CN105813602A - 3维生物支架 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制造三维(3D)生物支架的设备和方法；用其制造的3D生物支架；以及所述3D生物支架在制造用于治疗诸如但不限于半月板损伤之损伤的植入物中的用途。

Description

3维生物支架

技术领域

本发明涉及用于制造三维(3D)生物支架的设备和方法、使用所述方法制成的3D生物支架以及所述3D生物支架在制造用于治疗诸如但不限于半月板损伤之损伤的植入物中的用途。

背景技术

膝的半月板是两个半月形纤维软骨盘，位于胫骨与股骨之间的膝关节中，改善稳定性和帮助膝的旋转运动，充当减震器并且以滑液的形式向关节软骨提供营养。在人类中，半月板结构不仅仅出现在膝关节中，还存在于肩锁关节、胸锁关节和颞下颌关节中。

半月板通常是无血管结构，主要的血液供应被限制在外周，由滑液通过扩散来向半月板的内部部分提供营养。受限的血液供应阻碍了纤维软骨组织(fibro-cartilagenoustissue)的再生能力，导致愈合过程长并且通常不完全，这通常需要外科手术来移除或替换受损的组织。

半月板病变是骨科行医中最频繁的损伤之一，并且可以由膝的外伤或扭伤造成。运动员(尤其是从事身体接触运动(contactsports)的那些)处于半月板撕裂的风险中。然而，在老年人中，当组织随着年龄的增加而弱化时，也会发生半月板的损伤。

目前的治疗方法是关节镜半月板切除术(arthroscopicmeniscectomy)，这是移除膝中受损半月板的全部或一部分，或者在可能的情况下修复半月板的微创外科手术操作。但是，半月板组织的移除通常导致骨关节炎的进行性发展，其涉及关节(包括关节软骨和软骨下骨骼)的退化。骨关节炎是痛苦的、使人衰弱的病况，是关节炎最常见的形式。骨关节炎是不可治愈的。在疾病的早期阶段或较轻的形式的疾病中，已知诸如物理医疗和镇痛药的治疗选项是有效的。但是，骨关节炎是退化性过程，并且在严重的情况下需要进行外科手术操作如膝或髋置换来为患者提供一些缓解。在美国，骨关节炎是非常普遍的，并且是慢性残疾的主要原因。据估计，在2005年，约两千七百万美国人患有骨关节炎，并且二分之一的人在其一生中的某个阶段会患上骨关节炎。

全部或部分半月板切除术具有严重缺陷，这些严重缺陷已经将研究的关注点转移向生物材料和生物工程领域。组织工程提供了新的治疗形式并且减少了诸如捐赠器官排斥和免疫抑制药物依赖的副作用。然而，制造三维(3D)生物支架是存在问题的，因为培养中的细胞通常迁移形成二维层，而生物支架需要用作3D平台。目前用于制造3D生物支架的方法如粒子沥滤(particleleaching)、气压成型(gasforming)、3D打印或熔融沉积成型(fuseddepositionmodelling)产生3D结构，但是它们不能很好地对内部结构或分辨率进行控制。

WO2012/054195公开了用于沉积细胞和支撑材料并且从而形成具有限定的几何形状的构建体的生物打印机。通过使用该方法，申请人制造了多层血管。WO2013/040087公开了用于工程化的无生物支架的可植入组织和器官的平台及其制造方法。申请人公开了能够在培养中得以保持的骨骼肌组织的制造。

尽管组织工程方法已经取得实质性的发展，用于通过使用生物支架技术的组织工程化构建体(如合成聚合物、水凝胶、ECM组分或源于组织的材料)甚至使用细胞强化技术(cellaugmentationtechnique)来修复半月板撕裂或置换整个半月板的当前技术尚未产生持续的、可靠的长期结果。理想的半月板构建体需要在各个标准如力学(负载和润滑)、生物活性(维持细胞表型、无免疫原性、宿主组织整合)和后勤供应(人工生长半月板的供应、实用的手术植入)方面表现优异。

生物可降解聚合物生物支架已经在组织工程学中广泛地作为用于细胞增殖和后续组织再生的平台来使用。然而，用于3D生物支架制造的传统的微挤出方法由于其低分辨率而受限。电纺法(electro-spinning)是一种形式的电流体动力打印(electro-hydrodynamicprinting)，由于其在纳米/微米级水平制造高分辨率生物支架的能力，电纺法的使用尤其具有吸引力。在喷嘴与收集器之间电场的帮助下(图1a)，喷嘴中的液体带电并且被拉伸出来。随后，喷流被所施加的电力弯曲，并且随机地沉积在收集器上。所产生的微米/纳米丝通常是无序的，并且孔径小于20μm。此外，电纺丝网格是非编织的形式，其仅仅可用于诸如过滤的相对少数的应用。研究人员已经致力于通过操作电场或使用动态收集器(dynamiccollector)来修改过程，如图1b所示，使用心轴(mandrel)作为丝收集器以实现丝的对齐。实现了大部分丝在一个方向上对齐的垫，并且观察到细胞沿主丝方向附着。然而，没有实现每条丝的朝向的精确控制。此外，传统的电纺网格和生物支架二者的另一重要缺点是孔径有限，从而导致细胞繁殖速度缓慢。如大部分的体外研究所报导的，所附着的细胞仅在电纺生物支架的顶部形成单个层，并且几乎没有证据表明细胞能够向生物支架的深处生长，因为与细胞的尺寸相比，孔径较小。另一些工作者已经证明了近场电纺工艺(near-fieldelectro-spinningprocess，NFES)的能力(图1c)，其在打印过程中能够控制丝的朝向。在收集器的运动的帮助下，通过工作台控制器，丝沿着x轴和y轴沉积。尽管已经对使用NFES来制造3D聚合物生物支架进行了一些初步尝试，然而由于溶剂难以蒸发，工作总是被限制在2D图案化，并且目前不能构建3D结构。为了构建3D结构体，通常需要丝在喷嘴与收集器之间非常短的距离内快速固化，这对于基于溶剂的方法而言当然是非常具有挑战性的。电流体动力热喷流绘制技术(Electro-hydrodynamichotjetplottingtechnique)也已经用于制造高分辨率(亚10μm)3D生物支架。但是，在制造过程中需要高温来熔化聚合物，因此限制了对温度敏感之材料(即胶原、生长因子等)或具有高熔点之材料的应用。

在本研究中，我们已经开发了替选的电流体动力喷印(electro-hydrodynamicjetprinting)(在本文中称为E喷射(E-jetting))技术，并且将其用于制造具有期望的丝朝向和孔径的3D生物可降解聚酯生物支架，如聚己内酯(PCL)生物支架。结果表明通过E喷射技术在＞70％w/v的浓度下实现了固化丝，并且产生了直径20μm的均匀丝，此外，x射线衍射(XRD)和衰减全反射傅里叶变换红外(FTIR)光谱分析表明不存在对于生物可降解聚酯、PCL的物理化学变化。实现了孔径为450μm和孔隙度水平(porositylevel)为92％的生物支架。此外，初步的体外研究示出活软骨细胞附着在胶原包被的E喷射PCL生物支架的外表面和内表面上。E喷射生物支架增加了软骨细胞胞外基质(extracellularmatrix，ECM)分泌，并且来自软骨细胞的新形成的基质对生物支架的机械强度起到了重要作用。所有这些结果表明E喷射是替选的生物支架制造技术，其具有构建用于组织工程应用的具有对齐的丝和大孔径的3D生物支架的能力。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了用于制造生物支架的设备，其包含：正压储存器，所述正压储存器在使用中容纳聚酯溶液，并且还与喷嘴流体连通，所述溶液从所述喷嘴离开；工作台，所述工作台位于所述喷嘴附近并且适于沿X、Y和Z三个轴相对于所述喷嘴移动，并且所述工作台在使用中支撑所述溶液在其上沉积的基底；以及电源，所述电源用于在所述喷嘴与所述工作台或所述基底之间产生电场，使得离开所述喷嘴的溶液作为连续丝流动。

在本发明的一个优选实施方案中，所述聚酯溶液是可生物降解或不可生物降解的。此外，所述聚酯溶液可以包含天然聚合物材料，例如但不限于胶原。

在本发明的另一优选实施方案中，所述储存器被保持在0kPa至400kPa的正压下，并且最理想地为150kPa至250kPa，包括其间所有1kPa的区间，更理想地在操作设备时使用200kPa的正压。理想地，在制造支架时将压力保持在恒定水平。在一优选实施方案中，所述储存器还包含用于施加负压以用于在要撤回(retract)聚酯溶液的情况下使用的负压装置。更优选地，如本领域的技术人员已知的，通过气动装置来提供所述正压装置或所述负压装置。

在本发明的又一优选实施方案中，所述喷嘴的内径为80μm至510μm，并且最理想地为100μm至300μm，包括其间所有1μm的区间；更理想地，在操作设备时使用500μm或200μm的内径。

在本发明的又一优选实施方案中，所述工作台位于所述喷嘴下方。此外，理想的是工作台靠近所述喷嘴布置，即相距1mm至10mm，包括其间所有1mm的区间，理想地为2mm。此外，理想地，工作台适于在所述喷嘴保持静止的同时沿X、Y和Z三个轴移动。或者，所述喷嘴适于在所述工作台保持静止的同时沿X、Y和Z三个轴移动。再次替选地，所述工作台适于沿所述X、Y和Z三个轴中的至少一个轴移动，并且所述喷嘴适于沿所述X、Y和Z三个轴中的其余轴移动。

本文中提及的X轴、Y轴和Z轴指代左/右、前/后和上/下。

优选地，所述工作台设置有定位构件和紧固构件之一或二者。定位构件使得放置在所述工作台上的基底能够相对于所述喷嘴(理想地，所述喷嘴的起始位置)来被定位，并且所述紧固构件确保基底一旦被定位则在生物支架制造过程中被保持在适当位置。

更优选地，所述电源使得使用者能够施加0Kv至20Kv的电压，以及更理想地施加1.5Kv至5Kv(包括其间所有0.1kv的区间)的电压，更理想地，在操作设备时施加2.2kv的电压。

在本发明的一优选设备中，所述储存器包含生物可降解聚酯溶液如聚己内酯(PCL)，但是，可以使用其它生物可降解聚酯溶液如聚(环氧乙烷)、聚乙交酯、聚(L-乳酸)或聚(丙交酯-共-乙交酯)。理想地，所述生物可降解聚酯优选地以在30％w/v至80％w/v的浓度溶解在有机溶剂中。最典型地，大于40％的浓度是优选的，以及最典型地大于50％或60％。理想地，大于65％的浓度是优选的，并且优选66％w/v、67％w/v、68％w/v、69％w/v、70％w/v、71％w/v、72％w/v、73％w/v、74％w/v、75％w/v、76％w/v、77％w/v、78％w/v、79％w/v和80％w/v(优先级逐渐增加)。

理想地，有机溶剂是乙酸，但是可以使用其它溶剂如甲酸、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇或六氟异丙醇。

在本发明的一个优选的用途中，相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第一层。然后相对于所述喷嘴移动所述基底远离所述喷嘴，从而增加所述喷嘴与所述基底之间的距离，其后再次相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第二层。通常，重复第一层和第二层的成层直到制成具有期望深度的生物支架。本领域技术人员会理解，所述基底相对于所述喷嘴的精确运动可以被自动控制，使得能够制成各种尺寸和形状的3D生物支架。

在本发明的又一优选实施方案中，所述设备包含温度控制装置，从而能够控制所沉积的或所纺织的聚酯的温度。

因此，本发明的设备还包含计算机可读介质，其具有用于执行成层方法的计算机可执行指令，该计算机可执行指令包含存储在计算机可读介质上并且适于由处理器执行的程序，其中所述程序执行以下功能：

a)相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第一层；

b)移动所述基底使其远离所述喷嘴，从而增加所述喷嘴与所述基底之间的距离；以及

c)相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第二层；

d)可选地，重复步骤a)至步骤c)直到完成3D生物支架。

在本发明的一优选方法中，步骤b)还包括在执行步骤c)之前相对于所述喷嘴旋转所述基底。理想地，旋转的角度是90°，但是其可以是根据所设计的生物支架所模仿之生物材料的结构任意选择的旋转角度。例如，生物支架可以被设计成模仿半月板、骨软骨组织、肌腱、韧带或牙本质。

在本发明的另一优选方法中，所述来回移动可以沿直线、曲线、锯齿线或波浪线进行。再次，根据所设计的生物支架所模仿之生物材料的结构来选择来回移动的性质。

例如，在本发明的一实施方案中，制造了用于治疗半月板损伤的生物支架，图2a中示出了用于打印半月板生物支架的制造方案。第一层由半圆形如1/4圆形构成，以模仿半月板的环形纤维。在铺设第一层之后，在弯曲的纤维上铺设由径向纤维构成的第二层。通过重复这前两个步骤，能够构建多层结构体。为了模仿楔形半月板，每层的环形纤维的数目逐渐减少。

根据本发明的又一方面，提供了数据载体，其包含用于执行本发明的成层方法的程序。

根据本发明的第二方面，提供了用于制造生物支架的方法，其包括：

i)在正压下提供聚酯溶液；

ii)使所述溶液离开喷嘴并且沉积在基质上；

iii)在所述喷嘴与所述基质之间产生电场，使得离开所述喷嘴的所述溶液流动成为连续丝；以及

iv)相对于所述喷嘴沿X、Y和Z三个轴中的至少一个轴移动所述基底，从而以选定方式将所述丝铺设在所述基底上以创建三维生物支架。

在本发明的一个优选方法中，相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第一层。

在本发明的另一优选方法中，移动所述基底使其远离所述喷嘴，从而增加所述喷嘴与所述基底之间的距离。

在本发明的又一更优选方法中，在移动所述基底远离所述喷嘴之后，再次来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第二层。

在本发明的一优选方法中，在沉积所述第一层之后以及在移动所述喷嘴远离所述基底之前或之后，进一步相对于所述喷嘴旋转所述基底，然后沉积所述第二层。理想地，旋转的角度是90°，但是其可以是根据所设计的生物支架所模仿之生物材料的结构任意选择的旋转角度。

在本发明的另一优选方法中，所述来回移动可以沿直线、曲线、锯齿线或波浪线进行。再次，根据所设计的生物支架所模仿之生物材料的结构来选择来回移动的性质。

在本发明的一优选方法中，重复第一层和第二层的所述成层直到制成具有期望深度的生物支架。本领域技术人员会理解，所述基底相对于所述喷嘴的精确运动可以被自动控制，使得能够制成具有各种尺寸和形状的3D生物支架。

根据本发明的另一方面，提供了3D生物支架，其包含：由聚酯制成的多个丝状层，其中所述丝的直径为3μm至50μm，包括其间所有的1μm区间，并且生物支架的厚度为200μm至5000μm，包括其间所有的1μm区间。

在本发明的一优选实施方案中，所述丝的所述直径理想地为3μm至50μm，并且理想地为10μm至30μm，最优选地为20μm。

在本发明的又一优选实施方案中，在制作半月板的情况下，所述生物支架的所述厚度理想地为200μm至5000μm，并且理想地为300μm至5000μm，最优选地大于500μm。本领域技术人员会理解，将由生物支架要模仿的生物材料的性质来确定生物支架的厚度。

在本发明的又一优选实施方案中，所述3D生物支架的孔径为100μm至500μm，并且理想地为200μm至500μm，包括其间所有的1μm区间，以及最优选地为约250μm。

在本发明的又一优选实施方案中，所述3D生物支架的孔隙度为70％至95％，以及理想地为80％至95％，包括其间所有的1％区间，以及最优选地为约90％。

优选地，以定制的方式来设置所述3D生物支架的尺寸和形状以填充限定的腔。更理想地，设置所述3D生物支架的尺寸和形状以用于半月板修复。根据图3中的示意图，在表1中示出了天然半月板的尺寸。将根据患者的半月板来定制所制造的生物支架的大小。本文中所描述的是根据本发明制造的半月板，其中其纤维直径是18.6±2.8μm，并且其孔径是360±35μm。在本发明的该实施方案中，结合关节软骨细胞或具有产生关节软骨细胞之潜能的细胞(如祖细胞或干细胞)来使用所述3D生物支架。

因此，本发明涉及3D生物支架在制造用于治疗损伤或疾病(具体地但不排他地，半月板损伤)的植入物中的用途。在本发明的另一些实施方案中，其可以用于治疗骨软骨、韧带、肌腱、牙本质、血管和皮肤的损伤或疾病。

本领域技术人员会理解，本发明能够用于制造包含多种生物材料(如细胞和生长因子)的，并且具有复杂地雕刻的内部微观结构的生物可降解且生物相容的3D生物支架，该3D生物支架被设计成模仿正常组织的属性。

除了制造复杂的3D生物支架以外，认为本发明可以用于医用植入物的包被和图案化，此外，其还可以用于将药物溶解在聚合物溶液中，使得在用作植入物时，药物散布在整个生物支架和/或医用植入物内。

本发明提供以下优点：

1.在制造过程中没有材料变性的情况下处理生物相容材料的能力；

2.产生高分辨率的并且朝向良好的微米尺寸纤维的能力(具有达到纳米级的潜力)；

3.在空间图案和朝向两个方面的纤维的精确控制，使得能够制造仿生3D组织工程生物支架；

4.在室温下的单个制造轮次中构建具有复杂微结构和多种孔隙度水平的多材料3D生物支架的潜力。

在所附权利要求中以及在本发明的前述描述中，除非由于表达语言或必要的暗示而使上下文另外要求，术语“包含”或变体如“包括”被用于表示开放式的含义，即，在本发明的各种实施方案中，规定了所声称的特征的存在，但并不排除其它特征的存在或加入其它特征。

本说明书引用的所有参考资料，包括任何专利或专利申请，都通过引用并入本文。不承认任何参考构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。

可以结合任何其它方面来描述本发明每个方面的优选特征。

通过以下实例，本发明的其它特征将变得明显。一般而言，本发明延伸到本说明书(包括所附权利要求和附图)中公开的特征的任何新颖特征或任何新颖的组合。除了其中之间不相容的情况，结合本发明具体方面、实施方案或实例所描述的特性、整体、特点、化合物或化学实体应理解为可应用于本文中描述的任何其它方面、实施方案或实例。

此外，除非另有说明，本文中所公开的任何特征都可替换为用作同样或类似目的的替选特征。

在本说明书的描述和权利要求中，除非上下文另有要求，单数包括复数。具体地，在没有数词的情况下，除非上下文另有要求，说明书应被理解为包括了复数和单数。

现在，将仅通过具体地参照以下附图以实例的方式描述本发明的一实施方案。

图1示出了(a)传统电纺工艺，(b)经修改的具有旋转收集器的电纺工艺，以及(c)近场电纺工艺的示意图。

图2示出了E喷射系统的一示意性总览图。

图2a示出了用于打印半月板生物支架的一种制造方案。

图3示出了半月板的一横截面图，具体地示出了表1中所提及的长度、宽度和周长。

图4示出了使用各种浓度的PCL溶液的打印结果，(a)10％，(b)30％，(c)50％，以及(d)70％。

图5示出了使用E喷射技术制造的高孔隙度生物支架。(a)是E喷射的定向丝的SEM图像，(b)是生物支架的SEM图像，并且(c)是生物支架的快照。

图6示出了购买的PCL生物支架和E喷射的PCL生物支架的物理化学表征，(a)是XRD图谱，并且(b)是FTIR光谱。

图7示出了生物支架上的软骨细胞反应，(a)纤维生物支架上的软骨细胞的活/死染色的CLSM图像，(b)E喷射的生物支架和对照组上的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)产量(^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.05)，(c)无细胞生物支架(0周)和细胞装载生物支架(2周、4周、6周和8周)的拉伸模量(Tensilemodulus)(^＊p＜0.05)，(d)培养20天之后的II型胶原和I型胶原产量的表达表明在这些生物支架中细胞保持了它们如同健康软骨细胞一般的正常表型。

材料和方法

材料

在本研究中，使用了平均分子量为80kDa的PCL粒料和乙酸(99.7％纯度)。通过将PCL粒料溶解在乙酸中制备了10％至70％的各种重量体积比(w/v，PCL∶乙酸)的溶液，并连续搅拌4小时以获得均匀的PCL溶液。然后将该溶液用于制造生物支架。使用直径为100mm的抛光硅片(Polishedsiliconwafer)作为基底。使用乙醇垫(ethanolpad)对这些基底进行清洁，并且在使用前使其风干。

E喷射工艺

在E喷射工艺中(图2)，将足够的PCL溶液添加到装配有内径为500μm的不锈钢喷嘴的储存器中，所述不锈钢喷嘴位于硅片上方(喷嘴-基底距离为2mm)，并且基底被放置在XYZ工作台上。使用200kPa的正压来提供恒定的溶液补充，并且将2.2kV的高直流(DC)电压施加在喷嘴与基底之间以使溶液带电，从而连续地产生丝。

通过增大电场，喷嘴端部的液滴被拉长，并且形成细射流直到液滴的表面张力被克服。如图3所示，通过XYZ工作台的移动实现了丝的定向，并且通过来回移动将连续的丝沿Y轴放置以形成第一层。类似地，沿X轴完成了第二层，并且通过针沿Z轴向上移动来重复上面的过程，直到生物支架被构建具有预定的层数。

生物支架表征

使用原子力显微镜(atomicforcemicroscope，AFM)(SPM5，SeikoInstruments)在0.1Hz的扫描频率下测量了丝的直径。使用在15kV的加速电压和10mA的电流下操作的扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM)研究了E喷射的PCL生物支架的形态。使用X射线衍射(X-raydiffraction，XRD)确定了来样PCL生物支架和E喷射的PCL生物支架的结晶度。使用了在40kV和30mA下操作的衍射计CuK_α辐射。在5°至50°的2θ范围内以0.05°的步长和20s的计数时间收集了数据。在800cm^-1至4000cm^-1的范围内以8cm^-1的分辨率进行了来样PCL和E喷射的PCL生物支架的衰减全反射傅里叶变换红外(FTIR)光谱分析，对64次扫描进行平均。为了获得E喷射的生物支架的孔隙度，通过20层的丝打印制造了孔径为500μm的三个生物支架。使用电子称(±0.1mg)对所有样本进行了称重，并且使用测微计(±1μm)测量了样本的尺寸。然后使用以下等式计算了生物支架的孔隙度：

V_s＝L×W×H(1)

${\mathrm{\ρ}}_s=\frac{M_s}{V_s}---\left(2\right)$

其中，M_s和V_s是生物支架的质量和体积；L、W和H是支架的长度、宽度和高度；ρ_s是支架的密度；ρ_PCL(1100kg/m³)是PCL的密度。

半月板特征

构建了半月板生物支架，其具有散布着径向PCL/胶原纤维的环形PCL/胶原纤维，模仿正常半月板的内部微结构。纤维的直径为18.6±2.8μm，其相比之下小于使用微挤出系统制造的具有100μm纤维直径的纤维。已经证实细纤维提高细胞附着并且调节细胞信号传导路径，从而加速细胞外基质生成。生物支架的孔径为360±35μm，其处于在生物支架内提供足够的血液和营养素传送的期望范围内，尽管会降低生物支架的机械强度。

体外研究

从1岁的猪的膝关节采集了猪软骨细胞，并且在补充有10％胎牛血清，2％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’smodifiedeagle’smedium，DMEM)中进行培养。将细胞在37℃下、在含5％的二氧化碳的气氛中进行孵育。每2天更换培养基。分离了细胞并且使细胞重悬于DMEM中，直到实现70％至80％的细胞汇合。

使用紫外(UV)光对E喷射的生物支架进行15分钟的灭菌。然后将生物支架浸没在2mg/ml的多巴胺溶液(10mM的Tris缓冲液，pH8.5)中在黑暗中过夜，其后使用超纯水来漂洗以去除未附着的多巴胺。使用胶原(0.1M，在乙酸中)完成了聚多巴胺包被的PCL生物支架上的胶原接枝(grafting)，并且在37℃的潮湿的气氛中孵育过夜。使用无菌磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersaline，PBS)溶液将生物支架冲洗两次以去除未附着的胶原，并且在种植细胞之前在无菌环境中使其风干。然后将生物支架放置到24孔板中，并且以4×10⁵细胞/cm²的密度接种了50μl的细胞等分试样。接种在24孔聚苯乙烯培养皿上的细胞(1×10⁵细胞/cm²)被用作对照组。在37℃下将已接种细胞的生物支架和对照保持在培养箱中4h，以用于细胞附着，之后将其转移至新的24孔板，并且添加了1ml培养基。在8周的细胞培养过程中，每2天更换培养基。

为了使活软骨细胞和死软骨细胞群可视化，在培养3天之后使用钙黄绿素(calcein)和溴化乙锭对生物支架进行染色。为了进行细胞生存力检查，使用具有2μmol/L的钙黄绿素的乙酰甲氧基衍生物(钙黄绿素-AM)和2μmol/L的乙啡锭均二聚物-1(ethidiumhomodimer-1，EthD-1)的Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)溶液(活/死、生存力/细胞毒性试剂盒，Invitrogen)孵育了软骨细胞/生物支架1h。钙黄绿素-AM在活细胞中呈现绿色荧光，而EthD-1在死细胞中呈现红色荧光。然后使用反向落射荧光显微镜(invertedepifluorescencemicroscope)来观察软骨细胞/生物支架。

进行了硫酸化糖胺聚糖(sGAG)产量的测量来确定细胞是否是功能性的并且能够产生软骨样细胞外基质(ECM)。在培养第7天、第14天和第21天将接种细胞的支架和对照取出，使用PBS冲洗并且在水浴中在65℃下在0.5ml的木瓜蛋白酶萃取剂中消化过夜。然后，使用Blyscan试剂盒(Biocolor，UK)确定了总sGAG产量。根据制造商的方案实施了程序。使用酶标仪(microplatereader)在656nm下测量了吸光度。

在100N的装载细胞容量下，使用桌面拉力试验机(tabletoptensiletester，Instron3345，Canton，MA)在第2周、第4周、第6周和第8周进行了无细胞的生物支架和细胞装载生物支架的拉力试验，以1mm/min的速率将样本延长至损坏。通过使用测微计测量宽度和厚度确定了生物支架的横截面积和标距长度。通过使用横截面积和标距长度，根据应力应变曲线计算了拉伸模量。重复测量了三次，并且计算了平均值。

统计分析

使用t检验确定了实验组的平均值之间存在的任何显著差异。p＜0.05时认为组之间的差异是显著的。

实施例1：PCL溶液浓度的影响

浓度在本文中指代PCL在乙酸中的重量体积比，其对于丝的形成至关重要，并且因此对生物支架的制造至关重要。在传统的电纺工艺中，最常用的PCL溶液浓度是8％至12％(Seeram等2005)，而在E喷射工艺中，在这样的低浓度(＜10％)下不产生丝(图4a)。仅在基底上出现了溶液的宽线，这归因于用于溶剂蒸发的时间不足。所打印的线的完全干燥耗时超过5min，因此不可能构建生物支架结构体。研究了将PCL溶液浓度升高至70％来研究浓度对丝生成和生物支架制造的影响，并且在此示出了结果。

使用30％的溶液能够获得PCL丝。还能够完成交替地沿x轴和y轴的200层的重复打印。但是，在将生物支架从基体分离之后，所获得的样本仅仅是厚度为47±7μm的薄膜。同一位置上的所有丝趋向于融合在一起，彼此不能清晰地区分。此外，在打印数层之后，产生了不期望的附属丝，如图4b所示(包括在插入的正方形中)。伴随的细小丝归因于由于导电溶剂在基底上的累积而产生的增强的电场。这表明仍有大量的溶剂被包裹在丝内。

随着浓度增加至50％，成功地产生了PCL丝，并且所得丝的直径是3.1±0.1μm，该直径是使用AFM测量的。在打印200层之后，实现了246±37μm的厚度，这表明增加浓度能够提高性能。但是，丝仍具有融合在一起的趋势。根据图4c，可以看到丝塌陷(包括在插入的圆形中)，这是由于溶剂没有充足的时间来蒸发。快速固化对于丝为了3D构建而跨越它们下方的设计的间隙(500μm)而言至关重要。

如图4d所示，发现在70％的浓度下实现了均匀的单条丝，并且在打印50层之后成功地构建了3D生物支架。生物支架的厚度是965±19μm。丝没有沿同一轴融合在一起，这表示丝在喷射时快速地固化。但是，丝的直径是20.2±0.9μm，这比50％浓度的丝的直径大很多。该现象归因于溶液属性(包括导电率、表面张力、粘度和溶剂挥发速度)的改变。这些属性确定了在高压下从喷嘴端部被拉伸出的溶液的量，从而影响所产生的丝的形态。较高的导电率在工艺开始期间对于克服溶液的表面张力是必要的，并且对电流体动力喷流的后续的延伸也是重要的。随着PCL浓度的升高，较少的乙酸会存在于溶液中，并且因此游离离子较少，这导致导电率的下降，但是粘度和表面张力增加，从而导致丝直径较大。但是，由于溶液中的乙酸较少，溶剂蒸发速率提高了，并且能够实现丝的快速固化从而能够进行3D构建。在本研究中，所有其它处理参数如正压力、电压和工作台的移动速度保持不变，而所有这些参数在打印过程中都会影响进料速率或溶液的拉伸。可以通过降低溶液进料速率、增加高压电势或提高工作台的移动速度来减小丝直径。

对于E喷射工艺，通过将PCL浓度提高至70％实现了丝在喷嘴与收集器之间的非常短的距离(2mm)内的快速固化。成功地制造了具有多层特定对齐的丝和450±50μm的受控孔径的纤维生物支架。与电纺生物支架相比，E喷射的生物支架能够提供足够的空间以用于营养素和血液的传送，促进了3D生物支架内的细胞生长。结果证明E喷射技术能够构建具有理想的孔径和丝朝向的3D生物支架。

实施例2：生物支架的表征

图5a中示出了E喷射的PCL丝的SEM检测。获得了平行的丝，并且所打印的丝的表面大体上是光滑的。在高电压的作用下，实现了直径为20.5±1.9μm的均匀丝。这比使用微挤出系统制造的具有100μm丝直径的丝小很多(Kalita等2003，Wei等2012)。细丝已经显示提高细胞附着并且调节细胞信号传导路径，从而加速细胞外基质生成(Nur-E-Kamal等2005，Li等2006)。

根据文献报告，与细胞的尺寸相比，电纺生物支架的孔径较小，从而限制了细胞穿过进入生物支架(Kidoaki等2005)。为了对此进行评估，在本研究中制造了10层的生物支架(图5b)。所获得的孔径是450±50μm。大孔径当然会能够支撑和引导细胞向内生长，仅限制外表面上的细胞定殖。通过连续打印至50层，制造了孔隙度水平为92±3％的尺寸为15乘15mm的高孔隙度PCL生物支架(图5c)。整个制造工艺耗时约40分钟。高达90％的高孔隙度水平在提供生物支架内的充足血液和营养素传送方面是理想的(AgrawalandRay2001)，尽管会降低生物支架的机械强度。

如XRD图谱(图6a)所示，半结晶PCL的(110)晶格面和(200)晶格面的衍射在2θ等于21.5°和23.8°处表现为强峰。E喷射的PCL生物支架的两个主峰的强度比(I100/I200)(Lee等2003)是2.4，其低于来样PCL的两个主峰的强度比(I100/I200＝3.6)。这意味着丝中发生的结晶的延迟，表明在E喷射工艺过程中不存在PCL链的延长。

在FTIR光谱中对于所有样本检测了全部属于PCL的1723cm^-1处的特征性C＝O峰、CH₂在2945cm^-1处的不对称伸缩和2865cm^-1处的对称伸缩、1241cm^-1处的C-O-C伸缩和1170cm^-1处的C-O伸缩(图5b)，表明E喷射技术没有对PCL造成破坏。

实施例3：生物支架上的软骨细胞反应的体外研究

在培养3天之后，使用活/死染色方法评估了纤维生物支架上的软骨细胞的生存力。发现有大量的活软骨细胞(图中的高亮部分)附着在胶原包被的PCL丝的表面上并在胶原包被的PCL丝的表面上蔓延，表现出良好的细胞生存力(图7a)。此外，看到了粘附在生物支架内表面上的软骨细胞，表现出良好的细胞浸润。一些细胞在平面中良好地对焦，而其它细胞没有对焦，意味着这些细胞附着在生物支架的不同层中。

图7b示出了负载细胞的生物支架和对照上的sGAG产量。每个样本上的sGAG含量的量随着培养时间而升高。然而，在所有时间点处，由生物支架上的软骨细胞产生的sGAG显著高于对照的sGAG。结果表明，在第14天和第21天，与对照相比，生物支架上的sGAG含量增加两倍。这表示软骨细胞保持了它们的正常表型，并且E喷射的生物支架提高了软骨细胞ECM分泌，从而表现出组织修复能力。

图7c呈现了在无细胞的E喷射的生物支架(0周)和负载细胞的生物支架(2周、4周、6周和8周)上进行的拉力试验的结果。细胞装载生物支架的拉伸模量随着培养时间而增加，并且在第4周、第6周和第8周细胞装载生物支架的模量显著高于无细胞生物支架的模量，表明来自软骨细胞的新形成的基质对生物支架的机械强度起到了重要作用。在第8周，接种细胞的生物支架的拉伸模量是13.9±1.2MPa，这与人类半月板在径向方向上的拉伸模量相当，意味着已经复现了半月板的负荷传递、冲击吸收和关节稳定功能。当使用生物支架来置换受损半月板时，相似的机械属性通常是优选的。否则，可以预期生物支架发生不可恢复的变形，从而诱导软骨磨损并且加快软骨退化，这随后会损害膝功能。

图7d示出了培养20天后II型胶原产物之表达是培养10天后II型胶原产物之表达的约3倍，同时I型胶原产物的表达降低一半。这些结果表明在这些生物支架中细胞保持它们如同健康软骨细胞一般的的正常表型。

参考文献

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LeeKH，KimHY，KhilMS，RaYMandLeeDR2003Characterizationofnano-structuredpoly(epsilon-caprolactone)nonwovenmatsviaelectrospinningPolymer441287-94.

LiWJ，JiangYJandTuanRS2006ChondrocytephenotypeinengineeredfibrousmatrixisregulatedbyfibersizeTissueEng121775-85.

Nur-E-KamalA，AhmedI，KamalJ，SchindlerMandMeinersS2005ThreedimensionalnanofibrillarsurfacesinduceactivationofRacBiochemBiophResCo331428-34.

SeeramR，KazutoshiF，WeeET，TeikCLandZuweiM2005AnIntroductiontoElectrospinningandNanofibers：WorldScientificPublishingCo.Pte.Ltd).

表1人体中的内侧半月板和外侧半月板的尺寸

Claims (41)

1.一种用于制造生物支架的设备，其包含：正压储存器，所述正压储存器在使用中容纳聚酯溶液，并且还与喷嘴流体连通，所述溶液从所述喷嘴离开；工作台，所述工作台位于所述喷嘴附近并且适于沿X、Y和Z三个轴相对于所述喷嘴移动，并且所述工作台在使用中支撑所述溶液在其上沉积的基底；以及电源，所述电源用于在所述喷嘴与所述工作台或所述基底之间产生电场，使得离开所述喷嘴的溶液作为连续丝流动。

2.根据权利要求1所述的设备，其中所述储存器被保持在0kPa至400kPa的正压下。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的设备，其中在制造所述生物支架时所述正压储存器被保持在恒定压力下。

4.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述储存器还包含负压装置。

5.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述正压储存器或所述负压装置包含气动装置。

6.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述喷嘴的内径为80μm至510μm。

7.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述工作台位于所述喷嘴下方。

8.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述工作台适于在所述喷嘴保持静止的同时沿X、Y和Z三个轴移动。

9.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述工作台设置有定位构件和紧固构件之一或二者。

10.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述电源使得使用者能够施加0Kv至20Kv的电压。

11.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述设备包含温度控制装置。

12.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其中所述设备还包含计算机可读介质，所述计算机可读介质具有用于实施成层方法的计算机可执行指令，所述计算机可执行指令包含存储在计算机可读介质上并且适于由处理器来执行的程序，其中所述程序执行以下功能：

a)相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述聚酯溶液的第一层；

b)移动所述基底使其远离所述喷嘴，从而增加所述喷嘴与所述基底之间的距离；以及

c)相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述聚酯溶液的第二层；

d)可选地，重复步骤a)至步骤c)直到完成3D生物支架。

13.根据权利要求12所述的设备，其中步骤b)还包括在执行步骤c)之前相对于所述喷嘴旋转所述基底。

14.根据权利要求12或13中任一项所述的设备，其中所述来回移动沿直线、曲线、锯齿线或波浪线进行。

15.一种用于制造生物支架的方法，其包括：

i)在正压下提供聚酯溶液；

ii)使所述溶液离开喷嘴并且沉积在基底上；

iii)在所述喷嘴与所述基底之间产生电场，使得离开所述喷嘴的所述溶液流动成为连续丝；以及

iv)相对于所述喷嘴沿X、Y和Z三个轴中的至少一个轴移动所述基底，从而以选定方式将所述丝铺设在所述基底上以创建三维生物支架。

16.根据权利要求15所述的方法，其中相对于所述喷嘴来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第一层。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中移动所述基底使其远离所述喷嘴，从而增加所述喷嘴与所述基底之间的距离。

18.根据权利要求17所述的方法，其中在移动所述基底使其远离所述喷嘴之后，再次来回移动所述基底，从而沉积所述溶液的第二层。

19.根据权利要求17所述的方法，其中在沉积所述第一层之后以及在移动所述喷嘴远离所述基底之前或之后，进一步相对于所述喷嘴旋转所述基底。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在所述旋转之后沉积第二层。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述来回移动可以沿直线、曲线、锯齿线或波浪线进行。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中重复第一层和第二层的所述成层直到产生具有期望深度的生物支架。

23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述聚酯溶液是可生物降解或不可生物降解的。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述聚酯溶液选自包含胶原、聚己内酯(PCL)、聚(环氧乙烷)、聚乙交酯、聚(L-乳酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的组。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述聚酯溶液包含以30％w/v至80％w/v的浓度溶解在有机溶液中的聚酯。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述浓度选自包含大于40％、大于50％、大于60％以及65％w/v、66％w/v、67％w/v、68％w/v、69％w/v、70％w/v、71％w/v、72％w/v、73％w/v、74％w/v、75％w/v、76％w/v、77％w/v、78％w/v、79％w/v和80％w/v之浓度的组。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述有机溶剂选自包含乙酸、甲酸、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇和六氟异丙醇的组。

28.一种根据权利要求15至27中任一项所述方法制造的生物支架。

29.根据权利要求28所述的生物支架，其中所述生物支架被设计成模仿选自包含半月板、骨软骨组织、肌腱、韧带和牙本质的清单的结构。

30.一种数据载体，其包含用于执行根据权利要求15至22中任一项所述方法的程序。

31.一种3D生物支架，其包含由聚酯制成的多个丝状层，其中所述丝的直径为3μm至50μm，并且所述生物支架的厚度为200μm至5000μm。

32.根据权利要求31所述的3D生物支架，其中所述丝的直径选自包含3μm至50μm、10μm至30μm、5μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm和22μm的组。

33.根据权利要求31或32所述的3D生物支架，其中所述3D生物支架的孔径选自包含100μm至500μm、200μm至500μm、325μm至395μm、以及250μm的组。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的3D生物支架，其中所述3D生物支架的孔隙度选自包含70％至95％、80％至95％、以及90％的组。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的3D生物支架，其中所述生物支架被设计成模仿选自包含半月板、骨软骨组织、肌腱、韧带、血管、皮肤和牙本质之组的结构。

36.根据权利要求31至35中任一项所述的3D生物支架，其中所述生物支架还包含选自包含以下之组的生物组织：关节软骨细胞、具有产生关节软骨之潜能的细胞如祖细胞、生长因子和干细胞。

37.根据权利要求31至36中任一项所述的3D生物支架，其中所述生物支架还包含治疗剂。

38.根据权利要求31至37中任一项所述3D生物支架在制造用于治疗损伤或疾病的植入物中的用途。

39.根据权利要求38所述的用途，所述用途用于治疗半月板、骨软骨、韧带、肌腱、牙本质、血管和皮肤的损伤或疾病。

40.用根据权利要求28至37中任一项所述生物支架来包被或图案化的医用植入物。

41.基本上如本文中参照附图和表格描述的设备、方法、生物支架、数据载体或3D生物支架。