JP2001245679A - ＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡＲＥＥＳＥＩのβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニングおよび増幅によるセルロースの改良糖化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 洗浄剤とセロオリゴ糖の単離に有効なβ−グ
ルコシダーゼを含有しないセルラーゼ組成物を糸状菌類
によって産生する。 【解決手段】 β−グルコシダーゼを含むセルラーゼ組
成物を産生する糸状菌類のゲノムから、β−グルコシダ
ーゼを発現する遺伝子を欠損させて、この糸状菌によっ
てβ−グルコシダーゼを含まないセルラーゼ組成物を産
生させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はセルラーゼの調製お
よび増大したまたは減少したセルロース分解能を有する
組成物に関するものである。本発明はさらに、糸状菌類
からの細胞外β−グルコシダーゼをコードするｂｇｌ１
遺伝子のヌクレオチド配列、細胞外β−グルコシダーゼ
をコードする遺伝子を含有するプラスミドベクターおよ
びゲノム中に導入される増大したコピー数のβ−グルコ
シダーゼ（ｂｇｌ１）遺伝子を有する形質転換体菌株に
関するものである。さらに詳しくは、本発明は、他の組
成物と共に用いられ、増大したまたは減少したセルロー
ス分解能を有するセルラーゼ製品を製造する高められた
または全くない細胞外β−グルコシダーゼタンパク質レ
ベルとなるｂｇｌ１遺伝子の増大したレベルまたは全く
ないレベルの発現を有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒ
ｅｅｓｅｉ菌株に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】セルラーゼは、セルロース（β−１、４
−グルカン結合）を加水分解し、それによりグルコー
ス、セロビオース、セロオリゴ糖等を形成する酵素とし
て従来技術において知られている。ウッドらの「酵素学
における方法」、160 、25、234頁（1988）やその他の
文献に記載されているように、所定の微生物により産生
されたセルラーゼは、エキソセロビオヒドロラーゼ（Ｅ
Ｃ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、エンドグルカナ
ーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、β−グルコ
シダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）として
同定されたものを含むいくつかの異なった酵素綱からな
る。さらに、ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの菌類分類はさら
に、各分類内の多成分を含むほどさらに広げられる。例
えば、多発性のＣＢＨおよびＥＧは、２つのＣＢＨ、す
なわち、ＣＢＨ ＩおよびＣＢＨ ＩＩ成分、および少
なくとも３つのＥＧ、すなわち、ＥＧ Ｉ、ＥＧ ＩＩ
およびＥＧ ＩＩＩ成分を含有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａ ｒｅｅｓｅｉを含有する様々な細菌源と菌源から
単離される。

【０００３】各ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧ分類からの成分
を含有する完全セルラーゼ系は、セルロースの結晶性形
状をグルコースに能率的に転化するのに必要とされる。
単離成分は、結晶性セルロースを加水分解するのに効果
的であるにしろ非常にわずかである。さらに、特にセル
ラーゼ成分が異なる分類のものである場合、それらの成
分間で相乗作用が観察される。すなわち、完全セルラー
ゼ系の効果は、同一分類の単離成分からの寄与の合計よ
りも著しく大きい。この点に関して、ＥＧ成分とＣＢＨ
成分が相乗的に相互作用してより能率的にセルロースを
分解することが従来技術において知られている。例え
ば、ウッド、バイオケム．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、13、
407 −410 頁（1985）参照のこと。

【０００４】異なるセルラーゼ成分の作用機構および基
質特異性は、分類により異なり、その分類は結合した成
分の相乗作用を説明する。例えば、現在受け入れられて
いるセルラーゼの作用機構は、エンドグルカナーゼ成分
が、特にセルロースの低結晶度領域における、内部のβ
−１、４−グルコシド結合を加水分解し、エキソ−セロ
ビオヒドロラーゼ成分は、セルロースの非還元末端から
のセロビオースを加水分解することである。エンドグル
カナーゼ成分の作用は、エキソ−セロビオヒドロラーゼ
成分により認識される新しい鎖末端を生成することによ
りエキソ−セロビオヒドロラーゼの作用を著しく促進せ
しめる。

【０００５】β−グルコシダーゼは、セルラーゼシステ
ムの必須成分であり、セルロースのグルコースへの完全
な酵素的分解に重要である。β−グルコシダーゼ酵素
は、メチルβ−Ｄ−グルコシドおよびｐ−ニトロフェニ
ルグルコシドのようなアルキルおよび／またはアリルβ
−Ｄ−グルコシド、並びにセロビオースのような炭水化
物残留物のみを含有するグリコシドの加水分解に触媒作
用せしめる。β−グルコシダーゼによるセロビオースの
触媒作用は微生物のためにグルコース産生し、さらにセ
ロビオースの蓄積がセロビオヒドロラーゼおよびエンド
グルカナーゼを阻害し、それゆえセルロースからグルコ
ースへの加水分解の速度を減少せしめるので、β−グル
コシダーゼによるセロビオースの触媒作用は重要であ
る。

【０００６】β−グルコシダーゼは多数の異なる基質の
加水分解に触媒作用せしめるので、様々な異なる用途に
おいてこの酵素を使用することができる。例えば、果物
中の芳香を、その中に存在する様々なグルコシドを触媒
作用せしめることにより離生するのにあるβ−グルコシ
ダーゼを用いることができる。同様に、グナタらにより
記載された「様々なβ−グルコシダーゼによるグレープ
モノテルフェニルβ−Ｄ−グルコシドの加水分解」、
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、38巻、1232−
1236頁（1990）のように、加水分解により、ワインへの
重要な潜在的芳香の供給源を代表するグレープモノテル
フェニルβ−グルコシドを加水分解できる。

【０００７】さらに、セルラーゼは、バイオマスをエタ
ノールに分解するのに酵母と組み合わせて用いられ、こ
こでセルロースは、酵母がさらにエタノールに発酵でき
るグルコースにセロビオースを分解する。セルロースの
容易に得られる供給源からのエタノールのこの産生によ
り、安定で継続的な燃料源が供給される。エタノールの
燃料としての使用は、石油燃料産物と比較して、都市の
空気汚染、スモッグ、およびオゾン水準を低減し、それ
ゆえ環境をよくするといった多くの利点がある。さら
に、燃料源としてエタノールを使用すれば、海外からの
原油輸入および石油化学供給の依存性を減じられる。

【０００８】しかし、バイオマスからのエタノール生産
に対する主な律速段階は、セロビオースをグルコースに
能率的に転化するシステムにおけるβ−グルコシダーゼ
の量が不十分なことである。それゆえ、より多くの量の
β−グルコシダーゼを含有するセルラーゼ組成物はエタ
ノール産生に有用である。

【０００９】それに反して、ある場合においては、β−
グルコシダーゼが欠損した、好ましくはβ−グルコシダ
ーゼのないセルラーゼ組成物を産生することが望まし
い。そのような組成物はセロビオースおよび他のセロオ
リゴ糖の産生にも好ましい。

【００１０】β−グルコシダーゼは、様々な原核生物、
並びに真核生物中に存在する。β−グルコシダーゼをコ
ードする遺伝子は、いくつかの原核生物からクローンさ
れ、その遺伝子は大規模な遺伝子工学を必要とすること
なくＥ．ｃｏｌｉ中の検知可能な量のタンパク質の合成
を指示することができるが、ある場合には、ベクターに
より提供されるプロモーターとの連結が必要なこともあ
る。しかしながら、β−グルコシダーゼはそのような生
物により商業的に実行可能な量では産生されない。

【００１１】さらに、そのような原核遺伝子はしばし
ば、真核宿主の転換後には発現も検出もされない。それ
ゆえ、菌類菌株を使用するために、ここに記載した方法
を用いてまたは核酸雑種形成によるＴ．ｒｅｅｓｅｉ
ｂｇｌ１遺伝子による検出により菌類遺伝子をクローン
する。セルロース加水分解におけるβ−グルコシダーゼ
成分の寄与および生化学は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉおよび他
の菌類源と関連した酵素形態の明らかな多様性により複
雑となる（エナリら、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅ
ｓｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒβ−グ
ルコシダーゼの精製」Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、３巻、157 −163 頁（1981）；ユミレら、「Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉ中の構造形質膜結合β
−グルコシダーゼ」、ＦＥＭＳ Ｍｉｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、34巻、291 −295 頁（1986）；ジ
ャクソンら、「陰極ラン、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、32
巻、903 −909 頁（1988））。これらと多くの他の著者
は、70−80Ｋｄのサイズで7.5 −8.5 のｐＩの範囲に亘
るβ−グルコシダーゼ酵素を報告している。さらに最近
のデータは、β−グルコシダーゼの細胞外および細胞壁
関連形状が同一の酵素であり（ホファーら、「Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからのアルカリ性細胞外
β−グルコシダーゼに対する単クローン性抗体：他のＴ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａβ−グルコシダーゼとの反応
性」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、99
2 巻、298 −306頁（1989）；メスナーおよびクビセ
ク、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９
４１４からの細胞壁中の単特異性β−グルコシダーゼの
形跡」、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．、12巻、685 −690 頁（1990））、様々なサイズと
ｐＩは後翻訳修飾および酵素精製の異種異質法の結果で
ある。4.4 のｐＩと98,000の明確な分子量を有する細胞
内β−グルコシダーゼ種が新たなβ−グルコシダーゼ
（イングリンら、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓ
ｅｉの新たな細胞内β−グルコシダーゼの部分的精製お
よび特徴付け」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、185 巻、515
−519 頁（1980））または別のタンパク質に関連するア
ルカリ性細胞外β−グルコシダーゼの原核断片（ホファ
ーら、前出）であるか否か知られていない。

【００１２】検出可能なβ−グルコシダーゼ活性の大部
分は細胞壁に結合したままとなっているので（クビセ
ク、「Ｔｒｉｃｈｏｄｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの細胞壁か
らのβ−グルコシダーゼおよびカルボキシメチルセルラ
ーゼの放出」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．13巻、226 −231 頁（1981）：メスナーおよび
クビセク、前出；メスナーら、「Ｔｒｉｃｈｏｄｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉの細胞壁からの多糖類の活性化およびβ
−グルコシダーゼ結合の単離」、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ．、154 巻、150 −155 頁（1990））、セルラ
ーゼの商業的標品は、精製セルラーゼ標品中の比較的低
濃度のβ−グルコシダーゼのためにグルコースを産生す
る能力が減少せしめられると思われている。

【００１３】糸状菌類により産生されたセルラーゼを用
いたセルロースからのグルコースの産生において律速で
あるβ−グルコシダーゼの問題を克服するために、その
技術はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのβ−グルコシダーゼと
ともにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのセルロ
ース分解システムの捕捉を開示し、結果はセルロースか
らグルコースへの糖化が増加したことを示す（ダフ、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔｔｅｒｓ、７、185 （198
5）。ステルンバーグら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．、23、139 （1977）およびタンヌら、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、23、1837（1981）に記載
されているように、菌類の培養条件を変更してＴｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ中のβ−グルコシダーゼ
活性を増大せしめ、紫外線突然変異により得られた突然
変異菌株がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ中のβ
−グルコシダーゼの産生を高めたことが報告されてい
る。これら上述した方法は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉ中のβ−グルコシダーゼの量を増加せしめ
ているが、その方法は実用性を欠いており、多くの例に
おいて、商業的に実行可能ではない。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】より多量のβ−グルコ
シダーゼを産生するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓ
ｅｉまたは他の糸状菌類の遺伝子的に製造した菌株は、
能率的なセルラーゼシステムを作成するだけでなく、さ
らにｂｇｌ１遺伝子のより高い水準の発現を使用して増
大したセルロース分解能を有するセルラーゼ製品を産生
するのに理想的である。そのような菌株は転換を用いて
実行可能に産生できる。

【００１５】しかし、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅ
ｓｅｉまたは他の糸状菌類の突然変異菌株を転換するた
めに、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたは他
の糸状菌類のｂｇｌ１遺伝子のアミノ酸配列は、ｂｇｌ
１遺伝子がクローンされてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒ
ｅｅｓｅｉまたは他の糸状菌類の突然変異菌株中に導入
されるように最初に特徴付けられなければならない。

【００１６】加えて、一度ｂｇｌ１遺伝子が認識された
ら、ｂｇｌ１遺伝子の線状断片内の情報は、β−グルコ
シダーゼのないセルラーゼ組成物を産生するＴｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたは他の糸状菌類の菌株
を調製するのに用いられる。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明は、部分的には、
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたは他の糸状
菌類からの細胞外または細胞壁結合β−グルコシダーゼ
をコードするｂｇｌ１遺伝子の特徴付けを意図するもの
である。また、転換工程に用いられ、ｂｇｌ１遺伝子を
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたは他の糸状
菌類中に多様なコピーで導入し、それにより著しく増大
したβ−グルコシダーゼ活性を有するセルラーゼ組成物
を産生する転換菌株を生成するプラスミドベクター中へ
のｂｇｌ１遺伝子のクローニングに関する。

【００１８】さらに、本発明の一部は、Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたは他の糸状菌類ゲノムから
のｂｇｌ１遺伝子の欠損または分断に関するものであ
る。加えて、酵素の特性を変更するｂｇｌ１遺伝子の変
更コピーは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉま
たは他の糸状菌類ゲノム中に再導入される。

【００１９】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉか
らの細胞外または細胞壁結合β−グルコシダーゼタンパ
ク質のアミノ酸配列が、ｂｇｌ１遺伝子を適切なプラス
ミドベクター中にクローンさせられるほど十分に詳しく
得られた。次いでそのプラスミドベクターは、糸状菌類
の菌株を転換するのに用いられ、その中に導入されたｂ
ｇｌ１遺伝子の多様コピーを有する転換体を産生する。

【００２０】本発明は、細胞外β−グルコシダーゼのな
いβ−グルコシダーゼ糸状菌類からのセルラーゼを発現
する方法に関するものである。

【００２１】さらに別の方法の一面において、本発明
は、糸状菌類中の変更した細胞外β−グルコシダーゼを
発現する方法に関するものである。

【００２２】別の一面において、本発明は、Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの細胞外β−グルコシ
ダーゼのアミノ酸配列に関するものである。

【００２３】さらに別の一面において、本発明は、プロ
ーブとしてＴ． ｒｅｅｓｅｉ細胞外β−グルコシダー
ゼ遺伝子の完全なまたは部分的なヌクレオチド配列から
なり、他のβ−グルコシダーゼ糸状菌類からの等量のｂ
ｇｌ１遺伝子を認識し、クローンする配列からなるヌク
レオチド配列に関するものである。

【００２４】組成物の一面において、新しく有用なＴｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの転換体に関し、そ
の転換体は、菌類セルラーゼ組成物、特にβ−グルコシ
ダーゼの欠損した菌類セルラーゼ組成物を製造するのに
用いられる。また、本発明において、ｂｇｌ１遺伝子を
変更し、その変更したｂｇｌ１遺伝子をＴ．ｒｅｅｓｅ
ｉ中に導入して、変更した菌類セルラーゼ組成物を産生
するのに用いられる転換体を産生することを検討する。

【００２５】別の組成物の一面において、本発明は、転
換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ菌株により調
製した菌類セルラーゼ組成物に関するものである。

【００２６】

【発明の効果】本発明の態様におけるＴ．ｒｅｅｓｅｉ
菌株からのｂｇｌ１遺伝子の欠損は、洗浄剤と、セロオ
リゴ糖（セロビオース）の単離に使用されるセルラーゼ
組成物の調製に特に有用である。

【００２７】セルラーゼ酵素は様々な洗浄剤組成物に用
いられ、酵素的に衣類を柔らかくし、色を復元せしめて
いる。しかしながら、この従来技術において、セルラー
ゼ酵素を使用すると衣類のセルロース繊維を分解するこ
とが知られている。分解効果を減少せしめる１つの可能
性は、β−グルコシダーゼを含有しない洗浄剤を製造す
ることである。それゆえ、このタンパク質の欠損は、セ
ロビオースの蓄積により他の成分を抑制するセルラーゼ
システムに効果がある。

【００２８】

【発明の実施の形態】ここに用いているように、「増大
細胞外β−グルコシダーゼ」または「増大β−グルコシ
ダーゼ」という用語は、細胞外β−グルコシダーゼをコ
ードする遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーがゲノ
ム中に導入されたことを意味する。

【００２９】「ｂｇｌ１遺伝子の欠損」という用語は、
ｂｇｌ１遺伝子がゲノムから欠損せしめられ、それゆえ
組換え宿主微生物により発現されないこと、またはｂｇ
ｌ１遺伝子が、機能細胞外β−グルコシダーゼ酵素が組
換え宿主微生物により産生されないようにゲノム中で破
壊されたことのいずれかを意味する。

【００３０】「変性β−グルコシダーゼ」または「変性
β−グルコシダーゼ遺伝子」という用語は、発現された
タンパク質のアミノ酸配列が、遺伝子の核酸配列または
タンパク質のアミノ酸配列を、除去すること、加えるこ
と、および／または操作することにより変性せしめられ
たことを意味する。

【００３１】「組換え手段により」という用語は、通常
隣接しないＤＮＡの片をともに連結することにより試験
管中で生成したＤＮＡ分子で微生物を転換せしめること
を意味する。

【００３２】「細胞外β−グルコシダーゼを含まないセ
ルラーゼ」という用語は、機能細胞外β−グルコシダー
ゼ酵素を含有しないセルラーゼ組成物を意味する。その
ような組成物は好ましくは、糸状菌類を培養することに
より産生され、ここでβ−グルコシダーゼ遺伝子が欠損
されているかまたは破壊されているかのいずれかであ
る。好ましくは、これらの組成物は糸状菌類を培養する
ことにより産生され、ここでβ−グルコシダーゼ遺伝子
は欠損せしめられている。

【００３３】「糸状菌類」という用語は、いかなるそし
て従来技術において認識されている全ての糸状菌類を意
味する。

【００３４】「β−グルコシダーゼ糸状菌類」という用
語は、β−グルコシダーゼを含有するセルラーゼ組成物
を産生する糸状菌類を意味する。

【００３５】「セロオリゴ糖」という用語は、β−１，
４連結を有する２−８グルコース単位を含有するオリゴ
糖を意味する。そのようなセロオリゴ糖は、セロビオー
ス（β−１、４−連結を有するジグルコース）を含み、
好ましくはセルロースから誘導される。より詳しくは、
本発明は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
（「Ｔ．ｒｅｅｓｅｉと称することもある）からの細胞
外または細胞壁結合タンパク質をコードするｂｇｌ１遺
伝子の単離と特徴付け、並びにこの遺伝子のアミノ酸配
列および特異的ヌクレオチドに関するものである。ｂｇ
ｌ１遺伝子は、プラスミドベクター中にクローンされ、
このベクターはさらに、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの転換菌株
と、挿入されるｂｇｌ１遺伝子の余分のコピーを有する
他の糸状菌類とを産生するのに用いられる。次いでこれ
らの転換体は、増大したβ−グルコシダーゼ活性を有
し、それゆえセルロース分解を高めるセルラーゼ組成物
を産生するのに用いられる。ｂｇｌ１遺伝子の余分なコ
ピーをＴ．ｒｅｅｓｅｉ中に挿入することによりセルロ
ース分解を高めることの他にも、本発明では、ｂｇｌ１
遺伝子の欠損した転換菌株を産生することも検討してい
る。

【００３６】また、本発明ではｂｇｌ１遺伝子それ自身
の中のアミノ酸配列の操作も検討している。この酵素上
の活性部位を変更せしめることにより、触媒転化におい
て様々な異なった変化が導かれる。例えば、β−グルコ
シダーゼはヒドロラーゼ活性とトランスフェラーゼ活性
の両方を有しているので、アミノ酸配列を変更すると、
ヒドロラーゼ活性が除去され、トランスフェラーゼ活性
が増大することになり、それゆえ、β１、４オリゴ−デ
キストリンの合成を促進せしめる。さらに、β−グルコ
シダーゼのアミノ酸配列の操作により、異なるｐＨ最適
条件、異なる温度最適条件、変性触媒回転置換率（Ｖｍ
ａｘ）、セロビオースの増大した親和性またはより遅い
またはゼロの反応速度となるセロビオースの減少した親
和性に導かれるセロビオースの変性親和性（Ｋｍ）、グ
ルコースのより低いまたは高い水準がβ−グルコシダー
ゼ活性を抑制するような変性産生物抑制プロフィール等
のようなシステムにおいてさらに変化が生じる。

【００３７】さらにまた、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ中の細胞外
β−グルコシダーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列ま
たはその部分を含有する核酸配列を標識し、他の糸状菌
類中に等量のｂｇｌ１遺伝子を認識してクローンするプ
ローブとして用いることができる。

【００３８】一般的に、本発明は、続いてクローンされ
るｂｇｌ１遺伝子を含有する単一のＴ．ｒｅｅｓｅｉ断
片を認識するプローブとして用いられる遺伝子の７００
ｂｐｃＤＮＡ断片を認識することによるＴ．ｒｅｅｓｅ
ｉからのｂｇｌ１遺伝子の単離を含む。ｂｇｌ１遺伝子
の種相同性のために、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのｂｇｌ１遺伝
子の断片を用いたプローブは、他のセルロース分解微生
物中のｂｇｌ１遺伝子を認識するのに用いられ、以下の
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉに関する記載も他のβ−グルコシダー
ゼ糸状菌類に適応できると考えられる。

【００３９】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの場合、この６．０ｋｂ
断片をｐＵＣプラスミド中にクローンし、一連の遺伝地
図作成実験を行ない、完全なｂｇｌ１遺伝子がこの断片
中に含有されることを確認する。次いでヌクレオチド配
列を両方の鎖に決定し、イントロン／エキソン境界にお
よぶｂｇｌ１ ｃＤＮＡサブクローンの配列分析により
２つのイントロンの部分を確認する。ｂｇｌ１遺伝子の
単離後、追加のｂｇｌ１遺伝子コピーをＴ．ｒｅｅｓｅ
ｉまたは他の糸状菌類中に導入し、β−グルコシダーゼ
の発現を増大せしめる。

【００４０】これに対して、完全なｂｇｌ１遺伝子は、
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉまたは他のβ−グルコシダーゼ糸状菌
類のゲノムから欠損でき、それにより、β−グルコシダ
ーゼを含まないセルラーゼを発現する転換体を産生す
る。

【００４１】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのｂｇｌ１遺伝子の
単離は、細胞外β−グルコシダーゼの精製、このタンパ
ク質の化学分解とタンパク質分解、タンパク質分解断片
の配列の単離と決定、およびタンパク質配列を用いた合
成オリゴマーＤＮＡプローブの設計を含む。次いでさら
にオリゴマープローブは、標識でき、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ
からの切断ゲノムＤＮＡからの断片内に完全なｂｇｌ１
遺伝子を含有する断片を後に認識するのに用いられる７
００ｂｐβ−グルコシダーゼｃＤＮＡ断片を認識するの
に用いられる。

【００４２】さらなる分析にプローブとして用いられる
適切なｃＤＮＡ断片を認識するために、全ＲＮＡをＴ．
ｒｅｅｓｅｉ菌糸から最初に単離し、ポリアデニル化Ｒ
ＮＡをそこから単離する。次いでポリアデニル化ＲＮＡ
は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｂｇｌ１遺伝子をコードする特
異的ｃＤＮＡのみを増幅する特異的オリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅されるｃＤＮＡプールを産生す
るのに用いられる。

【００４３】より詳しくは、全ＲＮＡはＴ．ｒｅｅｓｅ
ｉの開始菌株から最初に単離される。本発明に用いられ
る開始菌株は、従来技術に知られているいかなるＴ．ｒ
ｅｅｓｅｉセルラーゼ過剰産生菌株であってもよい。こ
のセルラーゼ産生菌株は、従来技術により知られている
普通の突然変異誘発と選択方法によりいかなるＴ．ｒｅ
ｅｓｅｉ菌株により一般的に発達せしめられる。選択し
た菌株がセルラーゼを過剰産生することの確認は、既知
の分析方法により行なわれる。好ましい菌株は、容易に
入手しやすいＲＬＰ３７である。

【００４４】適切な成長媒質中で成長する、産生菌株に
亘るＴ．ｒｅｅｓｅｉからの菌糸接種を基本培地に加
え、25℃から32℃、好ましくは30℃の温度で50−65時間
の期間に亘り培養した。この培養期間の間、新鮮な基本
培地は置き換えられる。次いで培養培地を遠心分離し、
菌糸をそこから単離して洗浄する。次いで菌糸を緩衝液
中で再懸濁せしめて成長させ、１ｍＭのソホロース（グ
ルコースのβ、１−２二量体）を菌糸に加えてセルラー
ゼ酵素の産生を誘発せしめる。収穫の前に、菌糸標品を
追加の時間、好ましくは30℃で18時間に亘り培養する。

【００４５】プロテイナーゼＫリーシス、続いてのフェ
ノール：クロロホルム抽出、グアニジニウム イソチオ
シアネート抽出、続いての塩化セシウム勾配、塩酸グア
ニジンと有機溶媒抽出等のような従来技術において知ら
れている様々な方法により、全ＲＮＡは菌糸標品から単
離できる。チンバーレイクらにより「Ａ．ｎｉｄｕｌａ
ｎｓの無性胞子中で特異的に発現された遺伝子クラスタ
ーの機構」Ｃｅｌｌ、26、29−37頁（1981）に記載され
た方法によって全ＲＮＡを単離することが好ましい。濾
過により菌糸を培養培地から単離する。次いで抽出緩衝
液、ＴＥ−飽和フェノールとクロロホルムを転化するこ
とによりＲＮＡを菌糸から抽出する。水相を除去し、約
60℃から80℃の間の温度、好ましくは68℃での水浴中で
抽出混合物を加熱することにより抽出緩衝液のみで有機
相を再抽出し、ポリゾーム中で捕捉されたＲＮＡを界面
で放出せしめる。次いで抽出した水相全てをプールし、
遠心分離し、界面にもはやタンパク質がなくなるまでフ
ェノール−クロロホルムで再抽出する。さらにＲＮＡ
を、３Ｍの酢酸ナトリウムの0.1 容積と95％のエタノー
ルの２容積で沈殿せしめ、ＲＮアーゼ抑制因子を含有す
るＤＥＰ−水中で再懸濁する前に遠心分離により沈殿せ
しめる。

【００４６】次いで全ＲＮＡを１％のホルムアルデヒド
−アガロースゲル上で分画し、ニトラン^ＴＭ膜にブロッ
トし、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ２遺伝子の断片を用い
てプローブして、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ標品中のセルラーゼ
システムの酵素をコードする遺伝子が、ソホロースの転
化により実際に誘発されるか否かを決定する。基本的
に、本発明に用いるプローブは、既知の方法により産生
されたＣＢＨ ＩＩクローンから誘導する。どのように
クローンが産生されたかは、より詳細にチェンらの「Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからのセロビオヒ
ドロラーゼＩＩのヌクレオチド配列と推測の主な構造」
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５巻（1987、３月）に
記載されている。ＣＢＨ ＩＩクローンに部位定方向突
然変異を行ない、Ｂｇｌ ＩＩ部位を読み取り枠の正確
な５′末端に配し、Ｎｈｅ Ｉ部位を正確な３′末端に
配した。ＣＢＨ ＩＩ暗号配列を含有するＮｈｅ Ｉ制
限断片をさらにｐＵＣ２１８ファージミド（ｐｈａｇｅ
ｍｉｄ）中にクローンした。ＣＢＨ ＩＩ遺伝子をさら
に切断し、標識を添加する前にゲルを単離した。

【００４７】ｃｂｈ２プローブでプローブしたＴ．ｒｅ
ｅｓｅｉＲＮＡのノーザンブロットの結果により、ｃｂ
ｈ２特異的ｍＲＮＡの水準が誘発後の14−18時間でピー
クに達したことが示された。このデータから、β−グル
コシダーゼを含有する完全なセルラーゼ複合体はこのと
きに誘発されることが推論できる。14、18および22時間
からの全ＲＮＡをプールする。

【００４８】全ＲＮＡの特定の分画をプールした後、ポ
リアデニル化ｍＲＮＡをさらに全ＲＮＡから単離する。
転写後のポリアデニル化はほとんどの真核ｍＲＮＡの生
物発生の普通の性質である。新たに合成したｍＲＮＡ
は、ｍＲＮＡの年齢のように短くなる傾向にある長いポ
リ（Ａ）道（ｔｒａｃｔ）を有する。新たに合成したポ
リアデニル化ｍＲＮＡはさらに、既知の方法により全Ｒ
ＮＡから単離する。これらの方法は、オリゴ（ｄＴ）−
セルロース、ポリ（Ｕ）セファロースの使用、ポリ
（Ｕ）フィルターまたはニトロセルロース膜フィルター
への吸収とそれからの溶出等を含む。サムブルックらに
よる、分子クローニング、研究所マニュアル、第２版、
コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（198
9）に記載されている方法に従うｍＲＮＡの単離におい
て、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーを使
用することが好ましい。さらに具体的には、全ＲＮＡの
分画はクロマトグラフィー樹脂を通過せしめ、ｍＲＮＡ
を溶出緩衝液でそこから溶出せしめる。カラムに結合し
たＲＮＡは、ポリ（Ａ）尾を含有するＲＮＡが豊富であ
り、それゆえ、ｒＲＮＡおよび部分的に分解したｍＲＮ
Ａのような不純物を除去する。ｃＤＮＡをｍＲＮＡから
合成する場合、より高いｍＲＮＡコピーの産生と非メッ
センジャーＲＮＡのより少ない疑似コピーが生じるよう
に、精製を首尾よく行なうことが重要である。

【００４９】標品からのポリアデニル化ＲＮＡおよび全
ＲＮＡをさらに１％のホルムアルデヒドゲル上で分画
し、ニトラン^Ｒ 膜にブロットし、分析してセルラーゼ
複合体中の酵素がポリアデニル化ｍＲＮＡとして誘発さ
れたことを確認した。

【００５０】全ＲＮＡからのポリアデニル化ｍＲＮＡの
単離後、相補ＤＮＡまたはｃＤＮＡをそこから合成す
る。ｃＤＮＡの第１の鎖を、酵素ＲＮＡ−依存ＤＮＡポ
リメラーゼ（逆トランスクリプターゼ）を用いて合成
し、反応に触媒作用せしめる。アビアンレトロウイルス
の粒子またはマウスの逆トランスクリプターゼから精製
したアビアン逆トランスクリプターゼを本発明で用いる
が、マウスの逆トランスクリプターゼは、モロニーマウ
ス白血病ウイルスの逆トランスクリプターゼ遺伝子のク
ローンしたコピーを発現するＥ．ｃｏｌｉの菌株から単
離する。しかしながら、モロニーマウス白血病ウイルス
（Ｍ−ＭＬＶ）逆トランスクリプターゼを用いてポリア
デニル化ｍＲＮＡ固体群から第１の鎖ｃＤＮＡを合成す
ることが好ましい。必要とされるクローンしたＭ−ＭＬ
Ｖ逆トランスクリプターゼの量は、合成反応に用いられ
るポリアデニル化ｍＲＮＡの量に依存して変化する。通
常、約200 Ｕ／μｌの逆トランスクリプターゼが反応当
たり２から10μｇのｍＲＮＡに対して用いられる。

【００５１】また、ＤＮＡの合成を開始するプライマー
が合成混合物中に存在する。ｃＤＮＡのクローニングに
は、いかなるプライマーも用いられるが、長さで12−18
のヌクレオチドを含有するオリゴ（ｄＴ）を使用するこ
とが好ましく、そのオリゴ（ｄＴ）は、真核細胞ｍＲＮ
Ａ分子の３′末端でポリ（Ａ）道に結合する。ｍＲＮＡ
の各分子がオリゴ（ｄＴ）_{１２−１８} のいくつかの分
子に結合するように、過剰にプライマーを反応混合物中
に添加する。0.5 ｍｇ／ｍｌの濃度を有する約12.5μｇ
のプライマーを用いることが好ましい。

【００５２】酵素とプライマーの他に、それぞれ500 μ
Ｍの最終濃度でｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ
ＴＴＰを含有する緩衝液とｄＮＴＰの混合物により、反
応カクテルを仕上げる。本発明において、この合成と競
合する第１鎖ｃＤＮＡ合成に関していかなる緩衝液も用
いられる。250 ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ8.3 ）、37
5 ｍＭのＫＣｌ、15ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、および50ｍＭ
のジチオスレイトールからなる緩衝システムを用いるこ
とが好ましい。一般的に、約500 μｌの緩衝液で合成溶
液を仕上げる。

【００５３】第１の鎖を合成した後、ｃＤＮＡ：ｍＲＮ
Ａ複合体を変性し、逆トランスクリプターゼまたはＥ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を添加
し、次いでヌクレアーゼＳ１でヘアピンループを切断す
ることにより二重鎖ｃＤＮＡ分子を得るヘアピン−プラ
イムド（ｈａｉｒｐｉｎ−ｐｒｉｍｅｄ）合成、オカヤ
マおよびベルグ法、ガブラーおよびホフマン法等のよう
な、従来技術で知られている様々な方法によりｃＤＮＡ
の第２の鎖を合成する。オカヤマおよびベルグ法はＥ．
ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨを用いてランダムにｍＲＮＡを
ニックし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩによる
触媒作用によりニック翻訳反応においてＲＮＡを置換す
る。オカヤマおよびベルグ法において、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼＩによるＤＮＡを活性化するのにｍ
ＲＮＡを用いる。

【００５４】ｃＤＮＡの第２の鎖を合成する好ましい方
法は、ガブラーおよびホフマン法の改良方法である。こ
の方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨ、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、およびＤＮＡリガーゼを用いて第２の鎖を形
成する。実際に、第２の鎖合成に関して進行する２つの
異なる方法が本発明において用いられる。第１の方法
は、ＲＮアーゼＨを用いてランダムな様式でＲＮＡ：Ｄ
ＮＡハイブリッドを攻撃し、逆トランスクリプターゼに
より産生されたニックに加えてニックを産生する。第２
の合成が開始する前に、あまりにも多くのニックがメッ
セージの５′末端でＲＮＡ中に導入される場合には、短
すぎて雑種形成にとどまらない断片が産生され、それゆ
えプライマーとして作用できない。加えて、第２の鎖Ｄ
ＮＡ合成を活性化せしめる５′末端側のＲＮＡオリゴマ
ーは、２つのリボヌクレオチドのみが第２の鎖ＤＮＡの
５′末端に残るまで、分解し続ける。これらはポリメラ
ーゼＩ ＲＮアーゼＨ活性の基質であり、残りのヌクレ
オチドは除去される。これにより第１の鎖ｃＤＮＡの
３′末端を１本鎖にとどめ、それをポリメラーゼＩの
３′エキソヌクレアーゼ活性の基質にする。結果はｃＤ
ＮＡの固体群となり、それらを鈍端とする。

【００５５】別の方法は、ハイブリッド中のＲＮＡの
５′末端から10から20の塩基にニックを製造するＭ−Ｍ
ＬＶ逆トランスクリプターゼにある。次いでＤＮＡポリ
メラーゼＩが合成に用いられる。一般的に、１０Ｕ／μ
ｌの濃度のＤＮＡポリメラーゼＩが約500 ユニットで用
いられる。第２の鎖合成後、ＤＮＡポリメラーゼＩを除
去してＲＮアーゼＨを加え、二重鎖を産生し、この二重
鎖は、残ったキャップド（ｃａｐｐｅｄ）ＲＮＡ５′オ
リゴヌクレオチドを除いて、完全にＤＮＡである。

【００５６】上述したいずれかの方法による第２の鎖合
成は通常、緩衝液とｄＮＴＰ混合物の存在下で行なわれ
る。第２の鎖ｃＤＮＡ合成に関して従来技術で知られて
いるいかなる緩衝システムも用いられるが、188 ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.3 、906 ｍＭのＫＣｌ、100 ｍ
Ｍの（ＮＨ_４ ）_２ ＳＯ_４ 、46ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、
37.5ｍＭのジチオスレイトール、および1.5 ｍＭのＮＡ
Ｄを含有する緩衝システムを用いることが好ましい。

【００５７】第２の鎖合成は、従来技術で述べた既知の
方法により行なう。本発明においてｃＤＮＡを合成する
のに用いる方法と試薬は、ＢＲＬ ｃＤＮＡ合成システ
ム^Ｒ （ベセスダリサーチラボラトリーズ、ゲイサースブ
ルグ、メアリーランド）およびリブラリウムシステム
（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）で
ある。

【００５８】この点において、ｂｇｌ１遺伝子をコード
する小さな部分である、ｃＤＮＡのプールが第２の鎖合
成の後に存在する。ｃＤＮＡプール中の特異的ｂｇｌ１
遺伝子断片のみの増幅は、β−グルコシダーゼ遺伝子の
単離にとって重要であるので、特異的プライマーを設計
して、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）中のＴ．ｒｅｅｓ
ｅｉ ｂｇｌ１遺伝子をコードするｃＤＮＡ断片を増幅
した。使用したプライマーは、Ｎ末端および内部ＣＮＢ
ｒ断片をコードするｂｇｌ１遺伝子のｃＤＮＡと雑種形
成するように設計された退化（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）
プライマーである。

【００５９】一般的に、タンパク質のアミノ酸配列は、
特有の核酸トリプレットによりコードされる十分なアミ
ノ酸を含有せず、それゆえ使用するいかなるオリゴヌク
レオチドは退化しすぎてＰＣＲ反応中のｂｇｌ１遺伝子
を特異的に増幅できないので、ｂｇｌ１遺伝子を単離す
ることは困難である。しかしながら、本発明において、
プライマーを、熟成β−グルコシダーゼの増幅を標的と
した領域のアミノ酸を実験し、領域を選択することによ
り設計しており、その領域には遺伝暗号における退化が
低減した度合いであることが必要である。ｃｂｈ１、ｃ
ｂｈ２、ｅｇｌ１等のような様々な他のセルラーゼ遺伝
子のＴ．ｒｅｅｓｅｉ中のコドンバイアスもまた、オリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計したときに考慮にいれ
た。より具体的には、コドンバイアスは、異なるアミノ
酸をコードする好ましいヌクレオチドトリプレットを示
す鎖Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ中の様々な遺伝子に基づく。この
コドンバイアスを分析することにより、アミノ酸をコー
ドする特定のヌクレオチド配列が好ましいことが分か
る。例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのｃｂｈ１、ｃｂｈ
２およびｅｇｌ１遺伝子はアミノ酸プロリンをコードす
るＣＣＵを好む。それゆえ、オリゴヌクレオチドプロー
ブを設計する場合、ロイシンをコードする他のトリプレ
ット（ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＵＵＡおよびＣＵＧ）
よりもむしろ、ＣＵＧ配列がロイシンに好ましい選択と
なる。

【００６０】さらに、増幅を目的としたプライマーとし
てＮ末端領域と内部領域の選択後、非特異的塩基イノシ
ンをＮ末端のプライマーのウォブル位置に挿入し、内部
プライマーの１６の様々なプライマー配列のプールを用
いることにより、プライマーを設計した。基本的に、退
化プライマーの生成は、アカデミックプレスにより出版
された（1990）、ＰＣＲプロトコール：方法と応用への
ガイド中のリーらによる「退化プライマーを用いたｃＤ
ＮＡクローニング」およびコンプトンによる「ＤＮＡ増
幅のための退化プライマー」に記載されている。

【００６１】上述したプライマーを用いて、ｂｇｌ１遺
伝子のアミノ末端領域をコードするｃＤＮＡ配列を、Ｐ
ＣＲを用いて選択的に増幅する。増幅方法は、最初の、
95℃での５から15分間の変性周期、続いて35℃から55℃
の間の温度、好ましくは45℃から55℃の間の温度での１
−７分間のアニーリング工程、および65℃での５−15分
間の重合周期からなる。しかしながら、最初の10分間の
変性周期、続いて50℃での２分間のアニーリング、およ
び前述した温度での10分間、好ましくは30分間の重合周
期を用いるのが好ましい。

【００６２】次いで増幅断片を、700 ｂｐ ｃＤＮＡ部
分としてゲル電気泳動により認識する。ｃＤＮＡの増幅
プールを、ポリアクリルアミドゲル上に分画し、クロー
ニングを目的としたより精製した700 ｂｐのｃＤＮＡ断
片を得る。いかなるクローニングベクターも、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ
３２２、ｐＥＭＢＬ、ｐＲＳＡ１０１、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ等のようなｃＤＮＡｂｇｌ１遺伝子断片をクロ
ーンするのに用いられる。しかしながら、クローニング
ベクターｐＵＣ２１８およびｐＵＣ２１９を使用するこ
とが好ましく、それらのベクターはＭ１３の遺伝子間領
域の挿入によりｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９から誘導さ
れる。ｂｇｌ１遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片を有する
クローニングベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１
を転換するのに用いられる。転換後、ｂｇｌ１遺伝子を
含有する陽性コロニーを認識し、クロロホルム：フェノ
ール抽出およびエタノール沈殿法を用いてＤＮＡをそこ
から単離した。

【００６３】次いでサブクローンしたｃＤＮＡ700 ｂｐ
断片のヌクレオチド配列は、Ｕ．Ｓ．バイオケミカルス
により提供されるシーケナーゼ^Ｒ 試薬キットを用いる
サンガーらにより記載されたジデオキシ鎖終了法により
決定する。

【００６４】このヌクレオチド配列から、サブクローン
した700 ｂｐ ｃＤＮＡ部分は、ＣＮＢｒ分解および精
製Ｔ．ｒｅｅｓｅｉβ−グルコシダーゼのタンパク質分
解に続いて得られた多くの他の配列ペプチドと重複する
150 アミノ酸をコードする読み取り枠を含有することが
分かった。それゆえ、クローンした配列が細胞外Ｔ．ｒ
ｅｅｓｅｉβ−グルコシダーゼタンパク質をコードする
ことを確信した。

【００６５】完全β−グルコシダーゼ遺伝子のゲノミッ
クバージョンのクローニングは、サムブルックらにより
記載されたオリゴヌクレオチドを標識する方法を用い
て、700 ｂｐ ｂｇｌ１ ｃＤＮＡ断片を^３２Ｐで標識
することにより着手した。このプローブを用いて、Ｔ．
ｒｅｅｓｅｉからのＨｉｎｄ ＩＩＩ切断ゲノムＤＮＡ
のサザンブロット上に6.0 ｋｂのバンドを確認する。

【００６６】ゲノムＤＮＡを除タンパク質し、続いてリ
ボヌクレアーゼＡで処理することによるサザンブロット
分析のために、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのゲノムＤＮＡを
調製する。調製したゲノムＤＮＡを、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ等のような様々な制限酵素のうちの１つ
で切断し、ゲル上で展開せしめ、サザンブロットし、ｂ
ｇｌ１遺伝子の700 ｂｐ ｃＤＮＡ標識断片で雑種形成
せしめる。この分析から、Ｈｉｎｄ ＩＩＩは、ｂｇｌ
１遺伝子をクローンするのに用いられる種類の制限酵素
であることが分かった。

【００６７】次いでＨｉｎｄ ＩＩＩを菌株Ｔ．ｒｅｅ
ｓｅｉからのゲノムＤＮＡに加え、ＤＮＡをそこから抽
出する。この切断による試料をアガロースゲル上で展開
せしめ、電気泳動のように分画する。次いでゲルをサザ
ンブロットし、700 ｂｐ ｃＤＮＡプローブでプローブ
する。次いでＨｉｎｄ ＩＩＩ切断ゲノムＤＮＡのサザ
ンブロット上で6.0 ｋｂバンドを確認した。残りのＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ切断ゲノムＤＮＡに、予備のゲル電気泳動
を行ない、約5.0 ｋｂから7.0 ｋｂｋのサイズ範囲に亘
るＤＮＡをそこから溶出し、ファージミドベクター中に
クローンし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１を転換するのに
用いてライブラリーを作成した。上述したようないかな
るファージミドベクターも用いられるが、ｐＵＣ２１８
を用いることが望ましい。次いで転換により生じたコロ
ニーに、ｂｇｌ１をコードするクローンしたゲノムＤＮ
Ａを含有したそれらのコロニーを認識するプローブとし
て700 ｂｐ ｃＤＮＡ断片を用いたコロニー雑種形成を
行なった。転換からの陽性コロニーを採取し、従来技術
において既知の方法によりＤＮＡをそこから単離する。

【００６８】そのような陽性コロニーからの単離ＤＮＡ
を、様々な酵素で、１つずつそして様々な組合せで切断
し、アガロースゲルの電気泳動を施す。生成したバンド
模様を用いて、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのクローンした6.
0 ｋｂゲノムＤＮＡの制限マップを構成する。切断に用
いた酵素は、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｓｔ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、
Ｓｍａ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、ＸｂａＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、
Ｓｐｈ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｌ Ｉ、Ｐｖｕ
ＩＩ等を含む。

【００６９】次いで同一のゲルに、どのゲノム制限断片
がｂｇｌ１ ｃＤＮＡと相同性を分けたのかを認識する
プローブとして同一の700 ｂｐ ｂｇｌ１ ｃＤＮＡを
用いてサザンブロット分析を施す。これらの相同性断片
の位置は6.0 ｋｂゲノム断片の制限マップと相対的に決
定でき、β−グルコシダーゼタンパク質のサイズ（74ｋ
ｄ）が遺伝子の長さを2.1 ｋｂと評価するので（アミノ
酸の平均分子量が105ダルトンであり、74ｋｄのタンパ
ク質は平均705 のアミノ酸を含有し、それは2,115 ｂｐ
と等しいので）、マッピング実験により、完全ｂｇｌ１
遺伝子はゲノムＨｉｎｄ ＩＩＩクローン中に含有され
ることが確信される。

【００７０】サイズで600 ｂｐから1500ｂｐに亘るＰｖ
ｕ ＩＩおよびＢａｌ Ｉ制限断片を700 ｂｐ ｃＤＮ
Ａ ｂｇｌ１クローンで雑種形成し、それゆえｐＵＣ２
１８ファージミド中にサブクローンした。上述したサン
ガーらの方法を用いて、ヌクレオチド配列を決定した。
ｂｇｌ１遺伝子のヌクレオチド配列が両方の鎖上に決定
され２つの小さなイントロンの部分が糸状菌類の他の遺
伝子のイントロンに対する相同により推測される、総計
3033ｂｐとなる１本の連続配列が得られるまで、Ｐｖｕ
ＩＩおよびＢａｌ Ｉサブクローンを配列せしめ、サ
ブクローンの重複配列を整列せしめた。アミノ酸配列を
第１図のように推測する。

【００７１】完全Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｂｇｌ１遺伝子の
ヌクレオチド配列と推測した主なアミノ酸配列を第１図
に示す。コードしたβ−グルコシダーゼタンパク質の予
測分子量は74,341である。31のアミノ酸ペプチドは、ア
ミノ末端ペプチド配列から推測したようにβ−グルコシ
ダーゼの熟成アミノ末端よりも先行する。このペプチド
内には、Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａからなる３つの潜在的な信
号ペプチターゼ認識部位がある。

【００７２】β−グルコシダーゼの主なアミノ酸配列
は、208 、310 、417 、および566 の位置に７つの潜在
的なＮ−連結グリコシル化部位があり、それはＸがプロ
リンではないコンセンサスＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
−Ｘを示す。しかしながら、45、566 、および658 の位
置での部位は、コンセンサス配列中にプロリン残留物を
有し、グリコシル化されたりされなかったりする。

【００７３】他のセルラーゼ遺伝子と比較すると、ｂｇ
ｌ１遺伝子中には異常なコドンバイアスは観察されな
い。ｂｇｌ１暗号領域は、それぞれ70ｂｐ、64ｂｐの２
つの短いイントロンにより割り込まれる。両方のイント
ロンは、スプライス部位供与体、スプライス受容体、お
よびＴ．ｒｅｅｓｅｉから現れるコンセンサススプライ
ス信号および他の糸状菌類に対して相同を示すラリアト
（ｌａｒｉａｔ）枝受容体部位を有する。

【００７４】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ菌株からのｂｇｌ１遺伝
子は認識されクローンできるので、次の工程はｂｇｌ１
遺伝子の余分なコピーを有する転換体を産生することで
ある。

【００７５】最初に転換糸状菌類の検出を可能にするた
めに、選択的なマーカーを選択しなければならない。
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＴ．ｒｅｅｓｅｉからのａ
ｒｇＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｍｄＳ、Ｎｅｕ
ｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ
またはＴ．ｒｅｅｓｅｉからのｐｙｒ４、およびＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのｐｙｒＧを含む異
なる選択的なマーカーが用いられる。選択的なマーカー
は遺伝子から誘導され、その遺伝子は、転換される糸状
菌類により通常代謝されない代謝物を使用する能力また
は化学物または抗生物質の毒性衝撃効果に対抗する能力
のような新しい表現型を明示する。本発明においては、
従来技術で既知の方法により合成できる合成遺伝子マー
カーを検討している。次いでその中に導入される選択的
マーカーを基準として転換体が選択できる。Ｔ．ｒｅｅ
ｓｅｉはａｍｄＳ遺伝子を含有しないので、酵素アセト
アミダーゼをコードする選択的マーカーとしてＴ．ｒｅ
ｅｓｅｉ中のａｍｄＳを使用することが好ましく、その
アセトアミダーゼは転換体細胞が窒素供給源としてアセ
トアミド上で成長を可能にさせる。ｂｇｌ１遺伝子が
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉから欠損される場合には、選択的マー
カーとしてｐｙｒＧ遺伝子を使用することが好ましい。

【００７６】使用する宿主菌株は、選択された選択的マ
ーカーに対応する非機能的遺伝子を欠如したまたは有す
る糸状菌類の変異体であるべきである。例えば、ａｒｇ
Ｂの選択的マーカーを用いる場合、特異的ａｒｇ⁻ 変
異体菌株を転換方法における受容株として用いる。本発
明に用いられる選択的マーカーの他の例は、遺伝子ｔｒ
ｐ、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、Ｂ
ｍ１、ｐｋｉＡ、ｎｉａＤ、ｌｅｕ等を含む。それゆ
え、対応受容株菌株は、ｔｒｐ⁻ 、ｐｙｒ⁻、ｌｅｕ
⁻ 等のような変異体菌株でなければならない。

【００７７】変異体菌株は開始宿主菌株から誘導され、
その菌株はいかなる糸状菌類菌株であってもよい。しか
しながら、糸状菌類過剰産生変異体菌株、特に前述した
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ過剰産生菌株を使用することが好まし
く、これはこの菌株が大量のタンパク質、特に大量のセ
ルラーゼ酵素を分泌するからである。次いで選択した変
異体菌株は転換工程に用いられる。ｂｇｌ１遺伝子を欠
損せしめるのに用いられるＴ．ｒｅｅｓｅｉの好ましい
菌株は、ＲＬＰ３７、ｐｙｒＧ６９、ウリジン栄養素要
求株である。

【００７８】選択した糸状菌類の変異体菌株は、ナバレ
ンネンにより「工業的に重要な菌類菌株における酵素産
生の遺伝改良」、フィンランドのテクニカルリサーチセ
ンター、出版26（1985）に記載された濾過集積技術のよ
うな従来技術において知られている多くの技術により調
製できる。変異体菌株を得る別の技術は、異なる成長媒
質条件下で変異体を認識することである。例えば、アル
ギニン生合成の異なる中間体により供給される一連の極
小プレートを用いることにより、ａｒｇ⁻ 変異体を認
識できる。別の例は、菌株をフルオロオロチン酸（ＦＯ
Ａ）にさらすことによるｐｙｒ⁻ 変異体菌株の産生で
ある。無傷ｐｙｒ４遺伝子を有する菌株はウリジン媒質
中で成長し、フルオロオロチン酸に感度があり、それゆ
え、ＦＯＡ抵抗に関して選択することにより、ｐｙｒ４
⁻ 変異体菌株を選択することができる。

【００７９】次いで、選択した選択的マーカーを適切な
プラスミド中にクローンする。本発明において、ｐＵＣ
１８、ｐＢＲ３２２等のような選択的マーカーのクロー
ニングには、いかなるプラスミドも用いられる。しかし
ながら、ｐＵＣ１００を使用することが好ましい。ｐＵ
Ｃ１００を制限酵素ＳｍａＩで切断することによりベク
ターを生成し、次いで５′リン酸塩群を子牛アルカリ性
ホスファターゼで切断することにより除去する。断片ベ
クターを、ゲル電気泳動と続いての単離ゲル切片からの
電気溶出により精製する。ハインスらによりＭｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、1430−1439頁（1983）に記載
されたような既知の方法によるベクター配列の分離に続
いて、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｍｄＳ遺伝子を2.
4 ｋｂＳｓｔＩ制限断片として単離する。2.4 ｋｂのＳ
ｓｔＩ ａｍｄＳ断片と2.7 ｋｂ ｐＵＣ１００ベクタ
ー断片をともに連結し、連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ宿主
菌株ＪＭ１０１中に導入する。

【００８０】本発明においてｂｇｌ１遺伝子の挿入には
いかなるプラスミドも用いられるが、ｐＳＡＳプラスミ
ドを使用することが好ましい。

【００８１】ｐＳＡＳを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切
断し、ゲル電気泳動および電気溶出によって線状断片を
精製することによりｐＳＡＳβ−ｇｌｕを構成する。こ
のＨｉｎｄ ＩＩＩ処理ｐＳＡＳベクター断片に、転写
と翻訳に必要な配列とともにｂｇｌ１遺伝子の全ての暗
号領域を含有するＴ．ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡの6.0
ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を連結する。第２図はｐＳ
ＡＳβ−ｇｌｕの構成を示すものである。

【００８２】少なくとも１つのｂｇｌ１遺伝子の追加の
コピーを含有するベクターを構成すること、およびｂｇ
ｌ１遺伝子のアミノ酸配列が、部位定方向突然変異、Ｐ
ＣＲ法、並びに化学変異法のような従来技術で知られて
いる技術により変更されたベクターを構成することがで
きる。

【００８３】別の実施態様において、β−グルコシダー
ゼ糸状菌類のｂｇｌ１遺伝子は全体的に欠損でき、別の
既知の遺伝子と置き換えられる。好ましくは、置換遺伝
子は、精製した組換え微生物がいかなる非相同のタンパ
ク質を発現しないように、糸状菌類と相同である。例え
ば、選択したマーカーのためにクローンし、クローンさ
れてそれゆえゲノム中で認識された潜在的ないかなる
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ遺伝子は、ここに記載した技術を用い
てＴ．ｒｅｅｓｅｉ中のｂｇｌ１遺伝子と置き換えられ
る。

【００８４】一方、置換遺伝子は必ずしも相同である必
要はない。具体的には、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ中のｂｇｌ１
遺伝子の欠損のために、使用された非相同遺伝子を含有
するベクターを第３Ａ図および第３Ｂ図に示す。第３Ｂ
図において、挿入されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒ ｐｙｒＧ遺伝子を有するｐＵＣ２１８べクター
プラスミドを説明する。完全ｂｇｌ１遺伝子を含有する
ことが知られている、6.0 ｋｂのゲノムＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ断片をｐＵＣ２１８ポリリンカー中にクローンする。
ｂｇｌ１遺伝子の暗号領域を、ｂｇｌ１読み取り枠のま
さに５′と３′末端に位置した特有Ｂａｌ１制限部位
（第３Ａ図）または特有ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＶ制限
部位（第３Ｂ図）のいずれかを用いてこのプラスミドか
ら除去し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからの
ｐｙｒＧ遺伝子を含有する単離2412ｂｐ Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ／Ｂａｍ ＨＩ制限断片と置換する。Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いた連結の前に、全ての制限末端を、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼの処理により鈍端とする。

【００８５】適切なベクターを構成した後、そのベクタ
ーを糸状菌類菌株を転換するのに用いる。糸状菌類（例
えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中の細胞壁の浸透性は非常に
遅いので、所望のＤＮＡ配列、遺伝子または遺伝子断片
の取込みは最小である。この問題を克服するために、細
胞壁の浸透性は増大でき、またはＤＮＡは微粒子ガンア
プローチにより細胞中に直接発射できる。微粒子ガンア
プローチにおいて、細胞中に含有されるＤＮＡはミクロ
ンサイズのビーズ上に被覆され、これらのビーズはＤＮ
Ａを細胞中にとどめそして細胞膜中に孔を開けたまま細
胞中に実際に発射される。次いで細胞はＤＮＡをその中
に含んだまま細胞膜を自己修復する。この前述した方法
以外にも、転換方法の前に変異体菌株中の糸状菌類細胞
の浸透性を増大せしめる多くの方法がある（すなわち、
使用した選択的マーカーに対応する機能遺伝子を欠くこ
と）。

【００８６】１つの方法は、アルカリまたはアルカリ性
イオンを高濃度で糸状菌類細胞へ添加することを含む。
本発明において、いかなるアルカリ金属またはアルカリ
土類金属イオンも用いられるが、ＣａＣｌ_２ または酢
酸リチウムのいずれかを使用することが好ましく、より
好ましいのは酢酸リチウムである。アルカリまたはアル
カリ性イオンの濃度は使用するイオンに依存して変化
し、通常0.05Ｍから0.4Ｍ濃度が用いられる。約0.1 Ｍ
濃度を用いることが好ましい。

【００８７】細胞壁の浸透性を誘発するのに用いられ、
糸状菌類中のＤＮＡ吸収を高める別の方法は、ソルビト
ールと単体子牛胸腺ＤＮＡを補給した成長媒質中に細胞
を再懸濁することである。次いでガラスビーズを補給媒
質に加え、混合物を約30秒間、高速で撹拌せしめる。こ
の処理は細胞壁を破壊し、多くの細胞を殺生する。

【００８８】転換のための糸状菌類を調製するさらに別
の方法は、プロトプラストの調製を含む。菌類菌糸はプ
ロトプラストの供給源であり、その菌糸は細胞から単離
できる。プロトプラストの標品は、懸濁媒質中の浸透安
定剤の存在により保護される。これらの安定剤は、ソル
ビトール、マンニトール、塩化ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等を含む。通常、これらの安定剤の濃度は0.8 Ｍ
から1.2 Ｍの間に亘る。

【００８９】懸濁媒質中に約1.2 Ｍのソルビトール溶液
を使用することが好ましい。ＤＮＡの宿主変異体糸状菌
類菌株への吸収は、カルシウムイオンの濃度に依存す
る。一般的に、約10ｍＭのＣａＣｌ_２ と50ｍＭのＣａ
Ｃｌ_２ の間で吸収溶液中に用いられる。吸収溶液中の
カルシウムイオンの必要以外にも、一般的に含まれる他
の成分は、ＴＥ緩衝液（10ｍＭのトリス、ｐＨ7.4 ；１
ｍＭのＥＤＴＡ）または10ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ6.0 緩
衝液（モルフォリンプロパン−／スルホン酸）、および
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような緩衝システ
ムである。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合する
ように作用し、それゆえ、菌糸の成分を糸状菌類変異体
菌株の細胞質中に送り込ませ、プラスミドＤＮＡは核に
転移される。この融合はしばしば、プラスミドＤＮＡの
多様なコピーを宿主染色体中にともに統合させる。一般
的に、吸収溶液中には高濃度のＰＥＧが用いられる。吸
収溶液中には25％のＰＥＧ４０００の10容積までが用い
られる。しかしながら、吸収溶液中には約４容積を加え
ることが好ましい。ジメチルスルホキシド、ヘパリンス
ペルミジン、塩化カリウム等のような添加剤が吸収溶液
に加えられ、転換に役立つ。

【００９０】10^８ から10^９ ／ｍｌ、好ましくは２×
10^８ ／ｍｌの密度での浸透性処理またはプロトプラス
トに施された糸状菌類変異体細胞を含有する懸濁液が通
常転換に用いられる。これらのプロトプラストまたは細
胞は、選択的マーカーおよび他の関心のある遺伝子を含
有する所望の転換ベクターとともに吸収溶液に加えられ
て転換混合物を形成する。

【００９１】次いでその混合物を10から30分間の期間４
℃で培養する。次いで追加のＰＥＧを吸収溶液に加え
て、さらに所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の吸収を高め
る。ＰＥＧは、転換混合物の容積の10倍までの容積、好
ましくは約９倍の容積で加えられる。ＰＥＧを添加した
後、ソルビトールとＣａＣｌ_２ 溶液を添加する前に、
転換混合物を室温で培養する。次いでプロトプラスト懸
濁液を成長媒質の溶融アリコートにさらに加える。この
成長媒質はウリジンを含まず、転換体のみを選択的に成
長せしめる。続いてのコロニーを転移せしめ、ソルビト
ールの枯渇した成長媒質上で精製した。

【００９２】この段階で、安定な転換体は、より早い成
長速度と、固体培養媒質上のでこぼこした輪郭というよ
りもむしろ滑らかな円形のコロニーの形成とにより、不
安定な転換体とは区別できる。加えて、ある場合には、
固体非選択的媒質上で転換体を成長せしめ、この培養媒
質から芽胞を収穫し、続いて芽を出し、選択的媒質上で
成長するこれらの芽胞の百分率を測定することにより、
安定性の試験が行なえる。

【００９３】上述した方法により転換が行なわれること
を確認するために、サザンブロットとオートラジオグラ
フィーのようなさらなる分析を転換体に行なう。上述し
た同一の基本工程を用いて、完全ｂｇｌ１遺伝子をベク
ターから欠損せしめて糸状菌類菌株中に転換し、または
ｂｇｌ１遺伝子を変更して糸状菌類菌株中に転換せしめ
る。

【００９４】転換菌株が少なくとも１つのｂｇｌ１遺伝
子の追加のコピー、変更ｂｇｌ１遺伝子を含有し、また
は転換体が欠損ｂｇｌ１遺伝子を含有したことを確認し
た後、菌株をこれらの転換体が繁殖する条件下でさらに
培養する。次いで転換体は培養媒質から単離され、以下
に記載するような様々な用途に用いられる。あるいは、
転換体をさらに発酵せしめ、組換え菌類セルラーゼ組成
物を培養媒質から単離する。例えば、本発明により産生
された転換体は発酵媒質において、高められた、欠損し
たまたは変更された細胞外β−グルコシダーゼを発現で
きるので、菌類セルラーゼ組成物は媒質から単離でき
る。通常、単離工程は、転換体を含有する培養媒質また
は発酵媒質を遠心分離し、上澄み液を限外濾過により濾
過し、組換えにより産生した菌類セルラーゼ組成物を得
る各工程からなる。必要に応じて、以下に記載する様々
な用途に使用する前に、抗菌剤を組成物に加えることが
できる。加えられる抗菌剤の例は、アジ化ナトリウム、
安息香酸ナトリウム等である。

【００９５】本発明の方法により産生された転換体が高
められたセロビオースの活性を有したことを確認するた
めに、以下の実験を行なった。この実験において、1.0
ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ5.0 ）中に懸濁せしめら
れ、対照としての通常の非変異体Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ菌株
からの発酵産生物（135.0 ｍｇ／ｍｌタンパク質）を用
いて、転換体により産生された発酵産生物（65.5ｍｇ／
ｍｌタンパク質）と反応せしめられた50ｍｇのセロビオ
ース。最初の速度の条件下でセロビオース活性の結果を
以下の表Ｉに示す：

【表１】 この実施例からの結果により、本発明の転換体により産
生された発酵産生物は、非変異体Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ対照
菌株と比較して、基質、セロビオース上の特異的活性の
５倍以上を有することが分かった。

【００９６】さらに、第７図および第８図により、1.0
％の酵素／基質を用いて、基質アビセルとＰＳＣ（ＰＳ
Ｃはアビセルをリン酸で処理することによって得られた
リン酸膨潤セルロースである）の加水分解が高められる
ことが分かる。実験において、ＰＳＣまたはアビセルを
２ｍｌの50ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ4.8 中に
懸濁せしめ、非撹拌条件下で24時間まで40℃で培養し
た。溶性還元糖を、ネルソンおよびソモギの方法により
測定した。これらの図から、本発明による転換体から産
生された増大組換えβ−グルコシダーゼ発酵産生物は、
標準Ｃｙｔ−１２３対照と比較して様々な基質上での加
水分解活性の増大した速度と範囲を有することが分かっ
た（平均で20％高い活性）。Ｃｙｔ−１２３対照は、工
業規模での発酵が施されるＴ．ｒｅｅｓｅｉセルラーゼ
過剰酸性菌株から得られた産生物である。

【００９７】豊富転換体は、様々な異なった用途に用い
られる。例えば、あるβ−グルコシダーゼは、増大転換
体を含有する培養媒質からさらに単離され、ワインの製
造中にブドウに加えられ、完成ワイン製品の潜在的な芳
香を高める。別の用途は、果物中にβ−グルコシダーゼ
を用いその芳香を高めることである。あるいは、増大β
−グルコシダーゼを含有する単離組換え発酵産生物は、
直接食品添加物またはワイン加工に用いられ風味および
芳香を高める。

【００９８】セルロース製品の加水分解速度は、ゲノム
に挿入されたｂｇｌ１遺伝子の少なくとも１つの追加の
コピーを有する転換体を用いることにより増大せしめら
れるので、セルロースまたはヘテログリカンを含有する
産生物はより速い速度でより広範囲で分解せしめられ
る。紙、綿、紙おむつ等のようなセルロースから作った
製品は、ごみ処理地でより能率的に分解せしめられる。
紙おむつ製品上の非増大Ｃｙｔ１２３標準（上述のよう
に定義した）に比較して、ゲノム中に挿入されるｂｇｌ
１遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを有する転換
体を含有する発酵媒質から単離された増大したβ−グル
コシダーゼ標品の使用を説明している。この加水分解実
験は、100 ｍｇの基質（紙おむつ）当たり0.4 ｍｇの標
準と発酵製品を用いて行なった。実験は５時間に亘り50
℃で行ない、グルコース濃度を様々な時間間隔で二重に
測定した。この曲線は、標準と比較して、ｂｇｌ１の追
加のコピーを有する転換体から誘導した発酵産生物から
産生された製品の増大した加水分解速度を説明する。紙
おむつ誘導繊維は水溶液中で約14％不溶性であることが
分かった。それゆえ、転換体から得られた発酵製品は、
超満員のごみ処理地に加えられる様々なセルロース製品
を液化することにより分解を助ける組成物に用いられ
る。

【００９９】同時の糖化と発酵は、バイオマス中に存在
するセルロースがグルコースに転化され、同時に同一の
反応器中で酵母菌株がグルコースをエタノールに転化す
る方法である。この種の方法への使用が知られている酵
母菌株は、Ｂ．ｃｌａｕｓｅｎｉｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ａｃｉｄｏ
ｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｉｕｍ、Ｃ．ｂｒａｓｓｉｃａ
ｅ、Ｃ．ｌｕｓｔｉｎａｎｉａｅ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
等を含む。この方法からのエタノールは、さらに、オク
タンエンハンサーとして、または燃料源としてのエタノ
ールは石油誘導製品よりも環境的にやさしいので、ガソ
リンに代わる有利な燃料として直接用いられる。エタノ
ールの使用は空気の質を改善し、地域のオゾン水準とス
モッグを減少するかもしれない。さらに、ガソリンにか
わってのエタノールの使用は、非継続的なエネルギーお
よび石油化学供給における突然の転換の衝撃を緩和する
のに戦略上で重要になり得る。

【０１００】エタノールは、木、草木、都市の固体廃棄
物および農業と林業の残留物のようなセルロースバイオ
マスからの糖化および発酵により産生できる。しかしな
がら、この方法において遭遇した１つの主な問題は、セ
ロビオースをグルコースに転化するシステムにおいてβ
−グルコシダーゼを欠くことである。セロビオースはセ
ロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼの抑制因子と
して作用し、それにより完全セルラーゼシステムの加水
分解速度を減少せしめることが知られている。それゆ
え、急速にセロビオースをグルコースに転化する増大β
−グルコシダーゼ活性を使用すると、エタノールの産生
を著しく高められる。この点を説明すると、シトラーゼ
１２３と、発酵条件化で本発明による転換体（合計タン
パク質基準のシトラーゼに標準化した）により産生され
た発酵産生物を、都市の固体廃棄物（ＭＳＷ）の繊維分
画（ＲＤＦ）からの50−60％セルロースからなる粗い紙
分画を加水分解する能力について測定した。そのような
懸濁液を50ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ4.8 から
5.0 中に入れ、30℃で釣り合わせた。次いでフラスコに
４％のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ｉａｅを投与し、採取した期間で80時間まで採取した。
エタノール産生物を測定した。以下の表ＩＩは、セルロ
ース源としての都市の固体廃棄物の標品を使用する本発
明により調製されるβ−グルコシダーゼ標品を用いるこ
とにより、増大したエタノール産生が可能になる。

【０１０１】

【表２】 表ＩＩから、本発明により調製された増大β−グルコシ
ダーゼ標品は、シトラーゼ１２３対照と比較して、特に
低いタンパク質濃度においてエタノールの産生を高める
ことが明らかに分かる。

【０１０２】本発明の別の実施態様において、Ｔ．ｒｅ
ｅｓｅｉ菌株からのｂｇｌ１遺伝子の欠損は、洗浄剤
と、セロオリゴ糖（セロビオース）の単離に使用される
セルラーゼ組成物の調製に特に有用である。

【０１０３】セルラーゼ酵素は様々な洗浄剤組成物に用
いられ、酵素的に衣類を柔らかくし、色を復元せしめて
いる。しかしながら、この従来技術において、セルラー
ゼ酵素を使用すると衣類のセルロース繊維を分解するこ
とが知られている。分解効果を減少せしめる１つの可能
性は、β−グルコシダーゼを含有しない洗浄剤を製造す
ることである。それゆえ、このタンパク質の欠損は、セ
ロビオースの蓄積により他の成分を抑制するセルラーゼ
システムに効果がある。本発明の変性微生物は、ｂｇｌ
１遺伝子が残留するＣＢＨおよびＥＧ成分を残したまま
欠損され、それにより繊維を分解することなく組成物に
おいて柔軟性を改良し、色を復元することとなるので、
そのような組成物の調製に特に適している。

【０１０４】本発明の洗浄剤組成物は、セルラーゼ組成
物（β−グルコシダーゼが欠損した）の他にも、陰イオ
ン、非イオンおよび両性電解質界面活性剤を含む界面活
性剤、ヒドロラーゼ、ビルディング剤、漂白剤、青味付
け剤および蛍光染料、固化阻害剤、可溶化剤、陽イオン
界面活性剤等を使用する。これらの成分の全てが洗浄剤
業界において知られている。より詳しい検討に関して
は、「欠損セルラーゼ遺伝子を含有するＴｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉおよびそれから誘導したセルラ
ーゼを含有する洗浄剤組成物」と題した米国特許出願第
07/593,919号、および「欠損および／または豊富セルラ
ーゼおよび他の酵素遺伝子を含有するＴｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ ｒｅｅｓｅｉおよびそれから誘導したセルラー
ゼ組成物」と題した1991年10月４日に出願した米国特許
出願第07/770,049号を参照されたく、その両者はここに
その全部を参照文献として含むものとする。

【０１０５】別の実施態様において、洗浄剤組成物は、
増大した水準のβ−グルコシダーゼ、または変性したβ
−グルコシダーゼもまた含有できる。この点に関して、
適切な効果を与えるかどうかは、洗浄剤組成物に使用す
る所望の製品の種類によるものである。

【０１０６】好ましくは、セルラーゼ組成物は、全洗浄
剤組成物に対して約0.00005 重量パーセントから約５重
量パーセントまでである。より好ましくは、セルラーゼ
組成物は、全洗浄剤組成物に対して約0.01重量パーセン
トから約５重量パーセントであり、より好ましくは全洗
浄剤組成物に対して約0.05重量パーセントから約２重量
パーセントである。

【０１０７】ｂｇｌ１遺伝子の欠損は、セルラーゼシス
テムで処理したセルロース溶液中のセロオリゴ糖（例え
ば、セロビオース）を蓄積せしめ、そのセロオリゴ糖は
溶液から精製される。この点に関して、本発明は、容易
で効果的な方法で微生物を用いてセロオリゴ糖を単離す
る可能性を提供する。

【０１０８】セロオリゴ糖は、酵素的活性に関してセル
ラーゼ酵素をアッセイするのに有用であり、エタノール
とグルコースの合成にも有用である。さらに、そのよう
なオリゴ糖は、食品添加物、化学中間体等としても有用
であることも考えられる。

【０１０９】現在まで、セロオリゴ糖を調製するための
β−グルコシダーゼを含有するセルラーゼの使用には、
溶液のｐＨを約４未満、一般的には3.8 あたりに調整す
ることによりβ−グルコシダーゼを不活性化することが
必要であった。このｐＨでは、β−グルコシダーゼは一
般的に不活性化される。しかしながら、このｐＨでは、
セルラーゼの他の酵素成分もそれらの最適なｐＨと比較
して一般的に低くなり、したがって、β−グルコシダー
ゼを不活性化するそのようなｐＨの低減は、必然的に能
率的な方法ではなくなってしまう。

【０１１０】一方では、本発明によるβ−グルコシダー
ゼのないセルラーゼ組成物を使用すると、約4.5 から約
８のｐＨで、好ましくは約4.5 から約６のｐＨで、最も
好ましくは使用するセルラーゼ組成物に最適なｐＨで、
セロオリゴ糖を調製する容易な方法が得られる。この実
施態様において、本発明は、約4.5 から約８のｐＨで、
物質を含有するセルロース（すなわち、少なくとも20％
のセルロース、好ましくは少なくとも50％のセルロース
を含有する）とβ−グルコシダーゼを含まないセルラー
ゼ組成物とを接触せしめることからなるセロオリゴ糖を
産生する方法に関するものである。加えて、減少した量
のβ−グルコシダーゼを含有するセルラーゼ組成物は、
β−グルコシダーゼ糸状菌類により産生されたセルラー
ゼと、β−グルコシダーゼを産生できないように変性さ
れたβ−グルコシド糸状菌類とを混合することにより得
られる。

【０１１１】この点に関して、ｂｇｌ１遺伝子の完全ヌ
クレオチド配列が用いられるか、または他の糸状菌類か
らの等量の遺伝子を認識しクローンする部分となり得
る。糸状菌類の供給源は、属Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｈｕ
ｍｉｃｏｌａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ等からの菌類を
含む。さらに具体的には、好ましい種は、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒ
ｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒ
ｉｓｅａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｋｏｎｉｎｇｉｉ等を含む。ｂｇｌ１遺伝子の種相同
性により、糸状菌類等量遺伝子は容易に認識されクロー
ンされる。これを第１０Ａ図および第１０Ｂ図に示して
いるが、これらはＨｉｎｄ ＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断
し、さらにブロットしてＴ．ｒｅｅｓｅｉのｂｇｌ１遺
伝子を含有するＰ^３２標識Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 6.0 ｋｂ
ｂｇｌ１遺伝子ＤＮＡ断片でプローブしたＡ．ｎｉｄ
ｕｌａｎｓとＮ．ｃｒａｓｓａ（第１０Ａ図）および
Ｈ．ｇｒｉｓｅａ（第１０Ｂ図）ＤＮＡのオートラジオ
グラフを説明するものである。これらのオートラジオグ
ラフは、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのｂｇｌ１遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片は他の菌類中の細胞外ｂｇｌ１遺伝子を認識
するのに用いられることを明確に説明する。

【０１１２】それゆえ、他の糸状菌類のｂｇｌ１遺伝子
は、プローブとしてＰ^３２標識Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｂｇ
ｌ１遺伝子を用いた上記に概略を示した方法によりクロ
ーンされる。一度他の糸状菌類の遺伝子がクローンされ
ると、それらの遺伝子は、遺伝子が誘導された糸状菌類
または他の糸状菌類を転換して上述した方法によりβ−
グルコシダーゼを過剰に産生する。あるいは、他の糸状
菌類からのクローンｂｇｌ１遺伝子は、上述した方法に
より用いられ、ｂｇｌ１遺伝子が元来クローンされた糸
状菌類のゲノム中のｂｇｌ１遺伝子を欠損または破壊せ
しめ得る。

【０１１３】それらの本発明およびその利点を説明する
ために、以下に特定の実施例を記載し、そのものは、説
明のためであり、制限を目的とするものではない。

【０１１４】実施例１ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉからの全ＲＮＡ
の単離 セルラーゼを過剰産生するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒ
ｅｅｓｅｉ培養を、グリザリにより1977年に記載された
ようにソホロース、β、１−２ジグルコシドを用いたセ
ルラーゼに関して特異的に誘導した。Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの開始菌株は、シアー−ネイス、
Ｇ．およびモンテンコート、Ｂ．Ｓ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、20巻（198
4）46−53頁に記載された方法による突然変異により発
達せしめられたセルラーゼ過剰産生菌株（ＲＬ−Ｐ３
７）である。ポテトデキストロースアガー（ジフコ）上
での成長からのＴ．ｒｅｅｓｅｉの菌糸接種物を、1.40
グラム／リットルの（ＮＨ_４）_２ ・ＳＯ_４ 、2.0 グ
ラム／リットルのＫＨ_２ ＰＯ_４ 、0.30グラム／りっ
とるのＭｇＳＯ_４ 、0.30グラム／リットルの尿素、7.
50グラム／リットルのバクトペプトン（ＢａｃｔｏＰｅ
ｐｔｏｎｅ）、5.0 ｍｌ／リットルの10％のトイーン−
80、1.0 ｍｌ／リットルの微量元素−ＥＦＧ、ｐＨ5.4
を含有する50ｍｌのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの基本培地
に加え、その培地を、250 ｍｌのバッフルド（ｂａｆｆ
ｌｅｄ）フラスコ中の0.2 ミクロンのフィルターを通じ
て濾過した。この培養を、活力のあるエアレーションに
より30℃で48時間培養した。培養から５ミリリットルの
アリコートを採取し、７つの250 ｍｌのフラスコ中の25
ｍｌの新鮮な基本培地に加えた。これらを続いて30℃で
24時間成長せしめた。全ての培養を、2400×ｇのベンチ
トップ臨床遠心分離器中で10分間遠心分離した。菌糸沈
殿を、50ｍｌの17ｍＭ ＫＨＰＯ_４ 緩衝液（ｐＨ6.0
）中で３回洗浄した。最後に、１ｍＭのソホロースを
添加した50ｍｌの17ｍＭ ＫＨＰＯ_４ 緩衝液を含有す
る６つのフラスコと、ソホロースを含有しない対照フラ
スコ中に菌糸を懸濁せしめた。ミラクロス（カルバイオ
ケム）を通じての濾過による収穫の前に、フラスコを30
℃で18時間、培養した。次いで過剰の媒質を絞りだし、
菌糸マットを直接液体窒素中に配したが、その菌糸マッ
トは１か月に亘り−70℃で貯蔵される。次いで冷凍菌糸
を、いくつかのドライアイスの塊で予備冷却した電気コ
ーヒー粉砕機で、微粉末が得られるまで挽いた。その粉
末を、80ｍｌのＤＥＰ−処理水に溶解せしめた9.6 ｇの
ｐ−アミノサリチル酸、80ｍｌのＤＥＰ−処理水に溶解
せしめた1.6 ｇのトリイソプロピルナフタレンスルホン
酸、24.2ｇのトリス−ＨＣｌ、14.6ｇのＮａＣｌ、19.0
9 ｇのＥＤＴＡを含有する抽出緩衝液、約20ｍｌに加え
たが、その緩衝液は、ＤＥＰ−処理水で合計容積で200
ｍｌまで希釈したものであり、ｐＨはＮａＯＨで8.5 に
調整した。抽出緩衝液の添加後、0.5容積のＴＥ−飽和
フェノールを緩衝液に加え、抽出混合物を氷上に配し
た。次いで1/4 容積のクロロホルムを抽出混合物に加
え、その混合物を２分間振り混ぜた。次いで相を2500ｒ
ｐｍでの遠心分離により分離した。水相を除去して遠心
分離管中に配したが、その管は、底に数滴のフェノール
を含んだ。次いで有機相を2.0 ｍｌの抽出緩衝液で再抽
出して68℃の水浴中に５分間配し、ポリソームに捕捉さ
れ、抽出混合物の界面にあるＲＮＡを放出せしめた。次
いで抽出した混合物を遠心分離せしめ、水相を除去して
他の水分画とともに集積した。

【０１１５】次いで全体の水分画を、界面において視覚
的にもはやいかなるタンパク質も見られなくなるまで、
フェノール−クロロホルム（１：１ ｖ／ｖ）で４から
５回抽出した。次いで0.1 容積の３Ｍ 酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ5.2 （ＤＥＰ水で作成し、加圧滅菌した）およ
び2.5 容積の95％を有機抽出物に加え、抽出物を−20℃
で２から３時間、冷凍した。あるいは、ＲＮＡを２Ｍの
酢酸リチウムを用いて沈殿せしめた。次いでＲＮＡを1
2,000ｒｐｍで20分間の遠心分離により沈殿せしめた。
沈殿せしめたＲＮＡを、ＲＮアーゼ阻害因子を有するＤ
ＥＰ−水中に、μｌ当たり１ユニットの最終濃度となる
まで再懸濁せしめた。酵素をコードする遺伝子が誘発さ
れているかどうかを確認するために、全ＲＮＡを分析し
た。

【０１１６】全ＲＮＡ標品の分析 セルラーゼ複合体の酵素をコードする遺伝子が誘発され
ているかどうかを確認するために、プローブとしての
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｃｂｈ２遺伝子のＰ^３２断片を用い
たサムブルックらにより記載されたノーザンブロットに
より全ＲＮＡを分析した。ここに参照文献としているチ
ェンらにより「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉか
らのセロビオ−ヒドロラーゼＩＩの推測した主な構造お
よびヌクレオチド配列」、バイオテクノロジー、５巻
（1987、３月）に記載されている方法を用いて、ｃｂｈ
１クローンを単離した。そのｃｂｈ１クローンに、部位
定方向突然変異（サムブルックら、前出）を行ない、Ｂ
ｇｌ ＩＩ部位を読み取り枠の正確な５′末端に配し、
Ｎｈｅ Ｉ部位を正確な３′末端に配した。ＢｇｌＩＩ
／Ｎｈｅ Ｉ暗号配列をｐＵＣファージミド中にクロー
ンした。プローブとしての使用に関して、ｃｂｈ２断片
をＢｇｌ ＩＩ／Ｎｈｅ Ｉで切断し、ゲル電気泳動に
より単離した。その結果により、ｃｂｈ２特異的ｍＲＮ
Ａの水準は誘発の前の14−18時間でピークに達したこと
が示された。次いで14、18および22時間の前ＲＮＡを集
積した。

【０１１７】実施例２ ポリアデニル化ｍＲＮＡの精製 次いでオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーを
用いて上述した前ＲＮＡの集積分画からｍＲＮＡを単離
した。オリゴ（ｄＴ）セルロース（コラボラティブリサ
ーチ、レキシントン、ＭＡからのタイプ３）を、0.01Ｍ
のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5 、0.5 ＭのＮａＣｌ、およ
び１ｍＭのＥＤＴＡを含有するオリゴ（ｃＴ）結合緩衝
液で最初に平衡とし、25−300 ｍｇのアリコートを1.5
ｍｌのミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に加え
た。１ｍｌの結合緩衝液中に溶解せしめたＲＮＡを加
え、15分間、優しく振動せしめながら結合せしめた。懸
濁液を1500ｇで３−５分間、遠心分離し、１ｍｌの結合
緩衝液で３−５回洗浄し、0.01Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ7.5 、および１ｍＭのＥＤＴＡを含有する400 μｌの
溶出緩衝液で３回洗浄した。溶出物を集積し、0.5 Ｍ
ＮａＣｌで再調整し、再結合せしめ、溶出緩衝液の３回
の洗浄により再溶出せしめた。最終の３つの溶出緩衝液
の洗浄物を集積し、ｍＲＮＡをエタノール沈殿により回
収した。

【０１１８】全ＲＮＡおよびポリアデニル化ｍＲＮＡの
分析 全ＲＮＡおよびポリアデニル化ｍＲＮＡを、ニトラン
^Ｒ 膜にブロットしたそれぞれのレーンで10μｇのＲＮ
Ａを用いて１％のホルムアルデヒド−アガロースゲル上
で分画し、トーマスにより「変性ＲＮＡおよびニトロセ
ルロースに転移された小さなＤＮＡ断片の雑種形成」、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、77巻
（1980）、5201−5205頁に記載されているノーザンブロ
ット法により分析した。

【０１１９】手短にいうと、この方法は、１Ｍのグリオ
キサル／50％（容積／容積）Ｍｅ_２ ＳＯ／10ｍＭのリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.0 において50℃で１時間の
培養によるＲＮＡの変性（10μｇ／８μｌまでの反応）
を含む。反応混合物を氷上で冷却し、50％（容積／容
積）グリセロール、10ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ7.0 およびブロモフェノールブルーを含有する２μ
ｌの試料緩衝液を加えた。試料を、10ｍＭのリン酸緩衝
液、ｐＨ7.0 中の水平の１％ホルムアルデヒド−アガロ
ースゲル上で90Ｖで６時間、電気泳動せしめた。

【０１２０】グリコシル化ＲＮＡを、３Ｍ ＮａＣｌ／
0.3 Ｍクエン酸トリナトリウム（20×ＮａＣｌ／ｃｉ
ｔ）を用いてアガロースゲルからニトロセルロースに転
移せしめた。電気泳動後、ゲルを、20×ＮａＣｌ／ｃｉ
ｔで飽和せしめた２枚のワツマン３ＭＭ紙に亘り配し
た。ニトラン^Ｒ 膜を水で濡らし、20×ＮａＣｌ／ｃｉ
ｔで平衡とし、ゲルに亘り被せた。次いでゲルを２枚の
ワツマン３ＭＭ紙と、紙タオル、ガラス板およびおもり
の５から７ｃｍの層とで覆った。ＲＮＡの転移は12−15
時間で完了した。次いで、ブロットをランプの下で乾燥
せしめ、２時間に亘り80℃で真空中で焼成した。

【０１２１】膜をｃｂｈ２プローブでプローブして、ポ
リアデニル化ｍＲＮＡプールがｃｂｈ２ ｍＲＮＡを含
有することを確認し、推論により、セルラーゼ複合体の
酵素をコードする遺伝子は完全に誘発された。

【０１２２】実施例３ Ａ．第１の鎖合成 ｃＤＮＡの合成は、製造社の指示に従ってＢＲＬ ｃＤ
ＮＡ合成システム^Ｒ（ベセスダリサーチラボラトリー
ズ、Ｍｄ．）を用いて行なった。250 ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ8.3 、375 ｍＭのＫＣｌ、15ｍＭのＭｇＣｌ
_２ 、50ｍＭのＤＴＴ、2.5 μｌの10ｍＭ ｄＮＴＰ混
合物（10ｍＭのｄＡＴＰ、10ｍＭのｄＣＴＰ、10ｍＭの
ｄＧＴＰ、10ｍＭのｄＴＴＰ）、５μｌのオリゴ（ｄ
Ｔ）_{１２− １８} （0.5 ｍｇ／ｍｌ）、10μｌの0.5 ｍ
ｇ／ｍｌでのｍＲＮＡおよび20μｌのジエチルピロカル
バミン酸塩（ＤＥＰＣ）−処理水を含有する10μｌの５
×第１鎖緩衝液を、氷上の無菌のＤＥＰＣ処理管に加
え、50ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3 ）、75ｍＭのＫ
Ｃｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、10ｍＭのジチオスレイト
ール、それぞれ500 μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰ、50μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）
_{１２−１８} 、100 μｇ／ｍｌのポリアデニル化ＲＮＡ
および10,000Ｕ／ｍｌのクローンＭ−ＭＬＶ逆トランス
クリプターゼを含有する最終組成物を生成した。ｍＲＮ
Ａの変わりに10μｌの2.3 ｋｂ対照ＲＮＡ（0.5 ｍｇ／
ｍｌ）を用いて、同時に対照を展開させた。

【０１２３】反応混合物からの少量のアリコートをゲル
上で展開せしめ、その存在と量を確認した。得られた産
生物は約２−６μｇであった。

【０１２４】Ｂ．第２の鎖合成 第１の鎖合成の後に、230.6 μｌのＤＥＰＣ−処理水、
６μｌの10ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、並びに、188 ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.3 、906 ｍＭのＫＣｌ、100 ｍ
Ｍの（ＮＨ_４ ）_２ ＳＯ_４ 、46ｍＭのＭｇＣ
ｌ_２ 、37.5ｍＭのジチオスレイトール、1.5 ｍＭのＮ
ＡＤ、８μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ
（10μ／μｌ）、1.4 μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼ
Ｈおよび１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（100
ユニット）を含有する32μｌの10×第２の鎖緩衝液を氷
上の対照管に加えた。

【０１２５】289.5 μｌのＤＥＰＣ−処理水、7.5 μｌ
の10ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、40μｌの10×第２の鎖緩衝
液、10μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、1.
75μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨおよび1.25のＥ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼを、氷上の第１の鎖合成試料
に加え、25ｍＭのトリス−ＨＣｌ、（ｐＨ8.3 ）、100
ｍＭのＫＣｌ、10ｍＭの（ＮＨ_４ ）_２ ＳＯ_４ 、５
ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、それぞれ250 μＭのｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、0.15ｍＭのＮＡＤ、５ｍ
Ｍのジチオスレイトール、250 Ｕ／ｍｌのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、8.5Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＨ、および30Ｕ／
ｍｌのＤＮＡリガーゼを含有する最終組成物を生成し
た。対照管と試料管の両方をやさしく振動せしめ、16℃
で２時間、培養した。培養後、両方の管を氷上に配し
た。

【０１２６】次いで試料管を415 μｌのフェノールで抽
出し、エタノールで沈殿せしめた。沈殿物を200 μｌの
無菌ＴＥ緩衝液（10ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ7.5 、
１ｍＭのＮａ_２ ＥＤＴＡ）中に溶解せしめ、7.5 Ｍの
酢酸アンモニウムからエタノールで再沈殿せしめた。

【０１２７】試料のアリコートを、純度を調べるために
ゲル電気泳動により分析した。合成の産生物は約4.0 μ
ｇであった。

【０１２８】残りの対照試料を、前述したようにフェノ
ールで抽出し、エタノールで沈殿せしめた。沈殿物を20
0 μｌの無菌ＴＥ緩衝液中に溶解せしめた後、酢酸アン
モニウムからエタノールで再沈殿せしめ、乾燥沈殿物を
200 μｌの無菌ＴＥ緩衝液中に溶解せしめ、２μｌの溶
液を、純度を調べるためにさらにゲル電気泳動により分
析した。

【０１２９】実施例４ ｂｇｌ１ ｃＤＮＡ配列の増幅 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてタク^Ｒ ポリ
メラーゼとパーキンエルマーセタスサーマルサイクラー
^Ｒ により、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉβ−グルコシダーゼ遺伝
子の一部をコードするｃＤＮＡ断片の増幅を行なった。

【０１３０】76μｌの脱イオン水、166 ｍＭの（ＮＨ
_４ ）_２ ＳＯ_４ 、670 ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
8.8 、67ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、67μＭのＥＤＴＡ、10ｍ
Ｍのβ−メルカプトエタノール、10μｌのジメチルスル
ホキシド、および脱イオン水により合計で1.0 ｍｌの容
積に希釈した1.7 ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する10μｌ
の10×緩衝液混合物、８μｌの２つのｄＮＴＰ（それぞ
れ）、１μｌの５′オリゴヌクレオチドプライマー、１
μｌの３′内部オリゴヌクレオチドプライマー、３μｌ
の脱イオン水で希釈された1.0 μｇのｃＤＮＡ、および
１μｇのタク^Ｒポリメラーゼを混合することにより反応
混合物を生成した。

【０１３１】増幅方法は、最初の95℃で10分間の変性サ
イクル、続いて50℃での２分間のアニーリング工程、お
よび65℃での10分間の重合サイクル、追加の30サイクル
からなる。

【０１３２】Ａ．オリゴヌクレオチドプライマー Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ｂｇｌ１遺伝子をコードするｃＤＮ
Ａ断片を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライ
マーは、ｂｇｌ１遺伝子と内部オリゴヌクレオチドのた
めにＮ末端領域の選択したアミノ酸の遺伝暗号の退化に
基づいて設計した。５′オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列５′ＧＣＩ ＧＴＩ ＣＣＴＣＣＴ ＧＣＩ
ＧＧ３′からなり、ここでＩはイノシンである。

【０１３３】内部３′オリゴヌクレオチドプライマーは
16×21オリゴヌクレオチドのプールからなる。このプー
ルは以下の配列の様々な誘導体に基づく： ５′ＧＴＴ Ｇ／ＡＴＴ ＩＣＣ Ｇ／ＡＴＴ Ｇ／Ａ
ＡＡ Ｇ／ＡＴＣ ＴＧＴ３′ 実施例５ ＰＣＲ産生断片のサブクローニング それぞれ90μｌの反応混合物を、１× ＴＢＥ中の４％
ポリアクリルアミドゲル上で分画し、主なバンドをサム
ブルックらにより記載されたようにゲルスライスから削
除し、溶出した。溶出ＤＮＡ断片をエタノール中で沈殿
せしめ、15μｌのＴＥ緩衝液（10ｍＭのトリス、１ｍＭ
のＥＤＴＡ）中で再懸濁せしめた。それぞれ１−２μｇ
のＤＮＡ断片を0.5 ｍＭのＡＴＰとＴ_４ ポリヌクレオ
チドキナーゼで処理し、サムブルックらの方法に従って
各断片の５′末端をリン酸化した。３μｌの10×Ｔ_４
ポリメラーゼ緩衝液（ｐＨ7.9 での330 ｍＭのトリス−
酢酸塩、660 ｍＭの酢酸カリウム、100 ｍＭの酢酸マグ
ネシウム、１μｌの2.5 ｍＭ ｄＮＴＰＳ、１μｌのＴ
_４ ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌの蒸留水）を加え
ることにより鈍端を生成した。鈍端反応混合物は37℃で
60分間培養した。１ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度までＥＤ
ＴＡを添加することにより反応を停止せしめ、試料をさ
らに65℃で10分間加熱した。

【０１３４】鈍端ＤＮＡ断片を、サムブルックらにより
記載されたようにＭ１３Ｘ０７に感染したＳｍａＩ開裂
および脱リン酸化ｐＵＣ２１８と連結した。コーマンら
により「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａ
ｒ．ａｗａｍｏｒｉからの２つのα−アミラーゼ遺伝子
のクローニング、特徴付け、および発現」、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、17巻、203 −212 頁（1990）
に記載されているように、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉお
よびＸｈｏ Ｉポリリンカーの挿入により、クローニン
グべクターｐＵＣ２１８およびｐＵＣ２１９をｐＵＣ１
１８およびｐＵＣ１１９から誘導した。

【０１３５】上述したファージミドを用いて、ヤーニッ
シュらにより「改良Ｍ１３ファージクローニングベクタ
ーおよび宿主菌株：Ｍ１３ｍｐ１８およびｐＵＣ１９ベ
クターのヌクレオチド配列」、Ｇｅｎｅ、1197巻、103
−119 頁（1985）に記載されているようにＥ．ｃｏｌｉ
菌株ＪＭ１０１を転換した。

【０１３６】実施例６ ｃＤＮＡクローン断片の単離 転換菌株を、15μｌの飽和Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭＪ１０１
を以前に接種した管中の1.5 ｍｌの２ＹＴブイヨン中で
接種した。培養は、37℃で振動せしめながら８時間行な
った。次いで培養混合物を、５分間、6000回転で回転せ
しめ、上澄み液を別の管に注いだ。その上澄み液に、30
0 μｌの2.5 Ｍ ＮａＣｌ、20％のＰＥＧを加え、その
溶液を混合した。次いでその混合物を室温で15時間、培
養した。

【０１３７】その溶液をミクロフュージ中で５分間、回
転せしめ、上澄み液を吸い出した。溶液を再度回転せし
め、上澄み液をさらに吸い出した。

【０１３８】100 μｌの平衡フェノールをその管に加
え、その管を回転せしめた。100 μｌのクロロホルムを
加え、再度その管を回転せしめた。その管を５分間、55
℃で加熱し、混合し、さらに５分間、マイクロフュージ
（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅｄ）した。

【０１３９】160 μｌの上澄み液を計り取り、透明な管
に移送した。その上澄み液に、20μｌの１Ｎ ＮａＯＡ
ｃ、ｐＨ4.5 、および400 μｌの95％ ＥＴＯＨを加
え、その溶液を混合し、氷上で５分間、凍結せしめた。
次いでその管を15分間、回転せしめ、上澄み液を吸い出
した。

【０１４０】その管に、1000μｌの70％のエタノールを
加え、その管をさらに２分間、回転せしめ、再度吸い出
した。その混合物を真空下で４分間、回転せしめ、その
沈殿を15μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁せしめた。

【０１４１】実施例７ 700 ｂｐ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列の決定 700 ｂｐ ｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を、シーケ
ナーゼ^Ｒ 試薬キット（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルス）を
用いた、サンガーらにより、「鎖終終了阻害剤によるＤ
ＮＡ塩基配列決定法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、74巻（1977）、5463頁に記
載されたジデオキシＤＮＡ塩基配列決定法を用いて決定
した。

【０１４２】実施例８ ｂｇｌ１遺伝子の分析 Ａ．配列分析 ヌクレオチド配列決定は、シーケナーゼ^Ｒ 試薬キット
（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルス）を用いたサンガーらのジ
デオキシ鎖終了法により行なった。

【０１４３】Ｂ．アミノ酸配列決定 精製した、2.5 ｎモルの還元してカルボキシルメチル化
したβ−グルコシダーゼ標品の試料（パーキリコおよび
ブラウン、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．165 巻、333 頁）に、専売多相シーケン
サーでＮ末端配列決定を行なった。

【０１４４】β−グルコシダーゼの試料に、エンド−リ
スＣプロテアーゼを全タンパク質の１％まで加え、混合
物を37℃で１時間、培養したか、またはタンパク質試料
に臭化シアン処理を施した。等容積のＨＰＬＣ溶液Ａ
（水中に0.05％のＴＥＡ／0.05％のＴＦＡ）を加え、反
応を停止せしめた。生成したＣＮＢｒおよびエンド−リ
スＣ断片を、0-100 ％のＨＰＬＣ溶液Ｂ（ｎ−プロパノ
ール中に0.05％のＴＥＡ／0.05％のＴＦＡ）の、１分当
たり１％の速度での線形勾配を用いたブラウンリーＣ−
４カラムのクロマトグラフィーにより分離せしめた。ア
ミノ酸配列決定に関して、いくつかのピークを集積し、
そのデータを図１に示した。

【０１４５】実施例９ Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのｂｇｌ１遺伝子の同定 次いで700 ｂｐ ｂｇｌ１ ｃＤＮＡ断片を、前出のサ
ムブルックらにより記載された方法を用いて^３２Ｐで標
識した。

【０１４６】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのゲノムＤＮＡを、
ミラクロスを通過させたＴ．ｒｅｅｓｅｉの24−36時間
の培養を濾過し、培養培地から得た菌糸を冷凍せしめる
ことにより調製した。次いで冷凍した菌糸を微粉末に粉
砕し、22ｍｌのＴＥおよよび４ｍｌの20％ ＳＤＳを粉
末菌糸に加え、混合した。遠心分離と水相の除去の前
に、10ｍｌのフェノールとクロロホルムを加えた。200
μｌの５ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ有機抽出物に加
え、その混合物を55℃で20分間、培養した。クロロホル
ム／フェノール抽出とそれに続いてのエタノール沈殿を
用いた従来より知られている方法により、ＤＮＡをさら
に抽出した。次いで単離したＤＮＡを、ＴＥ緩衝液中の
20μｇのゲノムＤＮＡ当たり１μｇの加熱リボヌクレア
ーゼＡ（100 ℃で15分間）により37℃で30分間、処理
し、そして室温まで冷却せしめた。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉか
らのゲノムＤＮＡを単独で、またはＥｃｏ ＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ等のような様々な制限酵素と組み合わせて切
断し、サザンブロットしてプローブとしてのｂｇｌ１遺
伝子の700 ｂｐ ｃＤＮＡ断片で標識したＰ^３２で雑種
形成せしめた。この分析から、Ｈｉｎｄ ＩＩＩはβ−
グルコシダーゼ遺伝子を配置するのに用いられた選り抜
きの制限酵素であることが分かった。

【０１４７】ゲノムＤＮＡ１ミリグラム当たり10から20
ユニットのＨｉｎｄ ＩＩＩをＤＮＡに加え、ＤＮＡを
フェノール−クロロホルムで抽出し、タンパク質を除去
した。処理したＤＮＡをアルコール沈殿せしめ、ＴＥ緩
衝液中で２グラム／リットルまで再懸濁せしめた。

【０１４８】ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ切断から
の４μｌの試料を、１％のアガロースゲル上に装填し、
電気泳動で分画した。次いでゲルをサザンブロットし、
Ｐ^{３ ２}700 ｂｐ ｃＤＮＡプローブでプローブした。6.
0 ｋｂバンドを、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉからのＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ切断ゲノムＤＮＡのサザンブロット上で同定した。

【０１４９】次いで、残りのＨｉｎｄ ＩＩＩゲノムＤ
ＮＡに、標品ゲル電気泳動を行ない、５ｋｂから７ｋｂ
の範囲に亘る断片をアガロースゲルら電気溶出し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ切断ｐＵＣ２１８中にクローンした。生成し
たプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１を転換
し、ライブラリーを作成した。次いでそのライブラリー
を、プローブとしてのＰ^３２標識700 ｂｐ ｂｇｌ１
ｃＤＮＡを用いたコロニーハイブリッド法によりスクリ
ーン（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）し、ｂｇｌ１遺伝子をコード
するＤＮＡを含有するコロニーを同定した。

【０１５０】転換体からの陽性コロニーを採取し、前出
のサムブルックらにより記載されたフェノール：クロロ
ホルム抽出とエタノール沈殿によりそこからＤＮＡを単
離した。

【０１５１】陽性コロニーから単離したＤＮＡを単一
で、または以下の制限酵素：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＩ、Ｓｓｔ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｘｈｏ
Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｌ
Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、ＳｐｈＩ、Ｂａｌ Ｉ、およびＰｖ
ｕ ＩＩと組み合わせて切断した。切断物にアガロース
ゲル電気泳動を施し、生成したバンド模様を用いてクロ
ーンした6.0 ｋｂゲノムＤＮＡの制限マップを構成し
た。同一のアガロースゲルをサザンブロットし、Ｐ^３２
標識700 ｂｐ ｂｇｌ１ ｃＤＮＡでプローブして、ど
の制限酵素断片がｂｇｌ１ ｃＤＮＡが相同であるかを
確認した。遺伝地図作製実験により、完全ｂｇｌ１遺伝
子はゲノムＨｉｎｄ ＩＩＩクローンに含まれることが
確認された。600 ｂｐから1500ｂｐのサイズに亘るＰｖ
ｕ ＩＩおよびＢａｌ Ｉ制限断片を700 ｂｐ ＤＮＡ
ｂｇｌ１クローンで雑種形成せしめ、ｐＵＣ２１８フ
ァージミドへのサブクローンするのに選択した。これら
の断片をファージミド中にクローンした後に、サンガー
らのジデオキシ鎖終了法（1977）を用いて、ＰｖｕＩＩ
およびＢａｌ Ｉサブクローンを配列決定した。次いで
この配列法から、サブクローンの重複配列は、ヌクレオ
チド配列が両鎖に決定された単一の連続配列の合計3033
ｂｐで直線にしたことが分かった。

【０１５２】実施例１０ ｐＳＡＳβ−ｇｌｕの構成 ｐＳＡＳβ−ｇｌｕの構成のための開始ベクターはプラ
スミドｐＳＡＳであった。ｐＳＡＳを以下の方法に従っ
て構成した。ｐＵＣ１００（市販されているプラスミド
ベクター）を制限酵素ＳｍａＩで切断し、続いて５′リ
ン酸塩基を、牛腸アルカリ性ホスファターゼで切断する
ことにより除去した。線状ベクター断片を、アガロース
ゲル電気泳動により未切断ベクターとタンパク質から精
製し、続いて電気溶出により単離ゲルスライスから線状
ベクターＤＮＡを単離した。ベクター配列からの分離の
後に、ａｍｄＳ遺伝子を2.4 ｋｂ Ｓｓｔ Ｉ制限酵素
断片として単離した（ハインズ、Ｍ．Ｊ．、コリック、
Ｃ．Ｍ．、およびキング、Ｊ．Ａ．による、「Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子を
含有するゲノムクローンの単離および構造と規定突然変
異の分析への使用」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３
巻（1983）1430−1439頁）。2.4 ｋｂ ＳｓｔＩ ａｍ
ｄＳ断片と2.7 ｋｂのｐＵＣ１００ベクター断片をとも
に連結し（サムブルックら、前出）、連結混合物を転換
し、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌株、ＪＭ１０１中で増殖せしめ
た。

【０１５３】ｐＳＡＳを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切
断することによりｐＳＡＳβ−ｇｌｕを構成し、上述し
たように線状断片を精製した。このＨｉｎｄ ＩＩＩ処
理ｐＳＡＳベクター断片中に、遺伝子転写と翻訳に必要
な配列とともにｂｇｌ１遺伝子の全ての暗号領域を含有
するＴ．ｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡの6.0 ｋｂ Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ断片を連結した。

【０１５４】実施例１１ ＢＧＬ１欠損ベクターの調製 第３Ｂ図に示したように、遺伝子置換ベクターｐＵＣΔ
β−Ｇｌｕ Ａ／Ｒｐｙｒを、完全ｂｇｌ１遺伝子を含
有することが知られている6.0 ｋｂゲノムＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ断片を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩと牛腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで脱リン化した末端で切断したｐＵＣ２１８の
ポリリンカー中にクローニングすることにより構成し
た。ｂｇｌ１遺伝子の暗号領域を、ｂｇｌ１読み取り枠
の５′末端と３′末端に位置した特有ＡｐａＩおよびＥ
ｃｏＲＶ制限部位でのＡｐａＩおよびＥｃｏＲＶにより
プラスミドを切断することによりこのプラスミドから除
去し、線状プラスミドＤＮＡを単離した。制限部位末端
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで鈍端とした。次いでこのプ
ラスミドを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから
のｐｙｒＧ遺伝子を含有する単離2412ｂｐ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ／Ｂａｍ ＨＩ制限断片と連結し（ハーティング
スレットら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．206:71-75
（1987）、ここで制限末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで
の処理により鈍端としてｐＵＣΔβＧｌｕ Ａ／Ｒ ｐ
ｙｒ（第３Ｂ図）を生成した。

【０１５５】実施例１２ プロトプラストの単離 500 ｍｌのフラスコ中の100 ｍｌのＹＥＧ（0.5 ％の酵
母抽出物、２％のグルコース）に約５×10^７ のＴ．ｒ
ｅｅｓｅｉ細胞を接種することにより菌糸を得た。次い
でフラスコを振動せしめながら37℃で約16時間、培養し
た。2,750 ｇでの遠心分離により菌糸を収穫した。収穫
した菌糸をさらに1.2 Ｍのソルビトール溶液中で洗浄
し、40ｍｌのノボザイム^Ｒ 中で再懸濁せしめた。この
ノボザイム ^Ｒ は、Ｃｔ、ダンバリー、ノボバイオラボ
からの１、３−アルファ−グルカナーゼ、１、３−ベー
タ−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナーゼ、キ
チナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成分酵素の商
標であり、溶液は５ｍｇ／ｍｌのノボザイム^Ｒ ２３
４；５ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ_４ ・７Ｈ_２ Ｏ；0.5 ｍ
ｇ／ｍｌの牛血清アルブミン；1.2 Ｍのソルビトールを
含有する。ミラクロス（カルバイオケムコーポ）を通じ
ての濾過によりプロトプラストを細胞デブリから除去
し、2,000 ｇの遠心分離により集積した。プロトプラス
トを1.2 Ｍのソルビトール中で３回洗浄し、再度1.2 Ｍ
のソルビトール、50ｍＭのＣａＣｌ_２ 中で遠心分離
し、再懸濁せしめた。プロトプラストを最終的に、1.2
Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣａＣｌ_２ の１ｍｌ当た
り２×10^８ のプロトプラストの濃度で再懸濁せしめ
た。

【０１５６】実施例１３ 菌類プロトプラストのｐＳＡＳβ−Ｇｌｕによる転換 実施例１２で調製した200 μｌのプロトプラスト懸濁液
を、ＴＥ緩衝液中の20μｌ（20μｇ）のｐＳＡＳβ−Ｇ
ｌｕと、25％のＰＥＧ４０００、0.6 ＭのＫＣｌおよび
50ｍＭのＣａＣｌ_２ を含有するポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）溶液とに加えた。この混合物を氷上で20分
間、培養した。この培養期間の後、2.0ｍｌの上記のよ
うに同定したＰＥＧ溶液をそこに加え、その溶液をさら
に混合し、室温で５分間、培養した。この２回目の培養
後、1.2 Ｍのソルビトールと50ｍＭのＣａＣｌ_２ を含
有する4.0 ｍｌの溶液をそこに加え、この溶液をさらに
混合した。次いでプロトプラスト溶液を直ちにボゲル培
地Ｎの溶解アリコート（３グラムのクエン酸ナトリウ
ム、５グラムのＫＨ_２ ＰＯ_４ 、２グラムのＮＨ_４ Ｎ
Ｏ_３ 、0.2 グラムのＭｇＳＯ_４ ・７Ｈ_２ Ｏ、0.1
グラムのＣａＣｌ_２ ・２Ｈ_２ Ｏ、５μｇのα−ビオチ
ン、５ｍｇのクエン酸、５ｍｇのＺｎＳＯ _４ ・７Ｈ
_２ Ｏ、１ｍｇのＦｅ（ＮＨ_４ ）_２ ・６Ｈ_２ Ｏ、
0.25ｍｇのＣｕＳＯ_４ ・５Ｈ_２ Ｏ、並びに、追加の
１％のグルコース、1.2 Ｍのソルビトールおよび１％の
アガロースゲルを含有する50μｇのＭｎＳＯ_４ ・４
Ｈ）に加えた。次いでプロトプラスト／培地混合物を、
上述したように追加に窒素供給源のようなボゲルの媒地
を含有する固体上に注いだ。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉはａｍｄ
Ｓ遺伝子に相当する官能基を含まないので、転換体のみ
がこの培地上で成長する。これらのコロニーは、続いて
転移せしめられ、添加剤として１％のグルコースを含有
する固体ボゲル培地Ｎ上で精製せしめられる。ｂｇｌ１
遺伝子挿入転換体菌株はＡ８３ｐＳＡＳβＧｌｕと呼ば
れる。

【０１５７】安定な転換体は、早い成長と、固体培養培
地上のでこぼこの外形というよりもむしろ滑らかな円形
コロニーの形成により、不安定な転換体と区別できる。
加えて、ある場合には、安定性の試験は、固体非選択性
培地上に転換体を成長せしめ、この培養培地からの芽胞
を収穫し、続いて発芽し選択性培地上で成長するこれら
の芽胞の百分率を測定することにより行なわれる。

【０１５８】第６図は、ｂｇｌ１遺伝子の増大コピーを
有する異なる転換体の、プローブとしてのＰ３２標識70
0 ｂｐ断片を用いたサザンブロットのオートラジオグラ
フィー（レーン１−８）および対照としてＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで切断した過剰産生菌株からのゲノムＴ．ｒｅｅｓ
ｅｉを用いたもの（レーン９）である。このオートラジ
オグラフィーは、転換体は、対照と比較して増大した量
のｂｇｌ１遺伝子を含有したことを明確に示した。

【０１５９】第４図は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの親菌株（レ
ーンＢ）と比較してｂｇｌ１メッセージの水準において
対応する増大を示すソポロースでの誘発後に本発明によ
り産生された転換体のうちの１つから単離したＲＮＡ
（レーンＡ）のノーザンブロットのオートラジオグラフ
である。

【０１６０】転換体の視覚的な分析以外に、ニトラン
^Ｒ 膜から適切なバンドを切り取り、その中に存在する
放射線活性標識をシンチレーションカウンター中でカウ
ントすることにより、量的な分析も行なった。この実験
は、以下の表ＩＩＩに示すようにメッセージの相対量を
より正確に評価するために行なった。

【０１６１】

【表３】 表III は、本発明の方法により産生された転換体が余分
なβ−グルコシダーゼｍＲＮＡを有し、それゆえβ−グ
ルコシダーゼ酵素の増大が特異的活性の増大となること
を示している。

【０１６２】実施例１４ 菌類プロトプラストのｐＵＣΔβＧｌｕ Ａ／Ｒ ｐｙ
ｒ４による転換 細胞外β−グルコシダーゼ、ｂｇｌ１の暗号配列を欠い
たＴ．ｒｅｅｓｅｉの変異体は、標的遺伝子置換操作に
より得た。ｐＵＣΔβＧｌｕ Ａ／Ｒ ｐｙｒ４プラス
ミドをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断して、線状Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ断片を得た。ここでｂｇｌ１暗号配列は、Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからのｐｙｒＧ遺伝子と置
換されていた。プロトプラストは、実施例１２および１
３の方法により、ｂｇｌ１側腹配列とｐｙｒ４を含有す
る線状ＤＮＡ断片により転換した。欠損転換体はΔ１２
とΔ３６と呼ばれた。転換後、プロトプラスト溶液を、
追加の１％グルコース、1.2 Ｍソルビトールおよび１％
アガロースを含有するボゲル培地Ｎの融解アリコートに
加えた。次いでプロトプラスト／培地混合物を同一のボ
ゲル培地Ｎを含有する固体培地に注いだ。その培地には
まったくウリジンは存在せず、それゆえ、ＤＮＡ断片に
挿入された野生型ｐｙｒ４遺伝子によるＴ．ｒｅｅｓｅ
ｉ菌株ＲＬ−Ｐ３７のｐｙｒ４変異の相補の結果とし
て、転換コロニーのみが成長することができた。次いで
安定な転換体は実施例１３に記載した方法により選択し
た。

【０１６３】実施例１５ 転換体の分析 上述した700 ｂｐ ｃＤＮＡプローブを用いて、転換体
を、ｂｇｌ１遺伝子の存在または不在について分析し
た。転換体はＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて切断した。選択
した転換体からの合計ゲノムＤＮＡはＨｉｎｄ ＩＩＩ
制限酵素で切断し、１％のアガロースゲル上を展開せし
め、ニトラン^Ｒ 膜に移送し、上述したＰ ^３２標識700
ｂｐ ｃＤＮＡでプローブし、Ｘ線フイルム上のオート
ラジオグラフィーにより視覚化した。この分析の結果を
第５Ａ図に示す。その結果により、転換体（Δ１２およ
びΔ３６）はｂｇｌ１遺伝子に対応するバンドを含有し
ない一方、野生型菌株（ＲＬ−Ｐ３７、すなわち、Ｐ−
３７）はそのバンドを含有したことが示された。

【０１６４】ｍＲＮＡは実施例１４の転換体から単離
し、実施例２のようにノーザンブロットにより分析し
た。第５Ｂ図に示したように、Ｐ^３２標識2.2 Ｋｂ Ａ
ｐａＩ／ＥｃｏＲＶ ｂｇｌ１プローブを用いたノーザ
ンブロット分析により、ｂｇｌ１特異的ｍＲＮＡがＴ．
ｒｅｅｓｅｉ ＲＬ−Ｐ３７ ＰＹＲＧ６９中に存在し
ていたが、転換体Δ１２およびΔ３６中には存在しない
ことが示された。

【０１６５】上述した実施例８によりタンパク質を再生
し、次いで検出のためにホースラディシュペルオキシダ
ーゼを付けた多クローン性抗体（純粋β−グルコシダー
ゼを抗原投与した家ウサギからの）を使用することによ
り、β−グルコシダーゼの存在を分析した。その抗体を
用いて、純粋β−グルコシダーゼ（100 ｎｇ−−カラム
Ａ；1000ｎｇ−−カラムＢ）；野生型Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ
から産生されたセルラーゼ（カラムＣ）；β−グルコシ
ダーゼ遺伝子を欠損するように遺伝子操作されたＴ．ｒ
ｅｅｓｅｉ菌株から産生されたセルラーゼ（カラムＤ）
を同定した。この分析結果は第５Ｃ図に示し、カラムＤ
のみがβ−グルコシダーゼを含有しなかったことが分か
った。

【０１６６】本発明を様々な好ましい実施態様の点から
記載したが、当業者には、本発明の範囲から逸脱するこ
となく、様々な修正、代替、省略および変更が行なわれ
ることが理解されよう。したがって、本発明の範囲は、
同等物を含む以下の請求の範囲のみにより制限されるも
のである。

【０１６７】

【実施例】 【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】完全なＴ．ｒｅｅｓｅｉ ｂｇｌ１遺伝子の
ヌクレオチド配列および推測した主要なアミノ酸構造

【図１Ｂ】図１Ａの続きである

【図１Ｃ】図１Ｂの続きである

【図１Ｄ】図１Ｃの続きである

【図１Ｅ】図１Ｄの続きである

【図２】ベクターｐＳＡＳβ−ｇｌｕを模式的に示した
図

【図３Ａ】ベクターｐＳＡＳΔβＧｌｕ ｂａｌ ｐｙ
ｒ（Δ３６）を模式的に示した図

【図３Ｂ】ベクターｐＵＣΔβ−Ｇｌｕ Ａ／Ｒ ｐｙ
ｒ（Δ１２）を模式的に示した図

【図４】ｃｂｈ２のプローブおよびｂｇｌ１ ｃＤＮＡ
の７００ｂｐ断片を用いたソホロースによる誘発に続い
てＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの転換菌株か
ら単離した全ＲＮＡのノーザンブロットを示す図

【図５Ａ】β−グルコシダーゼ遺伝子を含有しないよう
に遺伝子的に修飾したＴ．ｒｅｅｓｅｉの菌株（Δ１２
およびΔ３６）と比較した野生型Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ（Ｒ
Ｌ−Ｐ３７）中のβ−グルコシダーゼ遺伝子の存在を説
明するＴ．ｒｅｅｓｅｉＤＮＡのサザーンブロットのオ
ートラジオグラフ

【図５Ｂ】β−グルコシダーゼ遺伝子を含有しないよう
に遺伝子的に修飾したＴ．ｒｅｅｓｅｉの菌株（Δ１２
およびΔ３６）と比較した野生型Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ（Ｒ
Ｌ−Ｐ３７）中のβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を説
明するＴ．ｒｅｅｓｅｉＲＮＡのノーザンブロットのオ
ートラジオグラフ

【図５Ｃ】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＰ
３７（野生型）、Δ１２、およびΔ３６菌株により発現
されたタンパク質の分析を示し、Δ１２およびΔ３６菌
株Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉにより発現さ
れたタンパク質中にはβ−グルコシダーゼがないことを
説明する

【図６】７００ｂｐ β−Ｇｌｕプローブでブロットし
プローブした、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ過剰産生菌株（レーン
９）およびｐＳＡＳβ−Ｇｌｕの転換体（レーン１−
８）からのＨｉｎｄ ＩＩＩ切断ゲノムＤＮＡのオート
ラジオグラフ

【図７】本発明により産生された豊富組換えβ−グルコ
シダーゼ組成物からの80:1の基質：酵素の供与量を用い
たアビセル加水分解を説明する曲線

【図８】本発明により産生された豊富組換えβ−グルコ
シダーゼ組成物からの300:1 の基質：酵素の供与量を用
いたＰＳＣ加水分解を説明する曲線

【図９】本発明により産生された豊富組換えβ−グルコ
シダーゼ組成物を用いたセルロース布誘導繊維の加水分
解速度を説明する曲線

【図１０Ａ】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの
ｂｇｌ１遺伝子を含有するＤＮＡ断片でブロットしプロ
ーブした、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＥｃｏ ＲＩで切断した
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｎｅｕｒ
ｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、ゲノムＤＮＡのオートラ
ジオグラフ

【図１０Ｂ】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの
ｂｇｌ１遺伝子を含有するＤＮＡ断片でブロットしプロ
ーブした、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＥｃｏ ＲＩで切断した
Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａゲノムＤＮＡのオート
ラジオグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｃ１２Ｒ 1:885） (72)発明者 クリストファー シー バーネット アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サン フランシスコ バ ンデン アヴェニュー 726 (72)発明者 シャロン シューメイカー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94533 フェアフィールド バーバンク ドライヴ 3173

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 糸状菌類中で細胞外β−グルコシダーゼ
   を発現しないがセルラーゼを発現する方法であって、組
   換え宿主微生物中でβ−グルコシダーゼをコードしない
   がセルラーゼをコードする菌類ＤＮＡ配列を発現するこ
   とからなり、前記組換え宿主微生物が、前記ＤＮＡ配列
   を含有する発現ベクターで転換した糸状菌類であること
   を特徴とする方法。
2. 【請求項２】 他のセルラーゼを発現することができる
   が、β−グルコシダーゼを発現しない転換体を単離する
   工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 請求項２記載の方法により産生した、β
   −グルコシダーゼを発現しないがセルラーゼを発現する
   転換体。
4. 【請求項４】 組換え手段によりβ−グルコシダーゼ以
   外の全てのセルラーゼを含む糸状菌類から誘導された菌
   類セルラーゼ組成物。
5. 【請求項５】 洗浄に効果的な量の界面活性剤および少
   なくとも ０．０００１重量パーセントの請求項４記載
   の菌類セルラーゼ組成物からなる洗浄剤組成物。