５μｍ、または約６５０ｎｍ〜１．２μｍの断面寸法を有し得る。例えば、図４の複雑なナノトポグラフィは、約１．２μｍの断面寸法を有するマイクロサイズのピラー１００を含む。

或るパターンが、例えば約５００ｎｍ以上の断面寸法（構造体の平均断面寸法または最大断面寸法として測定される）を有する１若しくは複数の大きなマイクロ構造体を含む場合、複雑なナノトポグラフィはまた、サイズや形状などが互いに異なる第１のナノ構造体及び第２のナノ構造体などのナノ構造体を含むことになる。例えば、図４の複雑なナノトポグラフィのピラー１０２は約４００ｎｍの断面寸法を有し、ピラー１０４は約２００ｎｍの断面寸法を有する。

ナノトポグラフィは、任意の数の様々な要素から形成され得る。例えば、要素のパターンは、２つの互いに異なる要素、３つの互いに異なる要素（図４に示した例）、４つの互いに異なる要素、あるいはそれ以上の互いに異なる要素を含み得る。互いに異なる各要素の繰り返しの相対的比率もまた異なり得る。一実施形態では、或るパターンの最も小さい要素は、より大きい要素よりも多数存在することになる。例えば、図４のパターンでは、１個のピラー１０２につき８個のピラー１０４が設けられており、中央大型ピラー１００につき８個のピラー１０２が設けられている。要素のサイズが大きくなると、一般的に、ナノトポグラフィにおける該要素の繰り返しはより少なくなる。例として、第１の要素の断面寸法が、より大きな第２の要素の断面寸法の約０．５（例えば、０．３〜０．７）倍である場合、トポグラフィ内に、第１の要素は第２の要素の約５倍以上の数で存在し得る。第１の要素の断面寸法が、より大きな第２の要素の断面寸法の約０．２５（または約０．１５〜０．３）倍である場合、トポグラフィ内に、第１の要素は第２の要素の約１０倍以上の数で存在し得る。

個々の要素間の間隔も様々であり得る。例えば、個々の構造体間の中心間距離は、約５０ｎｍ〜１μｍ、例えば約１００ｎｍ〜５００ｎｍであり得る。例えば、構造体間の中心間距離は、ナノサイズスケールであり得る。例えば、ナノサイズ構造の間隔について考えると、構造体間の中心間距離は約５００ｎｍ以下であり得る。しかし、このことはトポグラフィの必須要件ではなく、個々の構造体は互いにもっと離れていてもよい。構造体間の中心間距離は、構造体のサイズに応じて異なり得る。例えば、２つの互いに隣接する構造体の平均断面寸法の、該２つの構造体の中心間距離に対する比率は、約１：１（例えば接触状態）〜１：４、約１：１．５〜１：３．５、または約１：２〜１：３であり得る。例えば、中心間距離は、２つの互いに隣接する構造体の平均断面寸法の約２倍であり得る。一実施形態では、各々約２００ｎｍの断面寸法を有する２つの互いに隣接する構造体は、約４００ｎｍの中心間距離を有し得る。したがって、この場合、平均直径の中心間距離に対する比率は１：２である。

構造体間の間隔は、同一、すなわち等距離にしてもよいし、または、パターン内で構造体によって異なるようにしてもよい。例えば、或るパターンにおいて最も小さい構造体を第１の距離だけ互いに離間させ、該パターンの最も小さい構造体とより大きい構造体との間の距離、または２つのより大きい構造体間の距離を第１の距離と同一にしてもよいし、第１の距離と異ならせてもよい。

例えば、図４のパターンでは、最も小さい構造体１０４同士の中心間距離は約２００ｎｍである。より大きいピラー１０２とそれを取り囲むピラー１０４との間の中心間距離は、約１００ｎｍ以下である。最大ピラー１００とそれを取り囲む各ピラー１０４との間の中心間距離は、最も小さいピラー１０４同士の中心間距離よりも小さく、約１００ｎｍである。当然ながら、これは必須ではなく、全ての構造体は互いに対して等距離で離間配置されていてもよいし、または任意の互いに異なる距離で離間配置されていてもよい。一実施形態では、別個の構造体が、例えば後述するように互いに積層するように、互いに対して接触して配置されるか、または、互いに隣接して接触するように配置され得る。

或るトポグラフィの構造体は全て同じ高さ、概ね約１０ｎｍ〜１μｍで形成され得る。しかし、これは必須ではなく、或るパターンの個々の構造体は、一次元、二次元、三次元において様々なサイズであり得る。一実施形態では、或るトポグラフィの構造体の一部または全体は、約２０μｍ以下、約１０μｍ以下、または約１μｍ以下、例えば、７５０ｎｍ以下、６８０ｎｍ以下、または５００ｎｍ以下の高さを有し得る。例えば、構造体は、約５０ｎｍ〜２０μｍ、または約１００ｎｍ〜７００ｎｍの高さを有することができる。例えば、ナノ構造体またはマイクロ構造体は、約２０〜５００ｎｍ、約３０〜３００ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍの高さを有することができる。なお、これらの構造体は、断面寸法においてナノサイズであり得、マイクロサイズスケール（例えば５００ｎｍ以上）の高さを有し得ることを理解されたい。マイクロサイズの構造体は、同一のパターンのナノサイズ構造体と互いに同一または異なる高さを有することができる。例えば、マイクロサイズ構造体は、別の実施形態では、約５００ｎｍ〜２０μｍ、または約１〜１０μｍの高さを有することができる。マイクロサイズ構造体は、約５００ｎｍ以上のマイクロスケールの断面寸法を有することもでき、約５００ｎｍ以下のナノサイズ寸法の高さを有し得る。

構造体のアスペクト比（構造体の高さの断面寸法に対する比）は、約０．１５〜３０、約０．２〜５、約０．５〜３．５、または約１〜２．５であり得る。例えば、ナノ構造体は、これらの範囲内に入るアスペクト比を有し得る。

本発明のデバイスの表面は、図４に示すような１種類のパターン、または、互いに同一または異なるパターンの複数の繰り返しを含み得る。例えば、図５は、表面全体に渡って図４のパターンの複数の繰り返しを含む表面パターンを示す。

マイクロニードルの表面にナノトポグラフィを形成すると、マイクロニードルの体積を増大させることなく、マイクロニードルの表面積を増大させることができる。体積に対する表面積の比率（表面積対体積比）を高めると、マイクロニードルの表面とその周囲の生体物質との間の相互作用を向上させることができると考えられる。例えば、表面積対体積比を高めると、ナノトポグラフィとその周囲のタンパク質（例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質及び／または原形質膜タンパク質）との間の物理的相互作用を向上させると考えられる。

一般的に、本発明のデバイスの表面積対体積比は、約１０，０００ｃｍ^−１以上、約１５０，０００ｃｍ^−１以上、または約７５０，０００ｃｍ^−１以上であり得る。表面積対体積比は、当該技術分野で公知の任意の標準的な手法に従って求めることができる。例えば、マイクロニードル表面の比表面積は、吸着ガスとして窒素を使用した物理的気体吸着法（ＢＥＴ法）によって求めることができる。このことは当該技術分野では公知であり、非特許文献６に記載されている。非特許文献６は、引用を以て本明細書の一部となす。ＢＥＴ面積は、約５ｍ^２／ｇ以下であり、一実施形態では、例えば、約０．１〜４．５ｍ^２／ｇ、または約０．５〜３．５ｍ^２／ｇであり得る。また、表面積及び体積の値は、マイクロニードル表面を形成するのに使用したモールドの形状から、標準的な幾何学的計算法に従って推測することもできる。例えば、体積は、各パターン要素の体積の計算値と、所定領域（例えば、１本のマイクロニードルの表面）におけるパターン要素の総数とから推定することができる。例えば、体積は、各パターン要素の体積の計算値と、所定領域（例えば、１本のマイクロニードルの表面全体）におけるパターン要素の総数とから推定することができる。

表面において複雑なパターンナノトポグラフィを画定するデバイスの場合は、ナノトポグラフィは、前記パターンのフラクタル次元の測定により特徴付けられ得る。フラクタル次元は、再帰的な繰り返しを続けてスケールがだんだん小さくなるに従ってフラクタルがどのくらい完全に空間を満たすかを示す指標となる統計的量である。２次元構造のフラクタル次元は、次式で表すことができる。

ここで、Ｎ（ｅ）は、物体を各空間方向に１／ｅだけ縮小したときに物体全体を覆うのに必要な自己相似的な構造体の数である。

例えば、シェルピンスキーの三角形（正三角形の各辺の中点を互いに結んでできた三角形を切り取る）として知られている図６に示す２次元フラクタルを考える場合、フラクタル次元は以下のように計算される。

したがって、シェルピンスキーの三角形のフラクタルは、最初の２次元の正三角形よりも線長が増加する。加えて、このような線長の増加は、面積の増加を伴わない。

図４に示したパターンのフラクタル次元は、約１．８４である。一実施形態では、本発明のデバイスの表面のナノトポグラフィは、約１以上、例えば、約１．２〜５、約１．５〜３、または約１．５〜２．５のフラクタル次元を示し得る。

図７の（Ａ）及び（Ｂ）は、複雑なナノトポグラフィの別の例の拡大図である。図７の（Ａ）及び（Ｂ）のナノトポグラフィは、基板上に位置する繊維様ピラー７０のアレイを含む。各ピラーの遠位端において、ピラーは複数のより小さい繊維６０に分かれる。このようなより小さい繊維６０の遠位端において、各繊維はまたも複数の細繊維に分かれる（図７の（Ａ）及び（Ｂ）では見えない）。表面上に形成された約１以上のアスペクト比を有する構造体は、図７の（Ａ）及び（Ｂ）に示した構造体のように柔軟であってもよいし、硬くてもよい。

図７の（Ｃ）及び（Ｄ）は、複雑なナノトポグラフィの別の例を示す。この実施形態では、円形の中空貫通部７１を各々有する複数のピラー７２が基板上に形成されている。各中空ピラー７２の遠位端には、複数のより小型のピラー６２が形成されている。図に示すように、図７の（Ｃ）及び（Ｄ）のピラーは、硬さ及び直立配向を維持している。加えて、また従来のパターンとは対照的に、この実施形態の小型ピラー６２は、より大型のピラー７２とは形状が異なる。具体的には、小型ピラー６２は、中空ではなく中実である。このように、互いに異なるスケールに形成された構造体を含むナノトポグラフィは、全ての構造体が同じ形状に形成されている必要はなく、スケールが互いに異なる構造体は、サイズ及び形状の両方において互いに異なっていてもよい。

図８は、本発明のデバイスの表面に形成され得るナノサイズ構造体を含む別のパターンを示す。図に示すように、この実施形態では、個々のパターン構造体は、同一の全体サイズで形成され得るが、配向及び形状は互いに異なり得る。

上記した方法に加えて、またはその代わりに、或る表面を、表面粗さ、弾性率、表面エネルギーなどを含むがこれに限定されない他の方法によって特徴付けすることができる。

表面粗さを求めるための方法は、当該技術分野では周知である。例えば、或る材料の表面粗さを求めるために、標準的技法に従って原子間力顕微鏡法を接触モードまたは非接触モードで用いることができる。マイクロニードルを特徴付けするために用いることができる表面粗さには、平均粗さ（ＲＡ）、二乗平均平方根粗さ、歪度及び／または尖度が含まれ得る。一般的に、表面上に作製されたナノトポグラフィを画定する該表面の平均表面粗さ（表面の算術平均高さは、ISO 25178シリーズで規定された粗さパラメータである）は、約２００ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、または約５０ｎｍ以下であり得る。例えば、平均表面粗さは、約１０〜２００ｎｍ、または約５０〜１９０ｎｍであり得る。

本発明のデバイスは、ナノパターニングされた表面の弾性率によって、例えば、或る表面にナノトポグラフィに追加した場合の弾性率の変化によって、特徴付けることができる。一般的に、ナノトポグラフィを形成する複数の構造体をマイクロニードルの表面に追加すると、材料の弾性率を減少させることができるが、それは、ナノサイズ構造体を表面に追加すると、該表面の連続性の減少及びそれに関連する表面積の変化をもたらすことになるためである。表面にナノトポグラフィを有するマイクロニードルは、同じ材料から同じ方法によって形成された、表面にナノトポグラフィパターンを有していないこと以外は同様のマイクロニードルと比べると、約３５〜９９％、例えば約５０〜９９％、または約７５〜８０％の弾性率の低下を示し得る。例として、ナノパターニングされた表面の有効圧縮弾性率は、約５０ＭＰａ以下、または約２０ＭＰａ以下であり得る。一実施形態では、有効圧縮弾性率は、約０．２〜５０ＭＰａ、約５〜３５ＭＰａ、または約１０〜２０ＭＰａであり得る。有効剪断率は、約３２０ＭＰａ以下、または約２２０ＭＰａ以下であり得る。例えば、有効剪断率は、一実施形態では、約４〜３２０ＭＰａ、または約５０〜２５０ＭＰａ以下であり得る。

また、表面にナノトポグラフィを有するマイクロニードルは、表面にナノトポグラフィのパターンが画定されていない同様のマイクロニードルと比べると、表面エネルギーの増加を示し得る。例えば、表面にナノトポグラフィを有するマイクロニードルは、同じ材料から同じ方法によって形成された、表面にナノトポグラフィパターンを有していないこと以外は同様のマイクロニードルと比べると、表面エネルギーの増加を示し得る。例えば、ナノトポグラフィを有する表面の水接触角は、約８０°以上、約９０°以上、約１００°以上、または約１１０°以上であり得る。例えば、表面の水接触角は、一実施形態では、約８０〜１５０°、約９０〜１３０°、または約１００〜１２０°であり得る。

本発明のデバイスの表面にナノ構造体を形成する場合、構造体の充填密度は最大限にされ得る。例えば、基板上に要素をパターニングするのに、正方充填（図９の（Ａ））、六方充填（図９の（Ｂ））、またはそれらの変形例が用いられ得る。断面積がＡ、ＢまたはＣのサイズが互いに異なる複数の要素をマイクロニードル上に互いに隣接するように配置するパターンをデザインする場合は、図９の（Ｃ）に示すような円充填が用いられ得る。当然ながら、様々な充填密度及びそれに関連する表面特徴の改変の決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。

使用中、マイクロニードルデバイスは、皮膚結合組織の１若しくは複数の成分と相互作用し得る。結合組織は、他の種類の組織、すなわち、上皮、筋肉及び神経組織を支持するフレームワークである。結合組織は、一般的に、ＥＣＭ内に保持された個々の細胞を含む。ＥＣＭは、基質（例えば、骨のミネラル、血漿など）と、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどを含む線維成分とを含む。結合組織は、線維成分がなく基質が流体である血液から、皮膚に見られるような、細胞外線維（例えば、コラーゲン）を比較的多く含み、他の結合組織成分をほとんど含まないであろう高密度結合組織まで、広く多岐にわたる構造を想定し得る。皮膚には多くの特殊化した種類の結合組織があり、その一例は弾性組織である。弾性組織の主成分は弾性線維であり、コラーゲンやプロテオグリカンなど他の種類の結合組織によく見られる要素の量はごく僅かであり得る。

マイクロニードル表面のナノトポグラフィは、マイクロニードルと送達領域の皮膚結合組織の生物学的成分との相互作用を向上させることができる。例えば、経皮デバイスのマイクロニードルは、ＥＣＭタンパク質及び／または個々の細胞、例えば、ケラチノサイト、有棘層のランゲルハンス細胞または基底層の未分化基底細胞などと直接相互作用し得る。真皮の成分、例えば毛細血管床の血球にアクセスするために、経皮デバイス上のニードルを長くしたものを用いることができる。経皮デバイスと該デバイスが適用される場所またはその近隣（局所）の生物学的成分との相互作用を向上させることで、周囲組織は異物反応を示しにくくなり得るので、それにより、局所炎症を減少させ、活性薬剤の送達を向上させることができる。一実施形態では、本発明のデバイスは、薬剤送達において積極的な役割を果たすことができる。例えば、ナノトポグラフィと周囲の生物学的成分との相互作用は、例えば顆粒層におけるタイトジャンクションの開口を介しての、高分子量物質の送達を促進することができる。

如何なる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ナノトポグラフィは、２つの機序を通じて生物学的成分との相互作用の向上を促進すると考えられている。１つの機序によれば、ナノトポグラフィは、マイクロニードルが或る送達部位においてＥＣＭを模倣する能力を促進することができる。例えば、マイクロニードルのナノトポグラフィは、或る送達部位において基底膜の１若しくは複数の成分を模倣することができる。使用中に、細胞は、マイクロニードルのナノトポグラフィに接触し、ナノトポグラフィが模倣する天然の構造体（例えば、基底膜タンパク質）との通常の接触に同様に反応し得る。従って、本発明のデバイスは、細胞と直接相互作用することにより、細胞挙動、例えば、細胞シグナル伝達を調整または調節（すなわち改変）することができ、それによって、天然バリアを透過しての薬剤の送達を向上させるとともに、デバイスによって送達される薬剤のエンドサイトーシスを向上させる。

第２の機序によれば、ナノトポグラフィは、局所の結合組織の非細胞生物学的成分（ＥＣＭタンパク質など）と相互作用し得る。例えば、ＥＣＭタンパク質は、マイクロニードルの表面に吸着または脱着され得る。ＥＣＭタンパク質の吸着／脱着は、局所環境の化学的性質を変えることができ、結果として細胞挙動の変化をもたらし得る。この第２の機序によれば、本発明のデバイスは、細胞の挙動に間接的に影響を及ぼすことができる。例えば、デバイスの表面における１若しくは複数のＥＣＭタンパク質の吸着は、細胞内及び／または細胞間シグナル伝達を間接的に調整または調節することができる。

周囲の生物学的成分との相互作用を向上させることにより、本発明のデバイスは、送達薬の取り込みを向上させ得る。例えば、ナノトポグラフィのパターンを有するデバイスを使用することにより、タンパク質治療薬の薬物動態（ＰＫ）プロファイル（すなわち、上皮膜を介した吸収プロファイル）を向上させることができる。例として、１００Ｄａを超える分子量、例えば、約２０〜２００ｋＤａ、または約１５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質治療薬を、表面上にナノトポグラフィが画定されたパッチを介して、経皮的に送達することができる。一実施形態では、パッチを用いて、例えば、約２００〜５００μＬ、または約２５０μＬの単一用量のタンパク質治療薬を送達することができる。皮膚への経皮パッチの貼付後、該パッチを貼り付けられた者（レシピエント）は、投与から約１〜４時間以内に、パッチ面積の１ｃｍ^２あたり、治療薬１ｍｌあたり、最大で約５００〜１０００ｎｇ、例えば約７５０〜８５０ｎｇの血清濃度の急激な上昇を反映したＰＫプロファイルを示し得る。この血清濃度の初期の急激な上昇は、皮膚バリアを透過して治療薬が急激に取り込まれたことを反映するものであり、その後、約２０〜３０時間（例えば約２４時間）で、治療薬の血清濃度は無視できるほどの濃度までゆるやかに下降し得る。さらに、送達された治療薬の急速な取り込みは、炎症をほとんどまたは全く伴わずに行うことができる。特に、経皮バリアを透過しての薬剤の送達を向上させることに加えて、本発明のデバイスは、異物反応及び他の望ましくない反応（例えば炎症反応）を抑えることもできる。従来公知のデバイス、例えば、皮膚接触面にナノトポグラフィが画定されていない経皮パッチを使用すると、局所的な炎症または刺激が生じることが多い。

ナノトポグラフィの構造体は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの、１若しくは複数のＥＣＭタンパク質を模倣しかつ／またはＥＣＭタンパク質と相互作用することができる。これにより、細胞膜タンパク質を、立体構造、自由エネルギー、局所密度などの１若しくは複数の特性に関して、直接または間接的に改変することができる。例示的な細胞膜タンパク質には、これらに限定しないが、インテグリン、ビンキュリンまたは他の接着斑タンパク質、クラスリン、Ｇタンパク質共役受容体などの膜受容体などが含まれる。この改変は、細胞表面で、及び／または細胞骨格を通して下流効果によって細胞内で、及び細胞質内で、変化を誘発し得る。

本発明のデバイスは、表面におけるタンパク質吸着のおかげで直接または間接的に局所環境をより良好に模倣することができるので、デバイスを囲繞する局所領域内の細胞は、抗炎症性微小環境を維持することができる。それゆえ、本発明のデバイスを用いて、異物反応または免疫反応を伴わずに、物質を送達することができる。

マイクロニードルの存在によって直接または間接的に影響され得る具体的な細胞型には周囲皮膚結合組織の細胞が含まれる。例えば、ナノトポグラフィを画定するマイクロニードル表面を、異物反応または免疫反応誘発することなく、ランゲルハンス細胞、マクロファージ（大食細胞）及び／またはＴ細胞を含む或る領域に位置させることができる。ランゲルハンス細胞は、抗原を取り込んで処理することで、完全に機能的な抗原提示細胞になることができる。マクロファージ及びＴ細胞は、免疫反応の開始及び維持における中心的役割を果たす。例えばランゲルハンス細胞を介して病理学的または免疫原性の刺激によって活性化されると、Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ及び他の炎症性サイトカインを放出し得る。マクロファージは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、一酸化窒素、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなどを含む多くの炎症メディエータを放出することによって、炎症反応を引き起こす。放出されたサイトカインは他の免疫細胞を活性化し、一部のサイトカインは独立した細胞毒性薬として作用することもできる。マクロファージ及びＴ細胞由来の炎症メディエータが過剰に放出されると、正常細胞及び周囲組織を傷害することがある。

如何なる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ナノパターニングされた基板との相互作用を介して、個々の細胞において特定のケモカインを含む特定のサイトカイン（例えば、特定のケモカイン）の生成が上方制御または下方制御され得ると考えられる。発現プロファイルをそのように改変することにより、薬剤送達デバイスに対する細胞応答を最小限に抑えることができる。例えば、１若しくは複数の抗炎症性サイトカインの上方制御及び／または１若しくは複数の炎症性サイトカインの下方制御によって、炎症反応及び／または異物反応を最小限に抑えることができる。多くのサイトカインが、炎症への影響に照らして特徴付けられている。発現細胞がナノトポグラフィを有するデバイスの存在の影響を受けたときに発現プロファイルを改変できることが明らかになっている炎症性サイトカインには、これらに限定しないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ１６、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＩ、ＶＥＧＦなどが含まれ得る。発現プロファイルを改変できることが明らかになっている抗炎症性サイトカインには、これらに限定しないが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などが含まれ得る。発現プロファイルを改変できることが明らかになっている、異物反応に関連するサイトカインには、これらに限定しないが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などが含まれ得る。

一酸化窒素は、炎症反応のメディエータ及びレギュレータとして認識されている。局所環境に影響を与えることによって、マイクロニードルは、周囲細胞からの一酸化窒素の放出を制限することができる。このことは有益であろう。というのも、一酸化窒素は、送達される活性薬剤に向けて毒質を持つことができ、患者（被験体）の自身の組織に悪影響を及ぼすこともあるからである（非特許文献７）。一酸化窒素は、分子酸素及びスーパーオキシドアニオンと相互作用することにより、様々な細胞機能を変更し得る活性酸素種（ＲＯＳ）を産生することもできる。これらの一酸化窒素の間接的効果は、炎症において重要な役割を果たす；ここで、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）によって一酸化窒素を大量に産生することができ、活性化された炎症細胞によってＲＯＳを合成することができる。

一酸化窒素は、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、及び場合によりその他のものによって産生されることができ、これらのどれもが、マイクロニードルのナノトポグラフィによって直接または間接的に影響され得る。マイクロニードル表面のナノトポグラフィによって提供され得る一酸化窒素合成の阻害は、創収縮に影響し、コラーゲン組織を変化させ、かつ新生表皮（neoepidermis）厚さを変えることができる。創傷治癒過程での血管形成及びマスト細胞の遊走もまた、一酸化窒素の阻害に影響され得る。調整経路を変えることができるので、そして如何なる特定の理論にも拘束されるものではないが、本発明のデバイスは、一酸化窒素の産生を増加させかつ／または一酸化窒素の分解を遅らせることができる一方で、別の実施形態では、本発明のデバイスは、一酸化窒素の産生を減少させかつ／または一酸化窒素の分解を促進することができる。

本発明のデバイスと表皮の層または細胞ネットワークの構成要素との相互作用により、表皮内の細胞間結合の構造を調節（すなわち改変）することができる。細胞内結合は、タイトジャンクション（密着結合）、ギャップ結合、及びデスモソーム（接着斑）からなる群から選択される少なくとも１つの結合であり得る。例として、顆粒層のタイトジャンクションの開口を生じさせ、それによって活性薬剤（１つの特定の実施形態では、高分子量の活性薬剤）の表皮を透過しての送達を向上させるように、生物学的成分とナノトポグラフィの構造体との間の相互作用により、細胞ネットワークのタンパク質を調節することができる。

本発明のデバイスのナノトポグラフィは、ＥＣＭの１若しくは複数の成分を模倣しかつ／または吸着させることができる。一般に、ＥＣＭは、間質マトリックス及び基底膜の両者を含む。間質マトリックスは、タンパク質の複合混合物、プロテオグリカン及び、骨の場合にはミネラル沈着物からなる。基底膜は、基底板及び網状板の両者を含み、上皮及び内皮を固着及び支持する。ＥＣＭの個別の組成は、個別の組織の種類によって異なり得るが、通常は、様々なコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びエラスチンを含むことになる。それゆえ、本発明のデバイスのナノトポグラフィは、特定位置の成分と相互作用するように設計することができ、あるいはより一般的には、例えばほとんどの皮膚に共通している皮膚構造の成分と相互作用するように設計することができる。

ナノトポグラフィの構造体はコラーゲンと相互作用することができ、コラーゲンは、皮膚のＥＣＭにおいて見られるよくある基底膜タンパク質である。コラーゲンは、全ての動物において見られる不溶性の細胞外糖タンパク質であり、人体で最も豊富なタンパク質である。コラーゲンは、軟骨、骨、腱、靱帯、筋膜及び皮膚を含む大部分の結合組織の必須構成成分である。これまでに、ヒトにおいて１９種類のコラーゲンが見つかっている。主要な型には、腱、靱帯及び骨の主成分であるＩ型と、軟骨におけるタンパク質の５０％以上に相当し、また、脊椎動物の胚の脊索を構築するために用いられるＩＩ型と、動脈、腸、子宮のような中空構造体の壁を強化するＩＩＩ型と、上皮の基底板を形成するＩＶ型とが含まれる。ＩＶ型コラーゲンのネットワークは、毛細血管及び腎臓糸球体のためのフィルタを提供する。その他の１５種類のコラーゲンは、それほど豊富ではないが、それでもなおＥＣＭの機能に重要である。

コラーゲンの基本単位は、大抵はパターンGly-Pro-YまたはGly-X-Hypに従うポリペプチドであり、ここで、X及びYは様々な他のアミノ酸残基の任意のものであってよい。得られたポリペプチドは、ねじれて長寸の左巻きへリックス（らせん）になる。合成されたとき、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端は、分子を可溶性状態に保つ球状ドメインを有する。

本明細書において、「ポリペプチド」なる用語は、一般的に、アミノ酸の分子鎖を指し、産物の特定の長さを指すものではない。それゆえ、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、その他などの発現後修飾を受けたポリペプチドを含むよう意図されている。本明細書において、「タンパク質」なる用語は、一般的に、構造的に、酵素的に、または別な方法で、他のタンパク質、ポリペプチドあるいは任意の他の有機または無機分子と相互作用することができるアミノ酸の分子鎖を指す。

本明細書全体にわたって、下表１に記載の慣用的なアミノ酸略記号を用いる。

トロポコラーゲンは、フィブリルなどのより大きなコラーゲン凝集体のサブユニットである。トロポコラーゲンは、長さ約３００ｎｎ、直径１．５ｎｎで、３つのポリペプチド鎖で構成されており、各ポリペプチド鎖は左巻きへリックス構造を有する。

本発明のデバイス表面のナノトポグラフィは、コラーゲンのみならずトロポコラーゲンとも相互作用しかつ／または模倣することができる。一実施形態では、ナノトポグラフィは、より複雑であり得、ナノスケールのトロポコラーゲン及びマイクロスケールのコラーゲンの両者を模倣しかつ／または相互作用することができる。例えば、ナノトポグラフィのより大きな構成要素は、トロポコラーゲンの３つの左巻きヘリックスを模倣することができ、これらのヘリックスは、互いにねじれ合って、右巻きコイルドコイル、トリプルへリックス（三重らせん）または「スーパーへリックス（超らせん）」（多数の水素結合によって安定化された協同４次構造）になる。Ｉ型コラーゲン及び全てのコラーゲンではないにしても場合によっては全ての線維性コラーゲンとともに、各トリプルへリックスは互いに結合してコラーゲンミクロフィブリルと呼ばれる右巻きスーパースーパーコイルになる。各ミクロフィブリルは、隣接するミクロフィブリルと互いに指を組むように組み合わされている。いくつかのコラーゲン（例えばＩＩ型）では、ミクロフィブリルを構成する３つのポリペプチドは同一である。他のコラーゲン（例えばＩ型）では、１種類の２つのポリペプチド（遺伝子産物）が、第２の、類似しているが異なるポリペプチドと会合する。

ラミニンは、別のよくある皮膚基底膜タンパク質であり、本発明のデバイスが適用される場所またはその近隣において見られ得る。ラミニンは、異なるα、β及びγサブユニット鎖の様々な組合せから形成されるヘテロ三量体タンパク質複合体のファミリーのうちの１つである。ラミニンは一般に、主としてＥＣＭの基底膜において見られ、他のマトリックス高分子と相互作用することにより、細胞の分化、運動及び維持に寄与し得る。異なるラミニン鎖α−１ないしα−５、β−１ないしβ−３、γ−１ないしγ−３は、理論的には多くの異なるアイソフォームを形成し得るが、可能なアイソフォームのうちのたった１５個の存在しか確認されていない。

ラミニンは、３つの短腕及び１つの長腕を含む十字架構造をなしている。３つの短腕は、他のラミニン分子への結合に特に長けており、基底膜においてシートを形成する。長腕は一般的に細胞結合場所であり、細胞膜及び他のＥＣＭ分子に結合し、これは、構築された組織細胞を上記膜に固着させるのに役立つ。

ラミニンは、固有の幾何学構造を有するサブドメインをさらに含む。例えば、ラミニン−３３２α３鎖の末端部分に存在するＧドメインは、５つのサブドメインＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５にさらに分けられる。ラミニン−３３２α３鎖のＧサブドメインは、細胞表面上に特定の受容体インテグリンを有する細胞へのラミニン−３３２の接着に必要であることが証明されている。従って、ナノトポグラフィのナノサイズ構造体は、ラミニンの１若しくは複数のサブドメインを模倣し得る。より複雑なパターンにおいては、これらのナノサイズ構造体を、ラミニンタンパク質全体を模倣し得るより大きな構造体と結合させることができる。ナノトポグラフィは、同様に、または二者択一的に、ラミニンを吸着／脱着させ、それによって局所環境に影響を及ぼすことができる。

ナノトポグラフィは、フィブロネクチンと相互作用することができ、フィブロネクチンは、組織修復、胚形成、血液凝固、細胞遊走及び細胞接着に関与する。ＥＣＭにおいて、フィブロネクチンは不溶性の糖タンパク質二量体として存在する。フィブロネクチンの構造は、棒状であり、３つの異なる種類の相同の繰り返しモジュールであるＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型からなる。これらのモジュールは、全てが同じアミノ酸鎖の一部であるが、通常は、１つ１つが両隣と短いリンカーによって連結されている「糸につないだビーズ（beads on a string）」として想定される。

１２のＩ型モジュールが、タンパク質のアミノ末端及びカルボキシ末端領域を構成し、主としてフィブリン及びコラーゲン結合に関与する。フィブロネクチンには、２つのＩＩ型モジュールのみが含まれている。これらは、コラーゲンの結合に関与する。フィブロネクチンにおいて最も豊富なモジュールはＩＩＩ型であり、ＩＩＩ型は、他のインテグリン及びヘパリンのための結合部位とともにＲＧＤフィブロネクチン受容体認識配列を含む。組織の種類（型）及び／または細胞条件にもよるが、フィブロネクチン分子は１５〜１７のＩＩＩ型モジュールで構成されている。加えて、これらのどのカテゴリーにも分類されないＩＩＩＣＳと呼ばれるモジュールがある。このモジュールは、ＥＤＢ及びＥＤＡ（共にＩＩＩ型モジュール）とともに、ＦＮ（フィブロネクチン）プレｍＲＮＡの選択的スプライシングで制御される。フィブロネクチン分子は、カルボキシ末端において２つのジスルフィド架橋を形成し、共有結合された二量体を産生することができる。マイクロニードルデバイスのナノトポグラフィと接触している細胞は、細胞とフィブロネクチンとの通常の相互作用と同様に、本発明のデバイスと相互作用することができる。

本発明のデバイスが相互作用することができるさらに別のよくあるＥＣＭタンパク質は、エラスチン及び／またはエラスチンのポリペプチド断片である。エラスチンは、組織の弾性及び再コイル状化（recoil）に関与する結合組織のタンパク質成分である。さらに、エラスチンは、結合組織にかなり豊富にある。複数のトロポエラスチン鎖が自然に架橋構造を形成することで、弾性線維を形成する。コラーゲンとは異なり、エラスチン分子は、弾性線維が伸ばされたときに、（コイル状であったものが）非コイル状になって、より広げられた立体構造をとることができ、伸縮力が緩和され次第、自発的に再びコイル状になる。エラスチンは、主としてＧｌｙ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びＰｒｏからなる。エラスチンは、不規則またはランダムなコイル立体構造を画定する。

よくある皮膚線維性タンパク質に加えて、本発明のデバイスのナノトポグラフィは、プロテオグリカンなどの他のＥＣＭ成分を模倣しかつ／または吸着させることができる。プロテオグリカンは、糖タンパク質であるが、タンパク質よりもずっと多くの糖質からなる；すなわち、プロテオグリカンは、大抵はタンパク質骨格に付着した糖鎖の巨大な塊である。いくつかの糖がプロテオグリカンに取り入れられている。最も豊富なプロテオグリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）である。糖残基の長鎖は、タンパク質骨格内のセリン残基に付着させられる；すなわち、「Ｏ結合型」である。硫酸基も、分泌前に糖に加えられる。よくあるＥＣＭプロテオグリカンの例には、これらに限定しないが、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸（タンパク質成分を含まない）が含まれる。

表面上のナノトポグラフィは、本発明のデバイスが適用される場所またはその近隣において、細胞に直接及び／または間接的に影響を及ぼし得る。そのような細胞には、マイクロニードルデバイスによって送達される薬剤の送達部位と皮膚表面との間にあるバリア層の細胞と、薬剤が送達される細胞とが含まれ得る。本発明のデバイスの存在に起因する細胞への具体的な影響には、膜結合タンパク質の立体構造、リガンド結合活性、または触媒活性の変化が含まれ得る。

本発明のデバイスの存在により、一態様においては全細胞コンダクタンスを含む細胞膜導電率を調節することができる。さらに、全細胞コンダクタンスの調節は、全細胞コンダクタンスの線形的または非線形的電位依存性寄与のうちの少なくとも一方を調節することを含み得る。本発明のデバイスは、細胞膜電位及び細胞膜導電率のうちの少なくとも一方を調節することができる。例えば、本発明のデバイスは、カルシウム依存性細胞メッセージング経路またはシステムに直接または間接的に影響を及ぼし得る。

本発明のデバイスのナノトポグラフィは、細胞膜の成分に影響を及ぼし得る。細胞膜は、転写因子の下流エフェクタであるシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。例えば、ＥＣＭの成分を模倣するかまたはＥＣＭの成分と相互作用することにより、本発明のデバイスは、局所細胞内の遺伝子転写及び／または翻訳に影響を及ぼし得る。本発明のデバイスの存在は、膜タンパク質の場所及び／または立体構造に影響を及ぼし得る。これが、今度は、局所環境の自由エネルギーに影響を及ぼし、本発明のデバイスによって送達される活性薬剤のエンドサイトーシスの促進をもたらし得る。本発明のデバイスの存在は、細胞間結合、例えばタイトジャンクションの形成に影響を及ぼし、生物学的バリアを透過しての薬剤の送達を向上させ得る。

本発明のデバイスは、膜結合タンパク質を介して細胞に直接または間接的に影響を及ぼし得ると考えられている。膜結合タンパク質は、これらに限定しないが、表面受容体、膜貫通受容体、イオンチャンネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリンなどのうちの少なくとも１つを含み得る。特定の態様によれば、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり得る。例えば、本発明のデバイスは、ＧＰＣＲと相互作用するＥＣＭ成分を模倣することができ、ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質αサブユニットと相互作用する。Ｇタンパク質αサブユニットは、Ｇα_ｓ、Ｇα_ｉ、Ｇα_ｑ及びＧα_１２のいずれかであってよい。ＥＣＭの成分と相互作用する際に、本発明のデバイスは、カドヘリン、接着斑（焦点接着斑）、デスモソーム、インテグリン、クラスリン、カベオリン、ＴＳＬＰ受容体、β−２アドレナリン受容体、ブラジキニン受容体、イオンチャンネルタンパク質などに影響を及ぼし得る。一実施形態では、マイクロニードルの存在により、これらに限定しないが、ＪＡＭ２及び３、ＧＪＡ１、３、４及び５（接合部接着）、オクルディン（ＯＣＬＮ）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）並びにタイトジャンクションタンパク質１（ＴＪＰ１）を含む接合部接着分子を調節することができる。

本発明のデバイスは、細胞表面においてのみならず内部的にも細胞活性に影響を与え得る。例えば、本発明のデバイスは、接着斑に影響を与え得る。接着斑は、どの時点においても１００以上の異なるタンパク質を含み得る物質の大型会合体である。接着斑は、ほとんどの細胞型で動的であり、ＥＣＭから内部細胞への情報の伝達のための機械的及び化学的経路を提供する。接着斑の変形は、ＥＣＭに存在する分子構成、物理的構造及び物理的力が変化したときに起こる。

接着斑は、細胞骨格−ＥＣＭ間の連結を許容し、一般的には、機械力及び化学的シグナルの両者の伝達のためのシグナル伝達ハブであると考えられている。接着斑の大半は、細胞膜の真下にあり、通常はインテグリンを介してＥＣＭと連結しているが、情報伝達は、ヒアルロン酸結合タンパク質及びヘパリン−硫酸結合タンパク質を含む他の膜貫通物質を介してなされることもできる。

インテグリンは、細胞を基底膜のＥＣＭタンパク質（例えば、ラミニン）または他の細胞上のリガンドに付着する偏性ヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質の巨大ファミリーである。本発明のデバイスのナノトポグラフィは、細胞膜においてインテグリンに影響を及ぼし、それにより、例えば接着斑を介して細胞挙動に影響を及ぼすことができる。インテグリンは、サイズ１２０〜１７０ｋＤａの大（α）サブユニット及び９０〜１００ｋＤａの小（β）サブユニットを含む。哺乳類では、１８のα及びβサブユニットの特性が明らかになっている。いくつかのインテグリンは、直接細胞間認識及び相互作用を媒介する。インテグリンは、接着機能に必要な二価カチオンＭｇ^２＋及びＣａ^２＋のための結合部位を含む。哺乳類インテグリンは、異なるαサブユニットに結合する共通のβサブユニットを共有するいくつかのサブファミリーを形成する。αサブユニット及びβサブユニットはともに２つの別々の尾部を含み、両者は、細胞膜を貫通し、小さな細胞質ドメインを有する。例外は、任意の膜タンパク質の最大の既知の細胞質ドメインのうちの１つである１０８８アミノ酸の細胞質ドメインを有するβ−４サブユニットである。貫通部分は、接着斑内のタンパク質と相互作用して、ＥＣＭに関する情報を細胞骨格及び内部細胞に伝達することができる。細胞膜の外では、α鎖及びβ鎖は約２３ｎｍの長さに沿って互いに近接して位置し、最後の５ｎｍは、ＥＣＭのためのリガンド結合部位を形成する各鎖のＮ末端である。

細胞表面の領域内のナノトポグラフィの存在によって影響され得る接着斑内で知られている主要なタンパク質には、ビンキュリン、パキシリン、タリン、α−アクチン及びザイキシンが含まれる。接着斑タンパク質は、例えばアクチンとの相互作用により、細胞質を通じて細胞骨格へ情報を伝達する。接着斑は絶えず変化しているが、タンパク質は連続的に複合体と会合及び脱会合し、情報をＥＣＭから細胞の他の部分へ伝えている。葉状仮足の前端部における焦点複合体（focal complex）の形成から細胞の後端部における接着斑の崩壊までの接着斑の動的な集合及び脱集合は、細胞遊走における中心的役割である。接着斑を介して内部細胞に働く細胞外の機械的力によるＳｒｃキナーゼの活性化は、接着斑がＥＣＭの機械的力の検知において果たす役割を示唆している。従って、本発明のデバイスは、接着斑に関連する原形質膜タンパク質を介して細胞遊走に関与する下流機能を含む細胞の内部の活性を調節することができる。

本発明のデバイスのナノトポグラフィが影響を及ぼし得る他の細胞表面構造には、エンドサイトーシスに関与する膜タンパク質が含まれる。例えば、細胞膜と相互作用することによって、本発明のデバイスは、接触表面のナノトポグラフィのおかげで接着エネルギーの増加を示し得る。該接着エネルギーは、典型的な受容体−リガンド結合のエネルギーを模倣し得る。

如何なる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明のデバイスの表面とエンドサイトーシス媒介受容体とが接着すると、細胞膜内の他のエンドサイトーシス媒介受容体が細胞膜上の接着前均一分布から接着部位へ拡散し得ると考えられている。これらの膜タンパク質はその後、デバイス表面に接着し、それによって細胞表面とデバイスとの相互作用の自由エネルギーを低下させ得る。自由エネルギーの低下は、細胞表面における薬剤（例えば、本発明のデバイスにより送達される活性薬剤）のエンドサイトーシスを促進することができる。具体的には、デバイス表面と受容体との間で接着が生じると、放出されたエネルギー、すなわち増加した自由エネルギーが、接着部位またはその近傍において粒子を膜で包むことを促進し得る。あるいは、本発明のデバイスの表面へのＥＣＭの非細胞成分の吸着が、局所の化学的性質を変化させ、当該領域内の細胞によるエンドサイトーシスの活性の増加をもたらし得る。本発明のデバイスの存在に起因して媒介され得るエンドサイトーシス経路は、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ、マクロピノサイトーシス及びファゴサイトーシスを含む４つのカテゴリーにさらに分割することができる。

クラスリン媒介エンドサイトーシスは、主として細胞質タンパク質クラスリンと関連があるタンパク質複合体の形態学的に特徴的な結晶性コートを有する直径約１００ｎｍの小さな小胞によって媒介される。これらのクラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）は、実質的に全ての細胞において見られ、細胞膜にクラスリン被覆ピットを形成する。クラスリン被覆ピットは、例えば、低密度リポタンパク質、トランスフェリン、成長因子、抗体及びその他多くのものなど、リガンドの受容体媒介エンドサイトーシスに関与する様々な受容体を有する巨大な細胞外分子の濃度の増加を含み得る。

本発明のデバイスのナノトポグラフィは、カベオラに関連する膜タンパク質に影響を及ぼし得る。カベオラは、クラスリン被覆ピットより僅かに一般的ではないエンドサイトーシスに関与している膜構造であり、多くの、しかし全てではない細胞型の表面上に存在する。カベオラは、コレステロール及び糖脂質に富む二重層を有するコレステロール結合タンパク質カベオリン（Ｖｉｐ２１）で構成されている。カベオラは、ＣＣＶよりも小さく、直径約５０ｎｍであり、膜内でフラスコ形状のピットを形成する。それらは、最大でいくつかの組織の細胞の細胞膜領域の３分の１を占めることができ、皮膚で見られるように線維芽細胞、脂肪細胞及び内皮細胞において特に豊富である。細胞外分子の取り込みは、マイクロニードルのナノトポグラフィに影響され得るカベオラにおいて受容体を介して特異的に媒介されると考えられている。

マクロピノサイトーシス（飲作用）は、通常、細胞膜の大いに波打った領域から発生し、細胞膜が内側へ陥没して窪みを形成し、その後、細胞内への取り込み（pinch off）が行われ、大量の細胞外液及び分子（１０３〜１０６ＣＣＶに等しい）で満たされている大きな小胞（直径０．５〜５μｍ）を形成することである。窪みを満たすことは、非特異的な方法でなされる。小胞はその後、サイトゾル内に移行し、エンドソームやリソソームなど他の小胞と融合する。

ファゴサイトーシス（食作用）は、特定細胞においてのみ生じるような、小さなサイズの塵粒子、細胞残屑、微生物、そしてアポトーシス細胞などの直径約０．７５μｍ以上の微粒子状物質が結合及び内部移行することである。これらの過程には、クラスリン媒介エンドサイトーシス及びカベオラ経路より大きな膜領域の取り込みが含まれる。

本発明のデバイスのナノトポグラフィは、細胞表面のカドヘリンにも影響を及ぼし得る。カドヘリンは、一般的にカルシウム依存性の同種親和性細胞間接着の媒介に関与する受容体のファミリーである。カドヘリンは、胚形成中に極めて重要であるが、成人（成体）においても適切な細胞間結合を形成しかつ正常な組織構造を維持する役割を果たす。カドヘリンは、細胞外ドメインにおける１若しくは複数のカドヘリンリピートの存在によって分類される膜貫通タンパク質のスーパーファミリーである。これら約１１０の残基ドメインのアレイは、カドヘリン媒介細胞間相互作用の成立に関与する分子間表面を形成する。幾つかのカドヘリンドメインの解析から得られる構造情報は、カルシウムイオンが互いに隣接するカドヘリンリピート（ＣＲｓ）間の部位で結合し、剛体棒を形成することを示している。カドヘリンは通常、５つの縦列反復細胞外ドメインと、１つの膜貫通セグメントと、細胞質領域とを含む。

一実施形態では、本発明のデバイスは、上皮組織に見られるＥ−カドヘリンに影響を及ぼし得る。Ｅ−カドヘリンは、細胞外ドメイン内の５つのカドヘリンリピート（ＥＣ１〜ＥＣ５）と、１つの膜貫通ドメインと、ｐ１２０カテニン及びβカテニンを結合する細胞内ドメインとを含む。細胞内ドメインは、βカテニン結合とそれ故にＥ−カドヘリン機能とに不可欠であると考えられている高度にリン酸化された領域を含む。βカテニンはαカテニンに結合することもでき、αカテニンはアクチン含有細胞骨格線維の制御に関与する。上皮細胞において、細胞間結合を含むＥ−カドヘリンは、細胞骨格のアクチン含有線維に隣接していることが多い。

或る局所領域に本発明のデバイスが存在することが原因で影響され得る他の活動には、傍細胞輸送及び経細胞輸送が含まれる。例えば、デバイスの表面におけるＥＣＭタンパク質の吸着を通して、或る領域の局所の化学的性質が変化し、局所領域への被送達薬剤の傍細胞輸送を向上させ得る。局所領域には、本発明のデバイスの隣接領域のみならず、真皮のより深い領域も含まれ得る。例えば、本発明のデバイスの存在は、血流に送達されて全身送達されるように、被送達薬剤の、真皮の毛細血管床への、かつ毛細血管壁を通過しての傍細胞輸送を促進することができる。

使用中、本発明のデバイスは、それに接触した上皮組織の１若しくは複数の成分と相互作用して、傍細胞及び／または経細胞輸送機構によって上皮組織の多孔性を向上させることができる。上皮組織は、身体の主要な組織種類の１つである。本発明に従ってより多孔性の状態にされ得る上皮組織には、ケラチン性上皮及び移行上皮の両者を含む単層上皮及び重層上皮の両方が含まれ得る。加えて、本明細書に包含される上皮組織には、これらに限定しないが、ケラチノサイト、扁平細胞、円柱細胞、立方細胞及び偽重層（多列）細胞を含む上皮層のあらゆる細胞種類が含まれ得る。

本発明のデバイスの存在は、傍細胞輸送を促進するためにタイトジャンクション（密着結合）及びデスモソームを含む細胞間結合の形成及び維持に影響を及ぼし得る。上述したように、タイトジャンクションは顆粒層において見られ、タイトジャンクションの開口は、薬剤、特に、従来は経皮送達が妨げられた親油性を示す高分子量活性剤の送達を向上させるための細胞間経路を提供することができる。タイトジャンクションの主要なタンパク質の種類は、クローディン、オクルディン及び接合部接着分子である。

局所成分とナノトポグラフィの構造体との相互作用により、バリア層のデスモソームを開口させて傍細胞輸送を促進することができる。デスモソームは、主として、カドヘリンのメンバーであるデスモグレイン及びデスモコリンから形成され、細胞間接着に関与する。デスモソームは、細胞外コアドメイン（デスモグレア（desmoglea））を含み、ここで、互いに隣接する細胞のデスモグレイン及びデスモコリンタンパク質は、互いに結合する。互いに隣接する細胞は、幅約３０ｎｍのＥＣＭ層によって分離されている。細胞膜の真下に、外部濃密斑（dense plaque）及び内部濃密斑として知られている重い板状構造体が形成されている。これらの濃密斑間には、デスモプラキンタンパク質が跨っている。外部濃密斑は、カドヘリンの細胞質ドメインがプラコグロビン及びプラコフィリンを介してデスモプラキンに付着する部位である。内部濃密斑は、デスモプラキンが細胞の中間線維に付着する部位である。

個々の細胞とナノトポグラフィ構造体との間の相互作用により、バリア細胞を通過させての薬剤の送達を誘起し、経細胞輸送を促進することができる。例えば、角質層のケラチノサイトとの相互作用により、ケラチノサイトへの薬剤の分配（partitioning）と、その後の、バリア細胞中への拡散及び脂質二重層の通過を促進することができる。薬剤は傍細胞経路及び細胞間経路の両方によってバリア細胞を透過することができるが、高親水性分子に対しては細胞間経路が主に用いられ得る。しかし、当然ながら、主に用いられる輸送経路は薬剤の性質よって異なってよく、親水性はただ１つの定義される特徴である。

一実施形態によれば、細胞層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ，本明細書においては経上皮抵抗すなわちＴＥＲと呼ぶこともある）の測定により、細胞層の透過性の増加を判定することができる。周知のように、細胞層のＴＥＥＲの増加は、例えば細胞層のタイトジャンクションの開口または形成の欠如に起因する細胞層の透過性の増加の良い目安である。内皮及び特定の上皮において、傍細胞流動を制限するタイトジャンクションの能力は不変でないことは明白である。むしろ、タイトジャンクションのこのゲート機能は、動的調節が可能である（非特許文献８、９）。特に、受容体リガンドまたは特定の膜浸透性モジュレータのいずれかによるシグナル伝達経路の活性化は、細胞間隙経路の透過性に顕著な効果を及ぼすことができる。例えば、タンパク質キナーゼＣの活性化は、ＭＤＣＫ細胞（非特許文献１０）、上皮細胞株におけるタイトジャンクションの透過性のかなりの増加をを引き起こす。サイクリックＡＭＰの上昇は、血液脳関門の研究のためのモデル系である培養下の脳内皮細胞において、透過性を減少させる（非特許文献１１）。サイクリックＡＭＰはまた、末梢内皮細胞におけるタイトジャンクション透過性を減少させる（非特許文献１２、１３）。

タイトジャンクションの透過性特性は、アドヘレンス・ジャンクション（接着結合）の完全性にも依存する。細胞外Ｃａ^２＋の除去によるアドヘレンス・ジャンクションの破壊が、ＭＤＣＫ細胞（非特許文献１４、１５を参照）及び内皮細胞（非特許文献１６）におけるタイトジャンクションの開口をもたらす。タンパク質キナーゼは、ＭＤＣＫ細胞におけるタイトジャンクションの完全性のこの間接的調節に関与しているようである（非特許文献１７）。アドヘレンス・ジャンクション複合体のＣａ^２＋感受性成分は、カドヘリンである（非特許文献１８に概説されている）。これらの膜貫通タンパク質は、該タンパク質の細胞外ドメインを介してＣａ^２＋依存的に同種親和性で細胞間接着を媒介する。カドヘリンの細胞質ドメインは、α、β及びγカテニンと呼ばれる３つのさらなるタンパク質と関連があり（非特許文献１９）、これらは、カドヘリンをアクチン細胞骨格に結合し、かつカドヘリン接着に必要とされる（非特許文献２０〜２３、非特許文献２４を参照）。

本発明によれば、上皮層と本発明のデバイス表面（該表面上に作製された構造体の所定のパターンを含み、構造体の少なくとも一部はナノメートルスケールで作製されている）との接触は、透過性を増加させ、上皮層のＴＥＥＲを減少させることができる。例えば、上皮層とナノパターニングされた表面とを一定期間接触させた後に上皮層のＴＥＥＲを初期値の約９５％未満、約８５％未満または約７０％未満に下げることができる。例として、上皮層とナノ構造体のパターンを含む表面とを約３０分間接触させた後、上皮層のＴＥＥＲを初期値の約９０％〜約９５％にすることができる。約６０分間の接触後には、上皮層のＴＥＥＲを初期値の約８０％〜約９０％にすることができ、約１２０分間の接触後には、上皮層のＴＥＥＲを初期値の約６０％〜約７５％にすることができる。

図１０は、上皮層のＴＥＥＲを測定する１つの方法を示している。この実施形態では、細胞層、例えば上皮細胞単層を、アピカル（上部）チャンバの底部において成長させるかまたは別な方法で位置させることができる。２つのチャンバ間の流動を許容し、個々の細胞が基底（下部）チャンバに入ることを防止するために、図のように、アピカルチャンバの底部は微細孔ろ過膜であってよい。例として、微細孔ろ過膜は、約０．４μｍの孔を約４×１０^６孔／ｃｍの密度で含むことができる。当然ながら、様々なシステム構成要素の特定パラメータは決定的なものではなく、当技術分野で知られているように変更することができる。アピカルチャンバは、より大きなウェルに収まるトランスウェルインサートによって画定され、それによって、システムの基底チャンバを画定することができる。使用中、上皮細胞単層のどちらかの側に第１の電極１及び第２の電極２を配置することができ、２つの電極間にオーム計４を接続することができる。オーム計４は、細胞単層のＴＥＥＲを示すことができる。細胞層のＴＥＥＲを測定するシステムは既知であり、例えば、ミリセル（Millicell）（登録商標）電気抵抗値測定システム（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社（Millipore）から入手可能）を利用することができる。

上皮細胞層とナノ構造体が作製された表面とを接触させることにより、ＴＥＥＲを下げることができ、低いＴＥＥＲは、層透過性の増加を示している。従って、上皮層とナノ構造化された表面との接触後、化合物を層を透過して輸送する能力を大いに高めることができる。これにより、以前はこの方法で効率的に送達することができなかった化合物の経皮送達を改善することができる。例えば、開示されている方法及びデバイスを利用して、高分子量化合物、親油性化合物及び／または荷電化合物の経皮送達を向上させることができる。

当然ながら、本発明のデバイスのナノサイズ構造体は、周囲の微小環境の他の成分に直接または間接的に影響を及ぼすことができ、そのような構造体の代表的な実例のみが本明細書に記載されている。

表面に形成されたナノトポグラフィを有するデバイスは、単一段階製造方法に従って形成することができる。あるいは、予め形成された表面上にナノ構造体のパターンを形成する多段階製造方法を用いてもよい。例えば、まず、マイクロニードルのアレイを作製し、その後、作製されたマイクロニードルの表面にナノ構造体のランダムまたは非ランダムなパターンを形成することができる。単一段階製造方法または２段階製造方法のいずれでも、任意の適切なナノトポグラフィ作製方法に従って、或る表面またはモールド表面に構造体が形成され得る。ナノトポグラフィ作製方法には、これらに限定しないが、ナノインプリンティング、射出成形、リソグラフィ、エンボス成形などが含まれる。

通常、マイクロニードルのアレイは、任意の標準的な微細加工技術に従って作製することができ、そのような微細加工技術には、これらに限定しないが、リソグラフィ；エッチング技術、例えば、湿式化学エッチング、乾式エッチング、フォトレジスト除去；シリコンの熱酸化；電気めっき及び無電解めっき；拡散法、例えば、ホウ素、リン、ヒ素、またはアンチモン拡散；イオン注入；膜蒸着、例えば、蒸発（フィラメント、電子ビーム、フラッシュ、シャドーイング、ステップカバレッジ）、スパッタリング、化学蒸着（ＣＶＤ）、エピタキシー（気相、液相、分子ビーム）、電気めっき、スクリーン印刷及びラミネート加工；ステレオリソグラフィ；レーザ加工；レーザ切断（投影アブレーションを含む）が含まれる。

電気化学エッチング法を用いることもできる。電気化学エッチング法では、固体シリコンを電気エッチングして多孔質シリコンにすることにより、穿刺構造体として使用され得る極めて微細な（約０．０１ｍｍの）シリコンネットワークを形成する。この方法は、水性フッ化水素酸中におけるシリコンの電解陽極酸化によって、場合によっては光と組み合わせて、シリコンにチャンネルをエッチングすることができる。エッチングされるシリコンウエハのドープ濃度を変更することにより、最終的な多孔質構造体についての、エッチング中の電解電圧、入射光強度、または電解質濃度を制御することができる。エッチングされなかった材料（すなわち、残ったシリコン）が、マイクロニードルを形成する。

プラズマエッチングを用いることもできる。プラズマエッチングでは、シリコンのディーププラズマエッチングを行うことにより、約０．１ｍｍまたはそれ以上の直径を有するマイクロニードルを形成する。マイクロニードルは、（電気化学エッチングのように）電圧を制御することにより、間接的に作製することもできる。

フォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ、Ｘ線リソグラフィなどを含むリソグラフィ技術を、主要パターンの画定やマスターダイの作製に用いることもできる。その後、複製を行うことにより、マイクロニードルのアレイを有するデバイスを形成することができる。一般的な複製方法には、これらに限定しないが、溶媒補助微細成形及び鋳造、エンボス成形、射出成形などが含まれる。相分離性ブロックコポリマー、ポリマー脱混合及びコロイドリソグラフィ技術を含む自己組織化技術を用いて、マイクロニードルの表面にナノトポグラフィを形成することもできる。

周知のように、複数の方法の組み合わせを用いることもできる。例えば、形成されたナノ構造体の特徴、例えばナノピラーの直径、外形、高さ、ピッチなどを微細化するために、コロイドでパターニングされた基板を反応性イオンエッチング（ＲＩＥ，乾式エッチングとも呼ばれる）に曝してもよい。最初に別の方法（例えばポリマー脱混合技術）により作製したナノ構造体の外形を、湿式エッチングを用いて別の外形に変更することもできる。

構造体の直径、形状及びピッチは、適切な材料及び方法を選択することにより制御され得る。例えば、コロイドでパターニングされた基板上に最初に蒸着させた金属をエッチングした後にコロイドのリフトオフを行うことにより、角柱形状のピラーが一般的に得られる。その後、所望に応じて、エッチング方法を用いて構造体を完成させることができる。ポリマーナノ粒子を選択的に溶解させた後に、コロイドの隙間に規則的に配列された様々な三方晶系ナノメータフィーチャ（feature）を形成する温度制御焼結技術により、規則的に配列された非球形のポリマー性ナノ構造体を製造することもできる。これらの及び他の適切な製造技術は当該技術分野では公知である（例えば、非特許文献２５を参照されたい。非特許文献２５は、引用を以て本明細書の一部となす）。

表面にナノトポグラフィが形成されたマイクロニードルの製造に用いることができる他の方法には、超高精度レーザ加工技術を用いたナノインプリントリソグラフィ方法が含まれる。ナノインプリント技術の例は、米国特許第６，９９５，３３６号明細書（特許文献７）及び米国特許第７，３７４，８６４号明細書（特許文献８）に記載されており、これらの特許文献は引用を以て本明細書の一部となす。ナノインプリントリソグラフィは、ナノインプリントリソグラフィモールド及びフォトリソグラフィマスクの両方の役割を果たすハイブリッド型モールドが用いられるナノスケールリソグラフィ技術である。ナノインプリントリソグラフィ技術の概要を図１１の（Ａ）〜（Ｃ）に示す。作製中に、レジスト層上にフィーチャ（例えば、ナノトポグラフィを画定するマイクロニードル）を形成するために、圧力を加えることによりハイブリッド型モールド３０を基板３２上にインプリントする（図１１の（Ａ））。通常、モールド３０との係合の前に、基板３２の表面をそのガラス転移温度Ｔｇよりも高い温度まで加熱することができる。ハイブリッド型モールド３０が基板３２と係合されている間、フィーチャ３４を形成するために粘性ポリマー流をモールドキャビティ内に充填することができる（図１１の（Ｂ））。その後、モールド及び基板を紫外線（ＵＶ）に露光することができる。ハイブリッド型モールドは一般的に、特定の遮光領域を除いて、ＵＶ放射を透過する。そのため、ＵＶ放射は透過部分を通過し、レジスト層に入射する。モールド及び基板の冷却中、圧力が維持される。その後、基板及びポリマーのＴｇよりも低い温度で、冷却された基板３２からハイブリッド型モールド３０を取り除く（図１１の（Ｃ））。

図１１の（Ｃ）に示すような、作製されたフィーチャ３４を含むナノインプリント基板３２のモールド３０からの離型を容易にするためには、基板３２との接着力を低下させるために低エネルギーコーティングでモールド３０を処理することが有益である。というのも、モールド３０の表面エネルギーを小さくすると、それにより、モールド３０、基板３２及びポリマー間の表面エネルギー差が大きくなり、前記材料間の離型が容易になるためである。例として、トリデカ−（１，１，２，２−テトラヒドロ）−オクチルトリクロロシラン（Ｆ_１３−ＴＣＳ）などのシリコンモールドコーティングが用いられ得る。

ナノプリンティング法は、モールドにポリマーを充填した後に、形成されたポリマーをモールドから取り出すことを含む動的な方法である。モールド要素充填のために、ポリマー温度は、印加圧力で流動が開始されるのに十分なレベルまで高くするべきである。ポリマーの温度を高くすると、ポリマーの粘性が低下し、モールド充填がより迅速かつより容易になる。また、圧力を高くすると、充填速度及び全体充填を向上させることができ、モールド複製をより良好に行うことができる。ナノインプリントされた基板をモールドから離型するためには、基板温度を、降伏強度がモールドによる接着力を超える温度よりも低くすることができる。温度を変更することにより、例えば図８に示した構造体などの別個の構造体を得るための離型中に、ポリマー要素を引き出すことが可能になる。

構造体は、化学的方法によって形成することもできる。例えば、膜堆積、スパッタリング、化学蒸着（ＣＶＤ）、エピタキシー（気相、液相、分子ビーム）、電気めっきなどを用いて、表面に構造体を形成することができる。

当該技術分野で公知の自己組織化単分子層方法を用いて、表面上に構造体のパターンを形成してもよい。例えば、ブロックコポリマーの自己組織化能力を用いて、表面に単分子層パターンを形成することができる。単分子層パターンは、その後、該パターンに従って、所望の構造体（例えば、コロイド）を成長させるためのテンプレートとして使用することができる。

例として、２またはそれ以上の反応部位を有するモノマーから、２次元の架橋ポリマーネットワークが形成され得る。そのような架橋単分子層は、当該技術分野で既知の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）技術（例えば、金／アルキルチオールシステム）またはラングミュアーブロジェット（ＬＢ）単分子層技術（非特許文献２６）を用いて作製されてきた。単分子層は架橋結合され、それにより、構造的によりロバストな単分子層が形成され得る。

パターニングされた単分子層の形成に使用されるモノマーは、所望の重合技術及び／または単分子層形成技術に影響を及ぼすか、あるいは、全体溶解度などの性質、解離方法またはリソグラフィ方法に影響を与えるために必要な全ての構造的部分を含み得る。モノマーは、少なくとも１つの、大抵は少なくとも２つの反応性官能基を含み得る。

有機単分子層の形成に用いられる分子には、メチレン基鎖が散在している様々な有機官能基が含まれ得る。例えば、分子は、パッキング（充填）を促進するためのメチレン鎖を含む長鎖炭素構造体であり得る。メチレン基間のパッキングは、弱いファンデルワールス結合を生じさせ、それにより、作製された単分子層の安定性を高め、秩序相の形成に関連するエントロピーペナルティに対抗することができる。加えて、形成された単分子層上での構造体の成長を可能にするために、別の末端部分（例えば水素結合部分）が分子の一方の末端に存在し得るが、その場合には、重合可能な化学的部分が鎖の中間または他方の末端に位置し得る。前記アセンブリを形成するのに、任意の適切な分子認識化学が用いられ得る。例えば、構造体は、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、金属キレート化、結合配位（すなわち、ルイス酸塩基相互作用）、イオン結合、共有結合、または水素結合に基づいて、単分子層上に構築され得る。

ＳＡＢをベースにしたシステムを用いる場合、テンプレートを作製するためにさらなる分子が用いられ得る。このさらなる分子は、ＳＡＭを形成するために、その末端の１つにおいて適切な官能性を有し得る。例えば、金の表面に、チオール端末が含まれ得る。複製に影響を与えるために用いられ得る様々な有機分子がある。ジエンやジアセチレンなどのトポケミカル重合可能部分が、重合可能成分として特に望ましい。これらには、様々な長さのメチレンリンカーが散在し得る。

分子認識部分はＬＢ形成目的のための極性官能基としての役割も果たすこともできるので、ＬＢ単分子層には、１つのモノマー分子だけが必要とされる。基板に転写されたＬＢ単分子層上に、または前記トラフ（trough）に直接的に、リソグラフィが行われ得る。例えば、ジアセチレンモノマーのＬＢ単分子層は、マスクを介したＵＶ露光または電子ビームパターニングによりパターニングされ得る。

単分子層段階でトポケミカル重合される分子を用いて、単分子層形成を促進することができる。形成されたフィルムを重合触媒に曝すことにより、該フィルムはその場で成長し、動的分子アセンブリからよりロバストな重合アセンブリへ変化することができる。

単分子層のパターニングのための当該技術分野で既知の任意の技術を用いることができる。単分子層のパターニングに有用な技術には、これらに限定しないが、フォトリソグラフィ、電子ビーム技術、集束イオンビーム技術、またはソフトリソグラフィが含まれる。フォトレジストなどの様々な保護スキームを、ＳＡＭをベースにしたシステムに用いることができる。同様に、金の上にブロックコポリマーのパターンを形成し、選択的にエッチングすることにより、パターンが形成され得る。二成分系の場合、パターニングは、容易に利用可能な技術を用いて達成することもできる。

紫外線及びマスクを使用してパターニングを行うことができるソフトリソグラフィ技術が、単分子層のパターニングに用いられ得る。例えば、パターニングされていないベース単分子層が、ＵＶ／粒子ビーム反応性モノマー単分子層を形成するためのプラットホームとして使用され得る。ベースＳＡＭがパターニングされていなくても、前記モノマー単分子層は、その後、ＵＶフォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ、またはイオンビームリソグラフィによってパターニングされ得る。

パターニングされた単分子層上の構造体の成長は、様々な成長機構によって実現することができ、例えば、金属塩の適切な還元化学を介して、または、シード若しくはテンプレート媒介核形成を用いて実現することができる。単分子層上の認識要素を用いることにより、この界面で、様々な方法によって、無機成長を触媒することができる。例えば、パターニングされた有機単分子層の形状を支持するコロイド形態の無機化合物が形成され得る。例えば、炭酸カルシウムまたはシリカ構造体が、カルボン酸やアミドなどの様々な官能基によりテンプレート化され得る。結晶成長条件を制御することにより、無機物成長の厚さや結晶形態を制御することが可能である。また、二酸化チタンをテンプレート化してもよい。

テンプレート化された無電解めっき技術を用いて、既存の有機官能基を使用して金属を合成することができる。具体的には、金属原子を有機パターンのカルボニル部分にキレートすることによって、無電解金属堆積を前記パターン上で触媒し、パターニングされた金属コロイドを形成することができる。例えば、Ｃｕ、Ａｕ、Ｎｉ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、または無電解めっき条件でめっき可能な他の様々な金属を用いて、前記有機単分子層の形状の金属構造体を形成することができる。無電解めっき条件を制御することにより、めっきされる金属構造体の厚さを調節することが可能である。

当技術分野で既知の他の「ボトムアップ（bottom-up）」型の成長方法、例えば、米国特許第７，１８９，４３５号明細書（特許文献９）に記載された方法などを用いることができ、特許文献９は、引用を以て本明細書の一部となす。この方法によれば、導体または半導体基板（例えば、金などの金属）をブロックコポリマー膜（例えば、メタクルル酸メチルとスチレンのブロックコポリマー）で被覆することができ、このとき、コポリマーの一方の成分が、コポリマーの他方の成分のマトリックス内にナノスケールの円柱を形成する。その後、コポリマー上に導体層を配置することにより、複合構造体を形成することができる。前記複合構造体を垂直に配向にした際、例えば、ＵＶ放射線、電子ビームまたはオゾンへの曝露や、分解などにより、第１の成分のいくつかを除去し、第２の成分の領域にナノスケールの孔を形成することができる。

米国特許第６，９２６，９５３号明細書（特許文献１０）（この参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載された別の実施形態では、表面にイメージ層（例えば、アルキルシロキサンまたはオクタデトリクロロシラン自己組織化単分子層）を有する基板を、選択された波長の２つまたはそれ以上の光線に露光することによって、前記イメージ層において干渉パターンを形成し、該干渉パターンに従って前記イメージ層の湿潤性を変更することによって、コポリマー構造体を形成することができる。選択されたブロックコポリマー（例えば、ポリスチレンとポリ（メタクリル酸メチル）とのコポリマー）の層を、その後、露光されたイメージ層上に堆積させて焼きなますことにより、前記湿潤性パターンに従ってコポリマーの成分を分離し、イメージ層のパターンをコポリマー層において複製することができる。これにより、別々の成分のストライプまたは分離領域が、１００ｎｍまたはそれ以下の範囲の周期的寸法で形成され得る。

本発明のデバイスの表面は、作製されたナノ構造体のランダムな分布を含み得る。任意選択で、デバイスの表面は、作製されたナノ構造体と共に別の材料を含み得る。例えば、マイクロニードルは、その表面に作製された電子スパン繊維層を有し得、この電子スパン繊維層上に、ナノ構造体のランダムまたは非ランダムなパターンが作製され得る。

エレクトロスピニングは、毛細管内に保持されたポリマー融液または溶液に対して電界を印加し、個々のポリマー分子への帯電を引き起こすための高電圧供給器の使用を含む。電界を加えると、空気と表面との界面で帯電及び／または双極性配向が誘起されることになる。この誘起により、表面張力に対抗する力が生じる。臨界磁場強度では、静電気力は表面張力に打ち勝ち、ポリマー材料の噴流が毛細管から導電性のグランド面に向けて放出されることになる。前記噴流は、毛細管から出るとき、外部電界によって引き伸ばされ、かつ加速させられる。前記噴流が空気中を通過するとき、前記溶媒の一部が、帯電したポリマー繊維を残して蒸発し得る。帯電したポリマー繊維は、前記表面に集めることができる。前記繊維が集められると、まだ濡れている個々の繊維は互いに接着し、表面上に不織ウェブを形成することができる。その後、例えば、所望のナノ構造体を画定するモールドを用いたエンボス技術によって、エレクトロスピニングされた表面上にナノ構造体のパターンが作製され得る。前記モールドをマイクロニードル表面に適切な温度及び圧力で適用することにより、マイクロニードルの表面にパターンを転写することができる。ランダムなエレクトロスピニングされたナノサイズ繊維の表面は、マイクロニードル表面の望ましい特徴、例えば、表面積対体積比、表面粗さ、表面エネルギーなどのうちの１つまたは複数をさらに向上させることができ、それに伴う利益を提供することができる。

使用中に組織または個々の細胞に対する相互作用を向上させるために、マイクロニードル表面をさらに官能化してもよい。例えば、１若しくは複数の生体分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質全体、多糖類など）を、使用前に構造化表面に結合させることができる。

いくつかの実施形態では、構造体が形成された表面は、該表面の事前処理を必要とすることなく、該表面に追加的な望ましい官能基を自然発生的に結合させるような、適切な反応性を既に有し得る。なお、他の実施形態では、所望する化合物を結合させる前に、構造化表面の事前処理が行われ得る。例えば、構造体表面の反応性は、該表面上にアミン、カルボン酸、ヒドロキシル基、アルデヒド、チオールまたはエステル基を追加または生成することにより、高めることができる。１つの代表的な実施形態では、ナノ構造体のパターンを含むマイクロニードル表面は、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミン含有化合物と接触させてアミノ化することにより、該表面のアミノ官能性を高めることができ、追加されたアミノ官能性によって、１若しくは複数の生体分子がマイクロニードル表面に結合され得る。

パターニングされたデバイスの表面に結合させるのに望ましい物質には、ラミニン、トロポエラスチン、またはエラスチンなどのＥＣＭタンパク質、トロポコラーゲンまたはコラーゲン、フィブロネクチンなどが含まれ得る。多くのＥＣＭタンパク質に対するインテグリン結合の認識配列の一部であるＲＧＤ配列などの短タンペプチド断片が、パターニングされたデバイス表面に結合され得る。したがって、ＲＧＤによるマイクロニードル表面の官能化は、本発明のデバイスのＥＣＭタンパク質との相互作用を高めることができ、さらには、本発明のデバイスの使用時の該デバイスに対する異物反応を制限することができる。

本発明のデバイスを、該デバイスを介して送達される薬剤に関連させることができる。例えば、薬剤を角質層の真下、有棘層または基底層、あるいはさらに深く真皮内へ送達するために、経皮マイクロニードルパッチが使用され得る。通常、薬剤は、マイクロニードルによって（例えば、マイクロニードル内で、またはマイクロニードルの表面上で）角質層を透過して輸送されることができる。

本発明のデバイスは、薬剤を収容し、かつ送達のために薬剤を提供する貯蔵部（リザーバ）（例えば導管や多孔質マトリックスなど）を含み得る。本発明のデバイスは、該デバイス自体内に貯蔵部を含み得る。例えば、本発明のデバイスは、送達するための１若しくは複数の薬剤を保持することができる中空部または複数の孔を含み得る。薬剤は、本発明のデバイスの一部または全体が分解することにより、あるいは、本発明のデバイスから薬剤を拡散させることにより、該デバイスから放出され得る。

図１２の（Ａ）及び（Ｂ）は、貯蔵部を含む本発明のデバイスの斜視図である。デバイス１１０は、不透過性バッキング層１１４及びマイクロニードルアレイ１１６により画定された貯蔵部１１２を含む。バッキング層１１４及びマイクロニードルアレイ１１６は、デバイス１１０の外周部１１８付近で互いに結合されている。不透過性バッキング層１１４は、接着剤または熱融着などによって結合され得る。デバイス１１０はまた、複数のマイクロニードル１２０を含み得る。デバイス１１０の使用に先立って、マイクロニードル１２０を露出させるために、リリースライナ（release liner）１２２を取り外すことができる。

１若しくは複数の薬剤を含む製剤を、貯蔵部１１２内に保持することができる。不透過性バッキング層１１４として使用するのに適した材料には、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、または他の合成ポリマーなどが含まれ得る。前記材料は、一般的に、貯蔵部内容物の横方向の流れに対するバリアを提供するために、不透過性バッキング層に熱または他の方法でシール可能である。

不透過性バッキング層１１４とマイクロニードルアレイ１１６との間の空間または隙間により画定される貯蔵部１１２は、投与されることになる薬剤の懸濁液を保持する貯蔵構造を提供する。貯蔵部１１２は、該貯蔵部に収容される薬剤に適合する様々な材料から作製され得る。例として、天然若しくは合成ポリマー、金属、セラミック、半導体材料、またはそれらの複合材料によって貯蔵部が形成され得る。

一実施形態では、貯蔵部は、マイクロニードルが配置される基板に取り付けられ得る。別の実施形態によれば、貯蔵部は別個に設けられ、マイクロニードルアレイに取り外し可能に結合されるか、または、例えば適切なチューブやルアーロックなどを介して、マイクロニードルアレイに流体連通され得る。

本発明のデバイスは、送達される薬剤を収容するための１若しくは複数の貯蔵部を含み得る。例えば、本発明のデバイスは、１若しくは複数の薬剤含有製剤を収容する１つの貯蔵部を含み得るか、または、マイクロニードルアレイの全部または一部に送達するための１若しくは複数の薬剤を各々収容する複数の貯蔵部を含み得る。複数の貯蔵部は、各々、送達のために組み合わせられ得る互いに異なる薬剤を収容し得る。例えば、第１の貯蔵部は薬剤（例えば薬物）を収容することができ、第２の貯蔵部は媒体（例えば生理食塩水）を収容することができる。上記の互いに異なる薬剤は、送達前に互いに混合され得る。前記混合は、任意の手段、例えば、物理的崩壊（すなわち、穿通、分解または破壊）、孔隙率の変化、またはチャンバ同士を隔てている壁や膜の電気化学分解などによってトリガーされ得る。複数の貯蔵部は、互いに異なる、かつ同時または順次に送達される活性薬剤を収容し得る。

一実施形態では、貯蔵部は、経皮デバイスの１若しくは複数のマイクロニードルに流体連通されることができ、マイクロニードルは、貯蔵部から送達された薬剤をバリア層の真下へ輸送するための構造（例えば、中央ボアまたは側部ボア）を画定することができる。

別の実施形態では、本発明のデバイスは、マイクロニードルアセンブリと、貯蔵部アセンブリとを含むことができ、使用前に両アセンブリは流体連通されていない。例えば、本発明のデバイスは、貯蔵部またはマイクロニードルアレイの両方に隣接して配置されたリリース部材を含むことができる。使用中に貯蔵部及びマイクロニードルアレイが互いに流体連通されるように、リリース部材を使用前に本発明のデバイスから分離することができる。前記分離は、リリース部材を部分的または完全に取り外すことにより実現され得る。例えば、図１３〜図１８を参照すると、薬剤化合物の流動を開始するために、経皮パッチから取り外されるように構成されたリリース部材の一実施形態が示されている。より具体的には、図１３〜図１４は、薬剤送達アセンブリ３７０とマイクロニードルアセンブリ３８０とを含む経皮パッチ３００を示す。薬剤送達アセンブリ３７０は、流速制御膜３０８に隣接して配置された貯蔵部３０６を含む。

流量制御膜は、薬剤化合物の放出時に、該薬剤化合物の流速を遅くするのに役立ち得る。具体的には、薬剤貯蔵部からマイクロ流体チャンネルを介してマイクロニードルアセンブリへ送達される流体薬剤化合物は、圧力降下を受け、その結果、流速が低下する。この圧力差が大きすぎると、薬剤化合物の流れを妨げかつマイクロ流体チャンネルを流れる流体の毛細管圧に打ち勝つ可能性がある背圧が生じ得る。したがって、流速制御膜３０８を使用することにより、この圧力差を改善することができ、薬剤化合物をより良く制御された流速でマイクロニードルへ導入することを可能にする。流速制御膜の材料や厚さなどは、薬剤化合物の粘性や所望される送達時間などの様々な因子に基づいて変更され得る。

流速制御膜は、薬剤化合物の流速を制御し、薬剤貯蔵部の透過率よりも低い透過エンハンサー透過率を有するように、当技術分野で既知の、透過性、半透過性、または多孔性材料から製造され得る。例えば、流速制御膜の作製に使用される材料は、約５０ｎｍ〜５μｍ、いくつかの実施形態では約１００ｎｍ〜２μｍ、いくつかの実施形態では約３００ｎｍ〜１μｍ（例えば約６００ｎｍ）の平均孔径を有し得る。適切な膜材料には、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアセテート、エチレンｎブチルアセテート、またはエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマーから作製した、繊維ウェブ（例えば織布ウェブまたは不織布ウェブ）、開口部を有するフィルム、発泡体、スポンジなどが含まれる。このような膜材料はまた、米国特許第３，７９７，４９４号明細書（特許文献１１）、米国特許第４，０３１，８９４号明細書（特許文献１２）、米国特許第４，２０１，２１１号明細書（特許文献１３）、米国特許第４，３７９，４５４号明細書（特許文献１４）、米国特許第４，４３６，７４１号明細書（特許文献１５）、米国特許第４，５８８，５８０号明細書（特許文献１６）、米国特許第４，６１５，６９９号明細書（特許文献１７）、米国特許第４，６６１，１０５号明細書（特許文献１８）、米国特許第４，６８１，５８４号明細書（特許文献１９）、米国特許第４，６９８，０６２号明細書（特許文献２０）、米国特許第４，７２５，２７２号明細書（特許文献２１）、米国特許第４，８３２，９５３号明細書（特許文献２２）、米国特許第４，９０８，０２７号明細書（特許文献２３）、米国特許第５，００４，６１０号明細書（特許文献２４）、米国特許第５，３１０，５５９号明細書（特許文献２５）、米国特許第５，３４２，６２３号明細書（特許文献２６）、米国特許第５，３４４，６５６号明細書（特許文献２７）、米国特許第５，３６４，６３０号明細書（特許文献２８）及び米国特許第６，３７５，９７８号明細書（特許文献２９）に、より詳細に記載されており、これらの特許文献は、引用を以て本明細書の一部となす。特に適切な膜材料は、ローマン・テラピーシステーメ社（Lohmann Therapie-Systeme）から入手可能である。

図１３〜図１４を参照して、任意選択ではあるが、薬剤送達アセンブリ３７０は、貯蔵部３０６に隣接して設けられた接着層３０４を含み得る。また、マイクロニードルアセンブリ３８０は、同様に、上述したようなチャンネル３３１を有する複数のマイクロニードル３３０が延設される支持体３１２を含む。薬剤送達アセンブリ３７０及び／またはマイクロニードルアセンブリ３８０の両層は、所望に応じて、接着結合、熱結合、超音波結合などの任意の既知の結合技術を用いて互いに結合され得る。

用いられる特定の構造に関わらず、パッチ３００はまた、薬剤送達アセンブリ３７０とマイクロニードルアセンブリ３８０との間に配置されるリリース部材３１０を含む。リリース部材３１０は、任意選択で、該リリース部材に隣接する支持体３１２及び／または速度制御膜３０８に結合され得るが、その場合でも、一般的に、パッチ３００から容易に引き出されることができるように、軽く結合することが望ましい。所望に応じて、リリース部材３１０はまた、ユーザがリリース部材を掴んで所望する方向に引き出すのを容易にするために、パッチ３００の外周部を少なくとも部分的に超えて延在するタブ部分３７１（図１３〜図１４）を含み得る。図１３〜図１４に示すような「インアクティブ（inactive）」形態では、パッチ３００の薬剤送達アセンブリ３７０は、薬剤化合物３０７がマイクロニードル３３０に大量に流入しないように、薬剤化合物３０７をしっかりと保持する。リリース部材に対してパッチから取り外せるように単純に力を加えることにより、パッチは「アクティブ（active）」になり得る。

図１５〜図１６を参照すると、パッチ３００をアクティブ形態にするための一実施形態を示しており、ここで、リリース部材３１０は長手方向に引っ張られている。リリース部材３１０は、図１７〜図１８に示すように完全に除去されてもよいし、図１５〜図１６に示すように単に部分的に除去されてもよい。どちらの場合でも、リリース部材３１０と支持体３１２の開口部（図示せず）との間に形成されているシールは破壊される。このようにして、薬剤化合物３０７が薬剤送達アセンブリ３７０からの流出し、支持体３１２を介してマイクロニードル３３０のチャンネル３３１へ流入することが開始され得る。薬剤化合物３０７が貯蔵部３０６からチャンネル３３１へどのように流れるかについての例示的な説明が、図１７〜図１８に示されている。とりわけ、薬剤化合物３０７の流れは、受動的に開始され、能動的な送達機構（例えばポンプ）は必要としない。

図１３〜図１８に示した実施形態では、リリース部材を除去すると、薬剤送達アセンブリがマイクロニードルアセンブリに流体連通されるので、薬剤化合物のマイクロニードルへの流動が即座に開始される。なお、いくつかの実施形態では、薬剤化合物の放出タイミングについてのより多様な制御をユーザに提供することが望ましいであろう。このことは、マイクロニードルアセンブリが最初は薬剤送達アセンブリに流体連通されていないパッチ構造を用いることにより実現され得る。このようなパッチを使用することを望む場合、ユーザは、前記両アセンブリを物理的に操作して互いに流体連通させることができる。リリース部材は、そのような物理的操作を行う前または後に除去され得る。

例えば、図１９〜図２４を参照すると、パッチ２００の特定の一実施形態が示されている。図１９〜図２０は、パッチ２００の使用前の状態を示し、マイクロニードルアセンブリ２８０から作製された第１の部分２５０と、薬剤送達アセンブリ３７０から作製された第２の部分２６０とを示す。薬剤送達アセンブリ２７０は、上述したように、流速制御膜２０８に隣接して配置された貯蔵部２０６を含む。任意選択ではあるが、薬剤送達アセンブリ２７０は、貯蔵部２０６に隣接して配置された接着層２０４を含むこともできる。マイクロニードルアセンブリ２８０は、同様に、上述したように、チャンネル２３１を有する複数のマイクロニードル２３０が延設される支持体２１２を含む。

この実施形態では、支持体２１２及び流速制御膜２０８は、最初は、互いに水平方向に隣接して配置されており、リリース部材２１０は、支持体２１２及び流速制御膜２０８の上側に延在している。この特別な実施形態では一般的に、リリース部材２１０は、接着剤（例えば感圧接着剤）によって、支持体２１２及び流速制御膜２０８に取り外し可能に結合されていることが望ましい。図１９〜図２０に示すような「インアクティブ」形態では、パッチ２００の薬剤送達アセンブリ２７０は、パッチを「アクティブ」にすることが所望されたときは、図２１〜図２２に示すように、リリース部材２１０を引き剥がして除去することによって、リリース部材２１０と支持体２１２の開口部（図示せず）と間に形成されているシールを破壊することができる。その後、流速制御膜２０８が支持体２１２に垂直方向に積層配置されかつ支持体２１２に流体連通されるように、図２３の矢印方向で示すように、第２の部分２６０を折り畳み線「Ｆ」に沿って折り畳むことができる。あるいは、第１の部分２５０を折り畳んでもよい。いずれの場合でも、第１の部分２５０及び／または第２の部分２６０を折り畳むことによって、薬剤送達アセンブリ２７０から支持体２１２を介してマイクロニードル２３０のチャンネル２３１への薬剤化合物２０７の流動が開始される（図２４）。

本発明のデバイスは、治療上有用であるように或る速度で薬剤を送達することができる。この目的のために、本発明の経皮デバイスは、予めプログラムされたスケジュールに従って、または患者、医療専門家、または生体センサとのアクティブインターフェースを通じて送達速度を制御するために、マイクロエレクトロニクスまたは他のマイクロ加工構造体を有するハウジングを含み得る。本発明のデバイスは、該デバイス内に含有される薬剤の放出を制御するために、表面において所定の分解速度を有する材料を含み得る。送達速度は、送達される製剤の特徴（例えば、粘性、電荷及び／または化学組成）、各デバイスの寸法（例えば、開口部の外径及び容積）、経皮パッチに設けられるマイクロニードルの数、担体マトリックスにおける個々のデバイスの数、適用する駆動力（例えば、濃度勾配、電圧勾配、圧力勾配）、バルブの使用などの様々な因子を操作することにより制御することができる。

本発明のデバイスを介した薬剤の輸送は、例えば、バルブ、ポンプ、センサ、アクチュエータ、またはマイクロプロセッサの様々な組み合わせを使用して、制御または監視することができる。これらの部品は、一般的な製造技術または微細加工技術を用いて作製され得る。本発明のデバイスに有用であり得るアクチュエータには、マイクロポンプ、マイクロバルブ、またはポジショナーが含まれ得る。例えば、ポンプまたはバルブを制御し、それによって送達速度を制御するように、マイクロプロセッサをプログラムすることができる。

本発明のデバイスを通じた薬剤の流れは、拡散または毛細管現象に基づいて生じ得るか、あるいは、従来の機械的ポンプ若しくは非機械的駆動力（例えば、電気浸透や電位泳動）または対流を用いて引き起こされ得る。例えば、電気浸透の場合、逆帯電したイオン種及び／または中性分子を送達部位へ向けてまたは送達部位内に運ぶ対流を発生させるために、生体表面（例えば皮膚表面）、マイクロニードル、及び／またはマイクロニードルに隣接する基板に、電極が配置される。

薬剤の流れは、マイクロニードル表面を形成する材料を選択することにより操作され得る。例えば、特に液体状態の薬剤の通路を方向付けるのに、本発明のデバイスのマイクロニードルの表面に隣接する１若しくは複数の大きな溝が使用され得る。あるいは、本発明のデバイスの物理的表面特性は、例えば親水性または疎水性を制御することにより、表面に沿った薬剤の輸送を促進または抑制するように処理され得る。

薬剤の流れは、当技術分野で公知のバルブまたはゲートを使用して調節され得る。バルブは、繰り返し開閉することができるバルブ、または単回使用バルブであり得る。例えば、破壊可能なバリアまたは一方向ゲートが、本発明のデバイスの貯蔵部とパターニングされた表面との間に設けられ得る。すぐに使用できる状態のとき、バリアを破壊するかまたはゲートを開くことにより、薬剤のマイクロニードル表面への流動を可能にし得る。本発明のデバイスに使用される他のバルブまたはゲートは、該デバイスによる分子の流動を選択的に開始、調節または停止するように、熱的、電気化学的、機械的、または電磁的に駆動され得る。一実施形態では、前記流動は、流速制御膜を「バルブ」として使用することにより制御される。

一般的に、貯蔵部、流れ制御システム、センサシステムなどを含む当技術分野で既知の任意の送達制御システムを、本発明のデバイスに組み込むことができる。例として、米国特許第７，２５０，０３７号明細書（特許文献３０）、米国特許第７，３１５，７５８号明細書（特許文献３１）、米国特許第７，４２９，２５８号明細書（特許文献３２）、米国特許第７，５８２，０６９号明細書（特許文献３３）、米国特許第７，６１１，４８１号明細書（特許文献３４）に、本発明のデバイスに組み込むことができる貯蔵部及び制御システムが記載されている。

本発明のデバイスによって送達され得る薬剤は、該デバイスの近くの局所領域を対象としたものであってもよいし、より広範な分布を対象としたものであってもよい。例えば、一実施形態では、本発明のデバイスは、例えば変形性関節症または関節リウマチの治療において、疼痛管理または炎症管理のために関節付近の局所領域に薬剤を送達することができる。

本発明のデバイスのナノトポグラフィは、異物反応及び免疫反応を最小化しつつ、薬剤の送達を向上させることができる。このことは、核膜へのオリゴヌクレオチド及び他の治療薬の送達を考慮する場合に特に有益であることが分かるであろう。従来から、核膜への物質（例えば、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉなど）の送達に問題のあることが知られている。というのも、エンドサイトーシスが達成されたときでさえ、恐らくは異物反応及び免疫反応のせいで、核膜への適切なエンドソーム送達が難しいことが分かっているからである。細胞質内に取り込まれると、被送達物質は、多くの場合、後期エンドソームを経て再利用されるか、リソソーム内で分解される。開示されている方法によれば、マイクロニードルとＥＣＭとの相互作用により、エンドサイトーシスの後に細胞内での異物反応を防止し、核への物質の送達を促進することができる。

タンパク質治療薬の送達は、同様に問題のあることが証明されている。例えば、タンパク質治療薬などの高分子量薬剤の送達は、皮膚の天然バリアが原因で、経皮送達経路には困難であることが分かっている。マイクロニードル上のナノトポグラフィの存在は、ＥＣＭの熱力学に有利に影響を及ぼしかつタンパク質治療薬の送達効率及び取り込みを向上させることができる。本明細書において、「タンパク質治療薬」なる用語は、一般的に、任意の生物学的に活性なタンパク質性化合物を指し、これらに限定しないが、天然化合物、合成化合物、組み換え化合物、融合タンパク質、キメラなど、あるいは、２０個の標準的アミノ酸及び／または合成アミノ酸を含む化合物が含まれる。例えば、本発明のデバイスを顆粒層内またはその近傍に位置させることによってタイトジャンクション（密着結合）を開くことができ、それにより、高分子量薬剤の傍細胞輸送が可能になる。一実施形態では、本発明のデバイスは、高分子量薬剤（例えば、約４００Ｄａ以上、約１０Ｄａ以上、約２０Ｄａ以上、または約１００Ｄａ以上、例えば約１５０Ｄａ以上の分子量を有する薬剤）の経皮送達に用いることができる。加えて、本発明のデバイスの表面積対体積比の変化を利用してデバイスの表面でのタンパク質吸着を変化させることができ、それにより今度は、物質の送達及び細胞取り込みを変化させることができる。このようにして、デバイスの表面積／体積比の最適化を通じて特定の物質の送達を最適化することができる。

低分子量薬剤の送達を考慮する場合でも、本発明のデバイスと皮膚結合組織の成分との相互作用、並びにそれに伴う異物反応の減少及び該領域の局所的な化学ポテンシャルの向上に起因して、本発明のデバイスは送達効率の向上及び取り込みの改善を提供し得る。

当然ながら、本発明のデバイスは、標的指向性を有する薬剤送達に限定されるものではない。薬剤の全身送達も、本発明のデバイスを介して患者（被験体）から薬剤を取り除く場合と同様に、本発明に含まれる。

本発明のデバイスを用いて送達され得る薬剤には、特に制限はない。薬剤は、インスリン、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）、ＴＮＦ−α、抗ウイルス薬などのタンパク性医薬品；プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ヌクレオシド抗癌薬、ワクチンなどを含むポリヌクレオチド薬；アルカロイド、グリコシド、フェノールなどの小分子薬剤を含み得る。薬剤は、抗感染薬、ホルモン、強心作用または血流を調整する薬剤、疼痛管理薬などを含み得る。本発明に従って送達され得るさらに他の物質は、疾患の予防、診断、緩和、治療または治癒に有用な薬剤である。薬剤の非限定的な例として、抗血管新生薬、抗鬱薬、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、抗炎症性薬、ブトルファノール、カルシトニン及び類似体、ＣＯＸ−ＩＩ阻害薬、皮膚病薬、ドーパミンアゴニスト及びアンタゴニスト、エンケファリン及び他のオピオイドペプチド、上皮成長因子、エリトロポエチン及び類似体、卵胞刺激ホルモン、グルカゴン、成長ホルモン及び類似体（成長ホルモン放出ホルモンを含む）、成長ホルモンアンタゴニスト、ヘパリン、ヒルジン及びヒルジン類似体（ヒルログなど）、ＩｇＥ抑制因子及び他のタンパク質阻害薬、免疫抑制薬、インスリン、インシュリノトロピン（insulinotropin）及び類似体、インターフェロン、インターロイキン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン及び類似体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、動揺病（乗り物酔い）止め製剤、筋肉弛緩薬、麻薬性鎮痛薬、ニコチン、非ステロイド系抗炎症薬、オリゴ糖、副甲状腺ホルモン及び類似体、副甲状腺ホルモンアンタゴニスト、プロスタグランジンアンタゴニスト、プロスタグランジン、スコポラミン、鎮静薬、セロトニンアゴニスト及びアンタゴニスト、性機能低下、組織プラスミノーゲン活性化因子、精神安定薬、担体／アジュバント含有または不含ワクチン、血管拡張薬、主要診断薬（ツベルクリン及び米国特許第６，５６９，１４３号明細書（特許文献３５）に記載されているような他の過敏症薬など）が挙げられる。特許文献３５の全内容は、引用を以て本明細書の一部となす。ワクチン製剤は、ヒト病原体に対する、または他のウイルス病原体からの、免疫反応を誘発することができる抗原または抗原組成を含み得る。

１つの好適な実施形態では、関節リウマチなどの慢性疾患の治療において、薬剤の定常流を、それを必要とする患者に送達するために、本発明のデバイスを用いることができる。開示されているデバイスにより送達可能なＲＡ薬は、症状抑制化合物、例えば鎮痛薬及び抗炎症薬（ステロイド系抗炎症薬及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の両者）並びに疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）を含み得る。

本発明のデバイスは、鎮痛薬や抗炎症薬などの症状抑制化合物や、生物学的ＤＭＡＲＤを含むＤＭＡＲＤｓを保持しかつ送達することができる。如何なる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明のデバイスの表面に形成されたナノメートルスケールの構造体は、皮膚バリアを透過しての症状抑制化合物の送達を向上させると考えられる。本発明のデバイスを使用することにより、ＲＡ薬を一定濃度で或る徐放期間にわたって送達することができる。本発明のデバイスは、経口送達や注射を含む以前から知られているＲＡ薬送達方法を用いる場合によく見られる濃度の初期バーストを防止することができる。

本発明のデバイスに組み込まれ得るＲＡ薬には、これらに限定しないが、１若しくは複数の鎮痛薬、抗炎症薬、ＤＭＡＲＤｓ、ハーブをベースにした薬剤、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。当然ながら、特定の化合物は、大まかに、本明細書で説明する１以上の一般的なカテゴリに分類することができる。例えば、多くの化合物は、鎮痛薬と抗炎症薬の両方の機能を果たす；同様に、ハーブをベースにした薬剤は、ＤＭＡＲＤ及び抗炎症薬の機能を果たし得る。さらに、単一カテゴリに分類され得る複数の化合物を、本発明のデバイスに組み込んでもよい。例えば、本発明のデバイスは、アセトアミノフェン及びコデイン、またはアセトアミノフェン及びヒドロコドン（バイコディン）などの複数の鎮痛薬を含み得る。

本発明のデバイスに組み込まれ得る鎮痛薬及び／またはＮＳＡＩＤｓの例には、薬局で入手可能な（ＯＴＣ）比較的低用量の鎮痛薬が含まれ、そのようなものとしては、アセトアミド（アセトアミノフェンまたはパラセタモール）、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウムなどが挙げられる。本発明のデバイスに組み込まれ得る処方鎮痛薬及び／または抗炎症薬には、これらに限定しないが、処方を要する濃度のＯＴＣ鎮痛薬、セレコキシブ、スリンダク、オキサプロジン、サルサラート、ピロキシカム、インドメタシン、エトドラク、メロキシカム、ナブメトン、ケトロラック、ケトロラックトロメタミン、トルメチン、ジクロフェナク、ジプロクァロン、ジフルニサルが含まれ得る。麻薬性鎮痛薬には、コデイン、ヒドロコドン、オキシコドン、フェンタニル、プロポキシフェンが含まれ得る。

本発明のデバイスは、グルココルチコイドを主成分とする１若しくは複数のステロイド系抗炎症性化合物を含み得、そのようなものとしては、これらに限定しないが、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、アルドステロンが挙げられる。

本発明のデバイスに含まれ得るＤＭＡＲＤｓは、低分子薬剤及び生物学的薬剤の両方を包含し得る。ＤＭＡＲＤｓは、化学的に合成してもよいし、または、遺伝子工学プロセス（例えば組み換え技術）によって作製してもよい。

本明細書に包含される化学的に合成されるＤＭＡＲＤｓには、これらに限定しないが、アザチオプリン、シクロスポリン（シクロスポリン、シクロスポリンＡ）、Ｄ−ペニシラミン、金塩（例えば、オーラノフィン、アウロチオマレイン酸ナトリウム（Myocrism））、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、スルファサラジン、シクロホスファミドが含まれる。生物学的ＤＭＡＲＤｓには、これらに限定しないが、ＴＮＦα阻害薬、例えば、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））、インフリキシマブ（レミケード（登録商標））、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））、セルトリズマブペゴール（シムジア（登録商標））、ゴリムマブ（シンポニー（商標商標））；ＩＬ−１阻害薬、例えばアナキンラ（キネレット（登録商標））；Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体、例えば、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））；Ｔ細胞副刺激阻害薬、例えばアバタセプト（オレンシア（登録商標））；ＩＬ−６阻害薬、例えばトシリズマブ（ロアクテムラ（RoActemra）（登録商標）、アクテムラ（登録商標））；カルシニューリン阻害薬、例えばタクロリムス（プログラフ（登録商標））が含まれる。

本発明のデバイスには、１若しくは複数の、ハーブをベースにした薬剤や他の天然由来の薬剤が組み込まれ得る。例えば、アユルベーダ化合物、例えばボスウェル酸（ボスウェリア・セラータの抽出物）またはクルクミン（ウコン由来のクルクミノイド）や、他の天然由来化合物、例えばグルコサミン・サルフェイト（甲殻類の外骨格の加水分解または穀物の発酵により生成される）が、本発明のデバイスに組み込まれ得る。

本発明のデバイスには、複数のＲＡ薬が組み込まれ得る。例えば、本発明のデバイスは、鎮痛薬及び／または抗炎症薬に加えて、ＤＭＡＲＤｓの組み合わせを含み得る。ＤＭＡＲＤｓの一般的な組み合わせには、例えば、メトトレキサートとヒドロキシクロロキンとの組み合わせ、メトトレキサートとスルファサラジンとの組み合わせ、スルファサラジンとヒドロキシクロロキンとの組み合わせ、または、これらの３つのＤＭＡＲＤｓの全てすなわちメトトレキサートとスルファサラジンとヒドロキシクロロキンとの組み合わせが含まれる。

本発明のデバイスには、有益なことに、高分子量化合物及び／または低分子量化合物が組み込まれ得る。例えば、従来から、皮膚の天然バリアが原因でタンパク質治療薬の経皮送達に問題のあることが知られている。如何なる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明のデバイスのマイクロニードルのナノトポグラフィの存在は、有益なことに、皮膚バリアの細胞及びＥＣＭと相互作用して、タンパク質治療薬の送達効率及び取り込みを向上させ得る。例えば、本発明のデバイスを顆粒層内またはその近傍に位置させることによってタイトジャンクション（密着結合）を開くことができ、それにより、高分子量薬剤の傍細胞輸送を可能にする。本明細書で使用される高分子量薬剤なる用語は、一般的に、約４００Ｄａ以上、約１０Ｄａ以上、約２０Ｄａ以上、または約１００Ｄａ以上の高分子量を有する薬剤を指す。

より分子量の薬剤の送達を考慮する場合でも、本発明のデバイスと皮膚結合組織の成分との相互作用、並びにそれに伴う異物反応の減少及び該領域の局所的な化学ポテンシャルの向上に起因して、本発明のデバイスは送達効率の向上及び取り込みの改善を提供し得る。加えて、本発明のデバイスは、薬剤を一定濃度で所定の徐放時間に渡って送達することができ、このことは有益で有り得る。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、より良く理解できるであろう。

実施例１

電気回路の設計及び製造に用いられるものと同様のフォトリソグラフィ技術を用いて、幾つかの異なるモールドを準備した。個々のプロセスステップは、当分野で一般的に知られており、既に説明されている。

初めに、シリコン基板を、アセトン、メタノール及びイソプロピルアルコールにより洗浄することによって準備し、次に、化学蒸着プロセスに従って２５８ナノメートル（ｎｍ）の二酸化ケイ素層でコーティングした。

次に、日本電子（ＪＥＯＬ）製のＪＢＸ−９３００ＦＳ電子線描画（ＥＢＬ）装置を用いて、当分野で既知であるような電子ビームリソグラフィパターニングステップによって各基板上にパターンを形成した。処理条件は、以下の通りであった。
ビーム電流＝１１ｎＡ
加速電圧＝１００ｋＶ
ショットピッチ＝１４ｎｍ
ドーズ量＝２６０ｍＣ／ｃｍ^２
レジスト＝ＺＥＰ５２０Ａ，厚さ〜３３０ｎｍ
現像液＝酢酸ｎ−アミル
現像＝２分間浸漬した後、３０秒間イソプロピルアルコールでリンス。

その後、ＳＴＳ社の改良型酸化物エッチング（Advanced Oxide Etch：ＡＯＥ）装置を用いて二酸化ケイ素エッチングを行った。エッチング時間は５０秒間で、Ｈｅ流量５５標準立方センチメートル毎分（ｓｃｃｍ）、ＣＦ_４流量２２ｓｃｃｍ、Ｃ_４Ｆ_８流量２０ｓｃｃｍを用い、混合ガスの圧力４ｍＴｏｒｒ、コイル４００Ｗ、ＲＩＥ装置の電力２００Ｗ、ＤＣバイアス４０４〜４１１Ｖあった。

続いて、ＳＴＳ社の酸化ケイ素エッチング（silicon oxide etch：ＳＯＥ）装置を用いてシリコンエッチングを行った。エッチング時間は２分間で、２０ｓｃｃｍのＣｌ_２及び５ｓｃｃｍのＡｒを用い、混合ガスの圧力５ｍＴｏｒｒ、コイル６００Ｗ、ＲＩＥ装置の電力５０Ｗ、ＤＣバイアス９６〜１０２Ｖであった。シリコンエッチング深さは５００ｎｍであった。

残りの酸化物を除去するために、緩衝酸化物エッチング液（buffered oxide etchant：ＢＯＥ）を用いた。この除去は、３分間のＢＯＥ浸漬と、それに続く純水洗浄とを含むものであった。

オブデュキャット社（Obducat）製のナノインプリンタNIL-Eitre（登録商標）6を用いて、様々なポリマー基板上にナノパターンを形成した。冷却剤として外部水を用いた。利用したＵＶモジュールは、１．８Ｗ／ｃｍ^２で波長２００〜１０００ｎｍの単一パルスランプであった。２５０〜４００ｎｍのＵＶフィルタを用いた。最大温度２００℃及び圧力８０Ｂａｒで露光面積は６インチであった。ナノインプリンタは、半自動分離装置及び自動制御デモールディングを含んでいた。

ナノインプリントされたフィルムをモールドから離型しやすくするために、モールドをトリデカ−（１，１，２，２−テトラヒドロ）−オクチルトリクロロシラン（Ｆ_１３−ＴＣＳ）で処理した。モールドを処理するために、先ずアセトン、メタノール及びイソプロピルアルコールの洗浄液によりシリコンモールドをきれいにし、窒素ガスにより乾燥させた。ペトリ皿を窒素雰囲気中で熱板上に置き、ペトリ皿に１〜５ｍｌのＦ_１３−ＴＣＳを加えた。シリコンモールドをペトリ皿に置き、１０〜１５分間蓋をしてＦ_１３−ＴＣＳ蒸気でシリコンモールドを湿潤させてから、モールドを除去した。

下表２に記載されている５つの異なるポリマーを用いて、様々なナノトポグラフィ形状を形成した。

幾つかの異なるナノトポグラフィパターンを形成した。それらの略図を図２５Ａ〜図２５Ｄに示す。図２５Ｅに示すナノトポグラフィパターンは、日本国東京都のＮＴＴアドバンステクノロジ株式会社から購入した平坦基板の表面である。これらのパターンを、ＤＮ１（図２５Ａ）、ＤＮ２（図２５Ｂ）、ＤＮ３（図２５Ｃ）、ＤＮ４（図２５Ｄ）及びＮＴＴＡＴ２（図２５Ｅ）と名付けた。モールドのＳＥＭ像を図２５Ａ、図２５Ｂ及び図２５Ｃに示し、フィルムのＳＥＭ像を図２５Ｄ及び図２５Ｅに示している。図８は、図２５Ａ（ＤＮ１）のモールドを用いて形成したナノパターニングされたフィルムを示している。この特定のフィルムにおいては、先述のように温度変化によってポリマーのフィーチャが描かれた。図２４Ｅのパターンの表面粗さは、３４ｎｍであることが分かった。

このナノインプリンティングプロセスに従って、図７の（Ｃ）及び（Ｄ）に示されているパターンも形成した。このパターンには、図のように複数のピラー７２及びピラー６２が含まれていた。より大きなピラー７２は、直径３．５マイクロメートル（μｍ）、高さ３０μｍ、中心間距離６．８μｍに形成された。ピラー６２は、高さ５００ｎｍ、直径２００ｎｍ、中心間距離２５０ｎｍであった。

ポリプロピレンフィルムとともに用いたナノインプリンティングプロセス条件を下表３に示す。

実施例２

様々な異なるパターンを含みかつポリスチレン（ＰＳ）またはポリプロピレン（ＰＰ）のいずれかから形成されている実施例１に上記したようなフィルムを形成した。下層基板は、厚さが異なる。用いたパターンは、実施例１に記載した形成プロセスを利用するＤＮ２、ＤＮ３またはＤＮ４のいずれかであった。このように名付けられたパターンを有する様々な異なるサイズのフィーチャを形成するために、孔の深さ及びフィーチャが異なるパターンモールドを用いた。モールドとして０．６μｍのミリポアポリカーボネートフィルタを用い、サンプル８番（ＢＢ１と名付けた）を形成した。このフィルタの上に２５μｍのポリプロピレンフィルムを載せ、その後、ポリプロピレンがフィルタの孔に流れ込むことができるようにポリプロピレンを加熱して融解させた。それから、モールドを冷却し、塩化メチレン溶媒を用いてポリカーボネートモールドを溶解した。

形成されたフィルムのＳＥＭを図２６〜図３４に示し、形成されたフィルムの特徴を下表４に要約する。

各サンプルに対して、ＡＦＭを用いてフィルムの特徴付けを行った。特徴付けに含まれていたのは、走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）の形成、表面粗さの決定、最大測定フィーチャ高さの決定及びフラクタル次元の決定であった。

用いた原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）プローブは、マイクロマッシュ社（μMasch）製のシリーズ１６シリコンプローブ及びカンチレバーであった。カンチレバーは、共振周波数１７０ｋＨｚ、バネ定数４０Ｎ／ｍ、長さ２３０±５μｍ、幅４０±３μｍ、厚さ７．０±０．５μｍであった。プローブチップはリンをドープしたｎ型シリコンプローブであり、その標準的なプローブチップ半径は１０ｎｍ、チップ全体の円錐角は４０°、チップ高は２０〜２５μｍ、バルク抵抗率は０．０１〜０．０５Ω−ｃｍであった。

表４に記載されている表面粗さ値は、ＩＳＯ２５１７８シリーズにおいて定義される表面面積粗さパラメータの算術平均高さである。

フーリエ振幅スペクトルを解析することによって、異なる角度に対するフラクタル次元を計算した；異なる角度及び振幅に対して、フーリエプロファイルを抽出し、周波数及び振幅座標の対数を計算した。その後、各方向に対するフラクタル次元Ｄを次式の如く計算する。

Ｄ＝（６＋ｓ）／２

ここで、ｓは両対数曲線の（負の）傾きである。これにより得られるフラクタル次元は、全方向の平均である。

フラクタル次元は、両対数関数の適用によって２Ｄフーリエスペクトルから評価することもできる。表面がフラクタルである場合、両対数グラフは、負の傾きを持ち高度に線形であるはずである（例えば、非特許文献２７を参照）。

実施例３

６ウェルプレート内で、濃度２５，０００細胞／ｃｍ^２、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭでヒト皮膚ＨａＣａＴ上皮細胞を成長させた。プレートは、上記実施例１に記載したように形成され、ＤＮ１、ＤＮ２（表３のサンプル４）、ＤＮ３と名付けられた、ナノパターニングされたポリプロピレンフィルム、または未処理の表面のいずれかをウェルの底部に有していた。ナノパターニングされたフィルムをシアノアクリレートにより適所に接着した。

１ウェル当たり１ｍＬのトリプシンを用いて１０分間細胞を表面から引き離し、１ｍＬの成長培地（同上）によりクエンチし、その後、マイクロ遠心チューブに移して１２００ｒｐｍで７分間遠心してペレット状にした。

キアゲン（Qiagen）社製のRneasyミニプレップ・キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って、ペレット状にした細胞からＲＮＡを単離した。手短に言えば、細胞を溶解させ、エタノールと混合し、カラム内で遠沈した。その後、溶解物を３回洗浄し、DNaseで処理して４０ｍｌ容量で溶出した。

ＳＡバイオサイエンス社（SA Biosciences）製のＲＴ用ファーストストランド・キットを用いて単離したＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。手短に言えば、ＲＮＡを４２℃で５分間DNaseで再度処理した。次に、ランダムプライマー及び逆転写酵素を加え、４２℃で１５分間インキュベートし、その後９５℃で５分間インキュベートして反応を停止させた。

その後、ＩＬ１−β、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ−１、ＰＤＧＦＡ、ＧＡＰＤＨ、ＨＤＧＣ、ＲＴＣ及びＰＰＣのためのプライマーを使い、ＳＡバイオサイエンス社製のＲＴプロファイラ（RT profiler）カスタムＰＣＲアレイを用いて、ｃＤＮＡサンプルに対してｑＰＣＲを行った。手短に言えば、ｃＤＮＡをサイバーグリーン（SYBR green）及び水と混合し、次に、対象の遺伝子に対する適切なセンス及びアンチセンス・プライマー対を予め固定したＰＣＲプレートに、加えた。その後、９５℃に加熱したＡＢＩ社製StepOnePlus（登録商標）ＰＣＲシステム上でプレートのラン（測定）を１０分間行い、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４５サイクル行った。

内部対照（internal control）としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣｔ解析を行った。活性及びゲノムＤＮＡ混入のための追加内部対照として、ＨＤＧＣ、ＲＴＣ及びＰＰＣレベルを用いた。

その後、一元配置分散分析法（One-way ANOVA）及びテューキー２点法（Tukey's 2-point test）を用いて、表面間の差の統計的有意性を判定した。

下表５は、ポリプロピレンフィルム上に作製されたナノインプリントされた構造における発現の倍率変化（fold change）として得られたタンパク質発現と、構造化されていないフィルムにおける発現とを比較して表している。

実施例４

実施例３に記載の方法を用いて、ヒト皮膚ＨａＣａＴ上皮細胞を様々な異なるポリプロピレン（ＰＰ）またはポリスチレン（ＰＳ）フィルム上で成長させ、上記のように形成しかつパターニングしたときの、ヒト皮膚ＨａＣａＴ上皮細胞由来の幾つかの異なるサイトカインに対する発現レベルを調べた。各サイトカインに対する発現レベルと、標準組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上で培養されかつリポ多糖（ＬＰＳ）により誘発された同じ細胞型由来のサイトカインの発現レベルとを比較した。結果を下表６に示す。

上記したようなＤＮ２パターンを有するナノパターニングされたポリプロピレンフィルム上で成長させた細胞（表４のサンプル４）は、ＴＣＰＳと比べて、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１０及びＭＩＰ−１βの発現を上方制御し、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＭＩＧ、ＫＣ、ＩＬ−２、ＭＩＰ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６及びＩＬ−１αの発現を下方制御することが判明した。

幾つかの他のフィルムの、様々なサイトカインの細胞発現に対する効果を調べた。各フィルムを以下のように名付けた。
１−ＤＮ２パターンを有する７５μｍポリスチレンフィルム（表４のサンプル３）
２−ＤＮ３パターンを有する７５μｍポリスチレンフィルム（表４のサンプル１）
３−ＤＮ４パターンを有する７５μｍポリスチレンフィルム（表４のサンプル６）
４−インプリントされていない７５μｍポリスチレンフィルム
５−ＤＮ２パターンを有する２５．４μｍポリプロピレンフィルム（表４のサンプル４）
６−ＤＮ４パターンを有する２５．４μｍポリプロピレンフィルム（表４のサンプル７）
７−ＤＮ２パターンを有する５μｍポリプロピレンフィルム（表４のサンプル２）
８−ＢＢ１ポリプロピレンフィルム（表４のサンプル８）
９−インプリントされていない２５．４μｍポリプロピレンフィルム
１０−インプリントされていない５μｍポリプロピレンフィルム

結果を下表６に示す。結果は、以下のように与えられる。
−− 発現レベルは検査閾値を下回った
―― 発現レベルはＴＣＰＳの発現レベルを下回った
＝ 発現レベルはＴＣＰＳの発現レベルと同様であった
＋ 発現レベルはＴＣＰＳの発現レベルを上回ったが、ＬＰＳに誘発されたときの発現レベルを下回った
＋＋ 発現レベルはＬＰＳ誘発の発現レベルと同様であった
＋＋＋ 発現レベルはＬＰＳ誘発の発現レベルを上回った

実施例５

６ウェルプレート内で、濃度２５，０００細胞／ｃｍ^２、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭでヒト皮膚ＨａＣａＴ上皮細胞を成長させた。プレートは、上記実施例１に記載したように形成され、ＤＮ１、ＤＮ２（表３のサンプル４）、ＤＮ３と名付けられたポリプロピレンフィルム、または未処理の表面のいずれかをウェルの底部に有していた。フィルムをシアノアクリレートにより適所に接着した。

各ウェルから培地を採取し、ミリポア社（Millipore）製のミリプレックス・マップ・キットによりサイトカイン産生を解析した。ＩＬ１−β、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＧＧＦ−ＡＢ／ＢＢ及びＴＮＦ−αを検出するためにビーズを用いた。バイオ・ラッド社（BioRad）製バイオプレックス（BioPlex machine）にて測定を行った。手短に言えば、培地を、フィルタを備えたマイクロプレートウェル内に入れた。主要ビーズを加え、振盪させながら室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、検出抗体を加えて振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。その後、ストレプトアビジン−フィコエリスリンを加え、室温でさらに３０分間インキュベートした。それから、プレートを洗浄し、ビーズをアッセイ緩衝液中で再懸濁し、バイオプレックスを使って蛍光強度の中央値を解析した。

実施例６

上記したようにパターニングされたフィルムがＣａｃｏ−２細胞単層（ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞）に与える透過効果を判定した。

上記実施例１に記載したように形成したフィルム（ＤＮ２、ＤＮ３及びＤＮ４と名付けられたパターンを有して形成されたフィルムを含む）を用いた。第４のフィルムすなわちＢＢ１（上記実施例２で説明済み）と名付けられたフィルムも用いた。フィルムタイプ別に複数の例でプロトコールを実行した。

各フィルムに関して準拠した一般プロトコールは以下の通りであった。

材料
セルカルチャーインサート０．４ｕｍ孔径ＨＤＰＥＴメンブレン（BD Falcon）
２４ウェルプレート（BD Falcon）
Ｃａｃｏ−２培地
上記したようなナノ構造メンブレン
ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Sigma Aldrich）
ＢＳＡ−ＦＩＴＣ（Sigma Aldrich）
フェノールレッド不含ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地（Invitrogen）
ＴＥＥＲ電圧計
加温したＰＢＳ
黒色９６ウェルプレート
アルミ箔

プロトコール
１．透過性アッセイが行われる２週間前に、コラーゲンコーティングしたウェルインサート上にＣａｃｏ−２細胞を播く。１００％エタノールとコラーゲンの体積比を１：１にすることによって、コラーゲンコーティングプレートを作製する。無菌フード内で表面を乾燥するまで一晩乾燥させる。
２．フェノールレッド不含α−ＭＥＭ培地において対象のＦＩＴＣ共役分子（ＢＳＡ、ＩｇＧなど）の溶液を０．１ｍｇ／ｍＬ作る。アルミ箔にくるんで光から保護する。
３．抵抗を測定することによって、Ｃａｃｏ−２細胞の密集度をチェックする。密集度に対して抵抗は約〜６００Ωであるべきである。
４．頂端（アピカル）側及び基底外側においてセルカルチャーインサートから古い培地を吸引する。ＰＢＳでリンスして、残りのフェノールレッド色素を除去する。
５．各インサートの頂端側において０．５ｍＬのＦＩＴＣ共役溶液を加える。
６．セルカルチャーインサートを備えた別の２４ウェルプレートにおいて、０．５ｍＬの加温したＰＢＳを加える。
７．インサートをＰＢＳの付着したプレートに移す。キムワイプでインサートの底部を拭き取ることにより、残りのフェノールレッドを除去する。
８．ｔ＝０の時点：インサートの基底外側から７５ｍＬを採取し、底部が黒色の９６ウェルプレートに移す。上記体積を７５ｍＬの加温したＰＢＳに置き換える。「チョップスティック型」電極を用いて各ウェルの抵抗を記録する。
９．メンブレンを適切にラベルを付けたウェルに注意深く加える。対照は、インプリントされていないメンブレン及び細胞単独である。顕微鏡下で、メンブレンが細胞と直接接触することをチェックする。細胞との接触を示すはっきりした円を見ることができるはずである。
１０．ｔ＝０の時点：ステップ７を繰り返し、その後インキュベータ内に１時間載置する。
１１．ｔ＝１の時点：ステップ７を繰り返し、その後インキュベータ内に１時間載置する。
１２．ｔ＝２の時点：ステップ７を繰り返す。
１３．分光蛍光光度計プレートリーダーを用いて蛍光シグナルを測定する。ＦＩＴＣ（励起＝４９０ｎｍ、発光＝５２０ｎｍ）

結果
使用したフィルム及び得られた結果を要約したものを下表７に示す。

弾性率の決定は、非特許文献２８に記載されているような当分野で既知の標準方法に従って行った。

標準的技法（例えば、非特許文献２９を参照）に従って、表面上に水滴を垂らすことによって接触角を測定した。

図３５は、本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の透過率に対する効果をグラフで示している。フィルムパターンには、図のように、ＤＮ２パターン（サンプル３番）、ＤＮ３パターン（サンプル５番）及びＤＮ４パターン（サンプル６番）が含まれていた。さらに、パターニングされていないフィルムの結果（図３５にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムのない細胞層の結果（図３５に「細胞」と示されている）も示す。これらの結果は、透過率の倍率増加として、時間［hours］単位で測定した時間の関数として示されている。

図３６Ａ及び図３６Ｂは、本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上の細胞単層における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の透過率に対する効果をグラフで示している。フィルムパターンには、図のように、ＤＮ２パターン（サンプル３番）、ＤＮ３パターン（サンプル５番）及びＤＮ４パターン（サンプル６番）が含まれていた。さらに、パターニングされていないフィルムの結果（図３６Ａ及び図３６ＢにＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムのない細胞層の結果（図３６Ａ及び図３６Ｂに「細胞」と示されている）も示す。これら２つの図は、２つの異なる時間スケールでデータを示している。

蛍光光度計上でＢＳＡシグナルを読み取り、分光光度計上でＩｇＧシグナルを読み取った。

図３７Ａ及び図３７Ｂは、ＤＮ４がパターニングされたポリスチレン表面（サンプル６番）上の細胞単層内外のＩｇＧの傍細胞及び経細胞輸送をそれぞれ示す３次元生死判別（3D live/dead）蛍光染色像である。

図３８は、本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層におけるＢＳＡの透過率に対する効果をグラフで示している。パターンには、図のように、ＢＢ１（サンプル８番）、ＤＮ２（サンプル４番）及びＤＮ４（サンプル７番）が含まれていた。さらに、パターニングされていないフィルムの結果（図３８にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムのない細胞層の結果（図３８に「細胞」と示されている）も示す。

図３９は、本明細書に記載のナノパターンがパターニングされたポリプロピレンフィルム上の細胞単層におけるＩｇＧの透過率に対する効果をグラフで示している。パターンには、図のように、ＢＢ１（サンプル８番）、ＤＮ２（サンプル４番）及びＤＮ４（サンプル７番）が含まれていた。さらに、パターニングされていないフィルムの結果（図３９にＰＳＵＩと示されている）及び隣接フィルムのない細胞層の結果（図３９に「細胞」と示されている）も示す。

図４０Ａ及び図４０Ｂは、ポリプロピレンＤＮ２がパターニングされた表面（サンプル４番）上の細胞単層内外のＩｇＧの傍細胞輸送を示す３次元生死判別蛍光染色像である。

図４１の（Ａ）〜（Ｆ）は、ナノパターニングされた表面上で培養されたＣａｃｏ−２細胞の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。具体的には、図４１の（Ａ）及び（Ｂ）は、平坦ポリスチレン対照フィルム上のＣａｃｏ−２細胞を示している。図４１の（Ｃ）及び（Ｄ）は、上記したようなＤＮ２パターン（サンプル３番）がパターニングされたポリスチレンフィルム上のＣａｃｏ−２細胞を示しており、図４１の（Ｅ）及び（Ｆ）は、上記したようなＤＮ３（サンプル５番）パターンがパターニングされたポリスチレンフィルム上のＣａｃｏ−２細胞を示している。

実施例７

実施例６に記載の方法を用いて、融合タンパク質治療薬エタネルセプト（エンブレル（登録商標）という商品名で販売されている）のＣａｃｏ−２細胞単層透過性を調べた。図４２は、ポリプロピレン（ＤＮ２ ＰＰ−表４のサンプル４）及びポリスチレン（ＤＮ２ ＰＳ−表４のサンプル３及び、ＤＮ３ ＰＳ−表４のサンプル１）の両者を含む幾つかの異なるパターニングされた基板上で成長させた細胞層の結果、並びにインプリントされていないポリスチレンメンブレン（ＰＳＵＩ）の結果及びメンブレン（細胞）のない細胞層の結果をグラフで示している。これらの結果は、初期透過率からの経時的倍率変化として示されている。図４３は、図４２の基板及び細胞層に対して、ウェルにメンブレンを追加した後の、２時間（ｔ＝２）の時点での、初期時点ｔ＝０からの透過率の倍率増加を示している。

実施例８

ナノパターニングされた表面を含むマイクロニードルのアレイを形成した。初めに、フォトリソグラフィプロセスによって、図２に示したマイクロニードルのアレイをシリコンウェーハ上に形成した。各ニードルは、ニードルのベースに設けられた１つのダイ貫通孔（図２には見えない）に整合されかつ互いに相反する側に配置された２つの側面チャンネルを含んでいた。

シリコンベースのウェーハ上に、標準的なマイクロマシニングプロセスに従ってマイクロニードルを形成した。ウェーハにレジスト及び／または酸化物層を重ねて層状にし、続いて、標準方法に従って、選択エッチング（酸化物エッチング、ＤＲＩＥエッチング、（iso）エッチング）、レジスト除去、酸化物除去及び、リソグラフィ技術（例えば、イソ（iso）リソグラフィ、ホール（孔）リソグラフィ、スリットリソグラフィ）を行うことにより、マイクロニードルのアレイを形成した。

マイクロニードルアレイの形成に続き、マイクロニードルアレイ上に、例１で述べたようなＤＮ２パターンが形成された５μｍのポリプロピレンフィルムを載せた。その特徴は、表４中のサンプル２に説明されている。加熱された真空箱（３インチＨ_２Ｏ真空）上にウェーハ／フィルム構造を高温（１３０℃）で１時間保持し、フィルムのナノパターニングされた表面を維持しながらマイクロニードルの表面を覆うフィルムをゆっくりと引っ張った。

図４４は、マイクロニードルのアレイの上面を覆うフィルムを示しており、図４５は、ニードルの上面を覆うナノパターニングされたフィルムを含むアレイのうちの１本のニードルの拡大図である。

実施例９

実施例８に記載したように形成されたマイクロニードルアレイを含む経皮パッチを形成した。パッチの形成は、マイクロニードルアレイ上にＤＮ２パターンまたはＤＮ３パターンのいずれかを用いて行った。マイクロニードルに適用されたパターンを画定するフィルムを下表８において説明する。フィルム１は表４のサンプル２番に等しく、フィルム２は表４のサンプル９番に等しい。

対照パッチも形成した。対照パッチには、マイクロニードルのアレイに適用した後のフィルム上にパターンを形成しなかった。薬剤供給業者からの指示に従って、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））の経皮製剤及び皮下製剤を調製した。４ｍｇ／ｋｇの皮下薬剤投与を促進するために、皮下投与製剤（陽性対照用）を調製した。所望の投与量２００ｍｇ／ｋｇを２４時間で達成するように、経皮投与のためのエンブレル（登録商標）の濃度を調整した。

この研究では、全部で１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（番号＃１〜＃１０を割り当てた）を用い、下表９に示すように、そのうち８匹にエンブレル（登録商標）を経皮投与し（群１）、２匹にエンブレル（登録商標）を皮下投与した（群２）。剪毛皮膚領域に経皮パッチを貼り付け、皮膚にパッチを貼り付けた直後にマイクロニードル先端付近に孔を形成した。

使用した経皮パッチには、表面上にナノトポグラフィ（上記したようなＤＮ２及びＤＮ３パターン）を画定するパッチ及びナノトポグラフィのパターンなしのパッチの両者が含まれていた。

表９に示した時点で全血のサンプルを採取した。下顎出血によって約１００〜２００ｍｌの血液を採取し、次に冷凍遠心器（４℃に設定）内で約１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。結果的に得られた血清を吸引し、血液採取／遠心分離から３０分間以内に、適切にラベルを付けたチューブに移した。チューブを凍結させ、ヒトｓＴＮＦレセプタＥＬＩＳＡキット（R&D Systems cat# DRT200）を用いてエンブレル（登録商標）のレベルの解析を行うまで、−７０℃以下で暗所に保存した。被験体に不要なストレスがかからないようにするために、同一被験体に対する２回の血液採取間の時間間隔を２４時間とした。

図４６は、表面上にナノトポグラフィを画定した経皮パッチの平均ＰＫプロファイルをグラフで示している。ナノトポグラフィをマイクロニードル経皮パッチと組み合わせることの全体的効果を表すために、ナノトポグラフィを含むパッチ全てに対する結果の平均を用いた。図から分かるように、貼付から最初の２時間以内に血清レベルがパッチ面積８００ｎｇ／ｍＬ／ｃｍ^２超まで急上昇した。続いて、血清レベルは、貼付から２４時間以内に無視できる程度にまで徐々に低下した。図４６を作成するために用いたデータを下表１０に示す。

図４７Ａ及び図４７Ｂは、パッチと接触して保持されている皮膚の電子顕微鏡像の断面図を示している。これらの像は、パッチを除去した後（貼付後７２時間）に撮影した。図４７Ａのサンプルは、表面上にナノトポグラフィを含むパッチと接触させたものである。具体的には、上記したようなＤＮ２パターンをパッチの表面上に形成した。図４６Ｂのサンプルは、表面上にナノトポグラフィのパターンを画定しなかった経皮パッチと接触させたものである。図から分かるように、図４７Ｂのサンプルは、炎症の兆候及び高い密度のマクロファージの存在を示している。

実施例１０

実施例８に記載したように形成されたマイクロニードルアレイを含む経皮パッチを形成した。経皮パッチの形成は、実施例９の表８に記載したようなマイクロニードルアレイ上のＤＮ２パターンまたはＤＮ３パターンのいずれかを用いて行った。マイクロニードルのアレイを適用した後にフィルム上にパターンを形成しない対照パッチも形成した。薬剤供給業者からの指示に従って、エタネルセプト（エンブレル（登録商標））の経皮製剤及び皮下製剤を調製した。

被験体（ウサギ）に、エンブレル（登録商標）を経皮投与したか、あるいはエンブレル（登録商標）を皮下（ＳｕｂＱ）投与した。結果を図４８にグラフで示す。この図には、血清濃度がｐｇ／ｍｌ単位で時間の関数として与えられている。図４８を作成するために用いたデータを下表１１に示す。

本明細書において、本発明の主題をその具体的な実施形態に関して詳細に説明してきたが、当然のことながら、当業者は、上記記載を理解して、これらの実施形態の代替形態、変形形態及び等価形態を容易に考え出すことができる。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれと等価なものとして判断されるものとする。

Claims (21)

1. 支持体から外向きに延出するマイクロニードルのアレイを含む医療デバイスであって、
   前記マイクロニードルのうちの少なくとも１本の表面上に形成されかつ所定のパターンで配列された複数のナノ構造体を含むことを特徴とするデバイス。
2. 前記ナノ構造体が、ピラーの形状を有することを特徴とする請求項１に記載の医療デバイス。
3. 前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約５ｎｍ〜５００ｎｍの断面寸法を有するか、または約１００〜３００ｎｍの断面寸法を有するか、または略同一の断面寸法を有することを特徴とする請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の医療デバイス。
4. 前記パターンが、例えば約５００ｎｍ超程度の断面寸法を有するマイクロ構造体をさらに含み、前記ナノ構造体が、前記マイクロ構造体よりも小さい断面寸法を有することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の医療デバイス。
5. 前記マイクロ構造体の前記断面寸法より小さくかつ前記第１のナノ構造体の前記断面寸法より大きい断面寸法を有する第２のナノ構造体をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の医療デバイス。
6. 前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約５０ｎｍ〜１μｍの中心間距離を有することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の医療デバイス。
7. 互いに隣接する２つのナノ構造体の断面寸法と該２つの構造体間の中心間距離との比が、約１：１〜１：４であることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の医療デバイス。
8. 前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、互いに等距離間隔で離間されていることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医療デバイス。
9. 前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約１０ｎｍ〜２０μｍまたは約１００〜７００ｎｍの高さを有することを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の医療デバイス。
10. 前記複数のナノ構造体のうちの少なくとも一部のナノ構造体が、約０．１５〜３０または約０．２〜５のアスペクト比を有することを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の医療デバイス。
11. 前記パターンが、約１以上、例えば約１．５〜２．５程度のフラクタル次元を有することを特徴とする請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の医療デバイス。
12. 前記複数のナノ構造体を含む前記マイクロニードル表面が、以下の特性、すなわち、約１０〜２００ｎｍの平均表面粗さ、約４〜３２０ＭＰａの有効圧縮弾性率、約０．２〜５０ＭＰａの有効剪断率、約８０°〜１５０°の水接触角のうちの１若しくは複数を有することを特徴とする請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の医療デバイス。
13. 例えば約１００ｋＤａより大きな分子量を有する薬剤化合物などの薬剤化合物を保持するための貯蔵部をさらに含むことを特徴とする請求項１ないし請求項１２のいずれか１項に記載の医療デバイス。
14. 前記薬剤化合物が、例えばＴＮＦ−α阻害薬などのタンパク質治療薬であることを特徴とする請求項１３に記載の医療デバイス。
15. 前記マイクロニードルのアレイのうちの少なくとも１本のマイクロニードルが、前記薬剤化合物を送達するためのチャンネルを含むことを特徴とする請求項１ないし請求項１４のいずれか１項に記載の医療デバイス。
16. 薬剤化合物を皮下位置に送達する方法であって、
    表面上に形成されかつ或るパターンで配列された複数のナノ構造体を含みかつ前記薬剤化合物に流体連通しているマイクロニードルにより、角質層を穿刺するステップと、
    前記マイクロニードルを介しかつ角質層を透過させて前記薬剤化合物を輸送するステップとを含むことを特徴とする方法。
17. 細胞外マトリックスタンパク質、接着斑タンパク質などの原形質膜タンパク質、エンドサイトーシス媒介受容体、膜貫通タンパク質、またはこれらの組合せを、前記ナノ構造体と接触させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記ナノ構造体が、タイトジャンクションなどの細胞間結合の構造または細胞の膜伝導率の一方または両方を変更することを特徴とする請求項１６または請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記薬剤化合物が、細胞の細胞質または細胞の核膜に送達されることを特徴とする請求項６ないし請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 医療デバイスを作製する方法であって、
    マイクロニードルの表面上にナノ構造体のパターンを形成するステップを含むことを特徴とする方法。
21. 前記ナノ構造体のパターンを、フォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ、Ｘ線リソグラフィ、自己組織化技術、反応性イオンエッチング、湿式エッチング、膜堆積、スパッタリング、化学蒸着、エピタキシー、電気めっき、ナノインプリントリソグラフィ、及びそれらの組合せからなる群より選択される技術に従って作製することを特徴とする請求項２０に記載の方法。

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