CN116103148A - 核壳结构体外器官微球的制备系统和制备方法以及总系统 - Google Patents

核壳结构体外器官微球的制备系统和制备方法以及总系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了核壳结构体外器官微球的制备系统和制备方法以及总系统，制备系统包括微流控芯片，微流控芯片上设有壳结构的细胞流体流道、核结构的细胞流体流道和油相流道，壳结构的细胞流体流道和核结构的细胞流体流道相汇合形成汇合流道，汇合流道与油相流道相汇合形成微球流体流道。本发明基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备得到大小尺寸均一可控的VOS。同时，该系统能够制备得到核壳结构的VOS，该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础。

Description

核壳结构体外器官微球的制备系统和制备方法以及总系统
技术领域
本发明涉及体外器官技术领域，具体而言，本发明涉及核壳结构体外器官微球的制备系统和制备方法以及总系统。
背景技术
类器官是近些年来发展起来的与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型，自2009年首个类器官被培育出来以来，其已逐渐被应用于指导临床用药和个体化治疗等方向。事实上，自2016年起，类器官技术已被纳入临床试验中，截止到2020年9月，已有63起临床试验于FDA官方备案，适应症包括肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、食管癌等等。相关报道称，2019年北美类器官市场达到2.9139亿美元，预计将在2027年达到14.0647亿美元，将以21.7％的复合年增长率增长。随着新的药物管线的不断涌现，临床和患者对个体化治疗的需求日益增进，市场空间将持续增长，预计国内类器官市场将达百亿以上，而这也就要求未来类器官制备及培养环节也需要提高自动化程度，尽可能提高类器官的可重复性，实现标准化，规模化制备培养。这主要是因为类器官的制备及培养过程复杂，对于标准化有很高的要求，其中还会涉及到类器官的筛选及检测，分选等过程，而这些过程通常需要依靠大型的外部仪器来实现和完成，不利于规模化推广。
实践中大部分体外器官微球(VitroOrganoSphere,VOS)的制备为手动将细胞悬液或组织微块与基质胶混合后，通过移液枪将基质胶与细胞或组织微块的混合物滴加至孔板或培养皿中，待基质胶固化后加入培养基培养。手动制备体外器官微球的缺点如下：1)制备出的微球的质量与操作人员的技术与手法直接相关，因此制备出的体外器官微球的质量会由于操作者的不同而有明显差异，无法实现标准化制备；2)手动操作效率低，无法实现规模化高通量制备；3)手动制备的微球准确度和精确度不够，制备出的微球体积偏大包含的细胞及组织微块的数量偏多，容易造成样本的浪费；4)手动无法制备出具有核壳结构的微球。
此外，VOS与二维细胞系相比虽然与体内的来源组织或器官具有更高的相似度，但是由于缺乏血管结构及免疫细胞而与体内模型依然有较大的差距。目前公开的制备方法为单乳化微滴生成系统，制备得到的体外器官微球结构简单，无法具备血管结构或与免疫细胞等的共培养。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种核壳结构体外器官微球的制备系统和制备方法以及总系统。本发明基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备得到大小尺寸均一可控的VOS。同时，该系统能够制备得到核壳结构的VOS，该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础。
在本发明的第一个方面，本发明提出了一种核壳结构体外器官微球的制备系统。根据本发明的实施例，所述核壳结构体外器官微球的制备系统包括：
微流控芯片，所述微流控芯片上设有壳结构的细胞流体流道、核结构的细胞流体流道和油相流道，所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道相汇合形成汇合流道，所述汇合流道与所述油相流道相汇合形成微球流体流道，在所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道的汇合处，所述壳结构的细胞流体流道设置在所述核结构的细胞流体流道的两侧，在所述汇合流道与所述油相流道的汇合处，所述油相流道设置在所述汇合流道的两侧。
根据本发明上述实施例的核壳结构体外器官微球的制备系统，基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备大小尺寸均一可控的VOS，解决了传统制备方法中存在的通量低、尺寸大小不均一且不可控，重现性差以及较难实现自动化制备的问题。同时，该系统能够制备得到核壳结构的VOS，该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础，解决了目前的方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题。本发明的制备系统能够实现VOS的自动化制备，操作简单且无污染，为药物筛选及药效评价提供重现性良好的体外生物模型，具有良好的应用前景及推广价值。另外，上述系统能大大节约原料及用药量，也能极大程度地降低成本及劳动量，提高药物筛选及新药研发的效率，具有极大的经济效益。
另外，根据本发明上述实施例的核壳结构体外器官微球的制备系统还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：第一储液装置，所述第一储液装置的出液口与所述壳结构的细胞流体流道的入口相连，所述第一储液装置用于储存壳结构的细胞流体；第二储液装置，所述第二储液装置的出液口与所述核结构的细胞流体流道的入口相连，所述第二储液装置用于储存核结构的细胞流体；第三储液装置，所述第三储液装置的出液口与所述油相流道的入口相连，所述第三储液装置用于储存油相。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：压力控制器和隔膜泵，所述压力控制器分别与所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置相连，所述隔膜泵与所述压力控制器相连。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：流速控制单元，所述流速控制单元与所述压力控制器相连。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：制冷模块，所述制冷模块用于将所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置的温度维持在某一设定温度。
在本发明的一些实施例中，所述制备系统还包括：保温单元，所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置均设置在所述保温单元内。
在本发明的一些实施例中，所述壳结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的一些实施例中，所述核结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的一些实施例中，所述油相流道的宽度为75～300μm，所述油相流道内的油相的流速为1～20μL/min。
在本发明的一些实施例中，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体包括壳结构的细胞和第一水凝胶，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体包括核结构的细胞和第二水凝胶，所述壳结构的细胞与所述核结构的细胞不同，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶不同，所述壳结构的细胞选自脐带静脉内皮细胞和免疫细胞中的至少一种，所述核结构的细胞选自肿瘤细胞和干细胞中的至少一种，所述第一水凝胶选自纤维蛋白原、胶原和海藻酸盐中的至少一种，所述第二水凝胶选自基质胶、纤维蛋白原和胶原中的至少一种。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种采用以上实施例所述的制备系统制备核壳结构体外器官微球的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将壳结构的细胞流体通入壳结构的细胞流体流道，将核结构的细胞流体通入核结构的细胞流体流道，将油相通入油相流道；
(2)将所述壳结构的细胞流体和所述核结构的细胞流体汇合，形成汇合流体，且使所述壳结构的细胞流体分布在所述核结构的细胞流体的外侧；
(3)将所述汇合流体与所述油相汇合，形成核壳结构体外器官微球，且使所述核壳结构体外器官微球包裹在所述油相中。
根据本发明上述实施例的核壳结构体外器官微球的制备方法，基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备大小尺寸均一可控的VOS，解决了传统制备方法中存在的通量低、尺寸大小不均一且不可控，重现性差以及较难实现自动化制备的问题。同时，该方法能够制备得到核壳结构的VOS，该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础，解决了目前的方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题。
在本发明的第三个方面，本发明提出了一种核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统。根据本发明的实施例，所述核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统包括以上实施例所述的双核壳结构体外器官微球的制备系统。由此，所述核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统具有上述双核壳结构体外器官微球的制备系统的所有优点，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的核壳结构体外器官微球的制备系统包括的微流控芯片的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的制备系统的结构示意图；
图3是根据本发明实施例的集成制备系统和检测分选系统的微流控芯片的结构示意图；
图4是根据本发明实施例的检测分选系统的结构示意图；
图5是根据本发明实施例的分配发液系统的结构示意图；
图6是根据本发明实施例的制备双乳化核壳结构微球的原理示意图；
图7是根据本发明实施例的制备双乳化核壳结构微球的示意图；
图8是根据本发明实施例的移动单元的移动路径示意图；
图9是实施例1培养的核壳结构VOS的荧光图。
附图标记：
1000-制备系统，100-微流控芯片，1110-油相流道，1120-壳结构的细胞流体流道，1130-核结构的细胞流体流道，1140-汇合流道，1150-微球流体流道，1200-流速控制单元，1300-压力控制器，1400-隔膜泵，1500-第一储液装置，1600-第二储液装置，1700-第三储液装置；
2000-检测分选系统，2100-缺陷微球流体流道，2200-合格微球流体流道，2300-不对称电极，2400-光学检测单元，2500-信号发生器，2600-检测分选控制单元；
3000-分配发液系统，3100-支撑板，3200-滑道，3300-Y方向滑轨，3400-X方向滑轨，3500-移动平台，3600-第一立杆，3700-第一连接杆，3800-微球流体分配管，3810-分配头，3900-第二立杆，3910-第二连接杆，3920-培养液移液器，3921-移液枪头。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本发明的实施例中，针对现有制备方法制备的体外器官微球大小尺寸不均一且不可控问题，本发明利用微流控微液滴生成及凝胶固化技术实现了大小尺寸均一可控的体外器官微球的制备。针对现有方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题，本发明采用将壳结构的细胞和核结构的细胞分别进样的方法，实现了核壳结构的VOS的制备。针对现有制备方法中使用注射泵及注射器导致的加样繁琐且存在气泡等干扰因素，本发明基于隔膜泵驱动方式，一次加样后即可实现一键式操作。
有鉴于此，在本发明一个方面，本发明提出了一种核壳结构体外器官微球的制备系统，参考附图1和6，核壳结构体外器官微球的制备系统1000包括：微流控芯片100，所述微流控芯片100上设有壳结构的细胞流体流道1120、核结构的细胞流体流道1130和油相流道1110，壳结构的细胞流体流道1120内为壳结构的细胞流体，核结构的细胞流体流道1130内为核结构的细胞流体，油相流道1110内为油相。所述壳结构的细胞流体流道1120和所述核结构的细胞流体流道1130相汇合形成汇合流道1140，且在所述壳结构的细胞流体流道1120和所述核结构的细胞流体流道1130的汇合处，所述壳结构的细胞流体流道1120设置在所述核结构的细胞流体流道1130的两侧。在汇合流道1140内，壳结构的细胞流体和核结构的细胞流体并不相溶，而是形成依次包括壳结构的细胞流体、核结构的细胞流体和壳结构的细胞流体的三层层流，壳结构的细胞流体分布在核结构的细胞流体的两侧，由此使壳结构的细胞流体包裹在核结构的细胞流体的两侧，以便后续能形成核壳结构的微球。所述汇合流道1140与所述油相流道1110相汇合形成微球流体流道1150，在所述汇合流道1140与所述油相流道1110的汇合处，所述油相流道1110设置在所述汇合流道1140的两侧。在汇合处，上述依次包括壳结构的细胞流体、核结构的细胞流体和壳结构的细胞流体的三层层流被其两侧流入的油相剪切，从而形成核壳结构的微球，且使所述核壳结构体外器官微球包裹在所述油相中。该核壳结构体外器官微球的结构如附图7所示，其中图7a为核结构的示意图，图7b为壳结构的示意图，图7c为核壳结构的示意图。该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础，解决了目前的方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题。
在本发明的实施例中，上述壳结构的细胞流体流道1120的宽度以及壳结构的细胞流体流道1120内的壳结构的细胞流体的流速均不受特别限制，本领域人员可根据实际需求进行设计，作为一个优选的方案，所述壳结构的细胞流体流道1120的宽度为100～150μm，所述壳结构的细胞流体流道1120内的壳结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的实施例中，上述核结构的细胞流体流道1130的宽度以及核结构的细胞流体流道1130内的核结构的细胞流体的流速均不受特别限制，本领域人员可根据实际需求进行设计，作为一个优选的方案，所述核结构的细胞流体流道1130的宽度为100～150μm，所述核结构的细胞流体流道1130内的核结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
在本发明的实施例中，上述油相流道1110的宽度以及油相内的油相的流速均不受特别限制，本领域人员可根据实际需求进行设计，作为一个优选的方案，所述油相流道1110的宽度为75～300μm，所述油相流道1110内的油相的流速为1～20μL/min。
在本发明的实施例中，所述壳结构的细胞流体流道1120内的壳结构的细胞流体包括壳结构的细胞和第一水凝胶，第一水凝胶作为壳结构的细胞的分散介质。所述核结构的细胞流体流道1130内的核结构的细胞流体包括核结构的细胞和第二水凝胶，第二水凝胶作为核结构的细胞的分散介质。所述壳结构的细胞与所述核结构的细胞不同，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶不同，由此才能形成不相溶的多层层流。需要说明的是，上述壳结构的细胞的具体种类、核结构的细胞的具体种类、第一水凝胶的具体种类以及第二水凝胶的具体种类均不受特别限制，作为一个具体示例，所述壳结构的细胞选自脐带静脉内皮细胞和免疫细胞中的至少一种，所述核结构的细胞选自肿瘤细胞和干细胞中的至少一种，所述第一水凝胶选自纤维蛋白原、胶原和海藻酸盐中的至少一种，所述第二水凝胶选自基质胶、纤维蛋白原和胶原中的至少一种。
根据本发明的一个具体实施例，参考附图2，所述制备系统1000还包括：第一储液装置1500，所述第一储液装置1500的出液口与所述壳结构的细胞流体流道1120的入口相连，所述第一储液装置1500用于储存壳结构的细胞流体；第二储液装置1600，所述第二储液装置1600的出液口与所述核结构的细胞流体流道1130的入口相连，所述第二储液装置1600用于储存核结构的细胞流体；第三储液装置1700，所述第三储液装置1700的出液口与所述油相流道1110的入口相连，所述第三储液装置1700用于储存油相。
进一步地，参考附图2，所述制备系统1000还包括：压力控制器1300和隔膜泵1400，所述压力控制器1300分别与所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700相连，所述隔膜泵1400与所述压力控制器1300相连。具体地，隔膜泵1400连接压力控制器1300，压力控制器1300连接储液装置，储液装置通过管子连接压力控制器1300并通过伸入液面下的毛细管连接微流控芯片100。隔膜泵1400的作用是产生压力，压力控制器1300的作用是调节隔膜泵1400产生的压力，储液装置中的流体经压力控制器1300调节后的气压压出后进入微流控芯片100进行VOS制备。由此，通过调节压力控制器1300气压大小对各流道内流体的流速进行调控，从而实现对VOS的大小及间隔距离等参数进行调节；同时还解决了目前体外器官微球制备过程中的通量低、尺寸大小不均一且不可控以及依靠人工操作难实现标准化制备的问题。另外，在细胞或组织微块浓度一定的情况下，可进一步通过调控微球体积大小来决定其中细胞或组织微块的数量。
进一步地，参考附图2，所述制备系统1000还包括：流速控制单元1200，所述流速控制单元1200与所述压力控制器1300相连，所述流速控制单元1200通过控制压力控制器1300控制储液装置中的气压从而达到控制流道内流体的流速的目的。上述流速控制单元1200可以是电子设备，例如可以是手机或者电脑等。
进一步地，所述制备系统1000还包括：制冷模块(在图中未示出)，所述制冷模块用于将所述微流控芯片100、所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700的温度维持在某一设定温度(例如4℃)。具体地，可将所述微流控芯片100设置在制冷模块(例如制冷板)上，在所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700的外围包裹制冷模块。
进一步地，所述制备系统1000还包括：保温单元(在图中未示出)，所述微流控芯片100、所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700均设置在所述保温单元内，使所述微流控芯片100、所述第一储液装置1500、所述第二储液装置1600和所述第三储液装置1700均维持在低温状态(例如维持在4℃)，避免基质胶凝固。
根据本发明实施例所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备大小尺寸均一可控的VOS，解决了传统制备方法中存在的通量低、尺寸大小不均一且不可控，重现性差以及较难实现自动化制备的问题。同时，该系统能够制备得到核壳结构的VOS，该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础，解决了目前的方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题。本发明的制备系统能够实现VOS的自动化制备，操作简单且无污染，为药物筛选及药效评价提供重现性良好的体外生物模型，具有良好的应用前景及推广价值。另外，上述系统能大大节约原料及用药量，也能极大程度地降低成本及劳动量，提高药物筛选及新药研发的效率，具有极大的经济效益。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种采用以上实施例所述的制备系统制备核壳结构体外器官微球的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将壳结构的细胞流体通入壳结构的细胞流体流道，将核结构的细胞流体通入核结构的细胞流体流道，将油相通入油相流道；
(2)将所述壳结构的细胞流体和所述核结构的细胞流体汇合，形成汇合流体，且使所述壳结构的细胞流体分布在所述核结构的细胞流体的外侧；
(3)将所述汇合流体与所述油相汇合，形成核壳结构体外器官微球，且使所述核壳结构体外器官微球包裹在所述油相中。
根据本发明上述实施例的核壳结构体外器官微球的制备方法，基于微流控液滴生成及凝胶固化体系制备大小尺寸均一可控的VOS，解决了传统制备方法中存在的通量低、尺寸大小不均一且不可控，重现性差以及较难实现自动化制备的问题。同时，该方法能够制备得到核壳结构的VOS，该核壳结构可实现VOS的血管化共培养，进一步提高VOS在性能上对体内器官的仿真度，为VOS作为体外模型应用于临床医学、精准医疗及药物筛选等领域奠定了基础，解决了目前的方法制备的VOS结构简单而无法形成血管结构或与免疫细胞共培养等问题。
在本发明的第三个方面，本发明提出了一种核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统。根据本发明的实施例，所述核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统包括以上实施例所述的双核壳结构体外器官微球的制备系统。由此，所述核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统具有上述双核壳结构体外器官微球的制备系统的所有优点，在此不再赘述。
在本发明的实施例中，上述核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统包括以上实施例所述的制备系统、检测分选系统和分配发液系统。检测分选系统用于对上述制备系统制备得到的微球进行检测分选，将出现缺陷的微球筛选出来，剩余的都是活性较高的微球。上述分配发液系统用于将经过所述检测分选系统分选得到的合格微球流体分装在孔板中以及对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
在本发明的实施例中，上述检测分选系统可采用现有技术中常规的检测分选系统，也可采用如下检测分选系统：
在本发明的实施例中，参考附图3和4，上述检测分选系统包括由所述微球流体流道1150分岔形成的缺陷微球流体流道2100和合格微球流体流道2200，所述缺陷微球流体流道2100和所述合格微球流体流道2200均设置在所述微流控芯片100上，即微球的制备流道和检测分选流道均设置在所述微流控芯片100上，集制备和检测于一体。所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片100上设置不对称电极2300，且所述缺陷微球流体流道2100一侧对应的电极产生的电场大于所述合格微球流体流道2200一侧对应的电极产生的电场。所述检测分选系统还包括信号发生器2500、检测分选控制单元2600和光学检测单元2400，所述光学检测单元2400设置在所述微球流体流道在分岔前对应的微流控芯片100的上方，所述信号发生器2500分别与所述不对称电极2300和所述检测分选控制单元2600相连，所述检测分选控制单元2600分别与所述光学检测单元2400和所述信号发生器2500相连。
采用上述检测分选系统进行检测分选的过程如下：在所述分选前微球流体分岔前，采用光学检测单元2400(例如显微镜头)对分选前微球进行观测，例如同时对荧光及侧向光散射成像进行观测，所述光学检测单元2400将观测结果发送至检测分选控制单元2600，如果所述分选前微球存在缺陷，例如当捕捉到荧光信号和/或检测到空泡时，则所述检测分选控制单元2600向信号发生器2500发出指令，所述信号发生器2500则接通不对称电极2300，以便产生不均匀电场，所述不均匀电场使缺陷微球发生偏离进入缺陷微球流体流道2100；如果所述分选前微球不存在缺陷，则不接通所述不对称电极2300，以便使合格微球进入合格微球流体流道2200。由此，所述检测分选系统为自动化操作，同时采用了荧光及明场两种检测方式相结合的方式，不仅可以筛选死细胞或组织块同时也可以筛选出空泡，提高了检测效率及准确率。
需要说明的是，上述检测分选控制单元2600是电子设备，例如可以是手机或者电脑等。优选的，上述检测分选控制单元2600和上述流速控制单元可以在同一个电子设备上。
由此，在芯片上集成上述检测分选功能，对死细胞较多或无细胞的VOS进行了筛选，保证得到的VOS全部为高活性，实现目标VOS的有效分选，即实现高活性VOS的自动化标准化制备。
所述总系统还包括加热单元(在图中未示出)，用于将合格微球形成固态(此时的分散介质油相仍然是液态)，所述加热单元的一端与所述合格微球流体流道2200的出口相连。检测合格的VOS流体从合格微球流体流道2200的出口流出，进入加热单元，在加热单元的加热作用下(例如加热至25℃)使合格微球形成固态，然后随油相一起流入分配发液系统。
在本发明的实施例中，上述分配发液系统可采用现有技术中常规的分配发液系统，也可采用如下分配发液系统：
参考附图5，所述分配发液系统3000包括：支撑板3100，所述支撑板3100上设有滑道3200；移动单元，所述移动单元包括移动平台3500、X方向滑轨3400和Y方向滑轨3300，所述Y方向滑轨3300垂直设置在所述滑道3200上，所述Y方向滑轨3300可在所述滑道3200上沿Y方向移动，所述X方向滑轨3400垂直设置在所述Y方向滑轨3300上，所述X方向滑轨3400可在所述Y方向滑轨3300上沿X方向移动，所述移动平台3500固定在所述X方向滑轨3400的上方；孔板(在图5中未示出)，所述孔板设置在所述移动平台3500上，所述孔板上设有多个培养孔；微球流体分配单元，所述微球流体分配单元包括微球流体分配管3800、第一连接杆3700和第一立杆3600，所述第一立杆3600设置在所述支撑板3100上，所述微球流体分配管3800通过第一连接杆3700支撑在所述培养孔的上方，所述微球流体分配管3800包括分配头3810，所述分配头3810设置在所述微球流体分配管3800的下端，所述微球流体分配管3800的上端与所述加热单元的另一端相连；培养液移液单元，所述培养液移液单元包括所述培养液移液器3920、第二连接杆3910和第二立杆3900，所述第二立杆3900设置在所述支撑板3100上，所述培养液移液器3920通过第二连接杆3910支撑在所述培养孔的上方，所述培养液移液器3920底部设有多个移液枪头3921。进一步地，所述分配发液系统还包括：分配发液控制单元，所述分配发液控制单元分别与所述移动单元、所述微球流体分配单元和所述培养液移液单元相连，所述分配发液控制单元分别控制移动单元的移动路径、每个培养孔中分配的VOS数量以及每个培养孔中添加的培养液的量。
具体地，加热固化后的VOS流体通过PTFE管连接到微球流体分配管3800，通过分配头将加热固化后的VOS流体按照实际需求分发至孔板的各个培养孔中，此种分配方式可避免由于分配头移动产生的震动导致微球流体分配管3800中的VOS出现多个粘结等情况，确保VOS分发的稳定性。微球流体分配管3800垂直向下且位置固定，由此可减少因为移动而造成VOS分发的不稳定影响。在分发过程中将孔板放置于移动平台3500上方，并通过使移动平台3500按照预先设置的路线进行移动，将固化后的VOS通过分配头流出至孔板的各个孔中。每个孔中的VOS数量可根据实际需求进行调节。
具体地，移动单元可根据实际需求按照一定的路径运动，其中所述Y方向滑轨3300可在所述滑道上沿Y方向移动，从而控制移动平台3500在Y方向的移动，所述X方向滑轨3400可在所述Y方向滑轨3300上沿X方向移动，从而控制移动平台3500在X方向的移动，由此，保证每个需要的孔中都有分配到VOS，不需要中途进行换板操作。孔板的移动途径可通过分配发液控制单元进行设置，可根据孔板及测试需求进行个性化设置，确保分配的VOS可以满足后期实验的需求，图8为其中一种路径示意。
当孔板完成VOS的分发后，可控制培养液移液单元移动至孔板上方进行添加培养液。培养液移液器3920底部可连接不同规格及数量的移液枪头，将培养液移液器3920移至储液槽上方，移液枪头通过负压从培养液储液槽吸取一定量的培养基后，移动至孔板上方，释放负压使培养液流出至孔板中。其加液量以及培养液移液器3920底部连接的枪头数量及规格可根据使用的孔板规格进行匹配。自动加液在VOS分配结束后马上进行，避免基质胶脱水而导致细胞活性受到损伤。由此，所述分配发液系统为自动化操作。
进一步地，所述第一连接杆3700设置为可以所述第一立杆3600为轴周向转动，当微球流体分配管3800将加热成型后的微球流体分配完成后，可以第一立杆3600为轴周向转动第一连接杆3700，从而将微球流体分配管3800远离孔板的上方，避免影响后续培养液移液单元的操作。进一步地，所述第一立杆3600设置为可上下伸缩，由此，可实现第一立杆3600在Z轴上的移动，从而实现微球流体分配管3800在Z轴上的移动。
进一步地，所述第二立杆3900设置为可上下伸缩，可实现第二立杆3900在Z轴上的移动，从而实现培养液移液器3920在Z轴上的移动；另外，当微球流体分配单元分配加热成型后的微球流体时，将第二立杆3900升高，从而带动培养液移液器3920和第二连接杆升高，避免影响微球流体分配单元的分配操作；当微球流体分配单元的分配完成后，将第二立杆3900降低，从而带动培养液移液器3920和第二连接杆降低，使培养液移液器3920刚好处于培养孔的上方，对分装在所述孔板中的合格微球添加培养液。
由此，利用微球流体分配单元和可控运动平台相配合实现VOS的自动化分配，解决了手动点样中的效率低及准确性差以及受操作人员影响极大等问题；最后利用培养液移液单元实现自动化的培养基或药物注入，减少操作过程中的污染隐患。
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
采用附图1和附图2所示的制备系统制备双乳化核壳结构微球，方法如下：
对核层来自患者的肠肿瘤细胞进行带GFP报告基因的病毒转染后与matrigel混合均匀后加入核层细胞液储存装置中，对壳层人脐静脉内皮细胞进行带RFP报告基因的病毒转染后与胶原蛋白混合均匀后加入壳层细胞液储存装置中，将油相氟油HFE7000加入油相储存装置中，连接芯片。加样完成后对储液槽进行加压进样，打开隔膜泵，调节流量控制器，使核层细胞液的压力为15mbar，壳层细胞液的压力为15mbar，油相压力为25mbar，从而制备得到备双乳化核壳结构微球。
将上述双乳化核壳结构微球分配到384孔板中的各个培养孔中。然后采用培养液移液单元向各个培养孔中添加培养基，最后放入细胞培养箱中进行培养。
然后通过荧光显微镜观察，并收集图像，结果如附图9所示，从附图9中可以看出，中间核层细胞为来自患者的肠肿瘤细胞，荧光染色呈绿色，外层壳为人脐静脉内皮细胞形成的血管结构，荧光染色呈红色，红色分布在外圈层(如B所示)，绿色分布在中间层(如A所示)，因此可证明本方法制备的VOS为核壳结构。同时从图9中还可以看出，该VOS具有血管结构(如C所示)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，包括：
微流控芯片，所述微流控芯片上设有壳结构的细胞流体流道、核结构的细胞流体流道和油相流道，所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道相汇合形成汇合流道，所述汇合流道与所述油相流道相汇合形成微球流体流道，在所述壳结构的细胞流体流道和所述核结构的细胞流体流道的汇合处，所述壳结构的细胞流体流道设置在所述核结构的细胞流体流道的两侧，在所述汇合流道与所述油相流道的汇合处，所述油相流道设置在所述汇合流道的两侧。
2.根据权利要求1所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，还包括：
第一储液装置，所述第一储液装置的出液口与所述壳结构的细胞流体流道的入口相连，所述第一储液装置用于储存壳结构的细胞流体；
第二储液装置，所述第二储液装置的出液口与所述核结构的细胞流体流道的入口相连，所述第二储液装置用于储存核结构的细胞流体；
第三储液装置，所述第三储液装置的出液口与所述油相流道的入口相连，所述第三储液装置用于储存油相。
3.根据权利要求2所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，还包括：
压力控制器和隔膜泵，所述压力控制器分别与所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置相连，所述隔膜泵与所述压力控制器相连；
任选地，所述制备系统还包括：流速控制单元，所述流速控制单元与所述压力控制器相连。
4.根据权利要求2所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，还包括：
制冷模块，所述制冷模块用于将所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置的温度维持在某一设定温度。
5.根据权利要求4所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，还包括：
保温单元，所述微流控芯片、所述第一储液装置、所述第二储液装置和所述第三储液装置均设置在所述保温单元内。
6.根据权利要求1-5任一项所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，所述壳结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min。
7.根据权利要求1-5任一项所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，所述核结构的细胞流体流道的宽度为100～150μm，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体的流速为0.5～5μL/min；
任选地，所述油相流道的宽度为75～300μm，所述油相流道内的油相的流速为1～20μL/min。
8.根据权利要求1-5任一项所述的核壳结构体外器官微球的制备系统，其特征在于，所述壳结构的细胞流体流道内的壳结构的细胞流体包括壳结构的细胞和第一水凝胶，所述核结构的细胞流体流道内的核结构的细胞流体包括核结构的细胞和第二水凝胶，所述壳结构的细胞与所述核结构的细胞不同，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶不同，所述壳结构的细胞选自脐带静脉内皮细胞和免疫细胞中的至少一种，所述核结构的细胞选自肿瘤细胞和干细胞中的至少一种，所述第一水凝胶选自纤维蛋白原、胶原和海藻酸盐中的至少一种，所述第二水凝胶选自基质胶、纤维蛋白原和胶原中的至少一种。
9.一种采用权利要求1-8任一项所述的制备系统制备核壳结构体外器官微球的方法，其特征在于，包括：
(1)将壳结构的细胞流体通入壳结构的细胞流体流道，将核结构的细胞流体通入核结构的细胞流体流道，将油相通入油相流道；
(2)将所述壳结构的细胞流体和所述核结构的细胞流体汇合，形成汇合流体，且使所述壳结构的细胞流体分布在所述核结构的细胞流体的外侧；
(3)将所述汇合流体与所述油相汇合，形成核壳结构体外器官微球，且使所述核壳结构体外器官微球包裹在所述油相中。
10.一种核壳结构体外器官微球的制备、检测分选和分配培养的总系统，其特征在于，包括权利要求1-8任一项所述的核壳结构体外器官微球的制备系统。
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WO2024027717A1 (zh) * 2022-08-02 2024-02-08 丹望医疗科技(上海)有限公司 全自动化体外器官微球制备、分选以及分配培养的总系统和方法

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