CN104383610A - 血管移植物内皮化方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血管移植物内皮化方法，包括以下步骤：垂直固定一管状的血管支架，使该血管支架位于流式细胞仪的喷嘴下方，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，并使该血管支架电性连接到一接地电位；在该血管支架的内腔产生一旋转电场，使来自该喷嘴的不连续液滴落入该内腔时，这些液滴中含目标细胞的带电液滴在该内腔发生偏转，做离轴运动到达血管支架的内表面；以及在来自该喷嘴的液滴落入该内腔的过程中，带动该血管支架直线向下移动，使带电液滴达到血管支架在垂直方向上的不同位置。

Description

血管移植物内皮化方法和设备

技术领域

本发明涉及组织工程与再生医学技术领域，尤其是涉及一种可控、有序的血管移植物内皮化方法和设备。

背景技术

随着生活水平提高和人们生活方式的改变，心血管疾病已经逐渐成为当代人的首要死因，而外科技术及材料工程学的进展使得应用人造血管移植物替代病变血管治疗心血管疾病成为可能。目前，临床需要的血管移植物数量逐年递增。现有病变血管置换及搭桥术中所用血管移植物多来自患者自身非病变血管，如大隐静脉、内乳动脉等。应用自身血管作为移植物的缺点主要有二：一是造成患者非病变部位的损伤，增加患者痛苦和医疗成本；二是心血管疾病具有全身系统性病变的趋势，相当一部分患者无法提供可用于移植的非病变自体血管。因此，开发方便可用的人造血管移植物成为科研上亟待解决的问题，具有良好的市场化潜力。然而，由于血栓形成等因素的存在，小口径人造血管移植物(直径小于等于6毫米)的远期通畅率无法得到保证，从而限制了小口径人造血管在临床的广泛应用。研究表明，解决这一问题的关键在于创造人造血管移植物与血液的良好接触面，即形成完整的血管内皮层。此外，要制造临床可用的人造血管移植物，其制造过程还应具有操作方便、高效、无污染、可在需要使用时迅速获得等特点。对现有人造血管构建过程中内皮细胞种植(内皮化)的研究主要运用了如下的几类技术：

1、(配合生物胶等表面改性成分的)静态种植技术。此类方法为最传统的内皮种植方法，是将细胞悬液滴落或注射到支架内表面，利用重力作用使细胞粘附到支架材料上。这一过程高度依赖操作者的个人经验，种植效率相对较低且无法使内皮细胞完全覆盖支架内表面。

2、应用移植物旋转离心力或真空抽吸力的动态种植技术。离心力和真空抽吸力的运用减少了细胞种植的操作步骤，能快速将细胞和支架复合在一起。但离心力和抽吸力在一定程度上降低了细胞活力，因而增加了对细胞量的要求。同时，由于离心力和真空抽吸力会将内皮细胞吸入支架内壁，也无法确保在支架内壁上形成均一的单层内皮，从而可能带来血管内膜增生等问题影响内皮功能。

3、细胞薄片种植技术。将细胞长期培养后形成的细胞薄片卷成管状，继续培养直至卷筒边缘生长融合。这种方法能保证内皮细胞完全覆盖支架内表面，但需时长，消耗人力物力，不符合大规模产业化生产的要求。

4、带静电支架-细胞黏附种植或磁力种植。利用异种电荷或磁极相吸的原理可促进细胞在支架表面的黏附，种植效率较高，但此类种植方法对细胞总量要求高，种植过程中内皮细胞浪费大，不够经济。

5、真空旋转种植技术。这种方法实际上是利用移植物旋转离心力或真空抽吸力两种动态种植技术的组合，优点是相比之下种植效率得到了进一步提高，能够在更短时间内使更多的细胞和支架复合，但同时它也综合了两者的缺点，需要浪费大量的细胞和可能造成内膜增生。

总的来看，以上细胞种植技术虽然在很大程度上实现了细胞化需时短、操作方便、高效、无污染等目标，但从实际应用的角度考虑，目前的技术还不能满足产业化过程所需的低成本、可大量生产及可进行内皮化过程的标准化控制等要求，而组织工程血管产品的标准化生产更是在质量监管中不可缺少的环节。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简化的、可控的血管移植物内皮化方法和设备。

本发明的一个方面提供一种血管移植物内皮化方法，包括以下步骤：垂直固定一管状的血管支架，使该血管支架位于流式细胞仪的喷嘴下方，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，并使该血管支架电性连接到一接地电位；在该血管支架的内腔产生一旋转电场，使来自该喷嘴的不连续液滴落入该内腔时，这些液滴中含目标细胞的带电液滴在该内腔发生偏转，做离轴运动到达血管支架的内表面；以及在来自该喷嘴的液滴落入该内腔的过程中，带动该血管支架直线向下移动，使带电液滴达到血管支架在垂直方向上的不同位置。

在本发明的一实施例中，在该血管支架的内腔产生该旋转电场前还包括：通过调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴。

在本发明的一实施例中，调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴的步骤包括：从至少3个位于不同水平高度的不同角度发射激光照射该喷嘴和该血管支架之间的中轴线；以及调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度，使从每一束激光的相同水平高度的侧面拍摄到每一束激光照亮该喷嘴的不连续液滴。

在本发明的一实施例中，根据含目标细胞的带电液滴在该血管支架的内表面的布植密度设定该旋转电场的旋转角速度。

在本发明的一实施例中，根据含目标细胞的带电液滴在该血管支架的内表面的布植密度设定该血管支架直线向下移动的速度。

本发明的另一方面提出一种血管移植物内皮化设备，包括固定架、旋转电场发生元件以及固定架推进装置。固定架用于垂直固定一管状的血管支架，使该血管支架位于流式细胞仪的喷嘴下方并且该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，其中该固定架电性连接到一参考电位。该旋转电场发生元件设于该固定架周围，用以在该血管支架的内腔产生一旋转电场，使来自该喷嘴的液滴落入该内腔时，所述液滴中含目标细胞的带电液滴在该内腔发生偏转，做离轴运动到达血管支架的内表面。该固定架推进装置连接该固定架，在来自该喷嘴的液滴落入该内腔的过程中，带动该固定架及该血管支架直线向下移动，使带电液滴达到血管支架在垂直方向上的不同位置。

在本发明的一实施例中，上述的血管移植物内皮化设备还包括可调节底座，用于放置该固定架推进装置，用于调整该固定架的水平位置和倾斜程度。

在本发明的一实施例中，上述的血管移植物内皮化设备还包括共轴校准装置，用以检测该喷嘴的中轴线与该喷嘴的中轴线是否共轴。

在本发明的一实施例中，该共轴校准装置包括至少三个激光发射器以及至少三个摄像头。至少三个激光发射器布置在不同的水平高度和角度上，用以发射激光照射该喷嘴和该血管支架之间的中轴线。至少三个摄像头一一对应地布置在各激光发射器的相同水高度的侧面，以检测各束激光是否照亮该喷嘴的不连续液滴。

本发明与现有的细胞种植技术相比较有如下优点：

1、将细胞分选和血管移植物内皮化的过程融为一体，简化了以往的操作步骤，缩短了从细胞分离到细胞种植的时间，能降低此过程中发生污染的可能性；

2、可控的内皮化过程，包括种植细胞的种类、数量及细胞在血管支架内表面分布的均匀程度和密度，便于对血管移植物内皮化进行标准化研究和质量控制；

3、分选出的每个目的细胞都物尽其用，能最大程度地减少构建个体化血管移植物所需的细胞量，降低对患者的损伤程度；

4、细胞种植效率高，数分钟即可完成，方便快捷，缩短了个体化血管移植物从构建到临床应用的时间，有望在临床推广使用；

5、可针对不同口径、长度的血管支架材料调整参数设置及相应种植条件，能应用于个体化血管移植物的商品化生产。

附图说明

为让本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明，其中：

图1示出本发明一实施例的设备构成示意图。

图2示出本发明一实施例的内皮化过程原理示意图。

图3示出图2的俯视角度。

图4示出本发明一实施例的固定架推进装置结构图。

图5示出本发明一实施例的丝杆滑块结构图。

图6示出本发明一实施例的滑块导引装置结构图。

图7示出本发明一实施例的共轴校准装置结构。

图8A-8D示出本发明一实施例的可调节底座结构。

图9示出旋转电场产生的原理示意图。

图10示出单个含目标细胞液滴的运动轨迹。

图11示出多个含目标细胞液滴的运动轨迹和着陆点分布。

具体实施方式

本发明的下述实施例描述一种基于流式细胞分选原理的内皮化方法和设备。

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。流式细胞仪的分选过程为：细胞经过流式细胞仪时，由于高频振荡的作用，在离开流式细胞仪的喷嘴处断裂为一个个不连续的微小液滴，每个液滴中包含一个细胞。用激光照射带有特定表面分子标志的细胞时，可激发出能被光电转换器识别的发射光。随后，由充电电路根据识别出的发射光信号判断出目标细胞所在液滴并对其充电，充电后的液滴在飞行过程中受电场力作用发生偏移，可准确到达无菌的细胞收集管中。目前流式细胞分选应用于细胞生物学等领域的目标细胞分选纯化。

本发明的实施例所描述的血管移植物内皮化方法引入了流式细胞分选技术，利用转速可控的电场，配合可移动支架，将内皮细胞分选过程和种植过程整合，从而在分选过程中直接将得到的目标细胞有序地种植在支架内表面，以达到优化血管移植物内皮化过程的目的。

根据本发明的一实施例，内皮化方法可包括下列步骤。首先，垂直固定管状的血管支架，使该血管支架位于流式细胞仪的喷嘴下方，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，并使该血管支架电性连接到一接地电位。在该血管支架的内腔产生一旋转电场，使来自该喷嘴的不连续液滴落入该内腔时，这些液滴中含目标细胞的带电液滴在该内腔发生偏转，做离轴运动到达血管支架的内表面。并且，在来自该喷嘴的液滴落入该内腔的过程中，带动该血管支架直线向下移动，使带电液滴达到血管支架在垂直方向上的不同位置。

可通过一个导电的固定架来垂直固定这一血管支架，并利用一个推进装置来推进此固定架作单向直线移动。

为使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，可将此固定架及推进装置放置在一个可调节底座上，调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度来实现上述的共轴。

为了精确地实现共轴，可引入一个共轴校准装置，它可以通过检测来自喷嘴的液滴的下落位置及方向来确定喷嘴的中轴线与血管支架的中轴线是否共轴。例如，可在不同水平高度分别布置至少3个激光发射器，激光发射器均对准喷嘴与血管支架间的中轴线，但激光发射器的角度不同。这样，当来自喷嘴的液滴位于该中轴线时，从位于不同水平高度的不同角度发射激光均可照亮喷嘴的液滴。而当来自喷嘴的液滴不位于该中轴线时，会有激光未照亮这些液滴。与各激光发射器处于相同水平高度的摄像头或者其它检测设备可检测液滴是否被照亮。调整血管支架的水平位置和/或倾斜程度，可使从每一束激光的相同水平高度的侧面拍摄到每一束激光照亮该喷嘴的不连续液滴。

本发明的原理简述如下：采用大小恒定的旋转电场来替换流式细胞仪原有的静止的偏转电场，再利用一套可导电的固定架将用于构建血管移植物的血管支架固定，使之与流式细胞仪喷嘴中轴线共轴，让所有喷出的液滴均进入支架材料腔内。在旋转电场作用下，含目标细胞的带电液滴(即目标液滴)在血管支架的内腔内发生偏转，做离轴运动到达血管支架的管壁内表面。此时，液滴所带电荷由导电的血管支架-固定架体系接地线消除。固定架体系以一定速度(根据每秒分选出目标细胞数决定)做单向匀速移动，最终实现含目标细胞的液滴均匀分布在支架材料内腔面的目的。经过后续细胞-支架材料复合体体外预适应过程后，内皮细胞由球状铺展开并形成细胞连接，最后完全覆盖裸露的血管支架内腔面，形成具有抗凝血功能的完整血管内皮层。

图1示出本发明一实施例的设备构成示意图。参照图1所示，本发明的一实施例的内皮化设备100可包括旋转电场发生元件110、固定架120、固定架推进装置130、可调节底座140及共轴校准装置150。旋转电场发生元件110用以代替流式细胞仪200原有的两个偏转电极。

图2、图3示出本发明一实施例的内皮化过程原理示意图，其中图3为图2的俯视图。参照图2所示，在血管支架10上方设置流式细胞仪200，其喷嘴210向下对着血管支架10的中轴x，用来喷出含细胞的液滴11。血管支架10周围布置一个旋转电场发生元件110，用于产生旋转速度可调的旋转电场，最终通过电场力的变化控制目标细胞的运动轨迹与其在血管支架10的内表面的落点分布。

作为举例，旋转电场发生元件110可以包括如图2所示的4个电极板111-114，通以相位差90度的正弦电压的方法产生旋转电场。图9示出旋转电场产生的原理示意图，通过信号发生部115、逆变部116和整流部117来产生4个相位差为90度的正弦电压，分别施加到4个电极板111-114。尽管图2和图9示出旋转电场发生元件110包括4个电极板，但本发明不对旋转电场发生元件110的具体结构作任何限制，任何能够产生旋转速度可调的旋转电场的装置都可作为本实施例的旋转电场发生元件110。

固定架120用于固定血管支架10，使血管支架10保持垂直状态。固定架120可具有上固定圈121、下固定圈122、上连杆123、下连杆124、以及移动杆125。每一固定圈121、122的内缘可设有多个支脚126。通过上固定圈121和下固定圈122可将血管支架10固定、撑起、拉直成圆筒形。固定架120不对血管支架10上端的入口和下端的出口有任何遮挡。这样，依靠旋转电场对液滴的选择来决定液滴是留在血管支架10内表面，还是通过整个血管支架10的内腔后飞出。

上连杆123、下连杆124分别将上固定圈121、下固定圈122连接到移动杆125。通过移动杆125的上下移动，可使整个固定架120以及固定于其上的血管支架10随之上下移动。固定架120的长度(沿图2中X方向)可根据血管支架10长度不同进行调整。并且，固定架120可根据血管支架10内径而更换上固定圈121、下固定圈122。

由于含目标细胞的液滴是带电的，固定架120应具有将血管支架10上因落入液滴而累积的电荷导出的能力。在本实施例中，整个固定架120都由导电材料制成，并且连接到地(GND)。在其他实施例中，固定架120中，至少使用导电材料制作与血管支架10接触的上固定圈121、下固定圈122，并且将上固定圈121、下固定圈122均连接到地(GND)。

固定架推进装置130用来带动固定架120作上下移动。在本实施例中，固定架推进装置130由电机-滚珠丝杠副及其控制电路实现。图4示出本发明一实施例的固定架推进装置结构图。参考图4所示，固定架推进装置130包括载台131、丝杆132、丝杆滑块133、滑块导引装置134。载台131设有电机，通过电机转动来带动丝杆132。滑块导引装置134垂直立于载台131上，丝杆132位于滑块导引装置134内部。丝杆132的表面带有螺纹。图5示出本发明一实施例的丝杆滑块的结构，图6示出本发明一实施例的滑块导引装置的结构。参考图5和图6所示，丝杆滑块133的第一部分133a位于滑块导引装置134内，且通过与滑块导引装置134的配合，实现上下垂直运动。在丝杆滑块133的第一部分设有螺纹孔133c。丝杆132穿过丝杆滑块133的螺纹孔133c。在旋转的丝杆132推动下，丝杆滑块133可以产生缓慢的垂直方向的匀速直线运动。丝杆滑块133的第二部分133b露出于滑块导引装置134之外，并与固定架120的移动杆125上的短杆126刚性连接。

固定架固定支架时可根据所需支架长度不同进行调整，通过设定电机转速使丝杆滑块-固定架实现垂直方向匀速直线运动，使血管支架沿中轴线匀速直线向下移动。

图10示出本发明一实施例的共轴校准装置结构。共轴校准装置150位于固定架120的正上方，且通过血管支架接头158来连接固定架120。血管支架接头158下端连接血管支架10，上端与共轴校准装置150刚性相连。

共轴校准装置150的作用是确保流式细胞仪的液流从血管支架10的中轴处进入，且进入血管支架10时的速度方向与血管支架中轴重合。

在本实施例中，共轴校准装置150包括三个细光束激光发射器151、152、153和微型摄像机154、155、156。其中激光发射器151和微型摄像机154，激光发射器152和微型摄像机155，激光发射器153和微型摄像机156分别为一对。每一对都位于不同的水平高度。三个激光发射器151、152、153的发射角度预先校准为：从依次相差120度的角度，水平经过固定架120的中轴线。三个摄像机154、155、156从侧面拍摄每一个激光发射器的激光头是否照亮了未经偏转的液流。如果三个激光发射器的激光头同时照亮液流，则可判定液流进入血管支架10的位置和速度方向均满足要求。

图8A-8D示出可调节底座的结构，其中图8A为可调节底座的俯视图，图8B示出可调节底座的水平y方向调节机构，图8C示出可调节底座的水平z方向调节机构，图8D示出可调节底座的设备固定台。参照图8A-8D所示，可调节底座140位于整个装置的底部，和共轴校准装置150配合使用。可调节底座140可包括座体141、倾斜度定位螺丝142、水平位置调节区143、螺丝固定架144、第一水平定位螺丝组145、水平滑块146、第一引导杆147a、第二引导杆147b、第二水平定位螺丝组148、设备固定台149。

座体141可为各种平面形状，例如图8A所示的三角形。座体141大致呈水平放置，倾斜度定位螺丝142设置在座体141上，可用于调节座体141的倾斜度。倾斜度定位螺丝142的数量可根据需要选定。

座体141上具有水平位置调节区143，图8B所示的水平y方向调节机构可设置在这一区域。水平y方向调节机构可包括螺丝固定架144、第一水平定位螺丝组145以及第一引导杆147a。第一引导杆147a可穿过螺丝固定架144，在第一导引杆147a的中段设置水平滑块146。第一水平定位螺丝组145设在第一引导杆147a两端，用以调节水平滑块146在y方向的位置。

如图8C所示，水平z方向调节机构可包括水平滑块146、第二引导杆147b以及第二水平定位螺丝组148。第二引导杆147b可穿过水平滑块146，在第二引导杆147b的中段设置设备固定台149。第二水平定位螺丝组148设在第二引导杆147b两端，用以调节设备固定台149在z方向的位置。这样，设备固定台149将可在y、z方向移动。

如图8D所示，设备固定台149上具有导引槽149a。

可调节底座140的作用为调整整个固定架120以及共轴校准装置150的水平位置和倾斜程度，使共轴校准装置150的三个激光发射器151、152、153的激光头同时照亮未经偏转的液流，使液流进入血管支架10时的位置和速度方向符合预设的初始条件的要求。这一预设的初始条件将在后面引入数学模型来说明。

概括来说，本发明一实施例的血管内皮化设备的内皮化过程如下：固定血管支架10，调节底座140直到共轴校准装置150表明血管支架10的中轴线与流式细胞仪的喷嘴210的中轴线共轴。在旋转电场发生元件110间产生旋转电场。进入血管支架10中的带电目标液滴在电场力作用下，将做离轴运动到达支架材料内表面。目标液滴所带的电荷将由与血管支架10相连并接地的固定架120消除。非目标液滴则不受电场力作用，通过整个血管支架10的内腔后飞出。在后文中将证明，目标液滴将在血管支架10的内壁均匀整齐的着陆。经过后续细胞-支架材料复合体体外预适应过程后，内皮细胞由球状铺展开并形成细胞连接，最后将完全覆盖裸露的血管支架10的内腔面。最终实现目标细胞在血管移植物的支架材料上均匀种植即内皮化的目的。

下面通过建立带有目标细胞液滴的动力学模型来说明目标液滴如何落在血管支架10的内壁。

以带电的目标液滴为研究对象，可将目标液滴在血管支架内腔受电场作用的飞行过程抽象成一带电质点在旋转电场力、重力和空气阻力作用下的运动。参考系定义如图10所示：以重锤线方向喷嘴中心点所在直线为x轴，正方向指向重力方向；原点定为电场上边缘平面与x轴的交点。考虑到实际情况中，细胞的种植密度应该能使不同种植处的细胞间能够相互形成连接。因此，在确定液滴落点(即种植点)时不仅要计算着陆点水平间距(与电场旋转速度有关)，还应计算固定架120连同血管支架10一同的移动速度v_c。参数定义及实际取值范围详见下表1。为保持与本设备实际测量、设计过程的一致，涉及流式细胞仪的参数均以Beckman Coulter公司的MoFlo^TM分选型流式细胞仪为准：

表1：参数定义及实际取值范围/数量级

根据牛顿第二定律，带电液滴的运动情况可以用下面的运动学方程组进行描述：

$\left\{\begin{array}{c}{y}^{\′\′}\left(t\right)=\frac{\mathrm{Eq}}{m}\cos \left(\mathrm{\ωt}\right)-\frac{\mathrm{cf}\·\mathrm{\ρ}\·\mathrm{\π}{d}_1^2}{8m}{\left(y^{\′}\left(t\right)\right)}^2\·\mathrm{sgn}\left(y^{\′}\left(t\right)\right)\\ z^{\′\′}\left(t\right)=\frac{\mathrm{Eq}}{m}\sin \left(\mathrm{\ωt}\right)-\frac{\mathrm{cf}\·\mathrm{\ρ}\·\mathrm{\π}{d}_1^2}{8m}{\left(z^{\′}\left(t\right)\right)}^2\·\mathrm{sgn}\left(z^{\′}\left(t\right)\right)\\ x^{\′\′}\left(t\right)=g-\frac{\mathrm{cf}\·\mathrm{\ρ}\·\mathrm{\π}{d}_1^2}{8m}{\left(x^{\′}\left(t\right)\right)}^2\end{array}\right.---\left(1\right)$

血管支架内表面方程为式(2)

y²+z²＝r²   (2)

将(1)式与式(2)联立，并将绝对时间t换成相对表达形式t₁+t₀，就得到了方程组(3)。

$\left\{\begin{array}{c}{y}^{\′\′}(t_0+t_1)=\frac{\mathrm{Eq}}{m}\cos ({\mathrm{\ωt}}_0+{\mathrm{\ωt}}_1)-\frac{\mathrm{cf}\·\mathrm{\ρ}\·\mathrm{\π}{d}_1^2}{8m}{\left(y^{\′}(t_0+t_1)\right)}^2\·\mathrm{sgn}\left(y^{\′}(t_0+t_1)\right)\\ z^{\′\′}(t_0+t_1)=\frac{\mathrm{Eq}}{m}\sin ({\mathrm{\ωt}}_0+{\mathrm{\ωt}}_1)-\frac{\mathrm{cf}\·\mathrm{\ρ}\·\mathrm{\π}{d}_1^2}{8m}{\left(z^{\′}(t_0+t_1)\right)}^2\·\mathrm{sgn}\left(z^{\′}(t_0+t_1)\right)\\ x^{\′\′}(t_0+t_1)=g-\frac{\mathrm{cf}\·\mathrm{\ρ}\·\mathrm{\π}{d}_1^2}{8m}{\left(x^{\′}(t_0+t_1)\right)}^2\\ y^2(t_0+t_1)+z^2(t_0+t_1)=r^2\end{array}\right.---\left(3\right)$

因为目标液滴刚进入电场的坐标为原点且速度为V₀垂直向下，故该方程组的初始条件为：

$\left\{\begin{array}{c}{y}^{\′}\left(t_0\right)=0\\ y\left(t_0\right)=0\\ z^{\′}\left(t_0\right)=0\\ z\left(t_0\right)=0\\ x^{\′}\left(t_0\right)=V_0\\ x\left(t_0\right)=0\end{array}\right.---\left(4\right)$

由于目标液滴成单行逐个进入电场，因此每个液滴进入电场的时刻t₀取值唯一且各不相同。因此根据每一个目标液滴的t₀，即可求得其在血管支架内表面的着陆点坐标、着陆时间以及着陆速度。并且有如下的一些关系存在：

目标液滴的着陆点x坐标恒定不变，并且同电场强度大小E有关。E越大，目标液滴飞行时间t₁就越短，且其着陆点x坐标就越小。目标液滴着陆点y、z坐标仅与其刚进入电场时刻电场的方向ωt₀有关。

所有目标液滴的运动轨迹形状都相同。轨迹的朝向仅与目标液滴刚进入电场时刻电场的方向ωt₀有关。

目标液滴着陆点在yz平面上的投影围绕着原点，以r为半径，ω为角速度做匀速圆周运动。为了使目标液滴水平间距保持为d₂，取

血管支架以速度v_c不停倒退，目标液滴着陆点在支架内壁留下的轨迹将变成一条螺线。为了使螺纹间距为d₂，取

在描述了液滴的运动模型后，可以理解的是，对于不同口径、长度的血管支架材料，可在确定希望达到的最优内皮细胞分布密度后，计算总共所需的细胞量，从而调整流式细胞仪分选速度、支架移动速度和电场强度大小、旋转角速度等，从而可应用于不同型号的组织工程血管内皮化过程。小口径血管通常定义为直径小于或等于6毫米的血管，本发明实施例的设备适用于长度小于或等于10厘米、直径大于或等于2毫米的小口径血管。

采用Matlab进行仿真，单个目标液滴在血管支架腔内(图10所示圆柱面)的运行轨迹如图10中曲线A所示，轨迹终端圈出的位置即为其着陆点：

多个目标液滴在血管支架腔内的运动情况如图11所示，左图中的箭头为拍摄时刻电场强度瞬时方向，圆柱面是长度20cm，内直径2mm的血管支架10的内表面。可见多个目标液滴所构成的轨迹与单个目标液滴的运行轨迹类似，但是发生了弯曲。右图是左图虚线框部分的放大。图中的标记是目标液滴的着陆点。其中标出的两个相邻的着陆点坐标单位为米。可见目标液滴的着陆点分布整齐均匀。

上述的内皮化过程是可控的，其可控性体现在：

1、种植细胞的种类及数量精确可控。细胞与特异性抗体(例如，可利用单克隆抗体分选内皮细胞)结合后，在分选型流式细胞仪喷嘴处经高频振荡，产生不连续液滴，经激光照射后，流式细胞仪可精确识别含有目标细胞的液滴并对其充电，同时计算细胞数及细胞表面分子表达水平等信息。同时，通过流式细胞仪的用户界面，操作者可以决定种植细胞的种类、个数，从而为组织工程血管内皮化过程的质控提供了直观可行的方法。

2、细胞在血管支架内表面的分布的均一性和密度可控。经过充电的目标液滴在电场力作用下分布到支架内表面，细胞分布的密度与支架直径、支架移动速度、电场旋转角速度以及流式细胞仪分选速度等一系列参数有关。相关参数定义及实际取值范围详见上表1。可证明细胞在血管支架内表面着陆的轨迹是螺线，因此其分布具有均一性和规律性，通过设定固定架移动速度为旋转电场角速度为使相邻两个目标液滴在垂直和水平方向上的表面距离均为d₂，即使支架内表面完全被细胞覆盖，达到最好的内皮化效果。

以下给出一个设置具体参数的实际应用范例：

例如，计划从人体皮下脂肪组织提取内皮细胞构建一段长10cm，内直径4mm的组织工程血管。消化组织获得细胞悬液后用带荧光的抗人CD34抗体标记目标细胞后，将细胞悬液放入分选型流式细胞仪样品仓内上机分选(仍以Beckman Coulter公司的MoFloTM分选型流式细胞仪为准)。研究表明，CD34阳性细胞在人体皮下脂肪组织消化后得到的细胞悬液中占1％～6％，在此取平均值3.5％，设分选模式为富集模式，则实际分选速度约为80％最大分选速度，即每秒分选的总细胞数应为70000*80％＝56000个。每秒分选的目标细胞数为56000*3.5％＝1960个，即n的取值。按照支架内表面内皮细胞最大密度计算，内皮细胞粘附铺展后直径约20微米，即d2。对于长10cm，内直径4mm的支架材料。根据旋转电场角速度求得：

$\mathrm{Vc}=\frac{1960\×{(2\×{10}^{-5})}^2}{2\×\mathrm{\π}\×2\×{10}^{-3}}=6.239\×{10}^{-5}$ 米/秒，旋转电场角速度 $\mathrm{\ω}=\frac{1960\×2\×{10}^{-5}}{2\×{10}^{-3}}=19.6$ 弧度/秒。

因此所需时间为0.1/Vc＝1602.9秒，即约26.7分钟。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种血管移植物内皮化方法，包括以下步骤：

垂直固定一管状的血管支架，使该血管支架位于流式细胞仪的喷嘴下方，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，并使该血管支架电性连接到一接地电位；

在该血管支架的内腔产生一旋转电场，使来自该喷嘴的不连续液滴落入该内腔时，这些液滴中含目标细胞的带电液滴在该内腔发生偏转，做离轴运动到达血管支架的内表面；以及

在来自该喷嘴的液滴落入该内腔的过程中，带动该血管支架直线向下移动，使带电液滴达到血管支架在垂直方向上的不同位置。

2.如权利要求1所述的血管移植物内皮化方法，其特征在于，在该血管支架的内腔产生该旋转电场前还包括：

通过调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴。

3.如权利要求2所述的血管移植物内皮化方法，其特征在于，调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度，使该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴的步骤包括：

从至少3个位于不同水平高度的不同角度发射激光照射该喷嘴和该血管支架之间的中轴线；以及

调整该血管支架的水平位置和/或倾斜程度，使从每一束激光的相同水平高度的侧面拍摄到每一束激光照亮该喷嘴的不连续液滴。

4.如权利要求1所述的血管移植物内皮化方法，其特征在于，根据含目标细胞的带电液滴在该血管支架的内表面的布植密度设定该旋转电场的旋转角速度。

5.如权利要求1所述的血管移植物内皮化方法，其特征在于，根据含目标细胞的带电液滴在该血管支架的内表面的布植密度设定该血管支架直线向下移动的速度。

6.一种血管移植物内皮化设备，包括：

固定架，用于垂直固定一管状的血管支架，使该血管支架位于流式细胞仪的喷嘴下方并且该血管支架的中轴线与该喷嘴的中轴线共轴，其中该固定架电性连接到一参考电位；

旋转电场发生元件，设于该固定架周围，用以在该血管支架的内腔产生一旋转电场，使来自该喷嘴的液滴落入该内腔时，所述液滴中含目标细胞的带电液滴在该内腔发生偏转，做离轴运动到达血管支架的内表面；以及

固定架推进装置，连接该固定架，在来自该喷嘴的液滴落入该内腔的过程中，带动该固定架及该血管支架直线向下移动，使带电液滴达到血管支架在垂直方向上的不同位置。

7.如权利要求6所述的血管移植物内皮化设备，其特征在于，还包括可调节底座，用于放置该固定架推进装置，用于调整该固定架的水平位置和倾斜程度。

8.如权利要求6所述的血管移植物内皮化设备，其特征在于，还包括共轴校准装置，用以检测该喷嘴的中轴线与该喷嘴的中轴线是否共轴。

9.如权利要求8所述的血管移植物内皮化设备，其特征在于，该共轴校准装置包括：

至少三个激光发射器，布置在不同的水平高度和角度上，用以发射激光照射该喷嘴和该血管支架之间的中轴线；以及

至少三个摄像头，一一对应地布置在各激光发射器的相同水高度的侧面，以检测各束激光是否照亮该喷嘴的不连续液滴。