BRPI0718226A2 - Composições de enzimas livres de celulase e células hospedeiras para produzir as mesmas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES DE ENZIMAS LIVRES DE CELULASE E CÉLULAS HOSPEDEIRAS PARA PRODUZIR AS MESMAS".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona células bacterianas recombi-

nantes para a produção de uma proteína aditiva para detergentes (deter- gent-additive protein). Em algumas modalidades, as células são do gênero Bacillus. Em modalidades adicionais, as células compreendem um genoma que compreende um gene bglC desativado, assim como um ácido nucleico recombinante para a produção de pelo menos uma proteína aditiva para de- tergentes secretada (secreted detergent additive protein). Em algumas mo- dalidades preferidas, a proteína aditiva para detergentes secretada é uma protease. A presente invenção também proporciona métodos para a utiliza- ção das células bacterianas para produzir pelo menos uma proteína aditiva para detergentes, assim como composições livres de celulase contendo pelo menos uma proteína aditiva para detergentes. ANTECEDENTES

A expressão e a produção recombinante de polipeptídeos exó- genos é uma técnica amplamente utilizada. É de conhecimento geral que células podem ser transformadas com ácido nucleico codificador de polipep- tídeos exógenos de interesse para a expressão e produção de grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Em algumas aplicações, os méto- dos são usados para produzir vastas quantidades de polipeptídeos em com- paração com as quantidades que seriam produzidas naturalmente pelo or- ganismo de origem. De fato, a expressão de seqüências de ácido nucleico exógenas, assim como a superexpressão de seqüências endógenas, vêm sendo amplamente utilizadas na biotecnologia moderna.

Em alguns casos, produtos indesejáveis são produzidos junto com a proteína de interesse. Por exemplo, na produção de uma enzima re- combinante (p. ex., uma protease, amilase ou afim), outras enzimas, indese- jáveis, (p. ex., celulases) podem também ser produzidas.

A despeito de avanços da biologia molecular e da engenharia de proteínas, persiste a necessidade de métodos e composições que reduzam, mesmo que não eliminem, tais atividades indesejáveis. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona células bacterianas recombi- nantes para a produção de uma proteína aditiva para detergentes. Em algu- mas modalidades, as células são do gênero Bacillus. Em modalidades adi- cionais, as células compreendem um genoma que compreende um gene bglC desativado, assim como um ácido nucleico recombinante para a produ- ção de pelo menos uma proteína aditiva para detergentes secretada. Em algumas modalidades preferidas, a proteína aditiva para detergentes secre- tada é uma protease. A presente invenção também proporciona métodos para a utilização das células bacterianas para produzir pelo menos uma pro- teína aditiva para detergentes, assim com composições livres de celulase contendo pelo menos uma proteína aditiva para detergentes. A presente invenção proporciona células hospedeiras de Bacillus

sp compreendendo um genoma compreendendo um gene bglC desativado na qual a célula compreende ainda um ácido nucleico recombinante para a produção de uma proteína aditiva para detergentes secretada. Em algumas modalidades preferidas, o gene bglC desativado contém uma deleção, uma inserção, uma substituição ou um rearranjo. Em algumas modalidades prefe- ridas alternativas, a célula de Bacillus sp é uma célula de B. licheniformis. B. subtilis, B. clausii, B. alkalophilus ou B. halodurans. Em ainda outras modali- dades preferidas, a proteína aditiva para detergentes secretada é uma enzi- ma selecionada entre uma protease, uma amilase, uma pectina Iiase e uma lipase. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima é uma protease. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a protease é uma subtilisina. Em ainda outras modalidades preferidas, o gene bglC codifi- ca um polipeptídeo que é pelo menos 80% idêntico à SEQ ID NO:2.

A presente invenção também proporciona culturas de células compreendendo meio de cultura e uma célula hospedeira Bacillus sp recom- binante compreendendo um genoma compreendendo um gene bglC desati- vado; nessa invenção, a célula compreende ainda um ácido nucleico recom- binante para a produção de uma proteína aditiva para detergentes secreta- da. Em algumas modalidades preferidas, o gene bglC desativado contém uma deleção, uma inserção, uma substituição ou rearranjo. Em algumas modalidades preferidas alternativas, a célula Bacillus sp é uma célula de B.

Iicheniformis, B. subtilis, B. clausii, B. alkalophilus ou B. halodurans. Em mo- dalidades preferidas adicionais, a proteína aditiva para detergentes secreta- da é uma enzima selecionada entre uma protease, uma amilase, uma pecti- na liase, uma aciltransferase, uma arilesterase e uma lipase. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima é uma a protease. Em algumas modalidades mais particularmente preferidas, a protease é uma subtilisina. Em ainda outras modalidades preferidas, o gene bglC codifica um polipeptídeo pelo menos 80% à SEQ ID NO:2.

Além disso, a presente invenção proporciona métodos que com- preendem a manutenção da cultura celular sob condições adequadas à pro- dução da proteína aditiva para detergentes secretada. Em algumas modali- dades, os métodos compreendem ainda a recuperação da proteína aditiva para detergentes secretada do meio de cultura. Em modalidades adicionais, os métodos compreendem ainda a combinação da proteína aditiva para de- tergentes secretada com um detergente para a lavagem de roupas. Em ain- da outras modalidades preferidas, a proteína aditiva para detergentes secre- tada é uma protease de subtilisina.

A presente invenção também proporciona uma proteína ou com- posição enzimática livre de celulase produzida pelos métodos aqui apresen- tados. Em algumas modalidades preferidas, a composição compreende uma proteína aditiva para detergentes secretada produzida por um Bacillus speé caracterizada pelo fato de que a composição não apresenta atividade celulá- sica detectável.

A presente invenção proporciona ainda um detergente para la- vagem de roupas livre de celulase compreendendo uma proteína aditiva pa- ra detergentes secretada produzida pelos métodos aqui apresentados. Em algumas modalidades, o detergente para lavagem de roupas livre de celula- se compreende um polímero celulósico. A presente invenção também proporciona métodos para produzir uma célula hospedeira, compreendendo a introdução de um primeiro ácido nucleico recombinante em uma célula de Bacillus sp, de maneira que o ácido nucleico recombinante se recombine com o gene bglC da célula, e a introdu- ção de um segundo ácido nucleico recombinante na célula que promova a expressão da proteína aditiva para detergentes secretada. Em algumas mo- dalidades preferidas, o ácido nucleico se insere no gene bglC. Em algumas modalidades preferidas alternativas, o ácido nucleico deleta pelo menos uma porção do gene bglC. Em ainda outras modalidades preferidas, a proteína aditiva para detergentes secretada é uma subtilisina. BREVE DESCRIÇÃO DAS GRAVURAS

Certos aspectos da descrição detalhada a seguir são melhor compreendidos quando lidos em conjunto com as gravuras que a acompa- nham. Deve ser enfatizado que, de acordo com a prática usual, as várias características das gravuras não estão em escala. Em vez disso, as dimen- sões das várias características estão arbitrariamente expandidas ou reduzi- das para fins de clareza. Incluídas nas gravuras estão as seguintes figuras:

As Figuras 1A-B proporcionam a estratégia empregada para construir uma célula hospedeira de Bacillus compreendendo um gene bglC desativado.

A Figura 2 proporciona um gráfico que mostra os resultados dos testes de viscosidade dos sobrenadantes das culturas de duas cepas de Ba- cillus subtilis contendo um gene bglC desativado (ou seja, "hospedeira A" e "hospedeira B") e duas cepas de Bacillus subtilis contendo um gene bgIS desativado (ou seja, "hospedeira C" e "hospedeira D"). A viscosidade do flui- do foi medida em centipoise (ou seja, cP).

A figura 3 é um gráfico mostrando os resultados de testes de viscosidade nos sobrenadantes das culturas de duas cepas de Bacillus sub- tilis produtoras de subtilisina recombinante. A cepa MDT-05-28 tem um gene bglC desativado, enquanto a cepa MTD-04-250 contém gene bglC de tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona células bacterianas recombi- nantes para a produção de uma proteína aditiva para detergentes. Em algu- mas modalidades, as células são do gênero Bacillus. Em modalidades adi- cionais, as células compreendem um genoma contendo um gene bglC desa- tivado, assim como um ácido nucleico recombinante para a produção de pe- lo menos uma proteína aditiva para detergentes secretada. Em algumas mo- dalidades preferidas, a proteína aditiva para detergentes secretada é uma protease. A presente invenção também proporciona métodos para usar as células bacterianas para produzir pelo menos uma proteína aditiva para de- tergentes, assim como composições livres de celulase contendo pelo menos uma proteína aditiva para detergentes.

Exceto se de outra forma indicado, a prática da presente inven- ção envolve técnicas convencionais usadas comumente nos campos da bio- logia molecular, microbiologia, purificação de proteínas, engenharia de prote- ínas, sequenciamento de proteínas e DNA e DNA recombinante, que se si- tuam dentro dos limites daquele versado na técnica. Tais técnicas são co- nhecidas por aqueles versados na técnica e estão descritas em numerosos textos e obras de referência (ver, p. ex., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição (Cold Spring Harbor), [1989]) e Au- subel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" [1987]). Todas as pa- tentes, pedidos de patente, artigos e publicações aqui mencionadas, tanto supra quanto infra, são aqui expressamente incorporadas por referência.

Ademais, as orientações aqui proporcionadas não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tomadas como referência para a especificação como um todo. De acordo com isso, os termos definidos imediatamente abaixo são mais integralmente descritos por referência às especificações como um todo. Ainda assim, de maneira a facili- tar a compreensão da invenção, certo número de termos é definido abaixo. Definições

Exceto se definido de outra forma neste, todos os termos técni-

cos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendido por aquele medianamente versado na técnica à qual essa inven- ção diz respeito. Por exemplo, Singleton e Sainsbury1 Dictionary of Microbio- Iogy and Molecular Biology, segunda edição, John Wiley and Sons, NY (1994) e Hale e Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionam àqueles versados na técnica dicionários gerais de muitos dos termos aqui utilizados. Ainda que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos encontrem uso na prática da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descri- tos aqui.

Em conformidade com isso, os termos definidos imediatamente abaixo são mais integralmente descritos por referência à especificação como um todo. Além disso, tais como utilizados aqui, os termos singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem a referência ao plural exceto quando o contexto cla- ramente indicar de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a uma "cé- lula hospedeira" inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras. Da mesma forma, referência a "um gene" inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos e referência a "a célula" inclui referência a uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas por aqueles versados na técnica e assim por diante.

As faixas numéricas incluem os números que definem as faixas. De fato, pretende-se que todo limite numérico máximo fornecido nessa es- pecificação inclua todo limite numérico inferior, como se esses limites numé- ricos inferiores estivessem expressamente escritos aqui. Todo limite numéri- co mínimo fornecido nessa especificação incluirá todos os limites numéricos superiores, como se esses limites numéricos superiores estivessem expres- samente escritos neste. Sempre que uma faixa de valores for fornecida nes- sa especificação, ela incluirá todas as faixas de valores intermediárias que caírem nos limites da faixa de valores mais ampla mencionada, como se es- sas faixas numéricas mais estreitas estivessem expressamente escritas a- qui. Quando uma faixa de valores for proporcionada, entende-se que todos os valores intermediários, até a décima parte da unidade do limite inferior, também estará (a menos que o contexto claramente dite o contrário) especi- ficamente revelada entre o limite superior e o inferior da faixa. Os limites su- perior e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente inclu- ídos ou excluídos da faixa, e cada faixa na qual um, nenhum ou ambos limi- tes estejam incluídos nas faixas menores também está incluída na invenção, sujeita a qualquer limite especificamente excluído na faixa nomeada. Quan- do a faixa nomeada incluir um ou ambos limites, faixas excluindo um ou am- bos desses limites incluídos também estarão incluídos na invenção.

Todos os documentos citados estão, no que for relevante, incor- porados aqui por referência; a citação de qualquer documento não deve ser compreendida como uma admissão de que ele é um antecedente no que diz respeito à presente invenção. Nenhuma parte deste documento deve ser entendida como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de anteceder tal publicação em virtude de invenção prévia. Todas patentes e publicações, incluindo todas as seqüências reveladas nessas patentes e pu- blicações, aqui referidas estão expressamente incorporadas por referência. Ainda que quaisquer métodos e materiais adequados similares

ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, exemplos de métodos e materiais preferidos são agora descritos.

Exceto se de outra forma indicado, os ácidos nucleicos são es- critos da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; seqüências de a- minoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amina para carboxila, respectivamente. As orientações aqui proporcionadas não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tomados como referência para as especificações como um todo. Deve ser entendido que essa invenção não se limita à metodologia, protocolos e rea- gentes específicos descritos, uma vez que estes podem variar dependendo do contexto no qual forem utilizados por aqueles versados na técnica. Da mesma maneira, os termos definidos imediatamente a seguir são mais inte- gralmente descritos por referência à especificação como um todo. Como utilizado aqui, o termo "recombinante" se refere a um poli-

nucleotídeo ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Uma molécula recombinante pode conter duas ou mais sequên- cias de ocorrência natural que estão ligadas de uma maneira que não ocorre naturalmente. Uma célula recombinante contém um polinucleotídeo ou poli- peptídeo recombinante.

Como utilizado aqui, o termo "heterólogo" se refere a elementos que não se associam naturalmente uns com os outros. Por exemplo, se uma célula hospedeira produz uma proteína heteróloga, essa proteína não é nor- malmente produzida por essa célula hospedeira. Da mesma forma, um pro- motor que está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora hete- róloga é um promotor que está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora à qual ele em geral não está operacionalmente ligado em uma célula hospedeira de tipo selvagem.

Como utilizado aqui, o termo "homólogo" quando usado em refe- rência a um polinucleotídeo ou proteína, se refere a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são utilizados aqui de ma-

neira intercambiável.

Como utilizado aqui, uma "seqüência sinalizadora" é uma se- qüência de aminoácidos presente na porção N-terminal de uma proteína que facilita a secreção da forma madura da proteína no lado de fora da célula. A definição de uma seqüência sinalizadora é funcional. A forma madura da proteína extracelular não contém a seqüência sinalizadora, que é clivada durante o processo de secreção.

Como utilizado aqui, uma "seqüência codificadora" é um seg- mento de DNA que codifica um polipeptídeo. Como utilizado aqui, um "gene desativado" é um loco de um ge-

noma que, antes da sua desativação, era capaz de produzir uma proteína (isto é, capaz de ser transcrito em RNA que podia ser traduzido para produ- zir um polipeptídeo inteiro). Um gene codificador de uma enzima é desativa- do quando não é transcrito e traduzido em uma proteína cataliticamente ati- va inteira. Um gene pode ser desativado mediante a alteração de uma se- qüência necessária à sua transcrição, por exemplo mediante a alteração de uma seqüência exigida para o processamento do RNA (p. ex., poliadenila- ção), ou mediante a alteração de uma seqüência necessária para a tradu- ção. Exemplos de genes desativados incluem, sem se limitar a, um gene deletado, um gene contendo uma região deletada, um gene contendo uma região rearranjada, um gene contendo uma mutação pontual desativadora ou deslocamento do quadro de leitura (frameshift) e um gene contendo uma inserção. Além disso, um gene pode também ser desativado mediante o uso de tecnologia antissenso ou qualquer outro método que cancele sua expres- são.

Como utilizado aqui, "ácido nucleico" compreende DNA, RNA, sejam de fita única ou de fita dupla, e compreende DNA e RNA quimicamen- te modificados. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são utilizados aqui de maneira intercambiável.

Como utilizado aqui, o termo "vetor" se refere a um polinucleotí- deo concebido para introduzir ácidos nucleicos em uma ou mais células hospedeiras. Em modalidades preferidas, os vetores se replicam de maneira autônoma em diferentes células hospedeiras. O termo pretende compreen- der, sem se limitar a, vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores bifuncionais, plasmídeos, partículas de fagos, cassetes e afins.

Um "vetor de expressão", tal como aqui utilizado, se refere a um construto de DNA que compreende uma região codificadora de proteína ope- racionalmente ligada a uma seqüência controladora adequada capaz de efe- tuar a expressão da proteína em uma célula hospedeira apropriada. Em al- gumas modalidades, tais seqüências controladoras incluem um promotor que efetua a transcrição, uma seqüência operadora opcional para controlar a transcrição para produzir mRNA, uma seqüência codificadora de sítios apro- priados de ligação do ribossoma ao mRNA e enhancers e seqüências que controlam o término da transcrição e da tradução.

Como aqui utilizado, o termo "promotor" se refere a uma se- qüência regulatória que inicia a transcrição de um ácido nucleico à jusante. Como aqui utilizado, o termo "operacionalmente ligado(a)" se

refere a um arranjo de elementos que lhes permite estar funcionalmente re- lacionados. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se ele controla a transcrição da seqüência.

Como aqui utilizado, o termo "marcador seletivo" se refere a uma proteína capaz de se expressar em um hospedeiro que permite facilidade de seleção daqueles hospedeiros contendo um ácido nucleico ou vetor introdu- zido. Exemplo de marcadores selecionáveis incluem, sem se limitar a, anti- microbianos (p. ex., higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tais como uma vantagem nutricional, à célula hospedeira.

Como aqui utilizado, o termo "derivado" engloba os termos "ori- ginado de", "obtido" ou "obtenível de" e "isolado de".

Como aqui utilizado, um organismo "não-patogênico" é um orga- nismo que não é patogênico para os humanos e/ou outros animais.

Os termos "recuperado", "isolado" e "separado" como aqui utili- zados, referem-se a uma proteína, célula, ácido nucleico ou aminoácido re- movido de pelo menos um componente com o qual está naturalmente asso- ciado.

Como aqui utilizados, os termos "transformado", "estavelmente transformado" e "transgênico", quando utilizados em referência a uma célula, significam que a célula contém uma seqüência de ácido nucleico não-nativa (ou seja, heteróloga) integrada ao seu genoma ou como um plasmídeo epis- sômico mantido através de múltiplas gerações.

Como aqui utilizado, o termo "expressão" se refere ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na seqüência de ácido nu- cleico de um gene. O processo inclui tanto a transcrição quanto a tradução. Como aqui utilizado, o termo "introduzido", no contexto da inser-

ção de uma seqüência de ácido nucleico em uma célula, significa "transfec- ção", "transformação" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de uma seqüência de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica na qual a seqüência de ácido nucleico pode ser incorporada no genoma da célula (p. ex., cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), con- vertido em uma réplica autônoma ou temporariamente expressado (p. ex., mRNA transfectado). Como aqui utilizado, o termo "hibridização" se refere ao proces- so pelo qual um filamento de ácido nucleico se une a um filamento comple- mentar mediante pareamento de bases, como é de conhecimento na técni- ca. Um ácido nucleico é considerado "seletivamente hibridizável" a uma se- quência de ácido nucleico de referência quando as duas seqüências se hi- bridizam especificamente uma a outra sob condições de hibridização e de lavagem de moderadas a rigorosas. Condições de hibridização e de lavagem de moderadas a rigorosas são conhecidas daqueles versados na técnica (ver, p. ex., Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Bioloqy. 3a edição, Wiley & Sons, Hoboken, NJ [1995]; e Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. 3a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, NY [2001]). Um exemplo de condições altamente rigorosas inclui a hibridização a cerca de 42°C em 50% de formamida, 5 X SSC, 5X solução de Denhardt, 0,5% SDS e 100 ug/ml de DNA carreador desnaturado seguido de duas lavagens em 2X SSC e 0,5 % SDS a temperatura ambiente e duas vezes adicionais em 0,1 X SSC e 0,5% SDS a 42°C.

Como aqui utilizado, o termo "polímero celulósico" se refere a uma celulose, hemicelulose ou celulose modificada ou polímeros de hemice- Iulose que compreendem pelo menos uma ligação glicosídica (1-4)-beta-D. Como aqui utilizado, o termo "celulose" se refere a um polímero

polissacarídico compreendendo resíduos glicosídicos unidos por ligações beta-, 14.

Como aqui utilizado, o termo "hemicelulose" se refere a um po- límero polissacarídico compreendendo pelo menos um resíduo sacarídico não glicosídico (p. ex., xilose, galactose, arabinose, ramnose, manose, ácido urônico ou ácido galacturônico ou xilanas) unido por uma ligação beta-(1,4). As hemiceluloses incluem xilana, glicuronoxilana, arabinoxilana, arabinoga- lactana, glucomanan, xiloglicanas e galactomana).

Como aqui utilizado, o termo "celulase" se refere a uma enzima que hidrolisa as ligações glicosídicas (1-4)-beta-D da celulose, líquen e beta- D-glucanos dos cereais. A celulase aqui descrita tem uma atividade descrita como EC 3.2.1.4, de acordo com a nomenclatura enzimática da IUMBM (U- nião Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular). O nome sistemático da celulase aqui descrita é 1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 4-glucanohidrolase.

Como aqui utilizado, o termo "Bacillus sp." (p. ex., uma célula hospedeira do Bacillus) se refere a qualquer espécie do gênero Bacillus in- cluindo, sem se limitar a, B. subtilis, B, Iicheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halo- durans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. Iautus e B. thuríngien- sis, assim como subespécies dos mesmos.

Como aqui utilizado, o termo "Bacillus sp. livre de celulase" se refere a uma célula hospedeira de Bacillus sp. modificada por engenharia genética que não secreta uma quantidade detectável de celulase. Como se- rá discutido em maior detalhe abaixo, em algumas modalidades, uma cepa livre de celulase de Bacillus pode conter um gene bglC desativado.

Como aqui utilizado, uma "cepa de Bacillus sp. não alterada e- quivalente" se refere à cepa hospedeira idêntica a uma cepa de Bacillus sp. livre de celulase, exceto pelo fato de o gene bglC não estar alterado (isto é, é de tipo selvagem).

Como aqui utilizado, "cultivo" se refere a cultivar uma população de células microbianas sob condições adequadas em um meio líquido ou sólido. Em algumas modalidades, "cultivo" se refere à produção recombinan- te fermentativa de uma proteína exógena de interesse ou outros produtos finais desejados (normalmente em um recipiente ou reator).

Como aqui utilizado, uma "proteína aditiva para detergentes" se refere a uma proteína a ser adicionada a detergente para lavar roupas. Uma proteína aditiva para detergentes pode ser uma enzima (p. ex., uma protea- se, amilase, pectina liase, lipase, aciltransferase, arilesterases ou uma prote- ína que não tem atividade enzimática). Em algumas modalidades particular- mente preferidas, hidrolases beta-glucano (isto é, enzimas com uma ativida- de descrita como EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.32, EC 3.2.1.72, EC. 3.2.1.136, de acordo com a nomenclatura enzimática da IUMBM), estão especificamente excluídas do termo "proteína aditiva para detergentes". Em modalidades par- ticularmente preferidas adicionais, xilanases (isto é, enzimas com uma ativi- dade descrita como EC 3.2.1.75, de acordo com a nomenclatura enzimática da IUMBM) também estão especificamente excluídas do termo "proteína adi- tiva para detergentes".

Outras definições de termos podem surgir no curso da especifi-

cação.

Antes de os exemplos de modalidades serem descritos com maior detalhe, deve ser compreendido que a presente invenção não se limita a modalidades particulares descritas, uma vez que estas podem, é claro, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia aqui utilizada serve ao propósito de descrever apenas modalidades particulares e não pre- tende ser limitadora. Células hospedeiras

Como indicado acima, a presente invenção proporcionada uma célula hospedeira de Bacillus sp. que produz níveis reduzidos (p. ex., inde- tectáveis) de celulase. Em termos gerais, a célula hospedeira de Bacillus sp. em questão normalmente produz menos que cerca de 50% (p. ex., menos do que cerca de 40%, menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 20% ou menos do que cerca de 10%) da celulase produzida por uma célula hospedeira de Bacillus sp. de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a célula em questão produz menos do que cerca de 5% da celulase de uma célula hospedeira de Bacillus sp. equivalente. Em algumas modalidades par- ticularmente preferidas, a celulase é indetectável (isto é, a célula hospedeira de Bacillus sp. é uma célula hospedeira de Bacillus sp. livre de celulase). Pretende-se que a atividade de produção de celulase seja medida por um método adequado conhecido, por exemplo, pela coloração de placas de ágar LP contendo celulose com vermelho do Congo (ver, p. ex., Wolf et al., Mi- crobiol., 141:281-290 [1995]; e Carder, Anal. Biochem. 153:75-9 [1986]), e/ou mediante um teste de viscosidade, como descrito com mais detalhes abaixo.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira de Bacillus sp.

que produz uma quantidade reduzida de celulase é produzida pela redução da expressão do produto do gene bglC pela célula. Em tais modalidades, a expressão do bglC é reduzida em uma célula hospedeira de Bacillus sp. u- sando-se qualquer método adequado, incluindo, sem se limitar a, métodos que empregam moléculas antissenso, ou ribozimas, por exemplo. Em algu- mas modalidades preferidas, a expressão do bglC é reduzida pela desativa- ção do gene bglC na célula.

As seqüências de DNA de diversos genes bglC do Bacillus sp. e das proteínas codificadas por esses genes foram determinadas e deposita- das no banco de dados Genbank do NCBI. A seqüência é fornecida abaixo:

ATGAAACGGTCAATCTCTATTnTATTA CGTGTTTATTGATTACGTTATTGACAATGQ

GCGGCATGATAGCTTCGCCGGCATCAGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCCAAG

AATGGCCAGCTTAATAAAAGGTACACAGCTCGTTAACCGAGACGGTAAAGCGGTAC

AGCTGAAGGGGATCAGTTCACACGGATTGCAATGGTATGGAGAATATGTCAATAAA

GACAGCTTAAAATGGCTGAGAGATGATGGGTATCACCGTTTTCCGTGCAGCGATGTA

TACGGCAGATGGCGGTTATATTGACAACCCGTCCGTGAAAAATAAAGTAAAAGAAG

CGGTTGAAGCGGCAAAAGAGCTTGGGATATATGTCATCATGATGGCATATCTTAAAT

GACGGTAATCCAAACCAAAATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTCTTCAAGGAAATGTC

AAGCCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAA1TGCAAACGAACCAACX3G

GATGTGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCATATGCGGAAGAAGTGATTTCAGTTATC

CGCAAAAATGATCCAGACAACATCATCATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAGGA

TGTGAATGATCTGCGATGACCAGCTAAAAGATGCAAACGTTATGTACGCACTTCATT

TTTATGCCGGCACGCACGGCCAATTTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGCA

AAGGAGCACCTATTTTTGTGACGAGTGGGAACAAGCGACGCGTCTGGCAATGGCGG

TGTATTCCTTGATCAATCGAGGGAATGGCTGAAATATCTCGACAGCAAGACCATTAG

CrGGGTGAACTGGAATCTTTCTGATAAGCAGGAATATCCTCGCTTTAAAGCCGGGGG

CATCTAAAACAGGCGGCTGGCGGTTGTCAGATTTATCTGCTTCAGGAACATTCGTTA

GAGAAAACATTCTCGGCACCAAAGATTCGACGAAGGACATTCCTGAACGCCATCAA

AGATAAACCCACACAGGAAAATGGTATTrCTGTACAGTACAGAGCAGGGGATGGGA

GTATGAACAGCAACCAAATCCXjTCCGCAGCTICAAATAAAAAATAACGGCAATACC

ACGGTGATTTAAAGATGTCACTGCCCGTTACTGGTATAAAGCGAAAAACAAAGGCC

AAAACTTTGACTGTGACTACGCGCAGAITGGAIGCGGCAATGTGACACACAAGTTTG

TGACGTTGCATAAACCAAGCAAGGTGCGATACCT ATCTGGAACTrGGATrr AAAAAC

GGAACGTTGGCACCGGGAGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTCCGTCTTCACAATGA

TGACTGGAGCAATTATGCACAAAGCX5GCGATATTCCTTTTTAAATCAAATACGTTTA

AAACAACGAAAAAAATCACATTATATGATCAAGGAAAACTGATTTGGGGAACAGAA

CCAAATTAG (SEQ ID HO:l)

A seqüência abaixo é a seqüência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO:1.

MKRSISIFrrCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSnCGTQLVNRIXJKAVQLKGrSSHG LXJWYGEYVNKDSLKWLRDDWOITWJRAAMYTADGGYlDNPSVKNKVKEAVEAAKELGrYVI WHn^NDGNPNQNKEKAKEFFKEMSSL YGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPYAEEVISVIRK NDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAADIX^LKDANVMryALHFYAGTHGQFLRDKAWALSKGAPlFVE GTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKT1SWVNWNLSDKQESSSALKPGASKTGGWRLSDLSAS GTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQENGISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQIKNNGNTTDLD VTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIGCGNVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTG NIQLRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSN1TKTTKKITLYDQGKLIWGTEPN (SEQ ΓΟΝΟ:2)

Além disso, diversos domínios conservados de enzimas celulá- sicas foram identificados, assim como diversos aminoácidos conservados, permitindo a identificação por métodos bioinformáticos de genes bglC e pro- teínas do Bacillus sp. adicionais.

Em algumas modalidades, o gene bglC do Bacillus sp. compre- ende pelo menos 70% (p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%) de identidade de seqüência com uma seqüência de bglC depositada no banco de dados Genbank do NCBI e fornecida acima (SEQ ID NO:1). E algumas modalidades adicionais, gene bglC de Bacillus sp. se hibridiza sob condições rigorosas com uma se- qüência de bglC depositada no banco de dados Genbank do NCBI ou com a SEQ ID NO:1. Em ainda outras modalidades adicionais, o gene bglC de Ba- cillus sp. codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 70% de identidade de seqüência (p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 98% de identidade de seqüên- cia) com uma seqüência de bglC depositada no banco de dados Genbank do NCBI ou com a SEQ ID NO:2. Exemplos de seqüências de proteínas e de nucleotídeos de bglC depositadas no banco de dados Genbank do NCBI incluem: GID:3100136 (Bacillus lieheniformis), GID:52348343 (Bacillus Iiehe- niformis), GID:42491106 (Bacillus amyloliquefaeiens) e GID:50812243 (Baeil- Ius subtilis). Os números de adesão ao Genbank acima estão incorporadas por referência em sua totalidade, incluindo as seqüências de aminoácidos e de proteínas nelas contidas e as notações dessas seqüências.

Em algumas modalidades preferidas, a célula hospedeira de Ba- eillus sp. é de uma das seguintes espécies: Bacillus lieheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaeiens, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalo- philus, B. eoagulans, B. eireulans, B. pumilus, B. thuringiensis, B. elausii ou B. megaterium. As células hospedeiras de B. subtilis incluem, sem se limitar a, aquelas descritas nas patentes US 5.264.366 E 4.760.025 RE (34.606), assim como cepas 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753 até PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39.087), ATCC 21332, ATCC 6051, MM13, DE100 (ATCC 39.094), GX4931, PBT 110 e PEP 211 (ver. p. ex., Hoch et al., Genetics 73:215-228 [1973]; patente US 4.450.235; patente US 4.302.544 e EP 0134048 (ver também Paiva et al., Gene 19:81- 87 [1982] e Fahnestock e Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 [1986]; e Wang et al., Gene 69:39-47 [1988],

Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico recombinante compreendendo um cassete de expressão (isto é, um promotor, um polinucleotídeo codificador de uma proteína aditiva para detergentes e um terminador de transcrição), na qual o cassete de expres- são é suficiente para a produção da proteína aditiva para detergentes pela célula hospedeira de Bacillus sp. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é integrado ao genoma da célula hospedeira enquanto em outras modalidades o ácido nucleico recombinante está presente em um ve- tor que se replica de maneira autônoma no que diz respeito ao genoma. Em outras modalidades, o polinucleotídeo codificador da proteína aditiva para detergentes é um códon otimizado para a expressão da proteína na célula hospedeira de Bacillus sp.

Em algumas modalidades particularmente preferidas, a célula hospedeira de Bacillus é modificada para maximizar a expressão da proteí- na. Assim, em algumas modalidades, as células hospedeiras contém uma alteração desativadora em pelo menos um dos seguintes genes: degU, degS e degR e/ou deQ (ver Msadek et al., J. Bacteriol., 172:824-834 [1990] e Ol- mos et al., Mol. Gen. Genet., 253:562-567 [1997]). Em algumas modalidades particularmente preferidas, a célula hospedeira é um B. subtilis que carrega uma mutação degU32(Hy). Em algumas modalidades adicionais, a células hospedeira de Bacillus compreende uma mutação e/ou deleção no scoC4 (ver Caldwell et al., J. Bacteriol., 183:7329:7340 [2001]); spollE (ver Arigoni et al., Mol. Microbiol., 31:1407-1415 [1999]); oppA ou em outro gene no ope- ron opp (ver Perego et al., Mol. Microbiol., 5:173-185 [1991]). De fato, consi- dera-se que qualquer mutação no operon opp que cause o mesmo fenótipo que uma mutação no gene oppA encontrará uso em algumas modalidades da cepa alterada de Bacillus da presente invenção. Em algumas modalida- des, essa mutações ocorrem sozinhas, enquanto em outras modalidades estão presentes combinações de mutações. Em algumas modalidades, um Bacillus alterado da invenção é obtido de uma cepa hospedeira de Bacillus que já inclui uma mutação em um ou mais dos genes acima mencionados. Em modalidades alternativas, um Bacillus alterado da invenção é adicional- mente modificado para incluir a mutação de um ou mais dos genes mencio- nados acima.

Células hospedeiras de Bacillus sp. construídas usando qual- quer método conveniente encontram uso na presente invenção, incluindo células construídas pela alteração da seqüência do gene bglC da célula me- diante inserção, deleção, substituição, deslocamento do quadro de leitura (frameshift), mutação pontual e/ou rearranjo do gene encontram uso na pre- sente invenção. Em algumas modalidades, a porção do gene a ser alterada está dentro da região codificadora de um elemento regulador necessário pa- ra a expressão da região codificadora. Em algumas modalidades, a seqüên- cia reguladora ou controladora de um gene é uma seqüência promotora ou uma parte funcional da mesma (isto é, uma parte necessária para a expres- são do gene). Tais métodos de desativação de genes são bem conhecidos na técnica (ver, p. ex., Wolfet al, Microbiol., 141:281-290 [1995]).

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é construída por: introdução de um ácido nucleico recombinante em uma célula de Bacillus sp. de forma que o ácido nucleico recombinante se recombine com o gene bglC do genoma da célula e introdução de um segundo ácido nucleico recombi- nante na célula para proporcionar a expressão de uma proteína aditiva para detergentes secretada. Em algumas modalidades, o ácido nucleico se insere no gene bglC, enquanto em outras modalidades ele deleta pelo menos uma porção do gene bglC.

Métodos adequados para a introdução de seqüências de polinu- cleotídeos em células de Bacillus são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, p. ex., Ferrari et al., "Genetics", em Harwood et al. (ed), Ba- cillus. Plenum Publishing Corp. [1989], páginas 57-72; ver também Saunders et al., J. Bacteriol., 157:718-726 [1984]; Hoch et al., J. Bacteriol., 93:1925- 1937 [1967]; Mann et al., Curr. Microbiol., 13:131-135 [1986]; e Holubova, Folia Microbiol., 30:97 [1985]; Chang et al., Mol. Gen. Genet., 168:11-115 [1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett., 7:261-263 [1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217 [1981]; e McDonald, J. Gen. Microbiol., 130:203 [1984]). De fato, métodos tais como transformações incluindo transformação e agrega- ção de protoplastos (protoplast transformation and congression), transdução e fusão de protoplastos são conhecidos e adequados para uso na presente invenção.

Também como indicado acima, além de produzir níveis reduzi- dos (p. ex., indetectáveis) de celulase, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira de Bacillus sp. que contém adicionalmente um ácido nu- cleico recombinante para a produção de uma proteína aditiva para detergen- tes secretada, na qual uma proteína aditiva para detergentes secretada é uma proteína (p. ex., uma enzima) que é secretada pela célula e é adiciona- da a um detergente para lavagem de roupas. Exemplos de proteína aditiva para detergentes secretada incluem, sem se limitar a, proteases (p. ex., sub- tilisinas), alfa-amilases, mananases, celulases, liases, aciltransferases, ari- Iesterases e lipases, etc. Em algumas modalidades, a proteína aditiva para detergentes secretada pode ser expressada por uma cepa que é a mesma cepa da qual a proteína aditiva para detergentes secretada é derivada. Enzimas

As subtilisinas (ou seja, proteases serinas alcalinas extracelula- res), são de interesse particular. Qualquer subtilisina apropriada encontra uso na presente invenção (ver, p. ex., Siezen, Protein Sci., 6:501-523 [1997]; Bryan, Biochim. Biophys. Acta, 1543:203-222 [2000]; Maurer, Curr Op. Bio- technol., 2004 15:330-334 [2004]; e Gupta, Appl. Microbiol. Biotechnol., 59:15-32 [2002], Em algumas modalidades, a subtilisina de interesse tem uma atividade descrita como EC 3.4.4.16, de acordo com a nomenclatura enzimática da IUMBM.

Em algumas modalidades, tal subtilisina tem uma seqüência de aminoácidos que é encontrada em genomas de tipo selvagem (isto é, a sub- tilisina é uma subtilisina de ocorrência natural), enquanto em outras modali- dades a subtilisina é uma variante de uma subtilisina de ocorrência natural. Em algumas modalidades preferidas, a subtilisina variante compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica a uma subtilisina codificada por um genoma de tipo selvagem. Exemplos de subtilisinas incluem, mas não se limitam a: ALCANASE® (Novozymes), FNA™ (Genencor), SAVINASE® (Novozymes), PURAFECT™ (Genencor), KAP™ (Kao), EVERLASE™ (No- vozymes), PURAFECT OxP™ (Genencor), FN4™ (Genencor), BLAP S™ (Henkel), BLAP X™ (Henkel), ESPERASE® (Novozymes), KANNASE™ (Novozymes) e PROPERASE™ (Genencor). Em ainda outras modalidades, a subtilisina inclui, mas não se limita a, subtilisina 168, subtilisina BPN, subti- lisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 147 ou subtilisina 309 (ver, p. ex., EP414279B; WO 89/06279; e Stahl et al., Bacteriol., 159:811-818 [1984]). Subtilisinas adicionais e outras proteases que encontram uso na presente invenção incluem, mas não se limitam a, aquelas descritas em WO 99/20770; WO 99/20726; WO 99/20769; WO 89/06279; RE 34.606; patente US 4.914.031; patente US 4.980.288, patente US 5.208.158; patente US 5.310.675; patente US 5.336.611; patente US 5.399.283; patente US 5.441.882; patente US 5.482.849; patente US 5.631.217; patente US 5.665.587; patente US 5.700.676; patente US 5.741.694; patente US 5.858.757; patente US 5.880.080; patente US 6.197.567 e patente US 6.218.165.

Detergentes e proteína aditiva para detergentes

Em algumas modalidades, as células hospedeiras são usadas para fazer composições de proteínas e detergentes para a lavagem de rou- pas nas quais o detergente, em algumas modalidades preferidas, contém pelo menos um polímero celulósico. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é cultivada para

proporcionar pelo menos uma proteína aditiva para detergentes secretada no meio de cultura no qual a célula está crescendo. Em algumas modalida- des particularmente preferidas, a proteína aditiva para detergentes secretada é recuperada do meio de cultura mediante qualquer método apropriado (p. ex., precipitação, centrifugação, afinidade, filtração ou qualquer outro meio conhecido da técnica). Por exemplo, cromatografia de afinidade (Tilbeurgh et al., FESB Lett., 16:215 [1984]); métodos de cromatografia de troca iônica (Goyal et al., Bio. Technol., 36:37 [1991]; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbi- ol., 17:314 [1983]; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem., 6:336 [1984] e Ellouz et al., Chromatogr., 396:307 [1987]), incluindo troca iônica usando materiais como alto poder de resolução (ver, p. ex., Medve et al., J. Chromatogr. A 808:153 [1998]; cromatografia de integração hidrofóbica (Tomaz e Queiroz, J. Chromatogr. A 865:123 [1999]; partição bifásica (Brumbauer et. Al., Bio- separation 7:287 [1999]; precipitação com etanol; HLPC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em resina de troca catiônica como a DEAE; cro- matofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio e filtração em gel (p. ex., SEPHADEX® G-75), encontram uso.

Em algumas modalidades preferidas, a proteína aditiva para de- tergentes é usada sem purificação de outros componentes do meio de cultu- ra. Em algumas dessas modalidades, o meio de cultura é simplesmente concentrado e então usado sem purificação adicional da proteína dos com- ponentes do meio de cultura. Em outras modalidades, o meio de cultura é usado sem quaisquer modificações adicionais.

As composições de proteína produzidas usando as células hos- pedeiras em geral contêm quantidade reduzida de celulose em comparação com uma célula hospedeira de Bacillus equivalente que contenha um gene bglC não alterado (ou seja, de tipo selvagem).

Em uma modalidade, o conteúdo de celulase de uma composi- ção é avaliado pela medição da mudança na viscosidade de uma solução de um polímero celulósico (p. ex., uma solução contendo 1% de carboximetilce- Iulose (CMC)) após a adição da composição à solução. Tais métodos são bem conhecidos (ver, p. ex., Manning, Biochem. Biophys. Meth, 5:189-202 [1981] e Sheperd, Biochem. J., 193:67-74 [1981], Um exemplo de teste de viscosidade que encontra uso na presente invenção é proporcionado na se- ção Exemplos, abaixo.

Em algumas modalidades compreendendo a composição de pro- teína da presente invenção, a composição é capaz de reduzir a viscosidade de uma solução de material celulósico por menos que 80% (p. ex., menos que 50%, menos que 30%, menos que 20 ou menos que 20%), em compa- ração com a redução por uma composição de proteína equivalente usando uma célula de Bacillus com um gene bglC não alterado. Em algumas com- posições, a composição de proteína não produz uma redução detectável na viscosidade de uma solução de material celulósico, caso no qual a composi- ção de proteína é considerada uma composição de proteína "livre de célula- se .

Composições livres de proteínas encontram uso em várias apli- cações, incluindo, sem se limitar a, detergentes para lavagem de roupa, par- ticularmente aqueles detergentes que contêm polímeros celulósicos. Em al- gumas modalidades, detergentes para lavagem de roupa compreendendo a composição de proteína livre de celulase da presente invenção contêm de cerca de 1% a 80% (p. ex., 5% a 50%) (por peso) de surfactante. Em algu- mas modalidades, o surfactante, é um surfactante não-iônico, enquanto em outras modalidades ele é um surfactante catiônico, e em ainda outras moda- Iidades ele é um surfactante zwitteriônico e em modalidades adicionais ele compreende uma mistura dos mesmos (p. ex., uma mistura de surfactantes aniônicos e não iônicos). Exemplos de surfactantes incluem, mas não se limitam a, alquilbenzeno sulfonato (ABS), incluindo alquilbenzeno sulfonato linear e alquil sódio sulfonato linear, alquil-fenoxi-polietoxi-etanol (p. ex., no- nil fenoxi etoxilado ou nonilfenol), dietanolamina, trietanolamina e monoeta- nolamina. Descrições adicionais de surfactantes que encontram uso em de- tergentes para lavagem de roupas são fornecidas nas patentes US 3.664.961, US 3.919.678, US 4.222.905 e US 4.239.659.

O detergente para lavagem de roupas compreendendo a enzima livre de celulase da presente invenção encontra uso em qualquer forma (p. ex., sólida, líquida, gel, etc.). Em algumas modalidades, os detergentes para lavagem de roupas contem adicionalmente um tampão tal como carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, ou auxiliar de detergente, água sanitária, ativador de branqueamento, uma enzima, um agente estabilizador de enzi- ma, estabilizantes de espuma, supressores, agente antimanchas, agente anticorrosão, agente de suspensão de sujeira, agente de liberação de sujei- ra, germicida, agente de ajuste do pH, fonte de alcalinidade não-auxiliar, a- gente quelante, excipiente orgânico ou inorgânico, solvente, hidrótopo, alve- jante ótico, corante ou perfumes.

Como notado acima, em algumas modalidades, os detergentes para lavagem de roupas contêm um polímero celulósico (p. ex., um polímero de celulose) ou um polímero de celulose modificado. Polímeros celulósicos adequados incluem, mas não se limitam a, celulose anionicamente modifica- da, celulose não ionicamente modificada, celulose cationicamente modifica- da, celulose zwitteriniocamente modificada e misturas das mesmas, assim como celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxi- metilpropilcelulose, éster de carboximetilcelulose e qualquer (quaisquer) mis- turais) dos mesmos. Em algumas modalidades, um polímero de éster de celulose modificado (ver, p. ex., a patente US 6.833.347), ou outro polímero celulósico (ver, p. ex., as patentes US 5.009.800 e US 4.661.267) encontram uso na presente invenção. Em algumas modalidades, o detergente para la- vagem de roupas contém de cerca de 0,1% a 8% por peso (p. ex., cerca de 0,5% a 4% ou cerca de 1% a 3% de polímero celulósico). SOBRE OS EXPERIMENTOS

Os exemplos a seguir proporcionam àqueles medianamente ver- sados na técnica uma revelação e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção, mas não pretendem limitar o escopo daquilo que os inventores encaram como sua invenção, nem pretendem significar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentados realizados. Esforços foram feitos para garantir precisão no que diz respeito aos números usados (p. ex., quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser esperados. A menos que indicado de outra forma, partes são partes por peso, peso molecular é peso molecular médio, tempe- raturas estão em graus centígrados e a pressão é a nível atmosférico ou próximo dele.

Na revelação experimental abaixo, valem as seguintes abrevia-

ções: 0C (graus centígrados), rpm (rotações por minuto); H2O (água); aa (a- minoácido), bp (par de bases); Kb (par quilobase); kD (quilodaltons); gm (gramas); pg e ug (microgramas); mg(miligramas); ng (nanogramas); μΙ e ul (microlitros); ml (mililitros); mm (milímetros); nm (nanômetros); μιη e um (mi- crômetros); M (molar); mM (milimolar); μΜ e uM (micromolar); U (unidades); V (volts); MW (peso molecular); sec (segundos); min(s) (minuto/minutos);

h(s) (hora/horas); OD2So (densidade ótica a 280 nm); OD40S (densidade ótica a 405 nm); OD6oo (densidade ótica a 600 nm); PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida); LAS (lauril sulfonato de sódio); SDS (sódio dodecil sulfonato) e Tris (tris(hidroximetil)aminometano). EXEMPLO 1

Construção de uma cepa bglC::espectinomicina

A estratégia geral de deleção do gene bglC está representada nos diagramas das Figuras 1A-B. Resumidamente, fragmentos de DNA à montante e à jusante flanqueando o gene bglC foram amplificados por PCR e ligados em um vetor. O inserto foi aberto por digestão com uma endonu- clease de restrição e o cassete de espectinomicina, flanqueado por sítios IoxP1 foi ligado. O plasmídeo resultante foi Iinearizado por digestão com uma endonuclease de restrição e transformado em Bacillus. Mediante seleção com o marcador antimicrobiano introduzido (espectinomicina), a substituição do gene de interesse foi realizada por duplo cruzamento (by a double cros- sover event). No caso do bglC, a região codificadora foi substituída com o gene de resistência à espectinomicina removido com a recombinase Cre que reorganiza os sítios IoxP flanqueadores. Os construtos de DNA foram feitos mediante tecnologia de PCR usando a estratégia descrita em WO 03/083125 e mediante os iniciadores descritos na Tabela 1. Tabela 1: Iniciadores Nome do inicia- dor Sítio de restri- ção do inicia- dor Seqüência do iniciador SEQ ID NO: BgIC SacI UF IUF SacI acaaatGAGCTCgetggageattggatggcgcattcc 3 BgIC BamHl UR BamHl TgatctGGATCCccttcgcatcattttggctctacac 4 BgIC BamHl DF BamHl AaaactGGATCCgggaacagaaccaaattagttaagc 5 bglC Sall DR SaII atggtaGTCGACgcaaacgcggctaeaatatggetca 6 bglC Uout chk ttecgeggagggccggcctactata 7 bglC Dout chk catattcaeaatgcgatggtagagg 8 bglC DF chkdel Ttatgcacaaagcggcgattattcc 9 SPECchkUR: Atctcttgccagtcacgttacg 10 bglS xba UF Xba ggagtgTCTAGAactgaccagcttccgtctttccctg 11 BgIS BamHl UR BamHl ActaaeGGATCCcctgtaactatcatcatcttccctc 12 BgIS BainHl DF BamHl CaaaaaGGATCCgceaaatgtgaaagagectgctgca 13 bglS Sac DR Sac agaggtGAGCTCaccgctgattcccgctatgategoc 14 bglS Uout chk Caatatacacaatacagtgctgaaagc 15 bglS Drout chk Gcgggaatagegatgcttggttcgg 16 bglS DF chk dei Gatgaacttgtggaatggeaegggt 17 PloxBamUF TCGACGGTATCGATAAGCTGGATCCATAAC 18 ploxBamDR GCCTAGGATGCATATGGGATCCGCATAACTTC 19

Os sítios de restrição são designados como segue: Xbal é TC- TAGA (SEQ ID N0:20); BamHI é GGATCC (SEQ ID NO:21); Sacl é GAGCTC (SEQ ID NO:22); Asp718 é GGTACC (SEQ ID NO:23); Pstl é CTGCAG (SEQ ID NO:24) e Hindlll é AAGCTT (SEQ ID NO:25).

Neste método, reações de PCR de 100 μΙ foram realizadas em tubos Eppendorf de 150 μΙ contendo 84 μΙ de água, 10 μΙ de tampão PCR, 1 μΙ de cada iniciador (isto é, BgIC Sacl UF e BgIC BamHI UR, ou IoxPBa- mH1F e IoxPBamHIR), 2 μΙ de dnTPs, 1 μΙ de molde de DNA (p. ex., plas- mídeo cromossômico ou de controle de Bacillus do tipo selvagem) e 1 μΙ de DNA polimerase. As DNA polimerases usadas incluíram Taq Plus Precision e Herculase (Stratagene). As reações foram realizadas em um termociclador Hybaid PCRExpress com o seguinte programa. As amostras foram primeiro aquecidas a 94°C por 5 minutos, então resfriadas a 50°C.. A DNA polimera- se foi adicionada neste ponto. Vinte e cinco ciclos de amplificação consisti- ram de 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 50°C e 1 minuto a 72°C. Por fim, 10 mi- nutos a 72°C completaram o alongamento. As amostras foram mantidas a 4°C até a análise. As reações produziram os cassetes de DNA flanqueado- res (de aproximadamente 1 kb cada um) e o cassete de IoxPespectinomicina com sites de restrição BamHI nas extremidades 5' e 3'.

Após a conclusão do PCR1 10 μΙ de cada reação foram submeti- dos a eletroforese em um Ε-gel de agarose 1,2% da Invitrogen a 60 volts por 30 minutos para verificar a presença de uma banda de tamanho correto. To- dos os métodos de eletroforese em gel aqui descritos usaram essas condi- ções. Quando uma banda estava presente, o resto do tubo era purificado usando o kit de purificação de PCR QIAQUICK® da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante, então cortado com o par adequado de enzimas de restrição. As digestões foram realizadas a 37°C por 1 hora como uma reação de 20 μΙ consistindo de 9 μΙ de água, 2 μΙ de 10 χ ASB, 2 μΙ de um tampão de restrição NEB adequado (de acordo com o catálogo e referência técnica NEB 2000-01), 5 μΙ de molde e 1 μΙ de cada enzima de restrição. Por exemplo, o fragmento à montante do bglC foi cortado com Saci e BamHI no tampão de restrição B da NEB (New England Biolabs). Os fragmentos dige- ridos foram purificados por eletroforese em gel e extração com o kit de ex- tração QIAQUICK® da Qiagen de acordo com as instruções do fornecedor.

A ligação dos fragmentos em um vetor de plasmídeo foi realiza- da em duas etapas usando-se o kit de ligação Takara, de acordo com as instruções do fornecedor, ou T4 DNA Iigase (conteúdo da reação: 5 μΙ de cada fragmento de inserto, 1 μΙ de plasmídeo pUC19 cortado, 3 μΙ de tam- pão de T4 DNA Iigase e 1 μΙ de T4 DNA ligase). Primeiro, os fragmentos cor- tados à montante e à jusante foram ligados durante a noite a 15°C a sítios de restrição únicos do sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo pUC19 (ver Yanisch-Reman et al., Gene 33:103-119 [1985]) que tinha sido digerido com Sacl e purificado em gel, conectando no sítio BamHI comum para reconstuir um plasmídeo circular. Esse plasmídeo recircularizado foi transformado em células de E. coli competentes "Top 10" da Invitrogen usando o protocolo de transformação One Shot do fornecedor. Os transformantes foram selecionados em meio Luria-Bertani

(LB) solidificado com ágar 1,5% mais 50 ug/ml de carbenicilina contendo X- gal (Sigma) para seleção azul/branco. Os clones foram selecionados e culti- vados durante a noite a 37°C em 5 μΙ de meio Luria Bertani (LB) mais 50 ug/ml de carbenicilina e os plasmídeos foram isolados mediante o kit QIA- QUICK Mini-Prep da Qiagen. Análise de restrição com Sacl confirmou a pre- sença do inserto de 2 kb. Os plasmídeos nos quais o inserto foi confirmado foram cortados com BamHI para linearizá-los em reações de digestão, co- mo descrito acima (com 1 μΙ adicional de água em vez de uma segunda en- zima de restrição), tratados com 1 μΙ de fosfatase intestinal de bezerro ou fosfatase de camarão por 1 hora a 37° C para impedir recircularização e li- gados cassete de resistência à flanqueado por sítios IoxP digerido com Ba- mHI. Essa mistura de ligação foi transformada em células Top 10 de E. colie as colônias foram selecionadas em placas LA contendo 100 ug/ml de espec- tinomicina. A confirmação da inserção do marcador nos plasmídeos isolados foi feita como acima descrito, por análise de restrição com BamHI. Antes da transformação em B. subtilis, os plasmídeos foram Iinearizados com Scal para garantir o duplo cruzamento. EXEMPLO 2 Teste de viscosidade

As células foram cultivadas em balões de Erlenmayer de 250 ml (250 ml baffled flasks) contendo 50 ml de meio de crescimento adequados para a produção de subtilisina (ver Christianson et al., Anal. Biochem, 223:119-129 [1994]; e Hsia et al., Anal. Biochem., 242:221-227 [1996]). Os meios foram inoculados com 50 μΙ de uma cultura de 8 horas e 5 mL e culti- vados por 40 horas a 37°C com agitação a 250 RPM. As culturas da hospe- deira A (-bglC), da hospedeira B (-bglC), da hospedeira C (-bgIS) e da hos- pedeira D (-bgIS) foram cultivadas por 48 horas.

Uma amostra de 1 ml foi retirada de cada frasco agitado (shake bottle) a 37 horas. As células foram removidas por centrifugação e 60 micro- Iitros do sobrenadante foram submetidos a um teste de viscosidade. A visco- sidade foi medida a t=0, t=22 e t=120 horas. Água foi usada como controle. A viscosidade foi medida pelo seguinte método: um volume de 2

ml de material celulósico a 1 % (carboximetilcelulose) foi colocado em ampo- Ias criogênicas para cada experimento. Uma amostra de 60 microlitros foi adicionada a um volume de 2 ml de material celulósico. Após serem mistu- radas gentilmente, as amostras foram levadas para análise no tempo pré- selecionado apropriado (p. ex., incubação por 20 horas). Para a análise, 500 microlitros de amostra e substrato foram pipetados na cuba de amostras de um viscosímetro (viscosímetro de cone e placa Brookfield LV DVIII com um banho-maria em cone CP40 configurado a 25°C) e o viscosímetro foi pro- gramado de forma que a SSN (velocidade) ficasse em 16 RPM e o WTI (tempo de espera) ficasse em 30 segundos (software Rheocalc). Após 30 segundos, um sumário dos dados surgiu no display. Os resultados desses testes estão apresentados na Figura 2.

Não foi observada nenhuma diminuição da viscosidade durante o experi- mento para as amostras de Controle, da Hospedeira A (-bglC) e da Hospe- deira B (-bglC) postas em contato com material celulósico a 1%, indicando a ausência de atividade celulásica nas amostras. As cepas da hospedeira com seqüências genômicas do bgIS deletadas exibiam significativa atividade ce- lulásica, como indicado pela diminuição da viscosidade. EXEMPLO 3

Construção de cepas de bglC::espectinomicina produtoras de protease

As cepas a seguir foram testadas neste experimento: uma cepa de Bacillus subtilis produtora de protease de subtilisina e a mesma cepa com desativação por inserção no bglC.

As cepas a serem testadas foram construídas como segue. A cepa SC6 (spollE, amyE, aprE PxylxomK) foi transformada com DNA cro- mossômico de uma cepa produtora de subtilisina. Os transformantes foram selecionados em placas de L-agar contendo cloranfenicol (5 microgra- mas/ml) e 1,6% de leite desnatado. A presença de subtilisina foi confirmada pela produção de halo nas placas contendo leite desnatado. A cepa resultan- te, MDT04-250, foi transformada com DNA cromossômico de uma cepa de- sativadas por inserção no gene bglC e os transformantes foram seleciona- dos em placas de L-agar contendo espectinomicina (100 microgramas/ml). Foi confirmada a resistência da nova cepa, MDT05-28, ao cloranfenicol (5 microgramas/ml) e à espectinomicina (100 microgramas/ml). As duas cepas foram amplificadas para mediante seu cultivo seqüencial em placas de L- agar contendo cloranfenicol (10 microgramas/ml) e então com cloranfenicol (25 microgramas/ml). Essas cepas amplificadas foram cultivadas em frascos agitados contendo 25 ml de LB (Difco), glicose (0,1%) e cloranfenicol (25 microgramas/ml) em um balões de Erlenmayer de 250 ml. Os frascos agita- dos foram incubados a 37°C com agitação a 280 rpm e, à OD550 de 0,8, 1 mL da cultura foi misturado com 0,5 ml de glicerol a 30% e congelado a - 70°C. Trinta microlitros das ampolas congeladas foram usados para inocular 40 ml de meio FNII em frascos de 250 ml. Dois frascos por cepa foram usa- dos. Os frascos agitados foram incubados a 37°C com agitação a 280 rpm por diversos dias e amostras do sobrenadante foram recolhidas para teste de viscosidade e análise da subtilisina.

Os sobrenadantes das culturas líquidas foram colhidos após tempos diferentes durante o cultivo (p. ex., 16, 48 e 68 h) e testados para subtilisina como descrito anteriormente (ver Estell et al., J. Biol. Chem, 260:6518-6521 [1985] em uma solução contendo 0,3 mM de N-succinil-L- Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida (Vega Biochemicals), Tris 0,1 M, ph 8,6 a 25°C. Os testes mediram o aumento da absorção a 410 nm/min devido à hidrólise e liberação de p-nitroanilina. Essas cepas produziram quantidades equivalentes de subtilisina a taxas equivalentes.

Amostras de sobrenadante dos frascos agitados tanto da cepa- mãe, MDT04-250, quanto da cepa bglC::spec (MDT05-28) foram recolhidas a 16, 48 ou 64 horas após a inoculação e incubadas com um substrato de celulose (4,5 ml de CMC (5%) + 0,5 ml de sobrenadante) por 1, 24 ou 48 horas. A atividade das celulases sobre o substrato de celulose foi medida pela diminuição da viscosidade do substrato de celulose em um reômetro, sendo seu software usado de acordo com as instruções do fabricante, como discutido acima. Os dados são apresentados sob a forma de percentagem das leituras de controle (dH20). Amostras tomadas dos frascos agitados de MDT05-28 não exibiram redução da viscosidade do substrato de celulose, enquanto todas as amostras do MDT04-250 rapidamente reduziram a visco- sidade do substrato de celulose. Isso indica que a desativação do bglC im- pede a atividade sobre o substrato de celulose. Os resultados desses testes são mostrados na Figura 3. Esses resultados mostram que o sobrenadante da cultura das células hospedeiras expressando subtilisina com um gene bglC rompido não exibem atividade celulásica significativa.

Enquanto modalidades particulares da presente invenção foram

ilustradas e descritas, ficará claro para aqueles versados na técnica que vá- rias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que isso repre- sente um afastamento do espírito e do escopo da invenção. Pretende-se portanto cobrir nas reivindicações anexas todas essas alterações e modifi- cações que estão dentro do escopo desta invenção.

Todas as patentes e publicações mencionadas na especificação são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica à qual a invenção diz respeito. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas por re- ferência na mesma medida em que estariam se cada publicação individual tivesse sido específica e individualmente indicada como incorporada por re- ferência.

Tendo descrito as modalidades preferidas da presente invenção, ficará claro para aqueles medianamente versados na técnica que diversas modificações podem ser feitas nas modalidades reveladas e que se preten- de que tais modificações estejam no escopo da presente invenção.

Aqueles versados na técnica compreendem de imediato que a presente invenção se adapta bem a realizar os objetivos e alcançar os fins e vantagens mencionadas, assim como aqueles a eles inerentes. As composi- ções e métodos aqui descritos são representativos de modalidades preferi- das, são exemplos, e não pretendem ser limitações do escopo da invenção. É de imediato compreendido por aquele versado na técnica que várias subs- tituições e modificações podem ser feitas na invenção aqui revelada sem afastamento do escopo e do espírito da invenção.

A invenção aqui ilustrativamente descrita pode ser adequada- mente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações não especificamente reveladas aqui. Os termos e expressões empregados são usados como termos descritivos e não limitadores e não há intenção, no uso desses termos e expressões, de excluir quaisquer equiva- lentes das características mostradas e descritas ou de partes das mesmas, e se reconhece que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser compreendido que ainda que a pre- sente invenção tenha sido especificamente revelada mediante modalidades preferidas e características opcionais, aqueles versados na técnica podem recorrer a modificações e a variações dos conceitos aqui revelados e consi- dera-se que tais modificações e variações estão dentro do escopo dessa invenção conforme definida nas reivindicações anexas. A invenção foi descrita de maneira ampla e geral aqui. Cada

uma das espécies mais estreitas e grupamentos subgenéricos que caiam dentro da revelação genérica também fazem parte da invenção. Isso inclui a descrição geral da invenção com uma cláusula ou limitação negativa remo- vendo qualquer material do gênero, tenha sido ou não o material removido especificamente mencionado neste.

Claims (20)

1. Célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante compreen- dendo um genoma compreendendo um gene bglC desativado, compreen- dendo a célula mencionada ainda um ácido nucleico recombinante para a produção de uma proteína aditiva para detergentes secretada.

2. A célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante da reivindi- cação 1, na qual o gene bglC desativado contém uma deleção, uma inser- ção, uma substituição ou rearranjo.

3. Célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante da reivindica- ção 1, sendo a célula de Bacillus sp. mencionada uma célula de B. Iieheni- formis, B. subtilis, B. elausii, B. alkalophilus ou B. halodurans.

4. Célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante da reivindica- ção 1, sendo a proteína aditiva para detergentes secretada mencionada uma enzima selecionada entre uma protease, uma amilase, uma pectina liase, uma aciltransferase, uma arilesterase e uma lipase.

5. Célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante da reivindica- ção 4, sendo a a enzima mencionada uma protease.

6. Célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante da reivindica- ção 5, sendo a protease mencionada uma subtilisina.

7. Célula hospedeira de Bacillus sp. da reivindicação 1, na qual o gene bglC mencionado codifica um polipeptídeo que é pelo menos 80% i- dêntico à SEQ ID NO:2.

8. Cultura celular compreendendo: meio de cultura; e uma célula hospedeira de Bacillus sp. recombinante da reivindi- cação 1.

9. Método compreendendo: manutenção da cultura celular da reivindicação 8 sob condições adequadas à produção da proteína aditiva para detergentes secretada men- cionada.

10. Método da reivindicação 9, compreendendo ainda: recuperação da proteína aditiva para detergentes secretada mencionada do meio de cultura mencionado.

11. Método da reivindicação 10 compreendendo ainda a combi- nação da proteína aditiva para detergentes secretada mencionada com um detergente para lavagem de roupas.

12. Método da reivindicação 9 no qual a proteína aditiva para detergentes secretada mencionada é uma protease da subtilisina.

13. Composição de proteína livre de celulase produzida pelo mé- todo da reivindicação 9.

14. Composição de proteína livre de celulase da reivindicação 13 compreendendo a composição mencionada uma proteína aditiva para deter- gentes secretada produzida por um Bacillus sp. e caracterizada pelo fato de que a composição não tem atividade celulásica detectável.

15. Detergente para lavagem de roupas livre de celulase com- preendendo uma proteína aditiva para detergentes secretada produzida pelo método da reivindicação 9.

16. Detergente para lavagem de roupas livre de celulase da rei- vindicação 15 compreendendo o detergente mencionado um polímero celu- lósico.

17. Método para produzir uma célula compreendendo: a) Introdução de um primeiro ácido nucleico recombinante em uma célula de Bacillus sp. de maneira que o ácido nucleico recombinante mencionado se recombine com o gene bglC da célula mencionada; e b) Introdução de um segundo ácido nucleico recombinante na célula mencionada que proporcione expressão da proteína aditiva para de- tergentes secretada mencionada.

18. Método da reivindicação 17 no qual o ácido nucleico se inse- re no gene bglC.

19. Método da reivindicação 17 no qual o ácido nucleico men- cionado deleta uma porção do gene bglC mencionado.

20. Método da reivindicação 17 no qual a proteína aditiva para detergentes mencionada é uma subtilisina.