CN109385370A - 一种血管支架的快速内皮化设备及其方法 - Google Patents

一种血管支架的快速内皮化设备及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血管支架的快速内皮化设备及其方法。本发明在血管支架的表面滴敷内皮细胞悬液，血管支架的内外侧分别设置金属棒和金属圆筒，并浸没在培养基中，通过金属棒和金属圆筒为血管支架施加脉冲电场，使得血管支架处于均匀的电场中；控制脉冲电场的脉冲宽度、电场强度、脉冲频率以及脉冲激发个数，通过物理电刺激调控内皮细胞的增殖过程，以提高内皮细胞在血管支架表面的内皮化速度，最终达到抑制血管内再狭窄的目的。

Description

一种血管支架的快速内皮化设备及其方法
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种血管支架的快速内皮化设备及其方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们的生活方式也有了很大的改变，由于心血管疾病引起的死亡已经成为当代人的首要死因。目前，血管内介入治疗已将成为心血管疾病的重要手段之一，金属裸支架的植入可以有效改善血管狭窄引起的问题。但是裸支架的植入会引起平滑肌细胞的增殖，从而导致术后血管再狭窄的发生。药物洗脱支架和金属裸支架相比，可以显著减少血管再狭窄和新生内膜增生的危险，然而，药物洗脱支架改善了血管再狭窄的同时，但也抑制了内皮化的过程，因此受损血管的修复也被延误了，最终导致了晚期血栓和一些其他的并发症。研究表明，解决这个问题的关键在于创造血管支架与血液的良好接触面，即形成完整的血管内皮层，实现支架的内皮化过程。
支架内皮化的效果取决于种植的内皮细胞的数目、细胞在支架上面的黏附率、贴壁细胞暴露于血流之后的保留率。其中如何提高细胞在支架上面的黏附率是目前急需解决的问题。细胞与材料之间的黏附过程分为两个阶段：贴附过程和黏附过程。其中贴附过程是非常迅速的，是细胞和材料之间的一些物理、化学作用，如范德华力、离子力等所引起的，目前主要采取旋转培养的方法使细胞与血管支架表面充分接触、贴附。黏附过程则是由材料与一些生物活性分子如细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用而引起的，是十分关键的过程。只有当细胞和材料之间发生适当的黏附，才能在材料上进行铺展和生长，乃至分化、增殖。
发明内容
针对以上现有技术中存在的问题，本发明提出了一种血管支架的快速内皮化设备及其方法；本发明采用纳秒脉冲电场，对涂敷在支架表面的内皮细胞进行刺激，以提高内皮细胞在支架表面的内皮化速度，最终达到抑制血管再狭窄的目的。
纳秒脉冲电场因为具有短脉宽(ns)，高场强(kV/cm)，低能量(mJ/cc)等优点，在肿瘤治疗、基因转染、细胞内钙离子调控、细胞膜通透性调控等众多生物医学领域的应用潜力引起了学者们的广泛关注。在近期的研究中，我们发现脉冲能够有效促进梭梭树种子的萌发、软骨细胞的增殖以及阿维菌素的增产。
本发明的一个目的在于提出一种血管支架的快速内皮化设备。
本发明的血管支架的快速内皮化设备包括：培养皿、固定架、固定梁、金属棒、金属圆筒和脉冲电场发生装置；其中，在管状的血管支架的表面滴敷有内皮细胞悬液；在血管支架内设置金属棒；在血管支架外设置金属圆筒；金属棒、血管支架和金属圆筒的中轴线共轴，三者通过固定架固定；血管支架的内径大于金属棒的半径；血管支架的外径小于金属圆筒的内径，从而在血管支架与金属棒之间以及血管支架与金属圆筒之间有空隙；培养皿中盛有培养基；血管支架浸没在培养基中，并通过固定梁水平固定；金属棒和金属圆筒分别电学连接至脉冲电场发生装置的正极和负极，脉冲电场发生装置产生脉冲电场，在金属棒与金属圆筒之间形成均匀的电场，使得血管支架的各点电场相同；脉冲电场对细胞产生不同的生物学效应，通过控制脉冲电场的脉冲宽度、电场强度、脉冲频率以及脉冲激发个数，采用物理电刺激内皮细胞悬液，能够使内皮细胞的胞内游离的钙离子浓度和活性氧自由基含量显著提高，同时提高内皮细胞培养基中一氧化氮的含量，钙离子浓度的升高能够激活休眠细胞进入细胞周期进行分裂，活性氧自由基和一氧化氮作为信号分子调控内皮细胞的生理过程，以调控内皮细胞的增殖过程，从而加速血管支架内皮化。
内皮细胞悬液的浓度为1×107～5×107个/ml。
脉冲电场为非热效应的脉冲电场序列。
脉冲电场的脉冲宽度为10～300ns，具体可为100ns。脉冲电场的电场强度为5～20kV/cm，具体可为5kV/cm，10kV/cm，20kV/cm。脉冲电场的脉冲频率为0.1Hz～4Hz，具体可为1Hz。实施脉冲电场的脉冲激发个数为10～50个，具体可为10个。
固定架为可调节的固定架，根据血管支架的内径调整固定架的内径，从而满足不同血管支架固定需要。
本发明的另一个目的在于提供一种血管支架的快速内皮化方法。
本发明的血管支架的快速内皮化方法，包括以下步骤：
1)将内皮细胞悬液滴在管状的血管支架的表面；
2)将金属棒设置在血管支架内，将金属圆筒设置在血管支架外，金属棒、血管支架和金属圆筒的中轴线共轴，通过固定架将三者固定；
3)培养皿中盛放培养基，将血管支架浸没在培养基中，并通过固定梁将血管支架水平固定；
4)金属棒和金属圆筒分别电学连接至脉冲电场发生装置的正极和负极；
5)脉冲电场发生装置产生脉冲电场，在金属棒与金属圆筒之间形成均匀的电场，使得血管支架的各点电场相同，控制脉冲电场的脉冲宽度、电场强度、脉冲频率以及脉冲激发个数，通过物理电刺激调控内皮细胞的增殖过程，从而加速血管支架的内皮化；
6)将浸泡有物理电刺激后携带内皮细胞的血管支架的培养皿置于CO2培养箱中培养。
在步骤1)中，内皮细胞悬液的浓度为1×107～5×107个/ml。
在步骤5)中，脉冲电场的脉冲宽度为10～300ns；脉冲电场的电场强度为5～20kV/cm；脉冲电场的脉冲频率为0.1Hz～4Hz；脉冲激发个数为10～50个。
在步骤6)中，培养的时间为24～48h。
本发明的优点：
本发明在血管支架的表面滴敷内皮细胞悬液，血管支架的内外侧分别设置金属棒和金属圆筒，并浸没在培养基中，通过金属棒和金属圆筒为血管支架施加脉冲电场，使得血管支架处于均匀的电场中；控制脉冲电场的脉冲宽度、电场强度、脉冲频率以及脉冲激发个数，通过物理电刺激调控内皮细胞的增殖过程，以提高内皮细胞在血管支架表面的内皮化速度，最终达到抑制血管内再狭窄的目的。
附图说明
图1为本发明的血管支架的快速内皮化设备的一个实施例的示意图；
图2为本发明通过固定架固定金属棒、血管支架和金属圆筒的示意图；
图3为本发明的血管支架的快速内皮化设备的固定架的一个实施例的示意图；
图4为猪髖动脉内皮细胞形态的显微镜图；
图5为本发明的血管支架的快速内皮化方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。
脉冲电场发生装置是对细胞进行刺激的装置，它可以对细胞悬液，固体瘤等进行刺激，通过施加不同的刺激，可以产生不同的生物学效应，包括增殖、分化、抑制和凋亡。
本发明引入了纳秒脉冲功率技术，利用场强、脉宽、频率和激发个数可控的脉冲电场，通过物理电刺激调控内皮细胞的增殖过程，从而达到加速血管支架内皮化的目的。
实施例一
如图1所示，本实施例的血管支架的快速内皮化设备包括：培养皿1、固定架3、固定梁2、金属棒4、金属圆筒6和脉冲电场发生装置；其中，在管状的血管支架5的表面滴敷有内皮细胞悬液；在血管支架内设置金属棒4；在血管支架外设置金属圆筒6；金属棒、血管支架和金属圆筒的中轴线共轴，三者通过固定架3固定；血管支架的内径大于金属棒的半径；血管支架的外径小于金属圆筒的内径，从而在血管支架与金属棒之间以及血管支架与金属圆筒之间有空隙，如图2所示；培养皿1中盛有培养基；血管支架浸没在培养基中，并通过固定梁2水平固定架；金属棒4和金属圆筒6分别通过导线7电学连接至脉冲电场发生装置的正极和负极。
如图3所示，固定架3的侧面从内至外依次设置有金属棒固定槽31、血管支架固定槽32和金属圆筒固定槽33。在本实施例中，金属圆筒固定槽33的深度为0.2mm；血管支架固定槽32的深度为0.2mm。
本实施例的血管支架的快速内皮化方法，如图5所示，包括以下步骤：
1)将猪髖动脉内皮细胞(中国科学院细胞库No:GNO15)用90％RPMI164010％胎牛血清重悬，以1.1×106个的浓度接种至10cm培养皿中，放入37℃的CO2培养箱中培养，通过显微镜观察细胞形态，如图4所示，待生长至对数生长期后进行细胞传代；将处于对数生长期的内皮细胞用0.25％胰蛋白酶消化，离心后用90％RPMI1640和10％胎牛血清重悬后，即可得到所述的内皮细胞悬液，通过血细胞计数板进行计数，调整内皮细胞悬液浓度为1×107个/ml，将内皮细胞悬液滴在管状的血管支架的表面。
2)将金属棒设置在血管支架内，将金属圆筒设置在血管支架外，金属棒、血管支架和金属圆筒的中轴线共轴，通过固定架将三者固定，如图2所示。
3)通过固定梁将血管支架水平固定在培养皿中，向培养皿中加入RPMI1640培养基，直至完全淹没金属圆筒。
4)金属棒和金属圆筒分别电学连接至脉冲电场发生装置的正极和负极；
5)用脉冲功率技术对涂敷在支架表面的内皮细胞进行刺激，采用脉宽为100ns的脉冲装置，示波器显示金属棒2和金属圆筒6两极电压，调整两电极之间的场强为5kV/cm，频率为1HZ，脉冲激发个数为10下。
6)将浸泡有物理电刺激后携带内皮细胞的血管支架的培养皿置于CO2培养箱中培养24小时后观察支架表面内皮化情况。
本发明血管支架的快速内皮化方法的制备过程均进行了相应的理化性能和生物学特征检测，结果表明血管支架符合设计要求。表一是内皮化血管支架的生物学特征。
表一
实施例二
内皮细胞悬液、培养基以及快速内皮化设备与实施例一相同。
在本实施例中，用脉冲电场对滴敷在支架表面的内皮细胞进行刺激，施加脉宽为10ns的脉冲电场，示波器显示金属棒和金属圆筒之间的电压，调整两电极之间的场强为5kV/cm，频率为1HZ，脉冲激发个数为10下。将刺激后携带内皮细胞的支架置于CO2培养箱中培养24后观察支架表面内皮化情况。
对本发明快速内皮化方法后的血管支架，进行了相应的理化性能和生物学特征的检测，结果表明符合设计要求。
最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (9)

1.一种血管支架的快速内皮化设备，其特征在于，所述快速内皮化设备包括：培养皿、固定架、固定梁、金属棒、金属圆筒和脉冲电场发生装置；其中，在管状的血管支架的表面滴敷有内皮细胞悬液；在血管支架内设置金属棒；在血管支架外设置金属圆筒；所述金属棒、血管支架和金属圆筒的中轴线共轴，三者通过固定架固定；所述血管支架的内径大于金属棒的半径；血管支架的外径小于金属圆筒的内径，从而在血管支架与金属棒之间以及血管支架与金属圆筒之间有空隙；所述培养皿中盛有培养基；血管支架浸没在培养基中，并通过固定梁水平固定；所述金属棒和金属圆筒分别电学连接至脉冲电场发生装置的正极和负极，脉冲电场发生装置产生脉冲电场，在金属棒与金属圆筒之间形成均匀的电场，使得血管支架的各点电场相同；脉冲电场对细胞产生不同的生物学效应，通过控制脉冲电场的脉冲宽度、电场强度、脉冲频率以及脉冲激发个数，采用物理电刺激内皮细胞悬液，能够使内皮细胞的胞内游离的钙离子浓度和活性氧自由基含量显著提高，同时提高内皮细胞培养基中一氧化氮的含量，钙离子浓度的升高能够激活休眠细胞进入细胞周期进行分裂，活性氧自由基和一氧化氮作为信号分子调控内皮细胞的生理过程，以调控内皮细胞的增殖过程，从而加速血管支架内皮化。
2.如权利要求1所述的快速内皮化设备，其特征在于，所述内皮细胞悬液的浓度为1×107～5×107个/ml。
3.如权利要求1所述的快速内皮化设备，其特征在于，所述脉冲电场为非热效应的脉冲电场序列。
4.如权利要求1所述的快速内皮化设备，其特征在于，所述脉冲电场的脉冲宽度为10～300ns；脉冲电场的电场强度为5～20kV/cm；脉冲电场的脉冲频率为0.1Hz～4Hz；脉冲激发个数为10～50个。
5.如权利要求1所述的快速内皮化设备，其特征在于，所述固定架为可调节的固定架，根据血管支架的内径调整固定架的内径。
6.一种血管支架的快速内皮化方法，其特征在于，所述快速内皮化方法包括以下步骤：
1)将内皮细胞悬液滴在管状的血管支架的表面；
2)将金属棒设置在血管支架内，将金属圆筒设置在血管支架外，金属棒、血管支架和金属圆筒的中轴线共轴，通过固定架将三者固定；
3)培养皿中盛放培养基，将血管支架浸没在培养基中，并通过固定梁将血管支架水平固定；
4)金属棒和金属圆筒分别电学连接至脉冲电场发生装置的正极和负极；
5)脉冲电场发生装置产生脉冲电场，在金属棒与金属圆筒之间形成均匀的电场，使得血管支架的各点电场相同，控制脉冲电场的脉冲宽度、电场强度、脉冲频率以及脉冲激发个数，通过物理电刺激调控内皮细胞的增殖过程，从而加速血管支架的内皮化；
6)将浸泡有物理电刺激后携带内皮细胞的血管支架的培养皿置于CO2培养箱中培养。
7.如权利要求6所述的快速内皮化方法，其特征在于，在步骤1)中，内皮细胞悬液的浓度为1×107～5×107个/ml。
8.如权利要求6所述的快速内皮化方法，其特征在于，在步骤5)中，脉冲电场的脉冲宽度为10～300ns；脉冲电场的电场强度为5～20kV/cm；脉冲电场的脉冲频率为0.1Hz～4Hz；脉冲激发个数为10～50个。
9.如权利要求6所述的快速内皮化方法，其特征在于，在步骤6)中，培养的时间为24～48h。
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