JP2010521134A - セルラーゼを含まない酵素組成物及びこれを生成するための宿主細胞 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
図1Aは不活性化されたbglC遺伝子を含むバチルス宿主細胞を構築するために使用される戦略示す。
他に断らない限り、本明細書で用いられる技術及び科学上の用語は、本発明が関係する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を持つ。例えば、Singleton及びSainsburyの「微生物学及び分子生物学辞典」(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)第2版、John Wiley and Sons, NY (1994); 及びHale及びMarhamの 「Harper Collins 生物学辞典」(The Harper Collins Dictionary of Biology), Harper Perennial, NY (1991)は当業者に、本明細書で使用される多くの用語についての一般的辞書を提供する。本明細書に記載の方法及び材料と同様の又は同等の方法及び材料は本発明の実施のために使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。したがって、以下に定義される用語は明細書を全体として参照することによってより的確に規定される。また、本明細書で用いる単数形冠詞(a an)及び定冠詞(the)は、文意より明らかに他の意味に解される場合を除き、その複数の場合を含む。したがって、例えば、単数形の「宿主細胞」(a host cell)は「宿主細胞」の複数形を含む。同様に、単数形「遺伝子」(a gene)はその様な候補因子の複数形を含み、定冠詞を付した細胞(the cell)を言う場合、一以上の細胞及び当業者に知られている同等物についても言及するものとする。これらはその他の事象について言う場合も同様に適用されるものとする。
上で示した様に、本発明は低減した(例えば、検出されない)レベルのセルラーゼを生成するバチルス種宿主細胞を提供する。一般的に、本発明のバチルス種宿主細胞は通常同等の野生型バチルス種宿主細胞のセルラーゼの約50%未満(例えば、約40%未満、約%30未満、約20%未満、又は約10%未満)を生成する。ある実施の態様においては、本発明の細胞は同等のバチルス種宿主細胞のセルラーゼの約5%未満を生成する。ある特に好ましい実施の態様においては、セルラーゼは検出されない(すなわち、バチルス種宿主細胞はセルラーゼを含まないバチルス種宿主細胞である)。セルラーゼ活性は、例えば、セルラーゼ含有LP寒天プレートをコンゴ赤(例えば、Wolf 他、「微生物学」(Microbiol.), 141:281-290 [1995];及び Carder, Anal. 「バイオ化学」(Biochem.), 153:75-9 [1986]を参照)で染色する、及び/又は以下に更に詳細に記載する様に粘度アッセイによるなどの好適な任意の方法により評価することを意図している。
バチルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス レンツス (Bacillus lentus)、バチルス スブチリス (Bacillus subtilis)、バチルス アミロリケファシエンス(Bacillus amylloliquefaciens)、バチルス ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス プミルス (Bacillus pumilus)、バチルス ツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス クラウシ(Bacillus clausii)、又はバチルス メガテリウム(Bacillus megaterium)。
スブチリシン(例えば、細胞外アルカリ性 セリン プロテアーゼ)は特に関心の対象となる。任意の好適なスブチリシンは本発明で用いることができる(例えば、Siezen, Protein Sci.、6:501 -523 [1997]; Bryan,Biochim. Biophys、Acta, 1543:203-222 [2000]; Maurer, Curr. Op, Biotechnol., 2004 15:330-334 [2004];及びGupta, Appl. Microbiol. Biotechnol., 59:15-32 [2002]を参照)。ある実施の態様においては、関心の対象であるスブチリシンはIUMBM酵素命名法によるEC 3.4.4.16として表される活性を持つ。
ある実施の態様においては、宿主細胞がタンパク質組成物及び洗濯洗剤を生成するために使用され、ある好ましい実施の態様においては洗剤は少なくとも一つのセルロース系ポリマーを含む。
以下の実施例は本発明が如何に発明されまた本発明を如何に使用するかの完全な開示及び記述を提供するが、これは発明者が発明と考えているものの範囲を限定することを意図するものでもなく、また以下の実験は実施された実験の全て又は唯一のものであることを示すことを意図しているものでもない。用いられる数字(例えば、量、温度など)に関して出来るだけ正確なものにする様に務めているがある実験上の誤り及び誤差は避けることはできないことは了解すべきである。断らない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれに近いものである。
bglC遺伝子の欠失のための全体の戦略を図1A−Bの略図に表わす。簡潔に言えば、bglC遺伝子の側面に位置する上流及び下流DNAはPCRにより増幅されそしてベクター中で結紮された。挿入は制限エンドグルカナーゼによる消化により開かれ、そしてloxP部位が側面に位置するスペクチノマイシンカセットが結紮された。結果のプラスミドは制限エンドグルカナーゼによる消化により線状にされそしてバチルスに形質転換された。導入された抗菌性マーカー(スペクチノマイシン)による選択により、関心の対象となる遺伝子の置換は二重クロスオーバーにより達成された。bglCの場合、コード領域は、側面に位置するloxP部位を認識するCreリコンビナーゼを用いてループを作る(loop out)スペクチノマイシン耐性遺伝子により置換された。
粘度アッセイ
細胞はスブチリシン生成に適した50 mLの成長培地を含む250 mlバッフルフラスコで成長させた(Christianson他、Anal. Biochem., 223:119-129 [1994]; 及びHsia他、Anal. Biochem., 242:221-227 [1996]を参照)。媒体は8時間培養した5mL培養物の50μLを植菌され、40時間37℃、250 RPMで振動させ成長させた。宿主 A (-bglC)、宿主 B (-bglC), 宿主 C (-bglS) 及び宿主 D (-bglS)の培養物を48時間成長させた。
プロテアーゼを生成するbglC::スペクチノマイシン株の構築
以下の株がこの実験で使用された:スブチリシン プロテアーゼを生成するバチルス スブチリス株及び挿入によりbgICが不活性化された同じ株である。
Claims (20)
- 不活性化されたbglC遺伝子を含むゲノムを含む組み換えバチルス(Bacillus)種宿主細胞であり、前記細胞は分泌された洗剤添加タンパク質の生成のための組み換え核酸を更に含む、前記宿主細胞。
- 前記不活性化されたbglC遺伝子が欠失、挿入、置換又は再配置を含む請求項1の組み換えバチルス種宿主細胞。
- 前記バチルス種細胞がバチルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス スブチリス (Bacillus subtilis)、バチルス クラウシ (Bacillus clausii)、バチルス アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)又はバチルス ハロジュランス(Bacillus halodurans)細胞である請求項1の組み換えバチルス種宿主細胞。
- 前記分泌された洗剤添加タンパク質が、プロテアーゼ、アミラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、アシル トランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ及びリパーゼから選択される酵素である請求項1の組み換えバチルス種宿主細胞。
- 前記酵素がプロテアーゼである請求項4の組み換えバチルス種宿主細胞。
- 前記プロテアーゼはスブチリシンである請求項5の組み換えバチルス種宿主細胞。
- 前記bglC遺伝子が配列番号2と配列が少なくとも80%同一であるポリペプチドをコードする請求項1の組み換えバチルス種宿主細胞。
- 培地及び請求項1の組み換えバチルス種宿主細胞を含む細胞の培養物。
- 前記分泌された洗剤添加タンパク質の生成のために適した条件下で請求項8の細胞の培養物を維持することを含む方法
- 更に前記培地から前記分泌された洗剤添加タンパク質を回収することを含む請求項9の方法。
- 更に前記分泌された洗剤添加タンパク質を洗濯洗剤と組み合わせることを含む請求項10の方法。
- 前記分泌された洗剤添加タンパク質はスブチリシン プロテアーゼである請求項9の方法。
- 請求項9の方法により生成されたセルラーゼを含まないタンパク質組成物。
- 前記組成物がバチルス種により生成された分泌された洗剤添加タンパク質を含み、及び前記組成物は検出されうるセルラーゼ活性を持たない請求項13のセルラーゼを含まないタンパク質組成物。
- 請求項9の方法により生成された分泌された洗剤添加タンパク質を含む、セルラーゼを含まない洗濯洗剤。
- 前記洗剤がセルロース系ポリマーを含む請求項15のセルラーゼを含まない洗濯洗剤。
- 細胞を生成する方法であって、前記方法は
a)組み換え核酸が前記細胞のbglC遺伝子と再結合するように第一の組み換え核酸をバチルス種に導入し、及び
b) 第二の組み換え核酸を、分泌された洗剤添加タンパク質の発現をさせる前記細胞に導入することを含む、
前記細胞を生成する方法。 - 前記核酸が前記bglC遺伝子に挿入される請求項17の方法。
- 前記核酸が前記bglC遺伝子の少なくとも一部を欠失させる請求項17の方法。
- 前記分泌された洗剤添加タンパク質がスブチリシンである請求項17の方法。
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