CN103320877B - 一种可降解组织工程三维支架的制备方法及设备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可降解组织工程三维支架的制备方法及用于制造该三维支架的静电纺丝设备，静电纺丝设备主要包括高压电源、计算机、设有微量供液泵的精密供液系统、金属喷射头、X‑Y精密载物平台、接收板、CMOS摄像机和显微镜载物台。通过该静电纺丝设备可以制备得到具有较高孔隙率、良好力学性能和生物相容性、降解速率可控、能够悬浮于液面的组织工程三维支架，制备方法简单，整个过程易于操作。

Description

一种可降解组织工程三维支架的制备方法及设备

技术领域

本发明涉及组织工程和微纳制造技术领域，尤其涉及一种可降解组织工程三维支架的制备方法及用于制造该三维支架的静电纺丝设备。

背景技术

人体组织损伤、缺损会导致功能障碍，传统的修复方法是自体组织移植术，虽然可以取得满意疗效，但它是以牺牲自体健康组织为代价的办法，会导致很多并发症及附加损伤；人的器官功能衰竭，采用药物治疗、暂时性替代疗法可挽救部分病人生命，但供体器官来源极为有限，因免疫排斥反应需长期使用免疫抑制剂，由此而带来的并发症有时是致命的。为解决这些问题提出组织工程，通过开发具有生物活性的人工替代物，以恢复、维持或改善组织、器官的功能。

组织工程是生命科学领域的研究重点，其核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程的基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的三维支架上形成复合物，将细胞-三维支架复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在三维支架逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。

三维支架是组织工程的关键要素，是细胞获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，是新的具有形态和功能的组织、器官的基础。其主要功能包括以下两点：1、为体外构建工程组织或器官提供三维的细胞生长支架，使细胞间形成适宜的空间分布和细胞联系；2、提供特殊的生长和分化信号，诱导细胞的定向分化和维持细胞分化。组织工程三维支架必须具有良好的生物兼容性、良好的生物降解性、较大的孔隙率和比表面积以及足够的力学性能。经过多年的发展，已经确立不同的三维支架材料和制备方法，得到的三维支架能够基本满足组织工程的要求。

有一些三维支架已经应用于临床之上，但现有产品依然存在问题：1、支架的力学性能较差，容易发生变形或者断裂；2、支架的降解周期为定值，只适用于组织工程特定的领域；3、所得到三维支架的孔隙率难以控制，随机性较大。

静电纺丝设备主要由四部分组成：液体供给装置、喷射装置、高压电源、接收装置。随着各国对静电纺丝技术研究的深入，目前静电纺丝设备种类繁多，根据液体供给装置、喷射装置、高压装置和接收装置的不同，可以将静电纺丝装置分为多种类型。接收装置对三维支架的形成起着关键作用，根据接收装置的不同，静电纺丝设备可以分为平板式、碟状式、转鼓式、笼状式、辅助电极式等，应用较多的是转鼓式和平板式。不同类型接收装置可以获得不同结构三维支架，但都面临同样的问题：1、静电纺丝过程受到诸多因素的影响，存在极大的不稳定性；2、静电纺丝过程未能实现自动化和可视化；3、所制备三维支架结构单一，在组织工程应用方面存在一定局限性。

因此，针对上述技术问题，有必要提供一种具有改良结构的静电纺丝设备用以制备组织工程三维支架，以克服上述缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于制备可降解组织工程三维支架的静电纺丝设备，以及基于该设备制备可降解组织工程三维支架的方法，制备得到具有较高孔隙率、良好力学性能和生物相容性、降解速率可控、能够悬浮于液面的组织工程三维支架。

近年来，控制技术、微电子技术和精密仪器技术的快速发展为解决当前静电纺丝设备面临的问题提供了技术支持。本发明基于静电纺丝原理设计的静电纺丝设备，集先进控制技术、微电子技术和精密仪器技术于一体，实现了自动化、可视化操作。利用该设备可以实现稳定的静电纺丝过程，从而解决现有设备存在的问题，制备直径为微米、纳米尺度的纤维，进而得到组织工程三维支架。

具体的，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的静电纺丝设备主要包括高压电源、计算机、设有微量供液泵的精密供液系统、金属喷射头、X-Y精密载物平台、接收板、CMOS摄像机和显微镜载物台，所述高压电源的外控接口通过设于计算机内部的数据采集卡与计算机通讯接口相连接；所述精密供液系统通过通讯接口与计算机相连，外接有输流管，所述输流管末端接有金属喷射头，微量供液泵、输流管以及金属喷射头形成单向通路；所述X-Y精密载物平台、CMOS摄像机分别与计算机通过通讯接口相连接；所述接收板固定于X-Y精密载物平台上，并与高压电源负极相连接，所述高压电源正极与金属喷射头相连接，所述显微镜载物台安装于X-Y精密载物平台上，并设有生物显微镜。

优选的，所述的高压电源提供电压开启、关闭以及幅值大小可控的0～10KV直流电压。

优选的，所述的微量供液泵供液精度为1nl。

优选的，所述的X-Y精密载物平台运行速度为2cm/s。

优选的，所述的接收板为ITO（Indium Tin Oxides，氧化铟锡）导电玻璃。

本发明也提供了一种基于上述的静电纺丝设备制备可降解组织工程三维支架的方法，包括下述步骤：

1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物均匀溶解于有机溶剂中，制备电纺溶液，注入精密供液系统；

2、在接收板表面涂一层聚氧化乙烯（PEO）水溶液，并装夹于X-Y精密载物平台上；

3、根据待制备三维支架纤维形状的要求，选择金属喷射头内径，并将金属喷射头装夹于三自由度机械手上；

4、开启各个系统，调整三自由度机械手来确定金属喷射头的位置，金属喷射头和接收板之间的距离设定为3～8cm；

5、缓慢增大电压值并在计算机控制窗口观察金属喷射头尖端溶液的变化，直到出现稳定纺丝过程；

6、设定X-Y精密载物平台移动行走路线，静电纺丝过程自动进行，静电纺丝的纤维均匀沉积于接收板上；

7、静电纺丝过程结束之后拆下接收板，接着将接收板浸入水中，三维支架从接收板表面脱落。

优选的，步骤1中，所述的有机溶剂为氯仿、四氢呋喃、丙酮中的一种或者两种以上的混合物。

优选的，步骤1中，所述的电纺溶液浓度为0.2g/ml～0.4g/ml。

优选的，步骤5中，所述的电压值为4000V～9000V。

优选的，重复步骤3、4、5来选择合适的金属喷射头内径、纺丝间距和电压值。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在以下几个方面：

1、三维支架的降解速率可控，可用于组织工程不同领域。

2、纤维在不同方向交错排列，进而层层叠加，通过近似编织方法而得到的三维支架具有较好的力学性能。

3、根据具体细胞培养的要求可调节电压以及接收尺寸，进而得到不同直径的纤维，纺丝时间的长短决定了三维支架的厚度。

4、本发明的静电纺丝设备可以提供自动化、可视化和稳定的静电纺丝过程，能够制备不同类型组织工程三维支架。

5、ITO玻璃表面涂覆的聚氧化乙烯层不仅为沉积其上的纤维提供缓冲的作用，很好保护了纤维整体的形貌，而且在水中能够很快的与纤维支架分离，进而快速无损的得到纤维支架。

6、细胞培养支架能够漂浮于细胞培养液中，为细胞培养提供了必要条件。

7、细胞培养支架的制备所用的方法简单，整个过程易于操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的静电纺丝设备结构示意图；

图2是通过本发明的静电纺丝设备制备的三维支架的SEM图片。

具体实施方式

用于静电纺丝也即构成三维支架的原材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)，简称PLGA)，PLGA具有良好的生物相容性、生物降解性。聚乳酸-羟基乙酸共聚物由两种单体乳酸和羟基乙酸聚合而成，其降解程度随单体比例不同而有差异，乙交酯比例越大越易降解，通过调整单体比例，进而改变聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解时间。本发明利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物这一特性来制备降解度可控的组织工程三维支架。

为了获得一种可控降解组织工程三维支架，设计并组建静电纺丝设备，该设备由控制系统、视觉系统、X-Y移动平台接收系统、可控电源系统和精密供液系统组成。视觉系统包括生物显微镜、显微镜控制器和工业摄像机，利用显微镜将物体放大，通过摄像机采集图片信息并传输给计算机进行数据的分析和处理，实现可视化操作。X-Y移动平台接收系统包括X-Y移动平台、控制器和接收板夹持机构，运行速度为2cm/s。可控电源系统包括高压直流电源、AD转换卡和控制器，该系统可以提供0～10KV直流电压，电压开启、关闭以及幅值大小可控。精密供液系统由精密注射泵和输流管等组成，该系统为静电纺丝设备的供液装置，供液精度为1nl。控制系统包括计算机和所用到的软件，利用计算机将各个系统组合为整体，通过软件编程建立控制界面。利用该界面对静电纺丝仪器进行控制，可以实现以下操作：

1、通过视觉系统实现可视化操作，显微镜放大倍数可以自由切换，在低倍下寻找实物然后切到高倍进行观察；可以对试验过程进行录像或拍照，并可以对照片的亮度、对比度和光线进行调节实现图片处理功能。这些功能给实验提供了便利，对三维支架的制备有着重要意义。

2、利用控制界面可以定义三自由度机械手的移动方向、位移大小和行走速度，实现精准定位。喷丝头装夹于机械手之上，通过机械手调整喷丝头和接收板之间的距离，具有操作方便、精度高等优点。

3、利用控制界面可以定义X-Y移动平台的移动方向、位移大小和行走速度。接收板装夹于X-Y移动平台，通过控制界面选择各参数便可获得预先设定的轨迹。

4、利用控制界面可以设置电源的参数，控制电压启闭，调节幅值大小以及喷印的时间。电压是静电纺丝得以实现的基本条件，因此在设定时间内通过该界面控制电压的开启和停止便可以实现对静电纺丝过程的控制。

如图1所示，本发明的静电纺丝设备包括高压电源1、计算机2、设有微量供液泵的精密供液系统4、金属喷射头6、X-Y精密载物平台7、接收板8、CMOS摄像机和显微镜载物台，高压电源1的外控接口通过设于计算机2内部的数据采集卡与计算机2通讯接口相连接；精密供液系统4通过通讯接口3与计算机2相连，外接有输流管5，输流管5末端接有金属喷射头6，微量供液泵、输流管5以及金属喷射头6形成单向通路；X-Y精密载物平台7、CMOS摄像机分别与计算机2通过通讯接口相连接；接收板8固定于X-Y精密载物平台7上，并与高压电源1负极相连接，高压电源1正极与金属喷射头6相连接，显微镜载物台安装于X-Y精密载物平台7上，并设有生物显微镜，CMOS摄像机设于X-Y精密载物平台7上，CMOS摄像机与生物显微镜图中均未示出。

基于图1所示的静电纺丝设备，本发明的降解可控组织工程三维支架的制备方法，具体包括以下步骤：

1、制备电纺溶液，待溶剂溶解均匀后将溶液注入精密供液系统4；

2、在接收板8表面上涂一层聚氧化乙烯水溶液9，然后装夹于X-Y精密载物平台7之上；

3、根据三维支架纤维形状的要求，选择金属喷射头6内径（如60μm、110μm、160μm），将金属喷射头6装夹于三自由度机械手上；

4、开启各个系统，利用调整三自由度机械手来确定金属喷射头6的位置，金属喷射头6和接收板8之间的距离设定为3～8cm；

5、缓慢增大电压值并在计算机2控制窗口观察金属喷射头6尖端溶液的变化，直到出现稳定纺丝过程；

6、设定X-Y精密载物平台7的移动行走路线，静电纺丝过程自动进行，使得静电纺丝的纤维能够均匀沉积于接收板8上；

7、静电纺丝过程结束之后拆下接收板8，接着将接收板8浸入水中，三维支架从接收板8脱落。

步骤1所述电纺溶液的溶质即为PLGA，溶剂可以是氯仿、四氢呋喃和丙酮中的一种或者任意两种以上的混合物，溶液的浓度为0.2g/ml～0.4g/ml。

步骤2所述接收板8为ITO导电玻璃，该玻璃具有较强导电能力，连接电压负极形成高压电场；另外，该导电玻璃具有高透过率，方便显微镜下观察电纺纤维的分布和三维支架的结构。

由于各个参数和外界环境对静电纺丝的影响较大，为了获得稳定的纺丝过程，需要多次重复步骤3、4、5来选择合适的金属喷射头6内径、纺丝间距和电压值。参数的选择如下：纺丝间距一般在3～8cm范围内，电压值一般在4000V～9000V之间。

通过步骤7将三维支架从接收板8上取下，原理是步骤2中在接收板8表面涂了一层聚氧化乙烯水溶液作为基底，电纺纤维附着于聚氧化乙烯之上。当接收板8浸入水后，聚氧化乙烯溶于水，所得的三维支架便会自动脱落，漂浮于水面上。

从如图2的SEM图片中，可以观察到纤维在不同方向交错排列，进而层层叠加，通过近似编织方法而得到的三维支架应当具有较好的力学性能。

综上所述，利用本发明的静电纺丝设备可以制备得到具有较高孔隙率、良好力学性能和生物相容性、降解速率可控、能够悬浮于液面的组织工程三维支架，制备方法简单，整个过程易于操作。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种静电纺丝设备制备可降解组织工程三维支架的方法，所述静电纺丝设备，包括高压电源(1)、计算机(2)、设有微量供液泵的精密供液系统(4)、金属喷射头(6)、X-Y精密载物平台(7)、接收板(8)、CMOS摄像机和显微镜载物台，所述高压电源(1)的外控接口通过设于计算机(2)内部的数据采集卡与计算机(2)通讯接口相连接；所述精密供液系统(4)通过通讯接口(3)与计算机(2)相连，外接有输流管(5)，所述输流管(5)末端接有金属喷射头(6)，微量供液泵、输流管(5)以及金属喷射头(6)形成单向通路；所述X-Y精密载物平台(7)、CMOS摄像机分别与计算机(2)通过通讯接口相连接；所述接收板(8)固定于X-Y精密载物平台(7)上，并与高压电源(1)负极相连接，所述高压电源(1)正极与金属喷射头(6)相连接，所述显微镜载物台安装于X-Y精密载物平台(7)上，并设有生物显微镜，其特征在于，所述制备可降解组织工程三维支架的方法包括下述步骤：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物均匀溶解于有机溶剂中，制备电纺溶液，注入精密供液系统(4)；

(2)在接收板(8)表面涂一层聚氧化乙烯(PEO)水溶液(9)，并装夹于X-Y精密载物平台(7)上；

(3)根据待制备三维支架纤维形状的要求，选择金属喷射头(6)内径，并将金属喷射头(6)装夹于三自由度机械手上；

(4)开启各个系统，调整三自由度机械手来确定金属喷射头(6)的位置，金属喷射头(6)和接收板(8)之间的距离设定为3～8cm；

(5)缓慢增大电压值并在计算机(2)控制窗口观察金属喷射头(6)尖端溶液的变化，直到出现稳定纺丝过程；

(6)设定X-Y精密载物平台(7)移动行走路线，静电纺丝过程自动进行，静电纺丝的纤维均匀沉积于接收板(8)上；

(7)静电纺丝过程结束之后拆下接收板(8)，接着将接收板(8)浸入水中，三维支架从接收板(8)表面脱落。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的有机溶剂为氯仿、四氢呋喃、丙酮中的一种或者两种以上的混合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的电纺溶液浓度为0.2g/ml～0.4g/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述的电压值为4000V～9000V。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：重复步骤(3)、(4)、(5)来选择合适的金属喷射头内径、纺丝间距和电压值。