CN102367414B - 一种用于向活体组织中的细胞内部输运核酸的柔性电极芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用柔性电极芯片向活体组织细胞中输运核酸的方法，其中包括：将核酸引入活体组织中并使其分布于活体组织细胞外周；将柔性电极芯片贴附在活体组织表面并对活体组织施加电场以使核酸进入活体组织细胞内部，所述的柔性电极芯片，包括：可以弯曲并可以根据活体组织的外形制作成不同形状的柔性基板，以及制作在基板上的成对放置的微细电极。

Description

一种用于向活体组织中的细胞内部输运核酸的柔性电极芯片

技术领域

本发明涉及一种向活体组织中的细胞内部输运核酸的方法，更具体而言，本发明涉及一种利用制作在柔性薄膜材料上的金属电极所产生的大面积均匀电场对活体组织中的细胞进行电穿孔以输运核酸的方法。 

背景技术

随着基因技术的迅速发展，核酸药物已经成为了治疗肿瘤等疾病的最有发展前途的方法之一，而目前阻止核酸药物实用化的最大障碍就是缺乏有效输运核酸进入细胞内部的方法。和传统的化学药物不同，核酸无法侵彻细胞膜，所以无法像化学药物一样通过口服、注射等方式给药。目前已公开的方法多是通过载体包裹等方式使DNA及siRNA穿透细胞膜，而这些载体往往具有较大的毒性，所以无法实用化。而电穿孔技术是最有希望的替代技术之一。 

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。周围环境中的一些物质可以通过细胞膜，其它的物质则不行。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。 

研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，这就是细胞电穿孔效应(Electroporation)(Waver J.C.“Electroporation：A dramatic，non thermal electric field phenomenon”1992)。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、siRNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。与传统的化学穿孔和病毒穿孔相比，由于电穿孔具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学研究等领域有着广阔的应用前景。 

电穿孔现象不仅存在于体外培养的细胞中，活体组织中的细胞同样也会发生电穿孔现象(Aihara H.“Gene transfer into muscle by electroporation in vivo”2008)。 

虽然电穿孔作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电穿孔现象及活体组织中的细 胞电穿孔现象是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。 

无论是在基因治疗领域，还是在对核酸药物的研发领域，都需要高效的将核酸输运进活体组织的细胞内部。虽然电穿孔技术被认为是最有前景的药物输运技术之一，但目前已经公开的技术因为器件设计和工作参数两方面的原因，都无法很好的实现对活体组织细胞的核酸输运。 

现有技术中，主要有两类方法来完成活体组织细胞电穿孔的过程： 

1.向活体组织内部插入两根或多根针状电极，以此在活体组织中产生相应的电场，从而使处于电极之间的细胞发生穿孔(U.S.Patent 7922709B2，U.S.Patent 5389069，U.S.Patent 6233482B1，中国专利公开号1345607，中国专利公开号1248923)。这种方法有两个较大的缺陷：首先，针状电极对组织的穿透会对活体组织产生较大的物理损伤，针状电极越多，损伤就越严重；其次，针状电极所产生的电场是不均匀的，会造成有些区域的细胞因电场强度不够而未能被电穿孔，而同时有些区域的细胞却因为电场强度过大而死亡。上述两个缺陷决定了这种方式无法向大面积的组织输运核酸，更无法应用于临床领域，只能用于有限的科研场合。 

2.通过在活体组织表面放置各种形状的电极，以此形成相应的电场，从而使处于电极之下的细胞发生电穿孔(U.S.Patent 6775569B2)。这种方法解决了上述第一种方法中对活体组织的物理伤害问题，但这种方法同样有两个较大的缺陷：首先，因为要穿透皮肤的阻隔，在皮肤表面所需的电场要大于组织内部的电场，而目前的平面电极尺度都比较大(数毫米)，这意味这数百伏甚至上千伏的电压，这对活体组织来说是致命的；其次，目前的平面电极大部分是制作在刚性基板上(例如硅片，玻璃片)等，完全无法适应活体组织外形的变化，所以同样无法实际应用于核酸输运。理论上也可将电极制作在可弯曲基板上，但目前也缺乏相应的成型方法以使其适应活体组织的外形。上述两个缺陷使得这种方法也无法应用于向大面积的组织输运核酸。 

除了已分别陈述的缺陷以外，上述两种方法还具有一个共同的缺陷：因为没有采用生物兼容性好的材料、高电压及其具有伤害性的物理穿透方式，所以现有的方法都无法用于植入式器件，只能应用于距体表很近的浅层组织，这极大的限制了现有的方法的应用范围。植入式器件则可以直接作用于生物体内的器官。与浅层组织相比，对生物体内器官的核酸输运不论是在研究领域还是临床应用领域都更有价值。 

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供了一种柔性电极芯片，该芯片具有可以根据活体组织的外形而弯曲或成型的柔性基板以及制作在柔性基板上用来产生均匀电场的微细电极；本发明的另一目的是提供一种利用柔性电极芯片对大面积的活体组织中的细胞进行电穿孔以向活体组织中输运核酸的方法。 

为了达到上述的第一个目的，本发明所提供的电穿孔芯片的技术方案概述如下： 

一种柔性电极芯片，包括： 

可弯曲的柔性基板以及制作在基板上的微细电极，所述的微细电极，是成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极。 

所述柔性基板由绝缘及生物兼容性好的材料制成。 

所述柔性基板由Parylene(聚对二甲苯)材料制成。 

所述柔性基板厚度为0.5微米至500微米。 

所述电极由生物兼容性好的金属或导电化合物制成。 

所述电极由金制成。 

所述每对电极的阳极和阴极之间的距离为50微米至1毫米。 

为了达到上述的第二个目的，本发明所提供的输运核酸的技术方法概述如下： 

一种向活体组织内的细胞输运核酸的方法，包括： 

向活体组织中引入适量的核酸；将柔性电极芯片贴附在活体组织表面；对活体组织施加电场以使核酸进入活体组织细胞内部。 

所述活体组织为表层组织、肌肉、肿瘤或内脏器官。 

所述柔性芯片的贴附方式为直接贴附于皮肤表层或植入于生物体内部。 

所述电场强度为120V/cm至3000V/cm，其脉冲宽度为0.05～200毫秒，脉冲间隔0.1～30秒。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

1.采用柔性基板：采用柔性基板带来的直接有益效果是可以适应多样的组织外形，在任何形状的组织上都可以实现紧密的贴附，从而可以对大面积的活体组织施加均匀的电场并输运核酸，避免了已公开技术中无法对大面积组织进行核酸输运的缺陷。从另一方面来说，Parylene等材料的柔性基板完全兼容半导体刻蚀等微细加工技术，可以通过这些微细加工技术在柔性基板表面加工出微细电极，从而可以用较低的电压(100 伏特以下)对组织细胞进行电穿孔并输运核酸，避免了已公开技术中高电压对活体组织严重的伤害。最后，Parylene等材料的生物兼容性极好并很容易通过热塑等方法制造出所需的形状，所以可以植入生物体内对体内脏器进行核酸输运，这也是已公开技术所无法实现的。 

2.可以实现透过皮肤的组织细胞电穿孔：因为皮肤的阻隔，已公开技术只是实现了将无机物或生物分子穿透皮肤导入组织细胞周围，而这些分子是否能进入细胞只取决分子本身的穿透能力。如果使用已公开技术实施透皮电穿孔，所需的高压将会对生物体造成严重的伤害。 

3.可以用作植入式器件并作用于生物体内脏器：在某些优选实施例中，采用Parylene作为基板材料，该材料可以通过热塑的方法成型，从而可以适应生物体内部器官的外形，结合Parylene材料良好的生物兼容性，可以将柔性电极芯片作为植入式器件工作于生物体内，这是已公开技术所无法实现的。 

综上所述，本发明通过将具有良好生物兼容性并易于成型的柔性基板和微细加工的电极结合在一起，为向活体组织内的细胞输运核酸提供了一种不同于已有公开技术的方法并能够实现更高的效率、更大的面积覆盖、透皮工作及向生物体内部器官的核酸输运。 

附图说明

图1是柔性电极芯片在弯曲状态下的结构示意图； 

图2是柔性电极芯片贴附于小鼠腿部皮肤外实现对小鼠腓肠肌输运核酸的示意图； 

图3是通过柔性芯片成功对小鼠腿部肌肉输运DNA的荧光照片； 

图中，1-柔性基板；2-微细电极的阳极；3-微细电极的阴极，其和阳极成对布置；4-贴附于小鼠腿部腓肠肌外的皮肤上的柔性电极芯片；5-实验用小鼠；6-未经过柔性电极芯片处理的小鼠；7-经过已公开技术中的插入式针尖电穿孔处理的小鼠；8-经过柔性电极芯片处理的小鼠； 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述： 

1柔性基板： 

因为柔性基板起到承托电极并在电极之间实现电绝缘的作用，所以柔性基板需要由绝缘材料制成，或者由非绝缘材料覆盖绝缘层制成。同时，因为需要在柔性基板上制作微细电极，所以柔性基板需要和现有的微细电极加工方法(例如半导体蚀刻)兼容。此外，因为本发明的有益效果之一是其可以用于生物体内器官的植入式操作，所以柔性基板需要具有良好的生物兼容性。本发明中的柔性基板可由任何适合以上条件的材料来制作。 

优选的柔性基板是那些可以通过蒸镀、切割及热塑成型制成特定规格及形状的材料。特别优选的是较薄并透明的绝缘聚合物，因为在这种情况下，较薄的厚度特别有利于植入式器件，而透明的材料可以方便观察。已经被实验所确证的是，厚度为0.5微米至500微米的柔性基板都可以应用于植入式器件。 

在图1所示的优选实施例中，柔性基板采用Parylene材料制成，长5厘米、宽4厘米、厚度10微米。该尺寸是用于小鼠腓肠肌电穿孔的最佳尺寸。当需要对其它活体组织进行电穿孔时，该基板的尺寸可由具体需求决定，并通过切割等方法得到所需尺寸的柔性基板。 

在其它实施例中，基板材料也可以采用聚酰亚胺薄膜，或包覆Parylene材料的普通塑料膜。由于这些材料的加工技术在本领域中是公知的，因而本领域技术人员可以在本发明的实施中方便的采用这些材料。 

2电极 

电极可以由适当的导电材料或这些材料的复合物来制成。优选材料为生物兼容性好的材料，例如金、钛和掺有银离子的PDMS(聚二甲基硅氧烷，一种常用的聚合物)。当采用多种材料时(例如一种导电材料(例如金)镀在另一种导电材料(例如铜)上)，最外层的优选材料为生物兼容性好的材料。 

在如图1所示的实施例中，电极材料为铬和金。首先在基板上溅射(这是一种半导体加工工艺中公知的沉积金属的方法)一层厚度为0.1微米的铬，再溅射一层厚度为0.5微米的金。然后对整个基板进行光刻(同样是半导体加工工艺中公知的制作图形的方法)得到需要的电极形状。接着腐蚀掉金层和铬层上不需要的部分。最终得到所需的电极。当然，电镀等本领域公知的加工金属的方法也可以用来制造电极。 

本实施例采用铬和金来制作电极，是因为金的生物兼容性很好，而铬是为了增加金和基板材料之间的黏附性。在不同的需求下，其它的导电材料，例如铝、铜或者导电聚合物都可以用来制造电极。 

如图1所示的实施例中，电极的高度为0.6微米，这是因为这个高度的电极易于加工最适合用溅射工艺加工的。但同时已经被实验证实的是：当实施透皮电穿孔时电极高度从 0.1微米到500微米都是合适的。所以，电极高度可以由本领域技术人员根据不同的需求和加工方法来确定。 

如图2所示的实施例中，电极的宽度为200微米，电极之间的距离为500微米，电极的高度为12微米，这种尺寸的电极所产生的电场是对小鼠腓肠肌输运核酸的最优选电场。当需要对其它细胞进行电穿孔时，可以本领域技术人员自行选择合适的电极宽度和电极间距。 

3成型方法 

柔性基板可以采用铸模及热塑等方法按照进行成型以适应对象组织的外形。在图2所示的优选实施例中，采用Parylene材料作为基板材料。在完成微细电极的制作之后，将基板放入相应的夹具中，在230摄氏度中放置1小时，Parylene材料就会被热塑成相应的外形。 

5核酸输运方法 

如图2所示，本发明所述的芯片及方法适用于体表浅层组织的核酸输运及生物脏器的核酸输运，分别描述如下： 

A体表浅层组织的核酸输运： 

首先将核酸引入活体组织内，引入方法可以采用直接皮下注射，也可以采用直接静脉注射的方式，利用生物体自身的血液循环将核酸带到目标组织。对于某些无法通过血管屏障的核酸，则可以采用载体包裹之后再进行静脉注射。在核酸到达目标组织后，将柔性电极芯片贴附于活体组织的表皮外，通过电极芯片向活体组织施加合适的电场。电场将造成活体组织中的细胞发生电穿孔现象，核酸将通过细胞膜上的孔进入细胞内部。至此，完成核酸输运过程。已经被实验所证实的是，电场强度为800V/cm至3000V/cm都可以成功的使体表浅层组织的细胞发生电穿孔。 

B生物体内脏器的核酸输运： 

在对生物体内脏器进行核酸输运来说，首先要将柔性电极芯片植入生物体内，植入过程可以采用已公开的手术技术，将电极芯片直接贴附于脏器表面。在核酸引入方面，无法采用直接皮下注射的方式，需要采用静脉注射等间接方式，借助于生物体本身的血液循环，将核酸引入脏器。此后通过电极芯片向脏器施加合适的电场，电场将造成脏器中的细胞发生电穿孔现象，核酸将通过细胞膜上的孔进入细胞内部。至此，完成核酸输运过程。已经被实验所证实的是，电场强度为120V/cm至1000V/cm都可以成功的使脏器细胞发生电穿孔并依然保持其生理功能。 

6具体制造步骤 

由如下两套不同的制作工艺已经成功制造出了本发明所述芯片。给出具体制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而并不是对本发明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。 

制作方法A： 

采用半导体制造工艺常用的4英寸硅片，在硅片上蒸镀(常用的半导体薄膜加工技术)一层厚度为10微米的Parylene薄膜层，紧接着在Parylene薄膜层上溅射(常用的半导体加工技术)0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层。对整个硅片进行光刻(采用AZ4620光刻胶，厚度为15微米)，定义出所需电极的形状。将整个硅片进行电镀，这时没有光刻胶覆盖的位置(也就是微细电极的位置)将生长金材料。当金材料的厚度达到12.6微米时，去除光刻胶。使用碘化钾溶液腐蚀0.5微米的金层，使用硝酸铈铵溶液腐蚀0.1微米的铬层，此时只有经过电镀的区域存在金材料。将表面带有微细电极的Parylene薄膜整体从硅片上揭下并按所需尺寸进行切割。将切割好的Parylene薄膜放入相应夹具中，在温度为230摄氏度的烘箱中放置1小时。最后取出Parylene薄膜即得到所需的柔性电极芯片。 

制作方法B： 

同样采用半导体制造工艺常用的4英寸硅片，在硅片上旋涂(Spin，常用的半导体薄膜加工技术)一层厚度为20微米的聚酰亚胺薄膜层，紧接着在聚酰亚胺薄膜层上蒸镀(常用的半导体加工技术)0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层。对整个硅片进行光刻(采用RZJ-304光刻胶，厚度为2微米)，定义出所需电极的形状。使用碘化钾溶液腐蚀0.5微米的金层，使用硝酸铈铵溶液腐蚀0.1微米的铬层，此时被光刻胶保护的区域(也就是微细电极的区域)中的金和铬将不会被腐蚀。完成腐蚀过程并去除光刻胶后，将表面带有微细电极的聚酰亚胺薄膜整体从硅片上揭下并按所需尺寸进行切割即得到所需的柔性电极芯片。 

7具体核酸输运方法 

由如下的三种方法已经将本发明所述芯片成功应用于对活体组织输运核酸。给出具体方法是为了帮助本领域技术人员理解柔性芯片的功能及核酸输运方法，而并不是对本发明所述装置的适用范围做出限定。 

输运方法A： 

取用体重为18-22g的C57BL/6小鼠，向其腿部腓肠肌注射40μl(2μg/μl)的透明质酸(这 是为了使肌肉组织疏松，以便后续注射的DNA渗入组织中)。20分钟后，向腓肠肌注射40μl(1μg/μl)DNA(该DNA编码有pmRFP-C1荧光蛋白)。5分钟后，将柔性电极芯片直接贴附于腓肠肌外的皮肤表层，施加电场，其强度为2000V/cm，脉冲宽度为20ms，脉冲间隔为2s，一共施加5个脉冲。将柔性电极芯片取下并继续培养小鼠72小时。72小时后可在活体成像仪中观察到显著的红色荧光。具体输运结果见图3，经过柔性电极芯片处理的小鼠表达了和经过已公开技术中的插入式针尖处理的小鼠相同强度的荧光。继续观察小鼠96小时，可见经柔性电极芯片处理的小鼠腿部功能正常，而经插入式针尖处理的小鼠腿部已经残疾，完全失去功能。 

输运方法B： 

同样取用体重为18-22g的C57BL/6小鼠，剖开小鼠胸腔，将柔性电极芯片贴附于小鼠心脏表面并用少量生物胶进行粘结，此后缝合小鼠胸腔(电极引线直接于胸腔中穿出)。继续培养小鼠72小时以待伤口初步愈合。通过静脉注射120μl(1μg/μl)DNA(该DNA编码有pmRFP-C1荧光蛋白)。5分钟后，待DNA通过血液循环到达心脏部位并富集时，施加电场，其强度为400V/cm，脉冲宽度为5ms，脉冲间隔为4s，共施加3个脉冲。继续培养小鼠72小时，其后进行解剖，可通过活体成像仪观察到心脏表面显著的红色荧光表达。输运方法C： 

取用体重为24-28g的BALB/C裸鼠，在其腋下部位注射经过DNA改造从而会自发荧光的MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)以诱导肿瘤，约1周后，肿瘤增大至400mm³。通过静脉注射360μl(1μg/μl)被Lipid载体包裹siRNA(小干扰核酸，其会抑制MDA-MB-231细胞的基因表达)。5分钟后，部分siRNA将达到肿瘤部分，此后将柔性电极芯片直接贴附于肿瘤外的皮肤表层，施加电场，其强度为1200V/cm，脉冲宽度为10ms，脉冲间隔为2s，一共施加5个脉冲。将柔性电极芯片取下并继续培养小鼠72小时。72小时后可在活体成像仪中观察到肿瘤区域的荧光显著降低，说明肿瘤细胞的基因表达得到了抑制。 

Claims (2)

1.一种用于向活体组织中的细胞内部输运核酸的柔性电极芯片，包括：

柔性基板，以及制作在基板上的微细电极，所述的柔性基板，可以弯曲并可以根据活体组织的外形制作成不同的形状；所述的电极，是成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；

所述每对电极的阳极和阴极之间的距离为50微米至1毫米；

所述柔性电极芯片的制备方法包括：采用半导体制造工艺常用的4英寸硅片，在硅片上蒸镀一层厚度为10微米的聚对二甲苯薄膜层，紧接着在聚对二甲苯薄膜层上溅射0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层；对整个硅片进行光刻，光刻采用的光刻胶为AZ4620光刻胶，厚度为15微米，定义出所需电极的形状；将整个硅片进行电镀，这时没有光刻胶覆盖的位置，也就是微细电极的位置，将生长金材料；当金材料的厚度达到12.6微米时，去除光刻胶；使用碘化钾溶液腐蚀0.5微米的金层，使用硝酸铈铵溶液腐蚀0.1微米的铬层，此时只有经过电镀的区域存在金材料；将表面带有微细电极的聚对二甲苯薄膜整体从硅片上揭下并按所需尺寸进行切割；将切割好的聚对二甲苯薄膜放入相应夹具中，在温度为230摄氏度的烘箱中放置1小时；最后取出聚对二甲苯薄膜即得到所需的柔性电极芯片。

2.如权利要求1所述的柔性电极芯片，其中，基板材料可以通过热塑成型的方式加工成所需的形状。

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