KR20170093815A - 암 치료 응용을 위한 미세바늘 어레이 - Google Patents
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Abstract
미세바늘을 형성하는 방법은 하나 또는 그 이상의 화학요법제(chemotherapeutic agents)를 갖는 미세바늘 어레이(microneedle array)를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 미세바늘 어레이는 기저부(base portion) 및 기저부로부터 뻗는 다수의 미세바늘을 포함할 수 있고, 상기 하나 또는 그 이상의 화학요법제는 상기 기저부보다 다수의 미세바늘에 고농도로 존재될 수 있다.
Description
본 개시는 경피 약물 전달(transdermal drug delivery)을 위한 시스템 및 방법, 특히, 용해가능한 미세바늘 어레이(dissolvable microneedle arrays)를 만들고 사용하기 위한 시스템 및 방법과 관련이 있다.
피부의 주목할 만한 신체적 장벽 기능은 경피 약물 전달(transdermal drug delivery)에 대한 현저한 도전을 제기한다. 상기 도전 과제를 해결하기 위해, 다양한 미세바늘-어레이를 기반으로 하는 약물 전달 장치가 개발되었다. 예를 들면, 한가지 종래의 방법은 유효 성분을 가지지 않는 고체 또는 속이 빈(hollow) 미세바늘 어레이를 사용한다. 상기 미세바늘 어레이는 생물학적 담체 또는 전통적인 패치를 국소 적용하기 전에 경피의(percutaneous) 약물 침투를 증가하기 위하여 표피의 각질층(stratum corneum)) 및 상층을 관통하여 피부를 전제조건화(pre-condition)할 수 있다. 상기 방법은 피부의 투과성을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났으나; 이러한 방법은 단지 전달된 약물 또는 백신의 복용량(dosage)과 양(quantity)을 조절하는 제한된 능력을 제공한다.
생물제제의 저장소(reservoir of biologics)에 부착된 표면-코팅되거나 또는 속이 빈 미세바늘인 고체 미세바늘을 사용한 종래의 방법은 약물상의 제한 및 복용량 조합을 포함하는 현저한 제한, 및 일부 경우에서, 복합체 제조 절차 및 특성화된 응용 설정을 가진다. 비록 생체분해성(biodegradable)이고 용해가능한(dissolvable) 일부 고체 미세바늘 어레이가 개발되었지만, 이러한 시스템의 사용은 효과적이고 효율적인 방식으로 어레이로 내장될 수 있는 유효 성분으로 제한되는 제조 과정에 의해 제한되어 왔다.
따라서, 비록 미세바늘-어레이를 기반으로 하는 장치를 사용하는 생물제제(biologics)의 경피 전달이 구강 및 바늘-기반 약물 전달 방법에 대해 우세한 매력적인 이론적 이점을 제공하지만, 상당한 실용적인 제한이 종래의 과정을 이용하여 구성된 미세바늘 어레이와 연관된 디자인 및 제조에 존재한다.
도 1은 미세바늘의 예 및 이들의 규모를 나타낸다.
도 2는 전형적 미세바늘 어레이 및 이의 규모를 나타낸다.
도 3A 및 3B는 팁-부하된(tip-loaded) 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 4A 및 4B는 팁-부하된 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 5A 및 5B는 팁-부하된 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 6A 및 6B는 팁-부하된 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 7은 미세바늘 대표 주형(mastermolds)을 제조(fabricating)하는데 사용된 축소형 정확한-초정밀가공(micromilling) 시스템을 나타낸다.
도 8은 피라미드 바늘을 가진 초정밀가공된(micromilled) 대표 주형의 SEM 이미지이다.
도 9는 피라미드 생산 주형(pyramidal production mold)의 SEM 이미지이다.
도 10은 생산 주형(production mold)의 확대된 부분의 SEM 이미지이며, 이미지의 중앙에 피라미드 바늘 주형 웰을 나타내고 있다.
도 11A-11D는 전형적 CMC-고체 및 내장된 유효 성분을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 전형적 CMC-고체 및 내장된 유효 성분을 나타낸다.
도 13은 수직 다수의 층으로 된 증착 구조(deposition structure) 및 이의 제조(fabricating) 방법의 개략도(schematic illustration)이다.
도 14는 내장된 유효 성분의 층 및 공간 분포 기술을 이용하여 제조된 전형적 미세바늘 어레이의 개략도이다.
도 15는 공간적으로 조절된 방식으로 제조된 전형적 미세바늘 어레이의 개략도이다.
도 16A는 다수의 피라미드-유형 주형된 미세바늘의 SEM 이미지이다.
도 16B는 단일 피라미드-유형 주형된 미세바늘의 SEM 이미지이다.
도 17은 기둥(pillar) 유형 주형된 미세바늘의 SEM 이미지이다.
도 18은 피라미드 유형 주형된 미세바늘의 현미경 사진이다.
도 19는 기둥 유형 주형된 미세바늘의 현미경 사진이다.
도 20은 마이크로마일된 대표 주형 또는 재료 블록의 직접 초정밀 가공을 사용하여 형성될 수 있는 다양한 미세바늘 기하학을 나타낸다.
도 21은 실패 및 뚫는(piercing) 시험을 수행하기 위한 시험 장치를 나타낸다.
도 22는 기둥 유형 미세바늘(왼쪽) 및 피라미드 유형 미세바늘(오른쪽)에 대한 힘-변위 곡선(force-displacement curves)을 나타낸다.
도 23은 기둥 유형 미세바늘(왼쪽) 및 피라미드 유형 미세바늘(오른쪽)에 대한 미세바늘 편향(deflections)의 한정된 요소 모델을 나타낸다.
도 24는 피부 체외배양조직(skin explants)에서 피라미드 (A, C, E) 및 기둥 (B, D, F) 유형 미세바늘의 침투의 다양한 입체 현미경 사진을 나타낸다.
도 25A, 25B, 및 25C는 ?뎔? 들어가는 피부 체외배양조직에서 미세바늘 어레이의 효과를 나타낸다.
도 26A 및 26B는 미세바늘 어레이 면역화된 마우스의 림프절(lymph nodes)을 배수하는(draining) 피부에 미립자로 된 생체 내 전달을 나타낸다.
도 27은 미세바늘 전달된 모델 항원의 면역원성(immunogenicity)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 28은 저장중인 CMC-미세바늘 어레이의 활성 카고(active cargo)의 안정성을 나타내는 막대 그래프이다
도 29A 및 29B는 미세바늘 어레이를 통하여 시톡신®(Cytoxan®) (cyclophosphamide)이 전달된 표피 세포의 세포사멸(apoptosis)의 유도를 나타낸다.
도 30은 재료 블록의 직접적 초정밀가공(micromilling)에 의해 형성될 수 있는 미세바늘 기하학을 나타낸다.
도 31은 직접적으로-제조된 고체 CMC-미세바늘 어레이의 입체 현미경 이미지이다.
도 32는 도 31의 미세바늘 어레이의 부분의 입체 현미경 이미지이다.
도 33은 직접적 초정밀가공(micromilling)의 블록 또는 시트를 만들기 위한 캐스팅-주형 조합체(casting-mold assembly)의 개략 단면도(schematic cross-sectional view)이다.
도 34는 직접적 초정밀가공의 블록 또는 시트에 사용될 수 있는 건조 장치의 개략 단면도이다.
도 35는 GFP를 발현하는 표적 293T 세포의 세포유동 분석기(flow cytometry analysis)이다.
도 36은 저장 중에 많은 일(days) 후에 바이러스가 내장된 미세바늘의 안정성을 나타낸다.
도 37은 마이크로 바늘 어레이가 전달된 아데노벡터(adenovectors)의 발현 및 면역원성을 나타낸다.
도 38은 표적 조직으로 들어가는 미세바늘 삽입을 위한 도포기(applicator)를 나타낸다.
도 39는 도 38에 나타낸 바와 같은 도포기(applicator)와 함께 사용하기 위한 도포기 헤드 디자인을 나타낸다.
도 40은 도포기 헤드의 치수 이동의 개략도이다.
도 41A는 임의의 치료를 받지 않은 대조군 개체 및 MNA로 독소루비신(doxorubicin)이 통합된 치료를 받은 개체를 포함하는, B16 흑색종에 대한 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)의 시간 경과에 따른 종양 성장을 비교한다.
도 41B는 임의의 치료를 받지 않은 대조군 개체 및 MNA로 폴리(I:C)이 통합된 치료를 받은 개체를 포함하는, B16 흑색종에 대한 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)의 시간 경과에 따른 종양 성장을 비교한다.
도 41C는 임의의 치료를 받지 않은 대조군 개체 및 MNA로 독소루비신(doxorubicin) 및 폴리(I:C)가 통합된 치료를 받은 개체를 포함하는, B16 흑색종에 대한 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)의 시간 경과에 따른 종양 성장을 비교한다.
도 41D는 치료를 받지 않은 개체, MNAs를 경유한 독소루비신, MNAs를 경유한 폴리(I : C), 및 동일한 MNAs에 통합된 독소루비신 및 폴리(I : C) 모두를 포함하는, 개체의 시간 경과에 따른 생존율을 비교한다.
도 42는 B16 흑색종에 대한 대조군 동물과 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)으로 치료된 동물을 비교한 5일째의 대표 이미지를 나타낸다.
도 43은 B16 흑색종에 대한 대조군 동물과 MNA-전달된 화학면역요법으로 치료된 동물을 비교한 24일째의 대표 이미지를 나타낸다.
도 44는 초기 MNA-전달된 화학면역요법 치료 후에 재도전된 마우스의 감소된 폐 병변을 나타낸다.
도 45는 초기 MNA-전달된 화학면역요법 치료를 경험하지 않은 재도전된 마우스의 폐 병변을 나타낸다.
도 46은 치료되지 않은 마우스 및 MNA-전달 화학 요법으로 치료된 마우스의 폐 종양 초점(foci)의 수를 비교한다.
도 2는 전형적 미세바늘 어레이 및 이의 규모를 나타낸다.
도 3A 및 3B는 팁-부하된(tip-loaded) 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 4A 및 4B는 팁-부하된 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 5A 및 5B는 팁-부하된 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 6A 및 6B는 팁-부하된 유효 성분을 가진 전형적 미세바늘을 나타낸다.
도 7은 미세바늘 대표 주형(mastermolds)을 제조(fabricating)하는데 사용된 축소형 정확한-초정밀가공(micromilling) 시스템을 나타낸다.
도 8은 피라미드 바늘을 가진 초정밀가공된(micromilled) 대표 주형의 SEM 이미지이다.
도 9는 피라미드 생산 주형(pyramidal production mold)의 SEM 이미지이다.
도 10은 생산 주형(production mold)의 확대된 부분의 SEM 이미지이며, 이미지의 중앙에 피라미드 바늘 주형 웰을 나타내고 있다.
도 11A-11D는 전형적 CMC-고체 및 내장된 유효 성분을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 전형적 CMC-고체 및 내장된 유효 성분을 나타낸다.
도 13은 수직 다수의 층으로 된 증착 구조(deposition structure) 및 이의 제조(fabricating) 방법의 개략도(schematic illustration)이다.
도 14는 내장된 유효 성분의 층 및 공간 분포 기술을 이용하여 제조된 전형적 미세바늘 어레이의 개략도이다.
도 15는 공간적으로 조절된 방식으로 제조된 전형적 미세바늘 어레이의 개략도이다.
도 16A는 다수의 피라미드-유형 주형된 미세바늘의 SEM 이미지이다.
도 16B는 단일 피라미드-유형 주형된 미세바늘의 SEM 이미지이다.
도 17은 기둥(pillar) 유형 주형된 미세바늘의 SEM 이미지이다.
도 18은 피라미드 유형 주형된 미세바늘의 현미경 사진이다.
도 19는 기둥 유형 주형된 미세바늘의 현미경 사진이다.
도 20은 마이크로마일된 대표 주형 또는 재료 블록의 직접 초정밀 가공을 사용하여 형성될 수 있는 다양한 미세바늘 기하학을 나타낸다.
도 21은 실패 및 뚫는(piercing) 시험을 수행하기 위한 시험 장치를 나타낸다.
도 22는 기둥 유형 미세바늘(왼쪽) 및 피라미드 유형 미세바늘(오른쪽)에 대한 힘-변위 곡선(force-displacement curves)을 나타낸다.
도 23은 기둥 유형 미세바늘(왼쪽) 및 피라미드 유형 미세바늘(오른쪽)에 대한 미세바늘 편향(deflections)의 한정된 요소 모델을 나타낸다.
도 24는 피부 체외배양조직(skin explants)에서 피라미드 (A, C, E) 및 기둥 (B, D, F) 유형 미세바늘의 침투의 다양한 입체 현미경 사진을 나타낸다.
도 25A, 25B, 및 25C는 ?뎔? 들어가는 피부 체외배양조직에서 미세바늘 어레이의 효과를 나타낸다.
도 26A 및 26B는 미세바늘 어레이 면역화된 마우스의 림프절(lymph nodes)을 배수하는(draining) 피부에 미립자로 된 생체 내 전달을 나타낸다.
도 27은 미세바늘 전달된 모델 항원의 면역원성(immunogenicity)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 28은 저장중인 CMC-미세바늘 어레이의 활성 카고(active cargo)의 안정성을 나타내는 막대 그래프이다
도 29A 및 29B는 미세바늘 어레이를 통하여 시톡신®(Cytoxan®) (cyclophosphamide)이 전달된 표피 세포의 세포사멸(apoptosis)의 유도를 나타낸다.
도 30은 재료 블록의 직접적 초정밀가공(micromilling)에 의해 형성될 수 있는 미세바늘 기하학을 나타낸다.
도 31은 직접적으로-제조된 고체 CMC-미세바늘 어레이의 입체 현미경 이미지이다.
도 32는 도 31의 미세바늘 어레이의 부분의 입체 현미경 이미지이다.
도 33은 직접적 초정밀가공(micromilling)의 블록 또는 시트를 만들기 위한 캐스팅-주형 조합체(casting-mold assembly)의 개략 단면도(schematic cross-sectional view)이다.
도 34는 직접적 초정밀가공의 블록 또는 시트에 사용될 수 있는 건조 장치의 개략 단면도이다.
도 35는 GFP를 발현하는 표적 293T 세포의 세포유동 분석기(flow cytometry analysis)이다.
도 36은 저장 중에 많은 일(days) 후에 바이러스가 내장된 미세바늘의 안정성을 나타낸다.
도 37은 마이크로 바늘 어레이가 전달된 아데노벡터(adenovectors)의 발현 및 면역원성을 나타낸다.
도 38은 표적 조직으로 들어가는 미세바늘 삽입을 위한 도포기(applicator)를 나타낸다.
도 39는 도 38에 나타낸 바와 같은 도포기(applicator)와 함께 사용하기 위한 도포기 헤드 디자인을 나타낸다.
도 40은 도포기 헤드의 치수 이동의 개략도이다.
도 41A는 임의의 치료를 받지 않은 대조군 개체 및 MNA로 독소루비신(doxorubicin)이 통합된 치료를 받은 개체를 포함하는, B16 흑색종에 대한 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)의 시간 경과에 따른 종양 성장을 비교한다.
도 41B는 임의의 치료를 받지 않은 대조군 개체 및 MNA로 폴리(I:C)이 통합된 치료를 받은 개체를 포함하는, B16 흑색종에 대한 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)의 시간 경과에 따른 종양 성장을 비교한다.
도 41C는 임의의 치료를 받지 않은 대조군 개체 및 MNA로 독소루비신(doxorubicin) 및 폴리(I:C)가 통합된 치료를 받은 개체를 포함하는, B16 흑색종에 대한 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)의 시간 경과에 따른 종양 성장을 비교한다.
도 41D는 치료를 받지 않은 개체, MNAs를 경유한 독소루비신, MNAs를 경유한 폴리(I : C), 및 동일한 MNAs에 통합된 독소루비신 및 폴리(I : C) 모두를 포함하는, 개체의 시간 경과에 따른 생존율을 비교한다.
도 42는 B16 흑색종에 대한 대조군 동물과 MNA-전달된 화학면역요법(chemo-immunotherapy)으로 치료된 동물을 비교한 5일째의 대표 이미지를 나타낸다.
도 43은 B16 흑색종에 대한 대조군 동물과 MNA-전달된 화학면역요법으로 치료된 동물을 비교한 24일째의 대표 이미지를 나타낸다.
도 44는 초기 MNA-전달된 화학면역요법 치료 후에 재도전된 마우스의 감소된 폐 병변을 나타낸다.
도 45는 초기 MNA-전달된 화학면역요법 치료를 경험하지 않은 재도전된 마우스의 폐 병변을 나타낸다.
도 46은 치료되지 않은 마우스 및 MNA-전달 화학 요법으로 치료된 마우스의 폐 종양 초점(foci)의 수를 비교한다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 본 명세서에 전문이 참고로서 삽입된, 2014년 11월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/076,385의 이익을 청구한다.
정부 지원에 대한 감사의 말
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 부여한 보조금 번호 EB012776, AI076060, 및 CA121973에 따라 정부 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
요약
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 인간 피부에 생물학적 활성 분자의 효율적이고 정밀하며 재현 가능한 전달을 제공할 수 있는 용해 가능한 마이크로 바늘 어레이에 기반하여 피부 전달 플랫폼(cutaneous delivery platforms)을 포함한다. 미세바늘 어레이 전달 플랫폼은 암 치료 응용을 위해 본원에 개시된 바와 같은 화학요법제를 포함한, 광범위한 생체 유효 성분을 환자에게 전달하는데 사용될 수 있다.
개시된 실시형태의 이전 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
상세한 설명
하기의 설명은 본질적으로 예시적인 것이며 어떠한 방식으로도 개시된 실시형태의 범위, 응용성 또는 구성을 제한하려는 것이 아니다. 실시형태에서 설명된 다양한 변화는 본 개의 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에서 설명된 요소들의 기능 및 배열에서 만들어 질 수 있다.
본 출원 및 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 “a,”“an,” 및 “the”는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 추가적으로, 용어 “포함하다(includes)"는 “포함하다(comprises)”를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적(biologic)", "유효 성분(active component)", "생체 유효 성분(bioactive component)", "생체 유효 물질(bioactive material)" 또는 "카고(cargo)"는 진통제(analgesic agents), 마취제(anesthetic agents), 항-천식약(anti-asthmatic agents), 항생제(antibiotics), 항-우울제(anti-depressant agents), 항-당뇨병제(anti-diabetic agents), 항-곰팡이제(anti-fungal agents), 항-고혈압제(anti-hypertensive agents), 항-염증제(anti-inflammatory agents), 항-악성종양 제(anti-neoplastic agents), 항불안제(anxiolytic agents), 효소 활성제(enzymatically active agents), 핵산 구조체(nucleic acid constructs), 면역 자극제(immunostimulating agents), 면역 억제제(immunosuppressive agents), 백신(vaccines), 등과 같은 약학적 활성제(harmaceutically active agent)를 의미한다. 생체 유효 물질은 용해성(dissoluble) 물질, 불용성이지만 분산성 물질(insoluble but dispersible materials), 천연 또는 제조된 거대(macro), 미세(micro) 및 나노(nano) 미립자, 및/또는 2개 이상의 용해성, 분산성 불용성 물질 및 천연 및/또는 제조된 거대, 미세 및 나노 미립자로 된 혼합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “화학요법제(chemotherapeutic agent)”는 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질환의 치료에서 치료 유용성을 가진 모든 화학 작용제를 의미한다. 상기 질환은 종양, 신생물(neoplasm), 및 암을 포함한다. 화학요법제(chemotherapeutic agent)는 흑색종과 같은 종양을 치료하기 위해, 독소루비신(doxorubicin)을 포함하는, 당업자에 의해 알려진 것을 포함한다. 또한 화학요법제는 폴리(I:C) 및 폴리-ICLC와 같은, 종양을 거부하고 파괴하는 면역 시스템을 자극하기 위한 당업자에게 알려진 면역자극제(특이적 및 비-특이적)를 포함한다.
일실시예에서, 화학요법제(chemotherapeutic agent)는 피부암을 예방하거나 치료하기 위해 개체에게 투여된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “피부암,”은 많은 원인을 가질 수 있는 피부 상의 악성 종양을 의미한다. 일반적으로 피부암은 표피(피부의 가장 바깥층)에 발달되므로, 종양은 항상 명확히 육안으로 보인다. 피부암은 암의 흑색종 및 비흑색종 유형을 포함한다. 흑색종 (또는 악성 흑색종 또는 피부(cutaneous) 흑색종으로 알려진)은 멜라닌 세포에서 시작하는 암이다. 대부분의 흑색종 세포는 여전히 멜라닌(melanin)을 생성하기 때문에, 흑색종 종양은 항상 갈색 또는 검은색이다. 비흑색종 피부암은 악성 흑색종을 제외한 모든 피부암을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 흑색종에 대한 화학요법제는 흑색종의 발달 또는 전이를 예방하거나 억제하는 제제를 포함한다.
하나 또는 그 이상의 징후 또는 증상을 감소시키거나 억제하는 것과 같은, 원하는 반응을 일으키기에 충분한 제제의 양은 조건 또는 질환과 연관되어 있다. 개체에 투여될 때, 복용량은 일반적으로 표적 조직 농도를 달성할 수 있는 것이 사용된다. 일부 실시형태에서, “유효량(effective amount)”은 하나 또는 그 이상의 증상 및/또는 임의의 장애 또는 질환의 근본 원인을 치료하는 것이다. 일부 실시형태에서,“유효량”은 제제 단독 또는 피부암의 진전을 방지, 진행을 지연, 또는 퇴행의 초래와 같은, 원하는 반응을 유도하는, 추가 치료제와 함께 치료학적으로 유효한 양이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "미리 형성된(pre-formed)"은 사용 이전에 구조 또는 요소가 만들어지고, 구성되고, 및/또는 특정한 모양 또는 형태로 형성되는 것을 의미한다. 따라서, 미리 형성된 미세바늘 어레이의 모양 또는 형태는 환자에게 하나 또는 그 이상의 미세바늘 어레이의 미세바늘을 삽입하기 전의 미세바늘 어레이의 모양 또는 형태이다.
비록 개시된 방법의 전형적 실시형태의 작동이, 특히 편리한 프리젠테이션을 위해 순차적인 순서로 기술될 수 있지만, 개시된 실시형태는 순차적 순서 이외의 다른 작동 순서를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, 순차적으로 기술된 작동은 경우에 따라 재배치되거나 동시에 수행될 수 있다. 또한, 하나의 특정 실시 예와 관련하여 제공되는 설명 및 개시는 그 실시형태에 한정되지 않으며 개시된 임의의 실시형태에 적용될 수 있다.
더욱이, 간략화를 위해, 첨부된 도면은 개시된 시스템, 방법, 및 장치가 다른 시스템, 방법, 및 장치와 혼합하여 사용될 수 있는 다양한 방법(기술 분야의 당업자에 의해, 본 개시 내용에 기반하여, 쉽게 식별 가능)을 나타내지 않을 수도 있다. 추가적으로, 본 설명은 개시된 방법을 설명하기 위해 “생성(produce)” 및 “제공(provide)”와 같은 용어를 때때로 사용한다. 상기 용어는 수행될 수 있는 실제 작동의 상위 수준의 추상적 개념이다. 상기 용어에 해당하는 실제 작동은, 상기 개시에 기반하여, 특정한 실행에 의존하여 다양할 수 있고, 당업자에 의해 쉽게 인식될 수 있다.
팁-
부하된
(tip-loaded) 미세바늘 어레이
용해 가능한 미세바늘 어레이는 피부 및 점막 표면에 효율적이고 안전한 약물 및 백신 전달을 가능하게 한다. 그러나, 비효율적인 약물전달은 종래의 미세바늘 어레이 제조의 균질한 성질이 원인일 수 있다. 비록 환자에게 전달되어야 하는 약물 또는 다른 카고(cargo)는 일반적으로 전체 미세바늘 어레이 매트릭스에 통합되지만, 실제로는 단지 미세바늘만이 피부로 들어가므로, 각각의 바늘의 부피에 포함된 단독 카고(cargo)만이 전달 가능하다. 따라서, 비-바늘(non-needle) 성분(예를 들어, 어레이의 지지 구조)에 국한되어 있는 대부분의 약물 또는 카고는 일반적으로 폐기물(waste)로 폐기된다.
도 1 및 도 2는 미세바늘 및 미세바늘 어레이의 전형적 규모를 나타낸다. 도 1 및 도 2에 나타낸 예시적인 크기에 기반하여, 어레이 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 유효 성분을 포함하는 미세바늘 어레이는 40% 이상의 유효 성분의 폐기물(waste)을 나타낸다. 예를 들면, 어레이의 전체 면적이 61 mm2이고 미세바늘 어레이 면적이 36 mm2이면, 유효 성분의 사용률(percent utilization)은 60 퍼센트 미만이다. 비록 도 1 및 도 2에 반영된 규모가 특정한 크기 어레이 및 미세바늘의 모양을 나타내지만, 유사한 폐기물은, 어레이의 크기 또는 관여된 미세바늘의 모양에 상관없이, 유효 성분이 어레이 전체에 걸쳐 균질하게 분포되어 있는 다른 크기의 미세바늘 어레이에 존재한다는 것을 이해하여야만 한다.
본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법은 광범위한 단백질 및/또는 작은분자 의학 및 백신을 포함하는, 광범위한 유효 성분의 효과적인 전달을 가능하게 하는 완전히-용해가능한(dissolvable) 미세바늘 어레이 구조 및 고유한 미세바늘 기하학을 활용하는 신규한 미세바늘 어레이 제조기술을 제공한다.
본 명세서에서 상세하게 기술된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 또한 상기 기술은 다기능 약물 전달을 위한 다수의 화학적으로 구별되는 제제의 동시에 공동-전달을 유일하게 가능하게 할 수있다. 상기 장치의 활용성의 예는, 예를 들면, 감염 질환 방지 및 암 치료에 관련한 다기능 면역 반응을 생성하기 위하여 다수 항원 및 보조제를 동시에 전달, (2) 화학요법제의 공동-전달, 면역 자극제, 보조제, 및 동시 종양 치료법을 가능하게하는 항원, 및 (3) 다양한 피부 질환의 치료를 위한 시스템 노출이 없는 다수의 치료제의 국소화된 피부 전달을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 다양한 유효 성분이 바늘 팁으로 통합되는 것을 가능하게 하는 신규한 제조 기술에 관한 것이다. 따라서, 상기 방식으로 유효 성분을 국소화하여, 미세바늘 부피의 잔여 부분은 비활성적이고 일반적으로 안전하다고 간주되는 저렴한 매트릭스 물질을 사용하여 준비될 수 있다. 최종 결과는 (1) 미세바늘 어레이의 비-바늘(non-needle) 부분으로 비-전달가능한 유효 성분의 폐기물의 감소, 및 (2) 바늘 팁(needle tips)이 ?뎔? 들어가는 피부에서 높은 약물 농도에 기반하여 약물 전달의 효율성이 크게 향상된다. 상기 기술적 진보는 약물 카고의 비용에 비하여 경제적 실현 가능성을 획기적으로 향상시키고, 이러한 신규한 미세바늘 어레이의 바늘 당 효과적인 카고 전달 용량을 향상시키는 결과를 가진다.
도 3A, 3B, 4A, 및 4B는 유효 성분이 각각의 어레이의 미세바늘 팁에 농축된 미세바늘 어레이의 다양한 실시형태를 나타낸다. 따라서, 종래의 미세바늘 어레이와 반대로, 유효 성분이 지지 기반 구조에 거의 없거나 존재하지 않기 때문에 미세바늘 어레이 전체에 결쳐 유효 성분은 미세바늘 어레이 전체에 고르게 농축되어 존재하지 않는다. 추가적으로, 일부 실시형태에서(예를 들면, 도 3A, 3B, 4A, 및 4B에 나타낸 바와 같이), 지지 구조에 거의 또는 전혀 유효 성분이 없을 뿐만 아니라, 유효 성분의 위치가 어레이의 각각의 미세바늘의 상반부(upper half) 절반에 집중된다.
도 5A 및 5B는 각각의 미세바늘의 상반부에 농축된 유효 성분을 포함하는 미세바늘 어레이의 미세바늘의 전형적 이미지를 나타낸다. 유효 성분은 협착 및/또는 점점 가늘어지는 방식의 기저부로부터 뻗는 미세바늘의 면적에 의해 정의되는 팁을 가진, 미세바늘의 팁에서 농축된 형광 입자로서 나타낸다. 차례로, 기저부는 어레이의 지지구조로부터 확장된다.
도 6A 및 6B는 각각의 미세바늘의 상반부(upper half)에 농축된 유효 성분을 포함하는 미세바늘 어레이의 추가 전형적 이미지를 나타낸다. 도 6A에서, 미세바늘의 팁에 농축된, 유효 성분은 BSA-FITC이다. 도 6B에서, 미세바늘의 팁에 농축된, OVA-FITC이다.
상기에서 언급한 바와 같이, 일부 실시형태에서, 각각의 미세바늘은 미세바늘의 상반부에 단지 유효 성분을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 각각의 미세바늘은 미세바늘의 팁 근처의 팁에서 또는 좁아진 부분에서 단지 유효 성분을 포함할 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, 각각의 바늘은 지지 구조로부터 확장하는 전체 미세바늘 부분에 걸쳐 유효 성분을 포함할 수 있다.
하기의 실시형태는 각각의 미세바늘 어레이에서 미세바늘의 상부 절반 및/또는 팁에 농축된 하나 또는 그 이상의 유효 성분을 가진 미세바늘 어레이 제조를 위한 다양한 전형적 방법을 설명한다.
연속 미세가공(Sequential Micro-Molding) 및 스핀-건조 방법에 의해 제조된 미세바늘 어레이
하기의 단계는 연속 미세가공(Sequential Micro-Molding) 및 스핀-건조 를 사용하여 미세바늘 어레이를 제조(fabricating)의 전형적 방법을 설명한다. 유효 성분/카고(cargo)는 호환 가능한(compatible) 용매에서 원하는 유용한 농도로 제조될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 유효 성분의 용매는 예를 들면, 물, 유기 극성(organic polar), 및/또는 무극성(apolar) 액체를 포함하는, 광범위한 액체를 포함할 수 있고, 특이적 카고일 수 있다. 유효 성분의 예는 아래에 자세히 설명되어 있으며, 테스트된 최대 부하량(loading capacity) 의 미세바늘 어레이에 대해서도 아래에서 자세히 설명한 것을 포함하는 유효 성분에 대한 다양한 정보를 하기에서 더 상세히 논의된다.
원한다면, 다수 부하 사이클은 특이적 응용에 필요한 만큼 더 높은 활성 카고의 부하를 달성하기 위해 다수의 부하 사이클(loading cycles)이 수행될 수 있다. 추가적으로, 다수의 활성 카고(active cargos)는 각각의 카고의 특이적 카고-호환성 요구 당 다수 사이클(예를 들면, 하기에 설명된 바와 같이 부하 사이클을 재반복)에서 복합 용액, 또는 단일 용액으로서 단일 부하 사이클로서 부하(loading)될 수 있다. 또한, 미립자로 담겨진 카고(나노 크기 및 미세 크기의 기하학적인 것을 포함하는)는 원하는 입자 수/부피 밀도에서 현탁액으로서 제조 될 수 있다.
실시예
1
a) 하기의 초정밀 가공 (micromilling) 실시형태에서 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 활성 카고(active cargo)의 작업 저장 용액/현탁액은, 예를 들면, cm2 표면적 당 약 40 ㎕에서 미세바늘 어레이 생산 주형(production molds)의 표면에 적용될 수 있다.
b) 활성 카고를 가진 미세바늘 어레이 생산 주형(production molds)은 작업 카고(working cargo) 저장을 가진 미세바늘 어레이 생산 주형 바늘을 채우기 위해 10분 동안 4500 rpm에서 원심 분리될 수 있다.
c) 과량의 카고(cargo) 용액/현탁액은 제거되고 미세바늘 어레이 생산 주형의 표면은 cm2 주형-표면적 당 100 ㎕ 인산염완충식염수(PBS), 또는 활성 카고의 작업 재고(active cargo’s working stock)의 제조에 사용된 용매로 세척될 수 있다.
d) 바늘의 용량에서 활성 카고의 작업 재고(active cargo’s working stock)을 포함하는 미세바늘 어레이 생산 주형(production mold)은 바늘 팁에서 활성 카고를 건조하는 농도를 용이하게 하기 위해서 0-50 ℓ/분에서 원심 분리를 통하여 가스 흐름을 계속해서 정화하면서 요구되는 온도에서 30 분 동안 3500 rpm에서 스핀-건조할 수 있다. 정화 가스(purging gas)는 튜브형 입구를 통해 원심 분리기 챔버(centrifuge chamber)로 도입될 수 있다. 습기 함유량은 제습기를 사용하여 원심 분리기 챔버로 재순환시켜 원하는 온도로 조절하여 줄일 수 있다. 정화 가스는 특이적 카고에 요구되는 공기, 질소, 이산화탄소 또는 다른 불활성 가스 또는 활성 가스 일 수 있다. 유동률(flow rate)은 유량계에 의해 측정되고 순환 펌프 장치에 의해 조절된다.
e) H2O에 있는 100 ㎕ 20% CMC90 하이드로겔은 미세바늘 어레이 장치의 구조적 요소를 로드하기 위해 cm2 미세바늘 어레이 생산 주형-면적 당 표면 미세바늘 어레이 생산 주형으로 첨가될 수 있다.
f) 미세바늘 어레이 생산 주형은 미세바늘 어레이 생산 주형 바늘 공간을 CMC90 하이드로겔로 채우기 위해 원심 분리기 챔버에서 정화 가스 교환 없이 요구되는 온도에서 10 분 동안 4500 rpm에서 원심분리될 수 있다. 이어서 30 분 배양 기간을 가졌고 이것은 미세바늘 어레이 팁에 이전에 증착된 활성 카고의 재수화(rehydration)를 가능하게 한다.
g) 5% 습기 함량보다 적게 MNA 장치를 스핀-건조하기 위하여 미세바늘 어레이 생산 주형은 원심 분리기 챔버를 통해 0-50 ℓ/분 상수 정화 가수 유동률로 요구되는 온도에서 3 시간 이상 3500 rpm에서 원심분리될 수 있다.
h) 그런 다음 건조된 미세바늘 어레이 장치는 원하는 조건하에 저장하기 위해 미세바늘 어레이 생산 주형으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, CMC90가 기반된 장치는 약 50 ℃ 내지 -86 ℃ 사이에 저장될 수 있다.
미세바늘 어레이를 갖는 제조된 팁-부하된(tip-loaded) 활성 카고의 예는 도 3A-6B에 보여질 수 있다.
초정밀가공된
대표 주형 및 스핀-
주형된
미세바늘 배열
하기의 실시형태에서, 초정밀가공(micromilling) 단계는 다양한 특이성의 미세바늘 어레이를 만들기 위하여 수행될 수 있다. 그러나, 하기의 실시형태는, 이전의 실시예에서 상기 설명된 과정을 포함하여, 초정밀 가공 단계를 포함하지 않는 미세바늘 어레이 제조의 과정에 적용할 수 있는 미세바늘 어레이 제조의 특정 세부 사항을 설명한다는 것을 이해하여야만 한다.
하기의 실시형태에서, 기구 및 방법은 초정밀가공 기술에 의해 형성된 대표 주형을 사용하여 용해가능한(dissolvable) 미세바늘 어레이를 제조하기 위해 설명된다. 예를 들면, 미세바늘 어레이는 생산 주형(production mold) (음성)에서 어레이 (양성)방법으로 대표 주형(양성)에 기반하여 제조될 수 있다. 초정밀가공 기술은 금속, 중합체, 및 세라믹 부분을 포함하는, 가상적 임의의 유형의 물질에서 다양한 미세-규모 기하학을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 다양한 모양 및 형태의 초정밀가공된 대표 주형은 다수의 동일한 여성용 생산 주형을 생산하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 여성용 생산 주형(production molds)은 다양한 미세바늘 어레이를 마이크로캐스트(microcast)에 사용될 수 있다.
도 7은 미세바늘 대표 주형을 제조(fabricating)하는데 사용될 수 있는 정확한-초정밀가공(micromilling) 시스템의 예를 나타낸다. 기계적 초정밀가공은 정확한 컴퓨터 조절된 소형 기계-도구 플랫폼(computer controlled miniature machine-tool platform) 내에 미세-규모(예를 들면, 10 ㎛만큼 작은) 분쇄 도구(milling tools)를 사용한다. 시스템은 미세-공구(micro-tool)에 의해 잘려 지는(cut by) 소재(workpiece) 의 표면을 보기 위한 현미경을 포함한다. 미세-공구는 원하는 모양을 만들기 위하여 소재(workpiece)를 자르기 위해 초고속도 (200,000 rpm)에서 회전될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 초정밀가공 과정은 많은 종류의 물질을 가진 복잡한 기하학적 특징을 만드는데 사용될 수 있다. 다양한 유형의 공구세공(tooling)은, 예를 들면, 카바이드(carbide) 미세-공구를 포함하는, 초정밀가공(micromilling) 과정에서 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 다이아몬드 공구(diamond tools)는 대표 주형(master mold) 상의 미세바늘 어레이를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 다이아몬드 공구세공(tooling)은 카바이드(carbide)와 같은 종래의 물질보다 단단하기 때문에 다른 유형의 공구세공에 바람직할 수 있고, 소재(workpiece)의 표면을 보다 깨끗하게 절단할 수 있다.
대표 주형은 전형적 실시형태에 설명된 대표 주형인, 예를 들면, 시르렉스®(Cirlex®)(DuPont, Kapton® polyimide)을 포함하는, 다양한 물질로부터 미세가공될 수 있다. 대표 주형은 하기의 전형적 실시형태에서 설명된 생산 물질인, SYLGARD® 184 (Dow Corning)와 같은, 적합한 물질로부터 유연한 생산 주형(production molds)을 제조하는데 사용될 수 있다. 바람직하게 대표 주형은 재사용될 수 있는 물질로 형성되므로 단일 대표 주형이 다수의 생산 주형을 제조하는데 반복적으로 사용될 수 있다. 유사하게 각각의 생산 주형은 바람직하게는 다수의 미세바늘 어레이를 제조할 수 있다.
대표 주형은 초정밀 가공 기술을 이용하여 상대적으로 빠르게 만들 수 있다. 예를 들면, 100개의 미세바늘을 가진 10 mm x 10 mm 어레이를 포함하는 대표 주형은 미세가공하는데 몇 시간도 걸리지 않는, 일부 실시형태에서는, 몇 분도 걸리지 않을 수 있다. 따라서, 짧게 늘리는(ramp-up) 시간은 미세바늘 어레이의 신속한 개발을 가능하게 하고, 또한 실험 및 다양한 미세바늘 파라미터의 연구를 용이하게 하는, 상이한 기하학적 구조의 신속한 제조를 가능하게 한다.
대표 주형 물질은 바람직하게는 생산 주형 물질로부터 깨끗하게 분리될 수 있고, 바람직하게는 생산 주형 물질을 경화시키는데 필요할 수 있는 임의의 높은 경화 온도를 견딜 수 있다. 예를 들면, 기술된 실시형태에서, 실리콘-기반으로 하는 화합물 SYLGARD® 184 (Dow Corning)은 생산 주형 물질이고 상기 물질은 약 섭씨 80-90℃의 경화 온도(curing temperature)를 일반적으로 요구한다.
대표 주형은 다양한 크기로 만들어질 수 있다. 예를 들면, 전형적 실시형태에서, 대표주형은 1.8 mm 두께의 시르렉스®(Cirlex®)(DuPont, Kapton® polyimide) 및 5.0 mm 두께의 아크릴 시트(acrylic sheets)에서 만들어진다. 각각의 시트는 초정밀가공 공구로 첫째로 평평하게 할 수 있고, 미세바늘이 만들어지는 위치는 나머지 표면으로부터 들어올릴 수 있다. 미세-공구는 미세바늘 특징 (예를 들면, 대표주형(mastermold)으로 정의된 것처럼)을 만들기 위해 수치로 조절되는 초정밀가공(micromilling) 기계(도 1)와 함께 사용될 수 있다. 이런 방식에서 초정밀가공 과정은 미세바늘의 규모, 날카로움(sharpness) 및 공간 분포의 완전한 조절을 제공할 수 있다.
도 8은 다수의 피라미드 바늘을 가진 미세가공된 대표주형의 구조를 나타내는 주사 전자 현미경(scanning electron microscope(SEM)))으로부터의 이미지이다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, 원형홈(circular groove)은 생산 주형에서 고리(annular)(예를 들어, 원형(circular)) 벽 섹션(wall section)을 생성하기 위하여 대표주형의 미세바늘 어레이 주위에 형성될 수 있다. 생산 주형의 원형 벽 섹션(circular wall section)은 하기에 설명된 스핀캐스팅(spincasting) 과정을 용이하게 할 수 있다. 비록 도 9에 나타낸 벽 섹션 및 도 8에 나타낸 각각의 대표주형의 구조가 원형이지만, 다른 기하학의 벽 섹션 또는 격납(containment) 수단이 제공될 수 있다는 것을 이해해야만 한다. 예를 들어, 미세바늘 어레이 장치에 어떤 모양이 필요한지에 따라, 격납 수단은 예를 들어, 사각형(square), 직사각형(rectangular), 사다리꼴(trapezoidal), 다각형(polygonal) 또는 불규칙 모양을 포함하는 다양한 모양으로 형성될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 생산 주형은 SYLGARD® 184 (Dow Corning)로부터 만들어 질 수 있고, 이것은 10:1 SYLGARD®에서 경화제 비율로 혼합될 수 있는 2 가지 성분의 투명한 경화성 실리콘 엘라스토머(curable silicone elastomer)이다. 혼합물은 약 10분 동안 가스제거될 수 있고 대표주형 위에 붓고 대략 8mm 층을 형성 한 다음, 약 30 분 동안 다시 가스가 제거되고 85℃에서 45분 동안 경화될 수 있다. 실온으로 냉각된 후, 대표주형은 경화된 실리콘으로부터 분리될 수 있고, 실리콘 생산 주형은 어레이를 둘러싼 원형 벽 섹션의 가장자리로 다듬어진다(도 9). 단일 대표주형에서, 시르렉스®(Cirlex®) 또는 아크릴 대표 주형의 명백한 악화가 거의 발생하지 않는다면, 다수의 생산 주형(예를 들어, 100 개 이상)이 생산될 수 있다.
도 9는 상기 설명된 바와 같이 만들어진 피라미드 생산 주형의 SEM 이미지이다. 도 10은 이미지의 중앙에서 피라미드 바늘 주형 웰(molding well)을 가진 생산 주형의 확대된 부분(enlarged segment)을 나타낸다. 주형 웰은 기본 물질 (및 기본 물질에 첨가하는 임의의 성분)을 수용하도록 구성되어 주형 웰에 의해 정의된 외부 모양을 가진 미세바늘을 형성한다.
미세바늘 어레이를 구성하기 위해, 기본 물질은 생체 유효 성분(bioactive components) 및 가지지 않는 부분을 갖는 각각의 미세바늘의 부분을 형성하는데 사용될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 각각의 미세바늘은 단지 미세바늘에서, 또는 일부 실시형태에서, 미세바늘의 단지 상반부(upper half)에서, 또는 다른 실시형태에서, 단지 팁 근처에서 점점 좁아지는 미세바늘의 부분에서 생체 유효 성분을 포함할 수 있다. 생체 유효 성분의 전달을 조절하고 미세바늘 어레이의 비용을 조절하기 위하여, 각각의 미세바늘은 바람직하게 생체 유효 성분이 있는 부분과 생체 유효 성분이 없는 부분을 갖는다. 본 명세서에서 설명된 실시형태에서, 생체 유효 성분이 없는 부분은 미세바늘 어레이의 지지 구조 및, 일부 실시형태에서, 어레이에서 각각의 미세바늘의 기저부(기본 부분) (예를 들면, 하반부(lower half))를 포함한다.
다양한 물질이 미세바늘 어레이에 대하여 기본 물질로서 사용될 수 있다. 대부분의 생체 분해성(biodegradable) 고체 미세바늘의 구조적 기질은 일반적으로 폴리(락틱-코-글리콜 산)(poly(lactic-co-glycolic acid(PLGA)) 또는 카르복시 메틸 셀룰로오스(carboxymethylcellulose(CMC))를 기반으로 하는 제제를 포함한다; 그러나, 다른 염기가 사용될 수 있다.
CMC는 본 명세서에서 설명된 미세바늘 어레이의 기본 물질로서 PLGA가 바람직하다. PLGA를 기반으로 하는 장치는 제조시에 요구되는 상대적으로 높은 온도 (예: 섭씨 135℃ 이상) 및 진공에 기인한 약물 전달 및 백신 적용을 제한할 수 있다. 반대로, CMC-기반으로 하는 매트릭스는 CMC-미세바늘 어레이를 민감한 생물학적 제제, 펩타이드, 단백질, 핵산 및 다른 다양한 생체 유효 성분의 통합에 더욱 바람직하게 만드는 간단한 스핀-캐스팅 및 건조 과정으로 실온에서 형성될 수 있다.
CMC-하이드로겔은 멸균 dH2O에서 유효 성분이 없거나 있는 CMC의 저점도 소듐염(low viscosity sodium salt)(하기에 설명된 바와 같이)으로부터 제조될 수 있다. 전형적 실시형태에서, CMC는 약 25 중량%의 CMC 농도를 달성하기 위해 멸균 증류수(dH2O) 및 유효 성분과 혼합될 수 있다. 생성된 혼합물을 균질하게 교반하고 약 섭씨 4℃에서 24 시간 동안 평형화될 수 있다. 이 기간 동안, CMC 및 다른 성분은 수화(hydrated)될 수 있으며 하이드로겔이 형성될 수 있다. 하이드로겔은 진공에서 약 1시간 동안 가스 제거가 가능하며 약 20,000 g에서 1시간 동안 원심 분리하여 CMC-미세바늘 어레이의 스핀캐스팅(spincasting)/건조 과정을 방해할 수 있는 잔류 미세 기포를 제거한다. 하이드로겔의 건조 물질 함량은 약 72 시간 동안 섭씨 85 ℃에서 이의 분획(10g)을 건조하여 시험될 수 있다. 즉시 사용할 수 있는 CMC-하이드로겔은 사용하기 전에 약 섭씨 4 ℃에서 보관된는 것이 바람직하다.
유효 성분은 스핀-캐스팅 과정 전에 비교적 높은(20-30%) CMC-건조 생물제 중량비에서 CMC의 하이드로겔에 통합될 수 있다. 어레이는 실온에서 스핀-캐스팅 될 수 있어, 이 과정은 생체 유효 성분의 구조적으로 광범위한 기능적 안전성과 호환될 수 있다. 대표(master) 및 생산 주형은 다수의 제조 사이클로 재사용될 수 있기 때문에, 제조 비용을 크게 줄일 수 있다. 얻어진 탈수된 CMC-미세바늘 어레이는 일반적으로 실온 또는 약간 낮은 온도(섭씨 4℃와 같이)에서 안정적이며, 생물학적 제제의 활성을 보존하여 쉽고 저렴한 보관 및 분배를 용이하게 한다.
전형적 실시형태에서, 생산 주형의 표면은 약 50 ㎕(지름 11mm를 가진 주형(molds)에 대해)의 CMC-하이드로겔로 덮일 수 있고 약 5분 동안 2,500 g에서 원심 분리하여 스핀-캐스팅될 수 있다. 초기 CMC-하이드로겔 층 후에, 다른 50 ㎕ CMC-하이드로겔은 주형 위에 층이 될 수 있고 2,500 g에서 약 4시간 동안 원심분리될 수 있다. 건조 과정이 끝난 후에, CMC-미세바늘 어레이는 주형으로부터 분리되고, 가장자리의 과도한 물질이 제거되고, 약 섭씨 4℃에서 수득되고 보관된다. 미세바늘 어레이의 추가 캐스팅을 위해 생산 주형(production molds)을 세척하고 재사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, CMC-고체는 유효 성분을 포함하지 않는 층 및 유효 성분을 포함하는 층으로 형성 될 수 있다. 도 11A 내지 D는 상이한 모양 (도 11A 및 11B)을 가진 CMC-고체 및 초정밀가공 후에, 유효 성분을 가진 미세바늘의 부분이 되는 상층에 활성 카고를 내장되는 것을 나타낸다. 도 11C는 층을 포함하는 비-유효 성분의 표면에 층으로 된 마이크론(micron) 크기의 형광 입자를 나타내고 도 11D는 층을 포함하는 비-유효 성분의 표면에 층으로 된 톨루이딘 블루(toluidine blue) 실시예를 나타낸다.
또한 도 12A 및 12B는, 사각 모양을 나타내는 도 12B 및 직사각형 모양을 나타내는 도 12B으로, 상이한 모양을 가진 CMC-고체를 나타낸다. CMC 고체 모두는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 추가 과정을 위한 규모로 가공될 수 있다. 본 명세서에 나타낸 기하학 및 활성 카고가 전형적 실시형태에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
실시예
2
CMC-고체는 하나 또는 그 이상의 제조된 구조의 층의 정의된 기하학 및 활성 카고 함유량으로 제조될 수 있다. CMC-고체에 통합된 활성 카고의 예는 본 명세서에서 더욱 상세히 설명된다. CMC-고체의 적어도 하나의 층에 포함된 내장된 활성 카고를 가진 CMC-고체의 시공에 따라, CMC-고체는 계획-특이적 규모로 가공될 수 있고 본 명세서에서 설명된 바와 같이 미세바늘 장치를 제조하기 위해 미세-가공될 수 있다.
실시예
3
다른 실시형태에서, 활성 카고의 하나 또는 그 이상의 층은 미세바늘 어레이의 직접적 초정밀가공을 위하여 CMC-고체에 내장될 수 있다. 도 13은 MNA 장치의 직접적 미세가공을 위하여 CMC-고체 상에 활성 카고의 CMC 내장 및 수직 다층된 증착(multi-layered deposition)의 표본을 나타낸다.
일실시예의 방법에서, 미세바늘 어레이는 정의된 기하학을 갖고 본 명세서에 포함된 임의의 활성 카고 없이 MC-고체를 준비하여 제조될 수 있다. 그런 다음, 속이 빈(blank) CMC-고체는 원하는 규모로 가공될 수 있다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 활성 카고는 미세가공된 MNA 장치의 팁에 특이적으로 활성 카고의 포함을 위한 계획적 특이적 기하학적 패턴으로 CMC-고체 상으로 증착될 수 있다.
속이 빈(blank) CMC-고체 상에 활성 카고 증착 방법은 하기를 포함할 수 있다, 예를 들면:
1) 미세-노즐(micro-nozzle)이 보조된 비말 증착(droplet deposition)으로 직접 인쇄.
2) 미리 인쇄된 매트릭스로부터 이동.
3) 컴퓨터로 조절된 로봇 시스템을 이용한 비말 증착.
도 14는 CMC-고체 블록에 내장된 활성 카고의 층 및 공간 분포를 나타낸다. 첫번째 층이 증착된 후에(A) 활성 카고의 후속적 증착을 위한 표면을 제공하는(C) CMC 층으로 덮일 수 있다(B). 이 과정은 원하는 모든 층이 증착되어 미세가공 과정(D-F)에 적합한 고체 SMC-블록에 둘러싸일(encased) 때까지 반복될 수 있다.
도 15는 공간적으로 조절된 방식으로 활성 카고의 증착을 둘러싼 CMC-블록의 단면도(cross-section)를 나타낸다 (A). 방법은 MNA-장치에서 미세가공 후에 유효 성분의 3 차원 조절 및 배치를 허용한다(B). 도 15의 패늘 (B)에서, 활성 카고의 배치는 활성 카고의 줄기(stems)에 나타낸다; 그러나 가공 과정의 주절을 통하여 배치(placement)는 미세바늘의 팁에서부터 기초까지 수직으로 조절될 수 있다. 색깔은 동일한 물질의 유효 성분 또는 상이한 양의 농도를 나타낸다.
따라서, 미세바늘에 활성 카고를 수직으로 침전시키는 방법은 하나 또는 그 이상의 활성 카고를 CMC-고체 표면에 서로 접촉하여 연속적으로 증착하거나 CMC의 층에 의해 분리하여 제공된다. 일부 실시형태에서, 활성 카고의 수평적 패턴 증착은카고의 공간 분리를 초래할 수 있다. 활성 카고 증착의 수직 및 수평 패턴을 결합하여, 정의된 유효 성분의 3 차원 전달 및 분포가 달성될 수 있으며, 추가적으로 미세바늘 어레이의 제조 동안에 유효 성분의 낭비를 감소시킨다.
미세바늘 통합된
아데노벡터
(
adenovectors
)
하기의 실시형태는, 본 명세서에서 설명된 것과 같이, 미세바늘 어레이의 용해가능한(dissolvable) 매트릭스로 감염 바이러스 벡터를 통합하는 용해가능한 미세바늘 어레이에 관한 것이다. 상기 기술을 이용하여, 처음으로, 살아있는 바이러스 벡터는 미세바늘 어레이로 통합될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 개시된 미세바늘 어레이 내의 바이러스 벡터의 통합(incorporation)은 바이러스 벡터를 안정화시켜서 통합 후 및 장기간의 저장 기간 후에도 감염성을 유지한다. 아데노 벡터(adenovectors)가 통합된 미세바늘 어레이의 피부로의 적용은 피부 세포의 형질 감염을 초래한다. 백신 설정 후에, 우리는 HIV 항원을 암호화하는 MIA의 피부 적용이 강력한 HIV 특이적 면역 반응을 일으킨다는 것을 증명했다. 상기 결과는 하기의 실시예에서 상세히 설명된다.
실시예
4
본 명세서에서 설명된 아데노벡터가 통합된 미세바늘은 제조 및 건조보관 동안에 아데노 바이러스 입자의 생존력을 보존한다. 상기 단계는 CMC 미세바늘 어레이의 물리적 및 화학적 특성을 기반하여 특이적으로 디자인되었다. CMC 미세바늘 어레이의 바이러스 생존력은 하기에 의해 성취되었다.
- 2.5% 최종 농도에서 저점도의 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC90) 함유(2 단계) 및
- 시간과 온도가 조절된 미세바늘 어레이 장치의 팁에 있는 아데노 바이러스 입자의 바이러스 입자의 스핀-건조 농도 (6 단계).
- 바이러스 입자가 부하된 바늘-팁의 조절된 부분적 재수화(rehydration)(8 단계).
아데노벡터가 통합된 팁-부하된(tip-loaded)미세바늘(MIAs)의 제조:
1) 트레할로오스-저장 완충액(Trehalose-storage buffer)(5% 트레할로오스 시그마-알드리치 USA, 20mM 트리스 pH7.8, 75mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.025% 트윈 80) 에서 2 × 109 입자/㎖ 밀도의 아데노 바이러스 입자를 재현탁하기
2) 트레할로오스 저장 완충액에서 제조된 동일한 부피의 5% CMC90을 갖는 재현탁된 바이러스 재고을 혼합하여, 1x109 입자/㎖ 밀도의 아데노바이러스 재고을 초래한다.
3) 아데노 바이러스 작동 재고 현탁액을 미세바늘 어레이 생산 주형(본 명세서의 다른 실시형태에서 상세히 설명된 것과 같이)의 표면에 cm2 표면적 당 40 ㎕로 첨가하기.
4) 주형을 22℃에서 10분 동안 4500 rpm으로 원심 분리하여 바늘 팁을 아데노 바이러스 작동 재고으로 채운다.
5) 과도한 바이러스 재고을 제거하고 주형 표면을 cm2 주형-표면적 당 100 ㎕의 인산염완충식염수(PBS) 용액으로 세척한다.
6) 단지 바늘의 공간에 있는 아데노 바이러스 작동 재고을 포함하는 미세바늘 어레이-주형을 22℃에서 10분 동안 3500 rpm으로 부분적으로 스핀-건조한다.
7) 100 ㎕ 20% 구조적, H2O에 있는 CMC90 하이드로겔을 포함하는 비-카고를 cm2 주형-면적 당 미세바늘 어레이-주형의 표면에 첨가하여 MIA 장치의 구조를 형성한다.
8) 20% CMC90으로 바래 공간을 채우기 위해 22℃에서 10분 동안 4500 rpm으로 원심 분리하고 팁에서 건조된 아데노 바이러스 입자의 재수화를 위해 30분 동안 배양한다(상기 3-6 단계).
9) 원심 분리에 의해 MIA 장치를 5% 미만(less than)의 습기 함유량이 되도록 원심 분리기 챔버를 통과하는 10 L/분의 일정한 공기 흐름으로 22℃에서 3시간 동안 3500 rpm에서 스핀-건조한다.
10) 4℃ 또는 -80℃에서 보관하기 위해 건조된 MIA 장치를 탈형(De-mold)한다.
실시예
5
본 발명자들은 MNA가 통합된 재조합 아데노 바이러스 입자의 효능 및 안정성을 평가하였다. Ad5.EGFP를 CMC 하이드로겔 MNA에 통합하여 1010개의 바이러스 입자/MNA를 함유하는 최종 생성물을 제조하였다. 대조군 블랭크 MNA를 바이러스 없이 동일하게 준비하였다. Ad5.EGFP 및 대조군 MNA의 배치(Batches)를 실온, 4℃ 및 -86℃에서 저장하였고 감염 평가에서 바이러스 안정성을 평가하였다. 특이 적으로 MNA가 통합된 Ad5.EGFP 바이러스(MNA incorporated Ad5.EGFP virus)의 형질 전환 활성을 시험 관내에서 293T 세포를 사용하여 평가하였다. 세포를 6 개의 웰 플레이트에 2 x 106/웰로 도말하고 희석된 바이러스 현탁액, 서스펜션+비어있는 MNA (대조군) 또는 지적된 시간 동안 실온, 4℃ 및 -86℃에서 보관된 Ad5.EGFP MNA로 2 회 형질전환시켰다. 음성 대조군으로서 형질전환되지 않은 웰이 포함되었다. 초기 세포 집단은 GFP 발현에 대하여 유동 세포 분석법(flow cytometry)에 의해 24시간 후 분석되었다(대표 히스토그램은 도 35에 나타냄).
도 35에 나타낸 바와 같이, MNAs로 Ad5.EGFP의 통합은 형질전환(transduction) 효능을 감소시키지 않는다. 현탁액 또는 CMC-패취(patches) 대 비형질감염된 대조군 세포에 통합된 동일한 역가의 Ad5.EGFP를 가진 형질전환(transduction) 후 24시간째에 GFP를 발현하는 표적 293T 세포의 세포유동 분석을 관찰하였다. 도 36은 MNA가 내장된 Ad5.EGFP 바이러스(MNA embedded Ad5.EGFP virus)의 안정성을 나타낸다. GFP 유전자 발현은 도 37에서와 같이 유동 세포 분석법으로 평가하였고 -86℃에서 보존된 Ad5.EGFP 현탁액의 감염 효율로 기준화(normalized)하였다.
MNA Ad5.EGFP 바이러스를 이용한 감염 효율은 87.92 ± 4.5%이었고, 이것은 전통적으로 -86℃에 보존된 Ad5.EGFP 현탁액에서 관찰된 것과 유사하며(도 35 및 36), 이는 제조 과정은 Ad-EGFP 바이러스 입자의 형질전환의 효율에 부작용을 미치지 않는다. 시간이 지남에 따른 감염성을 평가하기 위해, 새로 준비된 -86℃에 보존된 Ad5.EGFP 현탁액의 형질감염의 효율을 실온, 4℃ 또는 -86℃에서 MNA가 통합된 Ad5.EGFP의 장기간 보관된 것과 비교하였다. 감염성 (Ad5.EGFP 현탁액 + 빈 CMC- 패치로 기준화됨)은 최대 365일까지 저장 기간으로 보고된다(도 36). 상기 결과는 MNA Ad5.EGFP의 감염성이 4℃ 또는 -86℃에서의 저장에서 현저하게 안정적이며, 실온에서 최대 30일까지 다소 안정하다는 것을 제시한다.
이러한 결과는 미세바늘 어레이가 전달된 Ad 형질전환 유전자(microneedle array delivered Ad transgenes)가 피부에서 발현되고 강력한 세포 면역 반응을 유도함을 나타낸다. 생체 내 유전자 발현을 특이적으로 평가하기 위해, 본 발명자들은 전통적인 피부내 주사(intradermal injection (I.D.) ) 또는 미세바늘 어레이-매개된 피부 내(intracutaneous)에서의 전달 후 피부테서 GFP 발현을 결정하였다. 본 발명자들은 단일 미세바늘 어레이 적용을 경유하여 ID 주입 또는 국소적으로 108 Ad5.GFP 바이러스 입자을 전달하였다(도 37). 피부를 48시간 후에 수득하였고, 동결 절편시키고(cryosectioned), 청색 형광 DAPI를 사용하여 염색된 것(counter-stained)의 수를 세고 세포핵을 확인한 다음, 형광 현미경으로 이미지화하였다. 현저한 세포 내 GFP 발현을 모든 I.D. 및 미세바늘 어레이 전달 후에 관찰하였다. 면역원성 (immunogenicity)을 평가하기 위해, 본 발명자들은 증폭(boosting) 없이 단일 I.D. 또는 미세바늘 어레이 면역화(immunization) 후에 생체 내 항원-특이적 용해성 활성을 평가하였다. 상기 목적을 위하여 본 발명자들은 코돈 최적화 SIVmac239 개그(gag) 전장 또는 SIVmac239 개그 p17 항원 (Ad5.SIV 개그, Ad5.SIV 개그 p17)을 암호화하는 E1/E3-결실된 Ad5-기반된 벡터로 마우스 군을 면역화하였다. 빈 벡터(Empty vector)는 대조군으로서 사용되었다(Ad5). 본 발명자들은 I.D. 또는 Ad5.SIV 개그 또는 Ad5.SIV 개그 p17을 가진 미세바늘 어레이 면역화 후에 우성의 SIVgag p17-유래된 펩타이드 KSLYNTVCV (SIVmac239 개그 76-84)에 대해 특이적인 강력하고 유사한 수준의 생체 내 용해 활성을 관찰하였다(도 37, CTL).
또한, 본 명세서에 개시된 미세바늘 어레이 기술은 임상 유전자 치료를 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, 이것은 적어도 두 가지 주요한 종래의 접근 방식의 제한을 해결한다. 첫째, 장기간 재조합 바이러스 벡터의 안정화 및 보관을 가능하게 한다. 냉동된 액체 제제에 대한 입증된 혈청동량(seroequivalence)와 함께 높은 온도와 낮은 온도에 저항하는 살아있는 바이러스 벡터를 만들게함으로써, 미세바늘 어레이 안정화는 '저온 유통 체계(cold chain)'과 관련된 압박을 완화시킬 것이다. 추가적으로, 미세바늘 어레이의 통합은 종래의 방법으로는 달성할 수 없는 바이러스 벡터의 정확하고 일관성 있고 재생가능한 투여를 가능하게 한다. 최종적으로, 바이러스 벡터는 피부의 표층(superficial layers)에 정확하게 직접적으로 전달할 수 있는 유일한 전달 장치인 생체적합하고 완전히 용해가능한 미세바늘 어레이로 포장된다.
이러한 유전자 전달 플랫폼은 환자 친화적인, 임상 유전자 치료를 제공하는데 유용하다. 상기 미세바늘 어레이는 혈관이나 신경 조직의 깊이까지 침투하지 않도록 조작되었기 때문에, 인간 피부로의 유전자 전달은 고통스럽지 않고(painless) 무혈(bloodless) 할 것이다. 추가적으로, 제조 과정이 유연하고 단순하며 효율적인 대규모 가능성을 지닌 신속한 저비용 생산이 가능하다. 또한, 최종 제품으로서, MIA 장치는 실온에서 안정적이고 운반 및 저장 비용이 저렴하다. 최종적으로, 구조적 및 제조상의 장점은 광범위하고 신속한 임상적 개발을 가능하게 할 수 있어서, 이러한 유전자 전달 기술을 광범위한 인간 질환의 예방 및/또는 치료에 쉽게 적용할 수 있게 한다. 더욱이, 이러한 접근법은 현재 동일한 제한(예를 들면, 백신 바이러스(vaccinia virus), AAV 등)에 의해 제한되는 다른 벡터가 기반된 백신 플랫폼(other vector-based vaccine platforms)으로 확장될 수 있다. 적어도 이러한 이유 때문에, 개시된 미세바늘 어레이 및 이를 사용하는 방법은 동일한 미세 입자를 사용하여 재조합 유전자 치료 분야를 현저하게 진보시킨다.
미세바늘 어레이-유효 성분의 예
다양한 유효 성분을 하기에 설명한다. 편의를 위해, 하기의 예는 6.3 x 6.3 mm인 미세바늘 어레이에 기반한다. 따라서, 크기 및 카고 전달(cargo delivery)은 2-100 배 증가 또는 감소에 의해 다양화될 수 있다.
최대 활성 카고량에 대한 일반적인 고려 사항은, 예를 들면, 어레이에 있는 총 바늘 부피 및 용매에 있는 유효 성분의 용해도를 포함한다(일반적으로 <50%으로 예상됨).
구성성분이 부하된 팁: MNA 장치로 부하된 팁의 양 최대 예상되는 부하량
㎍/장치(다르게 명시되지 않는다면) (loading capacity)
살아있는 바이러스
(1)
Ad5.GFP 5x108 입자/MNA 2-5x109 입자/MNA
(아데노 바이러스 GFP 발현벡터)
Ad-SIV개그 5x108 입자/MNA 2-5x109 입자/MNA
(아데노 바이러스 GFP 발현벡터)
Ad-SIVp17 5x108 입자/MNA 2-5x109 입자/MNA
(아데노 바이러스 개그-p17 발현벡터)
Ψ5 5x108 입자/MNA 2-5x109 입자/MNA
(비재조합 Ad 벡터)
렌티-GFP(2) 5x106 입자/MNA 2-5x107 입자/MNA
(렌티 바이러스 GFP 발현 벡터)
우두 바이러스(Vaccinia virus) (면역화(immunization))
재조합 우두 바이러스 (유전자 치료, 유전적 조작)
계절성 독감 (Seasonal influenza)
MMR (홍역(Measles), 볼거리(Mumps), 풍진(Rubella))
단백질/
펩타이드
BSA (표지된 FITC)
240 400
OVA (표지된 FITC)
100 400
OVA (표지없음) 240 400
독감 (분할 백신(split vaccine)) 0.22 (2-5)
에피토프
펩타이드
(3)
TRP-2
50 200
EphA2 (a) 50 400
EphA2 (b) 50 400
DLK-1
50 200
하나의 MNA에 있는 다수 에피토프 200 400-600
기질-P(NK-1R 리간드) 15
핵산
CpG 1668 120 250
CpG 2006 120 250
Poly(I:C) 250 250
플라스미드 벡터 100 200
(고분자량 DNA)
펩타이드
/핵산
콤보
OVA/CpG 250/120
OVA/CpG/poly(I:C) 250/120/250
에피토프 펩타이드/폴리(I:C) 200/250
기관(Organics)
독소루비신 100
R848 (TLR7/8 리간드) 6
L733 2
(NK-1 길항제)
DNCB (자극제) 10
미립자
미세입자(1 μ 지름 미세구) 1x106 입자/MNA 2-5x107 입자/MNA
나노 규모 입자
PLG
/
PLA
기반
다른
생물제
종양 용해물/CpG 250/120
종양 용해물/CpG/폴리(I:C) 250/120/250
종양 용해물/폴리(I:C) 200/250
살아있는 아데노 바이러스의 팁-부하(Tip-loading)는 일반적으로 하기의 수정을 포함한다:
a) 팁-부하 하이드로겔 현탁액에서 5% 트레할로오스 및 2.5% CMC90의 존재.
b)과정의 온도는 22℃로 유지된다.
추가적으로, 렌티 바이러스 벡터는 일반적으로 4℃ 진행 및 증기 트랩 기반 습도 조절(vapor trap based humidity controls)을 요구한다. 또한, 짧은 에피토프 펩타이드는 팁-부하 동안에 용매의 증발 시간이 4 시간이고, DMSO에서 가용화된다.
상기 제제의 양은 특정 적용에 따라 다양할 수 있고, 단독으로 또는 제제 또는 물질과 함께, 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 선택된다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 독소루비신 (doxorubicin)의 치료학적으로 유효한 양은 약 25 내지 300 마이크로그램, 약 50 내지 200 마이크로그램, 또는 다른 실시형태에서 약 75 내지 125 마이크로그램일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약(about)"은 양의 ±5%(plus 또는 minus five percent)를 의미한다. 예를 들면, “약 50 내지 200 마이크로그램"은 47.5 내지 210 마이크로그램을 포함한다.
미세바늘 구조 및 모양
하기의 각각의 실시형태에 대해, 유효 성분의 하나 또는 그 이상의 층은 상기 설명된 바와 같이 미세바늘의 어레이의 미세바늘로 제공될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 예를 들면, 일부 실시형태에서, 유효 성분은 도 15에 나타낸 바와 같은, 어레이의 구조적 지지가 아닌 미세바늘의 면적에서만 제공된다. 더욱이, 다른 실시형태에서, 유효 성분은 도 3A-4B에 나타낸 바와 같이 미세바늘의 팁에서와 같은, 미세바늘의 상반부(upper half)에 농축된다.
도 16A 및 16B는 다수의 피라미드 예측 (즉, 미세바늘)으로 형성된 CMC-미세바늘 어레이의 SEM 이미지이다. 도 16a에 나타낸 바와 같은 피라미드 바늘의 평균 팁 지름은 약 5-10㎛이다. 도 16B에서 나타낸 바와 같이, 피라미드 바늘의 측면은 피부에 삽입하는 것을 용이하게 할 수 있는 곡선(curved) 및/또는 아치형면(arcuate faces)으로 형성 될 수 있다.
도 17은 미세바늘 어레이의 단일 바늘의 다른 SEM 이미지이다. 도 17에 나타낸 미세바늘은 베이스-연장(base-extended) 기둥 유형 주형된 CMC-미세바늘이다. 베이스-연장 기둥 유형 미세바늘은 일반적으로 횡단면에서 다각형(예를 들면, 직사각형)이고, 기저부 (base portion)로부터 뻗어나온 돌출(projecting) 부분인, 기저부를 포함한다. 돌출 부분은 실질적으로 직사각형인 하단 부분 및 일반적으로 팁 부분으로 점차 좁아지는 팁 부분을 가진다. 팁 부분은 피라미드 모양이고, 피라미드의 노출된 면은 평평하거나 아치형 일 수 있다. 돌출 부분은 바늘의 전체 길이의 절반 이상이 될 수 있다.
도 18 및 19는 피라미드 (도 18) 및 기둥 유형 (도 19) 주형된 CMC-미세바늘의 현미경 사진을 나타낸다. 피라미드 바늘은 바늘 점에서 바늘 기저부까지 연속적으로 증가하는 횡단면 프로파일(치수)을 가지기 때문에, 바늘이 피부에 들어가기 때문에, 피라미드 바늘을 계속 피부에 밀어 넣는 데 필요한 힘이 증가한다. 반대로, 기둥 유형 바늘은 일반적으로 돌출부분의 직사각형 부분에 도달하면 연속적인 단면 프로파일(치수)을 가진다. 따라서, 기둥 유형 바늘은 더 적은 힘으로 피부로 바늘을 도입할 수 있도록 허용하기 때문에 피라미드 유형 바늘에 바람직할 수 있다.
도 20은 초정밀가공에 의해 형성된 대표주형으로 스핀-캐스팅 물질에 의해 제조에 일반적으로 적합한 미세바늘 모양 및 구조의 개략도를 나타낸다. 도 20에 나타낸 모양 및 구조는 임의의 언더컷(undercuts)도 포함하지 않기 때문에, 이들은 일반적으로 주형/탈형(molding/de-molding) 과정을 방해하지 않을 것이다. 도 20의 구조는 (a) 일반적으로 피라미드 미세바늘, (b) "날카로운(sharp)” 기둥 유형 미세바늘(도 8의 기본 수와 관계없이), (c)“넓은(wide)” 기둥 유형 미세바늘, (d) “짧은(short)” 기둥 유형 미세바늘 (짧은 기둥 섹션 및 길게 지적된 섹션을 가지는), 및 (e)“필렛(filleted)” 기둥 유형 미세바늘을 포함한다.
피라미드 바늘의 부피는 기둥 유형 미세바늘의 부피보다 커질 수 있지만, 증가하는 단면 프로파일(cross-sectional profile)(치수)은 증가하는 삽입의 힘을 요구한다. 따라서, 피라미드 미세바늘의 기하학적 구조는 감소된 삽입 깊이 및 감소된 효과적인 전달 부피를 초래할 수 있다. 다른 한편, 기둥 미세바늘의 더 작은 단면적(cross-sectional area) 및 더 큰 종횡비는 고장력 한계를 낮출 수 있다. 꼭지각(apex angle) α가 작을수록, 미세바늘의 팁은 점점 더 "날카로와 진다". 그러나 꼭지각 각도를 너무 작게(예를 들면, 약 30도 이하)하면, 결과적인 미세 혈관 용적 및 기계 강도가 바람직하지 않은 수준으로 감소될 수 있다.
미세바늘의 침투력(penetration force)은 미세바늘 날카로움에 반비례하며, 이것은 미세바늘의 포함된 (꼭지점) 각도뿐만 아니라, 미세바늘의 팁의 반지름에 의해서도 특징된다. 꼭지각은 대표주형의 기하학적 구조에 의해 미리 정해지지만, 팁의 날카로움은 주형의 신뢰성에 의존된다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이 대표 주형의 초정밀가공은 주형의 기하학적 구조의 정확도를 높여, 결과적으로, 얻어진 생산 주형 및 생산 주형에 의해 형성된 미세바늘 어레이에서 증가된 정확도 및 신뢰성을 가지게 한다.
초정밀 가공의 증가된 정확도는 주형 디자인에 포함되는 더 정확하고 상세한 요소를 허용한다. 예를 들면, 하기의 다음 섹션에 논의된 바와 같이, 기둥 유형의 미세바늘의 기본에서 필렛(fillet)의 형성은 미세바늘의 구조적 완전성을 현저하게 증가시킬 수 있고, 이것은 미세바늘이 피부에 충격을 주었을 때 파손 또는 깨질 가능성을 감소시킨다. 상기 필렛은 미세바늘의 강도를 현저하게 증가시킬 수 있지만, 이것은 미세바늘의 기능적 필요(requirements)를 방해하지 않는다(예를 들면, 침투 깊이 및 생물학적 부피). 상기 필렛은 종래 기술로 형성된 대표 주형에서 만들기 어려울 수 있는 매우 작은 특징이다. 그러나, 상기 기술된 초정밀가공(micromilling) 기술은 어려움이 거의 없거나 전혀 없는 상기 작은 특징을 포함하는 것을 허용한다.
기계적 완전성 및 침투 능력
미세바늘 어레이는 바람직하게는 표피 및/또는 진피(dermis)에 이들의 카고(예를 들어, 생물학적 또는 생체 유효 성분)을 전달하기 위해 각질층(stratum corneum)을 침투하는 것으로 구성되고, 신경 종말(nerve endings) 및 혈관(vessels)을 포함할 수 있는 더 깊은 층으로의 침투를 방지함으로써 통증 및 출혈을 최소화한다. 제작된 미세바늘 어레이의 기계적 생존력을 평가하기 위해, 어레이 기하학적 구조의 대표 변이체로서 피라미드 및 기둥 유형 미세바늘 어레이에서 시험을 수행하였다(예를 들면, 도 7B 및 8에서 나타냄). 시험의 첫번째 세트는 파손이 발생할 때까지 힘과 변위(displacement)를 동시에 측정하면서, 미세바늘의 파손의 한계를 나타내고, 일정한 접근 속도로 미세바늘 어레이를 고체 아크릴 표면에 가압하는 것을 포함한다. 시험의 두번째 세트는 인간 피부 체외배양조직에서 미세바늘의 관통 능력을 나타낸다.
도 21은 기능 테스트를 위해 디자인된 시험 장치를 나타낸다. 시료 (즉, 미세바늘 어레이)는 컴퓨터-조절된 움직임 단계(computer-controlled motion stage)(ES14283-52 Aerotech, Inc.)를 이용하여 약 10 mm/s의 속도로 정지된 아크릴 인공물(PMMA 표면)을 향하여 전진하는, 고정장치(fixture)에 부착되었다. 아크릴 인공물을 주재하는(hosted) 3개-축 동력계(tri-axial dynamometer)(9256C1, Kistler, Inc.)는 힘의 고감도 측정을 가능하게 한다.
도 22는 파괴 시험 동안 측정된 데이터의 힘-변위(force-displacement) 곡선을 나타낸다. 왼쪽의 곡선은 기둥 미세바늘 시료 시험으로부터 얻은 대표 데이터이고 오른쪽의 곡선은 피라미드 미세바늘 시험한 것으로부터 얻은 대표 데이터이다. 도 22에 보여진 바와 같이, 상기 2개 종류의 미세바늘의 파손은 현저하게 상이하다; 피라미드 어레이가 플라시틱적으로 변형(구부림)하는 동안, 기둥 유형 어레이는 기본에서 기둥의 파손(breakage)을 나타낸다. 이러한 상이한 파손은 상당히 상이한 변위-힘 데이타에 도움이 된다. 상기 파손 사건은 도에 지적된 바와 같이 변위-힘 데이타로부터 쉽게 확인될 수 있다. 얻어진 자료를 기반으로, 기둥 유형 미세바늘 파손점은 평균 100mN인 것으로 보였다. 단지 40mN의 힘이 각질층(stratum corneum)을 통하여 침투에 필요하기 때문에, 미세바늘은 실패 없이 인간 피부에 침투하기에 충분히 강하다. 추가적으로, 미세바늘 팁과 아크릴 인공물 사이의 평행도(parallelism)가 완벽하게 확립될 수 없기 때문에, 실제 파손 한계는 100 mN보다 현저히 높을 것이다(즉, 미세바늘은 대부분의/모든 미세바늘의 동시 파손이 아닌 연속 방식으로 깨짐).
피라미드 미세바늘은 결손 지점을 명확하게 나타내지 않으면서 지속적으로 증가하는 힘의 신호를 나타냈다. 피라미드 미세바늘에 대한 파손 한계를 확인하기 위해, 미세바늘을 특정량으로 인공물로 전진시키고, 후퇴시키고 광학 현미경 이미지를 통해 검사하는 방해된 시험을 수행하였다. 상기 과정은 파손이 관찰될 때까지 계속되었다. 이 목적을 위해, 파손은 15도 이상(beyond 15 degrees)으로 피라미드 미세바늘을 구부리는 것으로 정의되었다.
미세바늘의 파손을 추가적으로 분석하기 위하여, 도 23에 나타낸 미세바늘 어레이의 한정-요소 모델(inite-elements model(FEM))이 개발되었다. CMC 물질의 기계적 성질(탄성 계수 및 강도 한계)을 얻기 위해, 일련의 나노압입(nanoindentation) 시험(히시트론 나노압입(Hysitron nanoindentor)을 사용하여)가 수행되었다. CMC 물질(제조한대로)의 평균 탄성률(elastic modulus) 및 항복 강도(yield strength)는 각각 10.8 GPa 및 173 MPa였다. 이는 제조된 CMC 물질이 PMMA (탄성률: 3.1 GPa, 항복 강도: 103 MPa) 및 폴리카보네이트(polycarbonate) (탄성률: 2.2 GPa, 항복 강도: 75 MPa)보다 더 높은 탄성률 및 항복 강도를 갖는 것을 나타내고, 이는 다른 중합체에 비해 CMC 물질의 강도와 강성이 우수함을 나타낸다.
상기 데이터를 사용하여, 일련의 FEM 시뮬레이션이 수행되었다. 600 ㎛ 높이, 30도 꼭지각의 각도, 및 20 ㎛ 필렛 반지름을 가진 피라미드 및 날카로운 기둥(폭 = 134 ㎛)의 파손 한계는 비대칭 부하(asymmetric loading) (5도 부하 오류방향)에 대해 400 mN (피라미드) 및 290 mN (날카로운 기둥)인 FEM 모델로부터 예측되었다. 최소 꿰뚫는 힘의 필요가 약 40mN임을 고려하면, 피라미드 및 날카로운 기둥 미세바늘은 각각 약 10 및 7.25의 안전 인자를 가진다.
필렛 반지름이 40㎛로 두배가 되면, 기둥에 대한 파손 부하는, 350mN으로 증가되고, 필렛 반지름이 5㎛로 감소하면, 파손 부하는 실험적으로 결정된 파손 부하에 가까운, 60mN으로 감소된다. 기둥의 높이와 폭은 파손 부하에 현저한 영향을 미쳤다. 예를 들면, 100㎛ 폭 기둥의 경우, 높이를 500㎛에서 1000㎛로의 증가는 파손 부하를 230mN에서 150mN으로 감소시켰다. 750μm 높이 기둥의 경우, 폭이 75㎛로 줄어들 때, 파손 부하는 87mN 인 것으로 나타났다.
침투력(penetration capability)을 평가하기 위해, 피라미드 및 날카로운 기둥 형 미세바늘 어레이는 물 기반된 모델의 신축성 기질 및 전체 두께의 인간 피부에 관통(piercing) 검사했다. 도 24는 모델 탄성체에 노출 4분 후에 피라미드 (패널 A, C, E) 및 기둥 유형 미세바늘 어레이(B, D, F)의 입체 현미경 사진을 나타낸다. 특히, 톨루엔 블루 트레이서(toluene blue tracer) 염료는 피라미드 또는 기둥 유형 미세바늘 어레이의 적용 후에 모델 신축성 기질(패늘 C 및 D) 또는 새롭게 절단된 전체 두께 인간 피부 체외배양조직 (패늘 E 및 F)에 넣어졌다.
약 10%의 CMC 및 약 10%의 돼지 젤라틴으로 구성된 신축성 기질은 약 24 시간 이상 동안 섭씨 4℃에서 겔화되었다. 탄성체(elastics)의 표면은 약 100 ㎛ 두께의 파라필름(parafilm)으로 덮여있어 물 기반의 탄성체를 가진 바늘 팁과 패치 물질의 즉각적인 접촉을 방지한다. 입체 현미경 이미징을 가능하게 하기 위해, 트립판 블루 트레이서 염료(Sigma Chem., cat # T6146)를 0.1 % 농도의 CMC 하이드로겔에 통합시켰다. 패취(patches)를 용수철-부하된 도포기(spring-loaded applicator)를 사용하여 적용하였고 약 4 분 노출 후 분석하였다. 표적 기질에서 염료의 물리적 관점에 기반하여, 2개의 상이한 기하학적 구조의 미세바늘의 용해성이 현저하게 상이하였다.
모델 신축성 기질에 적용된 날카로운-기둥 바늘은 피라미드 디자인에 대하여 관찰된 것보다 젤 매트릭스로 실질적으로 더 많은 트레이서 염료를 배출했다(도 24, C 대 D). 날카로운 기둥 바늘의 분해가 피라미드 바늘의 분해보다 더 진전된 것처럼, 회수된 패취의 이미지는 상기 현상과 일치했다(도 24, A 대 B). 상기 분석을 더욱 임상적으로 관련된 모델로 추론하기 위해, 피라미드 및 기둥 유형 미세바늘 어레이는 용수철 부하 도포기로부터 같은 힘을 사용하여 신선하게 절단된 전체 두께의 피부 체외 배양 조직에 적용되었다. 탄력있는 모델로부터의 결과와 일치하여, 피라미드 마이크로 바늘 어레이는 날카로운 기둥의 미세바늘 어레이보다 눈에 띄게 적게 트레이서 염료를 증착되었다(도 24, E 대 F).
침투를 추가로 평가하고 인간 피부에 대한 전달 효과를 평가하기 위해, CMC- 미세바늘 어레이는 BioMag (Polysciences, Inc., cat # 84100) 비드 또는 형광 미립자로 된 트레이서(Fluoresbrite YG 1μm, Polysciences Inc., cat#. 15702)로 제조되었다. 형광 또는 고체 미립자를 퍼함하는 피라미드 CMC-미세바늘 어레이는 이전에 설명된 바와 같이 살아있는 인간 피부 체외배양조직에 적용된다. 적용 후 5분 후에, 표면 잔기는 제거되고 피부 시료는 동결 절편(cryo-sectioned)한 다음 광학 현미경(도 25A 및 25B) 또는 형광 현미경(도 25C)에 의한 이미징을 위해 톨루엔 블루로 대조염색(counterstained) 되었다.
각각의 바늘 삽입에 해당하는 바이오매그(BioMag) 비드 안쪽 침투의 증착에 의해 입증된 바와 같이, 피라미드 CMC-미세바늘은 살아있는 인간 피부 체외배양조직의 각질층, 표피 및 진피(dermis)에 침투하였다(도 25A 및 25B에 나타낸 대표 섹션). 특히, 정렬된 공간(도 25A, 1-4로 번호 매김된 공간, 톨루엔 블루 대조염색, 10x) 및 바이오매그(BioMag) 입자(갈색) 안쪽 침투의 증착은 분명하였고(도 25B, 40X), 이는 인간 피부의 침투된 미세바늘을 나타낸다. 추가적으로, 세포핵을 확인하기 위하여 DAPI로 염색 및 MHC class II + 항원 제시 세포를 확인하기 위해 항-HLA-DR로 염색된 살아있는 인간 체외배양조직으로부터의 섹션 분석은, class II+ 항원 제시 세포(도 25C, DAPI (푸른색), HLA-DR+ (붉은색) 및 형광 입자 (녹색), 40x)로 공동-국소된(co-localized) 몇 개의 입자를 포함하는, 피상적 표피 및 피부에 증착된 고밀도 형광 미립자를 드러냈다.
상기 결과는 본 명세서에서 설명된 CMC 미세바늘 어레이가 인간 피부에 효과적으로 침투할 수 있고 불용성 미립자를 포함하는, 필수적(cargo)(생체 유효 성분)을 전달할 수 있음을 추가적으로 나타낸다. 이들은 현재 합리적인 백신 디자인의 주요 목표인, 인간 피부에서 항원 제시 세포로 미립자로 된 항원의 효과적인 전달과 일치한다.
생체 내 미세바늘 어레이 전달을 추가적으로 기술하기 위하여, 생체 내 미립자로 된 항원의 피부(cutaneous) 전달은 형광 입자를 포함하는 어레이를 안락사 된 마우스의 귀의 등면(dorsal aspect)으로 유사하게 적용하여 모델링되었다. 5 분 후에, 패취가 제거되었고 마우스는 정상적인 활동을 재개하였다. 3 시간 또는 3 일에, 귀 피부 및 배수 림프절(lymph nodes)을 형광 입자의 존재에 대해 분석하였다. 인간 피부의 관찰과 일치하여, 미립자는 어레이 적용 부위로부터 절제된 피부에서 분명하게 나타났다 (데이터는 표시되지 않음). 추가적으로, 3 일 시간점에서, 실질적으로 많은 수의 입자가 배수 림프절에서 분명하게 나타났다. 도 26A 및 26B는 Class II + 세포와 밀접한 관련이 있는 미립자로 된 클러스터(도 26B, 60x)를 포함하는, 배수 림프절에서 분명하게 나타나는 실질적 수의 입자를 나타내고, 이는 내부화된 미립자를 가진 항원 제시 세포가 있는 림프절의 존재를 제시한다.
미세바늘 어레이를 사용한 카고 전달에서 바늘의 기하학적 구조의 효과를 정량적으로 평가하기 위해, 3H-트레이서가 표지된 CMC-미세바늘 어레이를 제작했다. CMC-하이드로겔은 25 wt% 최종 건조 중량 함유량(5g/95g OVA/CMC) 에서 모델 유효 성분으로서 5% wt 난백알부민(ovalbumin) 및 0.1 중량 % 트립판 블루 및 3H-티미딘 형태의 0.5x106 dpm/mg 건조 중량 3H-트레이서(ICN Inc., cat # 2406005)로 표지된 트레이스(trace)으로 제조하였다. 피라미드 및 날카로운 기둥 바늘 기하학적 구조의 여러개 각각의 패취를 포함하는, 표지된 CMC-하이드로겔-제조의 단일 배취로부터 3H-CMC-바늘 어레이의 4 개의 배치가 제조되었다. 상기 설명된 바와 같이 패취(patches)는 인간 피부 체외배양조직에 적용되었고 노출 30 분후에 제거되었다. 패치-처리된 면적은 표면 찌꺼기(debris)를 제거하기 위해 테이프 스트립(tape-striped)되었고 10 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 절단되었다. 절단된 인간 피부 체외배양조직-디스크(discs)의 3H 함량은 섬광 계수(scintillation counting)에 의해 결정되었다. 3H-CMC-미세바늘 패치-물질의 특이적 활성은 72,372 cpm/mg 건조 중량이 되도록 결정되었고 계산되었다. 상기 특이적 활성은 피부로 전달되고 피부에 남아있는 난백 알부민(ovalbumin)의 양을 간접적으로 결정하는데 사용되었다. 얻어진 데이타는 하기의 표 1에 요약되었다.
패취의 시험된 유형은 패취 미세바늘 어레이로부터 미세바늘 어레이 (평균 표준 편차 24-35%)및 회분식 배치(평균 표준 편차 7-19%)와 일치했다. 두개의 바늘 기하학 구조의 모두에 대한 내부-배치 가변성(intra-batch variability)은 일괄 처리 값(in-batch value)보다 낮았고, 이것은 표적의 삽입 과정 및 특성이 경피 물질 전달 및 유지(retention)에 성공적으로 주요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 패취-물질 유지 데이타는 경피 카고 전달에서 가장 중요한 미세바늘 기하학적 구조를 명확히 나타낸다. 기질-유형 바늘 기하학적 구조는 피라미드 바늘의 것보다 3H 표지된 바늘 물질의 3.89 배 더 큰 증착을 제공했다. 증착된 방사성 물질에 기초하여, 기둥-유형이 약 400 ㎛ 이상 삽입되는 동안 피라미드 바늘이 약 200 ㎛의 깊이로 삽입된 것으로 예상된다.
[표 4.2.5.] 피라미드 및 기둥-유형 바늘에 의한 인간 피부 체외배양조직으로의 3H-표지된 CMC-미세바늘 물질의 운반
바람직하게는, 본 명세서에서 설명된 미세바늘 어레이는 피부 면역화(cutaneous immunization)에 사용될 수 있다. 항원 및 보조제의 효과적인 전달을 위한 전략 개발은 백신 디자인의 주요 목표이고, 피부 수지상 세포를 표적으로 하는 면역화 전략은 전통적인 백신에 비해 장점을 가진다.
암 치료 응용
본 명세서에서 설명된 미세바늘 어레이로 사용된 생체 유효 성분(bioactive components)은 하나 또는 그 이상의 화학요법제(chemotherapeutic agents)를 포함할 수 있다. 피부 종양을 포함하는, 종양에 대한 화학요법제의 효과적이고 특이적인 전달은 현대 종양 치료의 주요한 목표이다. 그러나 화학요법제의 시스템 전달은 다수의 잘-정립된 독성에 의해 제한된다. 피부로부터 유래된 종양 (기저세포(basal cell), 편평 세포(squamous cell), 메르켈 세포(Merkel cell), 및 흑색종과 같은) 및 피부로 전이하는 종양(유방암, 흑색종과 같은)을 포함하는, 피부(cutaneous) 종양의 경우에서, 국소 전달은 효과적일 수 있다. 국소 전달의 현재 방법은 일반적으로 크림의 도포 또는 반복된 국소 주입을 요구한다. 이러한 접근법의 효과는 비-특이적으로 원하지 않는 부작용으로 피부로의 활성제의 제한된 침투에 의해 현재 제한된다.
본 개시의 미세바늘 어레이는 전통적인 국소 화학 접근에 대안적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있다. 본 개시의 미세바늘 어레이는 피부의 외부 층에 침투할 수 있고 진피(dermis) 및 표피에서 살아있는 세포에 대한 활성 생물제를 효과적으로 전달할 수 있다. 화학요법제의 전달은 피부 세포의 세포사멸 및 살상을 초래한다.
추가적으로, 다수의 생물활성제(bioactive agent)는 단일 미세바늘 어레이(patch)에서 전달될 수 있다. 이것은 세포 독성제와 면역 자극제 (보조제)의 동시 전달에 기반하여 면역 화학 요법 접근을 가능하게 한다. 보조제에 의해 만들어진 면역원성 환경에서, 죽어가는 종양 세포로부터의 종양 항원 방출은 치료 부위 및 신체에 걸쳐 종양 세포를 거부할 수 있는 국소 및 시스템 항-종양 면역 반응을 포함하여, 면역 시스템으로 제시될 것이다.
실시예
6
전형적 실시형태에서, 생물학적으로 활성 소분자의 전달이 연구되었다. 특히, CMC 미세바늘 어레이와 같이 피부로 전달된 화학요법제 사이톡산®(Cytoxan®)의 활성이 연구되었다. 사이톡산®(Cytoxan®)의 사용은 피부 악성 종양의 범위의 국소화된 치료에 대해 잠재적인 임상 활용성을 가진 대표적 제제 부류와 함께 생물학적 활성(피부에서 시톡산®로 유도된 세포 사멸)을 직접적으로 측정할 수 있게 한다.
항원에 통합된 CMC 미세바늘 어레이의 면역원성(immunogenicity)을 직접 평가하기 위해, 잘 특성화된 모델인 항원 난백 알부민(ovalbumin)을 사용하였다. 가용성 난백알부민(ovalbumin)(sOVA), 미립자로 된 난백알부민 (pOVA), 또는 cpGs와 함께 pOVA 모두를 포함하는 어레이를 혼합하여 피라미드 어레이가 제조되었다.
CpG의 보조제 효과는 동물 모델에서 잘 특성화되고, 인간에서 이들의 보조제는 현재 임상 시험에서 평가 중이다. 면역화는 상기 설명된 바와 같이, 용수철-부하된 도포기를 사용하여 안락사된 마우스의 귀에 CMC-미세바늘 어레이를 포함하는 항원을 적용하였고 이어서 적용 후 5분에 어레이를 제거하여 성취되었다. 상기 피라미드 바늘 어레이는 CMC에서 대략 5 wt% OVA 및 약 0.075 wt% (20μM)의 CpG를 포함하였다. 양성 대조군으로서, OVA를 암호화하는 플라스미드 DNA를 사용하는 유전자 면역화에 기반된 유전자 총(gene gun)이 사용되었다. 유전자 총 면역화는 마우스 모델에서 CTL 매개된 면역 반응의 유도에 대한 가장 강력하고 재생산가능한 방법 중에 있으며, 이것은 이러한 분석에서 비교에 대한 "최적표준(gold standard)"으로서의 사용을 제시한다.
마우스를 면역화시키고, 1 주일 후 부양(boosted)시킨 다음, 생체 내 OVA-특이적 CTL 활성에 대해 분석하였다. 특히, OVA와 CpG를 소량으로 포함하는 면역화는 높은 수준의 CTL 활성을 유도하였고, 이는 유전자 총 면역화에 의해 관찰된 것과 유사하다(도 27). 현저한 OVA-특이적 CTL 활성은 미립자로 되고 가용성 어레이 전달된 OVA 항원 모두와 함께, 보조제가 없을 때조차도 유도되었다. 유사한 반응은 전통적 바늘 주입에 의해 전달될 때 실질적으로 고용량의 항원을 요구한다는 것이 잘 알려져 있다.
제조된 어레이의 안정성을 평가하기 위해, 어레이의 배치를 제조하고, 저장한 다음 장시간 사용되었다. 도 28에 나타낸 바와 같이, 면역원성의 현저한 악화는 최대 80일까지 지속되는 저장 기간에 걸쳐 관찰되었다 (평가된 가장 긴 시간 점). 따라서, CMC의 미세바늘 어레이 및 상기 전달 기술은 항원 및 보조제의 효과적인 피부 전달을 가능하게 하여 항원 특이적 면역을 유도한다.
생물학적으로 활성 소분자(active small molecule)의 전달을 평가하기 위하여, 피라미드 CMC-미세바늘 어레이는 저분자 화학요법제 시톡산® (cyclophosphamide), 또는 대조군으로서 플루오레스브리트 녹색(FluoresBrite green) 형광 입자로 제조되었다. 시톡산®은 5 mg/g CMC의 농도에서 통합되어 어레이 당 대략 140 ㎍의 전달이 가능하게 되었다. 이것은 이는 표적된 피부 면적에 기반된 치료학적으로 관련된 농도지만, 아직까지는 시스템 독성과 관련된 수준 이하이다. 살아있는 인간 피부 기관 배양은 시톡산®의 세포독성을 평가하는데 사용되었다. 시톡산®은 본 발명자들이 이전에 기술 한 바와 같이 피부 체외배양조직으로 어레이를 적용하여 전달되었다. 어레이 및 잔여 물질은 적용 후 5분 후에 제거되었고, 노출 후 72시간 후에 살아있는 피부 체외배양조직 배양은 냉동 절제(cryo-sectioned)되고 고정되었다. 세포사멸은 녹색 형광 TUNEL 분석법 (In Situ Cell Death Detection Kit, TMR Green, Roche, cat # : 11-684-795-910)을 사용하여 평가되었다. 인간 피부 섹션의 형광 현미경 이미지 분석은 도 29A에 나타낸 바와 같이 시톡산® 처리된 피부에서 표피세포의 광범위한 세포사멸을 나타냈다. 도 29B에 나타낸 바와 같이, 형광 입자 처리된 피부에서는 가시적인 세포 사멸이 관찰되지 않았지만, 관찰된 면적이 미세바늘 어레이에 의해 정확히 표적화되었음을 입증했다.
실시예
7
다른 실시형태에서, MNAs로 통합된 독소루비신(doxorubicin) 및/또는 폴리(I:C)의 국소 치료는 종양 퇴행 및 후속 치명적인 전신성 종양의 도전으로부터 보호할 수 있는 내구성 면역(durable immunity)를 확립되었다.
확립된 피부 종양을 치료하는데 신규한 치료 접근은 MNA 전달된 화학요법제, MNA 전달된 면역자극 요법(immunostimulant therapy), 및/또는 MNAs 전달하는 병용 화학-면역요법(combination chemo-immunotherapy)의 혼합된 효과에 기반하여 제공되었다. B16 흑색종 모델은 이러한 새로운 접근법을 시험하기 위해 모델 종양으로서 사용되었다. B16 흑색종 모델은 매우 잘 연구되었으며, 가장 공격적인 마우스 피부 중의 하나이다. 모든 피부 종양 모델 중에서, 확립된 B16 종양은 치료하기가 가장 어렵다. 추가적으로, B16은 매우 높은 전이 잠재성(metastatic potential)을 가지므로, 전신성 종양 면역의 임상적으로 관련 평가를 가능하게 한다.
B16 피부종양은 정상 마우스에 주입에 의해 확립된다. 가시적으로 확립된 피부(cutaneous) 종양은 독소루비신(doxorubicin) 단독, 폴리(I:C) 단독, 또는 MNA로 통합된 독소루비신 및 폴리(I:C)를 포함하는 MNAs로 3주 동안 매주 1 회 처리되었다. 선택된 독소루비신 투여량은 괴사를 일으킴 없이 인간 피부에서 세포사멸을 유도하는 MNA 투여량에 해당된다. 종양 성장 및 생존은 연구기간 동안 정기적으로 측정되었다. 도 41A 및 41D에서 나타낸 바와 같이, 독소루비신을 단독으로 포함하는 MNAs에 의한 치료는 종양 성장을 늦추었고, 100% 치사율(mortality rate)을 가졌던 비처리된 종양을 가진 동물에서 관찰된 것과 비교하여 생존력(30%)을 개선하였다. 추가적으로, 폴리(I:C)를 단독으로 포함하는 치료는 종양 성장을 늦추었고(41B), 100% 치사율을 가졌던 비처리된 종양을 갖는 동물에서 관찰된 것과 비교하여 생존율 (50%)을 개선하였다(도 41D). 놀랍게도, 독소루비신 + 폴리(I:C) 모두를 포함하는 치료는 모든 동물에서 종양 성장을 실질적으로 늦추었고(도 41C), 10 마리 마우스 중 8마리에서 종양을 완전히 제거하였다. 이것은 70일까지 연장된 80% 장기 생존율에 반영되었다(도 41D).
대조군 및 처리된 동물의 대표 이미지를 도 42 및 43에 나타냈다. 생존하는 동물들은 상기와 같은 종양에 대해 장기간 면역이 발생했는지를 결정하기 위해 평가받았다. 특이적으로, 전신성 면역은 면역 반응의 내구성 및 IV 도전에 생존하는 동물의 생존 능력을 포함하는, 상기 동물에서 평가되었다. 특히, 초기 MNA 치료 후 60일째에, 마우스를 치사량의 B16으로 처리하였다. 14 일 후, 마우스를 희생시키고 폐 전이를 현미경으로 정량화하였다. 처리된 마우스는 비처리 대조군과 비교하여 폐 병변의 급격히 감소된 수를 나타냈다(도 44-46). 종합적으로 말하면, 상기 결과는 확립된 피부 종양의 퇴행을 유도하고, 동시에 후속적 종양으로부터 개체를 보호할 수 있는 내구성 전신성 종양 특이적 면역 반응을 동시에 유도하는 MNA가 화학요법제, 면역자극제, 및 상기 제제의 조합을 전달하는 MNA의 능력을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 폴리-ICLC는 폴리(I:C)에 대해 대체될 수 있고, 예를 들면, MNAs는 적어도 하나의 다른 화학요법제(예를 들면, 독소루비신)와 조합하여, 형성될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 화학요법제는 폴리(I:C) 및 폴리-ICLC와 같은, 종양을 거부하고 파괴하는 면역 시스템을 자극하기 위해 당업자에게 알려진 하나 또는 그 이상의 면역자극제(특이적 및 비-특이적)를 포함할 수 있다. 상기 면역자극제는 독소루비신 같은 세포독성제와 같이, 다른 화학요법제와 함께 MNAs로 통합될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 방식으로 사용될 수 있는 면역자극제는 보조제, 톨-같은 수용체(toll-like receptors(TLRs)), 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides), 이중가닥 RNAs (dsRNA), 및 폴리(I:C)의 유도체를 포함한다.
하나 또는 그 이상의 화학요법제는 다양한 안트라사이클린제(anthracycline agents)를 포함한다. 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이 독소루비신은 MNAs로 통합될 수 있다. 안트라사이클린제의 다른 실시예는, 예를 들면, 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신S(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valrubicin), 및 미토작트론(mitoxantrone)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 안트라사이클린제는 동일한 MNA로 통합될 수 있다. 본 명세서에서 더 상세히 논의된 바와 같이, MNAs는 CMC 또는 다른 적합한 중합체로 형성될 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 안트라사이클린제(예를 들면, 독소루비신) 또는 2개 또는 그 이상의 안트라사이클린제(예를 들면, 독소루비신(doxorubicin) 및 다른 안트라사이클린제(anthracycline agent))는 CMC와 같은, 중합체를 포함하는 MNAs로 통합될 수 있다.
직접적으로 제조된 미세바늘 어레이
상기에서 설명된 대표 주형의 초정밀가공은 다양한 기하하적 구조를 가진 미세바늘 어레이의 생성을 허용한다. 다른 실시형태에서, 시스템 및 방법은 건조된 CMC 시트와 같은, 직접적으로 초정밀가공 다양한 물질에 의해 미세바늘 어레이 제조에 제공된다. 대표 주형의 초정밀가공에 관해 상기 설명된 바와 같은 동일한 일반 공구세공(tooling)은 미세바늘 어레이를 직접적으로 초정밀가공하는데 사용될 수 있다.
미세바늘 어레이의 직접적 초정밀가공은 주형 단계가 필요 없고, 대규모 임상 사용과 호환될 것인, 단순화되고 확장가능(scalable)하며 정확하게 재생할 수 있는 생산 전략(reproducible production strategy)을 가능하게 한다. 더욱이, 초정밀가공을 통한 미세바늘 어레이의 직접적 제조는 미세바늘 기하학적 구조의 조절을 더욱 잘할 수 있다. 예를 들면, 초정밀가공은 주형 과정을 사용하여 성취될 수 없는, 언더컷(undercuts) 및/또는 베벨(bevel)와 같은 특징을 유지하는 미세바늘의 포함을 허용한다.
미세바늘 어레이의 직접적 가공의 재현성은 특히 이점이 있다. 즉, 모든 미세바늘의 직접적 초정밀가공은 가공 제조 과정의 결과와 동일하다. 주형 작동에서, 주형으로부터 이들을 물리적으로 분리하는 과정의 결과로서 일부 바늘이 주어진 패치로부터 없어지거나 파손되는 것은 드문 일이 아니다. 특정 의료 응용 분야에서 사용하기 위해, 패치로부터 패치까지의 바늘의 불규칙성이 전달된 약물/백신의 투여량(dose)의 가변성을 초래할 수 있기 때문에, 어레이 내의 생체 유효 성분의 양의 재현성(reproducibility)은 과정에 대한 적절한 수준의 "품질 관리(quality control)"를 제공하는데 매우 중요하다. 물론, 재현성(reproducibility)은 FDA의 승인을 필요로 하는 모든 응용 프로그램에 대한 중요한 이점이 될 것이다. 스핀캐스트(Spincast)/주형패취(molded patches)는 일치된 약물 전달에 대해 허용 가능한 균일성을 보증하기 위해 특별한 과정이 필요하다. 상기 품질 관리는 상기 배출 시험에 "실패(failing)"하는 패취의 특정 퍼센트를 초래할 가능성이 있고, 생산 과정으로 폐기물을 도입시킬 수 있다. 직접적 초정밀가공은 상기 잠재적 문제들을 제거하거나 또는 적어도 현저하게 감소시킨다.
또한 주형 과정은 웰 또는 공간을 채울 수 있어야 하고 상기 웰 또는 공간으로부터 경화된 주형 부분(cured molded part)을 제거할 수 있는 필요가 있기 때문에 고유한 제한을 가진다. 이는 주형의 기하학적 구조때문에, 언더컷(undercuts)은 부분 또는 주형으로부터 제거될 수 없는 부분을 주형할 때 일반적으로 회피될 수 있어야만 한다. 즉, 주형된 미세바늘 어레이와 같은, 주형된 부분의 기하학적 제한은, 꼭대기에 더 가깝게 위치된 임의의 특징이 기저를 향하여 위치된 임의의 특징보다 더 좁아야 한다.
따라서, 이러한 제한의 관점에서, 도 20은 주형에 의한 제조에 일반적으로 적합한 미세바늘 모양 및 구조의 개략도(schematic representation)을 나타낸다. 즉, 도 20에 나타낸 모양 및 구조는 부분(즉, 미세바늘)이 생산 주형으로부터 제거되는 것을 방지하는 언더컷을 포함하지 않는다. 반대로, 도 30은 본 명세서에서 설명된 방식으로 주형될 수 없는 베벨된(beveled), 언더컷 미세바늘 모양을 나타낸다.
상기 기하학적 구조는 제안된 초정밀 가공 기술을 사용하여 직접 제조를 통해서만 생성될 수 있다. 음각(negative angle) (bevel)은 조직에서 미세바늘 의 유지를 더 용이하게 한다. 추가적으로, 도 30의 미세바늘은 더 낮은 부분(더 작은 횡단면 치수를 갖는) 위에 더 넓은 중간부(더 큰 횡단면 치수를 갖는)을 가지기 때문에, 더 많은 양의 생체 유효 물질이 피부 내에 유지되도록 포함된, 더 넓은 섹션에 생체 유효 물질을 보유 또는 저장하도록 미세바늘을 구성함으로써 전달될 수 있다. 따라서, 중간부의 더 넓은 횡단면 치수는 대량의 생체 유효 성분을 "운반(carry)"할 수 있다. 더 낮은 부분(하부)이 더 좁은 단면 치수로 폭이 점점 더 가늘어지기 때문에, 더 넓은 중간부는 피부층으로 생체 유효 성분의 전달에 좋은 침투성을 얻을 것이다. 중간부 위에 있는 부분은 바람직하게는 바늘의 입구가 피부층으로 들어가는 것을 용이하게 하는 지점으로 좁혀진다(narrows).
주형된 부분의 또 다른 제한은 주형의 매우 작은 섹션을 정확하게 채우기가 어려울 수 있다는 것이다. 미세바늘 어레이에 대한 생산 주형은 많은 매우 작은 단면을 포함하기 때문에, 각각의 웰을 정확하게 채우는 것이 어려울 수 있다. 주형이 생체 유효 성분을 포함하는 물질 및 생체 유효 성분을 포함하지 않는 물질와 같은, 상이한 물질로 채워져야만 하는 경우에 특정하게 문제가 될 수 있다. 따라서, 만약 생산 주형이 층으로 채워진다면, 각각의 미세바늘과 연관된 아주 작은 웰을 정확하게 채우기가 어려울 수 있다. 미세바늘은 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분을 전달하고자 하기 때문에, 상기 재현성은 특히 중요하다. 따라서, 생산 주형을 채우기 위해 사용된 생체 유효 성분의 양의 약간의 변화조차도 매우 바람직하지 않을 수 있다.
또한, 미세가공 될 수 있는 시트 또는 블록을 형성하기 위해 적층 구조(lamination structure)를 사용하여, 다양한 유효 성분이 수직 층에 의해 단일 미세바늘로 통합될 수 있다. 예를 들면, 전형적 실시형태에서, CMC-하이드로겔 및 CMC-sOVA-하이드로겔(80% CMC/ 20 wt% OVA)은 시트 또는 블록 형태로 층을 이룬다. 상기 복합 시트는 본 명세서에서 설명된 직접적 초정밀 가공 기술을 사용하여 미세가공될 수 있다.
도 31은 전체 미세바늘 어레이의 입체-현미경 이미지 분석이다. 미세바늘은 미세바늘의 10 x 10 어레이를 포함한다. 도 32는 도 31의 미세바늘 어레이의 확대된 부분이다. 2개 성분의 층은 도 32에 나타내고, 이것은 팁 부분에서 미세바늘의 더 어두운 영역과 기저부의 미세 영역의 더 밝은 영역을 보여준다. 팁에서 더 어두운 층은 생체 유효 성분을 포함하는 층을 대표하고, 이 경우에는 가용성 난백 알부민이 CMC 층에 포함된다.
비록 유효 물질(예를 들면, 항원) 및 후속 초정밀 가공 층(및 임의의 다른 인접한 층)의 형성은 상대적으로 많은 양의 유효 물질의 사용을 요구할 수 있지만, 상기 물질은 제거(removed)될 수 있고(예 : 칩(chips) 형태로), 회복(recovered)될 수 있으며, 재활용(recycled)될 수 있다.
직접 기계 가공 기술은 주형/탈형(molding/de-molding) 접근으로부터 발생하는 기하학적 제약으로 인해 제한되지 않으므로, 따라서 더욱 혁신적인 바늘 디자인을 창조할 수 있고, 이것은 피부에서 유지된 바늘- 부피 및 바늘 유지 시간을 현저하게 향상시킬 수 있다.
다수의 층에 의해 형성된 시트 또는 블록의 생산은 미세가공 될 수 있고 생체 유효 성분을 갖는 하나 또는 그 이상의 층을 포함할 수 있는 고체 물질을 제공할 수 있다. 예를 들면, 용해가능한 고체 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) 중합체를 기반으로 하는 잘 정의되고 조절되는 규모(dimension)를 가진 시트 또는 블록은 적층 과정(lamination process)에 의해 제조될 수 있다. 얻어진 시트 또는 블록은 플라스틱 또는 금속 시트 또는 블록의 기계 가공과 유사하게, 완전히 기계 가공이 가능할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 상기 제조 과정은 활성 수준을 현저하게 감소시키지 않고 생체 유효 성분을 매트릭스에 혼입(incorporation)시키는데 적합할 수 있다.
하기에 설명된 바와 같이, 물질의 제조된 시트(CMC를 기반으로 하는 물질과 같은)는 피부를 통해 유효 성분을 전달하기에 적합한 하나 또는 그 이상의 미세바늘 어레이를 생산하기 위해 직접적으로 미세-가공/미세가공(micro-machined/micromilled) 할 수 있다. 이러한 용해가능한 생체적합한 CMC 블록-물질은 신체 표면 적용을 위해 시간 방출 방식으로 용해성 또는 불용성 미립자로 된 제제의 전달에 사용될 수 있다. 생체적합한 물질은 스캐폴딩(scaffolding) 물질의 용해가 요구되고 유용할 때 더 깊은 연질 또는 경질 조직의 임플란트에 적합할 수 있다.
하기의 방법은 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)(CMC) 중합체 저점도 하이드로겔을 12.5% 농도로 제조하는데 사용될 수 있다. 12.5 %의 카르복시메틸셀룰로오스 저점도 하이드로겔은 물 또는 PBS 또는 HBS(그러나 이에 제한되지 않음)와 같은, 다른 생체적합한 버퍼에서 제조될 수 있다. 중합체 용액을 제조하는 동안에, 가용성 제제(핵산, 펩타이드, 단백질, 지질 또는 다른 유기성 및 무기성 생물학적으로 유효 성분과 같은) 및 미립자가 첨가될 수 있다(예를 들면 난백알부민(ovalbumin), 가용성 제제). 20 w/w%의 CMC의 유효 성분을 함유한 철(Ferrous) 미립자가 사용될 수 있다.
유효 성분이 없는 1000 g 멸균 12.5% CMC 하이드로겔은 하기와 같이 성취될 수 있다:
1) 125 g CMC를 측정하고, 875 g 물 또는 다른 물을 기반으로 하는 용매를 첨가하시오.
2) 오버헤드 혼합기(overhead mixer)에서 균일하게 저으시오.
3) 균질체(homogenate)를 1시간 동안 섭씨 121℃에서 무균상태로 고압소독하시오(Autoclave)(고압 증기 멸균 단계는 향상된 층에 대한 점도를 감소시킬 수 있다) .
4) 섭씨 22℃로 냉각시키시오.
5) 얻어진 물질을 10 토르(torr) 및 섭씨 22℃에서 1시간 동안 진공 처리하여 갇혀있는 미세 기포를 제거하시오.
6) 생성물을 진공 챔버 원심 분리기에서 1시간 동안 25,000g에서 원심 분리하시오(잔여 미세 거품을 떠다니게 하고 추가 제거하기 위하여)
7) CMC-하이드로겔 생성물을 섭씨 4℃에서 저장하시오.
1000g 멸균 2.5 w/w% 건조 함량의 20/80% 난백알부민(ovalbumin)/CMC 하이드로겔의 제조는 하기와 같이 성취될 수 있다:
1) 100 g의 CMC를 측정하고 650 g 물 또는 다른 물을 기반으로 하는 용매를 첨가하시오.
2) 오버헤드 혼합기(overhead mixer)에서 균일하게 저으시오.
3) 균질체(homogenate)를 1시간 동안 섭씨 121℃에서 무균상태로 고압 소독하시오(Autoclave)(고압 증기 멸균 단계는 향상된 층에 대한 점도를 감소시킬 수 있다) .
4) 섭씨 22℃로 냉각시키시오.
5a) 25 g 난백알부민(ovalbumin)을 225 g 물에 용해시키시오.
5b) 0.22 ㎛ 기공 크기의 필터 상에서 난백알부민을 멸균 필터하시오.
6) 멸균 조건 하에서 균질체, 750g CMC 하이드로겔을 250g 멸균 난백 알부민과 섞으시오.
7) 얻어진 물질을 10 토르(torr) 및 섭씨 22℃에서 1시간 동안 진공 처리하여 갇혀있는 미세 기포를 제거하시오.
8) 생성물을 진공 챔버 원심 분리기에서 1시간 동안 25,000g에서 원심 분리하시오(잔여 미세 거품을 떠다니게 하고 추가 제거하기 위하여)
9) CMC-하이드로겔 생성물을 섭씨 4℃에서 저장하시오.
100 g 멸균 12.5 w/w% 건조 함량 20/80% 미립자로 된-난백알부민(ovalbumin)/CMC 하이드로겔은 하기과 같이 얻을 수 있다 :
1) 100 g의 CMC를 측정하고 87.5 g의 물 또는 다른 물을 기반으로 하는 용매를 첨가하시오.
2) 오버헤드 혼합기(overhead mixer)에서 균일하게 저으시오.
3) 균질체(homogenate)를 1시간 동안 섭씨 121℃에서 무균상태로 고압 소독하시오(Autoclave)(고압 증기 멸균 단계는 향상된 층에 대한 점도를 감소시킬 수 있다) .
4) 섭씨 22℃로 냉각시키시오.
5) 2.5 g 미립자로 된-난백알부민을 7.5 g, 섭씨 22℃ CMC-하이드로겔에 분산시키고 멸균 조건하에서, 균질체로 섞으시오.
6) 얻어진 물질을 10 토르(torr) 및 섭씨 22℃에서 2시간 동안 진공 처리하여 갇혀있는 미세 기포를 제거하시오.
7) 생성물을 진공 챔버 원심 분리기에서 1시간 동안 3,000g에서 원심 분리하시오(잔여 미세 거품을 떠다니게 하고 추가 제거하기 위하여).
8) CMC-하이드로겔 생성물을 섭씨 4℃에서 저장하시오.
상기 실시예에서, 미립자로 된-난백알부민은 난백알부민에 대해 활성화 된 철 비드(iron beads) 반응으로부터 제조되는 것을 주목하시오. 그러나, 상기 설명은 단지 전형적 실시형태 및 다른 화합물이고 유효 성분이 사용될 수 있다는 것을 주목해야 한다.
고체 블록/시트 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) (CMC)는 상기에서 언급된 저점도 CMC-하이드로겔을 사용하여 하기와 같은 방식으로 제조될 수 있다.
제조 과정은 규정된 두께에서 중합체의 적층 확산(laminar spreading) 및 중합체 층의 표면에 멸균 건조된 공기 흐름을 사용하여 약 5% 물 함유량보다 적게(less than) 층으로 된 중합체의 건조를 포함할 수 있다. 상기 2 단계는 원하는 블록 두께가 얻어질 때까지 반복될 수 있다.
캐스팅 주형 조립체(casting-mold assembly) 상에 규정된 두께의 적층 CMC-하이드로겔 층을 수행하는 방법은 도 33을 참조하여 기술된다. 도 33은 하기를 포함하는 캐스팅 주형 조립체(casting-mold assembly)의 횡단면을 나타낸다: (a) 캐스팅 베드(casting bed); (b) 조정가능한 캐스팅 베드 벽(adjustable casting bed wall); (c) 캐스팅-베드 깊이 조절 조립체(casting-bed depth adjustment assembly); 및 (d) 아크릴 스프레더(acrylic spreader). 도 33은 축척(scale)을 그리지 않거나, 또는 그렇지 않으면 요소들을 그들의 적절한 비율로 나타낸 것을 주목해야 한다.
캐스팅 주형 조립체(casting mold assembly)는 아크릴(Plexiglas)로부터 구성될 수 있고 캐스팅 베드 기본 유닛인, 수직으로 조절가능한 소수성 캐스팅-베드 벽(vertically adjustable hydrophobic casting-bed wall), 및 캐스팅-베드 조절 기전(casting-bed adjustment mechanism)을 포함할 수 있다. 캐스팅 베드 기본 유닛 (a1)은 셀룰로오스 층이 부착된 (a3) 이동식/교체형 캐스팅 베드 상부 플레이트(removable/replaceable casting bed top plate) (a2)가 포함될 수 있다. 셀룰로오스 층은 약 0.5 mm 두께일 수 있다. 수직으로 조절가능한 소수성 캐스트 베드 벽(vertically adjustable hydrophobic casting-bed wall)(b)은 납-나사(lead-screw) (c1) 및 레벨 조절 손잡이(level adjustment knob)(c2)로 구성될 수 있는, 캐스팅 베드 깊이 조절 기전을 사용하여 조정될 수 있다. 기술된 실시형태에서, 상기 손잡이(knob)를 1/4 바퀴 돌리면 베드 벽(bed wall)의 0.5mm 올릴 수 있는 결과를 초래할 수 있다.
초기에, 조절가능한 캐스팅 베드 벽은 스프레더가 제 위치에 있을 때 아크릴 스프레더(acrylic spreader)와 베드의 셀룰로오스 층 사이의 거리가 약 1mm 인 높이로 설정될 수 있다. 미리 정의된 부피(예를 들면, 약 0.1 ml/cm2)의 12.5% CMC-하이드로겔은 첨가될 수 있고 층이 될 수 있다. 상기 층은 조절가능한 캐스팅 벽의 상단 표면에 아크릴 스프레더(d)를 밀어서 균등하거나 평평하게 할 수 있으며 이로 인하여 약 1 mm CMC-하이드로겔의 균일한 층을 만든다. 층으로 된 CMC-하이드로겔은 도 34에 나타낸 건조 장치에서 고체 상으로 건조될 수 있고, 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
층을 만드는 단계 및 건조 단계는 원하는 층으로 된 구조가 얻어질 때까지 반복될 수있다. 캐스팅 베드 벽은 각각의 층을 추가하는 동안 적절한 양에 의해 올려질 수 있다. 예를 들면, 각각의 층을 추가한 후, 베드 벽은 약 0.5 mm로 올리거나(raised) 들어 올려(lifted)질 수 있다. 따라서, 상기 설명된 사이클은 약 0.5 mm의 CMC 층을 증착할 수 있다. 상기 과정(예를 들어, 물질의 층만들기, 베드 벽의 올리기, 등)은 원하는 블록 두께가 얻어질 때까지 반복될 수 있다.
층으로 된 CMC-하이드로겔 중합체는 다양한 방식으로 건조될 수 있다. 예를 들면, 도 34는 시트 물질의 다양하게 증착된 층을 건조하는데 사용될 수 있는 건조 장치를 나타낸다. 도 34는 축척(scale)으로 그려지지 않거나, 그렇지 않으면 적절한 비율로 적절한 요소와 함께 나타내고 있음을 주목해야 한다. 선풍기(fan)는 캐스팅 주형 조립체에서 CMC-하이드로겔 층 위에 연속적인 가스 흐름(예를 들면, 공기 또는 질소와 같은, 다른 불활성 가스)을 제공할 수 있다. 가스 흐름은 CMC-하이드로겔 층의 부드럽게 탈수를 초래한다. 건조 속도는 고체 CMC 생성물에서 가스 동봉한 것(gas enclosures)(예를 들면, 공기 거품)을 방지하거나 감소시키도록 조절될 수 있다. 층 위의 습한 공기는 건조제(desiccant) (예를 들어, 공기 건조기 또는 제습기)를 통해 건조되고, 온도가 조절되고, 속도가 조절가능한 선풍기(fan)에 의해 다시 하이드로겔 위로 되돌아갈 수 있다. 건조 과정의 상태를 알려주는 습도계(hygrometer)를 챔버의 습한면에 배치할 수 있다. 습도계에 표시된 대로, 미리 결정된 건조 성취된 후, 건조 과정을 종료할 수 있다.
공기흐름(Airflow)은 건조 속도에 영향을 미치도록 조정될 수 있다. 전형적 실시형태에서, 공기 흐름은 약 0.1-2.0 m/초 사이가 되도록 조절된다; 온도는 상온(ambient)과 섭씨 50℃ 사이이다. 이러한 형태를 사용하면, 단일 층 CMC-하이드로겔의 건조 시간은 공기 흐름 및 설정 온도에 따라 약 0.5-4 시간이 될 수 있다. 순수한 CMC를 기반으로 하는 생성물은 투명(transparent)하거나, 흰색이 꺼져 있거나(light off white), 황갈색(amber colored) 일 수 있다. 이것의 특이적 중력은 약 1.55-1.58 g/㎖일 수 있다. 생성물은 바람직하게는 미세 기포가 없고, 그렇지 않으면 마이크론 스케일 물체(micron scale objects)의 제조에 적합하다. 최종 블록/시트 생성물의 물리적 특성 (경도, 인장 강도, 등)은 다양할 수 있지만, 그러나 일반적으로 초정밀가공과 연관된 물리적 스트레스에 저항할 수 있어야 한다.
상기 설명된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 미세바늘 어레이는 다양한 생체 유효 성분에 대해 신뢰할 수 있고 정확한 전달 방법을 제공할 수 있다. 상기 기술된 미세바늘 어레이의 구조적, 제조적 및 분포 장점 특성은 백신을 전달하는데 사용하기 위해 특별히 적용될 수 있다. 상기 미세바늘 어레이의 장점은 (1) 백신 전달을 위한 바늘 또는 살아있는 벡터의 사용을 회피하는, 안전성, (2) 저렴한 생산, 생성물의 안정성, 및 분포의 용이성에 기인한, 경제성, 및 3) 다양한 항원 및 보조제와 호환 가능한 전달 플랫폼을 경유한, 다양성을 포함한다.
더욱이, 미세바늘 어레이에 의한 피부 면역화(cutaneous immunization)는 면역원성(immunogenicity)에서 중요한 장점을 가진다. 피부는 쉽게 접근할 수있는 수지상 세포(CDs)에 풍부하며 백신의 전달에 대한 높은 면역원성으로서 오랫동안 간주되어 왔다. 이러한 수지상 세포 집단은 현재까지 밝혀진 가장 강력한 항원 제시 세포(APC)를 구성한다. 예를 들면, 피부의 유전적 면역화(genetic immunization)는 마우스 및 인간 피부에서 형질감염 및 수지상 세포의 활성을 초래하고, 상기 형질감염된 수지상 세포는 형질 전환(transgenic) 항원을 합성하고, 피부를 배수 림프절(lymph nodes)으로 이동시키며, CD8+ T-세포를 자극하는 MHC 클래스 I 제한 경로를 통해 이들을 효율적으로 제시한다. 피부 로 유도된 DC에 의해 유도된 면역 반응은 다른 면역화 접근법에 의해 유도된 것과 비교하여 현저히 강력하고 오래 지속된다. 최근의 임상 연구는 심지어 종래의 백신이 표준 근육 내 바늘 주입보다, 진피내적(intradermally)으로 전달될 때 현저히 더욱 강력하다는 것을 나타낸다. 따라서, 미세바늘 어레이는 항원 및 보조제 모두를 효율적으로 및 동시에 전달할 수 있고, 동일한 전달 플랫폼을 사용하여면역 반응을 조작하는 DCs 및 보조제를 표적하는 것 모두를 가능하게 한다.
고주파 전자기 진동 도포기(High Frequency
Electro
-magnetic Oscillating applicator)
미세바늘 어레이 장치는 자가 또는 인간 압력에 의한 보조된 응용(예를 들면, 손가락 또는 엄지로 밀기), 또는 용수철-부하된 장치와 같은 다양한 방법으로 인간 피부에 적용될 수 있다. 팁-부하된(tip-loaded)미세바늘 어레이를 포함하는, 미세바늘 어레이 장치의 전달의 용이성 및 재현성(reproducibility)을 용이하게하기 위해, 도포기(applicator) 장치가 본 명세서에서 설명된다. 도포기(applicator) 장치는 고주파 전자기 발진을 능동 헤드의 단방향(unidirectional) 기계 공진으로 변환하기 위해 구성된다. 이것은 차례로 인간 피부를 포함하는 조직으로 미세바늘 어레이의 미세바늘의 삽입을 용이하게 하는 재현성 있는 낮은 진폭(amplitude)과 고주파 압력 스트로크(high frequency pressure strokes)를 가능하게 한다.
도 38에서 나타낸 바와 같이, 도포기(applicator)는 도포기 헤드, 발진기-에너지 변환기(oscillator-energy converter), 전자기 발진기(electro-magnetic oscillator) 및 전원(power source)을 포함할 수 있다. 원한다면, 상기 4 개의 요소 중 하나 또는 전부를 도포기 장치로부터 분리할 수 있다.
도포기 헤드는 상이한 크기 및 모양의 조직 표면적에서 수용 및 행동하기 위해 교환될 수 있다. 도 39에서 나타낸 바와 같이, 다양한 도포기 헤드 기하학적 구조는 본 명세서에서 설명된 도포기와 결합하여 활용될 수 있다. 도포기 헤드는 스테인레스 철 또는 다른 화학적 및 물리적 저항 물질로 교환할 수 있게 만들어질 수 있다. 원하는 경우, 도포기 헤드를 멸균을 위해 고압 증기 멸균(autoclaved)하거나 알콜 또는 기타 화학 물질로 멸균시킬 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 가스 멸균(에틸렌 옥사이드)이 가능하다.
특이적 기하학적 구조 적용은 신속하게 디자인되고 제작될 수 있다. 예를 들면, 상기 실시예에서 단일 적용은 활성 헤드의 기하학적 구조에 따라 5 mm2에서 250 mm2까지의 범위일 수 있다. 넓은 범위는 헤드의 기하학적 구조의 단순한 구조적 가변성에 의해 달성될 수 있다.
발진기 에너지 변환기 유닛은 전자 기적 진동(electro-magnetic oscillation)을 도포기 헤드의 기계적 움직임으로 변환하기 위해 구성될 수 있다. Z 방향에서의 도포기 헤드의 진폭(amplitude)은 0.5-2.5mm 사이에서 조절될 수 있다(도 40; A). 일부 실시형태에서, X-Y 방향의 헤드 이동은 0.2mm 미만(<0.2 mm)으로 무시될 수 있도록 구성될 수 있다(도 40; B). 방향 Z에서의 에너지 전환으로 인한 기계적 움직임의 빈도(frequency)는 500-25000 rpm 사이에서 조절될 수 있다. 원한다면, 발진기 에너지 변환기 유닛은 분리 가능(detachable)할 수 있고, 필요에 따라 배치(disposed)되거나 또는 멸균될 수 있다.
전자기 (EM) 발진기는 3개의 서브유닛으로 구성될 수 있다. 이러한 서브 유닛은 (1) 조절기(controller) 및 고주파 EM 발진기(high frequency EM oscillator)에 대해 전압 및 전력을 생성하는 조절된 전력 공급(regulated power supply); (2) 조절기-조정기(controller-regulator)는 고주파 신호 및 EM 발진기에 요구되는 전류를 발생시킨다; 및 (3) EM 발진기를 포함할 수 있다. 출력 주파수(output frequency)는 사용자에 의해 조절될 수 있다 (예를 들면, 범위는 100-500 Hz와 같은 범위에서). 일부 실시형태에서, EM 발진기는 완전히 밀폐되어 있고 알코올 용액 또는 다른 화학 제제로 멸균될 수 있다.
또한 전력 공급은 하기와 같은 상이한 부착 가능한 동력원을 수용할 수 있도록 분리 가능하다:
a. 배터리, 일반 일회용 알칼린(regular disposable alkaline) 또는 임의의 다른 유형의 것.
b. 유도 충전기(inductive charger)가 내장된 충전식(Rechargeable) NiCad 또는 Li 산화물 배터리(Li oxide battery).
c. 100-240 V에 대한 전자식 전원 어댑터
도포기는 미세바늘 어레이 적용과 관련하여 여러 가지 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 도포기는 조직으로의 미세바늘 어레이 삽입에 필요한 기계적 힘을 최소화할 수 있다. 또한 상기 도포기는 기존의 용수철-부하된 도포기와 비교하여 통증 효과를 줄일 수 있다. 추가적으로, 도포기는 휴대 가능(portable)하며 도포기의 구성요소는 분리 가능(detachable)하고 상호 교환 가능(interchangeable)할 수 있다. 최종적으로, 도포기는 무균 사용을 위해 멸균될 수 있도록 구성될 수 있다.
개시된 실시형태의 원칙이 적용될 수 있는 많은 가능한 실시형태의 관점에서, 상기 기술된 실시형태는 단지 바람직한 예일 뿐이라는 것을 인식해야 하고 보호 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다. 오히려, 보호 범위는 하기의 청구항에 의해 정의된다. 따라서 본 발명자들은 이러한 청구항의 범위 및 정신 내에 있는 모든 것을 청구한다.
Claims (58)
- 하기를 포함하는, 환자에게 경피 삽입(transdermal insertion)을 위한 용해가능한 미세바늘 어레이(dissolvable microneedle array):
적어도 하나의 화학요법제(chemotherapeutic agent)를 포함하고, 치료학적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분(bioactive components);
기저부(base portion); 및
기저부로부터 뻗는 다수의 미세바늘, 여기서 실질적으로 모든 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 다수의 미세바늘에 위치하므로 기저부는 거기에 포함된 임의의 생체 유효 성분 없이 실질적으로 형성된다.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 독소루비신(doxorubicin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이(microneedle array).
- 제2항에 있어서, 상기 독소루비신의 양은 약 50 내지 200 마이크로그램인 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 적어도 2개의 상이한 화학요법제(chemotherapeutic agents)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제4항에 있어서, 상기 2개의 상이한 화학요법제는 독소루비신 및 적어도 하나의 다른 안트라사이클린제(anthracycline agent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화학요법제는 세포 독성제(cytotoxic agent) 및 면역자극제(immunostimulant agent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 보조제(adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 TLR 길항제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 dsRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 폴리(I:C) 유도체(Poly(I:C) derviative)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 폴리(I:C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 면역자극제는 폴리-ICLC(Poly-ICLC)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 세포 독성제는 독소루비신이고 상기 면역자극제는 폴리(I:C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제6항에 있어서, 상기 세포 독성제는 독소루비신이고 상기 면역자극제는 폴리-ICLC를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 다수의 미세바늘에 국소적으로 농축되어 있어 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분이 미세바늘 어레이에서 각각의 미세바늘의 단지 상반부(upper half)에만 존재하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제1항에 있어서, 상기 다수의 미세바늘은 상부(top portion)에 첫번째 횡단면 치수(cross-sectional dimension), 바닥부(bottom portion)에 두번째 횡단면 치수, 및 중간부(intermediate portion)에 세번째 횡단면 치수를 포함하는 모양을 가지도록 미리 형성되고(pre-formed), 상기 중간부는 상부와 바닥부 사이에 위치되어 있고, 세번째 횡단면 치수는 첫번째 및 두번째 횡단면 치수보다 큰 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제17항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 중간부 또는 그 위의 면적에서 실질적으로 농축된 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제18항에 있어서, 상기 각각의 미세바늘은 일반적으로 중간부 위의 한 점으로 점점 가늘어지고 각각의 미세바늘은 일반적으로 중간부 아래의 더 작은 횡단면 치수로 점점 가늘어지는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제1항에 있어서, 상기 각각의 미세바늘은 다수의 용해가능한 생체적합한 물질 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제20항에 있어서, 상기 용해가능한 생체적합한 물질은 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)인 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제20항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 적어도 2개의 상이한 화학요법제(chemotherapeutic agents)를 포함하고, 상기 적어도 2개의 상이한 화학요법제는 독소루비신 및 적어도 하나의 다른 안트라사이클린제(anthracycline agent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제4항에 있어서, 상기 적어도 2개의 화학요법제는 암 화학 면역치료 적용(cancer chemo immunotherapy application)을 위하여 치료제(chemotherapeutic agent), 보조제(adjuvant), 및 화학유인물질(chemo attractant)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 하기를 포함하는, 다수의 층을 갖는 시트 재료(sheet of material)를 혈성하여 미세바늘 어레이를 제조(fabricating)하는 방법:
미세바늘 어레이 생산 주형(production mold)에 치료학적으로 유효량의 적어도 하나의 화학요법제를 포함하는 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분을 갖는 용해가능한 생체적합한 물질의 첫번째 용액을 적용하는 단계;
미세바늘 어레이 생산 주형(production mold)에 하나 또는 그 이상의 유효 성분을 포함하지 않는 용해가능한 생체적합한 물질의 두번째 용액을 적용하는 단계; 및
하나 또는 그 이상의 유효 성분이 다수의 미세바늘에 실질적으로 농축되어 있고, 기저부 및 기저부로부터 뻗는 다수의 미세바늘을 포함하는 고체 미세바늘 어레이를 형성하기 위해 첫번째 및 두번째 용액을 건조시키는 단계.
- 제24항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 독소루비신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 독소루비신의 양은 약 50 및 200 마이크로그램인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 적어도 2개의 상이한 화학요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 화학요법제는 독소루비신 및 적어도 하나의 다른 안트라사이클린제를 포함하고, 상기 용해가능한 생체적합한 물질은 카르복시메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화학요법제는 세포 독성제 및 면역자극제 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 TLR 길항제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 dsRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 폴리(I:C) 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 폴리(I:C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역자극제는 폴리-ICLC를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 세포 독성제는 독소루비신이고 면역자극제는 폴리(I:C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 세포 독성제는 독소루비신이고 면역자극제는 폴리-ICLC를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분(bioactive components)은 미세바늘 어레이의 각각의 미세바늘의 상반부(upper half)에 실질적으로 농축된 것을 특징으로 하는 미세바늘 어레이.
- 제24항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
미세바늘 어레이가 기저부(기본 portion) 및 기저부로부터 뻗는 다수의 미세바늘을 갖는 미세바늘 어레이가 형성될 때까지 재료 시트(sheet of material)로부터의 부분들을 제거하는 단계, 여기서 시트 어레이(sheet array)로부터 부분의 제거가 미세바늘 어레이를 형성하는 것을 포함하므로 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 미세바늘 어레이의 각각의 미세바늘에 농축되고 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 기저부로부터 실질적으로 부재이다.
- 제40항에 있어서, 상기 부분들을 제거하는 단계는 미세바늘 어레이를 형성하기 위하여 시트 재료를 초정밀가공(micromilling)하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기를 포함하는, 피부치료 방법:
피부암이 있거나 피부암에 걸릴 위험이 있는 개체를 선택하는 단계; 및
적어도 하나의 화학요법제의 유효한 양을 개체에게 전달하기 위하여 개체의 부위에 제1항의 미세바늘 어레이를 적용하는 단계.
- 제42항에 있어서, 상기 미세바늘 어레이의 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 독소루비신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 독소루비신의 양은 약 50 및 200 마이크로그램인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 미세바늘 어레이의 하나 또는 그 이상의 생체 유효 성분은 적어도 2개의 상이한 화학요법제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 미세바늘 어레이는 용해가능한 생체적합한 물질(dissoluble biocompatible material)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 용해가능한 생체적합한 물질은 카르복시메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 화학요법제는 독소루비신 및 적어도 하나의 다른 안트라사이클린제(anthracycline agent)를 포함하고, 상기 미세바늘 어레이는 용해가능한 생체적합한 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 적어도 2개의 화학요법제는 세포 독성제 및 면역자극제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 TLR 길항제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 면역자극제는 적어도 하나의 dsRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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- 제49항에 있어서, 상기 면역자극제는 폴리(I:C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 면역자극제는 폴리-ICLC를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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