BR112019012924A2

BR112019012924A2 - microestruturas interpenetrantes para liberação de carga com base em nanocanal

Info

Publication number: BR112019012924A2
Application number: BR112019012924A
Authority: BR
Inventors: Lingqian Chang; Daniel Gallego-Perez; Natalia Higuita-Castro; Chandan Sen
Original assignee: Ohio State Innovation Foundation
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2019-12-10
Also published as: US20190329014A1; KR102539625B1; WO2018119090A1; CA3045958A1; US11235132B2; JP2020513900A; KR20190099479A; CN110494126A; JP7114094B2; AU2017379879C1; EP3558265A1; AU2017379879B2; AU2017379879A1; EP3558265A4

Abstract

são providos aqui dispositivos e métodos para liberar topicamente e controlavelmente carga através de tecidos biológicos, ou no interior dos mesmos, particularmente a pele. esses dispositivos permitem liberação de carga em camadas celulares mais profundas de um tecido. esses dispositivos incluem arranjos microestruturais compreendendo nanocanais. é também divulgado um dispositivo compreendendo um ou mais arranjos microestruturais encaixado em uma armação.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

MICROESTRUTURAS INTERPENETRANTES PARA LIBERAÇÃO DE CARGA COM BASE EM NANOCANAL REFERÊNCIACRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [01] Este pedido reivindica benefício do Pedido Provisório US 62/438.256, depositado em 22 de dezembro de 2016, que está por meio disto incorporado aqui pela referência na sua íntegra.

CAMPO TÉCNICO [02] Essa invenção se refere a nanotecnologia e, mais particularmente, a nanocanais e métodos de liberação baseados em nanocanal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [03] Uma técnica comum para liberar agentes terapêuticos através, de um tecido biológico, ou no interior do mesmo, é o uso de arranjos de nanocanal. Entretanto, métodos de liberação baseados em nanocanal atuais só podem liberar carga diretamente na camada celular mais externa de um tecido, limitando significativamente a cinta de ação dessa tecnologia. Assim, existe uma necessidade de métodos baseados em nanocanal de liberação que possam liberar carga nas camadas celulares mais profundas de um tecido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [04] São providos aqui dispositivos e métodos para liberar tópica e controlavelmente carga através de tecidos biológicos, ou no interior dos mesmos, particularmente a pele. Esses dispositivos permitem liberação de carga nas camadas celulares mais profundas de um tecido. Esses dispositivos incluem arranjos microestruturais compreendendo nanocanais.

[05] Em algumas modalidades, o arranjo microestrutural inclui um substrato planar com uma superfície de topo e uma superfície de base, um reservatório em comunicação fluídica com a superfície de topo do substrato planar, e uma

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2/49 pluralidade de microestruturas que se projetam a partir da superfície de base do substrato planar. Cada qual da pluralidade de microestruturas compreende uma porção de corpo sólida que se afunila de uma base até uma ponta distai posicionada a uma altura da base do substrato planar, por meio disso definindo uma superfície da microestrutura. Cada qual da pluralidade de microestruturas também compreende um primeiro canal de liberação que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do primeiro canal na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do primeiro canal. Cada qual da pluralidade de microestruturas também compreende um segundo canal de liberação que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do segundo canal na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do segundo canal.

[06] Em algumas modalidades, a abertura do primeiro canal é posicionada em um primeiro plano paralela à superfície planar e a abertura do segundo canal é posicionada em um segundo plano paralela ao substrato planar. Nessas modalidades, o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano. Em algumas dessas modalidades, o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano por uma distância de 20% a 60% da altura entre a ponta distai e a base do substrato planar. Em outras modalidades, a abertura do primeiro canal é posicionada na ponta distai.

[07] Em algumas modalidades, cada qual da pluralidade de microestruturas compreende adicionalmente um terceiro canal de liberação que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do terceiro canal na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do terceiro canal. Em algumas dessas modalidades, a abertura do primeiro canal é posicionada em um primeiro plano paralelo ao

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3/49 substrato planar, a abertura do segundo canal é posicionada em um segundo plano paralelo ao substrato planar, a abertura do terceiro canal é posicionada em um terceiro plano paralelo ao substrato planar. Nessas modalidades, o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano e o segundo plano é distalmente espaçado do terceiro plano. Em algumas dessas modalidades, o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano por uma distância de 20% a 60% da altura entre a ponta distal e a base do substrato planar, e o segundo plano é distalmente espaçado do terceiro plano por uma distância de 20% a 60% da altura entre a ponta distal e a base do substrato planar.

[08] Em algumas modalidades, a altura entre a ponta distal e a base do substrato planar é de 20 microns a 1.000 microns.

[09] Em algumas modalidades a base tem um formato substancialmente circular. Em outras modalidades a base tem um formato substancialmente retangular.

[010] Em algumas modalidades, a porção de corpo sólida é formada de silício ou um material a base de silício, por exemplo, nitreto de silício. Em outras modalidades, o substrato planar é formado de silício ou um material a base de silício. Em outras modalidades, a porção de corpo sólida é formada de óxido de alumínio anodizado. Em outras modalidades, o substrato planar é formado de óxido de alumínio anodizado.

[011] Em algumas modalidades, o substrato planar compreende adicionalmente uma pluralidade de canais de liberação, cada um dos quais se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do canal na superfície de base do substrato planar, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do canal na superfície de base do substrato planar.

[012] É também divulgado um dispositivo compreendendo um ou mais arranjos microestruturais encaixado em uma armação. Em algumas modalidades, a

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4/49 armação é flexível e/ou maleável. Em alguns casos, isso permite aplicação a uma superfície curva. Em alguns casos, a armação é não planar. Por exemplo, a armação pode ser um cilindro de maneira tal que os arranjos microestruturais sejam circunferencialmente arranjados em torno do cilindro. Em alguns casos, um arranjo microestrutural é posicionado na extremidade distal do cilindro. Em algumas dessas modalidades, o cilindro define um lúmen, que pode funcionar como um reservatório para os arranjos microestruturais. Nessas modalidades, um eletrodo pode também ser posicionado no lúmen.

[013] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição a seguir. Outros recursos, objetivos e vantagens da invenção ficarão aparentes pela descrição e desenhos, e pelas reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [014] A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando a fabricação de nanocanais interpenetrantes arranjados a partir de materiais a base de silício usando técnicas fotolitográficas e de ataque químico. Primeiramente, um arranjo microestrutural interpenetrante cônico ou piramidal (aproximadamente 20-500 microns de altura) é definido em um substrato de silício usando padronização de resina fotossensível e ataque químico úmido ou seco. Subsequentemente, o substrato de silício é padronizado na parte de trás com um arranjo de nanopoços (aproximadamente 300-1.000 nm de diâmetro) usando litografia de projeção, que é então seguida por um ataque iônico reativo profundo altamente anisotrópico (DRIE) para perfurar nanocanais através do substrato de silício/microestruturas interpenetrantes.

[015] A Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando um método alternativo para fabricar nanocanais interpenetrantes arranjados a partir dos materiais a base de silício usando técnicas de ataque químico. Ataque químico superficial

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5/49 seletivo é usado para definir microestruturas interpenetrantes em uma plataforma de substrato nanocanalizado pré-fabricada.

[016] A Figura 3 é uma imagem de alta resolução mostrando uma modalidade de um arranjo microestrutural compreendendo nanocanais.

[017] A Figura 4 é um diagrama esquemático mostrando os métodos de aplicação de liberação a base de nanocanal tradicional (por exemplo, TNT).

[018] A Figura 5 é um diagrama esquemático mostrando a liberação de carga dentro/através de uma barreira biológica usando um arranjo microestrutural interpenetrante compreendendo nanocanais.

[019] As Figuras 6a-n mostram que TNT medeia a liberação e propagação do fator de reprogramação intensificada além do limite de transfecção. A Figura 6a mostra um diagrama esquemático do processo de TNT no tecido de pele esfoliada. O eletrodo positivo é inserido intradermicamente, enquanto o eletrodo negativo é colocado em contato com a solução de carga. Um campo elétrico pulsado (250 V, pulsos de 10 ms, 10 pulsos) é então aplicado através de eletrodos para nanoporar membranas celulares expostas e injetar a carga diretamente no citosol. Micrografias eletrônicas de varredura (topo) da superfície de plataforma de TNT mostrando o arranjo de nanoporo. A Figura 6b mostra um diagrama esquemático mostrando as condições de contorno para efeitos de simulação. A Figura 6c mostra uma simulação do perfil de poração para diferentes células que passam por TNT (linhas cheias) vs. BEP (linhas tracejadas). Esse gráfico mostra que TNT leva a poração focada, enquanto BEP resulta em poração espalhada. A Figura 6d mostra resultados de expressão ABM para TNT vs. BEP. TNT resultou em expressão ABM superior (t=24 horas). A Figura 6e mostra fluorescência IVIS representativa e a Figura 6f mostra imagem de microscópio confocal de pele de camundongo após tratamento com TNT com DNA marcados e os fatores ABM, respectivamente. GFP é o gene repórter no

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6/49 plasmideo Ascii. A Figura 6g mostra Microdissecação de Captura a laser (LCM) e resultados de qRT-PCR de expressão genética em epiderme e derme (t=24 horas) mostrando que a expressão genética propagou além do limite de transfecção epidérmica. A Figura 6h mostra um diagrama esquemático ilustrando o conceito de propagação de transfecção mediada por EV da epiderme para a derme. A Figura 6i mostra análise qRT-PCR da carga de EV mostrando carregamento significante de ABM mRNAs/cDNAs. A Figura 6j mostra projeto experimental para confirmar se EVs são um veículo viável para propagar transfecção e reprogramação. A Figura 6k mostra micrografia confocal mostrando um fibroblasto embriônico de camundongo que internalizou espontaneamente os EVs isolados da pele tratada com TNT. A Figura 61 mostra análise de expressão genética 14 dias após injeção de EV em camundongos naive comparado a transdução baseada em TNT de ABM. resultados de imunomanchamento mostrando (m) Tujl aumentado (semana 4) e a Figura 6n mostra expressão de neurofilamento (semana 8) na pele após tratamento com ABM com TNT. N= 3 animais (replicatas biológicas). * p<0,05 (método HolmSidak), # 0,05<p<0,08 (teste t de uma cauda).

[020] As Figuras 7a-k mostram fabricação de plataforma de TNT e simulação de arranjo de nanocanal. A Figura 7a mostra pastilha de silício polida de dupla face. As Figuras 7b-d mostram padronização de nanocanal e DRIE. A Figura 7e mostra imagem de microscopia eletrônica de varredura (SEM) dos nanocanais atacados quimicamente. A Figura 7f mostra ataque químico do lado de trás de microrreservatórios. A Figura 7g mostra micrografias SEM e as Figuras 7h e 7i mostram gráficos mostrando perfis de ataque químico e taxas de ataque químico, respectivamente, em diferentes condições. As Figuras 7j e 7k mostram resultados de simulação mostrando distribuição de campo (j1, k1) e perfis de dissipação de calor (j, k 2-3) para arranjos de nanocanal assimétricos (isto é, em

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7/49 formato de T) vs. arranjos simétricos (isto é, em formato de cruz). Eletroporação em células biológicas em suspensão (BEP) é o padrão ouro atual para liberação de gene não viral in vivo. Captação de gene em BEP, entretanto, é um processo altamente estocástico, que não é apenas influenciado por campos elétricos não uniformes, mas também por processos à jusante e/ou mais passivos tais como endocitose e difusão, respectivamente (Geng, T. & Lu, C. Lab Chip 13, 38033821 (2013);. Boukany, P.E. et al. Nat Nanotechnol 6, 747-754 (2011); GallegoPerez, D. et al. Nanomedicine (2015)). Como tal, abordagens simples que facilitam liberação de gene mais ativa e determinística in vivo são claramente necessárias. Aqui tecnologias baseadas em ambiente limpo foram implementadas (isto é, litografia de projeção, fotolitografia de contato, e ataque iônico reativo profundo - DRIE-) (Figuras 7a-i)) para fabricar dispositivos de TNT a base de silício para liberação de gene não viral ativo em superfícies de tecido naturalmente (por exemplo, pele) ou cirurgicamente acessíveis (por exemplo, músculo esquelético) de uma mais maneira determinística. A plataforma de TNT consistiu em um arranjo massivamente paralelo de nanocanais agrupados interconectados a reservatórios em escala micrométrica que pode reter a carga genética a ser transduzida para os tecidos. Resumidamente, arranjos de canais de ~400-500 nm foram primeiro definidos na superfície de um pastilha de silício polida de dupla face de ~200 pm de espessura usando litografia de projeção e DRIE. Estudos de simulação sugerem que tal arranjo assimétrico em forma de T provê algumas vantagens inerentes em termos de distribuição de campo elétrico e dissipação de calor comparado a uma distribuição de nanoporo mais simétrica, com agrupamentos assimétricos de nanocanais exibindo zonas menos inativas (Figuras 7j1, k1, asteriscos), ainda reduzindo ao mesmo tempo por 20-25% as temperaturas de pico e vale (Figuras 7j2-3, k2-3). Isso foi então seguido por padronização baseada em litografia de contato e perfuração mediada por DRIE

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8/49 de um arranjo de justaposição de microrreservatórios nos nanocanais. Finalmente, a superfície de plataforma foi apassivada com uma camada isolante fina de nitreto de silício.

[021] As Figuras 8a-h mostram resultados de simulação de eletroporação baseada em nanocanal in vivo vs. eletroporação em células biológicas em suspensão (BEP). A Figura 8a mostra um diagrama esquemático ilustrando a configuração experimental. As Figuras 8b e 8c mostram distribuição de tensão simulada sob um estímulo de 250 V. As Figuras 8d-f mostram uma simulação de potencial de transmembrana para eletroporação em células biológicas em suspensão de única célula. A Figura 8g mostra um perfil de poração para uma célula em contato direto com o nanocanal (célula 1) comparado a células longe dos nanocanais (célula 2 e célula 3). A Figura 8h mostra perfis em TNT vs. BEP. [022] As Figuras 9a-d mostram EVs carregados com ABM autólogos isolados de pele dorsal tratada com TNT exibem características tipo neurotróficas em um modelo de camundongo (C57BL/6) com acidente vascular cerebral MCAO. A Figura 9a mostra um diagrama esquemático ilustrando a configuração experimental. Acidente vascular cerebral MCAO é primeiro induzido. Isso é então seguido por tratamento com ABM com isolamento de TNT e EV da pele dorsal antes de injeção de EVs intracraniana. As Figuras 9b e 9c mostram imageamento MRI e quantificação mostrando uma redução significante no volume infartado apenas 7 dias após injeção de EV.

[023] A Figura 9D mostra imageamento com imunofluorescência 21 dias após indução de acidente vascular cerebral mostrando células DCX+/processos que se projetam da zona subventricular (SVZ) em direção à área infartada (setas brancas). Células DCX+ em cérebros de controle foram observadas basicamente revestindo as paredes da zona SVZ. * p<0,05 (método Holm-Sidak).

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9/49 [024] As Figuras 10a-b mostram iNs na pele originados de fontes epidérmicas e dérmicas. Micrografias de fluorescência de seções de pele tratada com TNT ABM da Figura 10a mostra repórter K14-Cre e Figura 10b mostra modelos de camundongo Col1A1 -GFP mostrando células de pele de origem tanto de K14 quanto Coll A1 (verde/GFP) também expressando 0 marcador neuronal Tujl. (Fig. 10a.1, Fig. 10b. 1) Elementos celulares que foram imunorreativos tanto para 0 traçador GFP quanto Tuj1 foram analisados adicionalmente por LCM/qRTPCR. Os resultados indicam que tais elementos duplos positivos tiveram expressão genética de marcador neuronal significativamente alto e expressão genética de marcador de célula da pele moderada a notadamente reduzida. * p<0,05 (método Holm-Sidak). Experimentos de traço de linhagem com um modelo de camundongo repórter de K14-Cre, onde células de Queratina 14 positiva (K14+) passam por recombinação mediada por ere do locus ROSA finalmente comutada da expressão tdTomato to eGFP, confirmou que os neurônios recém induzidos parcialmente originados de células de pele K14+. Experimentos com um modelo de camundongo Coll A1 -eGFP, onde células com um promotor de Coll A1 ativo expressa eGFP, mostrou inúmeras células de Colágeno/eGFP+ da derme em uma fase de transição para Tuj1+. LCM foi usada para capturar e caracterizar adicionalmente 0 perfil de expressão genética de elementos celulares pelas seções de modelo de camundongo transgênico que foram tanto GFP+ quanto Tuj1 +, que corresponderíam a células que foram de origem K14, mas que agora expressam um marcador neuronal, ou células que têm um promotor de colágeno ativo (por exemplo, fibroblastos) transicionando para uma morte neuronal. Os resultados indicaram que tais elementos certamente exibiram expressão aumentada de marcadores pró-neuronais, e expressão reduzida do marcador de origem da célula (isto é, K14, Coll A1).

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10/49 [025] A Figura 11 é uma ilustração de uma vista seccional transversal de uma modalidade de microestrutura de exemplo.

[026] A Figura 12 é uma ilustração de uma vista seccional transversal de uma modalidade de microestrutura de exemplo.

[027] A Figura 13 é uma ilustração de uma vista seccional transversal de uma modalidade de microestrutura de exemplo.

[028] As Figuras 14A-14D mostram vários arranjos e modalidades de arranjos microestruturais. A Figura 14A mostra uma modalidade com microagulhas cônicas. A Figura 14B mostra uma modalidade com microagulhas piramidais. A Figura 14C mostra uma modalidade com cilindros concentricamente arranjados. A Figura 14D mostra uma modalidade com cristas.

[029] As Figuras 15A e 15B são gráficos comparando o nível relativo de expressão genética observado mediante liberação de fatores de reprogramação de exemplo no tecido usando uma plataforma de TNT (Fig. 15A) e uma plataforma DTN (Fig, 15B). Níveis significativamente maiores de expressão genética foram observados em tecido quando formulações foram administradas usando a plataforma DTN.

[030] A Figura 16 mostra reprogramação de tecido de pele de camundongo em uma linhagem endotelial (isto é, estruturas celulares de CD31 +, manchadas de vermelho) usando a plataforma DTN. Um aumento acentuado em manchamento de CD31 através de toda a espessura da seção de tecido foi observado comparado com a pele de controle.

[031] As Figuras 17A e 17B são ilustrações de uma vista seccional transversal de uma modalidade de microestrutura de exemplo.

[032] A Figura 18 mostra vários formatos de microestruturas.

[033] A Figura 19 é uma vista em perspectiva de uma modalidade de arranjo microestrutural tendo fendas longas na porção do corpo.

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11/49 [034] A Figura 20 é uma vista em perspectiva de uma modalidade de arranjo microestrutural tendo fendas curtas/arranjadas na porção do corpo.

[035] A Figura 21 é uma vista seccional transversal da modalidade do arranjo microestrutural da Figura 20.

[036] As Figuras 22A e 22B são vistas em perspectiva de uma modalidade de arranjo microestrutural descrevendo reservatórios que podem ser usinados na porção do corpo (Fig. 22A) ou fabricados separadamente em um outro material e então interfaceados com a porção do corpo (Fig. 22B).

[037] A Figura 23 ilustra uma microestrutura de modalidade vista como uma seção transversal e seu uso para liberação de ácido nucleico no tecido de pele usando eletroporação.

[038] As Figuras 24A a 24D ilustram a fabricação de uma microestrutura das modalidades. A Figura 24A é uma pastilha de silício padronizada por meio de litografia e ataque iônico reativo profundo (DRIE) para criar um arranjo de nanocanais (Fig. 24B). Esses canais podem variar de tamanho entre -100-900 nm de diâmetro, com um passo entre bordas variando em torno de 1 -25 vezes o diâmetro. A Figura 24C ilustra o lado de trás da pastilha sendo atacado quimicamente por DRIE para ganhar acesso fluídico aos nanocanais (assim criando um arranjo através da espesssura de nanocanais). A Figura 2D ilustra arranjo de nanocanais 2D sendo atacados quimicamente em 3D por meio de padronização de litografia e ataque químico anisotrópico. Tal arranjo de nanocanais 3D permite a liberação de carga simultânea e graduada em múltiplos níveis/camadas de tecido. As extrusões em 3D na Fig. 24D podem variar de tamanho (na base) entre -1 e centenas de microns, dependendo do número de nanocanais (e lacuna intermediária) que precisam ser acomodados dentro/através deles. Em alguns casos, o número mínimo de nanocanais por extrusão em 3D é 2, e esse pode ser de diferentes alturas para ser capaz de

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12/49 permitir liberação de carga em diferentes níveis do tecido. Ambos nanocanais e/ou extrusões em 3D podem ser arranjados em arranjos de empacotamento compacto hexagonal (HCP) para maximizar a área ativa do dispositivo. Uma vez que a extrusão em 3D é definida, a superfície pode ser revestida com uma camada isolante, que pode ser nitreto de silício ou dióxido de silício. Revestimentos adicionais que podem ser aplicados para melhorar a durabilidade incluem (com camadas de semente compatíveis): carboneto de silício, nitreto de titânio, nitreto de alumínio e titânio, e nitreto de zircônio entre outros.

[039] As Figuras 25A a 25D ilustram uma abordagem de fabricação alternativa. A Figura 25A ilustra um substrato com nanocanais já definidos submetidos a (Fig. 25B) microusinagem superficial (por exemplo, através de uma abordagem litográfica, ou microfresagem, por exemplo) para criar extrusões em 3D de tal arranjo de nanocanal (Fig. 25C e 25D). Neste caso, o substrato de base podería ser produzido de silício de DRIE, ou alumina anodizada, ou uma membrana polimérica pegajosa-atacada quimicamente (por exemplo, PET).

[040] As Figuras 26A a 26E ilustram modalidades para aplicação a superfícies de tecido grandes/curvas. A Figura 26A mostra que um dispositivo de DTN processado pode ser fatiado em módulos menores. Tais módulos podem ser encaixados em uma armação polimérica flexível para permitir aplicação em superfícies de tecido grandes/curvas. A ilustração na Figura 26B mostra um arranjo de módulos 3x3 sendo aplicados em um braço de humano. A Figura 26B DTN em grande escala pode ser usado para interpor a modelos de animal préclínicos/modelos clínicos/grandes. Neste caso uma aba de pele isquêmica de um porco foi aplicada com DTN com EFF, que induz a formação de (Fig. 26D) nova vasculatura que pode (Fig. 26E) salvar a pele dobrada de necrose (esquerda) aumentando perfusão nesta área (direita).

DESCRIÇÃO DETALHADA

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Definições [041] Termos usados em todo esse pedido devem ser interpretados com significado ordinário e típico aos versados na técnica. Entretanto, requerentes desejam que os termos a seguir sejam dados a definição particular como definido a seguir.

[042] Como usado na especificação e reivindicações, a forma singular “um,” “uma,” “o” e “a” incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Por exemplo, a expressão “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas das mesmas.

[043] As expressões “cerca de” e “aproximadamente” são definidas como sendo “próximo a” como entendido pelos versados na técnica. Em uma modalidade não limitante os termos são definidos dentro de 10%. Em uma outra modalidade não limitante, os termos são definidos dentro de 5%. Ainda em uma outra modalidade não limitante, os termos são definidos dentro de 1 %.

[044] Como usado aqui, entende-se que o termo “compreendendo” significa que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluindo outros. “Consistindo essencialmente de” quando usado para definir composições e métodos deve significar excluindo outros elementos de qualquer significância essencial para a combinação. Assim, uma composição consistindo essencialmente dos elementos como definido aqui não excluiría contaminantes traços do método de isolamento e purificação e carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como salina tamponada com fosfato, conservantes, e similares. “Consistindo em” deve significar excluindo mais que elementos traços de outros ingredientes e etapas de método substanciais para administrar as composições dessa invenção. Modalidades definidas por cada desses termos de transição são no escopo dessa invenção.

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14/49 [045] Uma “quantidade efetiva” é uma quantidade suficiente para produzir resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade efetiva pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens.

[046] A expressão “carreador” ou “carreador farmaceuticamente aceitável” significa um carreador ou excipiente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica ou terapêutica que é geralmente segura e não tóxica, e inclui um carreador que é aceitável para uso veterinário e/ou farmacêutico ou terapêutico de humano. Como usado aqui, as expressões “carreador” ou “carreador farmaceuticamente aceitável” pode incluir solução de salina tamponada com fosfato, água, emulsões (tal como uma emulsão óleo/água ou água/óleo) e/ou vários tipos de agentes umectantes. Como usado aqui, o termo “carreador” engloba qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabilizante, solubilizante, lipídio, estabilizante, ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas e como descrito adicionalmente a seguir.

[047] Cintas podem ser expressas aqui como de “cerca de” um valor particular, e/ou como “cerca de” um outro valor particular. Quando uma cinta como essa é expressa, uma outra modalidade inclui de um valor particular e/ou a outro valor particular. Similarmente, quando valores são expressos como aproximações, por uso do antecedente “cerca de,” será entendido que o valor particular forma uma outra modalidade. Deve-se entender adicionalmente que os pontos finais de cada qual das cintas são significantes tanto em relação ao outro ponto final, e independentemente de o outro ponto final. Deve-se também entender que existem inúmeras valores divulgados aqui, e que cada valor é também aqui divulgado como “cerca de” que valor particular além do próprio valor. Por exemplo, se o valor “10” for divulgado, então “cerca de 10” é também divulgado.

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15/49 [048] As expressões “quantidade terapeuticamente efetiva” ou “dose terapeuticamente efetiva” se referem à quantidade de uma composição, tal como insulina modificada com glicose ligada a uma estrutura de ligação de glicose, que elicitará a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal, ou humano que é sendo procurada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico por um período de tempo generalizado. Em alguns casos, uma resposta biológica ou médica desejada é obtida após administração de múltiplas dosagens da composição ao sujeito por um período de dias, semanas, ou anos. [049] O termo “sujeito” ou “recipiente” é definido aqui de forma a incluir animais tais como mamíferos, incluindo, mas não se limitando a, primatas (por exemplo, humanos), vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, coelhos, ratos, camundongos e similares. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.

[050] Os termos “tratar,” “tratando,” “tratamento,” e variações gramaticais dos mesmos como usados aqui, incluem atrasar, aliviar, mitigar ou reduzir parcialmente ou completamente a intensidade de um ou mais sintomas decorrentes de um distúrbio ou condição e/ou aliviar, mitigar ou impedir uma ou mais causas de um distúrbio ou condição. Tratamentos de acordo com a invenção podem ser aplicados preventivamente, profilaticamente, palativamente ou remediavelmente.

Descrição Detalhada [051] O arranjo microestrutural e métodos de usar o mesmo divulgado aqui são úteis no transporte de material para as barreiras biológicas, ou através das mesmas. O arranjo microestrutural divulgado aqui tem a capacidade de liberar substâncias em diferentes camadas de células dentro do tecido simultaneamente (ou sequencialmente) em virtude de as microestruturas compreenderem múltiplos canais que podem atingir diferentes níveis celulares. Isso se dá é em virtude de múltiplos canais em uma microestrutura angulada

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16/49 permitirem diferentes alturas dos canais na microestrutura. Quando a microestrutura penetra o tecido, os canais são colocados em diferentes camadas de células, e podem, portanto, liberar substâncias em diferentes níveis no tecido. O arranjo microestrutural pode ser usado na pele (ou partes da mesma); através da barreira sangue-cérebro; tecido mucosal (por exemplo, oral, nasal, ocular, vaginal, uretral, gastrintestinal, respiratório); vasos sanguíneos; vasos linfáticos; ou membranas celulares (por exemplo, para a introdução de material no interior de uma célula ou células). As barreiras biológicas podem ser em humanos ou outros tipos de animais, bem como em plantas, insetos, ou outros organismos, incluindo bactérias, levedura, fungos e embriões. O arranjo microestrutural pode ser aplicado ao tecido internamente com a ajuda de um cateter ou laparoscópio. Para certas aplicações, tal como para liberação de fármaco em um tecido interno, os dispositivos podem ser cirurgicamente implantados.

[052] Com referência à Figura 1, o arranjo microestrutural (100) pode compreender: um substrato planar (101) tendo uma superfície de topo (102) e uma superfície de base (103); um reservatório (104) em comunicação fluídica com a superfície de topo do substrato planar; e uma pluralidade de microestruturas (105) que se projetam em partir da superfície de base do substrato planar, cada qual da pluralidade de microestruturas compreendendo: uma porção de corpo sólida (106) que se afunila de uma base (107) até uma ponta distai (108) posicionada a uma altura da superfície de base do substrato planar, por meio disso definindo uma superfície da microestrutura; um primeiro canal de liberação (109) se estendendo da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do primeiro canal (110) na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do primeiro canal; e um segundo canal de liberação (111) se estendendo da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do segundo canal (112) na superfície da

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17/49 microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do segundo canal.

[053] Cada qual dos canais de liberação pode ser o mesmo ou diferente em escala. Em algumas modalidades, os canais de liberação são nanocanais, por exemplo, com um diâmetro interno de cerca de 1 a cerca de 999 nm. Em algumas modalidades, os canais de liberação são microcanais, por exemplo, com um diâmetro interno de cerca de 1 a cerca de 999 pm. O tamanho do canal pode ser selecionado com base no tamanho do agente a ser liberado e/ou na dinâmica de fluxo necessária para uma dada aplicação.

[054] O substrato planar (101) pode compreender uma pluralidade de canais de liberação (109, 111, por exemplo), cada um dos quais se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do canal (110, 112, por exemplo) na superfície de base (103) do substrato planar, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório (104) à abertura do canal na superfície de base do substrato planar.

[055] Como pode ser visto nas Figuras 1 -2, o arranjo microestrutural (100) pode ser configurado de maneira tal que a abertura do primeiro canal (110) seja posicionada em um primeiro plano paralelo ao substrato planar (101), em que a abertura do segundo canal (112) é posicionada em um segundo plano paralelo ao substrato planar (101), e em que o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano. Pode também existir uma abertura do terceiro canal (114) conectada a um terceiro canal (113). Os planos de cada canal e sua abertura associada podem ser espaçados a intervalos regulares uns dos outros, ou em diferentes intervalos. Por exemplo, cada canal/abertura do canal pode ser espaçado igualmente dos outros. Por exemplo, a primeira e segunda aberturas de canal podem ser distalmente separadas por uma distância de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

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29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49,

50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70,

71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91,

92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% da altura da microestrutura. Em um exemplo, o primeiro plano pode ser distalmente espaçado do segundo plano por uma distância de 20% a 60%. Essa distância pode se aplicar a terceira, quarta, quinta, e mais aberturas de canal igualmente.

[056] As microestruturas (105) podem compreender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou mais canais. Esses canais podem agir como um conduíte entre o reservatório e as aberturas de canal. Portanto, os canais podem ficar em comunicação fluídica com o reservatório, de maneira tal que material colocado no reservatório possa percorrer o canal e ser liberado nas aberturas de canal. A primeira abertura do canal (110) pode ser posicionada na ponta distal, com aberturas de canal adicionais flanqueando a ponta distai. Por exemplo, pode haver três aberturas de canal na mesma microestrutura, com uma sendo na ponta distai, e mais duas aberturas de canal (112 e 114) em qualquer lado da ponta distai. Múltiplos canais na microestrutura (105) podem ficar dispostos paralelos um ao outro, e podem ficar dispostos paralelos ao plano vertical da microestrutura, como mostrado nas Figuras 1 e 2.

[057] Como pode ser visto nas Figuras 17A e 17B, a altura da porção de corpo sólida (106) da microestrutura (105) pode ser medida da ponta distai (108) da microestrutura até a base (107) da microestrutura, que pode ser localizada na superfície de base (103) do substrato planar (101). A altura da superfície da microestrutura pode ter 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1.000 microns de comprimento, ou mais, menos, ou qualquer quantidade intermediária. Em um exemplo, a altura da microestrutura pode ser de 100 a 500 microns. Como pode ser visto na Figura

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17A, a altura da microestrutura (105) é medida em um plano b que pode ficar disposto perpendicular ao plano do substrato planar (101).

[058] A base (107) da microestrutura pode ter qualquer formato, tais como um triângulo, quadrado, losango, retângulo, oval, ou círculo. Em uma modalidade particular, a base tem um formato circular. Quando a base é um círculo, a largura da base (107) da microestrutura (105) pode ser medida como o diâmetro da base da microestrutura onde ela faz contato superficial com o substrato planar (101). O plano a da base (107) da microestrutura (105) pode ficar disposto paralelo com o substrato planar (101), como visto na Figura 17B. A largura da base pode ter 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, ou 500 microns de comprimento, ou mais, menos, ou qualquer quantidade intermediária. A largura da base pode também ser medida em relação à altura da microestrutura, de maneira tal que, por exemplo, a largura da base da microestrutura possa ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, ou 200% da altura, ou mais, menos, ou qualquer quantidade intermediária.

[059] A ponta distai (108) da microestrutura pode ter qualquer formato, e pode ser pontuda, redonda, inclinada, dilatada, cônica, romba ou combinações dos mesmos, como pode ser visto na Figura 14A a 14D. Em uma modalidade, a microestrutura é pontuda.

[060] As microestruturas podem ser espaçadas umas das outras tanto em intervalos regulares, quanto aleatórios. Se espaçadas regularmente, as microestruturas podem ser 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, ou 1.000 ou mais microns separados uma da outra, medido a partir da linha central b. A porção de corpo sólida (106) das microestruturas pode compreender qualquer formato, tais como uma crista, um padrão em ziguezague, um padrão em forma de onda, cones, ou pirâmides. Exemplos de cones e pirâmides podem ser vistos nas Figuras 14A, 14B e 18.

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20/49 [061] Em alguns casos, as microestruturas não têm um formato ou padrão ordenado. Por exemplo, as microestruturas divulgadas podem ser produzidas por ataque químico sob medida/peça em bruto de uma superfície de silício para introduzir microestruturas/rugosidades distribuídas aleatórias com pontas vivas que podem penetrar nos tecidos/sistemas vivos.

[062] Os canais de liberação (109, 111) podem ter vários formatos, tais como um cilindro, cubóide, ou prisma retangular, por exemplo. A abertura do canal de liberação (110, 112) pode ser circular, retangular, oval, ou quadrado e, como estabelecido anteriormente, cada microestrutura (105) pode ter múltiplos canais, que podem todos ter a mesma geometria, ou podem ter formatos que diferem uns dos outros nas mesmas ou diferentes microestruturas. O canal de liberação pode ter um formato substancialmente circular formando canais substancialmente concêntricos.

[063] O reservatório (104) pode compreender qualquer substância a ser liberada em um sujeito através do canal da microestrutura (109, 111). Ao contrário, substâncias podem ser extraídas através do canal da microestrutura e depositadas no reservatório. O reservatório (104) pode ficar em comunicação fluídica com a abertura da microestrutura (110, 112) através do microcanal, que pode ficar disposto através da microestrutura. O reservatório pode portanto compreender qualquer substância para administração transdérmica. Em uma modalidade, o reservatório (104) é afixado à superfície de topo (102) do substrato planar, a dita superfície de topo (102) sendo oposta a uma superfície de base (104) do substrato planar (101), em que as microestruturas se projetam a partir da superfície de base.

[064] Como mostrado nas Figuras 22A e 22B, o reservatório pode ser integral com o substrato planar (101) (Fig. 22A), ou ele pode ser fabricado separadamente, por exemplo, em um outro material, e então interfaceado com o

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21/49 substrato planar (101) (Fig. 22B). Os reservatórios podem ser dimensionados para cada qual alimentar uma pluralidade dos canais da microestrutura, ou arranjados de maneira tal que cada um alimente uma única microestrutura. Por exemplo, em algumas modalidades, o arranjo microestrutural (100) compreende um único grande reservatório, tanto operado por máquina no substrato planar (101) quanto interfaceado com o substrato planar (101).

[065] O reservatório pode compreender um mecanismo de liberação para liberar a substância a ser liberada, por meio disso permitindo que a substância seja transportada ao interior e através de pelo menos um canal da microestrutura. O mecanismo de liberação pode utilizar uma força mecânica ou força de cisalhamento, que pode ser manual, por calor, uma reação química, um campo elétrico, um campo magnético, um campo de pressão, energia ultrassônica, tensão, injeção de difusão, osmose, gradiente de concentração, vácuo, pressão, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o reservatório (104) pode incluir um material poroso, em que a substância a ser administrada é armazenada nos poros do material poroso. Em uma outra modalidade, o reservatório é vedado. Em uma variação dessa modalidade, o arranjo microestrutural inclui adicionalmente pelo menos uma farpa de perfuração que se estende a partir da primeira superfície do substrato planar, em que a farpa de perfuração pode ser usada para perfurar o reservatório vedado.

[066] O reservatório pode, por exemplo, compreender um componente de realimentação, de maneira tal que volume ou quantidade da substância a ser transportada através da barreira biológica possa ser alterada com base no sinal fisiológico. O componente de realimentação pode compreender uma “chave liga e desliga, de maneira tal que, quando um sinal é detectado, o reservatório pode liberar uma substância no recipiente, mas, quando não é detectado nenhum sinal, nenhuma substância é liberada. Ao contrário, a detecção de um sinal pode

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22/49 ter o efeito oposto, em que os padrões do reservatório para liberação de uma substância no recipiente, a menos que um sinal seja detectado, que faz com que o reservatório não libere uma substância para liberação no recipiente. A título de ilustração, o componente de realimentação pode detectar a presença de um patógeno no sujeito e, quando a substância é detectada, o componente de realimentação pode permitir a liberação de um anticorpo do reservatório.

[067] Em um outro exemplo, o componente de realimentação pode detectar mudanças em um sinal fisiológico, tal como pH ou temperatura. O componente de realimentação pode compreender um “valor de corte” de maneira tal que, quando o pH ou a temperatura muda em uma certa quantidade, ou atinge um certo valor numérico (um pH abaixo de 6,5, por exemplo, ou uma temperatura acima de 99,1, por exemplo), o componente de realimentação permite uma mudança na liberação da substância, ou na quantidade da substância liberada, e subsequentemente administrada ao recipiente.

[068] O componente de realimentação pode também ajustar a quantidade ou volume da substância liberada com base na quantidade de sinal detectado, de maneira tal que uma maior quantidade de sinal detectado pode resultar em uma maior quantidade de substância liberada, ou, ao contrário, uma maior quantidade de sinal detectado pode resultar em uma menor quantidade de substância liberada.

[069] O sinal fisiológico detectado pode, em um aspecto, ser qualquer substância presente no sujeito ao qual o arranjo microestrutural está sendo administrado. Por exemplo, o sinal fisiológico pode ser uma substância biológica ou um fármaco. A substância pode tanto ocorrer naturalmente no recipiente, quanto pode ser uma substância não endógena, ou estranha. Em um outro aspecto, a resposta fisiológica no sujeito pode compreender fatores ambientais fisiológicos, incluindo pH e temperatura. Exemplos de sinal fisiológico incluem,

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23/49 mas são não se limitando a glicose, colesterol, bilirrubina, creatina, enzimas metabólicas, hemoglobina, heparina, fatores de coagulação, ácido úrico, antígeno carcinoembriônico ou outros antígenos tumorígenos, hormônios reprodutivos, oxigênio, pH, temperatura, álcool, metabólitos de tabaco, e drogas ilegais.

[070] A substância no reservatório a ser liberada no recipiente pode ser uma substância terapêutica, profilática, de diagnóstico ou teranóstica. Mais que uma substância pode ser liberada de uma vez, ou diferentes substâncias podem ser liberadas sequencialmente. Diferentes substâncias podem ser liberadas através de diferentes canais ao mesmo tempo, por exemplo. 2, 3, 4, 5, 6, ou mais substâncias podem ser liberadas simultaneamente através de diferentes canais. Em virtude de as aberturas de canal poderem atingir diferentes camadas de células, diferentes substâncias podem ser administradas em diferentes estratos de células no tecido simultaneamente utilizando o arranjo microestrutural divulgado aqui. Especificamente, uma primeira substância pode ser liberada por meio de um primeiro canal em uma primeira camada de células, e uma segunda substância pode ser liberada por meio de um segundo canal em uma segunda camada de células.

[071] A substância a ser liberada pode ser selecionada do grupo que consiste de peptídeos, proteínas, carboidratos, moléculas de ácido nucleico, lipídios, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas biologicamente ativas, e combinações dos mesmos. Por exemplo, uma ampla cinta de fármacos pode ser formulada para liberação com os presentes dispositivos e métodos de microagulha. Como usado aqui, as expressões “fármaco” ou “formulação de fármaco” são usadas amplamente para se referir a qualquer agente profilático, terapêutico, diagnóstico, ou teranóstico, ou outra substância que pode ser adequada para introdução nos tecidos biológicos, incluindo excipientes

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24/49 farmacêuticos e substâncias para tatuagem, cosméticos, e similares. O fármaco pode ser uma substância com atividade biológica. A formulação de fármaco pode incluir várias formas, tais como soluções líquidas, géis, partículas sólidas (por exemplo, micropartículas, nanopartículas), ou combinações dos mesmos. O fármaco pode compreender moléculas pequenas, moléculas grandes (isto é, macro), ou uma combinação das mesmas. Em modalidades não limitantes, representativas, o fármaco pode ser selecionado dentre aminoácidos, vacinas, agentes antivirais, vetores vetores de liberação de gene, inibidores de interleucina, imunomoduladores, fatores neurotrópicos, agentes neuroprotetores, agentes antineoplásticos, agentes quimioterapêuticos, polissacarídeos, anticoagulantes, antibióticos, agentes analgésicos, anestésicos, anti-histaminas, agentes anti-inflamatórios, e vírus. O fármaco pode ser selecionado de proteínas adequadas, peptídeos e fragmentos dos mesmos, que podem ser de ocorrência natural, sintetizados ou recombinantemente produzidos. Em uma modalidade, a formulação de fármaco inclui insulina.

[072] A formulação de fármaco pode incluir adicionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo modificadores de pH, modificadores de viscosidade, diluentes, etc., que são conhecidos na técnica. [073] O reservatório divulgado aqui pode compreender a substância para liberação por si mesma, ou um dispositivo para produzir uma substância a ser transportada através do reservatório da barreira biológica. Um exemplo de um meio para produzir uma substância são células. As células podem ser células de mamífero, tais como células de humano, ou podem ser células de qualquer outra fonte, que são capazes de produzir uma substância para administração a um recipiente. Por exemplo, as células podem ser células β pancreáticas ou células pancreáticas de humano diferenciadas da célula tronco.

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25/49 [074] A substância, ou os meios para produzir a substância, podem ser dispostos em um reservatório que é semipermeável, por exemplo. Isso pode permitir a troca de fluido com o recipiente, de maneira tal que o componente de realimentação possa ficar em comunicação fluídica com o recipiente e, por meio disso, detectar mudanças no sinal fisiológico do recipiente. Por exemplo, o reservatório pode compreender células, em que as células são sensíveis a mudanças em um sinal fisiológico do recipiente. Tais mudanças fisiológicas no recipiente podem estimular as células a liberar uma substância, ou interromper a liberação de uma substância, como descrito anteriormente em relação ao componente de realimentação. Em um exemplo, o reservatório pode compreender um microgel de alginato.

[075] O arranjo microestrutural 100 divulgado aqui pode incluir adicionalmente um estímulo (mecanismo de liberação) para translocar a carga do reservatório através dos canais. Em alguns casos, esse estímulo envolve campo elétrico de formação (por exemplo, eletroporação), no qual um campo elétrico de poração é aplicado para romper/deformar as membranas de lipídio e permitir a liberação de carga intracelular. Em algumas modalidades, a aplicação de um campo elétrico de poração através do sistema resulta na deformação e/ou ruptura de membranas celulares, que permite o deslocamento da carga para o espaço intracelular. Intensidades de campo elétrico podem ser acomodadas dependendo do tecido/sistema alvo. Por exemplo, a Figura 23 ilustra o uso do arranjo microestrutural divulgado 100 para liberar ácidos nucleicos no tecido de pele usando eletroporação.

[076] Em outras modalidades, o estímulo envolve força mecânica, força de cisalhamento, calor, reação química, campo magnético, campo de pressão, energia ultrassônica, tensão, injeção de difusão, osmose, gradiente de concentração, vácuo, pressão, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas

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26/49 modalidades, a carga compreende proteínas, ácidos nucleicos, ou partículas. Entretanto, em algumas modalidades, um estímulo elétrico é a carga sendo liberada. Campos elétricos pulsados têm muitas aplicações, por exemplo, em medicina regenerativa. O arranjo microestrutural divulgado 100 pode ser usado para liberar campos elétricos pulsados em diferentes níveis através da espessura do tecido.

[077] Microagulhas e aparelho de eletroporação são descritos nas Patentes US 6.334.856, 6.331.266, 6.312.612, 6.241.701, 6.233.482, 6.181.964, 6.090.790, 6.014.584, 5.928.207, 5.869.326, 5.855.801, 5.823.993, 5.702.359, 5.697.901, 5.591.139, 5.389.069, 5.273.525 e 7.127.284, que estão incorporadas pela referência para este precieto.

[078] O arranjo microestrutural pode compreender um primeiro eletrodo em contato elétrico com um segundo eletrodo, em que o primeiro eletrodo fica em contato com o reservatório e o segundo eletrodo fica em contato com uma ou mais células de um tecido enquanto o arranjo microestrutural está em uso. A fim de intensificar a captação da substância, que pode ser um gene, outro ácido nucleico, proteína ou outro fármaco de molécula grande, um fármaco de molécula pequena, ou similares, um campo elétrico pode ser estabelecido entre eletrodos espaçados em lados opostos da abertura. A tensão, frequência, e outros parâmetros de campo elétrico serão selecionados fundamentalmente com base na distância entre os eletrodos.

[079] O arranjo microestrutural compreendendo eletrodos pode compreender uma primeira estrutura de eletrodo formada na ponta distai (108) da microestrutura, de maneira tal que ela fique em contato com as células e tecido que foram perfuradas pela microestrutura. A segunda estrutura de eletrodo pode ser disposta no reservatório. As estruturas de eletrodos podem ser formadas como cintas concêntricas que são conectadas a blocos condutores. Cada cinta

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27/49 e segmento cintado pode ser ligada fisicamente com uma fonte de alimentação de eletroporação, ligado fisicamente separadamente a uma fonte de alimentação de eletroporação, e pode ser energizada em uma variedade de padrões e arranjos geométricos e sincronizados. Além do mais, as diferentes cintas e segmentos de cinta podem ser mantidos em diferentes potenciais elétricos (tensões) com respeito à primeira estrutura de eletrodo. Uma substância pode ser liberada através de uma abertura do canal (110, 112) na ponta distai (108) de maneira tal que ela permeie através de tecido para fora em uma região. A região pode coincidir com o campo elétrico que é gerado entre a primeira estrutura de eletrodo e a segunda estrutura de eletrodo. O campo elétrico intensifica a permeabilidade celular, intensificando assim a liberação da substância alvo desejada nas células.

[080] A fonte de alimentação de eletroporação pode ser uma fonte de alimentação convencional. As exigências e especificações de tais fontes de alimentação são bem descritas na literatura. Vide, por exemplo, Neumann et al., Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, Plenum Press, New York, N.Y., 1989; Chang et al., Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, San Diego, Calif., 1992; Jaroszeski et al., Eletrochemotherapy, Electrogenetherapy, and Transdermal Drug Delivery: Electrically Mediated Delivery of Molecules to Cells, Humana Press, Totowa, N.J., 2000; e Lynch and Davey, Electrical Manipulation of Cells, Chapman & Hall, New York, N.Y., 1996. As divulgações completas de cada qual dessas publicações estão incorporadas aqui pela referência.

[081 ] O arranjo microestrutural capaz de eletroporação pode compreender uma fonte de alimentação de corrente alternada adaptada para liberar corrente de eletroporação na estrutura de eletrodos a uma tensão e frequência desejadas, tipicamente selecionadas para liberar corrente de eletroporação nos eletrodos a

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28/49 uma tensão na faixa de 0,1 V a 30 kV. Em alguns casos, a tensão é menos que cerca de 300 a 500V. A tensão particular dependerá pelo menos em parte do espaçamento entre a primeira e segunda estruturas de eletrodo. A frequência tipicamente será na faixa de 10 Hz a 107 Hz, normalmente de 104 Hz a 106 Hz. A corrente pode ser aplicada em intervalos pulsados, tais como a cada 1,2, 3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, ou mais milissegundos, ou qualquer valor intermediário. 1,2,3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20, ou mais pulsos podem ser aplicados em um dado intervalo, e os intervalos podem ser repetidos até o resultado desejado ser obtido.

[082] É também divulgado aqui um método para liberar uma ou mais substâncias em múltiplos níveis celulares de um tecido, compreendendo: prover um arranjo microestrutural (100) compreendendo: um substrato planar (101) tendo uma superfície de topo (102) e uma superfície de base (103); um reservatório (104) em comunicação fluídica com a superfície de topo do substrato planar, em que o reservatório compreende a substância a ser liberada; e uma pluralidade de microestruturas (105) que se projetam a partir da superfície de base do substrato planar, cada qual da pluralidade de microestruturas compreendendo: uma porção de corpo sólida (106) que se afunila de uma base (107) até uma ponta distai (108) posicionada a uma altura da superfície de base do substrato planar, por meio disso definindo uma superfície da microestrutura; um primeiro canal de liberação (109) que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do primeiro canal (110) na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do primeiro canal; e um segundo canal de liberação (111) que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do segundo canal (112) na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do segundo canal; liberando uma ou mais

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29/49 substâncias dento do reservatório através dos canais de liberação nos múltiplos níveis celulares do tecido.

[083] É também divulgado aqui um método para liberar vesículas extracelulares de uma camada de células para uma outra camada de células, compreendendo: prover um arranjo microestrutural compreendendo: um substrato planar tendo uma superfície de topo e uma superfície de base; um reservatório em comunicação fluídica com a superfície de topo do substrato planar, em que o reservatório compreende a substância a ser liberada; e uma pluralidade de microestruturas que se projetam a partir da superfície de base do substrato planar, cada qual da pluralidade de microestruturas compreendendo: uma porção de corpo sólida que se afunila de uma base até uma ponta distai posicionada a uma altura da superfície de base do substrato planar, por meio disso definindo uma superfície da microestrutura; um primeiro canal que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do primeiro canal na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do primeiro canal; e um segundo canal que se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do segundo canal na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do segundo canal; isolar vesículas extracelulares de uma primeira camada de células através do primeiro canal; liberar as vesículas extracelulares em uma segunda camada de células por meio de um segundo canal. Em um exemplo, a primeira camada de células pode ser mais próxima da superfície externa do que a segunda camada de células.

[084] A porção de corpo sólida do arranjo microestrutural divulgado aqui, incluindo o substrato planar e o reservatório, pode ser formada de uma variedade de materiais, incluindo silício. É divulgado aqui um método para produzir o arranjo microestrutural (100). Isso pode incluir as etapas de formar um substrato

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30/49 substancialmente planar (101); e formar uma pluralidade de microestruturas (105) que se projetam em um ângulo em relação ao plano no qual o substrato planar fica, as microestruturas tendo uma base (107) integralmente conectada ao substrato, uma ponta distai (108) conectada à base, e a porção do corpo (106) entre as mesmas, em que pelo menos uma das microestruturas tem pelo menos um canal (109) que se estende substancialmente a partir da base porção através de pelo menos uma parte da porção do corpo, o canal sendo aberto ao longo de pelo menos parte da porção do corpo e em comunicação fluídica com o reservatório (104). Em várias modalidades, a etapa de formar as microestruturas compreende gravação, moagem por injeção, modelagem, ataque químico fotoquímico, usinagem eletroquímica, usinagem com descarga elétrica, estampagem de precisão, fresagem controlada numericamente por computador de alta velocidade, usinagem de parafuso suíço, litografia macia, ataque iônico quimicamente assistido direcional ou uma combinação dos mesmos.

[085] É também divulgado aqui um método provido para administrar uma substância a um sujeito que necessita da mesma, que inclui as etapas de inserir na pele do sujeito as microestruturas (105) do arranjo (100) descrito anteriormente, e fazer com que a substância seja transportada do reservatório (104) através de pelo menos um canal da microestrutura e através do estrato córneo da pele.

[086] Inúmeras modalidades da invenção foram descritas. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem fugir do espírito e escopo da invenção. Dessa maneira, outras modalidades estão de acordo com escopo das reivindicações seguintes.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Uso de Dispositivo de Nanotransfecção de Tecido para Liberação Cistólica Direta de Fatores de Reprogramação

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31/49 [087] É divulgado aqui um dispositivo para liberar tópica e controlavelmente fatores de reprogramação nos tecidos através de um dispositivo nanocanalizado (Fig. 6). Tal abordagem de nanotransfecção de tecido (TNT) permite, por exemplo, a liberação cistólica direta de fatores de reprogramação aplicando um campo elétrico altamente intenso e focado através de nanocanais arranjados (Gallego-Perez et al. Nanomedicine 2015; Boukany et al. Nat Nanotechnol 2011, 6(11): 747-754), que nanopora benignamente as membranas celulares do tecido justaposto, e aciona eletroforeticamente fatores de reprogramação nas células (Fig. 6 a-d). Um esquema do processo de fabricação do sistema TNT e resultados de simulação podem ser observados nas Figuras 1 e 2. Ao contrário das tecnologias de transfecção in vivo atuais (por exemplo, vírus, eletroporação de tecido convencional em células biológicas em suspensão ou BEP), nas quais liberação de gene é altamente estocástica por natureza e pode levar a efeitos laterais adversos (por exemplo, resposta inflamatória, morte celular) (Sen CK et al. Am J Pathol 2015, 185(10): 2629-2640), liberação a base de nanocanal permite liberação do fator de reprogramação mais amplo, benigno, instantâneo e controlado por dose ao nível de única célula, assim tornando essa uma abordagem mais segura e mais determinística para transfecção e reprogramação de gene in vivo.

[088] Experimentos com FAM-DNA marcados em camundongos C57BL/6 estabeleceram que TNT pode liberar carga na pele de uma maneira não invasiva/tópica e rápida (<l segundo) (Fig. 6e). Em seguida, foi determinado que a liberação de fatores de reprogramação tópica baseada em TNT pode levar a reprogramação da pele com êxito usando um modelo robusto onde sobreexpressão de Ascl1/Brn2/Myt1l (ABM) é conhecida para reprogramar diretamente fibroblastos em neurônios induzidos (iNs) in vitro (Vierbuchen et al. Nature 2010, 463(7284): 1035-1041). Essas descobertas mostraram que TNT

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32/49 não apenas pode ser usada para liberação de fatores de reprogramação tópica (Fig. 6f), mas ele pode também orquestrar uma resposta coordenada que resulta em propagação da reprogramação de estímulo (isto é, epiderme para derme) além do limite de transfecção inicial (isto é, epiderme) (Fig. 6g-i) possivelmente por meio de remoção do adesivo de vesículas extracelulares (EVs) ricas em mRNAs/cDNAs de gene alvo (Fig. 6h,i) (Valadi et al. Nat Cell Biol 2007, 9(6): 654-659). A exposição de células naive a EVs carregados com ABM isolados da pele tratada com TNT (Fig 6j-l) estabeleceu que esses EVs podem ser espontaneamente internalizados por células remotas (Fig. 6k). Além do mais, a análise de expressão genética indicou que injeção de ABM EV intradérmica desencadeou mudanças na pele consistentes com a indução neuronal (Fig. 61), evidenciado pelo aumento de aproximadamente 25 vezes em expressão de Tuj1 comparado com pele de controle. Comparativamente, AS-TNT resultou em um aumento de aproximadamente 94 vezes na expressão de Tujl, que reflete o efeito líquido de injeção de fator de reprogramação direta combinada com propagação mediada por EV. O efeito neurotrófico de EVs carregados com ABM derivados de pele confirmou adicionalmente em um modelo de camundongo com acidente vascular cerebral de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) (Fig. 9) (Khanna et al. J Cereb Sangue Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206).

[089] Reprogramação de célula da pele com êxito foi verificada por imunofluorescência, que mostrou expressão de Tujl e Neurofilamento aumentada com o tempo (Fig. 6m, n). Experimentos de rastreamento de linhagem com um modelo de camundongo repórter de K14-Cre confirmou que os neurônios recém-induzidos se originaram parcialmente das células de pele K14+ (Fig. 10). Folículos de cabelo também mostraram imunorreatividade de Tujl consistentemente marcada, sugerindo que células foliculares podem desempenhar potencialmente um papel no processo de reprogramação (Hunt et

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33/49 al. Stem Cells 2008, 26(1): 163-172; Higgins et al. J Invest Dermatol 2012, 132(6): 1725-1727). Experimentos adicionais com um modelo de camundongo CollAI-eGFP (Fig. 10), onde células com um promotor de CollAI ativo (por exemplo, fibroblastos dérmicos) expressam eGFP, mostraram inúmeras células de Colágeno/eGFP+ na derme em uma fase de transição para Tujl+, assim sugerindo também uma origem fibroblática para uma proporção das células reprogramadas na pele.

[090] Portanto, foi demonstrado aqui que TNT pode ser usada para liberar fatores de reprogramação na pele de uma maneira rápida, altamente efetiva, e não invasiva. Tal liberação de TNT leva a reprogramação de tecido de pele sob medida, como demonstrado com modelos de reprogramação recémdesenvolvidos bem estabelecidos e de INs e iECs, respectivamente. iECs derivados de pele induzidos por TNT rapidamente formaram redes de vaso sanguíneo que intercomunicaram com êxito com o sistema circulatório pai e restauraram o tecido e a perfusão do membro em dois modelos de murino de isquemia induzida por lesão. Essa abordagem simples para implementar TNT, que elicita e propaga respostas biológicas favoráveis poderosas através de um tratamento tópico de uma vez que dura apenas alguns segundos, pode encontrar aplicações no desenvolvimento de terapias baseadas em célula intervencionais inéditas para uma ampla variedade de aplicações.

Métodos

Fabricação da Plataforma de TNT [091] Dispositivos de TNT foram fabricados de (aproximadamente 200 pm) pastilhas de silício polidas de dupla face afinadas (100) (Fig. 7). Resumidamente, camadas de aproximadamente 1,5 pm de espessura de resina fotossensível AZ52I4E foram primeiro revestidas por centrifugação nas pastilhas de silício a aproximadamente 3.000 rpm. Aberturas em escala nanométrica foram

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34/49 subsequentemente padronizadas na resina fotossensível usando um sistema passo a passo GCA 6I00C. Até 16 matrizes de arranjos de abertura em escala nanométrica foram padronizadas por pastilha de 100-mm. Tais aberturas foram então usadas como máscaras de ataque químico para perfurar nanocanais de aproximadamente 10 pm de profundidade na superfície de silício usando ataque iônico reativo profundo (DRIE) (Oxford Plasma Lab 100 sistema). As condições de ataque químico otimizadas incluíram gás SF6: 13 s/100 sccm de fluxo de gás/7000 W ICP potência/40 W RF potência/30 mT APC pressão; condição de gás C4F8: 7 s/100 sccm de fluxo de gás/potência 700 W ICP/potência 10 W RF /pressão APC30 mT. Reservatórios em escala micrométrica foram então padronizados na parte de trás das pastilhas por meio de fotolitografia de contato e DRIE. Finalmente, uma camada isolante/protetora de aproximadamente 50 nm de espessura de nitreto de silício foi depositada na superfície da plataforma de TNT.

Zootecnia [092] Camundongos C57BL/6 foram obtidos de Harlan Laboratory. Camundongos B6.129(Cg)- Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J obtidos da Jackson laboratories, foram procriados com K14cre para produzir camundongos K14cre/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J.

Todos os camundongos foram machos e de 8-12 semanas de idade no momento do estudo. PCR de genotipagem para camundongos ROSAmT/mG foi conduzida usando oligonucleotídeos iniciadores OIMR73I8- CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT (SEQ ID NO: 1), OIMR73I9- CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA (SEQ ID NO: 2) e 0IMR732O- TCA ATG GGC GGG GGT CGT T (SEQ ID NO: 3), embora transgene K-I4 Cre tenha sido confirmada usando oligonucleotídeos iniciadores 0IMRIO84-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC (SEQ ID NO: 4); 0IMRIO85GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT (SEQ ID NO: 5). Os animais foram

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35/49 marcados e agrupados aleatoriamente usando um algoritmo baseado em computador.

Cultura de célula de mamífero e reprogramação in vitro [093] Fibroblastos dérmicos de humano adulto primários (ATCC PCS-201 -012) foram adquiridos, sem micoplasma e certificados, diretamente pela ATCC. Não foi conduzida nenhuma linhagem celular adicional. Essas células foram expandidas em meio de fibroblasto basal suplementado com kit de crescimento de fibroblasto sem soro (ATCC PCS 201-040) e penicilina/estreptomicina. Fibroblastos embriônicos de camundongo E12.5-E14 (MEFs) foram cultivados em DMEM/FI2 suplementados com 10% de soro bovino fetal. Experimentos de transfecção e reprogramação de célula não viral foram conduzidos por meio de Eletroporação de Nanocanal em3D (NEP). Resumidamente, as células foram primeiramente crescidas até confluência total por toda a noite no dispositivo NEP3D. Subsequentemente, um campo elétrico pulsado foi usado para liberar o coquetel de plasmídeo (0,05 pg/pL) nas células consistindo em uma mistura 1:1:1 de FH1 :Etv2:Foxc2. As células foram então colhidas 24 horas após liberação de plasmídeo, colocadas em meio basal EBM-2 (CC-3I56, Lonza) suplementadas com EGM-2 MV SingleQuot kit (CC-4I47, Lonza), e processadas adicionalmente para experimentos/medições adicionais.

Reprogramação in vivo [094] As áreas a ser tratadas foram primeiro naired 24-48 horas antes de TNT. A pele foi então esfoliada para eliminar a camada de célula morta/queratina e expor células nucleadas na epiderme. Os dispositivos de TNT foram colocados diretamente sobre a superfície da pele esfoliada. Coquetéis de ABM ou plasmídeo de EFF foram carregados no reservatório a uma concentração de 0,05-0,1 pg/pL. Um eletrodo revestido com ouro (isto é, catodo) foi imerso na solução de plasmídeo, enquanto um contraeletrodo de agulha contraeletrodo

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24G (isto é, anodo) foi inserido intradermicamente, justaposto na superfície de plataforma de TNT. Um estímulo elétrico pulsado (isto é, 10 pulsos de 250 V de amplitude e uma duração de 10 ms por pulso) foi então aplicado através de eletrodos para nanoporar as membranas celulares expostas e acionar a carga de plasmídeo nas células através dos nanocanais. Plasmídeo ABM foram misturados a uma razão molar de 2:1:1.

Cirurgia e análise de acidente vascular cerebral MC AO [095] Isquemia cerebral focal transiente foi induzida em camundongos por oclusão da artéria cerebral média (MCAO) foi obtida usando a técnica de inserção de filamento intraluminal previamente descrita (Khanna et al. J Cereb Sangue Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206). Imagens de MRI foram usadas para determinar o tamanho de infarto como uma porcentagem do hemisfério contralateral após corrigir para levar em conta o edema.

Cirurgia de isquemia do membro posterior [096] Isquemia do membro posterior unilateral foi induzida por meio de oclusão e transecção subsequente da artéria femoral seguido por transsecção (Limbourg et al. Nat Protoc 2009, 4(12): 1737-1746). Resumidamente, camundongos de 810 semanas foram anestesiados com isoflurano l-3%, colocados supinos sob um estereomicroscópioo (Zeiss OPMI) em uma almofada aquecida. A artéria femoral foi exposta e separada da veia femoral através de uma incisão de aproximadamente 1 cm. Oclusão da extremidade proximal e distai foi induzida com 7-0 sutura de seda, que foi então seguido por transação completa da artéria. Finalmente, uma dose única de buprenorfina foi administrada subcutaneamente para controlar a dor. Imageamento por Speckle laser (MoorLDI-Mark 2) foi conduzido 2 horas após a cirurgia para confirmar a oclusão do fluxo sanguíneo com êxito.

Isolamento de vesículas extracelulares (EVs)

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37/49 [097] EVs foram isoladas de biópsias de pele de 12 mm de diâmetro que foram coletadas nos blocos de OCT e armazenadas congeladas para uso posterior. Resumidamente, os blocos foram descongelados e lavados com salina de tampão de fosfato (PBS) para eliminar o OCT. Depois da remoção do tecido gorduroso com um escalpelo, o tecido de pele foi picado em peças de aproximadamente 1 mm e homogeneizado com um microtriturador em PBS. Após centrifugação a 3.000 g, um kit Exoquick (Sistema Biosciences) foi usado a uma razão de 1:5 (Exoquick:sobrenadante) para isolar EVs do sobrenadante por 12 horas a 4°C. EVs foram precipitados por meio de centrifugação a 1.500 g por 30 min. RNA total foi então extraído do precipitado usando o kit mirvana (Life technologies) seguindo as recomendações providas pelo fabricante.

Preparação de plasmídeo de DNA [098] Plasmídeos de ABM e EFFforam preparados usando o kit de purificação de DNA de plasmídeo (Qiagen Maxi-prep, catalogue number 12161, e Clontech Nucleobond catalogue number 740410). Concentrações de DNA foram obtidas de um Nanodrop 2000c Spectrophotemeter (Thermoscientific). Uma lista de construtos de DNA de plasmídeo e suas fontes originais pode ser observada na Tabela 1.

Tabela 1: cDNAde Plasmídeo
Nome do Construto	Inserto de Gene	Plasmídeo
		Espinha dorsal
Brn2-RFP	Brn2	pCAGGs
Myt1 l-CFP	Mytll	pCAGGs
AscU-GFP	Ascl1	pCAGGs
plRES-ER71 (HA)3	Etsvp71 (ER71)	plRES-hrGFP-2a
pAd-HA-Fli1-IREShrGFP	HA-FIÍ1	pAd-IRES-GFP

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38/49 mFoxc2 mFoxc2 pCDNA3.0 [099] LCM foi realizada usando um sistema de microdissecação a laser pela Technologies PALM (Bernreid, Alemanha). Regiões específicas de seções de tecido, identificadas baseadas em morfologia e/ou imunomanchamento, foram cortadas e capturadas sob uma lente ocular 20x. As amostras foram lançadas em 25 pL tampão de extração de lise de célula direta (I nvitrogen). Aproximadamente 1.000.000 pm² de área do tecido foram capturados em cada tampa e o lisato foi então armazenado a -80°C para processamento posterior. qRT-PCR das amostras de LCM foram realizadas pelo tampão de lise direta de célula seguindo a instrução do fabricante. Uma lista de oligonucleotídeos iniciadores pode ser observada na Tabela 2.

Table 2. Lista de Iniciadores
Nome do iniciador/sonda	Sequência de Iniciador
Ascii q F	5’-CGACGAGGGATCCTACGAC-3’ (SEQ ID NO: 6)
Ascii q R	5’-CTTCCTCTGCCCTCGAAC-3’ (SEQ ID NO: 7)
Brn2 q F	5’-GGTGGAGTTCAAGTCCATCTAC-3’ (SEQ ID NO: 8)
Brn2 q R	5’-TGGCGTCCACGTAGTAGTAG-3’ (SEQ ID NO: 9)
Myt1L q F	5’-ATACAAGAGCTGTTCAGCTGTC-3’ (SEQ ID NO: 10)
Myt1L q R	5’-GTCGTGCATAI I IGCCACTG-3’ (SEQ ID NO: 11)
PECAM1 F	5’-GGACCAGTCCCCGAAGCAGC-3’ (SEQ ID NO: 12)
PECAM1 R	5’-AGTGGAGCAGCTGGCCTGGA-3’ (SEQ ID NO: 13)
VEGFR2 F	5’-AGCGCTGTGAACGCTTGCCT-3’ (SEQ ID NO: 14)
VEGFR2 R	5’-CATGAGAGGCCCTCCCGGCT-3’ (SEQ ID NO: 15)
EGFP-N	5’-CCGTCCAGCTCGACCAG-3’ (SEQ ID NO: 16)
EGFP-C	5’-GATCACATGGTCCTGCTG-3’ (SEQ ID NO: 17)
Cdh5 F	5’-GTGCAACGAGCAGGGCGAGT-3’ (SEQ ID NO: 18)
Cdh5 R	5’-GGAGCCACCGCGCACAGAAT-3’ (SEQ ID NO: 19)
m-K14 F	5’-GCTGGTGCAGAGCGGCAAGA-3’ (SEQ ID NO: 20)
m-K14 R	5’-AGACGGCGGTAGGTGGCGAT-3’ (SEQ ID NO: 21)
m-Tu]1 F	5’-TACACGGGCGAGGGCATGGA-3’ (SEQ ID NO: 22)
m-Tu]1 R	5’-TCACTTGGGCCCCTGGGCTT-3’ (SEQ ID NO: 23)
m-Col1A1 F	5’-GTGTGATGGGATTCCCTGGACCTA-3’ (SEQ ID NO: 24)
m-Col1A1 R	5’-CCTGAGCTCCAGCTTCTCCATCTT-3’ (SEQ ID NO: 25)
m-MAP2 F	5’-AGGCCAGGTGGTGGACGTGT-3’ (SEQ ID NO: 26)
m-MAP2 R	5’-CACGCTGGACCTGCTTGGGG-3’ (SEQ ID NO: 27)
m-GAPDH F	5’-GTGCAGTGCCAGCCTCGTCC-3’ (SEQ ID NO: 28)
m-GAPDH R	5’-GCACCGGCCTCACCCCAI I I-3' (SEQ ID NO: 29)

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Imuno-histoquímica e Microscopia Confocal [0100] Imunomanchamento de tecido foi realizado usando anticorpos específicos e procedimentos padrões. Resumidamente, tecido embutido em OCT foi criosseccionado a 10pm de espessura, fixado com acetona fria, bloqueado com 10% de soro de cabra normal e incubado com anticorpos específicos. O sinal foi visualizado por incubação subsequente com anticorpos secundários apropriados marcados com fluorescência (um porquinho-da-índia marcado com Alexa 488, 1:200, um coelho marcado com Alexa 488,1:200; um coelho marcado com Alexa 568, 1:200) e contramanchados com DAPI. Imagens foram capturadas por microscópio confocal de varredura a laser (filtro/espectro Olympus FV I000).

Imageamento por I VIS [0101] Os animais foram imageados com anestesia 24 horas após transfecção de FAM-DNA usando sistema de imageamento óptico I VIS Lumina II. Imagens de sobreposição com imagens de luminescência foram feitas usando software Living Image.

Imageamento por ressonância magnética (MRI) de cérebros que sofreram acidente vascuar cerebral [0102] Angiografia de ressonância magnética foi usada para validar nosso modelo de MCAO em camundongos e otimizar o tamanho do oclusor e a distância de inserção da artéria carótida interna para MCAO efetivo. MRI ponderada por T2 foi realizado em camundongos anestesiados 48 horas após reperfusão de MCA usando 9,4 T MRI (Bruker Corporation, Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA). Imagens de MR foram adquiridas usando uma sequência Aquisição Rápida com Melhoria de Relaxamento (RARE) usando os seguintes parâmetros: campo de visão (FOV) 30 ^x 30 mm, matriz de aquisição 256 ^x256, TR 3.500 ms, TE 46.92 ms, lacuna da fatia 1,0 mm, fator Rare 8, número de médias 3. Resolução de 8,5 pixels por mm. Imagens de MR brutas

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40/49 foram convertidas no formato DICOM padrão e processadas. Após melhoria de contraste de software apropriada de imagens usando Osirix v3.4, planimetria digital foi realizada por um observador mascarado para delinear a área de infarto em cada fatia do cérebro coronário. Áreas de infarto das fatias de cérebro foram somadas, multiplicada por espessura de fatia, e corrigidas com relação ao inchaço induzido por edemas previamente descritos para determinar volume de infarto (Khanna S, et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206).

Análise de energética muscular [0103] Energética muscular foi avaliada por medições por espectroscopia NMR em um escâner 9.4 Tesla (Bruker BioSpec) usando uma bobina de volume para transmissão de RF e uma bobina 3IP para recepção (Fiedler et al. MAGMA 20I5, 28(5): 493-501.). O imageamento in v/vofoi conduzido em um arranjo de bobina de transceptor 1H/31P customizado. Dados foram adquiridos usando sequência de pulsos únicos. Os dados brutos foram coletados para redução de ruído e transformada de Fourier no domínio de espectro.

Imageamento baseado em ultrassom e caracterização de vasos sanguíneos [0104] A formação de vaso sanguíneo foi paralelamente monitorada por meio de imageamento por ultrassom.

[0105] Resumidamente, um sistema Vevo 2100 (Visual Sonics, Toronto, ON, Canadá) foi usado para obter imagens de ultrassom em modo B com uma sonda de arranjo linear v(Gnyawali et al. J Vis Exp 2010(41). Imageamento de fluxo colorido Doppler foi implementado para monitorar e quantificar características do fluxo sanguíneo sob sístole e diástole.

Análise estatística [0106] Amostras foram codificadas e análise de dados foi realizada em um modo cego. Para estudos de animal, dados são reportados como média ± SD de 3

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41/49 animais (isto é, replicatas biológicas). Nenhum animal foi excluído da análise. Igualmente, dados de reprogramação in vitro são reportados como média ± SD de pelo menos 3 experimentos. Os experimentos foram replicados pelo menos duas vezes para confirmar a reprodutibilidade. Comparações entre grupos foram feitas por análise de variância (ANOVA). Diferenças estatísticas foram determinadas por meio de testes paramétricos/não paramétricos como apropriado com SigmaPlot version 13.0.

[0107] Os resultados divulgados usando abordagem baseada em TNT são indicativos do que pode ser realizado usando liberação a base de nanocanal, incluindo o arranjo microestrutural divulgado aqui.

Exemplo 2:

[0108] Em uma modalidade particular, nanocanais interpenetrantes arranjados podem ser fabricados a partir de materiais a base de silício usando métodos de ambiente limpo tais como fotolitografia e ataque químico úmido ou seco. Primeiramente, um arranjo de microestruturas interpenetrantes cônicas ou piramidais (aproximadamente 20-500 microns de altura) é definido em uma superfície de silício usando fotolitografia e ataque químico úmido ou seco. Subsequentemente, o substrato de silício é padronizado no lado de trás com um arranjo de nanopoços (aproximadamente 300-1.000 nm de diâmetro) usando litografia de projeção. Em seguida, um ataque iônico reativo profundo altamente anisotrópico (DRIE) para perfurar nanocanais através do substrato de silício e das microestruturas interpenetrantes.

[0109] O que se segue é um método de exemplo para fabricação de arranjos de microagulha nanocanalizados em silício (1) Fabricação de Arranjo de Nanocanal 3D

1. Selecionar pastilha de silício de 4 polegadas: 500 pm, DSP, grau Prime.

2. Afinar a pastilha até 250 pm de espessura por ataque químico úmido

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42/49 (KOH, 45 %, 80 Graus C)

3. Padronizar o arranjo de nanocírculo AZ-5214 (400 nm de diâmetro, espaçamento: 25 pm) usando o sistema passo a passo (NTW).

4. Ataque químico DRIE da pastilha de silício mascarada pelo padrão AZ5214.

Sistema: Oxford Plasma Lab 100 em Dreese Lab

Nome da Receita: Lingqian_Bosch

Protocolo SF6: 100 sccm / 13 s / ICP 700 W / RF 30 W / Pressão da Câmara 30 mT (dupla verificação)

Protocolo C4F8: 100 sccm / 7 s / ICP 700 W / RF 10 W / Pressão da Câmara 30 mT (dupla verificação)

Procedimento de Ataque Químico: passar 40 ciclos; 5 minutos de parada; Passar mais 5 ciclos; 5 minutos de parada e verificar se ainda houver resina fotossensível remanescente. Se sim, passar mais 5 ciclos. Verificação novamente. Normalmente, os PR são totalmente feitos com 55 - 60 ciclos. (Favor ficar atento, não Passar diretamente 60 ciclos em vez de 40 + 5 + 5 + 5 +5. Senão, os PR serão queimados após 60 ciclos)

5. Limpar a pastilha de silício / AZ5214 completamente usando TMP; Limpar a pastilha em solução Piranha por 5 minutos (120 Graus C). Verificar se o arranjo de nanocanal é visível usando Microscópio Olympus em Baia 1 (NTW)

6. Procedimento de Fotolitografia Padrão para arranjo de microcanal padrão (50 pm de diâmetro; distância Centro a Centro: 70 pm) no outro lado da pastilha de silício. Resina fotossensível: SPR 220-7; Espesssura: 10 pm. No procedimento padronização: Certificar se o arranjo de microcanal está no geral com mesma direção do arranjo de nanocanal.

7. Preparar uma outra pastilha de silício com 250 pm de espesssura.

8. Revestir totalmente o óleo da bomba (usado para ETC04 na Baia 4,

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NTW) no lado do nanocanal. Chave: óleo em toda a superfície da pastilha de silício em vez de uma gotícula. Senão, a área sem óleo cozinhará o SPR 220 PR em procedimento DRIE.

9. Ligar cuidadosamente e totalmente a pastilha de silício de 250 pm de espessura com lado nanocanal, em interface com óleo. Este modo é para reduzir o calor do sistema DRIE a longo prazo mantendo ao mesmo tempo a pastilha de silício rígida o bastante à força de hélio no procedimento de DRIE.

10. Ataque químico DRIE da pastilha de silício mascarada por SPR 2207.

Sistema: Oxford Plasma Lab 100 em Dreese Lab

Nome da receita: Lingqian_Bosch

Protocolo C4F8: 100 sccm / 7 s / ICP 700 W / RF 10 W/ Pressão da câmara 30 mT (dupla verificação)

Procedimento de Ataque químico: Passar 250 ciclos; 5 minutos de parada; Passar mais 20 ciclos; 5 minutos de parada e verificar se ainda houver resina fotossensível remanescente. Se sim, Passar mais 10 ciclos. Verificação novamente. Em experiência, microcanal conectará nanocanal após cerca de 280 ciclos. Entretanto, o ciclo preciso é impossível de fixar uma vez que o sistema Oxford Plasma está sempre derivando. Portanto, após 270 ciclos, SEM deve ser usado para verificar a seção transversal de microcanal em qualquer tempo de parada, para avaliar que se todo microcanal foi conectado com nanocanal (Essa parte é na maioria das vezes demorada que precisa cerca de 3-5 dias, dependendo da disponibilidade)

11. Remover lenta e cuidadosamente a amostra

12. Limpar a pastilha em solução Piranha por 5 minutos (120 Graus C).

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Verificar o arranjo de nanocanal e o arranjo de microcanal usando Olympus Microscópio na Baia 1 (NTW)

13. Dependendo do projeto de nanocanal, a pastilha de silício foi cortada em pequenas peças.

(2) Fabricação de microagulhas usando DRIE

1. Pegar uma amostra de silício com a dimensão de 1 cm X 1 cm e limpar completamente a amostra com solução piranha.

2. Arranjo de microcírculo padrão do lado do nanocanal: resina fotossensível SPR 220-7, 10 pm de espesssura. Microcírculo padrão: 15 pm de diâmetro, que finalmente determinou a dimensão da agulha em formato de vulcão. Espaçamento: centro - centro 25 pm. Condição Ideal: alinhar microcírculo com arranjo de nanocanal em foto litografia, que pode aumentar a porcentagem de agulha oca.

3. Colar uma pequena amostra em uma pastilha de 4 polegadas fresca com óleo (área total revestida com óleo)

4. Procedimento de DRIE: Oxford Plasma Lab 100

Receita: Ataque químico Lingqianjsotropic (dupla verificação)

Protocolo: SF6: 40 seem / ICP potência: 600 W/ RF potência 5 W -10 W (que determina a formato do vulcão). Tempo do ataque químico: 2 minutos; parar e verificar se existem PR remanescentes; se sim, mais 1 minuto e verificar se PR permanece; se Sim, mais um minuto. Se não, verificar o microscópio ou SEM. Se a agulha não for mostrada, continuar o ataque químico 1 minuto sem máscara.

5. Sob o protocolo otimizado anteriormente, a microagulha será fabricada com ~2+ 1 +1 minutos.

Exemplo 3:

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45/49 [0110] Em uma modalidade particular, nanocanais interpenetrantes arranjados podem ser fabricados a partir de uma plataforma prefabricada de substrato nanocanalizado que pode tanto ser a base de silício quanto fabricada a partir de alumina anodizada por meio de ataque químico superficial seletivo. Ataque químico superficial seletivo é usado para definir microestruturas interpenetrantes Exemplo 4:

[0111] Em uma modalidade preferida, um método que libera carga nos tecidos biológicos em múltiplos níveis é realizado usando um arranjo de nanocanais interpenetrantes. O arranjo de nanocanais interpenetrantes é colocado em contato com tecido de pele esfoliada. Um eletrodo positivo é inserido intradermicamente, enquanto um eletrodo negativo é colocado em contato com a solução de carga. Um campo elétrico pulsado (250 V, pulsos de 10 ms, 10 pulsos) é então aplicado através de eletrodos para nanoporar membranas celulares expostas e injetar a carga diretamente dentro do citosol.

[0112] A solução de carga compreendeu uma mistura de três plasmídeos, que codificam para Etv2, Foxc2 e FI1. Biópsias de tecido pequeno foram coletadas 24 horas após liberação e analisadas por qRT-PCR. Biópsias adicionais foram coletadas 7 dias após a liberação e analisadas por meio de imuno-histoquímica com relação a marcadores endoteliais. Liberação baseada em DTN resultou em expressão transgene superior, bem como em respostas a reprogramação amplamente distribuídas através de toda a espessura do tecido.

[0113] A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados comumente entendidos pelos versados na técnica aos quais a invenção divulgada diz respeito. Publicações citadas aqui e os materiais para os quais elas são citadas estão especificamente incorporados pela referência.

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46/49 [0114] Versados na técnica perceberão, ou serão capazes de certificar, usando não mais que experimentos de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes devem ser englobados pelas reivindicações seguintes.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Arranjo microestrutural (100) caracterizado pelo fato de que compreende:

um substrato planar (101) tendo uma superfície de topo (102) e uma superfície de base (103);

um reservatório (104) em comunicação fluídica com a superfície de topo do substrato planar; e uma pluralidade de microestruturas (105) se projetando da superfície de base do substrato planar, cada qual da pluralidade de microestruturas compreendendo:

uma porção de corpo sólida (106) que se afunila de uma base (107) até uma ponta distai (108) posicionada a uma altura da superfície de base do substrato planar, por meio disso definindo uma superfície da microestrutura; um primeiro canal de liberação (109) se estendendo da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do primeiro canal (110) na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do primeiro canal; e um segundo canal de liberação (111) se estendendo da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do segundo canal (112) na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do segundo canal.
2. Arranjo microestrutural, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a abertura do primeiro canal é posicionada em um primeiro plano paralelo ao substrato planar, em que a abertura do segundo canal é posicionada em um segundo plano paralelo ao substrato planar, e em que o primeiro plano é

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2/8 distalmente espaçado do segundo plano.
3. Arranjo microestrutural, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano por uma distância de 20% a 60% da altura da superfície de base do substrato planar.
4. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

3, caracterizada pelo fato de que a abertura do primeiro canal é posicionada na ponta distai.
5. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

4, caracterizada pelo fato de que cada qual da pluralidade de microestruturas compreende adicionalmente um terceiro canal de liberação (113) se estendendo da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do terceiro canal (114) na superfície da microestrutura, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do terceiro canal.
6. Arranjo microestrutural, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a abertura do primeiro canal é posicionada em um primeiro plano paralelo ao substrato planar, em que a abertura do segundo canal é posicionada em um segundo plano paralelo ao substrato planar, em que a abertura do terceiro canal é posicionada em um terceiro plano paralelo ao substrato planar; e em que o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano e o segundo plano é distalmente espaçado do terceiro plano.
7. Arranjo microestrutural, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro plano é distalmente espaçado do segundo plano por uma distância de 20% a 60% da altura da superfície de base do substrato planar.
8. Arranjo microestrutural, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o segundo plano é distalmente espaçado do terceiro plano por

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3/8 uma distância de 20% a 60% da altura da superfície de base do substrato planar.
9. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

8, caracterizado pelo fato de que a altura da superfície da microestrutura é de 5 microns a 1.000 microns.
10. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

9, caracterizado pelo fato de que a largura da base da microestrutura é de 5 microns a 500 microns.
11. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -

10, caracterizado pelo fato de que a base da microestrutura tem um formato substancialmente circular.
12. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a base tem um formato substancialmente retangular.
13. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

12, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de microestruturas compreende cristas paralelas, cristas arranjadas em um padrão em ziguezague, cristas arranjadas em um padrão em forma de onda, cones ou pirâmides.
14. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

13, caracterizado pelo fato de que a ponta distai da microestrutura é pontuda, redonda, inclinada, dilatada, cônica, romba ou combinações das mesmas.
15. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

14, caracterizado pelo fato de que o primeiro canal de liberação e o segundo canal de liberação têm cada qual uma seção transversal substancialmente circular em um plano paralelo ao substrato planar.

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16. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro canal de liberação e o segundo canal de liberação têm cada qual uma seção transversal substancialmente retangular em um plano paralelo ao substrato planar.
17. Arranjo microestrutural, de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro canal de liberação e o segundo canal de liberação têm cada qual uma seção transversal substancialmente toroidal em um plano paralelo ao substrato planar; e em que o segundo canal de liberação é coaxialmente disposto em torno do primeiro canal de liberação.
18. Arranjo microestrutural, de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro canal de liberação tem uma seção transversal substancialmente circular em um plano paralelo ao substrato planar e o segundo canal de liberação tem uma seção transversal substancialmente toroidal em um plano paralelo ao substrato planar; e em que o segundo canal de liberação é coaxialmente disposto em torno do primeiro canal de liberação.
19. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que cada qual da pluralidade de microestruturas compreende uma porção de corpo sólida que se afunila de uma maneira escalonada da base até a ponta distai.
20. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que cada qual da pluralidade de microestruturas compreende uma porção de corpo sólida tendo um formato frustocônico.
21. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

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20, caracterizado pelo fato de que a porção de corpo sólida de cada qual da pluralidade de microestruturas é formada de silício.
22. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

21, caracterizado pelo fato de que o substrato planar é formado de silício.
23. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

22, caracterizado pelo fato de que o substrato planar compreende adicionalmente uma pluralidade de canais de liberação, cada um dos quais se estende da superfície de topo do substrato planar até uma abertura do canal na superfície de base do substrato planar, por meio disso conectando fluidicamente o reservatório à abertura do canal na superfície de base do substrato planar.
24. Arranjo microestrutural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

23, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: um primeiro eletrodo em contato elétrico com o reservatório e um segundo eletrodo configurado para colocar em contato eletricamente um tecido posicionado contra a superfície de base do substrato planar.
25. Método para liberar uma substância para células em um tecido, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

aplicar o arranjo microestrutural de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24 ao tecido, de maneira tal que a superfície de base do substrato planar fique posicionada contra o tecido e a pluralidade de microestruturas se estende ao interior do tecido;

liberar uma substância do reservatório através do primeiro canal de liberação e do segundo canal de liberação de cada qual da pluralidade de microestruturas nas células do tecido.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que

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6/8 a substância é simultaneamente liberada nos múltiplos níveis celulares do tecido.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado pelo fato de que a substância é liberada por meio de tensão, manualmente, força de cisalhamento, difusão, injeção, pressão, eletroporação, osmose, gradientes de concentração, campo eletromagnético, ultrassom de baixa frequência ou combinações dos mesmos.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a substância é liberada por meio de eletroporação.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o arranjo microestrutural compreende um primeiro eletrodo em contato elétrico com o reservatório e um segundo eletrodo em contato elétrico com o tecido; e em que a liberação por meio de eletroporação compreende aplicar um campo elétrico através do primeiro eletrodo e do segundo eletrodo para eletroporar as células no tecido, e acionar a substância do reservatório através do primeiro e segundo canais de liberação de cada qual da pluralidade de microestruturas e dentro das células do tecido.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o campo elétrico é aplicado a um potencial de 1 V a 500 V.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 30, caracterizado pelo fato de que o campo elétrico compreende um campo elétrico pulsado.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o campo elétrico pulsado compreende uma pluralidade de pulsos tendo uma duração de 0,1 milissegundo a 100 milissegundos.

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33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 32, caracterizado pelo fato de que o campo elétrico pulsado compreende de 1 a 500 pulsos.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 33, caracterizado pelo fato de que a liberação da substância é controlada por um sistema de realimentação.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 34, caracterizado pelo fato de que a substância compreende um agente terapêutico.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um ácido nucleico.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um peptídeo ou polipeptídeo.
38. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma molécula pequena.
39. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma vacina.
40. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico compreende vesículas isoladas das células que foram reprogramadas.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem exossomas.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 34, caracterizado pelo fato de que a substância compreende um agente de

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8/8 diagnóstico.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 42, caracterizado pelo fato de que o reservatório compreende duas ou mais diferentes substâncias, e o método compreende liberar as duas ou mais substâncias simultaneamente nas células no tecido.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 43, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente injetar uma substância no tecido a um nível além do qual a pluralidade de microestruturas se estende ao interior do tecido.