KR102539625B1

KR102539625B1 - 나노채널 기반 카고 전달을 위한 상호침투 마이크로구조물

Info

Publication number: KR102539625B1
Application number: KR1020197021274A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 갈레고-페레즈; 찬단 센; 나탈리아 히구이타-카스트로; 링챈 창
Original assignee: 오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2023-06-05
Also published as: BR112019012924A2; AU2017379879C1; US20190329014A1; AU2017379879B2; KR20190099479A; CN110494126A; US11235132B2; AU2017379879A1; JP7114094B2; CA3045958A1; EP3558265A1; WO2018119090A1; JP2020513900A; EP3558265A4

Abstract

본원에서는 국소적으로 및 제어가능하게 카고를 생물학적 조직, 특히 피부를 거쳐 또는 안으로 카고를 전달하기 위한 장치 및 방법이 제공된다. 이들 장치는 조직의 보다 깊은 세포 층으로 카고의 전달을 가능하게 한다. 이들 장치는 나노채널을 포함하는 마이크로구조물 어레이를 포함한다. 또한, 프레임에 내장된 하나 이상의 마이크로구조물 어레이를 포함하는 장치가 기재된다.

Description

나노채널 기반 카고 전달을 위한 상호침투 마이크로구조물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 12월 22일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/438,256호의 우선권을 주장하고 이의 내용은 전문이 본원에 참조로 인용된다.

기술분야

본 발명은 나노기술 및 보다 특히 나노채널 및 나노채널 기반 전달 방법에 관한 것이다.

생물학적 조직을 거쳐 또는 안으로 치료학적 제제를 전달하기 위한 통상의 기술은 나노채널 어레이의 사용이다. 그러나, 현재 나노채널 기반 전달 방법은 단지 직접적으로 조직의 최외곽 세포 층으로 카고를 전달할 수 있고 상기 기술의 작용 범위를 크게 제한한다. 따라서. 카고를 조직의 보다 깊은 세포 층으로 전달할 수 있는 나노채널 기반 전달 방법이 요구된다. 본 발명의 배경이 되는 기술은 일본 공표특허공보 특표2006-518675호 (2006.08.17.)에 개시되어 있다.

본원에서는 국소적으로 및 제어가능하게 카고를 생물학적 조직, 특히 피부를 거쳐 또는 안으로 카고를 전달하기 위한 장치 및 방법이 제공된다. 이들 장치는 조직의 보다 깊은 세포 층으로 카고의 전달을 가능하게 한다. 이들 장치는 나노채널을 포함하는 마이크로구조 어레이를 포함한다.

일부 구현예에서, 마이크로구조물 어레이는 상부 표면 및 하부 표면을 갖는 평면 기판, 상기 평면 기판의 상부 표면과 통류하는 유체 중 저장소, 및 평면 기판의 하부 표면으로부터 돌출된 다수의 마이크로구조물을 포함한다. 다수의 마이크로구조물 각각은 기저부로부터 평면 기판의 하부로부터의 일정 높이에 위치한 말단 팁까지 테이퍼링됨으로써 마이크로구조물 표면을 한정하는 고형 바디 부분을 포함한다. 다수의 마이크로구조물의 각각은 또한 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 제1 채널 개구부까지 연장하여 상기 저장소를 상기 제1 채널 개구부에 유동적으로 연결시키는 제1 전달 채널을 포함한다. 다수의 마이크로구조물 각각은 또한 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 마이크로구조물 표면 내 제2 채널 개구부까지 연장되어 상기 저장소를 제2 채널 개구부로 유체적으로 연결시키는 제2 전달 채널을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 채널 개구부는 평면 표면과 병행하는 제1 평면내에 위치하고 제2 채널 개구부는 평면 기판에 병행하는 제2 평면내에 위치한다. 이들 구현예에서, 제1 평면은 제2 평면과 원위적으로 이격되어 있다. 이들 구현예의 일부에서, 제1 평면은 평면 기판의 원위 팁과 하부 사이 높이의 20% 내지 60%의 거리 만큼 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있다. 다른 구현예에서, 제1 채널 개구부는 말단 팁에 위치한다.

일부 구현예에서, 다수의 마이크로구조물 각각은 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 제3 채널 개구부까지 연장되어 상기 저장소를 제3 채널 개구부에 유체적으로 연결시키는 제3 전달 채널을 추가로 포함한다. 이들 구현예의 일부에서, 제1 채널 개구부는 평면 기판과 평행한 제1 평면에 위치하고, 제2 채널 개구부는 평면 기판에 평행한 제2 평면 내에 위치하며, 제3 채널 개구부는 평면 기판에 평행한 제3 평면 내에 위치한다. 이들 구현예에서, 제1 평면은 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고 제2 평면은 제3 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있다. 이들 구현예의 일부에서, 제1 평면은 평면 기판의 말단 팁과 하부 사이 높이의 20% 내지 60%의 거리 만큼 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고, 제2 평면은 평면 기판의 말단 팁과 바닥 사이 높이의 20% 내지 60%의 거리 만큼 제3 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있다.

일부 구현예에서, 평면 기판의 말단 팁과 바닥 사이의 높이는 20 마이크론 내지 1000 마이크론이다.

일부 구현예에서, 기저부는 실질적으로 원형 형태를 갖는다. 다른 구현예에서, 기저부는 실질적으로 직사각형 형태를 갖는다.

일부 구현예에서, 고형 바디 부분은 규소 또는 규소계 재료, 예를 들어, 질화규소로부터 형성된다. 다른 구현예에서, 평면 기판은 규소 또는 규소계 재료로부터 형성된다. 다른 구현예에서, 고형 바디 부분은 애노드화된 산화알루미늄으로부터 형성된다. 다른 구현예에서, 평면 기판은 애노드화된 산화알루미늄으로부터 형성된다.

일부 구현예에서, 평면 기판은 추가로 다수의 전달 채널을 포함하고, 이의 각각은 평면 기판의 상부 표면으로부터 평면 기판의 하부 표면 내 채널 개구부까지 연장하여, 상기 저장소를 평면 기판의 바닥 표면 내 채널 개구부까지 유체적으로 연결한다.

또한, 프레임에 내장된 하나 이상의 마이크로구조물 어레이를 포함하는 장치가 기재된다. 일부 구현예에서, 상기 프레임은 유연하고/하거나 연성이다. 일부 경우에서, 이것은 곡면으로의 적용을 가능하게 한다. 일부 경우에, 상기 프레임은 비-평면이다. 예를 들어, 프레임은 실린더여서 마이크로구조물 어레이는 실린더 주위로 원주 방향으로 정렬될 수 있다. 일부 경우에, 마이크로구조물 어레이는 실린더의 원위 단부에 위치한다. 이들 구현예의 일부에서, 실린더는 루멘을 한정하고 이는 마이크로구조물 어레이에 대한 저장소로서 기능할 수 있다. 이들 구현예에서, 전극은 또한 루멘 내에 위치할 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 첨부된 도면과 하기의 기재에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 기재, 및 도면 및 특허청구범위로부터 자명하다.

도 1은 사진석판술 및 에칭 기술을 사용하여 규소계 재료로부터 어레이된 상호침투 나노채널의 제작을 보여주는 도식적 다이어그램이다. 첫번째, 원뿔형 또는 피라미드형 상호침투 마이크로구조물 (대략 20-500 마이크론 높이)의 어레이를 포토레지스트 패터닝 및 습윤 또는 건조 에칭을 사용하여 규소 기판 상에 한정한다. 후속적으로, 규소 기판은 투사 사진석판술을 사용하고, 이어서 규소 기판/상호침투 마이크로구조물을 통해 나노채널을 드릴링하기 위해 고도의 이방성 심도반응성 이온 에치 (DRIE)를 사용하여 나노웰 (직경 대략 300-1000 nm) 어레이로 후측면 상에 패턴화한다.
도 2는 에칭 기술을 사용하여 규소계 재료로부터 어레이된 상호침투 나노채널을 제작하는 또 다른 방법을 보여주는 도식적 다이어그램이다. 선택적 표면 에칭을 사용하여 이미 만들어진 나노채널 기판 플랫폼 상에 상호침투 마이크로구조물을 한정하였다.
도 3은 나노채널을 포함하는 미세구조물 어레이의 하나의 구현예를 보여주는 고해상 이미지이다.
도 4는 전통적인 나노채널-기반 전달 (예를 들어, TNT) 방법의 적용을 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 5는 나노채널을 포함하는 상호침투 마이크로구조물 어레이를 사용한 생물학적 장벽내로/이를 거쳐 카고의 전달을 보여주는 도식적 다이어그램이다.
도 6a-n은 TNT가 형질감염 경계선을 넘어 증진된 재프로그래밍 인자 전달 및 확산을 매개함을 보여준다. 도 6a는 박리된 피부 조직 상에 TNT 공정의 도식적 다이어그램을 보여준다. 양전극은 피내로 삽입하고 음전극은 카고 용액과 접촉시킨다. 펄스 전기장 (250 V, I0 ms 펄스, I0 펄스)은 이어서 전극에 걸쳐 나노공극 노출된 세포막에 적용하고 상기 카고를 직접 세포질에 주사한다. 나노공극 어레이를 보여주는 TNT 플랫폼 표면의 주사 전자현미경 사진 (상부). 도 6b는 시뮬레이션 목적을 위해 경계 상태를 보여주는 도식적 다이어그램을 보여준다. 도 6c는 TNT (실선) 대 BEP (점선)를 진행하는 상이한 세포에 대한 공극화 프로파일의 시뮬레이션을 보여준다. 상기 플롯은 TNT가 집중된 공극화를 유도하고 BEP가 광범위 공극화를 유도함을 보여준다. 도 6d는 TNT 대 BEP에 대한 ABM 발현 결과를 보여준다. TNT는 월등한 ABM 발현을 유도하였다 (:=24 시간). 도 6e는 대표적인 IVIS 형광성을 보여주고 도 6f는 각각 표지된 DNA 및 ABM 인자를 사용한 TNT 처리 후 마우스 피부의 공초점 현미경 이미지를 보여준다. GFP는 Ascl1 플라스미드 내 리포터 유전자이다. 도 6g는 유전자 발현이 상피 형질감염 경계를 넘어 확산됨을 보여주는 상피 및 진피 (t=24시간) 내 유전자 발현의 레이져 포획 미세해부 (LCM) 및 qRT-PCR 결과를 보여준다. 도 6h는 상피에서 진피로의 EV-매개된 형질감염 확산의 개념을 도시하는 도식적 다이어그램을 보여준다. 도 6i는 ABM mRNA/cDNA의 상당한 로딩을 보여주는 EV 카고의 qRT-PCR 분석을 보여준다. 도 6j는 EV가 형질감염 및 재프로그래밍을 확산시키기 위한 생존 비히클인지를 확인하기 위한 실험 디자인을 보여준다. 도 6k는 TNT-처리된 피부로부터 단리된 EV를 자발적으로 내재화하는 마우스 배아 섬유아세포를 보여주는 공초점 현미경사진을 보여준다. 도 6l은 ABM의 TNT-기반 형질도입과 비교하여 순수 마우스로 EV 주사 14일 후 유전자 발현 분석을 보여준다. 면역염색 결과는 증가된 (m) Tujl (4주)를 보여주고 도 6n은 ABM TNT 처리 후 피부에서 신경미세섬유 (8주) 발현을 보여준다. N=3 동물(생물학적 레플리케이트). * p<0.05 (Holm-Sidak 방법), # 0,05<p<0.08 (원-테일 t-시험).
도 7a-k는 TNT 플랫폼 제작 및 나노채널 어레이 시뮬레이션을 보여준다. 도 7a는 양면 광택 규소 웨이퍼를 보여준다. 도 7b-d는 나노채널 패터닝 및 DRIE를 보여준다. 도 7e는 에칭된 나노채널의 주사 전자현미경 (SEM)을 보여준다. 도 7f는 미세저장소 (microreservoir)의 후측면 에칭을 보여준다. 도 7g는 SEM 현미경사진을 보여주고 도 7h 및 7i는 상이한 조건하에서 각각 에칭 프로파일 및 에칭율을 보여주는 플롯을 보여준다. 도 7j 및 7k는 비대칭 (즉, T-형태) 나노채널 어레이 대 대칭 (즉, 교차 형태) 어레이에 대한 필드 분포 (j1, k1) 및 열 소실 프로파일 (j, k 2-3)을 보여주는 시뮬레이션 결과를 보여준다. 벌크 전기천공 (BEP)은 비-바이러스 유전자의 생체내 전달을 위한 현재의 골드 표준이다. BEP에서 유전자 취득은 그러나 고도의 확률적 공정이고, 이는 비-균일 전기장에 의해 영향 받을 뿐만 아니라 각각 다운스트림, 및/또는 세포내이입 및 확산과 같은 보다 수동적 공정이다(문헌참조: Geng, T. & Lu, C. Lab Chip 13, 3803-3821 (2013);. Boukany, P.E. et al. Nat Nanotechnol 6, 747-754 (2011); Gallego-Perez, D. et al. Nanomedicine (2015)). 이와 같이, 보다 능동적이고 생체내 결정적 유전자 전달을 촉진시키는 단순한 접근법이 명백히 요구된다. 여기서, 클린룸 기반 기술을 수행하여 (즉, 투사 사진석판술, 접촉 포토 사진석판술, 및 심도반응성 이온 에칭 - DRIE-) (도 7a-i)) 천연- (예를 들어, 피부) 또는 수술적으로-접근가능한 (예를 들어, 골격근) 조직 표면으로 보다 결정적 방식으로 능동적 비-바이러스 유전자 전달을 위한 규소계 TNT 장치를 제작한다. TNT 플랫폼은 조직으로 형질도입될 유전학적 카고를 유지할 수 있는 미세규모 저장소에 상호연결된 클러스터된 막대하게 평행한 어레이로 이루어져 있다. 간략하게, ~400-500 nm 채널의 어레이는 먼저 투사 사진석판술 및 DRIE를 사용하여 ~200 ㎛ 두께의 양면 광택 규소 웨이퍼의 표면 상에 한정하였다. 시뮬레이션 연구는 상기 비대칭 T-형태 어레이가 보다 대칭의 나노공극 분포와 비교하여 전기장 분포 및 열 소실 측면에서 일부 고유 이점을 제공하고, 나노채널의 비대칭 클러스터는 덜한 비활동 지대를 나타내고 (도 7j1, k1, 별표), 동시에 피크 및 발리 (valley) 온도를 20 내지 25%까지 감소시킴 (도 7j2-3, k2-3)을 시사한다. 이어서 나노채널에 병치된 미세저장소 어레이의 접촉 사진석판술-기반 패터닝 및 DRIE-매개된 드릴링을 수행하였다. 최종적으로, 플랫폼 표면은 질화규소의 얇은 절연층으로 부동태화하였다.
도 8a-h는 생체내 나노채널 기반 전기천공 대 벌크 전기천공 (BEP)의 시뮬레이션 결과를 보여준다. 도 8a는 실험 셋-업을 도시하는 도식적 다이어그램을 보여준다. 도 8b 및 8c는 250 V 시뮬레이션하에 시뮬레이션된 전압 분포를 보여준다. 도 8d-f는 단일-세포 벌크 전기천공에 대한 막관통 전위의 시뮬레이션을 보여준다. 도 8g는 나노채널로부터 멀리 떨어진 세포 (세포 2 및 세포 3)와 비교하여 나노채널(세포 1)과 직접적인 접촉 상태로 있는 세포에 대한 천공 프로파일을 보여준다. 도 8h는 TNT 대 BEP에서의 프로파일을 보여준다.
도 9a-d는 TNT-처리된 등 피부로부터 단리된 자가 AS-로딩된 EV가 MCAO 뇌졸증(stroke) 마우스 (C57BL/6) 모델에서 신경영양성 유사 특징을 나타냄을 보여준다. 도 9a는 실험 셋-업을 도시하는 도식적 다이어그램을 보여준다. MCAO 뇌졸증을 먼저 유도한다. 이어서 ABM TNT 처리 및 EV의 두개내 주사 전 등 피부로부터 EV 단리를 수행하였다. 도 9b 및 9c는 EV 주사 후 7일 만에 경색증 용적 내 상당한 감소를 보여주는 MRI 이미지화 및 정량을 보여준다. 도 9d는 경색증 영역 (백색 화살표)을 향하여 뇌실하 (SVZ) 구역으로부터 돌출된 DCX+ 세포/프로세스를 보여주는 뇌졸증 유도 후 21일째에 면역형광 이미지를 보여준다. 대조군 뇌에서 DCX+ 세포는 대부분 SVZ 구역의 벽을 따라 존재하는 것으로 밝혀졌다. * p<0.05 (홀름-시닥 (Holm-Sidak) 방법).
도 10a-b는 피부 내 iN이 상피 및 진피 공급원으로부터 유래함을 보여준다. 도 10a로부터 ABM TNT-처리된 피부 절개부의 형광 현미경사진은 K14-Cre 리포터를 보여주고 도 10b는 또한 Tujl 신경원 마커를 발현하는 K14 또는 Col1A1 오리진 (녹색/GFP)의 피부 세포를 보여주는 Col1A1-GFP 마우스 모델을 보여준다. (도 10a.1, 도 10b.1) GFP 트레이서 및 Tuj1 둘 다에 대해 면역반응성인 세포 요소들은 추가로 LCM/qRT-PCR에 의해 분석하였다. 상기 결과는 상기 이중-양성 요소들이 상당히 높은 신경원 마커 유전자 발현 및 중간정도 내지 현저히 감소된 피부 세포 마커 유전자 발현을 가졌음을 지적한다. * p<0.05 (홀름-시닥 (Holm-Sidak) 방법). K14-Cre 리포터 마우스 모델을 사용한 계통 추적 실험 (여기서, 케라틴 14개 양성 (K14+) 세포는 궁극적으로 TdTomato 발현으로부터 eGFP로 전환시키는 ROSA 유전자좌의 cre-매개된 재조합을 진행한다)은 새롭게 유도된 뉴런이 부분적으로 K14+ 피부 세포로부터 기원함을 확인시켰다. Col1A1-eGFP 마우스 모델을 사용한 실험 (여기서, 활성 Coll A1 프로모터를 갖는 세포는 eGFP를 발현한다)은 Tuj1+로의 전이 단계에서 진피로부터 다수의 콜라겐/eGFP+ 세포를 보여주었다. LCM을 사용하여 GFP+ 및 Tuj1 + 둘 다인 유전자전이 마우스 모델 절개부로부터 세포 요소들의 유전자 발현 프로파일을 포획하고 추가로 특징 분석하고, 이는 K14 기원이지만 현재 뉴런 마커를 발현하는 세포, 또는 뉴런 운명으로 전환하는 활성 콜라겐 프로모터를 갖는 세포 (예를 들어, 섬유아세포)에 상응한다. 상기 결과는 상기 요소들이 실제로 프로-뉴런 마커의 증가된 발현 및 세포 기원 마커 (즉, K14, Col1 A1)의 감소된 발현을 나타냄을 지적했다.
도 11은 예시된 마이크로구조물 구현예의 횡단면의 도해이다.
도 12는 예시된 마이크로구조물 구현예의 횡단면의 도해이다.
도 13은 예시된 마이크로구조물 구현예의 횡단면의 도해이다.
도 14a-14d는 다양한 마이크로구조물 어레이 정렬 및 구현예를 보여준다. 도 14a는 원뿔형 미세바늘을 갖는 구현예를 보여준다. 도 14b는 피라미드형 미세바늘을 갖는 구현예를 보여준다. 도 14c는 원주 방향으로 정렬된 실린더를 갖는 구현예를 보여준다. 도 14d는 릿지를 갖는 구현예를 보여준다.
도 15a 및 15b는 TNT 플랫폼 (도 15a) 및 DTN 플랫폼 (도 15b)을 사용한 예시적 재프로그래밍 인자들의 조직으로의 전달시 관찰된 유전자 발현의 상대적 수준을 비교하는 플롯이다. 상당히 보다 높은 수준이 유전자 발현은 제형이 DTN 플랫폼을 사용하여 투여되는 경우 조직내에서 관찰되었다.
도 16은 DTN 플랫폼을 사용한 내피 계통 (즉, CD31 + 세포성 구조물, 적색으로 염색된)으로의 마우스 피부 조직 재프로그래밍을 보여준다. 조직 절개부의 전체 두께에 걸쳐 있는 CD31 염색에서의 현저한 증가는 대조군 피부와 비교하여 관찰되었다.
도 17a 및 17b는 예시된 마이크로구조물 구현예의 횡단면의 도해이다.
도 18은 다양한 마이크로구조물 형태를 보여준다.
도 19는 신체 부분에서 긴 슬릿을 갖는 마이크로구조물 어레이 구현예의 투시도이다.
도 20은 신체 부분에서 짧은/어레이된 슬릿을 갖는 마이크로구조물 어레이 구현예의 투시도이다.
도 21은 도 20의 마이크로구조물 어레이 구현예의 횡단면이다.
도 22a 및 22b는 신체 부분으로 가공될 수 있거나 (도 22a) 또 다른 재료에서 별도로 제작되고 이어서 신체 부분과 접점될 수 있는 (도 22b) 저장소를 도시하는 마이크로구조물 어레이 구현예의 투시도이다.
도 23은 횡단면으로서 나타낸 구현예의 마이크로구조물 및 전기천공을 사용한 피부 조직으로의 핵산의 전달을 위한 이의 용도를 도해한다.
도 24a 내지 24d는 구현예의 마이크로구조물의 제조를 도해한다. 도 24a는 나노채널의 어레이를 생성하기 위한 사진석판술 및 심도반응성 이온 에칭 (DRIE)을 통해 패턴화된 규소 웨이퍼이다(도 24b). 이들 채널은 직경이 ~100-900 nm의 크기 범위일 수 있고, 엣지 간의 피치는 직경의 약 1 내지 25배 범위이다. 도 24c는 나노채널로의 유동성 접근을 획득하기 위해 DRIE에 의해 에칭된 (따라서 나노채널의 전체 두께 어레이를 생성하는) 웨이퍼의 후측면을 도해한다. 도 2d는 사진석판술 패터닝 및 이방성 에칭을 통한 3D로 에칭된 나노채널의 2D 어레이를 도해한다. 나노채널의 상기 3D 어레이는 다중 조직 수준/층에서 동시 및 등급화된 카고 전달을 가능하게 한다. 도 24d에서 3D 압출은 ~1 내지 수백 마이크론의 크기 범위 (기저부에서)일 수 있고, 이는 여기내에/이에 걸쳐 수용될 필요가 있는 나노채널 (및 이 사이의 갭)의 수에 의존한다. 일부 경우에, 3D 압출 당 나노채널의 최소 수는 2이고, 이들은 조직의 상이한 수준에서 카고의 전달을 가능하게 할 수 있는 상이한 높이일 수 있다. 나노채널 및/또는 3D 압출 둘 다는 장치의 활성 영역을 최대화하기 위해 6각형에 가까운 패킹 (HCP)으로 정렬될 수 있다. 일단 3D 압출이 한정되면, 상기 표면은 질화규소 또는 이산화규소일 수 있는 절연층으로 코팅될 수 있다. 내구성을 개선시키기 위해 적용될 수 있는 추가의 코팅은 다음을 포함한다 (상용성 씨드 층과 함께): 무엇보다 탄화규소, 질화티탄, 질화 알루미늄 티탄, 및 질화 지르코늄.
도 25a 내지 25d는 대안적 제작 접근법을 도해한다. 도 25a는 상기 나노채널 어레이의3D 압출을 생성하기 위해 표면 미세가공 (예를 들어, 사진석판술 접근법 또는 마이크로분쇄) (도 25c 및 25d)에 적용되는 이미 한정된 나노채널 (도 25b)을 갖는 기판을 도해한다. 상기 경우에, 기저부 기판은 DRIE'd 규소, 또는 애노드화된 알루미나, 또는 택 (tack)-에칭된 중합체성 막 (예를 들어, PET)으로 구성될 수 있다.
도 26a 내지 26e는 대형/굴곡 조직 표면으로의 적용을 위한 구현예를 도해한다. 도 26a는 프로세싱된 DTN 장치가 보다 작은 모듈로 분할 (diced)될 수 있음을 보여준다. 상기 모듈은 대형/굴곡 조직 표면 상에 적용을 가능하게 하기 위한 유연한 중합체성 프레임 내에 내장될 수 있다. 도 26b 내 그림은 인간 팔에 적용되는 3x3 모듈의 어레이를 보여준다. 도 26b는 대형 스케일 DTN이 대형/임상전 동물 모델 및 임상 모델을 중재하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 상기 경우에, 돼지의 허혈 피부 플랩은 EFF를 갖는 DTN'd이고, 이는 상기 영역 (우측)으로의 관류를 증가시킴에 의해 괴사로부터 플랩된 피부 (좌측)를 구제할 수 있는 새로운 혈관계 (도 26e)의 형성 (도 26d)을 유도한다.

정의

본원 전반에 걸쳐 사용된 용어는 당업자에게 통상적이고 전형적인 의미로 해석되어야만 한다. 그러나, 출원인은 하기의 용어가 하기 정의된 바와 같이 특정 정의로 주어지는 것을 원한다.

본 명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는다면, 복수형 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 포함하는 다수의 세포를 포함한다.

용어 "약" 및 "대략적으로"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 "근사치"인 것으로서 정의된다. 하나의 비제한적 구현예에서, 상기 용어는 10% 이내에 있는 것으로 정의된다. 또 다른 비제한적 구현예에서, 상기 용어는 5% 이내에 있는 것으로 정의된다. 여전히 또 다른 비제한적 구현예에서, 상기 용어는 1% 이내에 있는 것으로 정의된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는"은 상기 조성물 및 방법이 언급된 요소들을 포함하지만 다른 것들을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 한정하기 위해 사용되는 경우 "필수적으로 이루어진"은 조합에 임의의 필수적 유의성의 다른 요소들 배제함을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소들로 필수적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 인산 완충 식염수, 보존제 등을 배제하지 않는다. "로 이루어진"은 다른 성분들의 미량 초과의 요소들 및 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적 방법 단계를 배제함을 의미한다. 이들 이행 용어 각각에 의해 정의된 구현예는 본 발명의 범위내에 있다.

"유효량"은 이롭거나 목적하는 결과를 실행하기 위해 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 용량으로 투여될 수 있다.

용어 "담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 일반적으로 안전하고 비-독성인 약제학적 또는 치료학적 조성물을 제조하는데 유용한 담체 또는 부형제를 의미하고 수의과 및/또는 인간 약제학적 또는 치료학적 용도를 위해 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 인산 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼) 및/또는 다양한 유형의 습윤화제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어, 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 안정화제 또는 약제학적 제형에 사용하기 위해 당업계에 널리 공지되고 하기의 추가로 기재된 바와 같은 다른 재료를 포함한다.

범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값에서 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 상기 범위가 표현되는 경우, 또 다른 구현예는 하나의 특정 값에서 및/또는 다른 특정 값 까지를 포함한다. 유사하게, 값이 대략적인 것으로 표현되는 경우, 선행된 "약"을 사용하여 특정 값이 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해된다. 추가로 범위 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여 둘 다 유의적이고 다른 종점과는 무관하게 이해된다. 또한, 다수의 값이 본원에 기재되고, 각각의 값은 값 자체에 추가로 특정 값에 대해 "약"으로서 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 기재된 경우, "약 10"이 또한 기재된다.

용어 "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 용량"은 연구자, 수의사, 일반화된 시기 동안 의사 또는 다른 임상의에 의해 모색되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는, 글루코스-결합 구조물에 결합된 글루코스-변형된 인슐린과 같은, 조성물의 양을 언급한다. 일부 경우에, 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응은 다중 용량의 조성물을 수일, 수주 또는 수년 기간 동안 대상체에게 투여한 후 성취된다.

용어 "대상체" 또는 "수용자"는 본원에서 영장류 (예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 동물을 포함하는 것으로 정의된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료한다," "치료하는," "치료" 및 이의 문법적 변형어구는 부분적으로 완전하게 장애 또는 병태의 하나 이상의 해당 증상을 지연시키거나, 완화시키거나, 경감시키거나 이의 강도를 감소시키고/시키거나 장애 또는 병태의 하나 이상의 원인을 완화시키거나, 경감시키거나 방해함을 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 예방적으로, 예방학적으로, 일시처방으로 또는 보충적으로 적용될 수 있다.

상세한 기술

마이크로구조물 어레이 및 본원에 기재된 것을 사용하는 방법은 생물학적 장벽 내로 또는 이에 걸친 재료의 수송에 유용하다. 본원에 기재된 마이크로구조물 어레이는 상기 마이크로구조물이, 상이한 세포 수준에 도달할 수 있는 다중 채널을 포함하기 때문에 조직 내 동시에 (또는 연속적으로) 세포의 상이한 층으로 물질을 전달하는 능력을 갖는다. 이것은 각을 이룬 마이크로구조물이, 상이한 높이의 채널이 상기 마이크로구조물 내에 있도록 하기 때문이다. 상기 마이크로구조물이 조직에 침투하는 경우, 상기 채널은 세포의 상이한 층 내에 위치하고 따라서 물질을 상이한 수준으로 조직 내에 전달할 수 있다. 상기 마이크로구조물 어레이는 피부 (또는 이의 일부) 상에; 혈뇌 장벽을 거쳐; 점막 조직 (예를 들어, 경구, 비강, 눈, 질, 요도, 위장, 호흡기); 혈관; 림프 혈관; 또는 세포막 (예를 들어, 재료의 세포 또는 세포들의 내부로 도입하기 위한)에 사용될 수 있다. 생물학적 장벽은 식물, 곤충 또는 세균, 효모, 진균류 및 배아를 포함하는 다른 유기체에서 뿐만 아니라 인간 또는 다른 유형의 동물에 있을 수 있다. 마이크로구조물 어레이는 카테터 또는 복강경의 도움으로 내부적으로 조직에 적용될 수 있다. 예를 들어, 내부 조직으로의 약물 전달을 위해서와 같이, 특정 적용을 위해, 상기 장치는 수술적으로 이식될 수 있다.

도 1을 참조하여, 마이크로구조물 어레이 (100)는 다음을 포함할 수 있다: 상부 표면 (102) 및 하부 표면 (103)을 갖는 평면 기판 (101); 평면 기판의 상부 표면과 유체 통류하는 저장소 (104); 및 평면 기판의 하부 표면으로부터 돌출된 다수의 마이크로구조물 (105)로서 각각 기저부 (107)로부터 평면 기판의 하부 표면으로부터 일정 높이에 위치한 원위 팁 (108)까지 테이퍼링되어 마이크로구조물 표면을 한정하는 고형 바디 부분 (106)을 포함하는 다수의 마이크로구조물; 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 마이크로구조물 표면 내 제1 채널 개구부 (110)로 연장됨으로써 유체적으로 상기 저장소를 상기 제1 채널 개구부에 연결시키는 제1 전달 채널 (109); 및 상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 제2 채널 개구부 (112)로 연장됨으로써 유체적으로 상기 저장소를 상기 제2 채널 개구부에 연결하는 제2 전달 채널 (111).

전달 채널 각각은 스케일에서 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 전달 채널은 예를 들어, 약 1 내지 약 999 nm의 내부 직경을 갖는 나노채널이다. 일부 구현예에서, 상기 전달 채널은 예를 들어, 약 1 내지 약 999 마이크로미터의 내부 직경을 갖는 마이크로채널이다. 채널의 크기는 전달될 제제의 크기 및/또는 소정의 적용을 위해 요구되는 유동 역학을 기준으로 선택될 수 있다.

평면 기판 (101)은 다수의 전달 채널 (예를 들어, 109, 111)을 포함할 수 있고, 이의 각각은 상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 평면 기판의 하부 표면(103) 내 채널 개구부 (예를 들어, 110, 112)까지 연장하여, 유체적으로 상기 저장소 (104)를 상기 평면 기판의 하부 표면 내 채널 개구부까지 연결한다.

도 1-2에서 알 수 있는 바와 같이, 마이크로구조물 어레이 (100)는 제1 채널 개구부 (110)가 상기 평면 기판 (101)과 평행한 제1 평면 내 위치하도록 구성될 수 있고, 여기서, 상기 제2 채널 개구부 (112)는 상기 평면 기판 (101)에 평행한 제2 평면 내에 위치하고 상기 제1 평면은 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있다. 또한 제3 채널 (113)에 연결된 제3 채널 개부구(114)가 존재할 수 있다. 각각의 채널 및 이의 연합된 개구부의 평면은 서로로부터 규칙적 간격 또는 상이한 간격으로 공간적으로 이격될 수 있다. 예를 들어, 각각의 채널/채널 개구부는 다른 것으로부터 균등하게 공간적으로 이격될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 채널 개구부는 마이크로구조물 높이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 거리로 원위적으로 이격될 수 있다. 하나의 예에서, 제1 평면은 20% 내지 60%의 거리로 제2 평면으로부터 원위적으로 이격될 수 있다. 상기 거리는 또한 제3, 제4, 제5 및 보다 많은 채널 개구부에 적용될 수 있다.

마이크로구조물 (105)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개 이상의 채널을 포함할 수 있다. 이들 채널은 저장소와 채널 개구부 사이의 도관으로서 작용할 수 있다. 따라서, 상기 채널은 저장소 내 위치된 재료가 채널을 통해 이동하고 채널 개구부에 전달될 수 있도록 저장소와 유체 통류할 수 있다. 상기 제1 채널 개구부 (110)는 원위 팁에 위치할 수 있고 추가의 채널 개구부는 원위 팁을 플랭킹한다. 예를 들어, 동일한 마이크로구조물 상에 3개의 채널 개구부가 있을 수 있고 하나는 원위 팁에 있고 추가의 2개의 채널 개구부 (112 및 114)는 원위 팁의 어느 측면 상에 있다. 마이크로구조물 (105) 내 다중 채널은 서로 평행하게 위치할 수 있고 도 1 및 2에 보여진 바와 같이 마이크로구조물의 수직 평면에 평행하게 위치할 수 있다.

도 17a 및 17b에서 알 수 있는 바와 같이, 미세구조물 (105)의 고형 바디 부분 (106)의 높이는 마이크로구조물의 원위 팁 (108)로부터, 평면 기판 (101)의 하부 표면 (103) 상에 위치할 수 있는, 마이크로구조물의 기저부 (107)까지 측정될 수 있다. 마이크로구조물 표면의 높이는 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 마이크론 길이, 또는 이상, 미만 또는 이 사이의 임의의 정도일 수 있다. 하나의 예에서, 마이크로구조물의 높이는 100 내지 500 마이크론일 수 있다. 도 17a에서 알 수 있는 바와 같이, 마이크로구조물 (105)의 높이는 평면 기판 (101)의 평면에 직각으로 위치할 수 있는 평면 b에서 측정된다.

마이크로구조물의 기저부 (107)는 임의의 형태, 예를 들어, 삼각형, 사각형, 다이아몬드형, 직사각형, 타원형 또는 원형을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 기저부는 원형 형태를 갖는다. 기저부가 원형인 경우, 마이크로구조물 (105)의 기저부 (107)의 너비는 마이크로구조물의 기저부의 직경으로서 측정될 수 있고, 여기서, 이것은 평면 기판 (101)과 표면 접촉하게 한다. 마이크로구조물 (105)의 기저부 (107)의 평면은 도 17b에서 보여지는 바와 같이 평면 기판 (101)과 평행하게 위치할 수 있다. 기저부의 높이는 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500 마이크론 길이, 또는 이상, 미만 또는 이 사이의 임의의 정도일 수 있다. 기저부의 너비는 또한 마이크로구조물의 높이와 관련하여 측정될 수 있고, 예를 들어, 마이크로구조물의 기저부의 너비는 높이의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 또는 200% 또는 그 이상, 이하 또는 이 사이의 임의의 정도일 수 있다.

마이크로구조물의 원위 팁 (108)은 임의의 형태를 가질 수 있고 도 14a 내지 14d에서 알수 있는 바와 같이, 뽀족하거나,둥글거나, 경사지거나, 나팔 모양이거나, 테이퍼되거나, 평활 말단되거나 이들의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 마이크로구조물은 뾰족하다.

마이크로구조물은 규칙적 간격력 또는 무작위로 서로로부터 이격될 수 있다. 규칙적으로 이격되는 경우, 마이크로구조물은 중앙선 b로부터 측정되는 바와 같이 서로 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1000 이상의 마이크론으로 이격될 수 있다. 마이크로구조물의 고형 바디 부분 (106)은 릿지, 헤링본 패턴, 파도형 패턴, 원뿔, 절두원추 또는 피라미드와 같은 임의의 형태를 포함할 수 있다. 원뿔 및 피라미드의 예는 도 14a, 14b 및 18에 나타낼 수 있다.

일부 경우에, 마이크로구조물은 정돈된 형태 또는 패턴이 없다. 예를 들어, 기재된 마이크로구조물은 예리한 팁을 갖는, 무작위로 분포된 마이크로구조물/조직/생스시템을 침투할 수 있는 예리한 팁을 갖는 러프니스를 도입하기 위해 규소 표면의 테일러된/블랭크 에칭에 의해 제조될 수 있다.

상기 전달 채널 (109, 111)은 예를 들어, 실린더, 장방형 또는 직각 프리즘과 같은 다양한 형태를 가질 수 있다. 전달 채널 (110, 112)의 개구부는 환형, 직사각형, 타원형 또는 정사각형일 수 있고, 상기된 바와 같이 각각의 마이크로구조물 (105)는 다수의 채널을 가질 수 있고 이것은 모두 동일한 기하학적 구조를 가질 수 있거나, 동일하거나 상이한 마이크로구조물 내에서 서로 상이한 형태를 가질 수 있다. 상기 전달 채널은 실질적으로 동심원 채널을 가질 수 있다.

저장소 (104)는 마이크로구조물 채널 (109, 111)을 통해 대상체에게 전달될 임의의 물질을 포함할 수 있다. 역으로, 물질은 마이크로구조물 채널을 통해 인출되거나 저장소에 침적될 수 있다. 저장소 (104)는 마이크로구조물을 통해 유동할 수 있는, 마이크로구조물을 통한 마이크로구조물 개구부 (110, 112)와 유체 통류할 수 있다. 저장소는 따라서 경피 투여를 위한 임의의 물질을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 저장소 (104)는 평면 기판의 상부 표면 (102)에 부착되고, 상기 상부 표면 (102)은 평면 기판 (101)의 하부 표면 (104)에 대향하고, 상기 마이크로구조물은 하부 표면으로부터 돌출되어 있다.

도 22a 및 22b에 나타낸 바와 같이, 저장소는 평면 기판 (101)과 통합할 수 있거나 (도 22a) 이것은 예를 들어, 또 다른 물질에서 별도로 제작될 수 있고 이어서 평면 기판 (101)(도 22b)과 접속될 수 있다. 상기 저장소는 각각 다수의 마이크로구조물 채널에 공급하기 위한 크기일 수 있거나 각각이 단일 마이크로구조물을 공급하도록 정렬될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 마이크로구조물 어레이 (100)는 단일의 대형 저장소를 포함하고, 평면 기판 (101)으로 가공되거나 평면 기판 (101)과 접속될 수 있다.

저장소는 전달될 물질을 방출시키기 위한 방출 메카니즘을 포함함으로써 상기 물질이 마이크로구조물의 적어도 하나의 채널 내로 및 이를 통해 수송되도록 할 수 있다. 방출 메카니즘은 기계력 또는 전단력을 사용할 수 있고, 이는 수동으로, 열, 화학적 반응, 전기장, 자기장, 압력장, 초음파 에너지, 인장, 확산 주사, 삼투압, 농도 구배, 진공, 압력 또는 이의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 저장소 (104)는 다공성 재료를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 투여될 물질은 다공성 재료의 공극에 저장된다. 또 다른 구현예에서, 상기 저장소는 밀봉된다. 상기 구현예의 하나의 변화에서 마이크로구조물 어레이는 추가로 평면 기판의 제1 표면으로부터 연장하는 적어도 하나의 천공 미늘을 포함하고, 여기서, 상기 천공 미늘을 사용하여 밀봉된 저장소를 천공할 수 있다.

상기 저장소는 예를 들어, 피드백 성분을 포함하여 생물학적 장벽을 거쳐 수송될 물질의 용적 또는 양은 생리학적 신호를 기준으로 변화될 수 있다. 피드백 성분은 "가동 및 중단 스위치"를 포함하여, 신호가 검출된 경우, 저장소는 물질을 수용자에게 전달할 수 있지만 어떠한 신호가 검출되지 않은 경우 어떠한 물질도 전달되지 않는다. 역으로, 신호의 검출은 상반된 효과를 가질 수 있고, 여기서, 저장소는 신호가 검출되지 않는 경우 물질의 수용자로의 전달을 이행하지 못하고, 이는 상기 저장소가 수용자로의 전달을 위한 물질을 방출하지 않도록 한다. 예를 들어, 피드백 성분은 대상체 내 병원체의 존재를 검출할 수 있고, 상기 물질이 검출된 경우, 피드백 성분은 저장소로부터 항체의 방출을 가능하게 할 수 있다.

또 다른 예에서, 피드백 성분은 pH 또는 온도와 같은 생리학적 신호에서의 변화를 검출할 수 있다. 피드백 성분은 "컷 오프 값"을 포함하여 특정 양에 의해 pH 또는 온도가 변화하거나 특정 수치의 값 (예를 들어, 6.5 미만의 pH 또는 예를 들어, 99.1 초과의 온도)에 도달하는 경우, 피드백 성분은 물질의 방출 또는 방출되고 후속적으로 수용자에게 투여되는 물질의 양의 변화를 가능하게 한다.

피드백 성분은 또한 검출된 신호의 양을 기준으로 방출된 물질의 양 또는 용적을 조정하여, 검출된 보다 큰 양의 신호가 방출된 물질의 양을 보다 크게 할 수 있거나, 역으로 검출된 보다 큰 양의 신호는 방출된 물질의 양을 보다 작게할 수 있다.

검출된 생리학적 신호는 하나의 양상에서 마이크로구조물 어레이가 투여되는 대상체에 존재하는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 생리학적 신호는 생물학적 물질 또는 약물일 수 있다. 상기 물질은 수용자에서 천연적으로 존재할 수 있거나, 비-내인성, 또는 외래 물질일 수 있다. 또 다른 양상에서, 대상체에서 생리학적 반응은 pH 및 온도를 포함하는 생리학적 환경 인자를 포함할 수 있다. 생리학적 신호의 예는 글루코스, 콜레스테롤, 빌리루빈, 크레아틴, 대사 효소, 헤모글로빈, 헤파린, 응고 인자, 뇨산, 암배아 항원 또는 다른 종양 항원, 생식 호르몬, 산소, pH, 온도, 알콜, 담배 대상물, 및 불법 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

수용자에게 전달될 저장소 내 물질은 치료학적, 예방학적, 진단학적 또는 표적치료 물질일 수 있다. 하나 초과의 물질은 일시에 전달될 수 있거나 상이한 물질은 후속적으로 전달될 수 있다. 상이한 물질은 예를 들어, 동시에 상이한 채널을 통해 전달될 수 있다. 2, 3, 4, 5, 6 개 이상의 물질은 상이한 채널을 통해 동시에 전달될 수 있다. 채널 개구부가 세포의 상이한 층에 도달할 수 있기 때문에, 상이한 물질은 본원에 기재된 마이크로구조물 어레이를 동시에 사용하는, 조직 내 세포의 상이한 지층으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 제1 물질은 제1 채널을 통해 세포의 제1 층으로 전달될 수 있고 제2 물질은 제2 채널을 통해 세포의 제2 층으로 전달될 수 있다.

전달될 물질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산 분자, 지질, 유기 분자, 생물학적 활성 무기 분자 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 광범위한 약물은 본 발명의 미세바늘 장치 및 방법을 사용한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약물" 또는 "약물 제형"은 문신 및 화장품 등을 위해 약제학적 부형제 및 물질을 포함하는, 생물학적 조직으로의 도입을 위해 적합할 수 있는 임의의 예방학적, 치료학적, 진단학적 또는 표적치료 제제 또는 다른 물질을 언급하기 위해 광범위하게 사용된다. 상기 약물은 생물학적 활성을 갖는 물질일 수 있다. 약물 제형은 액체 용액, 겔, 고형 입자 (예를 들어, 마이크로입자, 나노입자) 또는 이의 조합물과 같은 다양한 형태를 포함할 수 있다. 약물은 소형 분자, 대형 (즉, 거대-) 분자 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 대표적인 비-제한적이지 않은 구현예에서, 약물은 아미노산, 백신, 항바이러스제, 유전자 전달 벡터, 인터류킨 억제제, 면역조절제, 신경영양성 인자, 신경보호제, 항신생물제, 화학치료제, 폴리사카라이드, 항-응고제, 항생제, 진통제, 마취제, 항히스타민, 소염제, 및 바이러스로부터 선택될 수 있다. 약물은 적합한 단백질, 펩타이드 및 이의 단편로부터 선택될 수 있고, 이는 천연적으로 존재하거나 재조합적으로 합성되거나 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 약물 제형은 인슐린을 포함한다.

약물 제형은 당업계에 공지된, pH 변형제, 점도 변형제, 희석제 등을 포함하는, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 기재된 저장소는 방출 자체를 위한 물질, 또는 생물학적 장벽 저장소를 거쳐 수송될 물질을 생성하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 물질을 생성하기 위한 수단의 하나의 예는 세포이다. 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포일 수 있거나 수용자에게 투여하기 위한 물질을 생성할 수 있는 임의의 다른 공급원 기원의 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 췌장 β 세포 또는 줄기 세포-분화된 인간 췌장 세포일 수 있다.

상기 물질 또는 상기 물질을 생성하기 위한 수단은 예를 들어, 반투과성인 저장소에 배치될 수 있다. 이것은 유체와 수용자의 것과의 교환을 가능하게 하여 상기 피드백 성분이 수용자의 것과 유체 통류하도록 하여 수용자의 생리학적 신호에서의 변화를 검출할 수 있게 한다. 예를 들어, 저장소는 세포를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 세포는 수용자로부터의 생리학적 신호에서의 변화에 민감하다. 수용자 내 상기 생리학적 변화는 피드백 성분과 관련하여 상기된 바와 같이, 세포가 물질을 방출하도록 또는 물질의 방출을 중단하도록 자극할 수 있다. 하나의 예에서, 상기 저장소는 알기네이트 마이크로겔을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 마이크로구조물 어레이 (100)는 추가로 채널을 통해 카고를 저장소로부터 이동시키기 위한 자극제 (방출 메카니즘)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 자극제는 형성 전기장 (예를 들어, 전기천공)을 포함하고, 여기서, 공극화 전기장은 지질 막을 분쇄하고/변형시키고 세포내 카고 전달을 가능하도록 적용된다. 일부 구현예에서, 시스템에 걸친 공극화 전기장의 적용은 세포막을 변형시키고/시키거나 분쇄하여 세포내 공간으로의 카고 이동을 가능하게 한다. 전기장 강도는 표적 조직/시스템에 의존하여 수용될 수 있다. 예를 들어, 도 23은 전기천공을 사용하여 핵산을 피부 조직으로 전달하기 위해 기재된 마이크로구조물 어레이 (100)의 용도를 도해한다.

다른 구현예에서, 상기 자극제는 기계력, 전단력, 열, 화학적 반응, 자기장, 압력장, 초음파 에너지, 인장, 확산 주사, 삼투압, 농도 구배, 진공, 압력 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 카고는 단백질, 핵산 또는 입자를 포함한다. 그러나, 일부 구현예에서, 전기 자극은 카고가 전달되도록 한다. 펄스 전기장은 예를 들어, 대표적인 의약에서 많은 적용을 갖는다. 본원에 기재된 마이크로구조물 어레이 (100)를 사용하여 상이한 수준에서 조직 두께를 거쳐 펄스 전기장을 전달할 수 있다.

미세바늘 및 전기천공 장치는 교시를 위해 참조로 인용되는 하기의 문헌에 기재되어 있다: 미국 특허 제6,334,856호; 제6,331,266호; 제6,312,612호; 제6,241,701호; 제6,233,482호; 제6,181,964호, 제6,090,790호; 제6,014,584호; 제5,928,207호; 제5,869,326호; 제5,855,801호; 제5,823,993호; 제5,702,359호; 제5,697,901호; 제5,591,139호; 제5,389,069호; 제5,273,525호; 및 제7,127,284호.

마이크로구조물 어레이는 제2 전극과 전기적으로 접촉되어 있는 제1 전극을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 제1 전극은 저장소와 접촉되어 있고 제2 전극은 마이크로구조물 어레이가 사용중에 있는 조직의 하나 이상의 세포와 접촉되어 있다. 유전자, 다른 핵산, 단백질 또는 다른 대형 분자, 소분자 약물 등일 수 있는, 물질의 흡수를 증진시키기 위해, 전기장은 개구부의 반대 측면상에 격리되어 있는 전극 사이에서 확립될 수 있다. 전압, 주파수 및 다른 전기장 파라미터는 주로 전극 사이의 거리를 기준으로 선택된다.

전극을 포함하는 마이크로구조물 어레이는 마이크로구조물의 원위 팁 (108)에 형성된 제1 전극 구조물을 포함하여, 이것은 마이크로구조물에 의해 천공된 세포 및 조직과 접촉해 있도록 할 수 있다. 제2 전극 구조물은 저장소에 배치될 수 있다. 전극 구조물은 전도성 패드에 연결된 동심원 밴드로서 형성될 수 있다. 각각의 밴드 및 밴드화된 분절을 함께 전기천공 전력 공급원에 전선으로 연결되거나 별도로 전기천공 전력 공급원에 전선으로 연결되고 다양한 기하학적 및 타이밍 패턴 및 정렬로 동력 공급될 수 있다. 더욱이, 상이한 밴드 및 밴드 분절은 제1 전극 구조물과 관련하여 상이한 전기 전위 (전압)에서 유지될 수 있다. 물질은 원위 팁 (108)에서 채널 개구부 (110, 112)를 통해 전달되어 이것이 영역 내에서 외부 방향으로 조직을 통해 침투하도록 할 수 있다. 영역은 제1 전극 구조물과 제2 전극 구조물 사이에서 생성되는 전기장과 일치할 수 있다. 전기장은 세포 침투를 증진시킴에 따라서 목적하는 표적 물질의 세포로의 전달을 증진시킨다.

전기천공 전력 공급원은 통상의 전력 공급원일 수 있다. 상기 전력 공급원의 요건 및 세부 항목은 문헌에 널리 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌(Neumann et al., Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, Plenum Press, New York, N.Y., 1989; Chang et al. , Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, San Diego, Calif., 1992; Jaroszeski et al., Eletrochemotherapy, Electrogenetherapy, and Transdermal Drug Delivery: Electrically Mediated Delivery of Molecules to Cells, Humana Press, Totowa, N.J., 2000; and Lynch and Davey, Electrical Manipulation of Cells, Chapman & Hall, New York, N.Y., 1996.)을 참조한다. 이들 공개공보 각각의 전체 기재사항은 본원에 참조로 인용된다.

전기천공할 수 있는 마이크로구조물 어레이는 전형적으로 0.1 V 내지 30 kV의 범위에서 전압에서 전극으로의 전기천공 전류를 전달하도록 선택된, 목적하는 접압에서 전극 구조물에 전기천공 전류를 전달하도록 적응된 교류 전력 공급원을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 전압은 약 300 내지 500 V 미만이다. 특정 전압은 적어도 부분적으로 제1 및 제2 전극 구조물 사이의 공간에 의존한다. 주파수는 전형적으로 10 Hz 내지 107 Hz의 범위, 일반적으로 104 Hz 내지 106 Hz의 범위이다. 전류는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 밀리초 마다 또는 이 사이의 임의의 양과 같은 펄스 간격으로 적용될 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 펄스는 소정의 간격으로 적용될 수 있고, 상기 간격은 목적하는 결과가 성취될때까지 반복될 수 있다.

또한 본원에 기재된 것은 하나 이상의 물질을 조직의 다중 세포 수준에 전달하기 위한 방법이고, 상기 방법은 상부 표면 (102) 및 하부 표면 (103)을 갖는 평면 기판 (101); 평면 기판의 상부 표면과 유체 통류하는 저장소 (104)로서, 전달될 물질을 포함하는 저장소; 및 평면 기판의 하부 표면으로부터 돌출된 다수의 마이크로구조물 (105)로서 각각 기저부 (107)로부터 평면 기판의 하부 표면으로부터 일정 높이에 위치한 원위 팁 (108)까지 테이퍼링되어 마이크로구조물 표면을 한정하는 고형 바디 부분 (106)을 포함하는 다수의 마이크로구조물; 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 마이크로구조물 표면 내 제1 채널 개구부 (110)로 연장됨으로써 유체적으로 상기 저장소를 상기 제1 채널 개구부에 연결시키는 제1 전달 채널 (109); 및 상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 제2 채널 개구부 (112)로 연장됨으로써 유체적으로 상기 저장소를 상기 제2 채널 개구부에 연결하는 제2 전달 채널 (111)을 포함하는 마이크로구조물 어레이 (100)를 제공하고; 전달 채널을 통한 상기 저장소 내 하나 이상의 물질을 조직의 다중 세포 수준으로 전달함을 포함한다.

또한 본원에 기재된 것은 세포외 소포체를 세포의 하나의 층으로부터 세포의 또 다른 층으로 전달하기 위한 방법이고, 상기 방법은 상부 표면 및 하부 표면을 갖는 평면 기판; 평면 기판의 상부 표면과 유체 통류하는 저장소로서, 전달될 물질을 포함하는 저장소; 및 평면 기판의 하부 표면으로부터 돌출된 다수의 마이크로구조물로서, 다수의 마이크로구조물 각각이 기저부로부터 평면 기판의 하부 표면으로부터 일정 높이에 위치한 원위 팁으로 테이퍼링됨으로써 마이크로구조물 표면을 한정하는 고형 바디 부분; 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 제1 채널 개구부로 연장함으로써 상기 저장소를 제1 채널 개구부에 유체적으로 연결되는 제1 채널; 및 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 제2 채널 개구부로 연장함으로써 상기 저장소를 제2 채널 개구부에 연결시키는 제2 채널을 포함하는 마이크로구조물 어레이를 제공하고; 제1 채널을 통해 세포의 제1 층으로부터 세포외 소포체를 단리하고; 세포외 소포체를 제2 채널을 통해 제2 층으로 전달함을 포함한다. 하나의 예에서, 세포의 제1 층은 세포의 제2 층 보다 외부 표면에 보다 인접할 수 있다. 상기 소포체는 엑소좀을 포함할 수 있다.

평면 기판 및 저장소를 포함하는, 본원에 기재된 마이크로구조물의 고형 바디 부분은 규소를 포함하는 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 본원에 기재된 것은 마이크로구조물 어레이 (100)를 제조하기 위한 방법이다. 이것은 실질적으로 평면 기판 (101)을 형성하고; 평면 기판이 있는 평면으로부터 일정 각도로 돌출된 다수의 마이크로구조물 (105)로서, 기판, 기저부에 연결된 원위팁 (108) 및 이들 사이의 바디 부분 (106) (여기서, 상기 마이크로구조물의 적어도 하나는 바디 부분의 적어도 일부를 통해 기저부 부분으로부터 실질적으로 연장하는 적어도 하나의 채널(109)를 갖는다)에 통합된 기저부 (107), 바디 부분의 적어도 일부를 따라 개방되고 저장소 (104)와 유체 통류하는 채널을 갖는 마이크로구조물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 마이크로구조물을 형성하는 단계는 엠보싱, 주사 성형, 주조, 광화학적 에칭, 전기화학적 가공, 전기 방전 가공, 정확 스탬핑, 고속 컴퓨터에 의해 수치적으로 제어된 밀링, 스위스 스크류 가공, 연질 사진석판술, 방향에서 화학적으로 원조된 이온 에칭 또는 이의 조합을 포함한다.

또한, 본원에 기재된 것은 물질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 제공되는 방법이고, 상기 방법은 상기된 어레이 (100)의 마이크로구조물 (105)을 대상체의 피부에 삽입하고, 상기 물질이 마이크로구조물의 적어도 하나의 채널을 통해서 및 피부의 각질층을 통해 피부의 저장소 (104)로부터 수송되도록 하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다수의 구현예가 기재되어 있다.

그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 다른 구현예는 하기의 청구항의 범위내에 있다.

실시예

실시예 1: 재프로그래밍 인자의 직접적인 시토졸 전달을 위한 조직 나노형질감염 장치의 용도

본원에 기재된 것은 재프로그래밍 인자들을 나노채널화된 장치를 통해 조직으로 국소적으로 및 제어가능하게 전달하기 위한 장치이다 (도 6). 상기 조직 나노-형질감염(TNT) 접근법은 예를 들어, 고도로 강하고 집중된 전기장을 어레이된 나노채널을 적용함에 의해 재프로그래밍 인자들의 직접적인 시토졸 전달을 가능하고(문헌참조: Gallego-Perez et al. Nanomedicine 2015; Boukany et al. Nat Nanotechnol 2011, 6(11): 747-754), 이는 병치된 조직 세포 막을 호의적으로 나노공극화하고 전기영동적으로 재프로그랭 인자들을 세포로 구동시킨다 (도 6a-d). TNT 시스템 제작 공정 및 시뮬레이션 결과의 도식은 도 1 및 2에 찾을 수 있다. 유전자 전달이 고도로 천연적으로 확률적이고 부작용 (예를 들어, 염증 반응, 세포사)(문헌참조: Sen CK et al. J Immunol (2015) 185:10 2629-2640)을 유도할 수 있는 현재 생체내 형질감염 기술(예를 들어, 바이러스, 종래 조직 덩이 전기천공 또는 BEP)과는 대조적으로, 나노채널 기반 전달은 단일 세포 수준에서 풍부하고, 유순하고, 즉각적이고 용량-제어된 재프로그래밍 인자 전달을 가능하게함에 따라서 이것을 생체내 유전자 형질감염 및 재프로그래밍을 위해 보다 안전하고 보다 결정적인 접근법이 되게한다.

C57BL/6 마우스에 대한 FAM-표지된 DNA를 사용한 실험은 TNT가 카고를 시속하게 (<l 초) 및 비-침습성/국소적 방식으로 피부에 카고를 전달할 수 있다(도 6e). 이어서, 재프로그래밍 인자들의 TNT 기반 국소 전달이 강인한 모델을 사용하여 성공적인 피부 재프로그래밍을 유도할 수 있는 것으로 결정되었고 상기 모델에서, Ascl1/Brn2/Myt1l (ABM)의 과발현은 섬유아세포를 직접 시험관내 유도된 뉴런 (iNs)으로 재프로그램하는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Vierbuchen et al. Nature 2010, 463(7284): 1035-1041). 이들 발견은 TNT가 재프로그래밍 인자들의 국소적 전달을 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라 (도 6f), 또한 이것은 능히 표적 유전자 mRNA/cDNA가 풍부한 세포외 소포체 (EV) (도 6h, i)의 디스패치를 통해 초기 형질감염 경계 (즉, 상피)(도 6g-i)를 넘어서 재프로그래밍 자극 확산 (즉, 상피에서 진피로)을 유도하는 협력적 반응을 구성할 수 있음을 보여주었다(문헌참조: Valadi et al. Nat Cell Biol 2007, 9(6): 654-659). 순수 세포의 TNT-처리된 피부 (도 6j-l)로부터 단리된 ABM-로딩된 EV로의 노출은 이들 EV가 원거리 세포에 의해 자발적으로 내재화될 수 있다(도 6k). 더욱이, 유전자 발현 분석은 피내 ABM EV 주사가 대조군 피부와 비교하여 Tuj1 발현에서의 대략 25배 증가에 의해 입증된 바와 같이, 뉴련 유도(도 6l)와 일관된 피부에서의 변화를 유발하였음을 지적했다. 비교되게, AS-TNT는 Tuj1 발현에서 대략적으로 94-배 증가를 유도하였고, 이는 EV-매개된 확산과 조합된 직접적인 재프로그래밍 인자의 순수 효과를 반영한다. 피부-유래된 AS-로딩된 EV의 신경영양성 효과는 추가로 중뇌 동맥 폐색 (MCAO) 뇌졸증 마우스 모델에서 확인되었다 (도 9) (문헌참조: Khanna et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206).

성공적인 피부 세포 재프로그래밍은 면역형광에 의해 확인되었고, 이는 증가된 Tujl 및 신경미세섬유 발현 오버타임을 보여주었다(도 6m, n). K14-Cre 리포터 마우스 모델을 사용한 계통 추적 실험은 새롭게 유도된 뉴런이 부분적으로 K14+ 피부 세포로부터 기원함을 확인하였다(도 10). 모낭은 또한 일관되게 현저한 Tujl 면역반응성을 보여주었고, 이는 모낭 세포가 재프로그래밍 공정에서 잠재적으로 역할을 수행할 수 있음을 시사한다(문헌참조: Hunt et al. Stem Cells 2008, 26(1): 163-172; Higgins et al. J Invest Dermatol 2012, 132(6) : 1725-1727) . CollAI-eGFP 마우스 모델을 사용한 추가의 실험(도 10) (여기서, 활성 CollAI 프로모터 (예를 들어, 진피 섬유아세포)는 eGFP를 발현한다)은 Tujl+로의 전이 단계에서 진피 내 다수의 콜라겐/eGFP+ 세포를 보여주었고, 따라서, 이는 또한 피부 내 재프로그램화된 세포의 비율에 대해 섬유아세포 기원을 시사한다.

따라서, 본원에서 TNT가 신속하고, 고도로 효과적이며 비-침습성 방식으로 재프로그래밍 인자를 피부로 전달하기 위해 사용될 수 있음이 입증되었다. 상기 TNT 전달은 각각 iN 및 iEC의 잘-확립되고 재롭게 개발된 재프로그래밍 모델을 사용하여 입증된 바와 같이 조정된 피부 조직 재프로그래밍을 유도한다. TNT-유도된 피부-유래된 iEC는 손상 유도된 허혈의 2개의 쥐 모델에서 모 순환계 및 회복된 조직 및 수족 관류와 성공적으로 문합된 혈관 네트워크를 신속하게 형성하였다. 단지 수초 지속하는 국소 원-타임 처리를 통해 강력하게 선호될 수 있는 생물학적 반응을 강력하게 유발하고 확산하는 TNT 접근법을 수행하기에 단순한 것은 신규 중재 세포-기반 치료요법의 발육에서 응용을 찾을 수 있다.

방법

TNT 플랫폼 제작

TNT 장치는 얇아진 (대략 200 ㎛) 양면 광맥 (100) 규소 웨이퍼로부터 제작하였다(도 7). 간략하게, AZ52I14E 포토레지스트의 대략적 1.5 ㎛ 두께의 두터운 층은 먼저 대략 3000 rpm에서 규소 웨이퍼 상에 스핀 피복시켰다. 나노스케일 개구부는 후속적으로 GCA 6I00C 스텝퍼를 사용하여 포토레지스트 상에서 패턴화시켰다. 나노스케일의 16 다이까지 개구부 어레이는 100-mm 웨이퍼 당 패턴화시켰다. 상기 개구부는 이어서 심도반응성 이온 에칭 (DRIE) (Oxford Plasma Lab 100 system)을 사용하여 규소 표면 상에 대략적으로 10 마이크로미터 심도 나노채널을 드릴링하기 위한 에치 마스크로서 사용되었다. 최적화된 에칭 조건은 SF6 가스를 포함하였다: 13 s/100 sccm 가스 흐름/7000 WICP 전력/40 W RF 전력/30 mT APC 압력; C4F8 가스 조건: 7 s/100 sccm 가스 흐름/700 W ICP 전력/10 W RF 전력/30 mT APC 압력. 마이크로스케일 저장소는 이어서 접촉 사진석판술 및 DRIE를 통해 웨이퍼의 후측면 상에 패턴화시켰다. 최종적으로, 대략적으로 50 nm 두께의 질화규소의 두터운 절연/보호 층은 TNT 플랫폼 표면 상에 침적시켰다.

동물 축산업

C57BL/6 마우스는 연구소(Harlan Laboratory)로부터 수득하였다. 연구소(Jackson laboratories)로부터 구입한 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB- tdTomato,-EGFP)Luo/J 마우스는 K14cre로 사육하여 K14cre/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J 마우스를 생성하였다. 모든 마우스는 수컷이고 연구 시점에 8 내지 12주령이다. ROSAmT/mG 마우스를 위한 유전형질분석 PCR은 프라이머 OIMR73I8- CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT (서열번호 1), OIMR73I9- CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA (서열번호 2) 및 0IMR732O- TCA ATG GGC GGG GGT CGT T (서열번호 3)을 사용하여 수행하였고, K-I4 Cre 전이유전자는 프라이머 olMRI084-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC (서열번호 4); 0IMRIO85-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT (서열번호 5)를 사용하여 확인하였다. 동물을 태그하고 컴퓨터 기반 알고리듬을 사용하여 무작위로 분류하였다.

포유동물 세포 배양물 및 시험관내 재프로그래밍

1차 인간 성인 진피 섬유아세포 (ATCC PCS-201-012)는 ATCC로부터 직접 구입하고 마이코플라스마 제거하고 보증하였다. 어떠한 추가의 세포주 입증은 수행하지 않았다. 이들 세포는 섬유아세포 성장 키트-무혈청 (ATCC PCS 201-040) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 섬유아세포 기본 배지에서 확장시켰다. E12.5-E14 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)는 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다. 비-바이러스 세포 형질감염 및 재프로그래밍 실험은 3D 나노채널 전기영동 (NEP)을 통해 수행하였다. 간략하게, 세포는 먼저 3D NEP 장치 상에서 밤새 완전한 컨플루언시때까지 성장시켰다. 후속적으로, 펄스 전기장을 사용하여 플라스미드 칵테일(0.05 ㎍/㎕)을 FH1:Etv2:Foxc2의 1:1:1 혼합물로 이루어진 세포에 전달하였다. 세포는 이어서 플라스미드 전달 24 시간 후 수확하였고, EGM-2 MV SingleQuot 키트(CC-4147, Lonza)로 보충된 EBM-2 기본 배지 (CC-3156, Lonza)에 위치시키고 추가의 실험/측정을 위해 추가로 가공하였다.

생체내 재프로그래밍

처리될 영역은 TNT 24 내지 48시간 전에 조련하였다. 이어서 피부를 각질 제거하여 죽은/케라틴 세포 층을 제거하고 상피에서 핵화된 세포를 노출시킨다. TNT 장치는 각질제거된 피부 표면 상에 직접 위치시켰다. ABM 또는 EFF 플라스미드 칵테일은 0.05-.1 ㎍/㎕의 농도로 저장소에 로딩하였다. 골드-피복된 전극 (즉, 캐소드)는 플라스미드 용액에 침지시키고, 24G 바늘 카운터-전극 (즉, 애노드)은 TNT 플랫폼 표면과 병치되게 진피내로 삽입하였다. 펄스된 전기 자극 (즉, 진폭에서 250 V의 10 펄스 및 펄스당 10 ms의 지속기간)은 이어서 전극을 거쳐 적용하여 노출된 세포막을 나노공극화하고 플라스미드 카고가 나노채널을 통해 세포로 구동되도록 하였다. ABM 플라스미드는 2:1:1의 몰비로 혼합하였다.

MCAO 뇌졸중 수술 및 분석

중뇌 동맥 페색 (MCAO)에 의해 마우수에 유도된 일시적 병소 뇌 허혈은 이전에 기재된 강내 필라멘트 삽입 기술을 사용함에 의해 성취되었다(문헌참조: Khanna et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206). MRI 이미지를 사용하여 부종에 대해 보정한 후 대측성 반구의 퍼센트로서 경색 크기를 결정하였다.

뒷다리 허혈 수술

일방향 뒷다리 허혈은 폐색 및 후속적 대퇴부 동맥의 절단에 이어서 절단에 의해 유도하였다(문헌참조: Limbourg et al. Nat Protoc 2009, 4(12): 1737-1746). 간략하게, 8 내지 10주 마우스를 1-3%의 이소플루란으로 마취시키고, 가열된 패드 상에 입체현미경 (Zeiss OPMI) 아래에 반듯이 눕혀 위치시켰다. 대퇴부 동맥을 노출시키고 대략 1cm 절개를 통해 대퇴부 정맥으로부터 분리하였다. 근위 및 원위 말단 폐색을 7-0 실크 봉합으로 유도하였고, 이어서 동맥을 완전히 처리하였다. 최종적으로, 단일 용량의 부프레노르핀은 통증을 제어하기 위해 피하로 투여하였다. 레이져 반점 이미지화 (Laser speckle imaging) (MoorLDI-Mark 2)를 수술 후 2시간 동안 수행하고 완전한 혈류 폐색을 확인하였다.

세포외 소포체의 단리 (EV)

EV는 OCT 블록에서 수거하고 이후 사용을 위해 동결 저장한 12 mm 직경 피부 생검으로부터 단리하였다. 간략하게, 상기 블록을 해동시키고 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하여 OCT를 제거하였다. 메스로 지방 조직의 제거 후, 피부 조직을 대략 1 mm의 조각으로 썰고 PBS 중에서 마이크로-그라인더로 파쇄시켰다. 3000 g에서 원심분리 후, 엑소퀵 키트(Exoquick kit) (System Biosciences)를 1:5의 비율(엑소퀵:상등액)로 사용하여 4℃에서 12시간 동안 상등액으로부터 EV를 단리하였다. EV는 1500 g에서 30분 동안 원심분리를 통해 침전시켰다. 이어서 총 RNA는 제조업자에 의해 제공된 추천에 따라 마르바나 키트 (Life technologies)를 사용하여 펠렛으로부터 추출하였다 .

DNA 플라스미드 제조

ABM 및 EFF 플라스미드는 플라스미드 DNA 정제 키트 (Qiagen Maxi-prep, 카탈로그 번호 12161, 및 Clontech Nucleobond 카탈로그 번호 740410)를 사용하여 제조하였다. DNA 농축물을 나노드랍 2000c 분광측정기 (Thermoscientific)로부터 수득하였다. 플라스미드 DNA 작제물 및 이들의 본래의 공급원의 목록은 표 1에서 찾을 수 있다.

LCM은 제조원 (PALM Technologies (Bernreid, Germany)으로부터 레이져 마이크로절개 시스템을 사용하여 수행하였다. 형태 및/또는 면역염색을 기준으로 동정된 조직 섹션의 특이적 영역을 절단하고 20x 눈 렌즈 아래 포착하였다. 상기 샘플은 25 ㎕의 세포 직접 용해 추출 완충액(Invitrogen)으로 나누었다. 대략적으로 조직 영역의 1,000,000 ㎛²를 각각의 캡으로 포착하고 용해물을 이어서 추가의 프로세싱을 위해 -80℃에서 저장하였다. LCM 샘플의 qRT-PCR은 제조업자의 지침 후 세포 직접적인 용해 완충액으로부터 수행하였다. 프라이머 목록은 표 2에서 찾을 수 있다.

면역조직화학 및 공초점 현미경

조직 면역염색은 특이적 항체 및 표준 과정을 사용하여 수행하였다. 간략하게, OCT-매립된 조직을 10 ㎛ 두께로 냉동 절개하고thick, 냉 아세톤으로 고정시키고, 10% 정상 염소 혈청으로 차단시키고 특이적 항체로 항온처리하였다. 후속적으로 형광성-태그된 적당한 2차 항체(Alexa 488-태그된 a-기니아 피그, 1:200, Alexa 488-태그된 a-토끼, 1:200; Alexa 568- 태그된 a-토끼, 1:200)와 항온처리하여 신호를 가시화하였고 DAPI로 대비 염색시켰다. 이미지는 레이져 스캐닝 공초점 현미경 (Olympus FV I000 필터/스펙트럼)에 의해 포착하였다.

IVIS 이미지화

동물은 MS Lumina II 광학 이미지화 시스템을 사용하여 FAM-DNA 형질감염 24시간 후 마취와 함께 이미지화하였다. 발광 이미지와 함께 오버레이 이미지는 생존 이미지 소프트웨어 (Living Image software)를 사용하여 생성하였다.

뇌졸증화된 뇌의 자기 공명 이미지화 (MRI)

자기 공명 사진촬영술을 사용하여 마우스에서 본 발명의 MCAO 모델을 확인하고 교합기 크기 및 효과적인 MCAO을 위한 경동맥 삽입 거리를 최적화하였다. T2-칭량된 MRI는 9.4 T MRI (Bruker Corporation, Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용하여 MCA-재관류 48시간 후 마취된 마우스에 대해 수행하였다. MR 이미지는 하기의 파라미터를 사용하여 이완 증진 (RARE) 서열과 함께 신속한 획득을 사용하여 획득하였다: 관측 시야 (FOV) 30　^χ　30 mm, 획득 매트릭스 256　x　256, TR 3,500 ms, TE 46.92 ms, 슬라이스 갭 1.0 mm, 희귀 인자 8, 평균 3의 수. mm 당 8.5 픽셀의 해상도. 원료 MR 이미지는 표준 DICOM 포맷으로 전환시켰고 프로세싱하였다. Osirix v3.4를 사용한 이미지의 적당한 소프트웨어 대비 증진 후, 디지탈 평면 측량은 마스크 관찰자에 의해 수행하여 각각의 관상 뇌 슬라이스에서 경색 영역을 기술하였다. 뇌 슬라이스로부터 경색 영역을 합하고 슬라이스 두께를 곱하고 경색 용적을 결정하기 위해 이전에 기재된 바와 같은 부종-유도된 종창에 대해 보정하였다(문헌참조: Khanna S, et al. J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206).

근육 활력의 분석

근육 활력은 RF 투과를 위한 용적 코일 및 수용에 대한 3IP 코일을 사용한 9.4 테슬라 스캐너 (Bruker Biospec) 상에서 NMR 분광측정으로 평가하였다(문헌참조: Fiedler et al. MAGMA 20I5, 28(5): 493-501.). 생체내 이미지화는 주문-제작된 1 H/31 P 트랜스시버 (transceiver) 코일 어레이에서 수행하였다. 데이터는 단일 펄스 시퀀스를 사용하여 획득하였다. 미가공 데이터는 노이즈 감소 및 스펙트럼 도메인으로 전환된 퓨리어를 위해 윈도우화하였다.

혈관의 초음파-기반 이미지화 및 특징 분석

혈관 형성은 초음파 이미지화를 통해 평행하게 모니터링하였다.

간략하게, Vevo 2100 시스템 (Visual Sonics, Toronto, ON, Canada)을 사용하여 MS 250 선형 어레이 프로브와 함께 B-모드 상에서 초음파 이미지를 수득하였다(문헌참조: Gnyawali et al. J Vis Exp 2010(41). 도플러 색 플루우 이미지화를 수행하여 수축기 및 확장기 하에 혈류 특징을 모니터링하고 정량하였다.

통계 분석

샘플을 코드화하고 데이터 분석은 맹검 양상으로 수행하였다. 동물 연구를 위해, 데이터는 3마리 동물의 평균 ± SD (즉, 생물학적 레플리케이트)로서 보고한다. 어떠한 동물도 분석으로부터 배제하지 않았다. 또한, 시험관내 재프로그래밍 데이터는 적어도 3개 실험의 평균 ± SD로서 보고한다.

실험은 적어도 2회 반복하여 재현성을 확인하였다. 그룹 간의 비교는 변량의 분석 (ANOVA)에 의해 수행하였다. 통계학적 차이는 적당히 SigmaPlot 버젼 13.0을 사용하여 파라미터/비-파라미터 시험을 통해 결정하였다.

TNT-기반 접근법을 사용하여 기재된 결과는 본원에 기재된 마이크로구조물 어레이를 포함하는 나노채널 기반 전달을 사용하여 성취될 수 있는 것을 지적한다.

실시예 2:

특정 구현예에서, 어레이된 상호침투 나노채널은 사진석판술 및 습윤 또는 건식 에칭과 같은 클린룸 방법을 사용하여 규소 기반 재료로부터 제작할 수 있다. 첫번째, 원뿔형 또는 피라미드형 상호침투 마이크로구조물 (대략 20-500 마이크론 높이)의 어레이를 사진석판술 및 습윤 또는 건식 에칭을 사용하여 규소 표면 상에 한정한다. 후속적으로, 규소 기판은 보호 석판술을 사용하여 나노웰 (대략 300 내지 1000 nm 직경)의 어레이로 후측면 상에 패턴화한다. 이어서 규소 기판/상호침투 마이크로구조물을 통해 나노채널을 드릴링하기 위한 고도의 이방성 심도반응성 이온 에치 (DRIE).

하기는 규소 상의 나노채널화된 미세바늘 어레이의 제작을 위한 예시적 방법이다

(1) 3D 나노채널 어레이의 제작

1. 4인치 규소 웨이퍼를 선택한다: 500 ㎛, DSP, 프라임 등급.

2. 웨이퍼를 습윤 에칭 (KOH, 45 %, 80℃)에 의해 250 ㎛ 두께로 얇게 한다.

3. 스텝퍼 (NTW)를 사용한 패턴 AZ-5214 나노-서클 어레이 (직경 400 nm, 공간: 25 ㎛)

4. AZ-5214 패턴에 의해 차폐된 규소 웨이퍼를 DRIE 에칭한다.

시스템: 드라지 연구소에서 Oxford Plasma Lab 100

조리법 명칭: Lingqian_Bosch

SF6 프로토콜: 100 sccm / 13 s / ICP 700 W / RF 30 W / Chamber Pressure 30 mT (double check)

C4F8 프로토콜: 100 sccm / 7 s / ICP 700 W / RF 10 W / 챔버 압력 30 mT (이중 조사)

에칭 과정: 40 사이클 전개; 5분 중지; 또 다른 5 사이클 전개; 5분 중지 및 여전히 포토레지스트가 남아있는지 조사. 예인 경우, 또 다른 5 사이클 전개 다시 조사 일반적으로, PR은 총 55 - 60 사이클을 수행한다. (40 + 5 + 5 + 5 +5 대신 60 사이클을 직접적으로 전개하지 않음을 주지한다. 다르게는, PR은 60사이클 후 연소시킨다)

5. TMP를 완전하게 사용하여 규소 웨이퍼/AZ5214를 세정하고; 5분 동안 피란하 용액 (120℃)를 중에서 웨이퍼를 세정한다. 베이 1 (NTW)에서 올림푸스 현미경을 사용하여 나노채널 어레이가 가시적인지를 조사한다

6. 규소 웨이퍼의 다른 측면 상에 패턴 마이크로채널 어레이 (직경 50 ㎛; 중심 대 중심 거리: 70 ㎛)에 대한 표준 사진석판술 과정. 포토레지스트: SPR 220-7; 두께: 10 ㎛. 패터닝 과정에서: 마이크로채널의 어레이가 일반적으로 나노채널 어레이와 동일한 방향이도록 확실히 한다.

7. 두께가 250 ㎛인 또 다른 규소 웨이퍼를 제조한다.

8. 나노채널 측면 상에 펌프 오일 (베이 4에서 ETCO4를 위해 사용되는, NTW)을 완전히 코팅시킨다. 주지사항: 소적 보다는 차라리 규소 웨이퍼의 표면 상의 전부에 오일. 다르게는, 오일이 없는 영역은 DRIE 과정에서 SPR 220 PR을 쿡킹한다.

9. 오일과 계면을 형성하는, 나노채널 측면을 갖는 250 ㎛ 두께 규소 웨이퍼에 주의깊게 및 완전하게 결합시킨다. 상기 방법은 DRIE 과정에서 규소 웨이퍼를 헬륨 힘에 충분히 강성이도록 유지하면서 장시간 DRIE 시스템에서의 열을 감소시키는 것이다.

10. SPR 220-7에 의해 차폐된 규소 웨이퍼를 DRIE 에칭한다.

시스템: 드라지 연구소에서 Oxford Plasma Lab 100

조리법 명칭: Lingqian_Bosch

SF6 프로토콜: 100 sccm / 13 s / ICP 700 W / RF 30 W / 챔버 압력 30 mT (이중 조사)

에칭 과정: 250 사이클 전개; 5분 중지; 또 다른 20 사이클 전개; 5분 중지 및 여전히 포토레지스트가 남아있는지 조사. 예인 경우, 또 다른 10 사이클 전개 다시 조사 경험적으로, 마이크로채널은 약 280 사이클 후 나노채널에 연결한다. 그러나, 정확한 사이클은 옥스포드 플라스마 시스템은 항상 표류하기 때문에 고정하기가 불가능하다. 따라서, 270 사이클 후, SEM은 임의의 중지 시간에 마이크로채널의 교차를 조사하고, 모든 마이크로채널이 나노채널에 연결되었는지를 평가 (이 부분이 가장 시간 소모적이고 이는 가용성에 따라 약 3 내지 5일을 필요로 한다)하기 위해 사용되어야 한다

11. 서서히 그리고 주의깊게 이로부터의 샘플을 제거한다

12. 5분 동안 피라나 용액 중에서 웨이퍼를 세정한다 (120℃). 베이 1 (NTW)에서 올림푸스 현미경을 사용하여 나노채널 어레이 및 마이크로채널 어레이가 가시적인지를 조사한다

13. 나노체널의 디자인에 의존하여, 규소 웨이퍼는 작은 조작으로 다이스하였다.

(2) DRIE를 사용한 미세마늘의 제작

1. 1 cm x 1 cm의 차원을 갖는 하나의 규소 샘플을 집어내고 피라나 용액으로 상기 샘플을 완전하게 세정한다.

2. 나노채널 측면 상에 마이크로-서클 어레이를 패턴화한다: SPR 220 -7 포토레지스트, 두께 10 ㎛. 마이크로-서클 패턴: 화산 형태의 바늘의 차원을 최종적으로 결정하는 직경 15 ㎛. 공간: 중심 - 중심 25 ㎛. 이상적인 조건: 중공 바늘 퍼센트를 증가시킬 수 있는, 사진석판술에서 나노채널 어레이와 마이크로-서클을 정렬시킨다.

3. 작은 샘플을 오일을 사용하여 (전체 영역이 오일로 코팅됨) 새로운 4인치 웨이퍼 상에 고착시킨다

4. DRIE 과정: Oxford Plasma Lab 100

조제법: 링키안이방성(Lingqian_Isotropic) 에칭 (이중 조사)

프로토콜: SF6: 40 sccm / ICP 전력: 600 W / RF 전력 5 W - 10 W (화산 형태를 결정하는). 에칭 시간: 2분; 중지하고 PR이 잔류하는지를 조사하고; 예인 경우, 1 초과의 분. 및 PR이 잔류하는지를 조사하고; 예인 경우 1 초과의 분. 진행된 경우, 현미경 또는 SEM을 조사한다. 바늘이 나타나지 않은 경우, 마스크 없이 에칭을 1분 동안 계속한다.

5. 상기 최적화된 프로토콜 하에, 미세-바늘은 ~ 2+ 1 +1 분으로 제작한다.

실시예 3:

하나의 특정 구현예에서, 어레이된 상호침투 나노채널은 규소계일 수 있거나 선택적 표면 에칭을 통해 애노드화된 알루미나로부터 제조될 수 있는 이미 만들어진 나노채널화된 기판 플랫폼으로부터 제작될 수 있다. 선택적 표면 에칭을 사용하여 상호 침투 마이크로구조물을 한정한다.

실시예 4:

바람직한 구현예에서, 카고를 다중 수준에서 생물학적 조직에 전달하는 방법은 상호침투 나노채널 어레이를 사용하여 수행한다. 상호침투 나노채널 어레이는 각질제거된 피부 조직과 접촉하도록 위치시킨다. 양전극은 진피내로 삽입하고 음전극은 카고 용액과 접촉시킨다. 펄스 전기장 (250 V, 10 ms 펄스, 10 펄스)은 이어서 전극에 걸쳐 나노공극 노출된 세포막에 적용하고 상기 카고를 직접 세포질에 주사한다.

카고 용액은 Etv2, Foxc2 및 FI1을 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 포함하였다. 작은 조직 생검은 전달 24시간 후 수거하고 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 추가의 생검은 전달 7일 후에 수거하고 내피 마커를 위해 면역조직화학을 통해 분석하였다. DTN-기반 전달은 전체 조직 두께에 걸쳐 광범위하게 분포된 재프로그래밍 반응 뿐만 아니라 월등한 전이유전자 발현을 유도한다.

달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 공보 및 이들이 인용된 자료들은 구체적으로 참조로 인용된다.

당업자는 단지 통상의 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예와의 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 상기 등가물은 하기의 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

참조문헌

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Claims

마이크로구조물 어레이 (100)가:
상부 표면 (102) 및 하부 표면 (103)을 갖는 평면 기판 (101);
상기 평면 기판의 상부 표면과 유체 통류하는 저장소 (104);
상기 평면 기판의 하부 표면으로부터 돌출된 다수의 마이크로구조물 (105)로서, 상기 다수의 마이크로구조물 각각이:
각각의 기저부 (107)로부터 상기 평면 기판의 하부 표면으로부터의 일정 높이에 위치한 원위 팁 (108)으로 테이퍼링되며, 상기 각각의 기저부로부터 각각의 상기 원위 팁으로 마이크로구조물 표면을 한정하는 각각의 고형 바디 부분 (106);
상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 마이크로구조물 표면 내 제1 채널 또는 슬릿 개구부 (110)까지 연장함으로써 상기 저장소를 각각의 상기 제1 채널 또는 슬릿 개구부에 유체적으로 연결하는 각각의 제1 전달 채널 (109) 또는 슬릿; 및
상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 마이크로구조물 표면 내 각각의 제2 채널 또는 슬릿 개구부 (112)까지 연장함으로써 상기 저장소를 상기 각각의 제2 채널 또는 슬릿 개구부에 유체적으로 연결하는 각각의 제2 전달 채널 (111) 또는 슬릿을 포함하는, 돌출된 다수의 마이크로구조물 (105); 및
상기 저장소와 전기 접촉되어 있는 제1 전극 및 조직의 하나 이상의 세포와 전기적으로 접촉하도록 구성된 제2 전극을 포함하고,
상기 다수의 마이크로구조물의 각각의 상기 고형 바디 부분은 사진석판술(photolithography) 및 에칭을 사용하여 규소(silicon)로부터 형성되고,
상기 제1 전달 채널 또는 슬릿 및 제2 전달 채널 또는 슬릿은 1 내지 999nm의 내부 직경을 가지고,
상기 각각의 제1 채널 또는 슬릿 개구부가 상기 평면 기판과 평행한 제1 평면 내 위치하고, 여기서, 상기 각각의 제2 채널 또는 슬릿 개구부가 상기 평면 기판에 평행한 제2 평면 내에 위치하고 상기 제1 평면이 상기 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고.
상기 제1 평면이 상기 평면 기판의 하부 표면으로부터의 높이의 20% 내지 60%의 거리만큼 상기 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고,
상기 각각의 제1 채널 또는 슬릿 개구부가 상기 각각의 원위 팁에 위치한, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 다수의 마이크로구조물 각각이 상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 마이크로구조물 표면 내 각각의 제3 채널 또는 슬릿 개구부 (114)까지 연장함으로써 상기 저장소를 제3 채널 또는 슬릿 개구부에 유체적으로 연결하는 각각의 제3 전달 채널 (113) 또는 슬릿을 추가로 포함하는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 2에 있어서, 상기 제1 채널 또는 슬릿 개구부가 상기 평면 기판과 평행한 제1 평면 내에 위치하고, 상기 제2 채널 또는 슬릿 개구부가 상기 평면 기판에 평행한 제2 평면 내에 위치하며, 상기 제3 채널 또는 슬릿 개구부가 상기 평면 기판에 평행한 제3 평면 내에 위치하고;
상기 제1 평면이 상기 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고, 상기 제2 평면이 상기 제3 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고, 상기 제3 평면이 상기 제1 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있고 상기 제 2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 3에 있어서, 상기 제1 평면이 상기 평면 기판의 하부 표면으로부터의 높이의 20% 내지 60%의 거리만큼 상기 제2 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 3에 있어서, 상기 제2 평면이 상기 평면 기판의 하부 표면으로부터의 높이의 20% 내지 60%의 거리만큼 상기 제3 평면으로부터 원위적으로 이격되어 있는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로구조물 표면의 높이가 5 마이크론 내지 1000 마이크론인, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로구조물의 기저부의 너비가 5 마이크론 내지 500 마이크론인, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로구조물의 기저부가 환형을 갖는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 기저부가 직사각형을 갖는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 다수의 각각의 상기 마이크로구조물의 상기 각각의 고형 바디가 평행한 릿지, 헤링본 패턴으로 어레이된 릿지, 파형 패턴, 원뿔 또는 피라미드로 어레이된 릿지를 독립적으로 포함하는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 다수의 마이크로구조물의 각각의 원위 팁이 뾰족하거나, 둥글거나, 경사지거나, 나팔 모양이거나, 테이퍼되거나, 평활 말단되는 것으로부터 독립적으로 선택된 형상을 가지는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 각각의 제1 전달 채널 또는 슬릿 및 상기 각각의 제2 전달 채널 또는 슬릿 각각이 상기 평면 기판과 평행한 평면에 환형 교차 (circular cross-section)를 갖는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 각각의 제1 전달 채널 또는 슬릿 및 상기 각각의 제2 전달 채널 또는 슬릿 각각이 상기 평면 기판과 평행한 평면에 직사각형 교차를 갖는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 다수의 마이크로구조물 각각이 상기 기저부로부터 상기 원위 팁까지 단계적 방식으로 테이퍼링된 각각의 고형 바디 부분을 포함하는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 다수의 마이크로구조물 각각의 상기 각각의 고형 바디 부분이 절두원추 형태를 갖는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 다수의 마이크로구조물 각각의 상기 각각의 고형 바디 부분이 규소로부터 형성되는, 마이크로구조물 어레이.
청구항 1에 있어서, 상기 평면 기판이 추가로 다수의 전달 채널을 포함하고, 이의 각각이 상기 평면 기판의 상부 표면으로부터 상기 평면 기판의 하부 표면 내 채널 개구부까지 연장함으로써, 상기 저장소를 상기 평면 기판의 하부 표면 내 상기 채널 개구부까지 유체적으로 연결하는, 마이크로구조물 어레이.
인간을 제외한 포유동물의 조직 내 세포로 물질을 전달하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
청구항 1의 미세구조물 어레이를 상기 조직에 적용하여 상기 평면 기판의 하부 표면이 상기 조직에 대응하여 위치되고 다수의 마이크로구조물이 상기 조직으로 연장하도록 하고;
물질을 상기 저장소로부터 상기 다수의 마이크로구조물 각각의 제1 전달 채널 및 제2 전달 채널을 통해 상기 조직 내 세포로 전달함을 포함하는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 물질이 상기 조직의 다중 세포 수준으로 동시에 전달되는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 물질이 인장, 수동으로, 전단력, 확산, 주사, 압력, 전기천공, 삼투압, 농도 구배, 전기 자기장, 낮은 주파수 초음파 또는 이들의 조합을 통해 전달되는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 물질이 전기천공을 통해 전달되는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 마이크로구조물 어레이가 저장소와 전기적으로 접촉된 제1 전극 및 조직과 전기적으로 접촉된 제2 전극을 포함하고;
전기천공을 통한 전달이 조직 내 세포를 전기천공하고 상기 다수의 마이크로구조물 각각의 상기 제1 및 제2 전달 채널을 통해 저장소로부터 물질을 상기 조직의 세포로 구동시키기 위해 상기 제1 전극과 상기 제2 전극에 걸쳐 전기장을 인가함을 포함하는, 방법.
청구항 22에 있어서, 상기 전기장이 1 V 내지 500 V의 전위로 인가되는, 방법.
청구항 22에 있어서, 상기 전기장이 펄스된 전기장을 포함하는, 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 펄스된 전기장이 0.1 밀리초 내지 100 밀리초의 지속기간을 갖는 다수의 펄스를 포함하는, 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 펄스된 전기장이 1 내지 500 펄스를 포함하는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 물질의 전달이 피드백 시스템에 의해 제어되는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 물질이 치료학적 제제를 포함하는, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 치료학적 제제가 핵산인, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 치료학적 제제가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 치료학적 제제가 소분자인, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 치료학적 제제가 백신인, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 치료학적 제제가 재프로그래밍된 세포로부터 단리된 소포체를 포함하는, 방법.
청구항 33에 있어서, 상기 소포체가 엑소좀을 포함하는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 물질이 진단학적 제제를 포함하는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 저장소가 2개 이상의 상이한 물질을 포함하고, 상기 방법이 2개 이상의 물질을 조직 내 세포에 동시에 전달함을 포함하는, 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 방법이 상기 다수의 마이크로구조물이 이를 넘어 조직으로 연장하는 수준에서 물질을 조직으로 주사함을 포함하는, 방법.
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