KR100279867B1

KR100279867B1 - 바실러스 퓨미루스로 부터 유래한 알칼리성 프로테아제

Info

Publication number: KR100279867B1
Application number: KR1019930010008A
Authority: KR
Inventors: 로만 베터 독토르.; 데트레프 빌케 독토르.; 베른하르트 묄러 독토르.; 뮐러 마르티나; 인고 뮈케 독토르.; 타켄베르크 마이케; 코니쩨니-얀다 게하르트
Original assignee: 닥터 디이터 로우어; 솔베이 엔침스 게엠베하 운트 컴퍼니. 콤만디트게젤샤프트
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 2001-02-01
Also published as: DE4218448A1; AR248166A1; JPH06217771A; EP0572992A1; ES2204897T3; CA2097523C; FI932538A; DE59310348D1; DK0572992T3; KR940000574A; ATE247706T1; PT572992E; MX9303257A; US5346822A; FI932538A0; EP0572992B1; CA2097523A1; US5478742A

Abstract

본 발명은 알칼리성 바실러스-프로테아제와 이의 이용 및 생산방법에 관한 것이다. 특히 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 바실러스 프로테아제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알칼리성 프로테아제는 세정 및 세탁 제제로의 이용에 적합한 것이다.

Description

바실러스 퓨미루스로 부터 유래한 알칼리성 프로테아제

제1도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P46의 최적 온도.

제2도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P415의 최적 온도.

제3도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P46의 열 안정성.

제4도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P415 열 안정성.

제5도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P46의 최적 pH.

제6도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P415의 최적 pH.

제7도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P46의 pH 안정성.

제8도는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제 P415의 pH 안정성.

제9도는 프로테아제 P415 첨가량에 따른 시험직물 M-PC 상에서의 세탁능력(△R = Reflection difference).

제10도는 프로테아제 P415 첨가량에 따른 시험직물 Y-MC 상에서의 세탁능력(△R = Reflection difference).

제11도는 프로테아제 P415 첨가량에 따른 시험직물 상에서의 세탁능력(△R = Reflection difference) 이다.

본 발명은 바실러스 퓨미루스(Bacillus pumilus)로 부터 유래된 알칼리성 프로테아제와 이의 이용 및 생산 방법에 관한 것이다.

알칼리성 프로테아제는 단백질이 함유된 이물질을 제거할 수 있기 때문에, 특히 세제 산업에 있어서, 이용도가 높은 산업적 제품이다. 이 프로테아제가 효용성이 있으려면, 세탁조건하에서(pH 값, 온도) 단백분해 역가를 지녀야 할 뿐만 아니라 다른 세제 조성물, 즉 다른 효소, 계면활성제, 지지체(Builder), 표백제, 표백 촉진제 그리고 기타 첨가제 및 보조제등과 배합에 적합한 것이어야 한다. 특히 프로테아제는 이러한 세제 성분에 대하여 충분한 안정성과 충분한 세정능력을 나타내야 한다.

종래에는 알칼리성 프로테아제가 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 및 바실러스 리케니포미스 등과 같은 바실러스 종의 배양에 의해 얻어졌는데, 이 바실러스 종은 알칼리성 프로테아제를 생성하여 배양액 중으로 분비한다.

이러한 알칼리성 프로테아제에 관하여는, 원하는 특성을 지닌 새로운 알칼리성 프로테아제를 얻기 위하여 이미 많은 노력을 해왔다. 그리하여 이미 여러 종류의 천연의 또는 인위적으로(유전자 조작에 의한) 변형된 알칼리성 또는 고알칼리성 프로테아제가 알려졌다. 그러나 특히 세정작용 면에서 적합한 특성을 지닌 새로운 알칼리성 프로테아제가 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 적합한 특성을 지닌, 새롭고 가치있는 알칼리성 프로테아제를 제조함에 있다.

놀랍게도 다음과 같은 특성을 지닌 알칼리성 프로테아제가 발견되었다. 즉 이 알칼리성 바실러스-프로테아제는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 혹은 이러한 알칼리성 프로테아제를 위한 유전정보를 지닌 형질전화체의 배양을 통하여 얻어지며, 적정 pH 가 알칼리 범주인 pH 8.0 - 11.5 사이에 있으며, 적정 온도가 약 50-60℃ 사이이고, 아주 우수한 세정작용을 나타낸다는 좋은 특성을 가지고 있다.

목적에 부합되게도, 본 발명에 따른 알칼리성 프로테아제는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래하는 프로테아제의 아미노산 서열과 비교하여 최소한 70 %, 바람직하게는 최소 80 %, 더욱 바람직하게는 최소 90 %의 동질성을 보여준다. 여기서 동질성(Homology)이란 발명에 따른 바실러스-프로테아제의 해당 아미노산 서열이 바실러스 퓨미루스 DSM 5777로부터 얻어진 프로테아제의 아미노산 서열과 비교하여 유사한 정도를 나타낸다. 동질성의 측정을 위하여는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 프로테아제의 특정 부위와 그와 비교할 한 프로테아제의 아미노산 서열을 최대의 일치성이 보이도록 배교하여 결정한다. 이때 각 상응되는 서열에서의 차이는 서열 부위의 대체와 고려된 개개의 아미노산의 결실이나 삽입에 의한다.

동질성의 % 는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 프로테아제가 가진 총 아미노산의 수와 서열상에서 일치하는 아미노산(동질성 부위) 수와의 백분율을 나타낸다. 서열 상의 유의차는 아미노산의 변형, 삽입 및 결실에 의해 생길 수 있다.

본 발명에 따른 프로테아제는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 혹은 이러한 알칼리성 프로테아제를 위한 유전정보를 지닌, 예를 들어 발현 벡터내에 함유된, 형질전환체의 배양을 통하여 얻어진다.

바실러스 퓨미루스 DSM 5777 배양 상등액을 고압액체크로마토그라피(HPLC)를 통해 분리하면, 바실러스 퓨미루스 DSM 5777로 부터 적어도 두 종류의 서로 다른 특성을 지닌 프로테아제를 얻을 수 있다.

바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 본 발명에 따른 프로테아제 중의 하나는 알칼리성 바실러스-프로테아제로서 다음과 같은 특성을 보여준다:

(1) 기 능 : 단백질 및 펩타이드의 분해

(2) 최적 pH : pH 범위 약 10.5 - 11.0

(3) pH 안정성 : pH 범위 9.7 - 10.8 사이에서 효소는 아주 안정함

(4) 최적온도 : 60℃

(5) 열 안정성 : 프로테아제를 45℃까지의 온도에서 15분간 방치후에도 효소역가에 별다른 영향을 주지 않는다 ; 50℃까지의 온도에서 15 분간 방치 후 효소의 잔존역가는 최소 90%에 달하였다.

바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 본 발명에 따른 프로테아제 중의 다른 하나는 다음과 같은 특성을 보여준다:

(1) 기 능 : 단백질 및 펩타이드의 분해

(2) 최적 pH : pH 범위 약 8.5 - 9.0

(3) pH 안정성 : pH 범위 5.5 - 10.5 사이에서 효소는 아주 안정함

(4) 최적온도 : 50℃

(5) 열 안정성 : 프로테아제를 40℃까지의 온도에서 15 분간 방치 후에도 효소역가에 별다른 영향을 주지 않는다 ; 45℃까지의 온도에서 15 분간 방치 후 효소의 잔존역가는 최소95% 에 달하였다.

본 발명에 따른 바실러스-프로테아제는 중성에서 알카리 pH 범위에서 그리고 낮은 온도, 특히 60℃까지의 저온에서 사용되어야 하는 세제 및 세정제 성분의 첨가제로 적합하다. 본 발명은, 따라서 본 발명에 따른 알카리성 바실러스-프로테아제가 세제, 세정제 및 식기용 세제에 사용될 수 있다는 내용을 포함한다. 이 효소는 또한 여타 다른 효소와, 특히 다른 프로테아제와, 혼용하여 유리하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 알카리성 바실러스-프로테아제의 장점은 60℃까지의 저온에서, 바람직하게는 30-60℃ 사이에서 세제, 세정제 및 식기용세제에 사용될 수 있다는 것이다.

또한 본 발명은, 본 발명에 따른 알칼리성 프로테아제 중 적어도 한 가지를 함유하는 세제, 세정제, 식기용 세제에 관한 것이다. 이러한 응용 분야에 있어서, 본 발명은 단백질-함유 불순물이 제거될 수 있는, 일련의 적합한 특성을 가진 새로운 알카리성 프로테아제를 제공한다.

또한 난황, 혈액 및 우유 등을 지닌 불순물도 마찬가지로 제거된다. 실질적으로 세제 조성에 함유된 다른 구성성분에 의한 손상을 본 발명에 따른 프로테아제의 세정효과에서 나타나지 않는다.

본 발명에 따른 프로테아제는 세제, 세정제 의 조제, 예를 들어 분말세제의 조제시, 개별적으로 혹은 경우에 따라 세제 및 세정용 프로테아제와 서로 배합하여 사용할 수 있으며 또한 세제, 세정용 프로테아제 혹은 첨가제로 흔히 사용되는 아밀라제, 리파제, 펙틴아제, 뉴클레아제, 옥시도리덕타제(Oxido-reductase) 및 셀룰라제 등과 혼용하여 사용된다. 본 발명에 따른 프로테아제는 세제 및 세정제 조제에 있어, 일반적인 세제용 효소 첨가량 처럼, 특히 3 중량 % 까지(전체 성분의 건조량으로 환산하여), 바람직하게는 0.2 - 1.5 중량 %로 첨가하여 사용될 수 있다.

이미 언급된 세제용 효소 외에도 본 발명에 의한 세탁 및 세정제는 종래의 일반적인 세제 함유성분들 즉, 계면활성제, 표백제 및 지지체(Builder) 그리고 제제상 필요한 일반적인 보조제 등을 보편적인 양 만큼 함유할 수 있다. 보조제에 속하는 것으로 강화제, 효소안정제, 재석출 방지제 및/또는 상화제(compatibilisation agent), 착화제 또는 킬레이트제, 거품조절제 그리고 광학적 광택제, 형광제, 부식방지제, 정전방지제, 착색제, 항세균제, 표백촉진제 및 과산화 표백제의 전구물질 등을 들 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 세탁제제는, 건조 중량으로 환산하여, 전형적인 예를 들면 다음과 같은 조성을 지닌다.

a) 최소 5 중량 %, 예를 들어 10 내지 50 중량 %의 계면활성제 또는 이의 혼합물,

b) 40 중량 % 까지의 지지체(Builder) 또는 이의 혼합물,

c) 40 중량 % 까지의 표백제 또는 표백제의 혼합물, 바람직하게는 소듐 퍼보레이트 테트라하이드레이트(Sodium perborate tetrahydrate) 또는 소듐레이트 모노하이드레이트(Sodium perborate monohydrate) 등의 퍼보레이트(Perborate),

d) 3 중량% 까지의 본 발명에 따른 적어도 하나의 프로테아제,

e) 이외의 보조제 등의 내용 성분을 합하여 100 중량 %로 한다.

이와 같은 세탁제제는 흔히 일반적인 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 프로테아제는 이들 제제에 미립자, 프릴(Prill) 이나 펠릿(Pellet) 형태로 또는 표면 도말제 형태로 다른 성분 들과 혼합될 수 있다.

본 발명에 따른 프로테아제는 그 이외에도 일반 액상의 세제에 아주 잘 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 알카리성 프로테아제는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 혹은 이러한 알칼리성 프로테아제를 위한 유전정보를 지닌 미생물을 배양한 후 다음과 같이 배양 상등액으로 부터 알칼리성 프로테아제를 분리함으로써 얻어진다. 배양 상등액으로 부터 알칼리성 프로테아제의 분리는 미생물체를 여과 또는 원심분리하여 분리한 후, 프로테아제는 막 여과법 또는 침전의 방법으로 농축하여 정제 및 분리한 후 원하는 곳에 사용한다.

예를 들면, 본 발명에 따른 알카리성 바실러스-프로테아제의 제조에는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 혹은 이러한 알칼리성 프로테아제를 위한 유전정보를 발현 벡터에 지닌, 바실러스 퓨미루스의 형질전환체가 사용된다.

산업적 대량생산을 위하여, 특히 생산의 간편화, 적합화 및 회수율 증가를 위하여 다른 종의 바실러스 균주를 본 발명에 따른 바실러스-프로테아제의 생산 및 회수에 이용할 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 프로테아제의 유전정보를 타 균주에 형질전환시켜 발현시킴으로써 가능하다.

따라서 본 발명은, 전술한 본 발명에 따른 바실러스-프로테아제와 동일한 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA-서열을 지니며, 프로테아제의 발현에 필요한 DNA-서열을 지닌 벡터(Vector)를 함유하고 있는, 형질전환된 바실러스를 이용하여 본 발명에 적합한 알칼리성 프로테아제를 생산하는 공정을 포함한다. 본 발명에 따라 형질전환된 미생물은 전술한 바와 같이 배양하고 배양액으로 부터 알카리성 바실러스-프로테아제를 분리한다. 본 발명에 따른 바실러스-프로테아제의 생산 및 회수에 유리한 형질전환 미생물로서는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 알카로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등의 바실러스 계통이다.

본 발명에 따른 형질 전환된 미생물들은 독일 종균 협회(Deutschen Sammlung von Mikroorganismen ; DSM)에 1990년 2월 9일자로 기탁된 바실러스 퓨미루스(기탁번호 DSM 5777)에서 유래한 알칼리성 프로테아제에 관한 유전정보를 지닌 발현 벡터로 형질전환된 미생물들로 분류된다. 마찬가지로 본 발명은 1992년 2월 23일자로 기탁된 기탁번호 DSM 6879와 DSM 6880인 미생물을 포함하며, 또한 이들 미생물들로부터 분리될 수 있고 본 발명에 따라 전술된 프로테아제의 유전 정보를 지닌 프라즈미드(Plasmid)를 포함한다.

전술한 공정에서 사용된, 본 발명의 대상이 되는 형질전환된 미생물을 생성하기 위해 다음과 같은 방법에 따라 행해진다.

a) 바실러스 퓨미루스 DSM 5777로 부터 얻어지는 프로테아제의 아미노산 서열과 비교하여 최소한 70 %, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 동질성을 보여주는 알카리성 프로테아제를 생성하는데 적합한 바실러스 균주로 부터 프로테아제를 코드(code)하는 DNA-서열(즉 프로테아제의 구조 유전자)을 분리한다.

b) 경우에 따라 프로테아제의 정밀한 구별을 위하여 DNA-서열의 핵산 염기서열을 확정한다.

c) 분리된 DNA-서열을 이용하여 발현 벡터를 만든다.

d) 알카리성 바실러스-프로테아제 생산에 이용될 적합한 미생물에 이 발현 벡터를 형질전환시킨다.

전술한 방법에 의해 본 발명에 따른 알카리성 바실러스-프로테아제를 분리 및 회수하는 공정, 발명의 대상이 될 수 있는 프로테아제에 유전자를 지닌 DNA-서열이나 DNA-인서트(Insert) 형태로 여기에서 얻어지는 중간물질, 벡터, 특히 발현벡터 및 형질전환된 미생물에 관하여서는 다음에서 상세히 한다.

알카리성 바실러스-프로테아제의 아미노산 서열을 코드하는 구조 유전자(structural gene)는 일반적인 잘 알려진 방법에 의해 얻어진다. 예를 들어 바실러스 퓨미루스 DSM 5777(공여 바실러스)로 부터, 알려진 방법에 따라 염색체 DNA를 분리하고 적합한 제한효소를 이용하여 부분 가수분해 한다.

얻어진 공여-DNA(Donor-DNA)의 제한 절편은 겔 전기영동 또는 원심분리에 의한 슈크로즈-농도구배를 통하여 크기에 따라 분리될 수 있고, 원하는 크기의 절편은 적절한 벡터 DNA와 재조합될 수 있다. 목적에 맞게 벡터로서 한 프라즈미드(Plasmid)가 사용되는데, 이것으로 숙주체에 삽입된 이형-DNA의 발현이 가능하게 된다. 실시예에서 서술되는 바와 같이, 예를 들어, pUB110에 폴리링커(Polylinker) 부위를 삽입시킴으로써 만들어진 pUB131로 표시되는 프라즈미드를 사용한다.

전술한 바와 같이 얻어진, 시험관내에서(in vitro) 재조합된 DNA는 적당한 숙주체, 예를 들어 본 발명에서 사용되는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) PSL1에 삽입될 수 있다. 형질전환체, 즉 숙주체는 벡터 DNA상의 미-커(예, 네오마이신 저항성)의 도움으로 선별될 수 있다. 이러한 항생물질에 저항성을 지닌 형질전환체 중에서 프로테아제를 분비하는 크론(Clone)을 찾을 수 있다. 이와같은 형질전환체 중에서 본 발명에 따른 프로테아제를 분비하는 것을 찾을 수 있다.

이렇게 분리한 프라즈미드는 알려진 제한부위를 지닌 벡터 DNA 외에도 찾고자하는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 알카리성 바실러스-프로테아제의 구조 유전자를 가지고 있으며, 경우에 따라서는 공여 바실러스로 부터 유래한 불필요한 DNA-서열을 가지고 있다. 이러한 프로테아제 유전자를 가진 프라즈미드의 예로서는, pPP46 및 pPP415를 들 수 있다. 프라즈미드 pPP46 은 7.6 kb(Kilobase) 크기의 것으로 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 본 발명에 따른 프로테아제 P46을 코드하고 있다. 프라즈미드 pPP415 는 6.2 kb 크기의 것으로 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에서 유래한 발명에 따른 프로테아제 P415를 코드하고 있다.

이러한 프라즈미드의 해당되는 알칼리성 프로테아제의 발현 능력을 평가할 수 있는 바, 한 박테리아, 특히 위에서 언급한 한 바실러스 종을 이 프라즈미드를 이용 형질전환시킨 후 배양하여 프로테아제 역가를 측정함으로써 테스트 할 수 있다. 이렇게 얻어진 형질전환체는 본 발명에 따른 알칼리성 프로테아제의 생산 및 회수를 위해 배양될 수 있으며, 전술한 바에 따라 알칼리성 프로테아제를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 프로테아제는 장점이 많은 특성을 지닌 것을 특징으로 한다. 이 효소는 알칼리 pH 범위에서 높은 안정성을 가진다. 본 발명에 따른 프로테아제는 적정 pH가 세제 및 세정제 성분으로서 적당한 응용 pH범위인 8.0 내지 11.5 사이에 놓여있다. 더우기 본 발명에 따른 프로테아제는 50-60℃에서 적정온도를 가진다. 또한 이 효소는 세탁용 알카리용액에 대하여 좋은 안정성을 보인다. 본 발명에 따른 바실러스-프로테아제는 60℃ 까지의 온도에서 적합한 역가를 보여, 낮은 온도, 특히 60℃까지의 온도, 바람직하게는 30℃ 내지 60℃ 사이에서 사용되어야 하는 세제 및 세정제의 성분으로 아주 적합한다. 본 발명에 따른 프로테아제를 함유한 세제 및 세정제는 제거해야 할 단백질 오염물에 대해 우수한 세탁 능력을 발휘한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하되, 이 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

달리 기술하지 않는 한, 일반적으로 Maniatis 등(Maniatis et al. = T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)에 서술된 방법에 준한다.

사용된 여러 종류의 제한효소는 종래 기술상 문제없이 상품으로 구입할 수 있는 것이다. 알려진 제한효소의 사용에 요구되는 반응, 조효소 및 기타 조건 등은 잘 알려져 있다. 예를 들어 약 1 μg의 DNA를 반응시키기 위하여 한 단위(1 U = Unit)의 제한효소를 약 20 μl의 완충용액에 녹여 사용한다. 보통 37℃에서 약 1시간 가량의 충분한 배양시간이 적용되며 배양 조건은 요구에 따라 변화시킬 수 있다. 제한효소와 반응시킨 후 단백질은 추출(예를 들어 페놀과 클로로포름으로 추출)에 의해 제거되며 DNA 절편은 분리(예를 들어 에탄올 침전에 의한 수용성 분획으로 부터 분리)하여 다음 단계에서 쓰인다.

제한효소를 이용한 DNA 혹은 벡터의 절단은, 경우에 따라 알카리성 포스파타제(Phosphatase)를 이용하여 말단 5′-포스페이트 잔기의 가수분해(Dephosphorylation)에 의해 종결될 수 있다. 실시예에서 이러한 5′-말단의 디포스포릴레이션은 알려진 방법에 의한다. 디포스포릴레이션 시키는 자세한 방법 및 필요한 시약은 Maniatis 등(P133-134)에 따른다.

부분 가수분해(Partial Hydrolysis)는 제한효소를 이용하여 DNA를 불완전하게 가수분해하는 것을 의미한다. 그 반응조건은, DNA 기질이 첨가된 제한효소에 의해 모든 인식 부위가 절단되는 것이 아니라 한 두 군데에서만 절단되도록 선택되어야 한다.

특정한 DNA 절편은, 예를 들어 DNA를 제한효소로 처리한 후, 다음과 같이 분리하여 얻을 수 있다. 원하는 DNA 절편은 일반적인 겔 전기영동(예, 아가로즈겔 상에서)에 의해 분리한 후, 분자량에 따라(분자량을 알고 있는 표준 DNA 절편과 비교하여 확정) 구분하여, 원하는 DNA 절편만을 해당 겔 부위로 부터 절단하여 얻는다.

봉합(Ligation)은 알려진 방법에 따라 행하는 데, 예를 들어 봉합될 DNA 절편 0.5 μg 당 약 10 단위의 T4-DNA-리가제(T4-DNa-Ligase)를 함유한 완충용액 중에서 행해진다.

“형질전환”이란 DNA를 한 미생물체에 이식함을 의미하며, 그럼으로써 DNA가 그 내부에서 재생되고 발현됨을 의미한다. 바실러스 종에는 Anagnostopoulos 등의 방법(1961, J. Bacteriol. 81: 741-746)이 적합하다.

하기 실시예에서 효소의 안정성에 관하여 설명할 때 “아주 안정함”은 잔존역가가 최소한 90 %, “안정함”은 잔존역가가 최소 80 % 존재함을 의미한다.

실시예 1에서 분리된 바실러스 퓨미루스 균주는 독일 종균 협회에 기탁번호 DSM 5777 로서 1990년 2월 7일 자로 기탁되었다. 실시예 3에서 언급된, 프라즈미드 pPP46 으로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 PSL1 균주는 DSM 6879 로, 실시예 3에서 언급된, 프라즈미드 pPP415로 형질전환된 균주 바실러스 서브틸러스 PSL1 균주는 DSM 6880 로서 독일 종균 협회에 1992년 1월 22일자로 기탁된 것이다. 예를 들어 바실러스 서브틸리스 PSL1(Bacillus Genetic Stock Center 1 A 510) 또는 바실러스 BD 366(Bacillus Genetic Stock Center 1 E 6)과 같이 사용된 다른 미생물들은 구입할 수 있는 것들이다.

[실시예 1]

[바실러스 퓨미루스의 분리 및 동정]

바실러스 퓨미루스 균주는 자연으로 부터 분리하여 독일 종균 협회(Deutschen Sammlung von Mikroorganismen ; DSM)에 기탁번호 DSM 5777로 기탁되었다.

이 균주는 바실러스 속에 속하는 것으로서 그람 양성, 포자를 형성하는 호기성 균주이다. 세포 및 콜로니(Colony)의 형태학적 서술은 다음과 같으며 생화학적 특성 및 특정 배양조건하에서의 특성은 표 1에 표기하였다.

바실러스 퓨미루스 DSM 5777 :

원형의 모서리를 가진 막대형 박테리아. 그람 반응(그람 염색, KOH - 테스트)은 양성이다. TY- 아가(아래 참조) 상에서 37℃에서 2 일간 배양한 후 콜로니의 지름은 3.2-4.2mm로 미색이였고 평평하거나 주름진 형태를 지녔다. 간혹 콜로니 상에서 물방울 형태의 것이 발견되며 이 콜로니는 광택이 있거나 건조하여 쭈글쭈글한 형태를 지닌다. 세포는 TY- 아가(아래 참조) 상에서 0.8 내지 0.9 μm x 1.2 내지 2.8 μm의 크기였으며, 보통 개별적으로 또는 두개 혹은 세개의 쇄상 형태였다. 포자는 타원형으로 중심 하단부에 위치한다. 포자 형성은 잘 일어난다.

TY-아가 배지 :

표 1에서 보는 바와 같은 테스트(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2, 1121 - 1125, P. H. A. Sneath(ed.), Williams and Wilkins, Baltimore-London-Los Angeles-Sydney, 1986)로 부터 바실러스 퓨미루스 종에 속하는 것으로 동정되었다. 분리된 균주 DSM 5777 은 표 1에서 나타난 바실러스 퓨미루스와 비교하여 약간의 차이(Voges-Proskaur Test, V-P-영양배지 상에서의 pH, 난황-레시틴아제의 형성 및 7 % 염용액 에서의 생장)가 있다.

바실러스 퓨미루스는 광범위하게 존재하는 미생물체로서, 영양배지 상에서 다양한 외형의 콜로니를 형성한다.

[표 1]

* 바실러스 퓨미루스에 대한 특성은 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2, 1123, P.H.A. Sneath, ed.: Williams and Wilkins, Baltimore-London-Los Angeles-Sydney,1986 에 의거하였다.

+, 90 % 혹은 그 이상 양성

-, 90 % 혹은 그 이상 음성

d. 11 - 89 % 양성

n.d., 측정 안됨

NB, 액체영양배지

[실시예 2]

[프라즈미드 pUB 131의 제조]

바실러스 서브틸리스 BD366(Bacillus Genetic Stock Center 1 E 6)으로 부터 T.J. Gryczan 등의 방법(1978, J. Bacteriol. 34:318-329)에 따라 프라즈미드 pUB110이 분리되었고 Maniatis 등의 방법에 따라 세슘크로라이드-밀도구배 원심분리에 의해 정제되었다. 벡터 pUB110는 제한효소 BamHI과 EoRI에 대해 오직 한 군데의 제한부위를 가지며, 미-커로서 네오마이신에 대한 항생물질 저항성을 코드하는 DNA 서열을 가지고 또한 바실러스 종(복제의 기원)에서 증식에 필요한 DNA-서열을 지녔다.

전술한 바와 같이 얻어진 프라즈미드 pUB110을 EcoRI 및 BamHI으로 제한 절단하면 한개의 큰 절편과 한개의 작은 절편이 얻어진다. 작은 790 bp의 절편을 미리 M13tg131 벡터를 EcoRI/Bg1II로 자른 절편에서 분리된 67 bp의 폴리링커로 대체하였다. 이와같은 벡터를 pUB131로 표시하였으며 이는 pUB110의 변형체로, 약 0.8 Kb의 EcoRI/BamHI 절편을 제거한 대신 한 폴리링커가 삽입된 것이다.

[실시예 3]

[바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 알칼리성 프로테아제 p46 및 p415의 크로닝]

실시예 1에서 자연 분리한 바실러스 퓨미루스 DSM 5777로 부터 Saito 등의 방법(1963, Biochim. Biophys. Acta. 72, 619-629)에 따라 각각의 염색체 DNA를 분리하였고 제한효소인 Sau3A로 부분 가수분해하였다. 제한 절편은 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 통하여 분리되었고, 3 내지 8 kb 크기의 절편들이 분리되었다.

바실러스 DSM 5777 로 부터 분리된 DMA 절편들을 프라즈미드 pUB 131의 벡터 DNA와 시험관 내에서(in Bitro) 재조합 시켰다.

프라즈미드 pUB 131 을 제한효소인 Bam HI으로 제한 절단한 후, 송아지 내장에서 유래한 알카리성 포스파타제로 디포스포리레이션 시켰다. 4μg의 절단되고 디포스포리레이션된 벡터 DNA를 바실러스 DSM 5777에서 유래된 DNA 20μg과 함께 전체 부피를 200μl로 하여 T4-DNA 리가제와 함께 16℃에서 24시간 반응시켰다.

각 개의 시험관내에서(in Vitro) 재조합시킨 DNA를 바실러스 서브틸리스 PSL1(Bacillus Genetic Stock Center 1 A 510)의 프로토플라스트(Protoplast)에 S. Chang and N. Cohen(1979,Mol. Gen, Genet. 168, 111-115) 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환체는 네오마이신이 함유된 배지상에서 선별되었고 탈지유 이-가배지에 옮겨졌다. 약 100,000 개의 얻어진 네오마이신 저항성 형질전환체 중 투명한 환형 부위를 보여 강력히 프로테아제를 분비하는 것으로 판단되는 몇개의 형질전환체가 발견되었다.

이 크론을 10μg/ml 네오마이신이 함유된 TY 배지(트립톤 10g, 효모 추출물 5 g, MgCl₂·2 H₂O 4.1mg, MnCl₂·2 H₂O 16mg을 이차 증류수로 1000 ml 되게 함)에서 24 시간 배양하였다. 배양 상등액 중의 프로테아제를 Ultropak TSK CM-2SW, 250 x 4.6 mm(LKB사) 의 HPLC 컬럼을 이용하여 분리하고 자외선 280 nm에서 검출하였다. 연결된 플로우인젝션(Flow injection) 분석법(기질: 아세틸 카제인, 검출시약: 트리나이트로벤젠술폰산, 검출: 420 nm) 을 통하여 단백분해 역가를 지닌 피크를 다른 단백질 피크와 구별할 수 있다. 단지 숙주체 자체의 프로테아제를 강력히 분비하는 크론 외에도 숙주체 자체의 프로테아제와 함께, 외부 프로테아제 유전자를 포함하여 외래의 프로테아제도 분비하는 크론도 있다.

유출되는 시간에 따라 두개의 다른 외래의 프로테아제가 확인되었는데, 이들을 프로테아제 P46 및 P415로 표시하였다. 바실러스 퓨미루스 DSM 5777 배양 상등액에서 발견되는 프로테아제를 분비하는, 그러므로써 이런 프로테아제의 유전 정보를 함유한 크론으로 부터 얻어진 프라즈미드를 pPP46 및 pPP415는 6.2 kb의 크기이다. 프라즈미드 pPP46으로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 PSL1 균주는 1992년 1월 23일자 독일 종균 협회(deutschen Sammlung von Mikroorganismen ; DSM)에 기탁번호 DSM 6879 로서 기탁되었다. 프라즈미드 pPP415로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 PSL1 균주는 1992년 1월 23일자 독일 종균 협회에 기탁번호 DSM 6880로서 기탁되었다.

[실시예 4]

[바실러스 퓨미루스 DSM 5777 유래의 알칼리성 프로테아제 P46 및 P415의 생산]

프라즈미드 pPP46 및 pPP415를 실시예 3의 바실러스 서브틸리스 PSL1(pPP46)과 바실러스 서브틸리스 PSL1(pPP45)로 부터 각각 분리한 후 공여균주인 바실러스 퓨미루스 DSM 5777에 옮겼다. 형질전환 Chang and Cohen(실시예 2 참조) 방법에 따라 프로토플라스트(Protoplast)에 형질전환시키는 방법으로 행하였다. 그리고 40 ml의 전배양액(10 g 트립톤, 5 g 효모 추출물, 5 g Nacl, 10 mg 네어마이신, 이차 증류수로 1000 ml 되게 함)이 들어있는 500 ml 진탕프라스크에, 바실러스 퓨미루스 DSM 5777(pPP46) 또는 바실러스 퓨미루스 DSM 5777(pPP415) 균주의 이-가 프레이트로 부터 각 한 콜로니를 접종하였다. 배양은 37℃, 250 rpm으로 16 시간 동안 행하였다. 이 배양액 1 ml를 40 ml의 본배양액(40 g 대두분, 90 g 감자전분 , 1.5 g 소듐설페이트, 3.5 mg 망간클로라이드, 10mg 네오마이신, 이차 증류수로 1000 ml 되게 함)이 들어있는 500 ml 진탕프라스크에 접종하였다. 본배양은 320 rpm으로 30 시간 동안 전배양에서와 같이 배양 후 원심분리 하였다.

여액으로 부터 알칼리성 프로테아제를 FPLC(CM Sepharose FF.(Pharmacia) 용리 완충용액 0.05 M 소듐아세테이트 pH 6 과 0.8 M 소듐아세테이트 pH 6 )를 이용하여 정제하거나 배양 상등액을 직접 다음 실험에 사용하였다.

[실시예 5]

[바실러스 퓨미루스 프로테아제의 효소적 특성의 측정]

프로테아제의 역가는 델프트 단위(Delft Unit : DU)로 측정된다. 1000 DU란 카세인 용액을 1 ml 의 2 %(중량/중량) 효소액으로 반응시 흡광도 차이가(이때 빛의 통과는 1cm로 275nm 파장에서 측정하며 공시료액일때 측정한 것과의 차이를 말한다.) 0.4000을 나타내는 단백 분해 역가를 말한다. 최적온도, 열 안정성, 최적 pH 및 pH 안정성 등의 효소 특성을 측정할 때 실시예 4에서와 같이 바실러스 퓨미루스 DSM 5777( pPP46) 및 DSM 5777(pPP415) 균주의 배양 상등액을 사용하였다.

상등액 중 프로테아제의 최적 온도는 40℃ 내지 73℃의 범위에서 측정되었다. 결과는 표 2와 제1도 및 제2도에 나타냈다.

바실러스 퓨미루스 DSM 5777( pPP46) 유래의 프로테아제 P46의 최적 온도는 60℃ 부근이다(제1도).

바실러스 퓨미루스 DSM 5777( pPP415) 유래의 프로테아제 P415의 최적 온도는 50℃ 부근이다(제2도).

[표 2]

열 안정성을 측정하기 위하여 프로테아제를 함유한 여액을 15 분간 각 온도에서 방치한 후 잔존 역가를 측정하였다. 결과는 표 3과 제3도 및 제4도에 나타내었다.

바실러스 퓨미루스 DSM 5777( pPP46) 유래의 프로테아제 P46은 50℃까지 안정하였으며(잔존 역가 > 90%) 55℃에서 15분간 방치 후에도 잔존 역가가 57.3 % 였다(제3도).

바실러스 퓨미루스 DSM 5777( pPP415) 유래의 프로테아제 P415는 45℃ 까지 안정하였으며(잔존 역가 > 90%) 50℃에서 15 분간 방치 후에도 잔존 역가가 76.4 % 였다(제4도).

[표 3]

바실러스-프로테아제의 최적 pH를 측정하기 위하여 여러 pH에서 이의 역가를 측정하였다. pH 값을 맞추는데, pH 5에서 pH 7까지는 0.1 몰의 포스페이트 완충액(Phosphate buffer), pH 7에서 pH 9까지는 0.1 몰의 트리스-염산-완충액(Tris-HCl-buffer), pH 9에서 pH 13까지는 0.1 몰의 글라이신-수산화나트리움-완충액(Glycine-NaOH-Buffer)을 사용하였다. 역가 측정결과는 표 4와 제5도 및 제6도에 나타내었다.

바실러스 균주 DSM 5777(pPP46) 유래의 알카리성 프로테아제 P46의 최적 pH는 10.9였다. pH 12.5에서도 역가는 80% 이상 이었다(제5도).

바실러스 균주 DSM 5777(pPP415) 유래의 알카리성 프로테아제 P415의 최적 pH는 약 8.6이었다(제6도).

[표 4]

pH 안정성을 측정하기 위하여 프로테아제를 여러 pH 값을 지닌 완충용액 중에서 24시간, 4℃에서 방치하였다. 그리고 프로테아제의 잔존역가를 측정하였다. pH 5 - 7.1까지에는 포스페이트 완충액(0.1 몰)을 pH 7.1 - 9 까지는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-완충액(Tris(hydroxymethyl) aminomethane- Buffer, 0.1 몰)을 그리고 pH 9 - 12.1까지는 글라이신-나트륨하이드록사이드-완충액(0.1 몰)을 사용하였다. 결과는 제7도와 제8도에 나타내었다.

바실러스 균주 DSM 5777(pPP46) 유래의 알카리성 프로테아제 P46은 pH 5.8 - 9.7에서 비교적 안정하였으며, pH 9.7 - 10.8에서는 아주 안정하였다; pH 12.06에서 24 시간 후에도 잔존역가는 34%를 나타냈다(제7도).

바실러스 균주 DSM 5777(pPP415) 유래의 알카리성 프로테아제 P415는 pH 5.8 - 10.4 에서 아주 안정하였으며, pH 10.4 - 10.8 에서 비교적 안정하였다(제8도).

[실시예 6]

[프로테아제 P46의 세정 능력 시험]

본 발명에 따른 프로테아제 P46의 세탁효능을 세탁시험을 통하여 측정하였다.

[실시예 6a]

세제의 첨가제로써 응용을 위해, 본 발명에 따른 프로테아제의 세정 능력을 EY-PC(난황/인디아잉크로 오염된 폴리에스테르-면-혼방, 자가제조) 테스트 직물을 이용 실험용 세탁기(Type: Polycolor)에서 측정하였다. 여기서 테스트 직물을 다음과 같은 기본 세제 조성을 지닌 세제 6 g/l에 본 발명에 따른 프로테아제(5000 DU/l)를 첨가하여 15 °dH(경도)의 물로 세탁하였다. 기본 세제 조성 성분은 18.4 % 제오라이트, 7.3 % 소듐 카보네이트, 4.8 % 직선형 알킬설페이트, 3.3 % 비이온성 화합물, 3.3 % 비누, 0.1 % 소포제, 1.5 % 카복시메틸셀룰로즈, 0.15 % 광학적 광택제, 3.5 % 소듐 다이실리케이트, 25 % 퍼보레이트(Perborate), 1.5 % TADE 및 30.85 %의 소듐설페이트 이다. 세액의 pH는 10.3 이었다. 15℃-60℃까지 45분간 세탁하였다(2℃/분으로, 머무는 시간 22.5분).

효소를 함유한 세제액은, 해당 프로그램 온도로 조절되는 수욕조 상의 회전되는 용기내에서 테스트 직물내로 작용하게 된다. 세탁과정이 끝난 후 테스트 작물을 수돗물로 2번 세척 후 다림질 하였다.

세정능력을 세탁된 테스트 직물의 레프렉션(Reflection)을 측정하여 정하였다. 효소를 함유한 세정제로 세탁한 테스트 직물의 레프렉션 정도가 높게 나타나는 것으로써 효소가 작용한 것의 세정능력을 알 수 있다. 기본 세제조성만으로 세탁한 테스트 직물의 레프렉션 값은 41로 측정되엇다. 본 발명에 따른 프로테아제 P46을 첨가한 경우, 테스트 직물의 레프렉션 값이 45로서 확실히 높은 값을 나타냈다.

[실시예 6b]

본 발명에 따른 프로테아제 P46의 세정 능력을 실시예 6a에 서술된 방법과 같은 행하였다. 세제는 상업적으로 유용한 강력 분말형 세제(pH 10.4) 였다. 기본 세제조성만으로 세탁한 테스트 직물의 레프렉션 값은 41로 측정되었다. 본 발명에 따른 프로테아제 P46을 첨가한 경우, 테스트 직물의 레프렉션 값이 48로서 확실히 높은 값을 나타냈다.

[실시예 6c]

본 발명에 따른 프로테아제 P46의 세정 능력을 실시예 6b에 서술된 방법과 같이 행하였다. 테스트 직물로 혈액, 우유 및 인디아 잉크로 오염시킨 폴리에스테르-면-혼방 직물(EMPA 117-Eidgenoessische Materialpruefungs- und Vesuchsanstalt,ST. Gallen, Swiss에 준한)을 사용하였다. 세제는 보통 매매되는 액체 세제(pH 7.5)로 4 g/l로 사용하였다. 세탁물을 15℃에서 40℃까지 세탁하였다(2℃/분으로 머무는 시간 22.5분).

본 발명에 따른 프로테아제를 첨가하지 아니한 기본 세제조성만으로 세탁한 테스트 직물의 레프렉션 값은 50으로 측정되었다. 본 발명에 따른 프로테아제 P46을 첨가한 경우, 테스트 직물의 레프렉션 값이 62을 나타냈다.

[실시예 6d]

본 발명에 따른 프로테아제 P46의 세정 능력을 실시예 6c에 서술된 방법과 같이 행하였다. 테스트 직물로 난황 및 인디아 잉크로 오염시킨 폴리에스테르-면-혼방-직물을 사용하였다.

본 발명에 따른 프로테아제를 첨가하지 아니한 기본 세제조성만으로 세탁한 테스트 직물의 레프렉션 값은 41로 측정되엇다. 본 발명에 따른 프로테아제 P46을 첨가한 경우, 테스트 직물의 레프렉션 값이 45를 나타냈다.

[실시예 6e]

본 발명에 따른 프로테아제 P46의 세정 능력을 실시예 6d에 서술된 방법과 같이 행하였다. 테스트 직물로 우유 및 인디아 잉크로 오염시킨 폴리에스테르-면-혼방 직물을 사용하였다.

본 발명에 따른 프로테아제를 첨가하지 아니한 기본 세제조성만으로 세탁한 테스트 직물의 레프렉션 값은 45로 측정되었다. 본 발명에 따른 프로테아제 P46을 첨가한 경우, 테스트 직물의 레프렉션 값이 52를 나타냈다.

실시예 6a 에서 6e 까지의 결과는 본 발명에 따른 프로테아제 P46의 월등한 세정능력을 나타내 준다. 본 발명에 따른 프로테아제 P46의 우수한 세정능력을 나타내는 지표로서, 본 발명에 따른 프로테아제를 첨가한 세제의 경우, 세탁된 테스트 직물의 레프렉션 정도가 확실히 높다는 것을 보면 알 수 있다. 여러 종류의 단백질 오염물이 프로테아제 P46에의해 테스트 직물로 부터 제거된다.

[실시예 7]

[프로테아제 P415의 세정 능력 시험]

본 발명에 따른 프로테아제 P415의 세정 능력 시험을 프로테아제 P46에 관한 실시예 6에 서술된 방법으로 행하였다.

[실시예 7a]

효소의 첨가량(DU/ml)에 따른 세정능력에 관하여 두 종류의 테스트 직물(M-PC = 우유/인디아 잉크로 오염된 폴리에스테르-면-혼방 직물, EY-PC = 난황/먹물로 오염된 폴리에스테르-면-혼방 직물)에 대해 실험하였다. 세제는 보통 매매되는 유럽 산의 액상 세제를 사용하였다. 세탁된 테스트 직물의 레프렉션 정도는 실시예 6에 서술된 바와 같이 측정하였다. 세탁 실험의 결과는 제9도(시험직물이 M-PC인 경우) 및 제10도(시험직물이 EY-PC인 경우)에 나타내었다. 여기서는, 본 발명의 프로테아제 P415를 첨가하지 않은 경우로부터 점차적으로 프로테아제 P415를 첨가하여 이때의 레프렉션 차이를 효소량에 따른 기능으로 나타내었다.

[실시예 7b]

본 발명에 따른 프로테아제 P415의 세정 능력 측정을 실시예 7a에 서술된 방법과 같이 행하였다. 세제는 보통 매매되는 유럽산 콤팩트 세제(pH 10.3)를 사용하였다. 첨가량은 3 g/l였다. 세탁실험의 결과는 효소 첨가량이 레프렉션 차이에 미치는 영향으로 제11도에 나타냈다.

실시예 7a와 7b의 결과는 본 발명에 따른 프로테아제 P415가 적은량의 첨가로도 우수한 세정능력을 나타낸다는 것을 보여준다. 여러 종류의 단백질 오염물이 세탁과정중 프로테아제 P415에 의해 테스트 직물로부터 제거된다.

Claims

바실러스 퓨미루스 DSM 5777 혹은 다음과 같은 특성을 지닌 알칼리성 프로테아제를 암호화 하는 DNA 서열을 지닌 형질전환된 박테리아의 배양을 통하여 얻어지며, 다음과 같은 특성을 지닌 알카리성 바실러스-프로테아제 :(1) 기능 : 단백질 및 펩타이드의 분해(2) 최적 pH : pH 10.5 - 11.0(3) pH 안정성 : pH 9.7 - 10.8에서 잔존 역가가 최소 90% 임(4) 최적온도 : 60℃(5) 열 안정성 : 프로테아제를 45℃까지의 온도에서 15 분간 방치후에도 효소역가에 별다른 영향을 주지 않는다 ; 50℃까지의 온도에서 15 분간 방치 후 효소의 잔존역가는 최소 90 % 에 달한다.
바실러스 퓨미루스 DSM 5777 혹은 다음과 같은 특성을 지닌 알칼리성 프로테아제를 암호화 하는 DNA 서열을 지닌 형질전환된 박테리아의 배양을 통하여 얻어지며, 다음과 같은 특성을 지닌 알카리성 바실러스-프로테아제 :(1) 기능 : 단백질 및 펩타이드의 분해(2) 최적 pH : pH 8.5 - 9.0(3) pH 안정성 : pH 5.5 - 10.8에서 잔존 역가가 최소 90% 임(4) 최적온도 : 50℃(5) 열 안정성 : 프로테아제를 40℃까지의 온도에서 15 분간 방치후에도 효소역가에 별다른 영향을 주지 않는다 ; 45℃까지의 온도에서 15 분간 방치 후 효소의 잔존역가는 최소 95 % 에 달한다.
제1항 또는 제2항에 따른 알카리성 바실러스-프로테아제가 함유된 세탁, 세정 또는 식기 세정제를 위한 조성물.
제3항에 있어서, 통상 세제와 세정제에 존재하는 프로테아제, 아밀라제, 리파제, 펙틴아제, 뉴클리아제, 옥시도 리덕타제(Oxido-reductase) 및 셀룰라제로 이루어진 군으로 부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 효소 존재하에서 알칼리성 바실러스-프로테아제가 함유된 조성물.
제4항에 있어서, 제 2의 다른 프로테아제 존재하에서 알칼리성 바실러스-프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 제1항 또는 제2항에 따른 두개의 알칼리성 바실러스-프로테아제의 조합을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 제1항에 따른 알칼리성 바실러스-프로테아제와 제3항에 따른 알칼리성 바실러스-프로테아제를 혼합하여 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 60℃ 까지의 낮은 온도 사용에 대한 제제에 알칼리성 바실러스-프로테아제가 함유됨을 특징으로 하는 조성물.
바실러스 퓨미루스 DSM 5777을 배양하여 생성된 알칼리성 프로테아제를 배지 상등액에서 분리하는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항의 알칼리성 바실러스 프로테아제를 생산하는 방법.
기탁번호 DSM 6879인 박테리아.
기탁번호 DSM 6879인 박테리아로 부터 분리되고, 제1항에 따른 프로테아제로 암호화 하는 DNA 서열을 지닌 프라즈미드.
기탁번호 DSM 6880인 박테리아로 부터 분리되고, 제2항에 따른 프로테아제를 암호화 하는 DNA 서열을 지닌 프라즈미드.
제3항에 있어서, 60℃ 까지의 낮은 온도 사용에 대한 제제에 알칼리성 바실러스-프로테아제가 함유됨을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 따른 알칼리성 프로테아제를 암호화 하는 DNA 서열을 지닌 박테리아를 배양하고 생성된 알칼리성 프로테아제를 배지 상등액에서 분리하는 것을 특징으로 하는 제2항의 알칼리성 바실러스 프로테아제를 생산하는 방법.
제2항에 따른 알칼리성 프로테아제를 암호화 하는 DNA 서열을 지닌 박테리아를 배양하고 생성된 알칼리성 프로테아제를 배지 상등액에서 분리하는 것을 특징으로 하는 제3항의 알칼리성 바실러스 프로테아제를 생산하는 방법.
제14 또는 제15항에 있어서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 알카로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아미로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquenfaciens) 또는 바실러스 퓨미루스(Bacillus pumilus) 가 박테리아로 사용된 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 발현벡터 상에 상기 DNA 서열을 지닌 박테리아가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 발현벡터가 기탁번호 DSM 6879인 박테리아로 부터 분리된 프라즈미드, 또는 기탁번호 DSM 6880인 박테리아로 부터 분리된 프라즈미드인 것을 특징으로 하는 방법.
기탁번호 DSM 6880인 박테리아.