CN102016028B - 无纤维素酶的酶组合物及用于生产其的宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于产生洗涤剂添加剂蛋白质的重组细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为芽孢杆菌属细胞。在另一些实施方案中，所述细胞包含含有失活的bglC基因的基因组以及用于产生至少一种分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。在一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是蛋白酶。本发明还提供使用所述细菌细胞产生至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的方法，以及含有至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的无纤维素酶的组合物。

Description

无纤维素酶的酶组合物及用于生产其的宿主细胞

技术领域

本发明提供用于生产洗涤剂添加剂蛋白质的重组细菌细胞。在一些实施方案中，该细胞为芽孢杆菌(Bacillus)属细胞。在另一些实施方案中，所述细胞包含含有失活的bglC基因的基因组、以及用于产生至少一种分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。在一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质为蛋白酶。本发明还提供使用所述细菌细胞来产生至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的方法、以及含有至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的无纤维素酶组合物。

背景技术

外源多肽的表达和重组产生是广泛使用的技术。人们熟知，可以用编码目的外源多肽的核酸转化细胞，用于表达和产生大量的所需多肽。在一些应用中，该方法用于产生比来源生物中天然产生的量更多的多肽。事实上，外源核酸序列的表达以及内源序列的过表达已经在现代生物技术中广泛使用。

在一些情况下，不期望的产物随目的蛋白质一起产生。例如，在产生重组酶(例如蛋白酶、淀粉酶等)时，可能还产生其他不期望的酶(如纤维素酶)。

尽管分子生物学和蛋白质工程已取得进展，但仍需要可以用于减少(如果不是消除的话)这些不期望活性的方法和组合物。

发明概述

本发明提供用于产生洗涤剂添加剂蛋白质的重组细菌细胞。在一些实施方案中，该细胞为芽孢杆菌属细胞。在另一些实施方案中，所述细胞包含含有失活的bglC基因的基因组，以及用于产生至少一种分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。在一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质为蛋白酶。本发明还提供使用所述细菌细胞来产生至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的方法以及含有至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的无纤维素酶组合物。

本发明提供重组的芽孢杆菌属物种宿主细胞，其包含含有失活的bglC基因的基因组，其中该细胞还包含用于产生分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。在一些优选的实施方案中，所述失活的bglC基因含有缺失、插入、替换或重排。在另一些优选的实施方案中，所述芽孢杆菌属物种细胞为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)或耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)的细胞。在另一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是选自蛋白酶、淀粉酶、果胶酸裂合酶和脂肪酶的酶。在一些特别优选的实施方案中，该酶为蛋白酶。在一些更特别优选的实施方案中，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在另一些优选的实施方案中，所述bglC基因编码与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的多肽。

本发明还提供包含培养基和重组芽孢杆菌属物种宿主细胞的细胞培养物，所述宿主细胞包含含有失活的bglC基因的基因组，其中所述细胞还包含用于产生分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。在一些优选的实施方案中，所述失活的bglC基因含有缺失、插入、替换或重排。在另一些优选的实施方案中，所述芽孢杆菌属物种细胞为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)或耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)的细胞。在另一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是选自蛋白酶、淀粉酶、果胶酸裂合酶、酰基转移酶、芳基酯酶和脂肪酶的酶。在一些特别优选的实施方案中，该酶为蛋白酶。在一些更特别优选的实施方案中，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在另一些优选的实施方案中，所述bglC基因编码与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的多肽。

本发明还提供包括在适于产生所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的条件下维持细胞培养物的方法。在一些实施方案中，该方法还包括从培养基中回收所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质。在另一些实施方案中，该方法还包括将所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质与洗衣洗涤剂(laundry detergent)组合。在另一些优选的实施方案中，所述洗涤剂添加剂蛋白质是枯草杆菌蛋白酶。

本发明还提供通过本文所述方法产生的无纤维素酶的蛋白质或酶组合物。在一些优选的实施方案中，所述组合物包含由芽孢杆菌属物种产生的分泌型洗涤剂添加剂蛋白质，并且其特征在于该组合物不具有可检测的纤维素酶活性。

本发明还提供包含通过本文所述方法产生的分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的无纤维素酶洗衣洗涤剂。在一些实施方案中，所述无纤维素酶的洗衣洗涤剂包含纤维素性聚合物(cellulosic polymer)。

本发明还提供用于生产宿主细胞的方法，其包括将第一重组核酸引入芽孢杆菌属物种细胞中，以使该重组核酸与该细胞的bglC基因重组；以及向该细胞中引入第二重组核酸，以提供分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的表达。在一些优选的实施方案中，所述核酸插入bglC基因中。在另一些优选实施方案中，所述核酸造成bglC基因的至少一个部分的缺失。在另一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质为枯草杆菌蛋白酶。

附图简述

在结合附图阅读后将能够充分理解以下详细描述的某些方面。需要强调的是，根据一般实践，附图的多个特征未按比例绘制。相反，多个特征的尺寸为清楚起见而主观地进行了放大或缩小。附图中包括以下各图：

图1A-B提供了用于构建含有失活的bglC基因的芽孢杆菌宿主细胞的策略。

图2显示在两种具有失活的blgC基因的枯草芽孢杆菌菌株(即“宿主A”和“宿主B”)及两种具有失活的bglS基因的枯草芽孢杆菌菌株(即“宿主C”和“宿主D”)的培养物上清液上进行的粘度测定试验的结果。流体粘度以厘泊(即cP)来衡量。

图3显示在两种产生重组枯草杆菌蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株的培养物上清液上进行的粘度测定试验的结果。菌株MDT-05-28具有失活的bglC基因，而菌株MTD-04-250含有野生型bglC基因。

发明详述

本发明提供用于产生洗涤剂添加剂蛋白质的重组细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为芽孢杆菌属细胞。在另一些实施方案中，所述细胞含有包含失活的bglC基因的基因组以及用于产生至少一种分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。在一些优选的实施方案中，所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是蛋白酶。本发明还提供使用该细菌细胞来产生至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的方法以及含有至少一种洗涤剂添加剂蛋白质的无纤维素酶组合物。

除非另外指明，否则本发明的实施涉及分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质及DNA测序及重组DNA领域中通常使用的常规技术，这些技术均属于本领域的技术范畴。这些技术为本领域技术人员已知，并描述于大量教科书及参考文献中(参阅如Sambrook等，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，第二版(Cold SpringHarbor)，[1989])；以及Ausubel等，″Current Protocols in MolecularBiology″[1987])。本文的上文和下文中提到的所有专利、专利申请、文章和出版物均明确地以参考方式并入本文。

此外，本文中提供的标题不构成对本发明的各个方面或实施方式的限制，所述方面和实施方式可以通过参考说明书整体而得。因此，紧接下面定义的术语将基于整个说明书作更全面地定义。然而，为了便于理解本发明，下文定义了多个术语。

定义

除非本文中另外指明，否则本文使用的所有科技术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology，第二版，John Wileyand Sons，NY(1994)以及Hale和Marham，TheHarper Collins Dictionaryof Biology，Harper Perennial，NY(1991)为本领域技术人员提供了许多本文所用术语的一般词典。尽管与本文所述方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于实施本发明，但本文描述了优选的方法和材料。因此，下文定义的术语将参考说明书整体得以更完整的描述。同时，本文使用的名词均包括复数含义，除非其上下文明确表示不是这样。因此，例如，提到“宿主细胞”时包括多个这样的宿主细胞。同样，提到“基因”时包括多个这样的候选试剂，提到“细胞”时包括对一个或多个细胞及本领域技术人员已知的其等同方案的提及，依此类推。

数值范围包含定义该范围的数值。事实上，本说明书全文中给出的每个最高数值界限均旨在包括每个较低的数值界限，如同本文中明确写出了这些较低数值界限那样。本说明书全文中给出的每个最低数值界限将包括每个较高的数值界限，如同本文中明确写出了这些较高数值界限那样。本说明书全文中给出的每个数值范围均包括落入这些较宽数值范围内的每个较窄的数值范围，如同这些较窄的数值范围均在本文中明确写出那样。当给出数值范围时，应该理解，也具体地公开了该范围的上限与下限之间间隔下限单位之十分之一的每个中间值，除非其上下文明确指明不是这样。这些较小范围的上限及下限可独立地包括或不包括在该范围中，并且这些包括一个、两个端点或不包括端点的较小范围也包含在本发明中，并排除所述范围中任何具体排除的界限。当所述范围包括一个或两个端点时，排除一个或两个包含在内的端点的范围也包括在本发明中。

引用的所有文献均通过参考并入本文的相关部分中，对任何文献的引用都不应理解为承认它是本发明的现有技术。本文中的任何内容都不应理解为承认本发明没有资格作为在先发明而先于这些出版物。本文提及的所有专利和出版物(包括这些专利和出版物中公开的所有序列)均通过引用方式明确并入本文中。

尽管与本文所述相似或等同的任何适宜的方法和材料均可用于实施或测试本发明，但现将描述示例性和优选的方法和材料。

除非另外指明，否则核酸以5’至3’的方向从左向右书写，而氨基酸序列则以氨基至羧基的方向从左向右书写。本文中提供的标题不构成对本发明的各个方面或实施方式的限制，所述方面和实施方式可以通过参考说明书整体而得。应该理解，本发明不受限于所描述的具体方法、方案和试剂，它们可根据本领域技术人员使用它们的情况而改变。因此，下文定义的术语应参考说明书整体作更完整地定义。

本文使用的术语“重组”指在宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或多肽。重组分子可含有通过以非天然方式连接在一起的两个或更多个天然序列。重组细胞含有重组多核苷酸或多肽。

本文使用的术语“异源”指天然彼此不相关的元件。例如，如果宿主细胞产生异源蛋白，则该蛋白不是该宿主细胞天然产生的蛋白质。类似地，与异源编码序列有效连接的启动子是指与在野生型宿主细胞中通常不与其有效连接的编码序列有效连接的启动子。

当用于多核苷酸或蛋白质时，本文使用的术语“同源”指宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。

本文使用的“信号序列”是蛋白质N端部分存在的氨基酸序列，其有利于将该蛋白质的成熟形式分泌到细胞之外。信号序列的定义是功能性定义。成熟形式的胞外蛋白质缺少信号序列，该信号序列在分泌过程中被切除。

本文使用的“编码序列”是编码多肽的DNA区段。

本文使用的“失活的基因”是基因组中的基因座，其在失活前能够产生蛋白质(即能够转录成可翻译产生全长多肽的RNA)。对于编码酶的基因而言，当其不能转录及翻译成全长的催化活性蛋白质时，是失活的。可通过改变基因转录所需的序列而失活基因，例如改变RNA加工(如polyA尾添加)所需的序列，或改变翻译所需的序列。失活的基因的实例包括但不仅限于缺失的基因、含有缺失区域的基因、含有重排区域的基因、含有失活点突变或移码的基因，以及含有插入的基因。此外，还可以使用反义或任何其他可以消除基因表达的方法来失活基因。

本文使用的术语“核酸”包括单链或双链的DNA、RNA，并包括经化学修饰的DNA或RNA。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。

本文使用的术语“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种宿主细胞的多核苷酸。在一些优选的实施方案中，载体在不同宿主细胞中自主复制。该术语旨在包括但不仅限于克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

本文使用的“表达载体”指包含与适宜的控制序列有效连接的蛋白质编码区的DNA构建体，所述控制序列能在合适的宿主细胞中实现该蛋白的表达。在一些实施方案中，这样的控制序列包括实现转录的启动子、控制转录产生mRNA的任选的操纵基因序列、编码mRNA上的适宜核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

本文使用的术语“启动子”指起始下游核酸转录的调节序列。

本文使用的术语“有效连接”指以允许元件在功能上相关的方式排列元件。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与该编码序列有效连接。

本文使用的术语“选择标记”指这样的蛋白质，其能在宿主中表达从而便于选择含有引入的核酸或载体的宿主。选择标记的实例包括但不仅限于抗微生物剂(如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(如营养优势)的基因。

本文使用的术语“来自”涵盖术语“源于”、“得自”或者“可得自”以及“分离自”。

本文使用的“非病原性”生物是对人和/或其他动物无致病性的生物。本文使用的术语“回收”、“分离”和“分开”指将蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从至少一种与其天然相关的组分中移出。

当用于细胞时，本文使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”指该细胞具有非天然(例如异源的)核酸序列，所述非天然核酸序列整合进其基因组中或以附加型质粒的形式存在，并历经多代而维持。

本文使用的术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，本文使用的术语“引入”指“转染”、“转化”或“转导”，并包括将核酸序列整合进真核或原核细胞中，其中核酸可整合进细胞基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转化成自主复制子或者瞬时表达(如转染的mRNA)。

本文使用的术语“杂交”指核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链结合的过程。如果一个核酸与参照核酸序列在中等至高严格杂交及洗涤条件下彼此特异地杂交，则认为该核酸能与参照核酸序列“选择性地杂交”。中等和高严格杂交条件为本领域技术人员已知(参阅如Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology.第三版，Wiley&Sons，Hoboken，NJ[1995]；以及Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor，NY[2001])。高严格条件的一个实例包括在约42℃在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt氏液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，其后在室温以2×SSC和0.5％SDS洗涤两次，其后42℃以0.1×SSC和0.5％SDS再洗涤两次。

本文使用的术语“纤维素性聚合物”指包含至少一个1，4-β-D糖苷键的纤维素、半纤维素或者改性的纤维素或半纤维素聚合物。

本文使用的术语“纤维素”指包含通过β-1，4键连接的葡萄糖残基的多糖聚合物。

本文使用的术语“半纤维素”指包含至少一个通过β-(1-4)键连接的非葡萄糖糖残基(如木糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、糖醛酸或半乳糖醛酸或木聚糖)的多糖聚合物。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖和半乳甘露聚糖。

本文使用的“纤维素酶”指水解纤维素、地衣及谷物β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷键的酶。本文所述的纤维素酶具有据IUMBM酶命名法描述为EC 3.2.1.4的活性。本文所述纤维素酶的系统名为1，4-(1，3：1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。

本文使用的术语“芽孢杆菌属物种”(或芽孢杆菌)(例如芽孢杆菌宿主细胞)指任何芽孢杆菌属物种，包括但不仅限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，以及它们的亚种。

本文使用的“无纤维素酶的芽孢杆菌”指经遗传改造的芽孢杆菌宿主细胞，其不分泌可检测量的纤维素酶。如下文将详细讨论的，在某些实施方案中，无纤维素酶的芽孢杆菌菌株可含有失活的bglC基因。

本文使用的“等同的未改变的芽孢杆菌菌株”指这样的宿主菌株，其除了bglC基因未改变(即为野生型)外在其他方面与无纤维素酶的芽孢杆菌菌株相同。

本文使用的“培养”指在适宜条件下在液体或固体培养基中培养微生物细胞群。在一些实施方案中，培养指发酵性重组生产目的外源蛋白或其他期望的终产物(一般在容器或反应器中生产)。

本文使用的“洗涤剂添加剂蛋白质”指待加入洗衣洗涤剂中的蛋白质。洗涤剂添加剂蛋白质可以是酶(如蛋白酶、淀粉酶、果胶酸裂合酶、脂肪酶、酰基转移酶、芳基酯酶或不具有酶活性的蛋白质)。在一些特别优选的实施方案中，β-葡聚糖水解酶(即具有据IUMBM酶命名法描述为EC3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.72、EC 3.2.1.136的活性的酶)被特别排除在术语“洗涤剂添加剂蛋白质”之外。在另一些特别优选的实施方案中，木聚糖酶(即具有据IUMBM酶命名法描述为EC 3.2.1.75的活性的酶)也被特别排除在术语“洗涤剂添加剂蛋白质”之外。

说明书全文中还可出现其他术语定义。

在详细描述示例性实施方案之前，应该理解，本发明不受限于描述的具体实施方案，因为它们当然是可以变化的。还应该理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制。

宿主细胞

如上述，本发明提供了产生降低(如不可检测的)水平的纤维素酶的芽孢杆菌宿主细胞。一般而言，本发明的芽孢杆菌宿主细胞一般产生少于等同的野生型芽孢杆菌宿主细胞的纤维素酶的约50％(例如少于约40％、少于约30％、少于约20％或少于约10％)的纤维素酶。在一些实施方案中，本发明细胞产生的纤维素酶少于等同的芽孢杆菌宿主细胞的纤维素酶的约5％。在一些特别优选的实施方案中，纤维素酶是检测不到的(即，该芽孢杆菌宿主细胞是无纤维素酶的芽孢杆菌宿主细胞)。纤维素酶活性旨在通过任何适宜的已知方法来测定，例如通过用刚果红染色含有纤维素的LP琼脂平板(参阅如Wolf等，Microbiol.，141：281-290[1995]；以及Carder，Anal.Biochem.，153：75-9[1986])和/或使用粘度测定试验(如下文更为详细的描述)来测定。

在一些实施方案中，通过减少细胞的bglC基因产物表达来产生纤维素酶生产量减少的芽孢杆菌宿主细胞。在这样的实施方案中，可以使用任何适宜方法减少芽孢杆菌宿主细胞中的bglC表达，上述方法包括但不仅限于例如使用反义分子或核酶的方法。在一些优选的实施方案中，通过失活细胞中的bglC基因来减少bglC的表达。

几种芽孢杆菌bglC基因的DNA序列以及这些基因所编码的蛋白质已经测定，并保存于NCBI的Genbank数据库中。以下提供该序列：

ATGAAACGGTCAATCTCTATTTTTATTACGTGTTTATTGATTACGTTATTGACAATGGGCGGCATGATAGCTTCGCCGGCATCAGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCCAAGAATGGCCAGCTTAATAAAAGGTACACAGCTCGTTAACCGAGACGGTAAAGCGGTACAGCTGAAGGGGATCAGTTCACACGGATTGCAATGGTATGGAGAATATGTCAATAAAGACAGCTTAAAATGGCTGAGAGATGATGGGTATCACCGTTTTCCGTGCAGCGATGTATACGGCAGATGGCGGTTATATTGACAACCCGTCCGTGAAAAATAAAGTAAAAGAAGCGGTTGAAGCGGCAAAAGAGCTTGGGATATATGTCATCATGATGGCATATCTTAAATGACGGTAATCCAAACCAAAATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTCTTCAAGGAAATGTCAAGCCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAACGGGATGTGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCATATGCGGAAGAAGTGATTTCAGTTATCCGCAAAAATGATCCAGACAACATCATCATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAGGATGTGAATGATCTGCGATGACCAGCTAAAAGATGCAAACGTTATGTACGCACTTCATTTTTATGCCGGCACGCACGGCCAATTTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGCAAAGGAGCACCTATTTTTTGTGACGAGTGGGAACAAGCGACGCGTCTGGCAATGGCGGTGTATTCCTTGATCAATCGAGGGAATGGCTGAAATATCTCGACAGCAAGACCATTAGCTGGGTGAACTGGAATCTTTCTGATAAGCAGGAATATCCTCGCTTTAAAGCCGGGGGCATCTAAAACAGGCGGCTGGCGGTTGTCAGATTTATCTGCTTCAGGAACATTCGTTAGAGAAAACATTCTCGGCACCAAAGATTCGACGAAGGACATTCCTGAACGCCATCAAAGATAAACCCACACAGGAAAATGGTATTTCTGTACAGTACAGAGCAGGGGATGGGAGTATGAACAGCAACCAAATCCGTCCGCAGCTTCAAATAAAAAATAACGGCAATACCACGGTGATTTAAAGATGTCACTGCCCGTTACTGGTATAAAGCGAAAAACAAAGGCCAAAACTTTGACTGTGACTACGCGCAGATTGGATGCGGCAATGTGACACACAAGTTTGTGACGTTGCATAAACCAAGCAAGGTGCGATACCTATCTGGAACTTGGATTTAAAAACGGAACGTTGGCACCGGGAGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTCCGTCTTCACAATGATGACTGGAGCAATTATGCACAAAGCGGCGATATTCCTTTTTAAATCAAATACGTTTAAAACAACGAAAAAAATCACATTATATGATCAAGGAAAACTGATTTGGGGAACAGAACCAAATTAG(SEQ ID NO：1)

以下为SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。

MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLVNRDGKAVQLKGISSHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADGGYIDNPSVKNKVKEAVEAAKELGIYVIWHILNDGNPNQNKEKAKEFFKEMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAADDQLKDANVMYALHFYAGTHGQFLRDKANYALSKGAPIFVEGTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKTISWVNWNLSDKQESSSALKPGASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQENGISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQIKNNGNTTDLDVTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIGCGNVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTGNIQLRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYDQGKLIWGTEPN(SEQ ID NO：2)

此外，已经鉴定了纤维素酶的几个保守性结构域以及大量保守性氨基酸，这使得人们可以通过生物信息学方法鉴定其他芽孢杆菌bglC基因及蛋白。

在一些实施方案中，芽孢杆菌bglC基因包含与上文提供的保存于NCBI Genbank数据库中的bglC序列(SEQ ID NO：1)至少70％(例如至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％)的序列同一性。在再一些实施方案中，芽孢杆菌bglC基因在严格条件下与保存于NCBIGenbank数据库的bglC序列或SEQ ID NO：1杂交。在另一些实施方案中，芽孢杆菌bglC基因编码与保存于NCBI Genbank数据库的bglC序列或SEQ ID NO：2具有至少70％的序列同一性(例如至少80％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％或至少98％的序列同一性)的多肽。保存于NCBI Genbank数据库的示例性bglC蛋白及核苷酸序列包括GID：3100136(地衣芽孢杆菌)、GID：52348343(地衣芽孢杆菌)、GID：42491106(解淀粉芽孢杆菌)和GID：50812243(枯草芽孢杆菌)。上述Genbank登录号(包括其中的核酸及蛋白质序列以及这些序列的注释)均通过参考整体并入本文中。

在一些优选实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞为任何以下物种：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(B.pumilus)，苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌宿主细胞包括但不仅限于：美国专利5,264,366和4,760,025(RE 34,606)中所述的那些，以及1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DEI00(ATCC39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(参阅如Hoch等，Genetics73：215-228[1973]；美国专利No.4,450,235；美国专利No.4,302,544以及EP 0134048(还参阅Palva等，Gene 19：81-87 [1982]；以及Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，165：796-804[1986]；和Wang等，Gene 69：39-47[1988])。

在一些实施方案中，宿主细胞包括含有表达盒(即启动子、编码洗涤剂添加剂蛋白质的多核苷酸以及转录终止子)的重组核酸，其中所述表达盒足以使芽孢杆菌宿主细胞产生洗涤剂添加剂蛋白质。在一些实施方案中，所述重组核酸被整合进宿主细胞基因组中，而在另一些实施方案中，所述重组核酸存在于独立于基因组之外的自主复制的载体中。在一些实施方案中，编码洗涤剂添加剂蛋白质的多核苷酸为在芽孢杆菌宿主细胞中表达该蛋白质而进行了密码子优化。

在一些特别优选的实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞被改造成使蛋白质表达最大化。因此，在一些实施方案中，宿主细胞在至少一个以下基因中含有失活改变：degU、degS、degR和/或degQ(参阅Msadek等，J.Bacterid.，172：824-834[1990]；和Olmos等，Mol.Gen.Genet.，253：562-567[1997])。在一些特别优选的实施方案中，宿主细胞为带有degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。在另一些实施方案中，芽孢杆菌宿主细胞在以下基因中含有突变和/或缺失：scoC4(参阅Caldwell等，J.Bacteriol，.183：7329-7340[2001])；spoIIE(参阅Arigoni等，Mol.Microbiol.，31：1407-1415[1999])；oppA或opp操纵子中的其他基因(参阅Perego等，Mol.Microbiol.，5：173-185[1991])。事实上，可以想到，opp操纵子中任何与oppA基因突变导致相同表型的突变都将可用于本发明的改变的芽孢杆菌菌株的一些实施方案中。在一些实施方案中，这些突变单独出现，而在另一些实施方案中，存在突变的组合。在一些实施方案中，本发明的改变的芽孢杆菌可得自已在一个或多个上述基因中包含了突变的芽孢杆菌宿主菌株。在另一些实施方案中，本发明的改变的芽孢杆菌可以进一步被改造以包含一个或多个上述基因的突变。

使用任何便利的方法构建的芽孢杆菌宿主细胞均可用于本发明，包括通过在细胞的bglC基因中进行插入、缺失、替换、移码、点突变和/或重排来改变该bglC基因序列而构建的细胞，可用于本发明。在一些实施方案中，待改变的基因部分在编码区中，或者在表达编码区所需的调节元件中。在一些实施方案中，基因的该调节或控制序列是启动子序列或其功能性部分(即基因表达所必需的部分)。这样的基因失活方法为本领域所熟知(参阅如Wolf等Microbiol.，141：281-290 [1995])。

在一些实施方案中，如下构建宿主细胞：将重组核酸引入芽孢杆菌细胞中，以使该重组核酸与细胞基因组中的bglC基因重组；将第二种重组核酸引入细胞中，以提供分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的表达。在一些实施方案中，将核酸插入bglC基因中，而在另一些实施方案中，该核酸造成bglC基因的至少一部分缺失。

用于将多核苷酸序列引入芽孢杆菌细胞的合适方法为本领域技术人员所熟知(参阅如Ferrari等，″Genetics，″in Harwood等(ed.)，Bacillus，Plenum Publishing Corp.[1989]，57-72页；还参阅Saunders等，J。Bacteriol.，157：718-726[1984]；Hoch等，J.Bacteriol.，93：1925-1937[1967]；Mann等，Curr.Mierobiol.，13：131-135[1986]；以及Holubova，FoliaMicrobiol.，30：97[1985]；Chang等，Mol.Gen.Genet，168：11-115；[1979]；Vorobjeva等，FEMS Microbiol.Lett.，7：261-263[1980]；Smith等，Appl.Env.Microbiol.，51：634[1986]；Fisher等，Arch.Microbiol.，139：213-217[1981]；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.，130：203[1984])。事实上，诸如转化等方法，包括原生质体转化和congression、转导和原生质体融合，是本领域已知的，并且适用于本发明。

如上文指出的，除了产生水平降低(例如检测不到)的纤维素酶以外，本发明提供还包含用于产生分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸的芽孢杆菌宿主细胞，其中分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是从细胞中分泌出来并将添加入洗衣洗涤剂中的蛋白质(例如酶)。示例性的洗涤剂添加剂蛋白质包括但不仅限于蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶)、α-淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、裂合酶、酰基转移酶、芳基酯酶和脂肪酶等。在一些实施方案中，洗涤剂添加剂蛋白质可由与该洗涤剂添加剂蛋白质的来源菌株相同的菌株表达。

酶

枯草杆菌蛋白酶(即胞外碱性丝氨酸蛋白酶)是特别有意义的。任何合适的枯草杆菌蛋白酶均可用于本发明(参阅如Siezen，Protein Sci.，6：501-523[1997]；Bryan，Biochim.Biophys.Acta，1543：203-222[2000]；Maurer，Curr.Op，Biotechnol.，2004 15：330-334[2004]；以及Gupta，Appl.Mierobiol.Biotechnol.，59：15-32[2002])。在一些实施方案中，目的枯草杆菌蛋白酶具有据IUMBM酶命名法描述为EC 3.4.4.16的活性。

在一些实施方案中，这样的枯草杆菌蛋白酶具有可见于野生型基因组的氨基酸序列(即该枯草杆菌蛋白酶是天然存在的枯草杆菌蛋白酶)，而在另一些实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶是天然存在的枯草杆菌蛋白酶的变体。在一些优选的实施方案中，所述变体枯草杆菌蛋白酶包含与野生型基因组所编码的枯草杆菌蛋白酶具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列。示例性枯草杆菌蛋白酶包括但不仅限于：(Novozymes)、FNA^TM(Genencor)、(Novozymes)、PURAFECT^TM(Genencor)、KAP^TM(Kao)、EVERLASE^TM(Novozymes)、PURAFECT OxP^TM(Genencor)、FN4^TM(Genencor)、BLAP S^TM(Henkel)、BLAP X^TM(Hen kel)、(Novozymes)、KANNASE^TM(N ovozymes)和PROPERASE^TM(Genencor)。在另一些实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶包括但不仅限于枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147或枯草杆菌蛋白酶309(参阅如EP414279B；WO89/06279；和Stahl等、J.Bacteriol.、159：811-818[1984])。其他可用于本发明的枯草杆菌蛋白酶和其他蛋白酶包括但不仅限于以下文献中所述的那些：WO 99/20770；WO 99/20726；WO 99/20769；WO89/06279；RE 34,606；美国专利No.4,914,031；美国专利No.4,980,288；美国专利No.5,208,158；美国专利No.5,310,675；美国专利No.5,336,611；美国专利No.5,399,283；美国专利No.5,441,882；美国专利No.5,482,849；美国专利No.5,631,217；美国专利No.5,665,587；美国专利No.5,700,676；美国专利No.5,741,694；美国专利No.5,858,757；美国专利No.5,880,080；美国专利No.6,197,567；以及美国专利No.6,218,165。

洗涤剂和洗涤剂添加剂蛋白质

在一些实施方案中，使用宿主细胞制备蛋白质组合物和洗衣洗涤剂，其中在一些优选的实施方案中，所述洗涤剂含有至少一种纤维素性聚合物。

在一些实施方案中，培养宿主细胞以提供至少一种分泌型洗涤剂添加剂蛋白质进入培养细胞的培养基中。在一些特别优选的实施方案中，使用任何适宜的方法(如沉淀、离心、亲和、过滤或任何其他本领域已知方法)从培养基中回收所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质。例如，可以使用亲和层析(Tilbeurgh等，FEBS Lett.，16：215 [1984])；离子交换层析法(Goyal等，Bio.Technol.，36：37[1991]；Fliess等，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，17：314[1983]；Bhikhabhai等，J.Appl.Biochem.，6：336[1984]；和Ellouz等，Chromatogr.，396：307[1987])，包括使用具高分辨力的材料进行的离子交换层析(参阅如Medve等，J.Chromatogr.A 808：153[1998])；疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz，J.Chromatogr.A865：123 [1999]；两相分配(Brumbauer等，Bioseparation 7：287[1999])；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和凝胶过滤(例如G-75)。

在一些优选的实施方案中，不经从培养基的其他组分中纯化而使用洗涤剂添加剂蛋白质。在一些这样的实施方案中，简单地浓缩所述培养基，接着不经进一步从培养基组分中纯化该蛋白质而进行使用。

与含有未改变(如野生型)bglC基因的等同芽孢杆菌宿主细胞相比，使用本发明宿主细胞产生的蛋白质组合物一般含有减少的纤维素酶。

在一个实施方案中，组合物的纤维素酶含量通过在将该组合物加入纤维素性聚合物溶液(例如含有1％羧甲基纤维素(CMC)的溶液)后测量该溶液的粘度改变来评估。这样的方法是熟知的(参阅如Manning，Biochem.Biophys.Meth.，5：189-202 [1981]；和Sheperd，Biochem.J.，193：67-74[1981])。可用于本发明的一种示例性粘度测定试验在下文的实施例中提供。

在包含本发明蛋白质组合物的一些实施方案中，与使用具有未改变bglC基因的芽孢杆菌细胞产生的等同蛋白质组合物造成的减少相比，本发明组合物能够造成少于80％(例如少于50％、少于30％、少于20％或少于10％)的纤维素性材料溶液粘度减少。在一些实施方案中，本发明蛋白质组合物不使纤维素性材料溶液的粘度产生可检测的降低，在这种情况下该蛋白质组合物被认为是“无纤维素酶”的蛋白质组合物。

无纤维素酶的蛋白质组合物可用于多种情况，包括但不仅限于洗衣洗涤剂，特别是含有纤维素性聚合物的洗涤剂。在一些实施方案中，包含本发明无纤维素酶的蛋白质组合物的洗衣洗涤剂包含约1％至80％(例如5％至50％)(以重量计)的表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，而在另一些实施方案中，它是阳离子型表面活性剂，在另一些实施方案中，它是阴离子型表面活性剂，在另一些实施方案中，它是兼性离子表面活性剂，在另一些实施方案中，它包含这些表面活性剂的任何组合(例如阴离子及非离子型表面活性剂的混合物)。示例性表面活性剂包括但不仅限于烷基苯磺酸盐(ABS)，包括直链烷基苯磺酸盐和直链烷基磺酸钠、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇(例如壬基苯氧基乙氧基化物或壬基酚)、二乙醇胺、三乙醇胺和单乙醇胺。可用于洗衣洗涤剂的表面活性剂的其他描述提供于美国专利No.3,664,961、3,919,678、4,222,905和4,239,659。

包含本发明无纤维素酶的酶的洗衣洗涤剂可以以任何形式(如固体、液体、凝胶等)使用。在一些实施方案中，所述洗衣洗涤剂还包含缓冲剂，例如碳酸钠、碳酸氢钠或洗涤剂助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、酶、酶稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防晦暗剂、抗腐蚀剂、污物助悬剂、污物释放剂、杀菌剂、pH调节剂、非助洗剂碱性源、螯合剂、有机或无机填充剂、溶剂、水溶助长剂、荧光增白剂、染料或香料。

如上文所述，在一些实施方案中，洗衣洗涤剂含有纤维素性聚合物(如纤维素聚合物)或改性的纤维素聚合物。合适的纤维素性聚合物包括但不仅限于阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物，以及纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其任何混合物。在一些实施方案中，改性的纤维素醚聚合物(参阅如美国专利No.6,833,347)或其他纤维素性聚合物(参阅如美国专利5,009,800和4,661,267)可用于本发明。在一些实施方案中，洗衣洗涤剂含有以重量计约0.1％至8％(例如约0.5％至4％或约1％至3％)的纤维素性聚合物。

实验

以下实施例为本领域普通技术人员提供了关于如何实施和使用本发明的完整公开及描述，并且不旨在限制本发明人所认为的其发明的范围，且也不意味着以下实验是所进行的全部或仅有的实验。已经尽力保证所用数字(例如量、温度等)的准确性，但一些实验误差和偏差也应考虑在内。除非另外指明，否则分数为按重量计分数，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。

在以下实验公开内容中，使用了以下缩写：℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H₂O(水)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；OD₂₈₀(280nm的光密度)；OD₄₀₅(405nm的光密度)；OD₆₀₀(600nm的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；LAS(月桂基磺酸钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。

实施例1

构建bglC::壮观霉素菌株

缺失bglC基因的一般策略示于图1A-B中。简言之，通过PCR扩增bglC基因侧翼的上游及下游DNA片段，并在载体中连接在一起。通过限制性内切核酸酶消化打开该插入片段，并将侧翼为loxP位点的壮观霉素盒连接进去。通过限制性内切核酸酶消化将所得质粒线性化，并转化进芽孢杆菌中。通过用引入的抗微生物剂标记(壮观霉素)进行选择，通过双交换事件实现了目的基因的置换。对于bglC的情况，以壮观霉素抗性基因置换编码区，之后使用识别侧翼loxP位点的Cre重组酶，将该壮观霉素抗性基因环出。

利用WO 03/083125所述策略及表1所述引物，使用PCR技术，构建DNA构建体。

限制性位点按如下命名：XbaI为TCTAGA(SEQ ID NO：20)；BamHI为GGATCC(SEQ IDNO：21)；SacI为GAGCTC(SEQ ID NO：22)；Asp718为GGTACC(SEQ ID NO：23)；PstI为CTGCAG(SEQ ID NO：24)，HindIII为AAGCTT(SEQ ID NO：25)。

在该方法中，使用150μL Eppendorf管进行100μL PCR反应，所述管中含有84μL水、10μL PCR缓冲液、1μL每种引物(即，BglC SacI UF和BglC BamH1 UR，或者loxPBamH1F和loxPBamH1R)、2μL dNTP、1μL DNA模板(例如野生型芽孢杆菌染色体或对照质粒)和1μL DNA聚合酶。所使用的DNA聚合酶包括Taq Plus高保真聚合酶和Herculase(Stratagene)。反应使用以下程序在Hybaid PCRExpress热循环仪中进行。首先将样品在94℃加热5分钟，接着冷却至50℃保持。在该点加入DNA聚合酶。25个扩增循环各由95℃1分钟、50℃1分钟和72℃1分钟构成。最终的72℃10分钟确保完全延伸。将样品保持在4℃至分析。该反应获得了侧翼DNA盒(各约1kb)以及5’和3’末端带有BamHI限制性位点的loxP壮观霉素盒。

PCR完成后，将每个反应物各10μL在Invitrogen 1.2％琼脂糖E-凝胶上以60伏电泳30分钟，以检查正确大小条带的存在。本文所述所有凝胶电泳法均使用这些条件。如果存在条带，则根据生产商的说明使用QiagenPCR纯化试剂盒来纯化剩余的反应物，接着用适当的限制性酶对进行切割。消化在37℃进行1小时，20μL反应物由9μL水、2μL10×BSA、2μL适当的NEB限制性缓冲液(根据2000-01 NEB目录和技术资料)、5μL模板和1μL每种限制性酶组成。例如，用SacI和BamHI在NEB(New England BioLabs)限制性缓冲液B中切割bglC上游片段。通过凝胶电泳纯化经消化的片段并根据生产商的说明使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行提取。

根据生产商的说明使用Takara连接试剂盒或者使用T4 DNA连接酶(反应内容：每种插入片段各5μL、1μL经切割的pUC19质粒、3μLT4DNA连接酶缓冲液和1μL T4 DNA连接酶)，在两个步骤中将片段连接进质粒载体中。首先，将经切割的上游及下游片段在15℃过夜连接进先已经SacI消化并凝胶纯化的pUC19质粒(参阅如Yanisch-Reman等，Gene33：103-119[1985])多接头中的单限制性酶切位点中，在共有的BamHI位点连接以重新形成环状质粒。使用生产商的One Shot转化方案将此重新环化的质粒转化进Invitrogen的感受态“Top10”大肠杆菌细胞中。

在以1.5％琼脂(LA)加50μg/ml羧苄青霉素固化的、含有X-gal(Sigma)用于蓝白筛选的、Luria-Bertani(LB)培养基上选择转化体。挑取克隆并在37℃在5mL Luria Bertani培养液(LB)加50μg/ml羧苄青霉素中培养过夜，使用Qiagen的小量制备试剂盒分离质粒。使用SacI进行的限制性分析证实了2kb插入片段的存在。在如上述消化反应(以额外的1μL水代替第二种限制性酶)中用BamHI切割经证实带有该插入片段的质粒以将其线性化，用1μL小牛肠或虾的磷酸酶在37℃处理1小时以防止再环化，并连接经BamHI消化的侧翼为loxP位点的壮观霉素抗性盒。将这种连接混合物转化进大肠杆菌Top 10细胞中，并在含有100μg/ml壮观霉素的LA平板上选择菌落。如上述通过以BamHI进行限制性分析来证实所分离质粒中的标记插入。在转化进枯草芽孢杆菌中之前，用ScaI将质粒线性化，以确保双交换事件。

实施例2

粘度测定试验

在含有50mL适于生产枯草杆菌蛋白酶的培养基的250ml带挡板锥形瓶中培养细胞(参阅Christianson等，Anal.Biochem.，223：119-129[1994]；以及Hsia等，Anal.Biochem.，242：221-227 [1996])。用50μL的8小时5mL培养物接种该培养基，并在37℃培养40小时同时以250 RPM摇动。培养宿主A(-bglC)、宿主B(-bglC)、宿主C(-bglS)和Host D(-bglS)培养物48小时。

在37小时时从每个摇瓶中取1ml样品。离心除去细胞，对60μL上清液进行粘度测定试验。在t＝0、t＝22小时和t＝120小时时测量粘度。使用水作为对照。

使用以下方法测量粘度：对于每个实验，将2ml体积的1％纤维素性材料(羧甲基纤维素)在深低温小瓶中分散。将60μL样品加入2ml体积的纤维素性材料中。轻柔混合后，在适当的预定时间(例如孵育20小时)取样进行分析。就分析而言，将500μL样品和底物吸入粘度计(BrookfieldLV DVIII Cone&Plate粘度计，带有设置为25℃的CP40水浴)的样品杯中，并将粘度计编程以便SSN(设置速度)为16 RPM，WTI(等待时间)设置为30秒(Rheocalc软件)。30秒后，显示摘要单。

这些测定的结果在图2提供。对于接触1％纤维素性材料的对照、宿主A(-bglC)和宿主B(-bglC)样品而言，在实验过程中未观察到粘度下降，表示样品中不存在纤维素酶活性。如粘度的下降所表示的，具有缺失的bglS基因组序列的宿主菌株显示出显著的纤维素酶活性。

实施例3

构建产生蛋白酶的bglC::壮观霉素菌株

在本实验中测试了以下菌株：产生枯草杆菌蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株以及带有插入失活的bglC的相同菌株。

如下构建待测试的菌株。用来自产生枯草杆菌蛋白酶的菌株的染色体DNA转化SC6菌株(spoIIE，amyE，aprE Pxyl：comK)。在含有氯霉素(5μg/ml)和1.6％脱脂乳的L琼脂平板上选择转化体。通过含有脱脂乳的平板上产生的晕圈来证实枯草杆菌蛋白酶的存在。所得菌株MDT04-250用来自具有插入失活的bglC基因的菌株的染色体DNA进行转化，并在含有壮观霉素(100μg/ml)的L琼脂平板上选择转化体。通过对氯霉素(5μg/ml)和壮观霉素(100μg/ml)的抗性来证实新菌株MDT05-28。为获得蛋白酶，扩增这两种菌株，这通过将其依次在含有氯霉素(10μg/ml)然后含有氯霉素(25μg/ml)的L琼脂平板上培养来进行。在250mL带挡板的锥形瓶中，在含有25ml LB(Difco)、葡萄糖(0.1％)和氯霉素(25μm/ml)的摇瓶中培养这些经扩增的菌株。将摇瓶在37℃孵育同时以280rpm摇动，在OD₅₅₀为0.8时，将1mL培养物与0.5ml 30％甘油混合并冷冻于-70℃。以解冻管中的30μL接种250ml三角瓶中的40ml FNII培养基。每个菌株使用两瓶。将摇瓶在280rpm摇动下以37℃孵育数天，收集上清液样品进行粘度测试和枯草杆菌蛋白酶分析。

在培养过程中在不同时间(如16、48和68小时)后从液体培养物中收获上清液，并在25℃在含有0.3 mM N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(VegaBiochemicals)、0.1M Tris，pH 8.6的溶液中如前述测定枯草杆菌蛋白酶(参阅Estell等，J.Biol.Chem.，260：6518-6521[1985])。该测定法测量由于对硝基苯胺的水解和释放导致的每分钟410nm吸光度的提高。这些菌株以相等的速率产生相等量的枯草杆菌蛋白酶。

在接种后16、48或68小时时自亲本菌株MDT04-250或bglC::spec菌株(MDT05-28)的摇瓶中取上清液样品，并与纤维素底物(4.5ml 5％CMC+0.5ml上清液)孵育1、24或48小时。通过纤维素底物的粘度下降来衡量纤维素酶对纤维素底物的活性，上述粘度下降根据生产商的指导使用软件通过流变仪测量(如上文所述)。数据以对照(dH₂O)读数的百分比来表示。得自MDT05-28摇瓶的样品未显示纤维素底物的粘度降低，而来自MDT04-250的所有样品都快速地降低纤维素底物的粘度。这表明bglC的失活阻止了对纤维素底物的活性。这些测定试验的结果示于图3。这些结果显示，具有已破坏的bglC基因的表达枯草杆菌蛋白酶的宿主芽孢杆菌菌株的培养物上清液未显示显著的纤维素酶活性。

尽管已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但对于本领域技术人员而言很明显的是，可以进行多种其他改变和修改，而不背离本发明的精神和范围。因此，所附的权利要求书旨在涵盖所有这些在本发明范围之内的改变和修改。

本说明书中提及的所有专利及出版物代表了本发明所属领域技术人员的水平。所有专利及出版物均以参考方式并入本文，其程度等同于每篇单个出版物均具体且单独地指明以参考方式并入。

尽管描述了本发明的优选实施方案，但对本领域普通技术人员而言很明显的是，可以对所公开的实施方案进行多种修改，而且这些修改均在本发明的范围之内。

本领域技术人员十分清楚，本发明非常适应于实现本发明的目的并获得所描述的结果和优点以及其内在的结果和优点。本文所述的组合物和方法代表优选实施方案，是示例性的，并且不意在限制本发明的范围。对本领域技术人员而言很明显的是，可以对本文所述发明进行多种替换和修改，而不背离本发明的范围和精神。

适宜地，本文示例性描述的发明可以在缺少本文未具体公开的任何要素、限制条件的情况下实施。所使用的术语和表述用作描述用语而非限制，这些术语及表述的使用并不旨在排除所示及所述特征的任何等同方案或其部分，而是应该认识到，在本发明要求保护的范围之内可以有多种修改。因此，应该理解，尽管本发明通过优选实施方案和任选特征进行了具体公开，但本领域技术人员可以对本文所公开的概念进行修改和改变，这些修改和改变均被认为在后附权利要求书所定义的本发明范围之内。

本文对本发明进行了宽泛和一般性的描述。落入公开的上位概念之内的每种下位概念及亚组均构成本发明的一部分。这包括附条件或负向限制因素的、对本发明的上位描述，以从该上位概念中除去任何主题，无论该被排除的主题是否在本文中具体提及。

序列表

<110>美国丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US，Inc.，Genencor Division)

<120>Cellulase-Free Enzyme Compositions and Host Cells for Producing

the Same

<130>GC930-PCT

<140>PCT/US2007/020851

<141>2007-09-26

<150>US 60/849,982

<151>2006-10-06

<160>26

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1478

<212>DNA

<213>芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)

<400>1

atgaaacggt caatctctat ttttattacg tgtttattga ttacgttatt gacaatgggc 60

ggcatgatag cttcgccggc atcagcagca gggacaaaaa cgccagtagc caagaatggc 120

cagcttaata aaaggtacac agctcgttaa ccgagacggt aaagcggtac agctgaaggg 180

gatcagttca cacggattgc aatggtatgg agaatatgtc aataaagaca gcttaaaatg 240

gctgagagat gatgggtatc accgttttcc gtgcagcgat gtatacggca gatggcggtt 300

atattgacaa cccgtccgtg aaaaataaag taaaagaagc ggttgaagcg gcaaaagagc 360

ttgggatata tgtcatcatg atggcatatc ttaaatgacg gtaatccaaa ccaaaataaa 420

gagaaggcaa aagaattctt caaggaaatg tcaagccttt acggaaacac gccaaacgtc 480

atttatgaaa ttgcaaacga accaacggga tgtgaactgg aagcgtgata ttaaaccata 540

tgcggaagaa gtgatttcag ttatccgcaa aaatgatcca gacaacatca tcattgtcgg 600

aaccggtaca tggagccagg atgtgaatga tctgcgatga ccagctaaaa gatgcaaacg 660

ttatgtacgc acttcatttt tatgccggca cgcacggcca atttttacgg gataaagcaa 720

actatgcact cagcaaagga gcacctattt ttgtgacgag tgggaacaag cgacgcgtct 780

ggcaatggcg gtgtattcct tgatcaatcg agggaatggc tgaaatatct cgacagcaag 840

accattagct gggtgaactg gaatctttct gataagcagg aatatcctcg ctttaaagcc 900

gggggcatct aaaacaggcg gctggcggtt gtcagattta tctgcttcag gaacattcgt 960

tagagaaaac attctcggca ccaaagattc gacgaaggac attcctgaac gccatcaaag 1020

ataaacccac acaggaaaat ggtatttctg tacagtacag agcaggggat gggagtatga 1080

acagcaacca aatccgtccg cagcttcaaa taaaaaataa cggcaatacc acggtgattt 1140

aaagatgtca ctgcccgtta ctggtataaa gcgaaaaaca aaggccaaaa ctttgactgt 1200

gactacgcgc agattggatg cggcaatgtg acacacaagt ttgtgacgtt gcataaacca 1260

agcaaggtgc gatacctatc tggaacttgg atttaaaaac ggaacgttgg caccgggagc 1320

aagcacaggg aatattcagc tccgtcttca caatgatgac tggagcaatt atgcacaaag 1380

cggcgatatt cctttttaaa tcaaatacgt ttaaaacaac gaaaaaaatc acattatatg 1440

atcaaggaaa actgatttgg ggaacagaac caaattag 1478

<210>2

<211>493

<212>PRT

<213>芽孢杆菌属物种

<400>2

Met Lys Arg Ser Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu

1 5 10 15

Leu Thr Met Gly Gly Met Ile Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln

35 40 45

Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser

50 55 60

His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys

65 70 75 80

Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr

85 90 95

Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Val

100 105 110

Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Trp

115 120 125

His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys

130 135 140

Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg

165 170 175

Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn

180 185 190

Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp

195 200 205

Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Tyr

210 215 220

Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys

225 230 235 240

Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Glu Gly Thr

245 250 255

Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu

260 265 270

Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn

275 280 285

Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser

290 295 300

Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe

305 310 315 320

Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro

325 330 335

Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val

340 345 350

Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro

355 360 365

Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Asp Leu Asp Val Thr

370 375 380

Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Phe Asp Cys

385 390 395 400

Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys Gly Asn Val Thr His Lys Phe Val Thr

405 410 415

Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe

420 425 430

Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu

435 440 445

Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr

450 455 460

Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu

465 470 475 480

Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn

485 490

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>3

acaaatgagc tcgctggagc attggatggc gcattcc 37

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>4

tgatctggat ccccttcgca tcattttggc tctacac 37

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>5

aaaactggat ccgggaacag aaccaaatta gttaagc 37

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>6

atggtagtcg acgcaaacgc ggctacaata tggctca 37

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>7

ttccgcggag ggccggccta ctata 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>8

catattcaca atgcgatggt agagg 25

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>9

ttatgcacaa agcggcgattattcc 25

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>10

atctcttgcc agtcacgtta cg 22

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>11

ggagtgtcta gaactgacca gcttccgtct ttccctg 37

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>12

actaacggat cccctgtaac tatcatcatc ttccctc 37

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>13

caaaaaggat ccgccaaatg tgaaagagcc tgctgca 37

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>14

agaggtgagc tcaccgctga ttcccgctat gatcgcc 37

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>15

caatatacac aatacagtgc tgaaagc 27

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>16

gcgggaatag cgatgcttgg ttcgg 25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>17

gatgaacttg tggaatggca cgggt 25

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>18

tcgacggtat cgataagctg gatccataac 30

<210>19

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>19

gcctaggatg catatgggat ccgcataact tc 32

<210>20

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的限制性位点

<400>20

tctaga 6

<210>21

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的限制性位点

<400>21

ggatcc 6

<210>22

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的限制性位点

<400>22

gagctc 6

<210>23

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的限制性位点

<400>23

ggtacc 6

<210>24

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的限制性位点

<400>24

ctgcag 6

<210>25

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的限制性位点

<400>25

aagctt 6

<210>26

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的试剂

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)..(2)

<223>L-Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>(3)..(3)

<223>L-Pro

<220>

<221>VARIANT

<222>(4)..(4)

<223>L-Phe

<400>26

Ala Ala Pro Phe

1

Claims (20)

1.重组的无纤维素酶的芽孢杆菌宿主细胞，其包含含有经重组而失活的bglC基因的基因组，其中所述细胞还包含用于产生分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的重组核酸。

2.权利要求1的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述失活的bglC基因包含缺失、插入、替换或重排。

3.权利要求1的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌细胞为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)或耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)的细胞。

4.权利要求1的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质为选自蛋白酶、淀粉酶、果胶酸裂合酶、酰基转移酶、芳基酯酶和脂肪酶的酶。

5.权利要求4的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述酶是蛋白酶。

6.权利要求5的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。

7.权利要求1的重组芽孢杆菌宿主细胞，其中所述bglC基因编码与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的多肽。

8.细胞培养物，其包含：

培养基；和

权利要求1的重组芽孢杆菌宿主细胞。

9.一种用于产生分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的方法，其包括：

在适于产生所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的条件下维持权利要求8的细胞培养物。

10.权利要求9的方法，还包括：

从所述培养基中回收所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质。

11.权利要求10的方法，还包括将所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质与洗衣洗涤剂组合。

12.权利要求9的方法，其中所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是枯草杆菌蛋白酶。

13.通过权利要求9的方法产生的细胞培养物或其培养基在制备无纤维素酶的蛋白质组合物中的用途，其中所述细胞培养物或培养基包含所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质。

14.权利要求13的用途，其中所述组合物包含由芽孢杆菌产生的分泌型洗涤剂添加剂蛋白质，并且其特征在于该组合物不具有可检测的纤维素酶活性。

15.通过权利要求9的方法产生的细胞培养物或其培养基在制备无纤维素酶的洗衣洗涤剂中的用途，其中所述细胞培养物或培养基包含所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质。

16.权利要求15的用途，其中所述洗涤剂含有纤维素性聚合物。

17.构建细胞的方法，其包括

a)将第一重组核酸引入芽孢杆菌细胞中，以使所述重组核酸与所述细胞的bglC基因重组，造成bglC基因失活；和

b)将第二重组核酸引入所述细胞中，其提供分泌型洗涤剂添加剂蛋白质的表达，

其中，所述细胞产生无纤维素酶的洗涤剂添加剂蛋白质。

18.权利要求17的方法，其中所述第一重组核酸插入到所述bglC基因中。

19.权利要求17的方法，其中所述第一重组核酸造成所述bglC基因的至少一个部分缺失。

20.权利要求17的方法，其中所述分泌型洗涤剂添加剂蛋白质是枯草杆菌蛋白酶。