CN104531524A - 一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片及其应用 - Google Patents

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魏泽文
胡志远
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion

Abstract

本发明涉及一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片，包括：基板，设置在基板上的多个微针尖构成的阵列，以及将这些微针尖连接在一起的连接电极。本发明还公开了一种利用微针尖阵列芯片对生物组织进行电穿孔，转染组织细胞，从而增强组织免疫应答效应的方法，该方法包括：向皮下组织中注射适量的DNA，将微针尖阵列芯片贴附在皮肤表面，利用微针尖阵列芯片穿透皮肤的角质层，对皮下组织施加电场以使DNA进入皮下组织细胞内部并高效表达出该种DNA所编码的蛋白，增强生物组织对该种蛋白的免疫应答效应。本发明的微针尖阵列芯片可降低对组织的物理损伤和电穿孔所需的电压，提高细胞电穿孔的效率。

Description

一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片及其应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料及微加工技术领域，具体涉及一种微针尖阵列芯片，尤其涉及一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片及其在增加免疫应答效应中的应用。
背景技术
细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。
目前的研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程(Waver J.C.“Electroporation:A dramatic,nothermalelectric field phenomenon”，1992年)。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。与传统的化学穿孔和病毒穿孔相比，由于电穿孔具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。
随着技术的发展，电穿孔技术已经应用于诸多研究领域。不仅在实验室中被用于向体外培养的细胞内部输运大分子，还被用于向生物组织内的细胞内部输运核酸。如果向生物组织内的细胞内输运的核酸是DNA，并且该种DNA成功表达出其编码的蛋白，那这种核酸输运的过程就被称为细胞转染。经由高效的细胞转染而产生的蛋白可以引起生物组织的免疫应答，该种免疫应答的效率和细胞转染的效率正相关。因此，与直接向机体内注射DNA相比，电穿孔技术可以有效增强该种DNA所编码的蛋白引起的免疫应答反应，从而有助于DNA疫苗等领域的研究。
关于对细胞，特别是生物组织中的细胞进行电穿孔目前主要有以下两类技术：
(1)向生物组织内部插入两根或多根针状电极，以此在生物组织中产生相应的电场，从而使处于电极之间的细胞发生穿孔(如US7922709B2，US5389069A1，US6233482B1，CN1345607A，CN1248923A)。这类方法有三个较大的缺陷：首先，针状电极对组织的穿透会对生物组织产生较大的物理损伤，针状电极越多，损伤就越严重；其次，针状电极所产生的电场是不均匀的，会造成有些区域的细胞因电场强度不够而未能被电穿孔，而同时有些区域的细胞却因为电场强度过大而死亡；最后，因为现有机械加工技术的限制，针状电极之间的间距相对较大，通常在毫米级别，造成电穿孔需要的电压较高，通常在数百伏特量级，上述三个缺陷决定了这种方式无法向大面积的组织输运核酸，只能用于有限的科研场合；
(2)通过在生物组织表面放置各种形状的平面电极，以此形成相应的电场，从而使处于电极之下的细胞发生电穿孔(US 6775569B2)。这是一类非侵入性的方法，这种方法解决了上述第一种方法中对生物组织的物理伤害问题，但这种方法的致命缺陷在于：因为要穿透皮肤的阻隔，在皮肤表面所需的电场要大于组织内部的电场，同时目前的平面电极尺度都较大(数毫米)，上述两方面的缺陷意味着需要数百伏甚至上千伏的电压才能完成电穿孔过程，而如此高的电压对生物组织来说是致命的。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供了一种微针尖阵列芯片，可以穿透高电阻率的皮肤，直接在皮下产生电场，从而完成对细胞的电穿孔。同时，也可以将体外培养的细胞直接放置于该芯片上，该芯片产生的电场同样可以对这些细胞进行电穿孔；本发明的另一个目的是提供一种利用微针尖阵列芯片对生物组织进行电穿孔，高效转染组织细胞，从而增强组织免疫应答效应的方法。
为了达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片，其包括：基板，设置在基板上的多个微针尖构成的阵列，以及将所述的微针尖连接在一起的连接电极。
本发明中所述的基板，可以是由绝缘材料制成，也可以是在非绝缘材料表层覆盖绝缘材料而制成。
在本发明中细胞电穿孔是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。
本发明中所述的微针尖阵列是成对布置的，每对微针尖包括相对设置的阴极和阳极。
本发明中所述的微针尖阵列是由有较高硬度的材料制成，例如硅或者玻璃。
本发明中所述的微针尖阵列中针尖的数量为10-250个，例如可以是10个、20个、40个、50个、60个、80个、90个、100个、120个、150个、180个、2000个、220个、250个。
本发明中所述的微针尖阵列中针尖的形状为圆锥形或底面为四边形的尖锥形。
本发明中所述的微针尖阵列中针尖的高度为300微米-1毫米，例如可以是300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm。
本发明中所述的微针尖阵列中针尖的间距为100-400微米，例如可以是100μm、120μm、150μm、180μm、200μm、220μm、250μm、280μm、300μm、320μm、350μm、380μm、400μm。
本发明中所述连接电极是由适当的导电材料或这些材料的复合物来制成。优选材料为生物兼容性好的材料，例如金、钛和掺有银离子的PDMS(聚二甲基硅氧烷)。当采用多种材料时(例如一种导电材料(例如金)镀在另一种导电材料(例如铜)上)，最外层的优选材料为生物兼容性好的材料。
本发明中所述连接电极是成对布置的，每对微针尖包括相对设置的阴极和阳极。
本发明中所述连接电极材料为金，并且连接电极的厚度大于5微米，宽度大于100微米。
第二方面，本发明还提供了一种利用本发明第一方面所述的微针尖阵列芯片增强免疫应答的方法，该方法包括利用所述的微针尖阵列芯片对生物组织进行电穿孔，转染组织细胞，从而增强组织免疫应答效应。
作为优选的技术方案，所述的方法具体包括以下步骤：
首先向皮下组织中注射适量的DNA，再将所述的微针尖阵列芯片贴附在皮肤表面，利用所述的微针尖阵列芯片穿透皮肤的角质层，然后对皮下组织施加电场以使DNA进入皮下组织细胞内部并表达出所述DNA编码的蛋白，从而增强生物组织对所述蛋白的免疫应答效应。
本发明中所述的皮下组织为皮下腺体或肌肉。
本发明中所述微针尖阵列芯片的贴附方式为直接贴附于皮肤表层。
本发明中所述的电场强度为200V/cm至1000V/cm，其脉冲宽度为10～200毫秒，脉冲间隔1～30秒；其中电场强度可以是200V/cm、250V/cm、300V/cm、350V/cm、400V/cm、450V/cm、500V/cm、550V/cm、600V/cm、650V/cm、700V/cm、750V/cm、800V/cm、850V/cm、900V/cm、950V/cm、1000V/cm；脉冲宽度可以是10毫秒、20毫秒、50毫秒、100毫秒、120毫秒、150毫秒、180毫秒、200毫秒；脉冲间隔可以是1秒、3秒、5秒、8秒、10秒、13秒、15秒、18秒、20秒、23秒、25秒、28秒、30秒。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)降低了对组织的物理损伤：本发明提出的微针尖高度为300微米至1毫米，仅仅穿透皮肤组织，对皮下肌肉组织完全无损伤；由于微针尖的横向尺寸同样很小，所以对皮肤的穿透也是无痛而且易恢复的；
(2)降低了电穿孔所需的电压：一方面，由于本发明显著降低了微针尖之间的间距，也就是降低了相邻电极之间的间距，因此，在实现相同电场强度的前提下，本发明所用的微针尖阵列可显著降低电压(从数百伏特降低到数十伏特)；另一方面，和现有的放置在皮肤表层的电极器件相比，本发明的所述的微针尖电极阵列不会在高电阻率的角质层上消耗电压，所以同样可以显著降低电压(从数百伏特降低到数十伏特)；
(3)提高了细胞电穿孔的效率：本发明中，微针尖阵列中的针尖密度要远大于已有的用于电穿孔的针尖器件，从而可以实现更加均匀的电场分布，最终带来更好的电穿孔效率；
(4)适宜的微针尖尺寸：本发明提出将机械加工方法和MEMS加工方法结合在一起，可加工出高度足够高，同时间距足够小的微针尖阵列；因而本发明通过引入MEMS微加工技术，开发了微针尖阵列芯片，可以透过高电阻率的皮肤直接对皮下组织施加均匀的电场，实现了对细胞，特别是生物组织中的细胞的高效电穿孔；同时，实现了近似非侵入式(仅仅穿透皮肤或者皮肤表层的角质层)的操作方式，并降低了电穿孔所需电压，从而显著降低了对组织的损伤。
附图说明
图1是微针尖阵列芯片的结构示意图；
图2是微针尖阵列芯片用于穿透皮肤直接对皮下组织进行电穿孔的示意图；
图3是微针尖阵列芯片的俯视示意图；
其中，1-基板；2-微针尖；3-皮肤；4-连接电极(阴极)；5-连接电极(阳极)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
在本发明中，基板起到承托微针尖阵列和连接电极的作用，并在不同微针尖之间起到绝缘作用，所以基板需要由绝缘材料制成，或者由非绝缘材料覆盖绝缘层制成。因为需要在基板上制作微细电极，所以基板需要和现有的微细电极加工方法(例如半导体刻蚀)兼容。此外，因为本发明的目的是用于生物组织，所以基板需要具有良好的生物兼容性。本发明中的基板可由任何适合以上条件的材料来制作。
优选的基板是那些可以通过蒸镀、切割及热塑成型制成特定规格及形状的材料。特别优选的材料是硅或玻璃。在图1和图2中，基板采用玻璃材料制成，长3厘米、宽2厘米、厚度500微米。该尺寸是用于小鼠腿部肌肉组织电穿孔的最佳尺寸；当需要对其它组织进行电穿孔时，该基板的尺寸可由具体需求决定，并通过切割等方法得到所需尺寸的基板。
在本发明中，微针尖阵列是所述的微针尖阵列芯片的关键部分。首先，微针尖需要穿透高电阻的角质层，又不能伤害到皮下肌肉组织，所以其高度要大于300微米，又要小于1毫米；其次，微针尖需要有足够的强度的穿透组织；最后，微针尖需要作为电极来向皮下组织施加电场，所以需要由导电材料制成，或者由绝缘材料覆盖导电层制成。在微针尖的排列方面，针尖之间的间距要小于400微米，以降低电穿孔所需的电压；针尖之间的间距又要大于100微米，以免过密的针尖无法扎入组织。
优选的微针尖阵列采用那些可以通过现有MEMS加工方法进行精密加工的材料，包括硅或玻璃。在图1和图2中，微针尖阵列优选硅材料，优选形状为圆锥形，优选高度为300微米～1毫米，优选针尖间距为100～400微米。上述参数是用于小鼠腿部肌肉组织电穿孔的最佳尺寸。当需要对其它组织进行电穿孔时，这些参数可由具体需求决定；在图1和图2中，针尖的数量为45，这是用于小鼠腿部肌肉组织电穿孔的最佳尺寸；针对不同的组织，实验证实针尖数量可以在10至250之间选择。过少的针尖的覆盖面积太小，而过多的针尖又大大增加了加工难度并降低了良品率。
在本发明中，连接电极起到将不同的微针尖在电学上连通在一起的作用，所以连接电极需要由适当的导电材料或这些材料的复合物来制成。优选材料为生物兼容性好的材料，例如金、钛和掺有银离子的PDMS(聚二甲基硅氧烷)。当采用多种材料时(例如一种导电材料(例如金)镀在另一种导电材料(例如铜)上)，最外层的优选材料为生物兼容性好的材料。
连接电极需要承受电穿孔所需的高电场所带来的高电流。所以连接电极需要有良好的导电性，同时需要较大的截面积。
在图3中，连接电极材料为铬和金。其制备方法为：首先在制作有微针尖阵列的基板上溅射(这是一种半导体加工工艺中公知的沉积金属的方法)一层厚度为0.1微米的铬，再溅射一层厚度为0.5微米的金。然后对整个基板进行光刻(同样是半导体加工工艺中公知的制作图形的方法)得到需要的电极形状。接着腐蚀掉金层和铬层上不需要的部分，并且进行电镀以将金层加厚到10微米，最终得到所需的电极。
本发明中采用铬和金来制作连接电极，是因为金的生物兼容性很好，而铬是为了增加金和基板材料之间的黏附性。在不同的需求下，其它的导电材料，例如铝、铜或者导电聚合物都可以用来制造连接电极。
图3中，连接电极的厚度为10微米，宽度为200微米，这是应用于腿部肌肉组织电穿孔的最优尺寸，当需要对其它细胞或组织进行电穿孔时，可以本领域技术人员自行选择合适的电极宽度和电极间距。需要说明的是，为了实现本发明的有益效果，当应用于组织中的细胞电穿孔并采用金材料时，连接电极的厚度必须大于5微米，宽度必须大于100微米。
在对组织进行电穿孔时，需要一个脉冲电压发生器为微针尖阵列芯片提供合适的脉冲电压。
本发明给出所述微针尖阵列芯片的具体制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而并不是对本发明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。
实施例1
采用如下方法制作本发明所述的微针尖阵列芯片，具体包括以下步骤：
采用半导体制造工艺常用的4英寸玻璃片(厚度500微米)作为基板材料。用键合(Bonding,常用的MEMS加工技术)的方法将一块4英寸硅片连接在玻璃片上，然后在硅片上加工微针尖阵列。首先在把硅片上相邻针尖之间空隙位置的硅用高速砂轮去除一部分，然后光刻出圆形针尖区域(采用AZ4620光刻胶，厚度为15微米)，利用光刻胶作为阻挡层进行各向同性干法刻蚀(常用的MEMS加工技术)形成针尖的大致形状，此后利用各向异性干法刻蚀(常用的MEMS加工技术)形成较高的硅柱，最后进行各向同性刻蚀形成圆锥形针尖，阻挡层会自动脱落。此时已经获得微针尖阵列。然后进行连接电极的加工。在基片和微针尖阵列上溅射(常用的半导体加工技术)0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层。对整个硅片进行光刻(采用AZ4620光刻胶，厚度为15微米)，定义出所需连接电极的形状。将整个硅片进行电镀，这时没有光刻胶覆盖的位置(也就是连接电极的位置)将生长金材料。当金材料的厚度达到10.6微米时，去除光刻胶。使用碘化钾溶液腐蚀0.5微米的金层，使用硝酸铈铵溶液腐蚀0.1微米的铬层，此时只有经过电镀的区域存在金材料。由此获得了连接电极。最终，将4寸的基片按长3厘米、宽2厘米的尺寸进行切割，获得所需的微针尖阵列芯片。
在该制作方法中，基片材料是玻璃(绝缘)，微针尖阵列材料是硅(绝缘)，连接电极材料是金(导电)。微针尖是圆锥形的(如图1所示)。针尖高度为400微米，相邻针尖间距为340微米。
实施例2
采用如下方法制作本发明所述的微针尖阵列芯片，具体包括以下步骤：
采用半导体制造工艺常用的4英寸掺杂有硼元素的硅片，这种硅片是导电的，对其进行氧化，在硅片表面产生氧化硅，形成一种绝缘氧化层覆盖在导电硅片上的结构。将两片氧化过的硅片键合在一起，然后将其中的一片加工成微针尖阵列。首先利用光刻定义出相邻针尖之间的空隙位置(采用AZ4620光刻胶，厚度为15微米)，用干法腐蚀(常用的MEMS加工技术)去除该部分的硅。然后光刻出方形针尖区域(采用AZ4620光刻胶，厚度为15微米)，利用光刻胶作为阻挡层，利用干法刻蚀去除一部分二氧化硅层，此后利用二氧化硅层作为阻挡层，进行各向异性湿法刻蚀(常用的MEMS加工技术)形成微针尖的形状。因为该加工方法对硅片晶向的选择性，获得的硅针尖形状是底面为四边形的尖锥形。然后去除二氧化硅阻挡层，此时已经获得微针尖阵列。然后进行连接电极的加工。在基片和微针尖阵列上溅射(常用的半导体加工技术)0.3微米厚的铝金属层。对整个硅片进行光刻(采用AZ4620光刻胶，厚度为15微米)，定义出所需电极的形状。将整个硅片进行电镀，这时没有光刻胶覆盖的位置(也就是微细电极的位置)将生长铝材料。当金材料的厚度达到10.3微米时，去除光刻胶。使用氢氧化钠水溶液腐蚀0.3微米的铝层，此时只有经过电镀的区域存在铝材料。由此获得了连接电极。最终，将4寸的基片按长3厘米、宽2厘米的尺寸进行切割，获得所需的微针尖阵列芯片。
在该制作方法中，基片材料是二氧化硅(绝缘)覆盖在经掺杂的硅(导电)上，微针尖阵列材料是经掺杂的硅(导电)，连接电极材料是铝(导电)。微针尖是底面为四边形的尖锥形。针尖高度为470微米，相邻针尖间距为400微米。
在上述实施例1和2的制作方法中，都需要将相邻针尖之间空隙位置的硅材料先去除一部分，目的是使得后续的刻蚀(干法和湿法)过程可以从微针尖的上表面和侧面同时进行，由此获得更大的高宽比，以达到更好地增强效果。
实施例3
本发明利用所述的微针尖阵列芯片对体外细胞和组织细胞进行电穿孔的方法，具体包括以下步骤：
对体外细胞的电穿孔方法：
收集处于对数生长期的MDCK(狗肾上皮细胞)，转速800g离心5分钟，弃上清，用电穿孔缓冲液(氯化钾15mM，磷酸二氢钾0.3mM，磷酸氢二钾0.85mM，肌醇56mM)重悬细胞，使得细胞的密度为2X103个/ul(微升)，加入需要电穿孔转入细胞的DNA质粒pEGFP—C3，使质粒的浓度为20ug(微克)ug/ml(毫升)，轻柔混合均匀。将混好的细胞悬液20ul均匀滴加微针尖阵列芯片表面，采用如下条件进行电刺激：电压70伏特，脉冲宽度0.2毫秒，脉冲次数3次，脉冲间隔2秒。
电穿孔结束后，将细胞转移至96孔板进行培养，加入0.2-1ml细胞培养基。培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度5％。24小时后荧光显微镜下观察，可成功观察到90％以上的细胞有绿色荧光表达，表明电穿孔的转染效率达90％以上。
对组织细胞的电穿孔方法A：
取用体重为18-22g的C57BL/6小鼠，向其腿部肌肉注射40μl(2μg/μl)的透明质酸(这是为了使肌肉组织疏松，以便后续注射的DNA渗入组织中)。20分钟后，向肌肉内注射40μl(1μg/μl)DNA(该DNA编码有pmRFP-C1荧光蛋白)。5分钟后，将微针尖阵列芯片直接贴附于肌肉外的皮肤表层，穿透皮肤，直接对皮下肌肉施加电场，其电压为70V，脉冲宽度为20毫秒，脉冲间隔为2秒，一共施加5个脉冲。将微针尖阵列芯片取下并继续培养小鼠72小时。72小时后可在活体成像仪中观察到显著的红色荧光。经过微针尖阵列芯片处理的小鼠表达了和经过已公开技术中的插入式针尖处理的小鼠相同强度的荧光。继续观察小鼠96小时，可见经微针尖阵列芯片处理的小鼠腿部功能正常，而经插入式针尖处理的小鼠腿部已经残疾，完全失去功能。
对组织细胞的电穿孔方法B：
取用体重为24-28g的BALB/C裸鼠，在其腋下部位注射经过DNA改造从而会自发荧光的MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)以诱导肿瘤，约1周后，肿瘤增大至400mm3。通过静脉注射360μl(1μg/μl)siRNA(小干扰核酸，其会抑制MDA-MB-231细胞的基因表达)。5分钟后，部分siRNA将达到肿瘤部分，此后将微针尖阵列芯片直接贴附于肿瘤外的皮肤表层，施加电场，其电压为70V，脉冲宽度为10毫秒，脉冲间隔为2秒，一共施加5个脉冲。将微针尖阵列芯片取下并继续培养小鼠72小时。72小时后可在活体成像仪中观察到肿瘤区域的荧光显著降低，说明肿瘤细胞的基因表达得到了抑制。
实施例4
利用实施例1的微针尖阵列芯片增强组织免疫应答的方法，具体包括以下步骤：
取体重为18-22g的C57BL/6小鼠，向其腿部肌肉注射40μl(2μg/μL)的透明质酸(这是为了使肌肉组织疏松，以便后续注射的DNA渗入组织中)。20分钟后，向肌肉内注射40μL(1μg/μL)DNA(该DNA编码对小鼠来说是外源性的蛋白，例如BHMT，人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶)。5分钟后，将微针尖阵列芯片直接贴附于肌肉外的皮肤表层，施加电场，其电压为50V，脉冲宽度为20毫秒，脉冲间隔为2秒，一共施加5个脉冲。将微针尖阵列芯片取下并继续饲养小鼠。分别以7天，7天和10天的间隔重复上述流程。共计经过四次处理后，取小鼠尾静脉血，进行相应的BHMT抗体滴度检测，可以观察到高达8万的抗体滴度，而未经电穿孔的对照组抗体滴度仅为3000左右，说明利用微针尖阵列芯片的电穿孔显著增强了组织的免疫应答效应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片，其特征在于，包括：
基板，设置在基板上的多个微针尖构成的阵列，以及将所述的微针尖连接在一起的连接电极。
2.如权利要求1所述的微针尖阵列芯片，其特征在于，所述的基板由绝缘材料而制成或者由非绝缘材料表层覆盖绝缘材料而制成。
3.如权利要求1或2所述的微针尖阵列芯片，其特征在于，所述的微针尖阵列是成对布置的；
优选地，每对微针尖包括相对设置的阴极和阳极。
4.如权利要求1-3任一项所述的微针尖阵列芯片，其特征在于，所述的微针尖阵列中针尖的形状为圆锥形；
优选地，所述的微针尖阵列中针尖是底面为四边形的尖锥形；
优选地，所述的针尖数量为10-250个。
5.如权利要求1-4任一项所述的微针尖阵列芯片，其特征在于，所述微针尖阵列中针尖的高度为300μm-1mm；
优选地，相邻微针尖的间距为100-400μm。
6.如权利要求1-5任一项所述的微针尖阵列芯片，其特征在于，所述的连接电极是成对布置的。
7.如权利要求1-6任一项所述的微针尖阵列芯片，其特征在于，所述的连接电极材料为金；
优选地，所述连接电极的厚度大于5μm，宽度大于100μm。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的微针尖阵列芯片增强免疫应答的方法，其特征在于，所述的方法包括利用所述的微针尖阵列芯片对生物组织进行电穿孔，转染组织细胞，从而增强组织免疫应答效应。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法具体包括以下步骤：首先向皮下组织中注射适量的DNA，再将所述的微针尖阵列芯片贴附在皮肤表面，利用所述的微针尖阵列芯片穿透皮肤的角质层，然后对皮下组织施加电场以使DNA进入皮下组织细胞内部并表达出所述DNA编码的蛋白，从而增强生物组织对所述蛋白的免疫应答效应。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的电场强度为200V/cm至1000V/cm，脉冲宽度为10-200毫秒，脉冲间隔1-30秒。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106893665A (zh) * 2015-11-19 2017-06-27 美天施生物科技有限责任公司 从生物组织分离细胞的方法和设备
CN108060078A (zh) * 2018-02-05 2018-05-22 上海交通大学 镀金表面硅纳米柱电极及其应用
CN111155066A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 西安交通大学 一种镀银层的微针阵列及其制备方法
CN115096945A (zh) * 2022-06-22 2022-09-23 中国人民解放军陆军军医大学 用于检测心肌细胞电信号的微针阵列电极及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857836A (zh) * 2009-11-10 2010-10-13 北京大学 一种流式电穿孔装置及系统
CN102174387A (zh) * 2011-01-25 2011-09-07 重庆大学 一种低压直流控制的连续流细胞电融合芯片

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101857836A (zh) * 2009-11-10 2010-10-13 北京大学 一种流式电穿孔装置及系统
CN102174387A (zh) * 2011-01-25 2011-09-07 重庆大学 一种低压直流控制的连续流细胞电融合芯片

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI ET AL: "A flexible microneedle array as low-voltage electroporation electrodes for in vivo DNA and siRNA delivery", 《LAB ON A CHIP》, vol. 14, no. 20, 11 August 2014 (2014-08-11) *
胡友旺和孙小燕: "柔性平板波传感器研究进展", 《功能材料》, vol. 40, 31 December 2009 (2009-12-31) *
霍丹群等: "微电极芯片系统中酵母细胞电穿孔的实验研究", 《生命科学研究》, vol. 14, no. 5, 31 October 2010 (2010-10-31) *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106893665A (zh) * 2015-11-19 2017-06-27 美天施生物科技有限责任公司 从生物组织分离细胞的方法和设备
CN108060078A (zh) * 2018-02-05 2018-05-22 上海交通大学 镀金表面硅纳米柱电极及其应用
CN108060078B (zh) * 2018-02-05 2022-05-10 上海交通大学 镀金表面硅纳米柱电极及其应用
CN111155066A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 西安交通大学 一种镀银层的微针阵列及其制备方法
CN111155066B (zh) * 2020-01-20 2021-03-16 西安交通大学 一种镀银层的微针阵列及其制备方法
CN115096945A (zh) * 2022-06-22 2022-09-23 中国人民解放军陆军军医大学 用于检测心肌细胞电信号的微针阵列电极及其制备方法
WO2023246212A1 (zh) * 2022-06-22 2023-12-28 中国人民解放军陆军军医大学 用于检测心肌细胞电信号的微针阵列电极及其制备方法

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