CN108060078A - 镀金表面硅纳米柱电极及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因导入技术领域，具体涉及一种镀金表面硅纳米柱电极及其应用。本发明所述电极以硅片为基底，所述硅片包括第一表面和第二表面，所述硅片的第一表面上具有若干个纳米柱状凸起，各个纳米柱状凸起之间存在间隙，所述硅片的第一表面上及各纳米柱状凸起上均包覆有镀金层。本发明所述电极组建成的细胞电转染装置能够转染贴壁细胞或者悬浮细胞等多种细胞，能够对大量细胞进行电穿孔试验，细胞存活率高，转染效果良好，具有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因导入技术领域，具体涉及一种镀金表面硅纳米柱电极及其应用。
背景技术
目前，肿瘤逐渐成为威胁人类生命的高发疾病，肿瘤的治疗方法也成为当前研究的重点。免疫治疗是时下比较热门的治疗方法，肿瘤的免疫治疗主要分为：细胞因子治疗，过继性免疫治疗和肿瘤疫苗等方法。其中，过继性免疫治疗效果好，受到了广泛关注和研究。CAR-T技术也有临床应用的例子。
过继性免疫治疗分为特异性和非特异性治疗两种。非特异性过继免疫细胞治疗是指将病人体内的淋巴细胞分离出来后，经体外细胞因子的刺激后，产生具有免疫活性的免疫效应细胞，再注回病人体内从而达到抗肿瘤的免疫治疗效果；特异性过继免疫细胞治疗是指将病人体内的T淋巴细胞分离出来后，将外源基因转染进入T淋巴细胞中，对细胞进行基因上的改变，使分离出来的细胞表达目的蛋白以达到特异性免疫的效果。
因此，想要实现CAR-T细胞的构建，细胞转染是一项关键技术。细胞转染主要有三类方法：化学方法，生物方法和物理方法。免疫治疗过程就是对T淋巴细胞改造的过程。T淋巴细胞通常是一种悬浮细胞，利用传统的化学方法转染很难达到预期的效果。目前已知针对T淋巴细胞转染效果比较好的两种方法是慢病毒转染法和电穿孔转染法。但是慢病毒转染法存在一定安全风险，在实际临床应用过程中使用较少。电穿孔转染法是利用细胞在电场中受到的作用，在细胞膜上形成孔洞的瞬间将外源生物大分子导入细胞进而发挥作用。
目前，商用细胞电穿孔仪器存在一定的缺陷，高电压下，产生高热量，对细胞损伤性大，会对后续研究应用产生影响；另外，在电场作用下，电转液会产生明显电化学效应，电穿孔过程中电离产生细胞毒性物质，对细胞杀伤性较大。
经检索，公开号为CN 106517445 A(申请号201611114099.3)的中国发明专利申请，该专利公开一种用于细胞电穿孔的电极，该电极为表面杂乱金属纳米线，用于低电压下细胞电穿孔技术。但是，该专利技术存在以下不足：电极表面纳米线杂乱无章，缺乏特定结构，可控性不高，造成电穿孔的效果不稳定。
经检索，公开号为CN 103396944 A(申请号201310308644.2)的中国发明专利申请，该专利公开一种用于细胞转染的电穿孔芯片电极，该电穿孔芯片通过将细胞及生物大分子混合液注入芯片三维管道中，进行悬浮细胞的电穿孔转染。但是，该专利技术存在以下不足：电穿孔装置复杂，操作步骤繁琐，单次转染细胞量小，不能应用于需要大量细胞的后续实验。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种镀金表面硅纳米柱电极及其应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种镀金表面硅纳米柱电极，所述电极以硅片为基底，所述硅片包括第一表面和第二表面，所述硅片的第一表面上具有若干个纳米柱状凸起，各个纳米柱状凸起之间存在间隙，所述硅片的第一表面上及各纳米柱状凸起上均包覆有镀金层。
需要说明的是，镀金表面硅纳米柱电极中纳米二字并不对电极的尺寸构成限制。
优选地，所述硅片呈正方型。
优选地，所述硅片的边长为5～15mm。例如，所述硅片的边长可以是10mm。
本发明所述第一表面上的纳米柱状凸起的半径单位可以为nm。
在本发明中，当纳米柱状的直径在1nm～5μm范围时，均称为是纳米柱，并不限定为纳米柱的直径必须在100nm以下。
优选地，所述第一表面上的纳米柱状凸起的直径为0.8～1.2μm。
优选地，所述第一表面上的纳米柱状凸起的高度为4～8μm。
优选地，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为5～20μm。
优选地，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为10～20μm。
优选地，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为10～15μm。
优选地，所述镀金层的厚度为50～200nm。
进一步地，每平方毫米的硅片表面上含有2601～40401个所述纳米柱状凸起。
再进一步地，每平方毫米的硅片表面上含有4489～10201个所述纳米柱状凸起。
本发明的第二方面，提供所述镀金表面硅纳米柱电极在制备细胞电穿孔装置中的用途。
本发明的第三方面，提供一种细胞电穿孔装置，至少包括一个电转染控制电路、两个前述镀金表面硅纳米柱状电极以及一个细胞电穿孔容器。
优选地，两个前述镀金表面硅纳米柱状电极与电转染控制电路中的电源连接，其中一个电极作为正电极，另外一个电极作为负电极。
使用时，前述镀金表面硅纳米柱状电极可设于所述电穿孔容器内。
优选地，所述电转染控制电路可提供方波、脉冲、正弦波等转染波形。例如，可采用信号发生器普源DG1022U作为电转染电源。
可采用现有技术中的方法制备前述细胞电穿孔装置中的镀金表面硅纳米柱状电极。例如：光刻法。
本发明的第四方面，提供了一种采用前述细胞电穿孔装置进行电转染的方法，包括如下步骤：
(1)在电穿孔容器中，加入待转染细胞和待转染物质；
(2)开启电转染控制电路，进行电转染。
优选地，采用前述细胞电穿孔装置进行电转染的方法为非治疗诊断目的的电转染方法。
优选地，步骤(1)中，所述待转染细胞选自悬浮细胞或贴壁细胞。进一步优选地，所述待转染细胞选自干细胞、DC细胞、巨噬细胞、淋巴细胞。
优选地，步骤(1)中，所述待转染细胞的密度范围是2*106以上。
优选地，步骤(1)中，所述待转染物质选自质粒、mRNA、DNA、siRNA、microRNA、蛋白、多肽。
优选地，步骤(2)中，所述电转染控制电路采用信号发生器。进一步优选地，所述信号发生器选用普源DG1022U。
优选地，步骤(2)中，电转染时，所述电转染控制电路的输出电压为2～8V。
优选地，步骤(2)中，电转染时，所述电转染控制电路的脉冲波的脉宽为10～30ms。
优选地，步骤(2)中，电转染时，所述电转染控制电路的循环数为2～8cycles。
优选地，步骤(2)中，电转染时，所述电转染控制电路的输出电压为8V，所述电转染控制电路的脉冲波的脉宽为10ms，所述电转染控制电路的循环数为2cycles。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以镀金表面硅纳米柱状电极组建的电转染装置，使用时，最大电压为10v，远低于其他电转仪的应用电压，应用本发明能够减少高电压下电穿孔对细胞的损伤，减小电流在电转液中产生的热效应及化学效应对细胞的伤害。
(2)本发明以镀金表面硅纳米柱状电极组建的电转染装置，增加硅片作为电极时的导电性，减少能量损失，提高电穿孔效果。
(3)本发明单次进行细胞电穿孔最大体积为240μL，处理的细胞量大，为后续实验提供大量材料。
(4)本发明操作方便简洁，解决了多数细胞电穿孔装置操作繁琐复杂的缺陷。
(5)本发明的镀金表面硅纳米柱状电极具有纳米柱状结构，利用纳米结构的的特殊性质，将低电压放大，在纳米结构上产生较大的电压实现电穿孔，节约能量，减少细胞损伤。
附图说明
图1A：表面具有硅纳米柱结构阵列的硅片结构示意图。
图1B：镀金表面硅纳米柱状电极上的硅纳米柱结构示意图。
图2：镀金表面硅纳米柱状电极上的硅纳米柱结构实物图。
图3：细胞电穿孔装置将pGL3质粒转入DC 2.4细胞效果。
图4：细胞电穿孔装置将pGL3质粒转入RAW264.7细胞效果。
图5：氧化铜杂乱纳米线电极。
图6：不同细胞电穿孔装置的转染效果对比。
图7：本发明细胞电穿孔装置与商用电转仪所需细胞量对比。
图8：本发明细胞电穿孔装置与商用电转仪转染效果对比。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1镀金表面硅纳米柱状电极的制备、细胞电穿孔装置的构建
一、镀金表面硅纳米柱状电极的制备
(1)光学掩模板的制作：设计四种不同规格的纳米柱阵列掩模板，掩模板材质为玻璃，表面不透光位置为铬层覆盖，掩模板尺寸为127mm*127mm，如图1A所示，铬层覆盖图形为矩形阵列，阵列规格为：以直径为1μm的圆为结构单元，圆心间距分别为5μm、10μm、15μm和20μm的矩形阵列，每个矩形阵列的尺寸为10mm*10mm，每个矩形阵列之间的间距为3mm，不同规格圆间距的矩形阵列区域之间的距离为4mm。
(2)光刻：取待操作硅片放置在HP-303DU热板进行180℃烘烤，10min后，放在凉板上降温，降至室温，然后取3-4ml光刻胶，用SUSS匀胶机将光刻胶均匀涂抹在硅片上，取出后放置在HP-303DU热板上烘干，放凉至室温后，将硅片和掩模板放置在VistecEBPG-5200+电子束光刻系统中进行光刻操作，取出硅片后，用显影液显影。
(3)深硅刻蚀：利用NMC反应离子式深硅刻蚀系统(DRIE-II)在硅片表面刻蚀形成纳米柱状结构。设置的程序为：Process A，反应时长为4min20s，循环数为20cycles，沉积过程5，压力19mg刻蚀过程8s，压力30mg。气体C4F8 85sccm SF6 130sccm O213sccm。ICP功率为600，偏压功率为13w，温度15℃。
(4)除光刻胶：PVA-TePla微波等离子去胶机/表面处理机除掉表面光刻胶。除胶时间为5min。
(5)观察形貌：除掉光刻胶后，利用正置显微镜观察除胶后硅片的形貌特征，若仍有光刻胶残留则重复步骤(4)所述操作，直到干净为止。
(6)镀金：利用Denton电子束蒸发镀膜设备为表面具有纳米柱结构的硅片进行镀金，镀金层厚度为150nm。
(7)切割：沿矩形阵列之间3mm的缝隙进行切割，获得镀金表面硅纳米柱状电极，如图1B所示。
通过本实施例的方法，制备获得的电极，称之为镀金表面硅纳米柱状电极，镀金表面硅纳米柱状电极上的硅纳米柱结构实物图可如图2所示。所述电极的基底为硅片，所述硅片包括第一表面和第二表面，所述硅片的第一表面上具有若干个纳米柱状凸起，各个纳米柱状凸起之间存在间隙，所述硅片的第一表面上及各纳米柱状凸起上均包覆有镀金层。
具体地，通过本实施例，制备获得了四个型号的电极，
其中，第一型号的电极：硅片呈正方型，硅片的大小为10mm*10mm，第一表面上的纳米柱状凸起的直径为1μm、高度为5μm，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为5μm，每平方毫米的硅片表面上含有40401个所述纳米柱状凸起，镀金层厚度为150nm。
第二型号的电极：硅片呈正方型，硅片的大小为10mm*10mm，第一表面上的纳米柱状凸起的直径为1μm、高度为5μm，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为10μm，每平方毫米的硅片表面上含有10201个所述纳米柱状凸起，镀金层厚度为150nm。
第三型号的电极：硅片呈正方型，硅片的大小为10mm*10mm，第一表面上的纳米柱状凸起的直径为1μm、高度为5μm，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为15μm，每平方毫米的硅片表面上含有4489个所述纳米柱状凸起，镀金层厚度为150nm。
第四型号的电极：硅片呈正方型，硅片的大小为10mm*10mm，第一表面上的纳米柱状凸起的直径为1μm、高度为5μm，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为20μm，每平方毫米的硅片表面上含有2601个所述纳米柱状凸起，镀金层厚度为150nm。
此外，还参照上述方法，制备获得了第五型号电极：硅片呈正方型，硅片的大小为15mm*15mm，第一表面上的纳米柱状凸起的直径为1.2μm、高度为8μm，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为15μm，每平方毫米的硅片表面上含有4489个所述纳米柱状凸起，镀金层厚度为200nm。
制备获得了第六型号电极：硅片呈正方型，硅片的大小为5mm*5mm，第一表面上的纳米柱状凸起的直径为0.8μm、高度为4μm，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为10μm，每平方毫米的硅片表面上含有10201个所述纳米柱状凸起，镀金层厚度为50nm。
二、细胞电穿孔容器制备
(1)设计细胞电穿孔容器形状、尺寸：细胞电穿孔容器外形为长方体，内部有容积为240μL的长方体空间，空间两侧有宽度为13mm，厚度为0.55mm的凹槽。
(2)制备：交由公司，利用微纳米加工技术进行制备，选用聚碳酸酯作为细胞电穿孔容器的材质，具有无毒，可视、轻便等优势。
三、组装细胞电穿孔装置
所述细胞电穿孔装置，至少包括一个电转染控制电路、两个镀金表面硅纳米柱状电极，以及一个细胞电穿孔容器。所述电转染控制电路可采用现有技术，例如电脉冲发生仪，能够产生精确、稳定、低失真的输出信号，电脉冲波形可为方波、脉冲波、正弦波，指数波、正弦波等五种标准波形，并可利用任意波编辑软件Ultrawave输出所需要的波形，输出电压范围0.1v-10v，频率范围1μHz～25MHz；可根据电转细胞的不同灵活调节所需要的波形、电压、脉宽、脉冲次数、循环数、相位、偏移等参数。两个镀金表面硅纳米柱状电极分别与电转染控制电路中的电源连接。两个镀金表面硅纳米柱状电极可设于电穿孔容器内，其中一个电极可作为正极，另外一个可作为负极，通电后，即可形成电场，对置于电穿孔容器内的细胞进行电转染。为了防止镀金表面硅纳米柱状电极移动，影响判断电极之间的实际电压，可将镀金表面硅纳米柱状电极分别沿凹槽位置插入细胞电穿孔容器中。
实施例2细胞电穿孔装置转染贴壁细胞
运用实施例1所构建的细胞电穿孔装置转染贴壁细胞，本实施例以贴壁DC2.4细胞电穿孔转染pGL3-luc和贴壁RAW264.7巨噬细胞电穿孔转染pGL3-luc实验为例说明。
(一)、贴壁DC 2.4细胞电穿孔转染pGL3-luc实验，转染方法包括如下步骤：
(1)将镀金后的纳米柱硅片电极放置在6孔板中；
(2)将DC 2.4细胞用胰酶消化后，加入培养基终止消化，用吸管将细胞轻轻吹打下来，将细胞转移至15mL离心管中，用1000g速度离心5min，用1640培养基重悬，保证细胞最终密度为4*107个/mL，取100μL细胞滴加在硅片电极上，放置在培养箱中，培养2-3h，保证细胞在电极上贴壁生长；
(3)取出6孔板，用PBS清洗细胞3次，注意不要将细胞从硅片电极上冲下来，然后将硅片电极插入细胞电穿孔容器中；
(4)向BTX商用电转液中加入pGL3-luc质粒，质粒最终浓度为0.08mg/mL，向细胞电穿孔容器中加入配置好的200μL的BTX商用电转液；
(5)按照实施例1中的方法进行组装细胞电穿孔装置；
(6)取6孔板，每孔加入2mL细胞培养基，将其置于37℃细胞培养箱中预热；
(7)设置电压、波形、脉宽和周期等参数，接通电源，进行细胞电穿孔实验；
(8)取出硅片电极，放置在细胞培养基中过夜培养；
(9)用PBS清洗细胞后，进行荧光检测。
结果如图3所示，此处所使用的是实施例1中的第二型号电极组建的细胞电穿孔装置，横坐标记为blank组是指阴性对照组即就未经过电穿孔操作的细胞转染检测值，这一组的结果显示细胞未经过电穿孔处理的转染效果差。横坐标记为2v 10ms 8cycles组是指电穿孔操作时对细胞施加的电场条件为电压2v，脉宽10ms，电击循环数8cycles，这一组的结果显示在这个电场条件下DC2.4细胞的转染效果一般。横坐标记为2v 30ms2cycles组是指电穿孔操作时对细胞施加的电场条件为电压2v，脉宽30ms，电击循环数2cycles，这一组的结果显示在这个电场条件下DC2.4细胞的转染效果稍有提升。横坐标记为2v 30ms 8cycles组是指电穿孔操作时对细胞施加的电场条件为电压2v，脉宽30ms，电击循环数8cycles，这一组的结果显示在这个电场条件下DC2.4细胞的转染效果一般。横坐标记为8v 10ms2cycles组是指电穿孔操作时对细胞施加的电场条件为电压8v，脉宽10ms，电击循环数2cycles，这一组的结果显示在这个电场条件下DC2.4细胞的转染效果最优。横坐标记为8v10ms 8cycles组是指电穿孔操作时对细胞施加的电场条件为电压8v，脉宽10ms，电击循环数8cycles，这一组的结果显示在这个电场条件下DC2.4细胞的转染效果很差。横坐标记为8v 30ms 2cycles组是指电穿孔操作时对细胞施加的电场条件为电压8v，脉宽30ms，电击循环数2cycles，这一组的结果显示在这个电场条件下DC2.4细胞的转染效果很差。横坐标记为water组是指水中的检测值作为空白对照为实验提供参照，这一组的结果显示水中的检测值很低可以作为空白对照。当实用实施例1中的第三型号电极组建的细胞电穿孔装置，在上述不同的电场条件下进行转染，转染结果与采用实施例1中的第二型号电极组建的细胞电穿孔装置一致。当采用实施例1中的第五型号电极组建的细胞电穿孔装置，在上述不同的电场条件下进行转染，结果与采用实施例1中的第二型号电极组建的细胞电穿孔装置一致。当采用实施例1中的第六型号电极组建的细胞电穿孔装置，在上述不同的电场条件下进行转染，结果与采用实施例1中的第二型号电极组建的细胞电穿孔装置一致。
(二)、贴壁RAW264.7巨噬细胞电穿孔转染pGL3-luc实验，转染方法包括如下步骤：
(1)细胞电穿孔前处理：将细胞电穿孔容器和镀金表面硅纳米柱状电极浸泡于75％乙醇中进行灭菌处理，取出后，放置于超净台中自然风干，待用；
(2)将经前处理的镀金表面硅纳米柱状电极放置在6孔板中；
(3)将RAW264.7细胞用培养基吹打下来，将细胞转移至15mL离心管中，用1000g速度离心5min，用培养基重悬细胞，保证最终浓度为4*107个/mL，取100μL细胞滴加在6孔板中的镀金表面硅纳米柱状电极上，放置在培养箱中培养3-4h，保证细胞在镀金表面硅纳米柱状电极贴壁生长；
(4)取出6孔板，用PBS清洗细胞，注意不要将细胞从镀金表面硅纳米柱状电极上冲下来，然后将带有细胞的镀金表面硅纳米柱状电极插入细胞电穿孔容器中；
(5)向BTX商用电转液中加入pGL3-luc质粒，质粒最终浓度为0.08μL，向细胞电穿孔容器中加入配置好的200μL的BTX商用电转液；
(6)按照实施例1中的方法进行组装细胞电穿孔装置；
(7)取6孔板，每孔加入2mL细胞培养基，将其置于37℃细胞培养箱中预热；
(8)设置电压、波形、脉宽和周期等参数，接通电源，进行细胞电穿孔实验；
(9)取出镀金表面硅纳米柱状电极，放置在细胞培养基中过夜培养；
(10)用PBS清洗细胞后，进行荧光检测。
结果如图4所示，此处所使用的电压、波形、脉宽和周期参数为8v，10ms，2cycles。
横坐标记为water组是指水中的检测值作为空白对照为实验提供参照，这一组的结果显示水中的检测值很低可以作为空白对照。横坐标记为cell+pGL3组是指细胞转入pGL3质粒但未经过电穿孔操作的实验组，这一组的结果显示未经过电场作用的细胞电转染效果差作为阴性对照组。横坐标记为cell+pGL3+siNWs组是指将硅纳米柱、细胞和pGL3质粒共同置于细胞电转液中，未经做电穿孔操作的实验组，这一组的结果显示单纯用硅纳米柱状电极与细胞和质粒共同作用没有转染效果。横坐标记为5μm组是指采用实施例1中的第一型号电极构建的细胞电穿孔装置进行转染，结果显示第一型号电极的转染效果较差，仍需要进一步改进。横坐标记为10μm组是指采用实施例1中的第二型号电极构建的细胞电穿孔装置进行转染，结果显示第二型号的电极转染效果很好，相较于第一型号电极有很大的进步。横坐标记为15μm组是指采用实施例1中的第三型号电极构建的细胞电穿孔装置进行转染，结果显示第三型号的电极转染效果也很好，相较于第一型号电极有很大的进步。横坐标记为20μm组是指采用实施例1中的第四型号电极构建的细胞电穿孔装置进行转染，结果显示第四型号的电极转染效果稍有减弱，相较于第二和第三型号电极略有逊色，但相比于第一型号电极转染效果很好。此外，当采用实施例1中的第五型号电极组建的细胞电穿孔装置，在电压、波形、脉宽和周期参数为8v，10ms，2cycles，转染结果与采用实施例1中的第二型号电极组建的细胞电穿孔装置一致。此外，当采用实施例1中的第六型号电极组建的细胞电穿孔装置，在电压、波形、脉宽和周期参数为8v，10ms，2cycles，转染结果与采用实施例1中的第三型号电极组建的细胞电穿孔装置一致。
(三)、以平板电极和氧化铜杂乱纳米线电极分别组装细胞电穿孔装置，转染RAW264.7细胞效果对比
所使用的平板电极通过购买获得，厂商为宁波赛邦国际贸易有限公司、产品型号为8英寸IC级半导体单晶硅片。组装细胞电穿孔装置的具体方法参见实施例1。
氧化铜杂乱纳米线电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)将铜网裁剪成电极的形状，利用压片机压平。
(2)将铜网放入石英坩埚中，放置于加热炉中，在气压为0.03MPa真空度的大气氛围中，以一定的升温速率分别升高温度至500℃。保温时间分别为2h。
(3)加热完毕后，将铜网在加热炉内随炉冷却或放置在室温下冷却。
所述氧化铜杂乱纳米线电极如图5所示。
转染方法参见本实施例中的(二)，不同之处在于使用的细胞电穿孔装置的电极不同。
结果如图6所示，silicon plate electrode 8v 20ms 8 cycles组是指采用平板电极组建的细胞电穿孔装置向贴壁RAW264.7巨噬细胞中电穿孔转染pGL3-luc，结果显示利用硅平板电极转染的情况下转染效果一般。silicon nanopillars electrode 8v 20ms 8cycles组是指采用本发明实施例1中第二型号电极组建的细胞电穿孔装置向贴壁RAW264.7巨噬细胞中电穿孔转染pGL3-luc，结果显示利用第二型号电极组建的细胞电穿孔装置转染细胞的效果较平板电极有飞跃式的提升。Cuo nanowires electrode 8v 20ms 8 cycles组是指采用所述氧化铜杂乱纳米线电极组建的细胞电穿孔装置向贴壁RAW264.7巨噬细胞中电穿孔转染pGL3-luc，结果显示氧化铜纳米线虽然对细胞转染转染有所帮助但是效果没有第二型号电极好。
(四)、本发明细胞电穿孔装置与商用电转仪转染效果对比
转染方法参见本实施例中的(二)，不同之处在于使用的细胞电穿孔装置的电极不同。通过试验发现，如图7所示，细胞需求量方面：左图显示商用电转仪每次电转染实验需要细胞的量在1*107个以上，而右图显示本发明细胞电穿孔装置应用过程中每次电穿孔实验需要细胞的量在2*106左右，远远低于商用电转仪。
如图8所示，左图结果显示，商用电转仪在电转染过程中会造成大量细胞死亡，死亡细胞形成团块；右图显示，本发明细胞电穿孔装置应用过程中基本不会造成细胞死亡。因此，对比来看本发明细胞电穿孔装置的优势体现在，细胞需求量小，细胞损伤小，对稀有细胞类似于PBMC或者人血分离的免疫细胞可以减少电转染实验过程中，对细胞的浪费。
实施例3细胞电穿孔装置转染悬浮细胞
运用实施例1所构建的细胞电穿孔装置转染悬浮细胞，本实施例以悬浮Jurkat细胞电穿孔转染pGL3-luc和mRNA为例说明。
一、悬浮Jurkat细胞电穿孔转染pGL3-luc实验，转染方法包括如下步骤：
(1)取出一定量的Jurkat细胞，1000g速度离心5min，弃上层清液，用1-2mLPBS重悬细胞，用细胞计数板计数，再次用1000g速度离心5min，弃上层清液，用BTX商用电转液重悬，细胞最终为4*107个/mL；
(2)向细胞悬液中加入待转染的pGL3-luc质粒，保证质粒的最终浓度为0.08μg/μL；
(3)按照实施例1中的方法进行组装细胞电穿孔装置；
(4)取6孔板，每孔加入2mL细胞培养基，将其置于37℃细胞培养箱中预热；
(5)设置电压、波形、脉宽和周期等参数，每个细胞电穿孔容器中加入100μL与质粒混合好的细胞悬液；
(6)接通电源，进行细胞电穿孔实验，将电穿孔的细胞转移至6孔板中，放置在细胞培养基中过夜培养；
(7)用PBS清洗细胞后，进行荧光检测。
二、悬浮Jurkat细胞电穿孔转染mRNA实验，转染方法包括如下步骤：
(1)对实验过程中使用到的枪头，EP管，超纯水等必需品进行RNase Free处理；
(2)取出一定量的Jurkat细胞，1000g速度离心5min，弃上层清液，用PBS清洗吹打细胞，用计数板计数，再次1000g速度离心5min，弃上层清液，用BTX商用电转液重悬，保证细胞最终为4*107个/mL；
(3)向细胞悬液中加入体外转录的mRNA，保证mRNA最终浓度最低为0.08μg/μL；
(4)按照实施例1中的方法进行组装细胞电穿孔装置；
(5)取6孔板，每孔加入2mL细胞培养基，将其置于37℃细胞培养箱中预热；
(6)设置电压、波形、脉宽和周期等参数，每个细胞电穿孔容器中加入100μL与mRNA混匀的细胞悬液；
(7)接通电源，进行细胞电穿孔实验，转移转染好的细胞至预热好培养基的6孔板中，放置在细胞培养基中过夜培养；
(8)用PBS清洗细胞后，进行荧光素酶检测。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种镀金表面硅纳米柱电极，所述电极以硅片为基底，所述硅片包括第一表面和第二表面，所述硅片的第一表面上具有若干个纳米柱状凸起，各个纳米柱状凸起之间存在间隙，所述硅片的第一表面上及各纳米柱状凸起上均包覆有镀金层。
2.根据权利要求1所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，所述硅片呈正方型。
3.根据权利要求2所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，所述硅片的边长为5～15mm。
4.根据权利要求1所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，所述第一表面上的纳米柱状凸起的直径为0.8～1.2μm。
5.根据权利要求1所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，所述第一表面上的纳米柱状凸起的高度为4～8μm。
6.根据权利要求1所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，各纳米柱状凸起之间的圆心间距为5～20μm。
7.根据权利要求1所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，所述镀金层的厚度为50～200nm。
8.根据权利要求1所述的镀金表面硅纳米柱电极，其特征在于，每平方毫米的硅片表面上含有2601～40401个所述纳米柱状凸起。
9.如权利要求1～8之任一项所述镀金表面硅纳米柱电极在制备细胞电穿孔装置中的用途。
10.一种细胞电穿孔装置，至少包括一个电转染控制电路、两个如权利要求1～8之任一项所述镀金表面硅纳米柱电极以及一个细胞电穿孔容器。
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