FI121925B - Parannettu selluloosan sakkarifikaatio Trichoderma reesein b-glukosidaasi-geenin kloonauksen ja amplifikaation avulla - Google Patents

Parannettu selluloosan sakkarifikaatio Trichoderma reesein b-glukosidaasi-geenin kloonauksen ja amplifikaation avulla Download PDF

Info

Publication number
FI121925B
FI121925B FI932633A FI932633A FI121925B FI 121925 B FI121925 B FI 121925B FI 932633 A FI932633 A FI 932633A FI 932633 A FI932633 A FI 932633A FI 121925 B FI121925 B FI 121925B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
glucosidase
gene
mold
transformants
bglii
Prior art date
Application number
FI932633A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI932633A0 (fi
FI932633A (fi
Inventor
Christopher C Barnett
Timothy Fowler
Sharon Shoemaker
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24504759&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI121925(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI932633A0 publication Critical patent/FI932633A0/fi
Publication of FI932633A publication Critical patent/FI932633A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121925B publication Critical patent/FI121925B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

Parannettu selluloosan sakkariflkaatlo Trichoderma reeseln β-glukosidaasi-geenin kloonauksen ja ampllfikaatlon avulla
Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ekstrasel-lulaarisen β-glukosidaasin ekspression modifioimiseksi fi-lamenttihomeessa sekä sellulaasivalmisteita ja koostumuksia, joilla on parempi sellulolyyttinen kapasiteetti. Kek-10 sintö koskee lisäksi filamenttihomeen ekstrasellulaarista β-glukosidaasia koodaavaa bgll-geenin nukleotidisekvenssiä ja transformanttikantoja, jotka sisältävät genomissaan useampia kopioita β-glukosidaasin (bgll) geeniä. Yksityiskohtaisemmin, esillä oleva keksintö koskee menetelmiä, 15 joissa käytetään Trichoderma reesei -kantoja, jotka eks-pressoivat paremmin bgll-geeniä, minkä seurauksena syntyy korkeampia β-glukosidaasiproteiinitasoja, joita voidaan käyttää yhdessä muiden koostumuksien kanssa tuottamaan sellulaasituotetta, jolla on parempi sellulolyyttinen ka-20 pasiteetti.
2. Tekniikan taso
Sellulaasit tunnetaan alalla entsyymeinä, jotka hydrolysoivat selluloosaa (β-l,4-glukaanisidoksia), minkä seurauksena syntyy glukoosia, sellobioosia, sello-oligo- 25 sakkarideja ja vastaavia. Kuten mm. julkaisussa Wood et ai., "Methods in Enzymology" 160/25 (1988) 234 lähtien, q mainitaan, tietyn mikro-organismin tuottama sellulaasi koos- c\i ^ tuu useista eri entsyymiluokista, mukaan lukien eksosello- ? biohydrolaaseiksi (EC.3.2.1.91) ("CBH"), endoglukanaaseiksi oo w 30 (EC 3.2.1.4) ("EG"), β-glukosidaaseiksi (EC 3.2.1.21) ("BG") g identifioituja entsyymiluokkia. Lisäksi CBH:n, EG:n ja pq BG:n sieniluokituksia voidaan edelleen laajentaa sisältä en mään useita komponentteja kunkin luokituksen sisällä. Esi-
CO
O) merkiksi monia CBH:ja ja EG:ja on eristetty useista bak- 35 teeri- ja sienilähteistä, mm. Trichoderma reeseistä, joka 2 sisältää kaksi CBH-komponenttia, ts. CBH I ja CBH II, ja ainakin kolme EG-komponenttia, ts. EG I, EG II ja EG III.
Tarvitaan täydellinen sellulaasijärjestelmä, joka sisältää komponentteja kustakin CBH-, EG- ja BG-luoki-5 tuksesta, selluloosan kiteisten muotojen muuttamiseksi tehokkaasti glukoosiksi. Toisistaan eristetyt komponentit ovat paljon tehottomampia hydrolysoimaan kiteistä selluloosaa, mikäli toimivat lainkaan. Lisäksi synergistinen suhde havaitaan sellulaasikomponenttien välillä erityises-10 ti, jos ne ovat eri luokituksesta. Toisin sanottuna täydellisen sellulaasijärjestelmän tehokkuus on huomattavasti suurempi kuin saman luokituksen erillisten komponenttien vaikutusten summa. Tässä suhteessa alalla tiedetään, että EG-komponentit ja CBH—komponentit vaikuttavat toisiinsa 15 synergistisesti, siten että ne hajottavat tehokkaammin selluloosaa. Katso esimerkki: Wood, Biochem. Soc. Trans.
13 (1985) 407 - 410.
Eri sellulaasikomponenttien substraattispesifisyys ja toimintatapa eroaa luokituksesta riippuen, mikä saattaa 20 selittää yhdistettyjen komponenttien yhteisvaikutuksen.
Esimerkiksi nykyinen hyväksytty sellulaasien toimintatapa on se, että endoglukanaasikomponentit hydrolysoivat sisäisiä β-1,4-glukosidisidoksia, erityisesti sellaisilla alueilla, joissa selluloosan kiteisyys on vähäistä, ja ek-25 sosellobiohydrolaasikomponentit hydrolysoivat sellobioosia selluloosan ei-pelkistävästä päästä. Endoglukanaasikompo-5 nenttien toiminta helpottaa suuresti eksosellobiohydro-
(M
^ laasien toimintaa, koska se luo uusia ketjun päitä, jotka ° eksosellobiohydrolaasikomponentit tunnistavat.
00 ^ 30 β-glukosidaasit ovat sellulaasijärjestelmän vält- x £ tämättömiä komponentteja ja ovat tärkeitä selluloosan täy- co delliselle hajoamiselle glukoosiksi, β-glukosidaasientsyy- oo mit voivat katalysoida alkyyli- ja/tai aryyli^-D-glukosi-oo <y> dien, kuten metyyli^-D-glukosidin ja p-nitrofenyyligluko- 35 sidin, hydrolyysia, samoin kuin ainoastaan hiilihydraatti- tähteitä sisältävien glukosidien, kuten sellobioosin hyd- 3 rolyysiä. Sellobioosin katalyysi β-glukosidaasin avulla on tärkeä, koska se tuottaa glukoosia mikro-organismille ja lisäksi koska sellobioosin kertyminen inhiboi sellobiohyd-rolaaseja ja endoglukanaaseja vähentäen näin hydrolyysin 5 nopeutta selluloosasta glukoosiksi.
Koska β-glukosidaasit voivat katalysoida monien eri substraattien hydrolyysiä, tämän entsyymin käyttö on mahdollista useissa eri sovellutuksissa. Esimerkiksi joitakin β-glukosidaaseja voidaan käyttää vapauttamaan hedel-10 män aromiaine katalysoimalla siinä olevia eri glukosideja. Samoin jotkut β-glukosidaasit voivat hydrolysoida viinirypäleen monoterpenyyli^-glukosidaasia, joka hydrolyysin kautta on tärkeä potentiaalinen viinin aromiainelähde, kuten Gunata et al.'n julkaisussa "Hydrolysis of Grape mono-15 terpenyl β-D-Glucosides by Various β-Glucosidases", J. Ag-ric. Food Chem. 38 (1990) 1232 - 1236 on kuvattu.
Lisäksi sellulaaseja voidaan käyttää hiivojen kanssa hajottamaan biomassaa etanoliksi, jolloin selluloosa hajottaa sellobioosia glukoosiksi, jonka hiivat voivat 20 edelleen fermentoida etanoliksi. Tämä etanolin tuotto hyvin saatavilla olevista selluloosalähteistä voi antaa käyttöön stabiilin, uusiutuvan polttoainelähteen. Etanolin käyttö polttoaineena on monella tavoin edullista verrattuna raa-kaöljypolttoainetuotteiden käyttöön, se edistää mm. taaja-25 mien ilmansaasteen ja savusumun vähenemistä ja otsonitason alenemista ja parantaa näin ympäristön tilaa. Lisäksi eta- o nolin käyttö polttoainelähteenä vähentäisi riippuvuutta ul- c\i ^ komaisen öljyn tuonnista ja petrokemian jakelijoista.
^ Mutta kun etanolia tuotetaan biomassasta, suurin oo 30 nopeutta rajoittava vaihe on järjestelmän riittämätön £ β-glukosidaasin määrä, jotta sellobioosista tulisi tehok- co kaasti glukoosia. Siksi sellulaasikoostumus, joka sisältää oo ^ enemmän β-glukosidaasia, olisi käyttökelpoinen etanolia tuo- oo σ> tettaessa.
4
Joissakin tapauksissa päinvastoin on edullista tuottaa sellulaasikoostumus, jossa on vähän ja edullisesti ei lainkaan β-glukosidaasia. Tällaiset koostumukset olisivat edullisia sellobioosia tai muita sello-oligosakkarideja 5 tuotettaessa.
β-glukosidaaseja on monissa prokaryoottisissa organismeissa ja myös eukaryoottisissa organismeissa, β-glukosidaasia koodaava geeni on kloonattu useista prokaryoot-tisista organismeista, ja geeni kykenee ohjaamaan todetta-10 vien proteiinimäärien synteesiä colissa, ilman että tarvitaan edistyneempää geeniteknologiaa, vaikka joissakin tapauksissa tarvitaan kytkentää vektorissa olevaan promoottoriin. Tällaiset organismit eivät kuitenkaan tuota β-glukosidaaseja kaupallisiin tarkoituksiin sovellettavia 15 määriä.
Lisäksi sellaisia prokaryoottigeenejä ei voida usein ekspressoida eikä detektoida eukaryoottisen isännän transformoinnin jälkeen. Näin ollen, jotta voitaisiin käyttää homekantoja, homegeenit tulisi kloonata käyttäen 20 tässä kuvattuja menetelmiä tai detektoimalla Th_ reesein bgll-geenillä nukleiinihappohybridisaation avulla.
β-glukosidaasikomponentin vaikutuksen ja biokemian selluloosan hydrolyysissä tekee monimutkaiseksi Th_ reesein ja muiden homelähteiden entsyymimuotojen ilmeinen moninai-25 suus (Enari et ai., "Purification of Trichoderma reesei and Aspergillus niger β-glucosidase", J. Appi. Biochem. 3 q (1981) 157 - 163; Umile et ai., "A constitutive, plasma
CVJ
^ membrane bound β-glucosidase in Trichoderma reesei", FEMS
^ Microbiology Letters, 34 (1986) 291 - 295; Jackson et ai., oo 0X1 30 "Purification and partial characterization of an extracel- ϊ lular β-glucosidase of Trichoderma reesei using cathodic or) run, polyacrylamide gel electrophoresis", Biotechnol. Bioeng.
32 (1988) 903 - 909. Nämä ja monet muut kirjoittajat ra- CO ...
<j> portoivat β-glukosidaasientsyymejä, joiden koko on 70 - 80 Kd 35 ja pl on 7,5 - 8,5. Tuoreemmat tulokset viittaavat siihen, että ekstrasellulaariset ja soluseinämään sidotut β-glukosi- 5 daasin muodot ovat yksi ja sama entsyymi [Hofer et ai., "A monoclonal antibody against the alkaline ekstracellular β-glucosidase from Trichoderma reesei: reactivity with other Trichoderma β-glucosidases", Biochim. Biophys. Acta 5 992 (1989) 298 - 306; Messner and Kubicek, "Evidence for a single specific β-glucosidase in cell walls from Trichoderma reesei QM9414", Enzyme Microb. Technol. 12 (1990) 685 - 690] ja että koon ja pl:n vaihtelut johtuvat post-translationaalisesta modifikaatiosta ja entsyymin puhdis-10 tusmenetelmien heterogeenisyydestä. Ei tiedetä, onko in-trasellulaarinen β-glukosidaasi, jonka pl on 4,4 ja jonka näennäinen molekyylipaino on 98 000, uusi β—glukosidaasi [Inglin et ai., "Partial purification and characterization of a new intracellular β-glucosidase of Trichoderma ree-15 sei", Biochem. J. 185 (1980) 515 - 519] vai alkalisen ekstrasellulaarisen β-glukosidaasin proteolyyttinen fragmentti assosioituneena toiseen proteiiniin (Hofer et ai., supra).
Vaikka valtaosa detektoitavasta β-glukosidaasiaktii-visuudesta jää sitoutuneeksi soluseinämään [Kubicek, "Re-20 lease of carboxymethylcellulase and β-glucosidase from cell walls of Trichoderma reesei", Eur. J. Appi. Biotech-nol. 13 (1981) 226 - 231; Messner and Kubicek, supra;
Messner et al., "Isolation of a β-glucosidase binding and activating polysaccharide from cell walls of Trichoderma 25 reesei", Arch. Microbiol. 154 (1990) 150 - 155], kaupal listen sellulaasivalmisteiden ajatellaan kykenevän tuotta- o maan vähemmän glukoosia, koska puhdistetuissa sellu- c\i ^ laasivalmisteissa on suhteellisen vähän β-glukosidaasia.
^ Sen ongelman ratkaisemiseksi, että β-glukosidaasi oo ^ 30 on nopeutta rajoittava tekijä, tuotettaessa glukoosia sel- £ luloosasta käyttäen filamenttihomeen tuottamaa sellulaa- oo siä, alalla esitetään, että Trichoderma reesein sellulo- oo lyyttistä järjestelmää voidaan täydentää Aspergilluksen oo σ> β-glukosidaasilla, ja tulokset osoittavat, että selluloo- 35 san sakkarifikaationopeus glukoosiksi kasvaa. Duff, Bio- technol Letters 7 (1985) 185. Homeiden viljelyolosuhteita 6 on myös muutettu siten, että ne nostavat Trichoderma ree-sein β-glukosidaasiaktiivisuutta, kuten julkaisuissa kuvataan Sternberg et ai., Can. J. Microbiol. 23 (1977) 139 ja Tangnu et ai., Biotechnol. Bioeng. 23 (1981) 1837, ja 5 UV-säteilytyksen avulla saatujen mutanttikantojen on kerrottu lisäävän Trichoderma reesein β-glukosidaasin tuottoa. Vaikka nämä edellä mainitut menetelmät lisäävät Trichoderma reesein β-glukosidaasimäärää, menetelmät eivät ole käytännöllisiä, eivätkä monessa suhteessa kaupallises-10 ti tarkoituksenmukaisia.
Geeniteknologian avulla tuotettu Trichoderma ree-sei- tai muu filamenttihomekanta, joka tuottaa enemmän β-glukosidaasia, olisi ideaalinen, ei ainoastaan riittävän sellulaasijärjestelmän tuottamiseksi, vaan siksi, että edel-15 leen voitaisiin käyttää bgll-geenin korkeampia ekspres- siotasoja tuottamaan sellulaasituotetta, jolla on suurempi sellulolyyttinen kapasiteetti. Tällainen kanta voidaan tarkoituksenmukaisesti tuottaa transformaatiota käyttäen.
Mutta jotta Trichoderma reesein tai muiden fila-20 menttihomeiden kantoja voidaan transformoida, Trichoderma reesein tai muiden filamenttihomeiden bgll-geenin aminohapposekvenssi täytyy ensin karakterisoida, niin että bgll-geeni voidaan kloonata ja siirtää Trichoderma reesein tai muiden filamenttihomeiden mutanttikantoihin.
25 Lisäksi, kun bgll-geeni on tunnistettu, bgll-gee nin lineaaristen fragmenttien informaatiota voidaan käyttö tää Trichoderma reesei- ja muiden filamenttihomekantojen
CM
^ valmistamiseksi, jotka kannat tuottavat sellulaasikoostu- ^ muksia ilman β-glukosidaasia.
oo ^ 30 Siten keksintö koskee osaksi Trichoderma reesein x £ ja muiden filamenttihomeiden ekstrasellulaarista tai solu- oo seinämään sitoutunutta β-glukosidaasia koodaavan bgll-gee- oo ^ nin karakterisoimista. Tämä keksintö koskee edelleen bgll- co <y> geenrn kloonaamista plasmidivektoriin, jota voidaan käyt- 35 tää transformaatioprosessissa, ja bgll-geenin siirtämistä Trichoderma reesein tai muiden filamenttihomeiden genomiin 7 useina kopioina, jolloin muodostuu transformoituja kantoja, jotka tuottavat sellulaasikoostumuksia, joissa on huomattavasti suurempi β-glukosidaasiaktiivisuus. Lisäksi esitetään sellulaasikoostumuksia, joilla on enemmän sellulo-5 lyyttistä kapasiteettia.
Tämä keksintö koskee edelleen osaksi muunnettuja bgll-geenin kopioita, jotka voivat muuttaa entsyymin ominaisuuksia ja joita voidaan viedä uudelleen takaisin Trichoderma reesein tai muiden filamenttihomeiden geno-10 miin.
Keksinnön yhteenveto
Ekstrasellulaarisen tai soluseinämään sidotun Trichoderma reesein β-glukosidaasiproteiinin riittävän yksityiskohtainen aminohapposekvenssi on nyt tiedossa, niin 15 että bgll-geeni voidaan kloonata sopivaan plasmidivektoriin. Plasmidivektoria voidaan sitten käyttää transformoimaan filamenttihomekantoja transformanttien, joihin on viety useita bgll-geenikopioita, tuottamiseksi.
Esillä olevan keksinnön yksi menetelmäaspekti on 20 se, että keksintö koskee menetelmää parannetun ekstrasel lulaarisen β-glukosidaasin ekspressoimiseksi filamenttiho-meessa, jossa menetelmässä ekspressoidaan parannettua β-glukosidaasia koodaavaa home-DNA-sekvenssiä rekombinantissa isäntämikro-organismissa, joka mainittu rekombinantti 25 isäntämikro-organismi on filamenttihome, joka on transfor moitu Trichoderma reesein bgll-geenillä.
q Esillä olevan keksinnön yksi aspekti on homesellu- c\i laasikoostumus, joka sisältää rekombinanttia muunneltua β- oo glukosidaasia, joka on tuotettu edellä mainitulla menetel-oo ^ 30 mällä.
g Lisäksi esillä olevan keksinnön aspekteja ovat me- co netelmä glukoosin hajottamiseksi selluloosasta tai hetero- oo £0 glykaaneista, menetelmä rehun, biomassan tai lietteen si- oo σ> sältämän selluloosa-aineksen hajottamrseksr; ja menetelmä 35 selluloosan hajottamiseksi glukoosiksi. Kaikille näille menetelmille on tunnusomaista ensimmäisessä menetelmäas- 8 pektin mukaisella menetelmällä tuotetun rekombinantin ho-mesellulaasikoostumuksen käyttö.
Esillä olevan keksinnön vielä eräinä aspekteina ovat ensimmäisen menetelmäaspektin mukaisella menetelmällä 5 tuotetun rekombinaatin homesellulaasikoostumuksen tai puh distetun β-glukosidaasin käyttö elintarvikelisäaineissa elintarvikkeiden maun ja aromin parantamiseksi sekä deter-genttikoostumus, joka sisältää puhdistavan tehokkaan määrän pinta-aktiivista ainetta ja ainakin 0,0001 painopro-10 senttiä em. homesellulaasikoostumusta.
Vielä yhdessä aspektissa esillä oleva keksintö koskee Trichoderma reesein ekstrasellulaarisen β-glukosi-daasigeenin leimatun kokonaisen tai osittaisen sekvenssin sisältävän nukleiinihappofragmentin käyttöä koettimena ek-15 vivalentin bgll-geenin tunnistamiseksi ja kloonaamiseksi ulos muista β-glukosidisista filamenttihomeista.
Eräässä koostumusaspektissa esillä oleva keksintö koskee uusia ja käyttökelpoisia Trichoderma reesein trans-formantteja, joita voidaan käyttää tuottamaan homeperäisiä 20 sellulaasikoostumuksia, erityisesti homesellulaasikoostu- muksia, jotka on rikastettu β-glukosidaasin suhteen.
Vielä eräässä koostumusaspektissa esillä oleva keksintö koskee homesellulaasikoostumuksia, jotka on valmistettu bgll-geenillä transformoiduilla Trichoderma ree-25 sei -kannoilla.
Piirustusten lyhyt kuvaus o Kuvio 1 on koko T. reesein bgll-geenin nukleoti- c\j — - ^ disekvenssi ja siitä johdettu primaariaminohapporakenne.
o 1 Kuvio 2 on kaaviomainen esitys ρδΑδβ-ρΙη-νβ^οιίε- w 30 ta. x g Kuvio 3A on kuvallinen esitys ΡεΑεΔβΘΙυ bal pyr co (Δ36) -vektorista, co ^ Kuvio 3B on kuvallinen esitys ρυθΔβ-Glu A/R pyr S (Δ12) -vektorista.
9
Kuvio 4 esittää Trichoderma reesein transformoiduista kannoista eristetyn kokonais-RNA:n Northern-blotin, sen jälkeen kun sitä on indusoitu soforoosilla käyttäen koettimina cbh2:ta ja bgll-cDNA:n 700 emäsparin 5 fragmenttia.
Kuvio 5A esittää T. reesein DNA:n Southern-blotin autoradiogrammia ja kuvaa β-glukosidaasigeenin esiintymistä villityyppisessä T. reeseissä (RL-P37) verrattuna T. ree-sei-kantoihin, joita on geneettisesti muunnettu niin, ett-10 eivät ne sisällä β-glukosidaasigeeniä (Δ12 ja Δ36).
Kuvio 5B esittää T. reesein RNA:n Northern-blotin autoradiogrammia ja kuvaa β-glukosidaasigeenin ekspressiota villityyppisessä T. reeseissä (RL-P37) verrattuna T. reesein- kantoihin, joita on geneettisesti muunnettu niin, 15 etteivät ne sisällä β-glukosidaasigeeniä (Δ12 ja Δ36) .
Kuvio 5C esittää Trichoderma reesein P37- (villi-tyyppi), Δ12- ja A36-kantojen ekspressoimien proteiinien analyysiä ja se valaisee sitä, että β-glukosidaasi puuttuu Trichoderma reesein Δ12- ja A36-kantojen ekspressoimista 20 proteiineista.
Kuvio 6 esittää autoradiogrammia Hind 111:11a pilkotusta T. reesein ylituotantokannan genomisesta DNA:sta (pystyrivi 9) ja pSAS3-Glu-transformanteista (pystyrivit 1-8), jotka on siirretty kalvolle ja tutkittu 700 emäs-25 parin β-Glu-koettimen avulla.
Kuvio 7 kuvaa esillä olevan keksinnön avulla tuo-5 tetun, rikastetun, rekombinantin β-glukosidaasikoostumuk-
(M
^ sen Avicel—hydrolyysikäyrää käyttäen annostusta substraat- ° ti: entsyymi 80:1.
oo ^ 30 Kuvio 8 kuvaa esillä olevan keksinnön avulla tuo- x £ tetun, rikastetun, rekombinantin β-glukosidaasikoostumuk- co sen PSC-hydrolyysikäyrää käyttäen annostusta substraat- oo ti:entsyymi 300:1.
oo σ> 10
Kuvio 9 esittää käyrää, joka valaisee selluloosa-vaippakuidun hydrolyysinopeutta, kun käytetään esillä olevan keksinnön avulla tuotettua rikastettua rekombinanttia β-glukosidaasikoostumusta.
5 Kuviot 10A ja 10B ovat autoradiogrammeja Aspergil lus nidulansin, Neurospora crassan, Humicola grisean geno-misesta DNA:sta, joka on pilkottu Hind III:lla ja Eco Ritilä, siirretty kalvolle ja tutkittu Trichoderma reesein bgll-geenin sisältämän DNA-fragmentin avulla.
10 Yksityiskohtainen kuvaus keksinnön edullisesta suoritusmuodosta Tässä käytettynä termi "parantunut ekstrasellulaa-rinen β-glukosidaasi" tai "parantunut β-glukosidaasi" tarkoittaa, että genomiin on viety ainakin yksi ylimääräinen 15 kopio ekstrasellulaarista β-glukosidaasia koodaavaa geeniä.
Termi "muunnettu β-glukosidaasi" tai "muunnettu β-glukosidaasigeeni" tarkoittaa sitä, että ekspressoidun proteiinin aminohapposekvenssiä on muutettu poistamalla, lisäämällä ja/tai manipuloimalla geenin nukleiinihappose-20 kvenssiä tai proteiinin aminohapposekvenssiä.
Termi "geeniteknisesti" ilmaisee sitä, että mikro-organismi on transformoitu DNA-molekyylillä, joka on tehty koeputkessa ligoimalla yhteen DNA-jaksoja, jotka eivät normaalisti ole vierekkäisiä.
25 Termi "ekstrasellulaarinen β-glukosidaasi, joka ei sisällä sellulaasia" viittaa sellulaasikoostumukseen, joka 5 ei sisällä toimintakykyistä, ekstrasellulaarista β-gluko-
(M
^ sidaasientsyymiä. Tällaisia koostumuksia valmistetaan edul- ° lisesti viljelemällä filamenttihometta, josta β-glukosi- 00 ^ 30 daasigeeni on joko deletoitu tai rikottu toimintakyvyttö- £ mäksi. Edullisesti näitä koostumuksia valmistetaan vilje- (vj lemällä f ilamenttihometta, josta β-glukosidaasigeeni on de- oo £0 letoitu.
CO
σ> Termr "frlamenttihome" tarkoittaa mitä tahansa tai 35 kaikkia alalla tunnettuja filamenttihomeita.
11
Termi "β-glukosidinen filamenttihome" viittaa niihin filamenttihomeisiin, jotka tuottavat β-glukosidaasia sisältävää seUulaasikoostumusta.
Termi "sello-oligosakkaridi" viittaa niihin oli-5 gosakkaridiryhmiin, jotka sisältävät 2-8 glukoosiyksik-köä ja β-l,4-sidoksia. Tällaisiin sello-oligosakkarideihin kuuluu sellobioosi (diglukoosi, jossa on β-l,4-sidos) ja ne on edullisesti saatu selluloosasta.
Tarkemmin ilmaistuna esillä oleva keksintö liittyy 10 bgll-geenin, joka koodaa Trichoderma reesein (joskus käytetään T. reesei) ekstrasellulaarista tai soluseinämään sitoutunutta proteiinia koodaavan bgll-geenin, eristykseen ja karakterisointiin ja tämän geenin spesifisiin nukleotidi ja aminohapposekvensseihin. bgll-geeni kloonataan plas-15 midivektoreihin, joita käytetään edelleen tuottamaan transformoituja TL reesei- ja muita filamenttihomekantoja, joihin on viety bgll-geenin ylimääräisiä kopioita. Näitä transformantteja käytetään sitten tuottamaan sellulaasi-koostumuksia, joissa on suurempi β-glukosidaasiaktiivisuus 20 ja siten parempi selluloosan hajottamiskyky.
bgll-geenin aminohapposekvenssiä voidaan manipuloida. Tämän entsyymin aktiivisten kohtien muuttaminen saattaa johtaa lukuisiin erilaisiin muutoksiin katalyyttisissä ominaisuuksissa. Esimerkiksi koska β-glukosidaasilla 25 on sekä hydrolaasi- että transferaasiaktiivisuutta, aminohapposekvenssin muutos saattaa johtaa hydrolaasiaktiivi-o suuden lop-pumiseen ja transferaasiaktiivisuuden kasvuun,
CM
^ mikä näin tekee β-l,4-oligodekstriinien synteesin helpommak- ° si. Lisäksi β-glukosidaasin aminohapposekvenssin manipu- 00 ^ 30 lointi saattaa aiheuttaa järjestelmään muita muutoksia, x £ kuten erilaisen pH-optimin, erilaisen lämpötilaoptimin, co katalyyttisen turn over -nopeuden (Vmax) muutoksen, eri- oo ^ laisen sellobioosiaffiniteetin (Km), mikä johtaa suurem- oo ....
σ> paan sellobioosiaf f lniteettnn tai pienempään sellobi- 35 oosiaffiniteettiin, mistä seuraa alempi tai olematon reak tionopeus, muuttunut tuoteinhibitioprofiili niin, että ma- 12 talammat tai korkeammat glukoositasot inhiboivat β-gluko-sidaasiaktiivisuutta, ja muuta vastaavaa.
Lisäksi nukleiinihappofragmentti, joka sisältää T_. reesein ekstrasellulaarisen β-glukosidaasigeenin koko 5 nukleotidisekvenssin tai osan siitä, voidaan myös leimata ja sitä voidaan käyttää koettimena muiden filamenttihomei-den ekvivalenttien bgll-geenien identifioimiseen ja ulos-kloonaamiseen.
Yleistetysti esillä oleva keksintö käsittää bgll-10 geenin eristämisen T. reeseistä tunnistamalla geenin 700 emäsparin cDNA-fragmentin, jota sitten käytetään koettimena yhden T. reesei -fragmentin tunnistamiseksi, joka sisältää bgll-geenin, ja sen kloonauksen edelleen, bgll-geenin lajihomologian vuoksi koetinta, jossa käytetään 15 T_. reesein bgll-geenin fragmenttia, voidaan käyttää tun nistamaan bgll-geeni muista sellulolyyttisistä mikro-organismeista ja on ymmärrettävä, että seuraavaa T. reesein kuvausta voidaan myös soveltaa muihin β-glukosidisiin filament tihomei s iin .
20 T. reesein tapauksessa tämä 6,0 kiloemäksen frag mentti kloonataan sen jälkeen pUC-plasmidiin ja tehdään sarja kartoituskokeita sen varmistamiseksi, että koko bgll-geeni sisältyy tähän fragmenttiin. Sen jälkeen määritetään nukleotidisekvenssi molemmista säikeistä, ja kahden 25 intronin sijainti voidaan varmistaa introni/eksonirajan ylimenevän bgll-cDNA-jatkokloonin sekvenssianalyysillä.
q bgll-geenin eristyksen jälkeen ylimääräisiä bgll-geeni-
(M
^ kopioita viedään sitten jT. reesei- ja muihin filamenttiho- ° mekantoihin β-glukosidaasin ekspression lisäämiseksi, oo ^ 30 bgll-geenin eristys T. reeseistä käsittää ekstra- x g sellulaarisen β-glukosidaasin puhdistuksen, tämän proten- ςτ) nin kemiallisen ja proteolyyttisen pilkkomisen, proteo- oo ^ lyyttisten fragmenttien eristyksen ja sekvenssin määrityk- oo , , σ> sen ja synteettisten oligomeeri-DNA-koettimien suunnitte- 35 lun proteiinisekvenssin perusteella. Oligomeerikoettimia käytetään sitten edelleen 700 emäsparin β-glukosidaasi- 13 cDNA-fragmentin tunnistamiseen, joka fragmentti voidaan leimata ja jota voidaan myöhemmin käyttää identifioimaan fragmenttia, joka sisältää koko bgll-geenin, Tb reesein pilkotusta genomisesta DNA:sta peräisin olevasta fragmen-5 tista.
Jotta voitaisiin identifioida soveltuva cDNA- fragmentti, jota voidaan käyttää koettimena tulevissa analyyseissä, koko RNA eristetään ensin Th reesei -rihmastosta ja siitä eristetään polyadenyloitu RNA. Polyadeny-10 loitua RNA:ta käytetään sitten tuottamaan cDNA-pooli, jota sitten amplifioidaan käyttäen spesifisiä oligonukleoti-dialukkeita, jotka amplifioivat vain spesifistä cDNA-frag-menttia, joka koodaa Th reesein bgll-geeniä.
Tarkemmin sanottuna koko RNA eristetään ensin Th 15 reesei- lähtökannasta. Lähtökanta, jota käytetään esillä olevassa keksinnössä, voi olla mikä tahansa Th reesein sellulaaseja ylimäärin tuottava kanta, joka on alalla tunnettu. Tämä sellulaaseja tuottava kanta kehitetään yleensä mistä tahansa T. reesein kannasta alalla tunnetun tavalli-20 sen mutageneesin ja tavallisten selektiomenetelmien avul la. Varmistus sille, että valittu kanta tuottaa ylimäärin sellulaaseja, voidaan tehdä tunnettuja analyysimenetelmiä käyttäen. Edullinen kanta on RLP37, joka on helposti saatavissa .
25 T. reesein ylituottokannasta peräisin oleva mysee- liymppi, jota on kasvatettu sopivassa kasvualustassa, lisä-5 tään perusalustaan ja inkuboidaan 50 - 65 tuntia 25 -
(M
32 °C:ssa, edullisesti 30 °C:ssa. Tämän inkuboinnin aikana voidaan vaihtaa tuore perusalusta. Kasvatusalusta sentri-oo 30 fugoidaan sen jälkeen, ja siitä erotetaan myseeli ja se x g pestään. Sitten myseeli suspendoidaan uudelleen puskuriin, co jossa se voi kasvaa, ja myseeliin lisätään 1 mM soforoosia oo ^ (glukoosin β,1-2-dimeeri) indusoimaan sellulaasientsyymien oo O) tuottoa. Sen jälkeen myseelipreparaattia inkuboidaan vielä 35 jonkin aikaa, edullisesti 18 tuntia 30 °C:ssa, ennen keräystä .
14
Kokonais-RNA voidaan eristää myseelipreparaatista monia alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen, kuten pro-teinaasi K -hajotusta ja sitä seuraavaa fenoli:kloro-formiuuttoa, guanidiumisotiosyanaattiuuttoa ja sitä seu-5 raavia kesiumkloridigradientteja, guanidiinihydrokloridi-uuttoa ja orgaanisilla liuottimilla tapahtuvaa uuttoa, sekä muilla vastaavilla menetelmillä. Kokonais-RNA on edullista eristää Timberlakern et ai.'n kuvaamalla menetelmällä: "Organization of a Gene Cluster Expressed Specifical- 10 ly in the Asexual Spores of A^ nidulans", Cell 26 (1981) 29 - 37.
Myseeli eristetään kasvatusliuoksesta suodatuksen avulla. Sen jälkeen RNA uutetaan myseelistä lisäämällä uuttopuskuria, TE:llä kyllästettyä fenolia ja kloroformia. 15 Vesifaasi poistetaan ja orgaaninen faasi uutetaan uudestaan pelkkää uuttopuskuria käyttäen lämmittämällä uut-toseosta vesihauteessa noin 60 - 80 °C:n lämpötilassa, edullisesti 68 °C:ssa, jotta voidaan vapauttaa polysomeis-sa ja rajapinnassa kiinni oleva RNA. Kaikki uutosta synty-20 neet vesifaasit yhdistetään, sentrifugoidaan ja uutetaan uudelleen fenoli/kloroformilla niin kauan, ettei rajapinnassa enää ole proteiinia. RNA saostetaan edelleen 0,1 tilavuudella 3 M natriumasetaattia ja kahdella tilavuudella 95-%:ista etanolia ja sentrifugoidaan, ja muodostunut pel-25 letti suspendoidaan uudelleen DEP-veteen, joka sisältää RNaasi-inhibiittoria.
o Kokonais RNA fraktioidaan sen jälkeen l-%:isilla
^ TM
^ formaldehydi-agaroosigeeleillä, siirretään Nytran -mem- ^ braaneille ja tutkitaan käyttäen koettimena T. reesein 00 ^ 30 cbh2-geenin fragmenttia, jotta saataisiin selville, ovatko x g Ib reesei -preparaatin sellulaasijärjestelmän entsyymejä co koodaavat geenit todella indusoituneet soforoosin lisäyk- oo ^ sestä. Varsinaisesti esillä olevassa keksinnössä käytetty oo koetin on saatu CBH II -kloonista, joka on tuotettu tun-35 nettuja menetelmiä käyttäen. Yksityiskohtaisempi tieto siitä, miten klooni tuotettiin, löytyy julkaisusta Chen et 15 al., "Nucleotide Sequence and Deduced Primary Structure of Cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei", Bio/Techno-logy 5 (March 1987) . CBH II -kloonille suoritettiin kohdistettu mutageneesi ja Bgl II -kohta asetettiin täsmäl-5 leen avoimen lukukehyksen 5'-päähän ja Nhe I -kohta täsmälleen 3'-päähän. Bgl II- ja Nhe I -restriktiofragmentti, joka sisältää CBH II: n koodaavan sekvenssin, kloonattiin edelleen pUC218-phagemid-vektoriin. Sen jälkeen CBH II -geeni pilkottiin ja eristettiin geelillä, minkä jälkeen 10 lisättiin leima.
Tulokset Th_ reesein RNA:n Northern-blotista, jossa koettimena oli käytetty cbh2-koetinta, osoitti, että cbh2-spesifinen mRNA saavutti huipun 14 - 18 tunnin kuluttua induktion jälkeen. Näistä tuloksista voidaan päätellä, et-15 tä koko sellulaasikompleksi, joka sisältää β-glukosi- daasin, indusoituu tänä ajankohtana. Tämän jälkeen yhdistetään 14, 18 ja 22 tunnin kokonais-RNA:t.
Kun kokonais-RNA:n spesifiset fraktiot on yhdistetty, siitä eristetään polyadenyloitu mRNA. Transkription 20 jälkeinen polyadenylaatio on useimpien eukaryootti mRNA:iden biogeneesin yleinen piirre. Juuri syntetisoiduilla RNA:illa on pitkät poly(A)alueet, joilla on taipumus lyhentyä, kun mRNA:t vanhenevat. Juuri syntetisoitu polyadenyloitu mRNA eristetään edelleen kokonais-RNA:sta tunnetuilla menetel-25 millä. Näihin menetelmiin kuuluvat oligo(dT)selluloosan, poly(U)sefaroosin, käyttö, adsorptio poly(U)suodattimille q tai nitroselluloosamembraanisuodattimille ja uutto niistä
CM
^ ja muita vastaavia. On edullista käyttää oligo(dT)sellu- ^ loosakromatografiaa mRNA:n eristämiseksi Sambrookin et oo ^ 30 ai.'n kuvaaman menetelmän mukaan: Molecular Cloning, A Laji boratory Manual, 2. painos, Cold Spring Harbor Laboratory pj Press (1989). Tarkemmin sanottuna kokonais-RNA-fraktiot oo ajetaan kromatografiahartsin läpi, ja mRNA eluoidaan siitä co ...
σ> eluutiopuskurilla. RNA, joka sitoutuu pylvääseen, rikastuu 35 paljon poly(A)hännällisten RNA:iden suhteen, ja näin estyy kontaminanttien, kuten rRNA:n ja osittain pilkkoutuneiden 16 mRNA:iden sitoutuminen. On tärkeää, että puhdistus onnistuu siten, että olisi enemmän mRNA-kopioita ja vähemmän vääriä ei-lähetti RNA:ita, kun cDNA syntetisoidaan mRNA:sta.
5 Preparaattien kokonais-RNA ja polyadenyloitu RNA
fraktioitiin edelleen l-%lisillä formaldehydigeeleillä, siirrettiin NytranR~membraaneille ja analysoitiin sen varmistamiseksi, että sellulaasikompleksin entsyymit indusoituvat polyadenyloituna mRNA:na.
10 Sen jälkeen kun polyadenyloitu mRNA on eristetty kokonais RNArsta, siitä syntetisoidaan komplementaarinen DNA eli cDNA. cDNA:n ensimmäinen säie syntetisoidaan käyttäen reaktion katalysoimiseen RNA-riippuvaista DNA-polyme-raasia (käänteistranskriptaasia). Linnun käänteistran-15 skriptaasia, joka puhdistetaan linnun retroviruspartikke-leista, tai hiiren käänteistranskriptaasia, joka eristetään Eh_ colin kannasta, joka ekspressoi Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasin kloonattua kopiota, voidaan käyttää esillä olevassa keksinnössä. On kui-20 tenkin edullista käyttää Moloney-hiiren leukemiaviruksen (M-MLV) käänteistranskriptaasia ensimmäisen cDNA-juosteen syntetisoimiseksi polyadenyloidusta mRNA-populaatiosta. Määrä, joka kloonattua M-MLV-käänteistranskriptaasia tarvitaan, saattaa vaihdella synteesireaktiossa käytettävän po-25 lyadenyloidun mRNA:n määrästä riippuen. Yleensä reaktiota kohden käytetään noin 200 U/μΙ käänteistranskriptaasia 5 2-10 pg:aa kohti mRNArta.
(M
^ Synteesiseoksessa on myös aluke, joka tarvitaan ° aloittamaan DNA:n synteesi. cDNA:n kloonaukseen voidaan 00 ^ 30 käyttää mitä tahansa aluketta, mutta on edullista käyttää g oligo (dT) : ta, joka sisältää 12 - 18 nukleotidia ja joka co sitoutuu eukaryoottisolun mRNA-molekyylien 3'-päissä ole- oo viin poly(A)alueisiin. Aluketta lisätään reaktioseokseen oo ...
a runsaasti ylimäärin, siten että kukin mRNA-molekyyli sitoo 35 useita oligo (dT) i2-i8_molekyyle j a. On edullista käyttää noin 12,5 pg aluketta, jonka pitoisuus on 0,5 mg/ml.
17
Entsyymin ja alukkeen lisäksi reaktioseos sisältää yleensä puskuri- ja dNTP-seosta, joka sisältää dATP:ia, dCTP:ia, dGTPria ja dTTP:ia, siten että kunkin lopullinen pitoisuus on 500 μΜ. Esillä olevassa keksinnössä voidaan 5 ensimmäisen cDNA-säikeen synteesiin käyttää mitä tahansa puskuria, mikä sopii yhteen tämän synteesin kanssa. On edullista käyttää puskurijärjestelmää, joka sisältää 250 mM Tris-HCl:a (pH 8,3), 375 mM KCl:a, 15 mM MgCl2:a ja 50 mM
ditiotreitolia. Yleensä synteesiliuos sisältää noin 500 μΐ 10 puskuria.
Ensimmäisen säikeen synteesin jälkeen toinen cDNA:n säie voidaan syntetisoida lukuisilla alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten hiusneula-aloitussynteesillä denaturoimalla cDNA:mRNA-kompleksi, lisäämällä E_;_ colin 15 DNA-polymeraasin Klenow-fragmentti tai käänteistranskrip-taasi ja pilkkomalla hiusneulasilmukka Sl-nukleaasilla, jolloin syntyy kaksisäikeinen cDNA-molekyyli, Okayama- ja Berg-menetelmällä, Gubler- ja Hoffman-menetelmällä ja vastaavilla menetelmillä. Okayama- ja Berg-menetelmässä 20 käytetään E^ colin RNaasi H:ta tekemään sattumanvaraisesti aukkoja mRNA:han, jolloin RNA korvautuu nick-trans-laatioreaktiossa E. colin DNA-polymeraasi I:n katalysoimana. Okayama- ja Berg-menetelmässä mRNA:ta käytetään alukkeena 25 colin DNA-polymeraasi I:n katalysoimassa DNA-syntee- sissä.
5 Edullinen menetelmä syntetisoida toinen säie on
(M
^ modifioitu Gubler— ja Hoffman-menetelmä. Tässä menetelmäs- ° sä käytetään E. colin RNaasi H:ta, DNA-polymeraasi I:stä oo — - 0X1 30 ja DNA-ligaasia toisen säikeen muodostamiseksi. Itse asi- £ assa esillä olevassa keksinnössä voidaan käyttää kahta eri co menettelytapaa toisen säikeen syntetisoimiseksi. Ensimmäi- oo ^ sessä menetelmässä käytetään RNaasi H:ta, joka sattumanva- oo <J> raisesti pilkkoo RNA: DNA-hybridiä, jolloin syntyy aukkoja 35 niiden aukkojen lisäksi, joita käänteistranskriptaasi tuotti. Mikäli lähetin 5'-pään RNA:hän tehdään liian monta 18 aukkoa, ennen kuin toisen säikeen synteesi alkaa, voi syntyä niin pieniä fragmentteja, etteivät ne pysy hybrideinä, jolloin ne eivät voi toimia alukkeina. Lisäksi aivan 5'-pään RNA-oligomeeri, joka toimii alukkeena toisen säikeen DNA-syn-5 teesissä, jatkaa pilkkoutumista, kunnes toisen säikeen DNA:n 5 ' -päähän jää vain kaksi ribonukleotidia. Nämä ovat substraatteja polymeraasi I:n RNaasi H-aktiivisuudelle, ja jäljellä olevat nukleotidit poistuvat. Tästä johtuu, että ensimmäisen säikeen cDNA:n 3'-pää jää yksisäikeiseksi, jol-10 loin se toimii substraattina polymeraasi I:n 3'-eksonukle-aasiaktiivisuudelle. Lopputuloksena syntyy joukko cDNA:ita, jotka ovat tasaisia päistään.
Vaihtoehtoinen menetelmä perustuu siihen, että M-MLV-käänteistranskriptaasi tuottaa aukkoja 10 - 20 emäksen 15 päähän hybridin RNA:n 5'-päästä. DNA-polymeraasi I:stä käytetään sitten synteesiin. Yleensä käytetään noin 500 yksikköä DNA-polymeraasi I:stä, jonka pitoisuus on 10 υ/μΐ. Vastinsäikeen synteesin jälkeen lisätään RNaasi H:ta DNA-polymeraasi I:n poiston jälkeen, jolloin muodostuu dublek-20 si, joka on kokonaan DNA:ta, lukuun ottamatta jäljelle jäävää RNA-5'-oligonukleotidia.
Toisen säikeen synteesi kummalla tahansa edellä esitetyllä menetelmällä tapahtuu yleensä puskurin ja dNTP-seoksen läsnä ollessa. Mitä tahansa alalla tunnettua toi-25 sen säikeen synteesissä käytettyä puskurointijärjestelmää voidaan käyttää, on kuitenkin edullista käyttää puskuri-q järjestelmää, joka sisältää 188 mM Tris-HCl:ia, pH 8,3,
CM
^ 906 mM KC1: a, 100 mM (NH4)2S04:a, 46 mM MgCl2:a, 37,5 mM
ditiotreitolia ja 1,5 mM NAD:ia. dNTP-seos sisältää edul-oo
^ 30 lisesti 10 mM dATP:ia, 10 mM dCTP:ia, 10 mM dGTP:ia ja 10 mM
g dTTP:ia.
oo Toisen säikeen synteesi tehdään alalla esitettyjen oo menetelmien mukaan. Edulliset menetelmät ja reagenssit, oo σ> joita käytetään cDNA:n syntetisormrseen esillä olevassa 35 keksinnössä, ovat BRL cDNA Synthesis SystemR (Bethesda Re- 19 search Laboratories, Gaithersburg, Maryland) ja Librarium System (Invitrogen, San Diego, CA).
Tässä vaiheessa yhdistetyt cDNA:t, joista pieni määrä koodaa bgll-geeniä, on jäljellä toisen säikeen syn-5 teesin jälkeen. Koska ainoastaan cDNA-poolin spesifisen bgll-geenifragmentin amplifikaatio on ratkaiseva β-gluko-sidaasigeenin eristämiselle, suunniteltiin spesifiset aluk-keet, cDNA-fragmentin, joka koodaa ΪΚ_ reesein bgll-geeniä, amplifioimiseksi polymeraasiketjureaktiossa (PCR). Käyte-10 tyt alukkeet ovat degeneroituneita alukkeita, jotka on suunniteltu hybridisoitumaan bgll-geenin cDNA:han, joka koodaa N-päätä ja geenin sisäistä CNBr-fragmenttia.
Yleensä on vaikea eristää bgll-geeniä, koska proteiinin aminohapposekvenssi ei sisällä riittävästi amino-15 happoja, joita harvinaiset aminohappotripletit koodaavat, ja näin ollen mikä tahansa käytetty oligonukleotidi olisi liian degeneroitunut amplifioidakseen spesifisesti bgll-geeniä PCR-reaktiossa. Tässä keksinnössä alukkeet suunniteltiin kuitenkin tutkimalla kypsän β-glukosidaasin amp-20 lifikaatiolle kohdistetun alueen aminohapot ja valitsemal la alueet, jotka tarvitsevat pienemmän geneettisen koodin degeneroitumisasteen. Ih_ reeseissä oleva kodonin poikkeama moniin muihin sellulaasigeeneihin, kuten cbhl:een, cbh2:een, egll:een, nähden otettiin myös huomioon, kun suunniteltiin 25 oligonukleotidialukkeita. Tarkemmin sanottuna kodonipoik-keama perustuu Th_ reesei -kannan eri geeneihin, jotka il-o mentävät edullista nukleotiditriplettiä, joka koodaa eri
CVJ
^ aminohappoja. Analysoimalla tämä kodonipoikkeama voidaan ^ määrittää se, että tietty aminohappoa koodaava nukleoti- 00 30 disekvenssi olisi edullinen. Esimerkiksi T. reesein cbhl-, x g cbh2- ja egl-geenit suosivat edullisesti CCU-triplettiä, co joka koodaa proliiniaminohappoa. Näin ollen, kun suunnitel ee ^ laan oligonukleotidikoetinta, olisi CUG-sekvenssi edulli- co σ> sempi valinta leusunia koodaavista tripleteistä kuin muut 35 leusiinia koodaavat tripletit (CUU, CUC, CUA, UUA ja CUG).
20
Lisäksi, kun oli valittu N-terminaalinen ja sekvenssin sisäinen alue amplifikaatioalukkeiksi, alukkeet suunniteltiin insertoimalla epäspesifinen emäs, inosiini, N-pään alukkeen muuttuvaan kohtaan ja käyttämällä 16 erilaisen 5 alukesekvenssin yhdistelmää sisäisenä alukkeena. Compton kuvaa degeneroituneiden alukkeiden valmistuksen perusteet artikkelissa "Degenerate Primers For DNA Amplification" ja Lee et ai. artikkelissa "cDNA Cloning Using Degenerate Primers" teoksessa PCR Protocols: A Guide to Methods and 10 Amplifications, jonka on julkaissut Academic Press (1990).
Käyttämällä yllä kuvattuja alukkeita bgll-geenin aminoterminaalista aluetta koodaavat cDNA-sekvenssit amp-lifioidaan sitten selektiivisesti PCR:ta käyttäen. Amplifi-kaatiomenetelmä sisältää aluksi 5-15 minuutin denatu-15 rointisyklin 95 °C:ssa, jota seuraa 1-7 minuutin hybridi-soitumisvaihe 35 - 55 °C:ssa, edullisesti 45 - 55 °C:ssa, ja 5 - 15 minuutin polymerisaatiosykli 65 °C:ssa. On kuitenkin edullista käyttää kymmenen minuutin denaturointi-sykliä alussa, jota seuraa kahden minuutin hybridisaatio 20 50 °C:ssa ja 10 minuutin, ja edullisesti 30 minuutin, po lymerisaatiosykli edellä kuvatuissa lämpötiloissa.
Amplifioitu fragmentti tunnistetaan sitten geeli-elektroforeesilla 700 emäsparin cDNA-segmentiksi. Amplifioitu cDNA-pooli fraktioidaan edelleen polyakryyliamidigee-25 Iillä, jotta saadaan puhtaampi 700 emäsparin cDNA-frag- mentti kloonaustarkoituksiin. Kun 700 emäsparin fragmentit 5 on eluoitu geelistä, 700 emäsparin cDNA-fragmentit kloona- c\j ^ taan sen jälkeen phagemid-vektoriin. Mitä tahansa kloo- ° nausvektoria, esimerkiksi pUC18:aa, pUC19:ää, pUC118:aa, oo ^ 30 pUC119:ää, pBR322:ta, pEMBL:ää, pRSA101:ä, pBluecriptiä ja x £ muita vastaavia, voidaan käyttää cDNA bgll -geenin kloo- co naamiseen. On kuitenkin edullista käyttää pUC218- ja co £0 pUC219-kloonausvektoreita, jotka on johdettu pUC18:sta ja co σ> pUC19:stä insertoimalla M13:n intergeeninen alue. Kloo- 35 nausvektoreita, jotka sisältävät bgll-geenin sisältävän cDNA-fragmentin, käytetään sen jälkeen transformoimaan 21 E. colin JMlOl-kanta. Transformaation jälkeen tunnistettiin bgll-geenin sisältävät positiiviset pesäkkeet ja niistä eristettiin DNA kloroformi:fenoliuutto- ja etanolisaostus-menetelmää käyttäen.
5 Jatkokloonatun cDNA:n 700 emäsparin fragmentin nuk- leotidisekvenssi määritetään sen jälkeen Sanger et ai. 'n kuvaamalla dideoksiketjuterminaatiomenetelmällä U.S. Bio-chemicals -yhtiön SequenaseR-reagenssikittiä käyttäen.
Tästä nukleotidisekvenssistä määritettiin se, että 10 jatkokloonattu 700 emäsparin cDNA-segmentti sisälsi 150 aminohappoa koodaavan avoimen lukukehyksen, joka meni päällekkäin monien muiden sekvenoitujen, puhdistetun ree- sein β-glukosidaasin CNBr- ja proteolyyttisellä hajotuksella saatujen peptidien kanssa. Näin varmistettiin, että 15 kloonatut sekvenssit koodasivat ekstrasellulaarista Th_ ree-sein β-glukosidaasiproteiinia.
Koko β-glukosidaasigeenin genomisen version kloonaus tehtiin leimaamalla 700 emäsparin bgll-cDNA-frag-mentti 32P:lla käyttäen oligonukleotidien leimausmenetel-20 mää, jonka Sambrook et ai., supra, on kuvannut. Tätä koe-tinta käy-tetään tunnistamaan 6, 0 kiloemäksen juovaa T. reesein Hind III :11a hajotetusta genomisen DNA:n Southern-blotista.
T. reesein genominen DNA valmistetaan Southern-25 blot -analyysiä varten poistamalla proteiini genomisesta DNA:sta ja käsittelemällä se ribonukleaasi A:11a. Käsitel-q ty genominen DNA pilkotaan sen jälkeen yhdellä lukuisista
CM
^ restriktioentsyymeistä, kuten Eco RI:llä, Hind III :11a tai ^ jollakin vastaavalla, ajetaan geelissä, tehdään Southern- co 00 30 blot ja hybridisoidaan 700 emäsparin bgll-geenin leimatun g cDNA-fragmentin kanssa. Tämän analyysin perusteella pää- oq tettiin, että Hind III oli paras restriktioentsyymi bgll- eo geenin kloonaukseen.
CO
σ> Sen jälkeen Hind III:sta lisätään Th_ reesei -kan- 35 nan genomiseen DNA:han, ja siitä uutetaan DNA. Tästä di-gestiosta otettu näyte ajetaan agaroosigeelillä ja frakti- 22 oidaan elektroforeettisesti. Sen jälkeen geelistä tehdään Southern-blot ja se tutkitaan 700 emäsparin cDNA-koetti-mella. Hind III:lla pilkotun genomisen DNA:n Southern-blotista tunnistettiin 6,0 kiloemäksen juova. Jäljellä 5 olevasta Hind III:lla pilkotusta genomisesta DNA:sta ajettiin sitten preparatiivinen geelielektroforeesi, ja geelistä eluoitiin noin 5,0 - 7,0 kiloemäksen kokoinen DNA ja se kloonattiin phagemid-vektoriin ja käytettiin colin JM101:n transformoimiseksi, kirjaston luomista varten. Mi-10 tä tahansa phagemid-vektoria voidaan käyttää, kuten yllä kuvattuja, kuitenkin on edullista käyttää pUC218-vektoria. Transformaatiosta saadut pesäkkeet pesäkehybridisoitiin sitten käyttäen 700 emäsparin cDNA-fragmenttia koettimena tunnistamaan ne pesäkkeet, jotka sisälsivät bgll:tä koo-15 daavan kloonatun genomisen DNA:n. Transformaation positiiviset pesäkkeet poimitaan ja niistä eristetään DNA alalla tunnetuilla menetelmillä.
Tällaisesta positiivisesta pesäkkeestä eristetty DNA pilkotaan sen jälkeen eri restriktioentsyymeillä, sekä 20 yhdellä että erilaisilla kombinaatioilla, ja siitä ajetaan agaroosigeelielektroforeesi. Muodostunutta juovakuviota käytetään sitten restriktiokartan tekemiseen kloonatusta T^ ree-sein 6,0 kiloemäksen genomisesta DNA:sta. Digestiossa käytettyjä entsyymejä ovat Eco Rl, Sst I, Κρη I, Sma I, Bam 25 HI, Xho 1, Bgl II, Cla I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Hind III, Bal I, Pvu II ja vastaavat.
5 Samasta geelistä tehdään sitten Southern-blot-
(M
^ analyysi käyttäen koettimena samaa 700 emäsparin bgll- ^ cDNA:ta tunnistamaan, mitkä genomiset restriktiofragmentit 00 ^ 30 ovat homologisia bgll-cDNA:n kanssa. Koska näiden homolo- x g gisten fragmenttien sijainti voidaan määrittää suhteessa co 6,0 kiloemäksen genomisen fragmentin restriktiokarttaan, co ^ ja myös koska β-glukosidaasiproteiinin koosta (74 kd) voi- oo ...
en daan arvioida geenin pituus 2,1 kiloemäkseksi (koska ami- 35 nohapon keskimääräinen molekyylipaino on 105 daltonia, 74 kiloemäksen proteiini sisältää keskimäärin 705 aminohap- 23 poa, mikä puolestaan vastaa 2 115 emäsparia), kartoitusko-keet varmistivat sen, että koko bgll-geeni sisältyy geno-miseen Hind III -klooniin.
Pvu II- ja Bal I-restriktiofragmentit, kooltaan 5 600 - 1 500 emäsparia, hybridisoituivat 700 emäsparin cDNA
bgll -kloonin kanssa ja ne valittiin siksi jatkokloonatta-viksi pUC218 phagemid -vektoreihin. Nukleotidisekvenssi määritettiin käyttäen yllä kuvattuja Sangerin et ai. 'n menetelmiä. Pvu II- ja Bal I-jatkokloonit sekvenoitiin ja 10 jatkokloonien päällekkäin meneviä sekvenssejä verrattiin toisiinsa, kunnes löydettiin yksi yhtenäinen 3 033 emäsparin sekvenssi, jonka sisällä bgll-geenin nukleotidisekvenssi määritettiin molemmista säikeistä, ja kahden pienen intronin sijainti pääteltiin muiden filamenttihomegeenien 15 intronien homologian perusteella. Aminohapposekvenssi päätellään myös kuvion 1 mukaisesti.
Koko ΊΚ_ reesein bgll-geenin nukleotidisekvenssi ja siitä päätelty primaariaminohapposekvenssi esitetään kuviossa 1. Koodatun β-glukosidaasiproteiinin arvioitu mole-20 kyylipaino on 74 341. 31 aminohapon peptidi edeltää β-glu-kosidaasin kypsää aminopäätä, kuten on päätelty aminopään peptidisekvenssistä. Tämän peptidin sisällä on kolme mahdollista signaalipeptidaasin tunnistuskohtaa, jotka koostuvat Ala-X-Ala-peptideistä.
25 β-glukosidaasin primaariaminohapposekvenssi osoit taa seitsemän mahdollista N-kytkettyä glykosylaatiokohtaa o asemissa 208, 310, 417 ja 566, joissa on yhteistä Asn-X-
<M
^ Ser/Thr-X, missä X ei ole proliini. Kuitenkin asemien 45, ^ 566 ja 658 kohdissa on proliinitähde konsensussekvenssis- 00 ^ 30 sä, ja ne saattavat joko olla glykosyloituja tai glykosy- x g lortumattomra. Mitään epätavallisia kodonipoikkeamia ei co havaita bgll-geenissä muihin sellulaasigeeneihin verrattu- oo ^ na. Bgll:n koodaavan alueen katkaisee kaksi lyhyttä introko ...
σ> ma, 70 ja 64 emäsparin intronit, tässä järjestyksessä.
35 Kummassakin intronissa on silmukoitumiskohtadonori, silmu-koitumisakseptori ja silmukkahaara-akseptorikohdat, jotka 24 ovat homologisia reesein ja muiden filamenttihomeiden konsensussilmukoitumissignaalien kanssa.
Koska reesei -kannan bgll-geeni tunnistetaan ja voidaan kloonata, seuraava vaihe on tuottaa transformant-5 ti, jolla on ylimääräisiä bgll-geenin kopioita.
Ensin täytyy valita selektoiva markkeri, jotta transformoitu filamenttihome voitaisiin detektoida. Voidaan käyttää erilaisia selektoivia markkereita, esimerkiksi A. nidulansin tai reesein argB:tä, nidulansin amdS:ää, 10 Neurospora crassan, A. nidulansin tai reesein pyr4:ää, ja Aspergillus nigerin pyrGrtä. Selektoiva markkeri voidaan saada geenistä, joka spesifioi uutta fenotyyppiä, kuten kykyä hyväksikäyttää metaboliittia, jota transformoitavat filamenttihomeet eivät yleensä metaboloi, tai kykyä 15 vastustaa kemikaalien tai antibioottien aiheuttamia toksisia shokkivaikutuksia. Esillä olevassa keksinnössä tarkastellaan myös synteettisiä geenimarkkereita, joita voidaan syntetisoida alalla tunnetuilla menetelmillä. Transforman-tit voidaan sen jälkeen valikoida sinne viedyn selektoivan 20 markkerin perusteella. Koska reeseissä ei ole amdS- geeniä, on edullista käyttää reeseissä selektoivana markkerina amds-geeniä, joka koodaa asetamidaasientsyymiä, joka sallii transformanttisolujen kasvatuksen asetamidi typenlähteenä. Tapauksessa, jossa bgll-geeni deletoidaan 25 Tb_ reeseistä, on edullista käyttää pyrG-geeniä selektoivana markkerina.
o Käytetyn isäntäkannan tulisi olla sellaisten fila-
<M
^ menttihomeiden mutantti, joilta puuttuu, tai joilla on ^ toimintakyvytön geeni tai geenejä, jotka vastaavat valit- oo ^ 30 tua selektoivaa markkeria. Esimerkiksi, jos argB:tä käyte- £ tään selektoivana markkerina, käytetään transformaatiome- oo netelmässä vastaanottajana spesifistä arg"-mutanttikantaa.
oo
Muita esimerkkejä selektoivista markkereista, joita voi-
CO
en daan käyttää esillä olevassa keksinnössä, ovat geenit trp, 35 pyr4, pyrG, trpl, oliC31, Bml, pkiA, niaD, leu ja muut vastaavat. Vastaavan vastaanottajakannan täytyy siksi olla 25 sellainen mutanttikanta, kuin trp~, pyr“, leu” tai vastaava .
Mutanttikanta saadaan lähtöisäntäkannasta, joka on mikä tahansa filamenttihomekanta. On kuitenkin edullista 5 käyttää filamenttihomeen ylituotantomutanttikantaa ja erityisesti edellä kuvattua reesein ylituottokantaa, koska tämä kanta erittää paljon proteiinia ja erityisesti paljon sellulaasientsyymejä. Valittua mutanttikantaa käytetään sitten transformaatioprosessissa. Edullinen Td_ reesein 10 kanta käytettäväksi bgll-geenin deletioon on RLP37 pyrG69, uridiiniauksotrofi.
Valitun filamenttihomeen mutanttikanta voidaan valmistaa monilla alalla tunnetuilla tekniikoilla, kuten suodatus-rikastustekniikalla, jonka on kuvannut Nevalainen 15 julkaisussa "Genetic improvement of enzyme production in industrially important fungal strains", Technical Research Center of Finland, Publications 26 (1985). Toinen tekniikka, jolla saadaan mutanttikanta, on tunnistaa mutantit erilaisissa kasvualustan olosuhteissa. Esimerkiksi argdnu-20 tantit voidaan tunnistaa käyttämällä minimialustasarjaa, joissa on eri arginiinibiosynteesin välituotteita. Toinen esimerkki on pyr‘-mutanttikantojen tuotto altistamalla kannat fluoro-oroottihapolle (FOA). Kannat, joilla on intakti pyr4-geeni, kasvavat uridiinialustalla ja ovat herkkiä 25 fluoro-oroottihapolle, ja siksi on mahdollista FOA-resis- tenssin avulla poimia pyr4-mutantit.
0 Valittu selektoiva markkeri kloonataan sen jälkeen
CVJ
pjj sopivaan plasmidiin. Esillä olevassa keksinnössä voidaan ° käyttää mitä tahansa plasmidia, kuten pUC18:aa, pBR322:ta 00 0X1 30 ja muita vastaavia, selektoivan markkerin kloonaukseen. On £ kuitenkin edullista käyttää pUC100:aa. Vektori muodoste- oo taan pilkkomalla pUCIOO Sma I-restriktioentsyymillä, minkä oo ^ jälkeen 5 ’-fosfaattiryhmät poistetaan pilkkomalla vasikan oo alkalisella fosfataasilla. Vektorifragmentti puhdistetaan 35 sen jälkeen geelielektroforeesilla, jota seuraa eristetyn geelipalan elektroeluutio. A^ nidulansin amdS-geeni eris- 26 tetään 2,4 kiloemäksen Sstl-restriktiofragmenttina, minkä jälkeen vektorisekvenssit eristetään tunnetuilla menetelmillä, kuten Hynesin et ai. rn kuvaamalla tavalla: Mol.
Cell. Biol. 3 (1983) 1430 - 1439. Sen jälkeen 2,4 ki- 5 loemäksen SstI amdS -fragmentti ja 2,7 kiloemäksen pUCIOO-vektorifragmentti liitetään yhteen ja ligaatioseos viedään sitten coli -isäntäkantaan JM101.
Esillä olevassa keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa plasmidia bgll-geenin insertoimiseksi, mutta on 10 edullista käyttää pSAS-plasmidia.
ρΞΑΞβ-ρΙυ muodostetaan pilkkomalla pSAS Hind III-restriktioentsyymillä ja puhdistamalla lineaarinen fragmentti geelielektroforeesilla ja elektroeluutiolla. Tähän Hind III:lla käsiteltyyn pSAS-vektorifragmenttiin liite-15 tään 6,0 kiloemäksen Ih_ reesein genomisen DNA:n Hind III-fragmentti, joka sisälsi bgll-geenin koko koodaavan alueen sekä transkriptioon ja translaatioon tarvittavat sekvenssit. Kuvio 2 valaisee pSASp-glu:n muodostumista.
On myös mahdollista muodostaa vektoreita, jotka 20 sisältävät ainakin yhden ylimääräisen kopion bgll-gee-nistä, ja muodostaa vektoreita, joissa bgll-geenin aminohapposekvenssi on muunnettu alalla tunnetuilla tavoilla, kuten kohdistetulla mutageneesillä, PCR-menetelmillä ja kemiallisen mutaation avulla.
25 Sen jälkeen kun sopiva vektori on muodostettu, si tä käytetään filamenttihomekantojen transformoimiseksi.
^ Koska filamenttihomeiden (esim. T. reesein) soluseinämien
(M
^ läpäisevyys on hyvin huono, halutun DNA-sekvenssin, geenin ° tai geenifragmentin sisäänotto on parhaimmillaankin mini- 00 ^ 30 maalinen. Tämän ongelman ratkaisemiseksi soluseinämän lä- £ päisevyyttä voidaan lisätä tai DNA voidaan suoraan ampua pr) soluihin partikkelinampumismenetelmällä. Partikkelinampu- oo mismenetelmässä solun sisään saatettavalla DNA:11a pääl-
CO
σ> lystetään mikroniluokan helmiä, ja nämä helmet kirjaimel- 35 lisesti ammutaan soluihin, jolloin DNA jää soluihin ja so-lumembraaniin jää aukko. Sen jälkeen solu korjaa itse so- 27 lumembraanin jättäen inkorporoidun DNA:n solun sisälle. Tämän yllä kuvatun menetelmän lisäksi on paljon menetelmiä filamenttihomeiden soluseinämien läpäisevyyden nostamiseksi mutanttikannoilla (toisin sanoen niillä, joilta puuttuu 5 käytetyn selektoivan markkerin funktionaalinen geeni) ennen transformaatiokäsittelyä.
Eräässä menetelmässä lisätään filamenttihomesolui-hin suuria pitoisuuksia emästä tai alkali-ioneja. Esillä olevassa keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa alkali-10 tai maa-alkalimetalli-ionia, on kuitenkin edullista käyttää joko CaCl2:ia tai litiumasetaattia ja edullisempaa käyttää litiumasetaattia. Alkali- tai maa-alkali-ionien pitoisuus saattaa vaihdella riippuen käytetystä ionista, ja yleensä käytetään 0,05 - 0,4 M pitoisuuksia. On edul-15 lista käyttää noin 0,1 M pitoisuutta.
Vielä eräs menetelmä, jota voidaan käyttää lisäämään soluseinämän läpäisevyyttä ja DNA:n sisäänottoa fila-menttihomeilla, on suspendoida solut uudelleen kasvualustaan, jota on täydennetty sorbitolilla ja vasikan haimasta 20 saadulla kantaja-DNA:11a. Täydennettyyn alustaan lisätään sitten lasihelmiä ja seosta sekoitetaan Vortexilla suurella nopeudella noin 30 sekuntia. Tämä käsittely rikkoo so-luseinämät, mutta saattaa tappaa monia soluja.
Vielä eräs menetelmä valmistaa filamenttihome 25 transformaatiota varten on protoplastien valmistaminen.
Homerihmasto on protoplastilähde, joten rihmasto voidaan 5 eristää soluista. Sen jälkeen protoplastivalmisteita
(M
^ suojataan suspensioalustan osmoottisella stabilaattorilla.
° Näitä stabilaattoreita ovat sorbitoli, mannitoli, natrium- oo 0X1 30 kloridi, magnesiumsulfaatti ja vastaavat. Yleensä näiden £ stabilaattoreiden pitoisuus on 0,8 - 1,2 M. On edullista co käyttää noin 1,2 M sorbitoliliuosta suspensioalustassa.
oo DNA:n sisäänotto isäntämutanttifilamenttihomekan-oo σ> taan on riippuvainen kalsiumionipitoisuudesta. Yleensä käy- 35 tetään noin 10 - 50 mM CaCl2 sisäänottoliuoksessa. Sen lisäksi, että sisäänottoliuoksessa pitää olla kalsiumioneja, 28 muita yleensä tarvittavia seikkoja ovat puskurointijärjes-telmä, kuten TE- puskuri (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA) tai 10 mM MOPS-puskuri, pH 6,0, (morfoliinipropaanisulfo-nihappo) ja polyetyleeniglykoli (PEG). Polyetyleeniglykoli 5 fuusioi solumembraaneja sallien siten rihmaston sisällön siirtyä filamenttihomemutanttikannan sytoplasmaan ja plas-midi-DNA:n ytimeen. Tämä fuusio jättää usein monia plasmi-di-DNA-kopioita peräkkäin integroituneiksi isännän kromosomiin. Yleensä sisäänottoliuoksessa käytetään suurta 10 PEG-pitoisuutta. Sisäänottoliuoksessa voidaan käyttää kymmeneen tilavuuteen saakka 25-%:ista PEG 4 000:a. On kuitenkin edullista lisätä noin neljä tilavuutta sisäänotto-liuokseen. Lisäaineita, kuten dimetyylisulfoksidia, hepa-riinispermidiiniä, kaliumkloridia ja vastaavia, saatetaan 15 myös lisätä sisäänottoliuokseen transformaation avustamiseksi.
Yleensä transformaatiossa käytetään suspensiota, joka sisältää filamenttihomemutanttisoluja, joita on käsitelty läpäisevyyden lisäämiseksi, tai protoplasteja edul-20 lisesti 108 - 109/ml tiheytenä. Nämä protoplastit tai solut lisätään sisäänottoliuokseen halutun transformaa-tiovektorin kanssa, joka sisältää selektoivan markkerin ja muita kiinnostavia geenejä transformaatioseoksen muodostamiseksi .
25 Seosta inkuboidaan sitten 4 °C:ssa 10 - 30 minuut tia. Lisää PEG:ia lisätään sen jälkeen sisäänottoliuokseen 5 halutun geenin tai DNA-sekvenssin sisäänoton lisäämiseksi.
(M
^ PEG voidaan lisätä jopa 10-kertaisena tilavuutena verrat- ^ tuna transformaatioseokseen nähden, edullisesti noin 9-ker- oo ^ 30 täisenä. Sen jälkeen kun PEG on lisätty, transformaa- £ tioliuosta inkuboidaan huoneenlämpötilassa ennen sorbito- oo Iin ja CaCl2-liuoksen lisäämistä. Sen jälkeen lisätään oo protoplastisuspensio sulatettuihin kasvualustaeriin. Tämä oo ..... ....
σ> kasvualusta ei sisällä undimia ja sallii selektiivisesti 35 vain transformanttien kasvun. Saadut pesäkkeet siirretään ja puhdistetaan kasvualustalla, jossa ei ole sorbitolia.
29 Tässä vaiheessa stabiilit transformantit voidaan erottaa epästabiileista transformanteista nopeuden ja sen mukaan, että muodostuu sirkulaarisia pesäkkeitä, joilla on pikemminkin sileät kuin epätasaiset reunat kiinteällä kas-5 vualustalla. Lisäksi joissakin tapauksissa voidaan tehdä lisästabiilisuustesti kasvattamalla transformantteja kiinteällä, ei-selektiivisellä alustalla, keräämällä itiöt tältä kasvualustalta ja määrittämällä se näiden itiöiden prosenttiosuus, joka tämän jälkeen jakautuu ja kasvaa se-10 lektiivisellä alustalla.
Sen varmistamiseksi, että transformaatio tapahtui yllä kuvatuilla menetelmillä, transformanteille tehdään lisäanalyysejä, kuten Southern-blot -analyysi ja autora-diografia. Käyttäen samoja yllä mainittuja perusmenetel-15 miä, koko bgll-geeni voidaan deletoida vektorista ja transformoida filamenttihomekantoihin tai bgll-geeni voidaan muuntaa ja transformoida filamenttihomekantoihin.
Sen jälkeen kun on varmistettu, että transformoidut kannat sisälsivät ainakin yhden ylimääräisen kopion 20 bgll-geenistä tai geeniteknologisesti muunnetun bgll-gee- nin kantoja viljellään edelleen olosuhteissa, jotka sallivat näiden transformanttien lisääntymisen. Transformantit voidaan sitten eristää kasvualustasta ja käyttää monissa sovellutuksissa, joita kuvataan alla. Vaihtoehtoisesti trans-25 formantteja voidaan edelleen fermentoida ja rekombinantti homesellulaasikoostumus voidaan eristää kasvualustasta. 5 Koska esillä olevassa keksinnössä tuotetut transformantit
(M
^ voivat esimerkiksi ilmentää parannettua tai muunnettua ^ ekstrasellulaarista β-glukosidaasia fermentaatioalustassa, 00 30 homesellulaasikoostumukset voidaan eristää alustasta. Yleen- £ sä eristysmenetelmässä sentrifugoidaan kasvatus- tai fermen- oo taatioalusta, joka sisältää transformantit, ja superna- co tantti suodatetaan ultrasuodattamalla geeniteknologisesti co σ> tuotetun homesellulaasikoostumuksen saamiseksi. Vaihtoeh- 35 toisesti voidaan sen jälkeen lisätä vielä antimikrobiaa- lista ainetta koostumukseen, ennen kuin sitä käytetään 30 useissa alla kuvatuissa sovellutuksissa. Esimerkkejä mik-robiaalisista aineista, joita voidaan lisätä, ovat natri-umatsidi, natriumbentsoaatti ja vastaavat.
Jotta todistettaisiin se, että esillä olevan kek-5 sinnön mukaisella menetelmällä tuotetuilla transforman-teilla on suurempi aktiivisuus hajottaa sellobioosia, tehtiin seuraava koe. Tässä kokeessa 50 mg sellobioosia, joka oli suspendoitu 1,0 ml:aan fosfaattipuskuria (pH 5,0), saatettiin reagoimaan transformantin tuottaman fermentaa-10 tiotuotteen (65,5 mg/ml proteiinia) kanssa käyttäen normaalista ei-mutantti reesei -kannasta peräisin olevaa fermentaatiotuotetta kontrollina (135,0 mg/ml proteiinia). Tulokset sellobiaasiaktiivisuudesta lähtöolosuhteissa esitetään alla olevassa taulukossa I: 15
Taulukko I
Tuote Proteiini (mg/ml) Sellubioosia pilkkova aktiivisuus mikromoolia glukoosia/mg proteiinia 20 Kontrolli 135,0 6
Esillä ole- 65,5 33 valla keksinnöllä tuotettu tuote 25 Tämän kokeen tulokset osoittavat, että esillä ole- o van keksinnön mukaisten transformanttien tuottamalla fer-
<M
^ mentaatiotuotteella on ainakin viisinkertainen sellobi- ^ oosisubstraattia pilkkova spesifinen aktiivisuus verrattu- 00 ^ 30 na ei-mutantti Th_ reesei -kontrollikantaan.
x ^ Lisäksi kuviot 7 ja 8 todistavat, että Avicel- ja co PSC-substraattien hydrolyysi lisääntyy (huomautus: PSC on co ^ fosforihapossa turvotettu selluloosa, joka on saatu käsit- 00 ...
o> telemällä Avicelia fosforihapolla) käytettäessä l,0-%:ista 35 entsyymi/substraattia. Kokeessa PSC tai Avicel suspendoi-tiin 2 ml: aan 50 mM natriumasetaattipuskuria, pH 4,8, ja 31 suspensiota inkuboitiin 40°:ssa ilman sekoitusta enintään 24 tuntia. Liukeneva pelkistävä sokeri mitattiin Nelsonia Somogyi-menetelmällä. Näistä kuvioista selviää edelleen, että esillä olevan keksinnön mukaisilla transforman-5 teillä tuotetuilla, parannetuilla rekombinanteilla β-glu-kosidaasifermentaatiotuotteilla on suurempi nopeus ja hyd-rolyysiaktiivisuusmäärä eri substraatteja kohtaan verrattuna standardiin Cyt-123-kontrolliin (keskimäärin 20 % suurempi aktiivisuus). Cyt-123-kontrolli on tuote, joka saa-10 daan reesein sellulaasiylituottokannasta, kun sitä fermentoidaan teollisuusmittakaavassa.
Rikastettuja transformantteja voidaan käyttää useissa eri sovellutuksissa. Esimerkiksi joitakin β-glu-kosidaaseja voidaan edelleen eristää kasvatusalustasta, 15 joka sisältää parannettuja transformantteja, ja lisätä viinirypäleisiin viinin valmistuksen aikana lopullisen viinituotteen mahdollisen aromin parantamiseksi. Vielä eräs sovellutus on käyttää β-glukosidaasia hedelmissä niiden aromin parantamiseksi. Vaihtoehtoisesti eristettyä re-20 kombinanttia fermentaatiotuotetta, joka sisältää parannettua β-glukosidaasia, voidaan käyttää suoraan elintarvikelisäaineissa tai viinintekoprosessissa maun ja aromin lisäämiseksi .
Koska selluloosatuotteiden hydrolyysinopeus para-25 nee käytettäessä transformantteja, joilla on ainakin yksi ylimääräinen bgll-geenikopio insertoituna genomissa, tuot-o teitä, jotka sisältävät selluloosaa tai heteroglykaaneja,
CM
^ voidaan hajottaa nopeammin ja enemmän. Selluloosasta teh- ^ tyjä tuotteita, kuten paperia, puuvillaa, selluloosavaip- oo ^ 30 poja ja vastaavia, voidaan hajottaa tehokkaammin täyttö- £ maassa. Kuvio 9 valaisee lisätyn β-glukosidaasipreparaa- oo tin käyttöä, jolloin preparaatti on eristetty fermen- oo tointialustasta, joka sisältää transformantteja, joilla on oo O) ainakin yksi ylimääräinen bgll-geenikopio insertoituna ge- 35 nomissa verrattuun ei-parannettuun Cyt-123-standardiin (kuvattu yllä) selluloosavaippatuotteessa. Tämä hydrolyysikoe 32 tehtiin käyttäen 0,4 mg standardia ja fermentaatiotuotetta 100 mg:aa substraattia (selluloosavaippa) kohden. Koe tehtiin 50 °C:ssa viiden tunnin ajan, ja glukoosipitoisuus mitattiin rinnakkaisina eri ajankohtina. Tämä käyrä kuvaa 5 kasvavaa hydrolyysinopeutta transformantin, jolla on ylimääräisiä bgll-kopioita, fermentointituotteen tuottamalle tuotteelle, verrattuna standardiin. Määritettiin myös, että vaipasta peräisin olevat kuidut olivat noin 14-%:isesti liukenemattomia vesiliuokseen. Näin transformanteista saa-10 tua fermentaatiotuotetta tai pelkkiä transformantteja voidaan käyttää koostumuksissa hajoamisen edistämiseksi tekemällä liukoisiksi monia selluloosatuotteita, jotka lisäävät ylikuormitettua täyttömaata.
Samanaikainen sakkarifikaatio ja fermentaatio on 15 prosessi, jossa biomassassa oleva selluloosa muuttuu glukoosiksi, ja samalla ja samassa reaktorissa hiivakannat muuttavat glukoosia etanoliksi. Hiivakannat, joita tiedetään käytettävän tämänkaltaisessa prosessissa, ovat B. clausenii, S. cerevisiae, Cellulotyticus acidothermo- phi-2 0 lium, C. brassicae, C. lustinaniae, S. uvarum, Schizosac- charomyces pombe ja vastaavat. Tästä prosessista syntyvää etanolia voidaan edelleen käyttää oktaanin lisääjänä tai suoraan polttoaineena bensiinin asemesta, mikä on edullista, koska etanoli polttoainelähteenä on ympäristöystäväl-25 lisempää kuin raakaöljystä johdetut tuotteet. Tiedetään, että etanolin käyttö parantaa ilman laatua ja mahdollises- o ti alentaa paikallisia otsonitasoja ja savusumun määrää.
C\l ^ Lisäksi etanolin käyttö bensiinin sijasta voi olla strate- ° gisesti tärkeä, kun pehmennetään nopeiden muutosten vaiku- 00 0X1 30 tusta uusiutumattoman energian ja petrokemian jakelussa.
g Etanolia voidaan tuottaa sakkarifikaatiolla ja or) fermentaatioprosesseilla selluloosabiomassasta, kuten puus- oo ta, ruohokasveista, taajamien kiinteästä jätteestä ja
CO
σ> maanviljely- ja metsätalousjätteistä. Kuitenkin tämän pro- 35 sessin eräs suuri ongelma on β-glukosidaasin puute järjestelmässä sellobioosin muuttamiseksi glukoosiksi. Tiede- 33 tään, että sellobioosi toimii sellobiohydrolaasien ja en-doglukanaasien inhibiittoreina ja laskee siten koko sellu-laasijärjestelmän hydrolyysinopeutta. Siksi lisätyn β-glu-kosidaasiaktiivisuuden käyttö sellobioosin muuttamiseksi 5 nopeasti glukoosiksi kiihdyttäisi suuresti etanolin tuottoa. Tämän asian valaisemiseksi sytolaasi 123:a ja esillä olevan keksinnön mukaisten transformanttien tuottamaa fer-mentaatiotuotetta (normalisoitu sytolaasiksi kokonaispro-teiinin perusteella) verrattiin fermentaatio-olosuhteissa 10 niiden kyvyn suhteen hydrolysoida raakapaperifraktioita, jotka koostuivat 50 - 60-%risesti taajaman kiinteän jätteen (MSW) kuitufraktion (RDF) selluloosasta. Tällaiset suspensiot olivat 50 mM natriumasetaattipuskurissa, pH 4,8 - 5,0, ja ne tasapainotettiin 30 °C:ssa. Pulloihin lisät-15 tiin sitten 4 % Saccharomyces cerevisiae -hiivaa ja siitä otettiin näyte tietyin aikavälein 80 tuntiin asti. Sen jälkeen mitattiin etanolin saanto. Seuraava taulukko II valaisee sitä, että etanolia on mahdollista tuottaa enemmän käyttämällä esillä olevan keksinnön mukaista parannet-20 tua β-glukosidaasivalmistetta taajaman kiinteäjäteprepa-raatteja selluloosan lähteenä käyttäen.
Taulukko II
Annos graramaa/litra etanolia 25 mg proteiinia/ Sytolaasi Runsaasti B-Glu si- g selluloosaa 123 sältävä preparaatti 5 10 2,1 5,0
CM
, 20 5,3 7,2 co ' ° 30 6, 9 8,8 oo w 30 40 8,0 9,3 | 50 8,5 9,3 ςτ) 60 8,5 9,3 co
CD
CM
co O)
Taulukosta II voidaan selvästi nähdä, että esillä 35 olevan keksinnön mukaisesti parannettu β-glukosidaasipre-paraatti lisää etanolin tuotantoa verrattuna sytolaasi 34 123-kontrolliin erityisesti matalilla proteiinikonsentraa- tioilla.
Tämän keksinnön mukaisissa detengenttikoostumuk-sissa voidaan käyttää sellulaasikoostumuksen lisäksi pin-5 ta-aktiivista ainetta, mukaan lukien anioniset, nonioniset ja amfolyyttiset pinta-aktiiviset aineet, hydrolaasia, ra-kenneaineita, valkaisuaineita, sinerrysaineita ja fluoresoivia värejä, kokkaroitumisen estoaineita, liuokseksi tekeviä aineita, kationisia pinta-aktiivisia aineita ja vas-10 taavia. Kaikki nämä koostumukset ovat tunnettuja deter-genttialalla. Perusteellisempaa pohdintaa varten katso US-patenttihakemus, sarjanro 07/593 919, joka on otsikoitu: "Trichoderma reesei Containing Deleted Cellulase Genes and Detergent Compositions Containing Cellulases Derived The-15 refrom", ja US-patenttihakemus, sarjanro 07/770 049, jätetty 4. pnä lokakuuta, 1991, ja jonka otsikko on "Trichoderma reesei Containing Deleted and/or enriched Cellulase and other enzyme Genes and Cellulase Compositions Derived Therefrom", joista molemmat sisältyvät tähän kokonaisina 20 viitteinä.
Vielä eräässä suoritusmuodossa voivat detergentti-koostumukset myös sisältää suurempia β-glukosidaasimääriä tai muunnettua β-glukosidaasia. Tässä suhteessa riippuu todella halutusta tuotetyypistä, jota käytetään detergent-25 tikoostumuksissa antamaan vastaavia vaikutuksia.
Sellulaasikoostumuksia käytetään edullisesti noin o 0,00005 - 5 painoprosenttisena suhteessa koko detergentti-
<M
koostumukseen. Sellulaasikoostumuksia käytetään edullisem- oo ^ min noin 0,01 - 5 painoprosenttisena suhteessa koko deter- oo ^ 30 genttikoostumukseen ja vieläkin edullisemmin noin 0,05 - 2 £ painoprosenttisena suhteessa koko detergenttikoostumukseen.
m Bgll-geenin deleetio aiheuttaisi myös sello-oligo- oo sakkaridien (esim. sellobioosin) kertymisen sellulaasijär-oo o jestelmällä käsiteltyihin selluloosaliuoksiin, joista oli- 35 gosakkaridit voidaan puhdistaa. Tässä suhteessa esillä oleva keksintö esittää mahdollisuuden eristää sello-oligo- 35 sakkaridit mikro-organismia käyttäen helpolla ja tehokkaalla tavalla.
Sello-oligosakkaridit ovat käyttökelpoisia määritettäessä sellulaasientsyymien entsymaattista aktiivisuut-5 ta ja myös syntetisoitaessa etanolia ja glukoosia. Tiedetään lisäksi, että tällaiset oligosakkaridit olisivat käyttökelpoisia elintarvikkeiden lisäaineina, kemiallisena välituotteena jne.
β-glukosidaaseja sisältävän sellulaasin käyttö sello-10 oligosakkaridien valmistamiseksi vaati aikaisemmin β-glukosi-daasin aktiivisuuden poistoa säätämällä liuoksen pH noin alle neljän ja yleensä noin 3,8:aan. Tässä pH:ssa β-glu-kosidaasi yleensä inaktivoituu. Tässä pH:ssa kuitenkin muut sellulaasin entsyymikomponentit ovat yleensä vähemmän 15 aktiivisia kuin niiden optimi-pH:issa, mistä seuraa se, että tällainen pH:n lasku β-glukosidaasin inaktivoimiseksi johtaa välttämättä tehottomampaan prosessiin.
Lisäksi esillä oleva keksintö sisältää myös T. reesein β-glukosidaasin nukleotidisekvenssin käytön eri-20 laisten koettimien suunnitteluun muiden filamenttihomeiden ekstrasellulaarisen β-glukosidaasigeenin identifioimiseksi. Tässä suhteessa koko bgll-geenin nukleotidisekvenssiä tai osaa siitä voidaan käyttää tunnistamaan ja kloonaamaan ulos vastaavia geenejä muista filamenttihomeista. Filamentti-25 homelähteitä ovat Trichoderma-, Aspergillus-, Neurospora-, Humicola-, Penicillium- ja vastaavien sukujen homeet. Tar- ^ kemmin sanottuna edullisia lajeja ovat Trichoderma reesei,
CM
^ Trichoderma viridae, Aspergillus niger, Aspergillus ory- zae, Neurospora erässä, Humicola grisae, Humicola inso- oo - - - - 30 lens, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Asper- £ gillus phoenicis, Trichoderma koningii ja vastaavat. Bgll- oo geenin lajihomologiasta johtuen filamenttihomeiden ekviva- oo £0 lentit geenit voidaan helposti tunnistaa ja kloonata. Täs- oo ....
σ> tä osoituksena ovat kuviot 10A ja 10B, jotka esittävät au- 35 toradiogrammia A^_ nidulansin ja crassan (kuvio 10A) ja H. grisean (kuvio 10B) Hind 111:11a ja Eco RI:llä pilko- 36 tusta DNArsta ajetusta blotista, joka on tutkittu P32-leimatulla Hind III:n 6,0 kiloemäksen bgll-DNA-fragmentti-koettimella, joka sisältää T^ reesein bgll-geenin. Nämä autoradiogrammit osoittavat selvästi, että Tb_ reesein 5 bgll-geeniä sisältävää DNA-fragmenttia voidaan käyttää tunnistamaan muiden homeiden ekstrasellulaarista bgll-geeniä .
Näin ollen muiden filamenttihomeiden bgll-geeni voidaan kloonata yllä esitetyillä menetelmillä käyttäen 10 koettimena P32-leimattua Tb_ reesein bgll-geeniä. Kun muiden filamenttihomeiden geenit on kloonattu, niitä voidaan käyttää transformoimaan filamenttihomeita, joista geeni oli saatu, tai muita filamenttihomeita, jotka tuottavat β-glukosidaasia ylimäärin, yllä kuvatuilla menetelmillä.
15 Esillä olevan keksinnön ja sen etujen perusteelli semmaksi selventämiseksi annetaan seuraavat spesifiset esimerkit, jotka on tarkoitettu vain selventäviksi eikä missään nimessä rajoittaviksi.
Esimerkki 1 20 Kokonais-RNA:n eristys Trichoderma reeseistä
Trichoderma reesein viljelmässä, joka tuottaa ylimäärin sellulaaseja, indusoitiin spesifisesti sellulaasia käyttäen soforoosia, β,1—2 diglukosidia, kuten Gritzali, 1977, kuvaa. Trichoderma reesein lähtökanta on sellulaase-25 ja ylimäärin tuottava kanta (RL-P37), joka on kehitetty mutageneesillä menetelmillä, joita ovat kuvanneet Sheir-5 Neiss, G. ja Montenecourt, B. S., Appi. Microbiol. Bio-
(M
^ technol. 20 (1984) 46 - 53. reesein myseeliymppi, peru- ° nadekstroosiagar (Difco) -viljelmästä, lisättiin 50 ml:aan 00 ^ 30 Trichoderma reesein perusalustaa, joka sisälsi 1,40 gram- £ maa/litra (NH^SO^a, 2,0 grammaa/litra KH2P04:a, 0,30 gram- oo maa/litra MgSCGia, 0,30 grammaa/litra ureaa, 7,50 gram- oo maa/litra BactoPeptonia, 5,0 ml/litra, 10 % Tween - 80 :ä, co en 1,0 ml/litra hivenaineita - EFG, pH 5,4, ja joka suodatet- 35 tiin 0,2 mikrometrin suodattimen läpi 250 ml:n väliseinäi-sessä pullossa. Tätä viljelmää inkuboitiin 30 °C:ssa 48 37 tuntia tehokkaalla ilmastuksella. Viljelmästä otettiin viiden millilitran eriä ja ne lisättiin seitsemään 250 ml:n pulloon, jotka sisälsivät tuoretta perusalustaa. Näitä kasvatettiin sen jälkeen 24 tuntia 30 °C:ssa. Kaikki vil-5 jelmät sentrifugoitiin kliinisellä pöytäsentrifugilla kiihtyvyydellä 2 400 x g 10 minuuttia. Myseelipelletit pestiin kolme kertaa 50 ml :11a 17 mM KHPCh-puskuria (pH 6,0). Lopuksi myseelit suspendoitiin kuuteen pulloon, jotka sisälsivät 50 ml 17 mM KHPCy-puskuria ja lisäksi 1 mM soforoosia, ja 10 kontrollipulloon, joka ei sisältänyt soforoosia. Pulloja inkuboitiin 18 tuntia 30 °C:ssa ennen keräämistä suodattamalla Miraclothin (Calbiochem) läpi. Ylimääräinen alusta puristettiin sen jälkeen pois ja myseelimatto pantiin suoraan nestetyppeen, jossa sitä voidaan säilyttää -70 °C:ssa 15 jopa kuukauden ajan. Jäätyneet hyyfit jauhettiin sen jälkeen sähkökahvimyllyssä, joka oli esijäädytetty muutaman kuiva-jääpalan avulla, kunnes saatiin hienoa pulveria. Sen jälkeen pulveri lisättiin noin 20 ml:aan uuttopuskuria, joka sisälsi 9,6 grammaa p-aminosalisyylihappoa liuotettuna 80 20 ml:aan DEP-käsiteltyä vettä, 1,6 grammaa tri-isopropyyli-naftaleenisulfonihappoa, joka oli liuotettu 80 ml:aan DEP-käsiteltyä vettä, 24,2 grammaa Tris-HCl:a, 14,6 grammaa NaCl:a, 19,09 grammaa EDTA:a, ja joka laimennettiin 200 ml:n kokonaistilavuuteen DEP-käsiteltyä vettä ja pH asetettiin 25 8,5:ksi NaOH:lla. Uuttopuskurin lisäyksen jälkeen seokseen lisättiin myös 0,5 tilavuutta TE-kyllästettyä fenolia, ja o uuttoseos pantiin jäiden päällä. Sitten uuttoseokseen li-
(M
^ sättiin neljäsosa tilavuutta kloroformia, ja seosta ravis- ° teltiin kaksi minuuttia. Sen jälkeen faasit erotettiin 00 ^ 30 sentrifugoimalla kierrosnopeudella 2 500 rpm. Vesifaasi x g poistettiin ja pantiin sentrifugiputkeen, jonka pohjalla co oli muutama pisara fenolia. Putki pantiin jäiden päälle.
oo ^ Orgaaninen faasi uutettiin sitten uudelleen 2,0 ml :11a
CO
σ> uuttopuskuria ja pantiin 68 °C:n vesihauteeseen viideksi 35 minuutiksi polysomeihin ja uuttoseoksen välipinnalle kiinni jääneen RNA:n vapauttamiseksi. Tämän jälkeen uutettu 38 seos sentrifugoitiin ja vesifaasi poistettiin ja yhdistettiin muihin vesifraktioihin.
Kaikki yhdistetyt vesifraktiot uutettiin sitten fenoli-kloroformilla (1:1 v/v) 4-5 kertaa, kunnes ei 5 enää nähty proteiinia rajapinnalla. Sen jälkeen lisättiin 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia, pH 5,2, (tehty DEP-ve-teen ja autoklavoitu) ja 2,5 tilavuutta 95-%:ista lisättiin orgaanisiin uutteisiin ja uutteita jäädytettiin -20 °C:ssa 2 -3 tuntia. Vaihtoehtoisesti RNA saostettiin 2 M litiumase-10 taatilla. Sen jälkeen RNA pelletoitiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 12 000 rpm 20 minuuttia. RNA-pelletti suspendoitiin sen jälkeen uudelleen DEP-veteen, joka sisälsi RNaasi-inhibiittoria lopullisen pitoisuuden ollessa 1 yksikkö piissä. Sen määrittämiseksi, olivatko entsyymejä 15 koodaavat geenit indusoituneet, kokonais-RNA analysoitiin.
Kokonais-RNA-preparaatin analyysi
Sen varmistamiseksi, olivatko sellulaasikompleksin entsyymejä koodaavat geenit indusoituneet, kokonais-RNA analysoitiin Northern-blot -analyysillä, kuten ovat kuvan-20 neet Sambrook et ai., supra, käyttäen lh_ reesein cbh2-gee-nin P32-fragmenttia koettimena. cbh2-klooni eristettiin käyttäen menetelmiä, joita on kuvannut Chen et ai. julkaisussa "Nucleotide Sequence and Deduced Primary Structure of Cellobio-hydrolase II from Trichoderma reesei", Bio-25 technology 5 (maaliskuu 1987), joka on sisällytettynä viitteeksi. Kohdennettua mutageeniä (Sambrook et ai., sup-5 ra) käytettiin cbh2-klooniin, ja Bglll-kohta asetettiin
(M
^ aivan avoimen lukukehyksen 5'-päähän ja Nhe I -kohta aivan ° 3'-päähän. Bgl II/Nhe I -koodaava sekvenssi kloonattiin 00 0X1 30 sen jälkeen pUC218-phagemid-vektoriin. Koettimena käyttöä £ varten cbh2-fragmentti pilkottiin Bgh II/Nhe Iillä ja co eristettiin geelielektroforeesilla. Tulokset osoittivat, oo ^ että cbh2-spesifisen RNA:n taso saavutti huipun 14 - 18 co σ> tuntia induktion jälkeen. Sitten 14, 18 ja 22 tunnin ko- 35 konais-RNA yhdistettiin.
39
Esimerkki 2
Polyadenyloidun mRNA:n puhdistus Tämän jälkeen mRNA eristettiin yllä esitetyistä kokonais-RNA:n yhdistetyistä fraktioista käyttäen oli-5 go(dT)selluloosakromatografiaa. Oligo(dT)selluloosa (tyyp pi 3, Collaborative Research, Lexington, MA) tasapainotetaan ensin oligo(dT):tä sitovalla puskurilla, joka sisältää 0,01 M Tris-HCl: ia, pH 7,5, 0,5 M NaCl:ia, 1 mM ED- TA:a, minkä jälkeen 25 - 300 mg:n erät lisättiin 1,5 ml:n 10 mikrosentrifugiputkiin. 1 ml:aan sitomispuskuria liotettu RNA lisättiin ja sen annettiin sitoutua 15 minuuttia lievässä ravistelussa. Suspensioita sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 1 500 g 3 - 5 minuuttia, pestiin 3-5 kertaa 1 ml:lla sitomispuskuria ja pestiin sen jälkeen 3 kertaa 400 15 pl:lla eluutiopuskuria, joka sisälsi 0,01 M Tris-HCl:ia, pH 7,5, ja 1 mM EDTA:a. Eluaatit yhdistettiin, tehtiin 0,5 M:iksi NaCl:n suhteen, sidottiin uudelleen ja eluoitiin uudelleen kolmella eluutiopuskuripesulla. Viimeiset kolme eluutiopuskuripesua yhdistettiin ja mRNA otettiin talteen 20 etanolisaostuksella.
Kokonais-RNA:n ja polyadenyloidun RNA:n analyysi
Kokonais-RNA ja polyadenyloitu RNA fraftioitiin l-%:isella formaldehydiagaroosigeeleillä käyttäen 10 pg RNA:ta pystyriviä kohti, siirrettiin NytranR-membraaneille 25 ja analysoitiin Northern-blot -menetelmällä, jonka on ku vannut Thomas julkaisussa "Hybridization of denatured RNA o and Small DNA fragments transferred to Nitrocellulose", C\l ^ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980) 5 201 - 5 205.
^ Lyhyesti tämä menetelmä sisältää RNA:n denaturoin- oo 30 nin (enintään 10 pg/8 μΐ reaktioseosta) inkuboimalla nat- £ riumfosfaattipuskurissa, pH 7,0, joka sisältää 1 M glyok- co saalia/50 % (vol/vol) Me2SO:a/10 mM 50 °C:ssa yhden tunnin oo ^ ajan. Reaktioseos jäähdytettiin jäillä ja kaksi μΐ näyte-
CO
<y> puskuria, joka sisälsi 50 % (vol/vol) glyserolia, 10 mM
35 natriumfosfaattipuskuria 7,0:ssa ja bromifenolisinistä li sättiin. Näytteet ajettiin elektroforeesissa horisontaali- 40 sesti l-%:isella formaldehydiagaroosigeelillä 10 mM fosfaattipuskurissa, pH 7,0 90 V kuusi tuntia.
Glyoksyloitu RNA siirrettiin agaroosigeeleiltä nitroselluloosalle käyttäen 3 M NaCl/0,3 M trisodiumsit-5 raattia käyttäen (20X NaCl/sitr.). Elektroforeesin jälkeen geeli laitettiin kahden 20X NaCl/sitraatilla kyllästetyn Whatman 3 MM-paperiarkin päälle. NitranR-membraani kasteltiin vedellä, tasapainotettiin 20X NaCl/sitraatissa ja asetettiin geelin päälle. Sen jälkeen geeli peitettiin 10 kahdella arkilla Whatman 3 MM-paperia ja 5 - 7 cm:n kerroksella paperipyyhkeitä, lasilevyllä ja painolla. RNA siirtyi täydellisesti 12 - 15 tunnissa. Blotit kuivattiin lampun alla ja käsiteltiin vakuumiuunissa yli kahden tunnin ajan 80 °C:ssa.
15 Membraanit tutkittiin cbh2-koettimella sen varmis tamiseksi, että polyadenyloitu mRNA-pooli sisälsi cbh2-mRNArta ja että geenit, jotka koodaavat sellulaasikomplek-sin entsyymejä, indusoituivat.
Esimerkki 3 20 cDNA-synteesi A. Ensimmäisen säikeen synteesi cDNA-synteesi tehtiin käyttäen BRL cDNA Synthesis SystemR-järjestelmää (Bethesda Research Laboratories, Md.) valmistajan ohjeiden mukaan. Jäillä olevaan steriiliin, 25 DEPC-käsiteltyyn putkeen lisättiin 10 μΐ 5X ensimmäisen säikeen puskuria, joka sisältää 250 mM Tris-HCl:ia, pH o 8/3, 375 mM KCl:ia, 15 mM MgCl2:ia, 50 mM DTT:tä, 2,5 μΐ
(M
jJj 10 mM dNTP-seosta (10 mM dATPS, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 ° mM dTTP) , 5 μΐ oligo (dT)i2-is (0,5) mg/ml) , 10 μΐ mRNA:ta, oo 0X1 30 pitoisuutena 0,5 mg/ml ja 20 μΐ dietyylipirokarbamaatilla x £ (DEPC) käsiteltyä vettä, jolloin lopullinen koostumus si-
oo sältää 50 mM Tris-HCl (pH (8,3), 75 mM KClria, 3 mM
oo ^ MgCl2:ia, 10 mM ditiotreitolia, 500 μΜ kutakin seuraavis- σ> ta: dATP, dCTP, dGTP ja dTTP, 50 pg/ml oligo (dT)i2-is, 100 35 pg/ml polyadenyloitua RNA:ta ja 10 000 U/ml kloonattua M- MLV-käänteistranskriptaasia. Samanaikaisesti ajettiin myös 41 kontrolliajo käyttäen 10 μΐ 2,3 kiloemäksen kontrolli-RNA:ta (0,5 mg/ml) mRNA:n asemesta.
Reaktio aloitettiin lisäämällä 2,5 μΐ Molony-hii-ren leukemiaviruksen (M-MLV) käänteistranskriptaasia (100 5 U/μΙ) mRNA-putkeen ja kontrolli-RNA:hän. Näytteet sekoitettiin. Kaikkia reaktioputkia inkuboitiin 37 °C:ssa yksi tunti ja pantiin sen jälkeen jäiden päälle.
Pieni näyte reaktioseoksesta ajettiin geelissä sen olemassaolon ja määrän varmistamiseksi. Saanto oli noin 10 2 - 6 pg.
B. Toisen säikeen synteesi
Ensimmäisen säikeen synteesin jälkeen jäillä olevaan kontrolliputkeen lisättiin 230,6 μΐ DEPC-käsiteltyä vettä, 6 μΐ 10 mM dNTP-seosta, 32 μΐ 10X toisen säikeen 15 puskuria, joka sisältää 188 mM Tris-HC:ia, pH 8;3, 906 mM KC1: ia, 100 mM (NH4) 2S04: ia, 46 mM MgCl2:ia, 37,5 mM di-tiotreitolia, 1,5 mM NAD:ia, 8 μΐ E. Coli -DNA-polymeraasi I:stä (10 μ/μΐ), 1,4 μΐ ΕΜ_ colin RNaasi H:ta ja 1 μΐ E.
colin DNA-ligaasia (100 yksikköä) .
20 Näytteen ensimmäisen säikeen synteesiin lisättiin
jäiden päällä DEPC-käsiteltyä vettä, 7,5 μΐ 10 mM DNTP-seosta, 40 μΐ 10X toisen säikeen puskuria, 10 μΐ ΕΜ_ colin DNA-polymeraasi I:stä, 1,75 μΐ E^ colin RNaasi H: ta ja 1,25 E^ colin DNA-ligaasia, jolloin lopullinen koostumus 25 sisältää 25 mM Tris-HCl:ia (pH 8,3), 100 mM KCl:ia, 10 mM
(NH4)S04:ia, 5 mM MgCl2:ia, 250 μΜ kutakin seuraavista: 5 dATP, dCTP, dGTP ja dTTP, 0,15 mM NAD:ia, 5 mM ditiotrei- c\i ^ tolia, 250 U/ml DNA-polymeraasi I:stä, 8,5 U/ml RNaasi ^ H:ta ja 30 U/ml DNA-ligaasia. Sekä kontrolliputkia että oo ^ 30 näyteputkia ravisteltiin hellävaraisesti vortexilla ja nii- ^ tä inkuboitiin kaksi tuntia 16 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen oo molemmat putket pantiin jäiden päälle, oo
Sen jälkeen näyteputki uutettiin 415 pl:lla feno-co σ> lia ja saostettiin etanolilla. Pelletti liuotettiin 200
35 μΐ:aan steriiliä TE-puskuria (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM
42
Na2EDTA) ja saostettiin uudelleen 7,5 M ammoniumasetaatis-ta etanolilla.
Osa näytteestä analysoitiin edelleen geelielektro-foreesilla puhtauden tarkistamiseksi. Synteesin saanto oli 5 noin 4,0 pg.
Jäljellä oleva kontrollinäyte uutettiin edelleen fenolilla ja saostettiin etanolilla, kuten näytteelle on kuvattu yllä. Sen jälkeen kun pelletti oli liuotettu 200 μΐ:aan steriiliä TE-puskuria, saostettu uudelleen am-10 moniumasetaatista etanolilla ja kuiva pelletti oli liuo tettu uudelleen 20 pl:aan steriiliä TE-puskuria, 2 μΐ liuosta analysoitiin edelleen geelielektroforeesilla puhtauden tarkistamiseksi.
Esimerkki 4 15 bgll-cDNA-sekvenssien amplifikaatio cDNA-fragmenttien, jotka koodaavat Th_ reesein β-glukosidaasigeenin osaa, bgll:tä, amplifikaatio tehtiin käyttäen polymeraasiketjureaktio (PCR) -menetelmää, TaqR-polymeraasia ja Perkin Elmer Cetus Thermal CyclerR-lai-20 tetta.
Reaktioseos muodostettiin sekoittamalla 76 μΐ de-ionisoitua vettä, 10 μΐ 10X puskuriseosta, joka sisälsi 166 mM (NH4)2S04, 670 mM Tris-HCl:ia, pH 8,8, 67 mM MgCl2:ia, 67 μΜ EDTA:a, 10 mM β-merkaptoetanolia, 10 μΐ dimetyylisulf-25 oksisia ja 1,7 mg/ml BSA:ta liuotettuna 1,0 ml:n kokonaistilavuuteen deionisoitua vettä, 8 μΐ 2 dNTP:ja (kutakin), 5 1 μΐ 5 '-oligonukleotidialuketta, 1,0 μρ cDNA:ta liuo-
CM
^ tettuna 3 μΐ: aan deionisoitua vettä ja 1 μg Taq-poly- o meraasia.
oo ^ 30 Amplifikaatiomenetelmä koostuu lähtödenaturointi- ^ syklistä 95 °C:ssa 10 minuuttia, sitä seuraavasta kahden co minuutin hybridisaatiosyklistä 50 °C:ssa ja kymmenen mi- oo ^ nuutin polymerisaatiosyklistä 65 °C:ssa, vielä 30 sykliä.
CO
σ> A. Oligonukleotidialukkeet 35 Oligonukleotidialukkeet, joita käytettiin amplifi- oimaan Th_ reesein bgll-geeniä koodaavaa cDNA-fragmenttia, 43 suunniteltiin bgll-geenin N-terminaaliselta alueelta valittujen aminohappojen geneettisen koodin degeneraation perusteella ja valittiin oligonukleotidin sisältä. 5'-oli-gonukleotidialuke koostui sekvenssistä: 5 5'GCI GTI CCT CCT GCI GG 3', jossa I on inosiini.
Sekvenssin sisäinen 3'-oligonukleotidialuke koostui 16 x 21 oligonukleotidin seoksesta. Tämä seos perustui seuraavan sekvenssin eri johdannaisiin: 10 5' GTT G/ATT ICC G/ATT G/AAA G/ATC TGT 3'.
Esimerkki 5 PCR:llä tuotettujen fragmenttien jatkokloonaus
90 μΐ kutakin reaktioseosta fraktioitiin 4-%:silla polyakryyliamidigeeleillä IX TBE:ssä, suurin vyöhyke lei-15 kattiin pois ja eluoitiin geelipalasta, kuten on kuvannut Sambrook et ai., supra. Eluoitu DNA-fragmentti saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 15 μΐ:aan TE-pus-kuria (10 mM Tris, 1 mM EDTA). Kukin 1-2 pg:n DNA-frag-mentti käsiteltiin 0,5 mM ATP:llä ja T4-polynukleotidi-20 kinaasilla kunkin fragmentin 5' -pään fosforyloimiseksi käyttäen Sambrook et ai. 'n, supra, menetelmää. Tasaiset päät saatiin aikaan lisäämällä kolme μΐ 10X T4-DNA-poly-meraasipuskuria (330 mM Tris-asetaatti, pH 7,9, 660 mM ka-liumasetaatti, 100 mM magnesiumasetaatti, 1 μΐ 2,5 mM
25 dNTP:itä, 1 μΐ T4-DNA-polymeraasia ja 5 μΐ tislattua vettä) . Päiden tasaamiseen käytettyä reaktioseosta inkuboi-q tiin sen jälkeen 37 °C:ssa 60 minuuttia. Reaktio pysäytet- C\] i tiin lisäämällä EDTA:ta, siten että lopulliseksi EDTA- co pitoisuudeksi tuli 1 mM, ja näytettä kuumennettiin vielä oo ^ 30 10 minuuttia 65 C:ssa.
ir Tasapäiset DNA-fragmentit ligoitiin Smal:llä pil- ^ kotun ja defosforyloidun pUC218:n kanssa, joka oli infek- co cd toitu M13X07:llä, kuten Sambrook et ai., supra, ovat kuvan- S neet. pUC218- ja pUC219-kloonausvektorit saatiin pUC118:sta 35 ja pUCH9:stä insertoimalla Bgl II-, Cla I- ja Xho I -po- lylinkkerit, kuten Korman et ai. ovat kuvanneet julkaisus- 44 sa "Cloning, Characterization, and expression of two alpha-amylase genes from Aspergillus niger var. awamori", Current Genetics 17 (1990) 203 - 121.
Tämän jälkeen käytettiin yllä kuvattua phagemid-5 vektoria coli -kannan JM101 transformointiin, kuten
Yarnisch et ai. ovat kuvanneet julkaisussa "Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13mpl8 and pUC19 Vectors", Gene 1 197 (1985) 103 - 119.
10 Esimerkki 6 cDNA-jatkokloonatun fragmentin eristys
Transformoitu kanta inokuloitiin 1,5 ml:aan 2YT-lientä putkessa, joka oli aikaisemmin inokuloitu 15 pl:lla kyllästettyä coli JM101:tä. Viljelmää kasvatettiin kah-15 deksan tuntia ravistuksessa 37 °C:ssa.
Kasvatusseosta sentrifugoitiin sen jälkeen kier-rosnopeudella 6 000 rpm viisi minuuttia, ja supernatantti kaadettiin toiseen putkeen. Supernatanttiin lisättiin 300 μΐ 2,5 M NaCl:a, 20 % PEG:ia, ja liuos sekoitettiin. Seosta 20 inkuboitiin sen jälkeen huoneenlämpötilassa 15 minuuttia.
Sen jälkeen liuosta sentrifugoitiin 5 minuuttia mikrosentrifugissa ja supernatantti imettiin pois. Liuos sekoitettiin taas kerran ja supernatantti imettiin jälleen pois.
25 100 μΐ tasapainotettua fenolia lisättiin putkeen ja putki sekoitettiin Vortexilla. 100 μΐ kloroformia li- q sättiin ja jälleen putki sekoitettiin Vortexilla. Putkea
CM
^ lämmitettiin 55 C:ssa viisi minuuttia, sekoitettiin ja ° sentrifugoitiin mikrosentrifugilla vielä viisi minuuttia.
CO
0X1 30 160 μΐ supernatanttia pipetoitiin sitten kirkkaa- £ seen putkeen. 20 μΐ 1 N NaOACria, pH 4,5, ja 400 μΐ 95-%:ista crj ETOH:ia lisättiin supernatanttiin ja seosta sekoitettiin co ja se jäädytettiin kuivajäillä viideksi minuutiksi. Sen
CO
O) jälkeen putkea sentrifugoitiin vielä 15 minuuttia ja su- 35 pernatantti imettiin pois.
45
Putkeen lisättiin 1 000 μΐ 70-%:ista etanolia ja putkea sentrifugoitiin vielä kaksi minuuttia ja imettiin uudelleen. Seosta sentrifugoitiin vielä kerran vakuumissa neljä minuuttia ja pelletti suspendoitiin uudelleen 15 5 μΐ:aan TE-puskuria.
Esimerkki 7 700 emäsparin cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssin määritys 700 emäsparin cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssi 10 määritettiin käyttämällä dideoksi-DNA-sekvenointimenetel- mää, jonka ovat kuvanneet Sanger et ai.: "DNA Sequencing with chain terminating inhibitors", Proc. Natl. Adad. Sci. U.S.A. 74 (1977) 5 463, SequenaseR-reagenssikittiä käyttä en (U.S. Biochemicals).
15 Esimerkki 8 bgll-geenin analyysi A. Sekvenssianalyysi
Nukleotidisekvenointi tehtiin käyttäen Sanger et ai. 'n (1977) dideoksiketjuterminaatiomenetelmää SequenaseR-20 reagenssikitillä (U.S. Biochemicals).
B. Aminohapposekvenointi 2,5 nmoolin näyte pelkistettyä ja karboksimetyloi-tua β-glukosidaasipreparaattia puhdistettiin (Chiricon ja Brownin mukaan: European Journal of Biochem. 165, 333 et 25 seq.) N-terminaalisekvenoitiin patentoidulla multifaasisek- venaattorilla.
5 β-glukosidaasinäytteeseen lisättiin Endo-Lys C-pro- c\j ^ teaasia 1 % kokonaisproteiinista, ja seosta inkuboitiin ° yksi tunti 37 °C:ssa tai proteiininäyte käsiteltiin syaa- 00 0X1 30 nogeenibromidilla. Yhtä suuri tilavuus HPLC-liosta A (0,05 % g TEA/0,05 TFA vedessä) lisättiin reaktion pysäyttämiseksi.
oo Tuloksena saadut CNBr- ja Endo-Lys C -fragmentit erotet- oo tiin kromatografisesti Brownlee C-4 -kolonnissa käyttäen co
σ> 0 - 100 %:n lineaarista gradienttia HPLC-liuoksesta B
35 (0,05 % TEA/0,05 % TFA n-propanolissa) nopeudella 1 % mi- 46 nuutissa. Aminohapposekvenointia varten kerättiin useita huippuja ja tulos nähdään kuviossa 1.
Esimerkki 9 T. reesein bgll-geenin tunnistaminen 5 700 emäsparin bgll-cDNA-fragmentti leimattiin 32P:lla käyttäen Sambrook et ai. 'n supra, kuvaamaa menetelmää.
T. reesein genominen DNA valmistettiin suodattamalla reesein 24 - 36 tunnin viljelmä Miraclothin läpi ja jäädyttämällä kasvatusalustasta saadut myseelit. Jäädy-10 tetyt myseelit jauhettiin sen jälkeen hienoksi pulveriksi ja 22 ml TE:tä ja 4 ml 20-%:ista SDS:ia lisättiin myseeli-pulveriin ja sekoitettiin. Ennen sentrifugointia ja vesi-faasin poistoa seokseen lisättiin 10 ml fenolia ja kloroformia. Orgaaniseen uutteeseen lisättiin 5 mg/ml pro-15 teinaasi K:ta ja seosta inkuboitiin 20 minuuttia 55 °C:ssa. Sen jälkeen DNA uutettiin edelleen alalla tunnetuilla menetelmillä käyttäen kloroformi/fenoliuuttoa ja senjälkeistä etanolisaostusta. Sitten eristetty DNA käsiteltiin 1 pg:lla kuumennettua ribonukleaasi A: ta (100 °C 15 minuuttia) 20 20 pg:aa kohti genomista DNA:ta TE-puskurissa 37 °C:ssa 30 minuuttia, minkä jälkeen seos jäähdytettiin huoneenlämpö-tilaan. reesein genominen DNA pilkottiin yhdellä re- striktioentsyymillä tai useamman restrikstioentsyymin yhdistelmällä, kuten Eco Ritilä, Hind 111:11a ja vastaavil-25 la, ja tehtiin Southern-blot, joka tutkittiin hybridisaa- o o tiolla käyttäen koettimena P -leimattua bgll-geenm 700 o emäsparin cDNA-fragmenttia. Tämän analyysin perusteella
(M
^ päätettiin, että Hind III oli paras restriktioentsyymi β- o ^ glukosidaasigeenin paikantamiseen.
00 30 10 - 20 yksikköä Hind III:a milligrammaa kohti ge- £ nomista DNA:ta lisättiin DNAthan ja DNA uutettiin fenoli- oo kloroformilla proteiinien poistamiseksi. Sen jälkeen käsi- oo es} telty DNA saostettiin alkoholilla ja suspendoitiin uudel- oo leen pitoisuudessa 2 grammaa/litra TE-puskuriin.
35 4 μΐ: n näytettä genomisen DNA:n Hind III -diges- tiosta vietiin 1-prosenttiseen agaroosigeeliin ja frakti- 47 oitiin elektroforeettisesti. Sen jälkeen geelistä tehtiin Southern-blot ja se tutkittiin P32-leimatulla 700 emäspa-rin cDNA-koettimella. Hind III -digeroidun Tb_ reesein ge-nomisen DNA:n Southern-blotilta tunnistettiin 6,0 kilo-5 emäksen juova.
Jäljellä olevasta Hind III -genomisesta DNA:sta ajettiin preparatiivinen geelielektroforeesi ja fraktiot 5-7 kiloemästä elektroeluoitiin agaroosigeelistä ja kloonattiin Hind III digeroituun pUC218:aan. Saatuja plas-10 mideja käytettiin transformoimaan coli JM101:tä kirjas ton luomiseksi. Kirjasto seulottiin pesäkehydridisaatiolla käyttäen P32-leimattua 700 emäsparin bgll-cDNA:ta koettimena tunnistamaan ne pesäkkeet, jotka sisälsivät bgll-gee-niä koodaavaa DNA:ta.
15 Positiiviset pesäkkeet poimittiin sitten transfor maatiosta ja niistä eristettiin DNA fenoli:kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella Sambrook et al.'n, supra, kuvaamalla menetelmällä.
Positiivisista pesäkkeistä eristetty DNA pilkot-20 tiin sekä yhdellä restriktioentsyymillä että eri yhdistelmillä restriktioentsyymejä Hind III, Eco Rl, Sst 1, Kpn 1, Bam HI, Xho 1, Bgl II, Cla I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Bal I ja Pvu II. Pilkkoutumistuotteet ajettiin aga-roosigeelielektroforeesissa ja tuloksena olevaa juovaku-25 viota käytettiin kloonatun 6,0 emäsparin genomisen DNA:n restriktiokartan muodostamisessa. Samasta agaroosigeelistä g g q tehtiin Southern-blot, joka tutkittiin P -leimatun 700
(M
^ emäsparin bgll-cDNA-koettimen avulla sen identifioimisek- ° si, mitkä genomiset restriktiofragmentit olivat homologi- oo 0X1 30 siä bgll-cDNA:n kanssa. Kartoituskokeet varmistivat, että £ koko bgll-geeni sisältyi genomiseen Hind III -klooniin.
oo Pvu II- ja Bal I -restriktiof ragmentit, kooltaan 66 - oo £0 1 500 emäsparia, hydridisoituivat 700 emäsparin DNA-bgll- oo ....
<7> kloonin kanssa ja ne valittiin j atkokloonattaviksi pUC218 35 phagemid-vektoriin. Kun nämä fragmentit oli kloonattu pha-gemid-vektoriin, Pvu II- ja Bal I -jatkokloonit sekvenoi- 48 tiin käyttäen Sanger et ai. 'n (1977) dideoksiketjutermi-naatiomenetelmää. Tästä sekvenoinnista pääteltiin, että jatkokloonien osittain päällekkäin menevät sekvenssit liittyivät yhteen jatkuvan 3 033 emäsparin sekvenssin 5 kanssa, jonka sisältä määritettiin nukleotidisekvenssi molemmista säikeistä.
Esimerkki 10 pSASp-glu:n konstruktio
Lähtövektori pSASP~Glu:n muodostamiseksi oli pSAS-10 plasmidi. pSAS muodostettiin seuraavalla tavalla. pUCIOO
(kaupallisesti saatavana oleva plasmidivektori) pilkottiin Smal-restriktioentsyymillä ja 5'-fosfaattiryhmät poistet tiin sen jälkeen vasikan suolen alkalisella fosfataasilla. Lineaarinen vektorifragmentti puhdistettiin pilkkoutumat- 15 tomasta vektorista ja proteiinista agaroosigeelielektrofo-reesilla, minkä jälkeen lineaarinen vektori DNA eristettiin eristetystä geelipalasta elektroeluutiolla. amdS-geeni eristettiin 2,4 kiloemäksen Sstl-restriktiofrag-menttina vektorisekvensseistä eristämisen jälkeen (sisäl- 20 tyy julkaisuun: Hynes, M. J., Corrick, C. M., ja King, J.
A., "Isolation of genomic clones containing the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of structural and regulatory mutations", Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 1430 - 1439). 2,4 kiloemäksen SstI amdS -fragmentti 25 ja 2,7 kiloemäksen pUCIOO-vektorifragmentti yhdistettiin sen jälkeen (Sambrook et al., supra) ja ligaatioseos ^ transformoitiin ja saatettiin lisääntymään E. colin isän- c\j täkannassa JM101.
co ? pSASp-glu muodostettiin pilkkomalla pSAS:ia Hind oo ^ 30 III -restriktioentsyymillä ja puhdistamalla lineaarinen g fragmentti edellä kuvatulla tavalla. Tähän Hind III :11a en käsiteltyyn pSAS-vektorifragmenttiin liitetään T. reesein co genomisen DNA:n 6,0 kiloemäksen Hind III -fragmentti, joka
CO
σ> sisälsi bgll-geenin koko koodaavan alueen sekä transkrip- 35 tioon ja translaatioon tarvittavat sekvenssit.
49
Esimerkki 11 BGLl-deleetiovektorin valmistus
Geenin korvaava vektori ρυθΔβ-glu A/R pyr, joka on kuvattu kuviossa 3B, muodostettiin kloonaamalla 6,0 ki-5 loemäksen genominen Hind III -fragmentti, jonka tiedetään sisältävän koko bgll-geenin, pUC218:n polylinkkeriin, joka oli pilkottu Hind 111:11a ja jonka päät oli defosforyloitu vasikan suolen alkalisella fosfataasilla. bgll-geeniä koo-daava alue poistettiin sen jälkeen tästä plasmidista pilk-10 komalla plasmidi Apal:llä ja Eco RV:lla, ainutlaatuisista Apal- ja EcoRV-restriktiokohdista, jotka sijaitsevat aivan bgll:n avoimen lukukehyksen 5'- ja 3’-päissä ja eristämällä lineaarinen plasmidi-DNA. Restriktiokohdan päät tehdään tasaisiksi T4-DNA-polymeraasilla. Sen jälkeen tämä plasmi-15 di ligoitiin eristetyn 2 412 emäsparin Hind III/Bam HI-restriktiofragmentin kanssa, joka sisälsi Aspergillus ni-gerin pyrG-geenin [Hartingsreldt et ai., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 71 - 75], jonka restriktiopäät tehtiin tasai siksi T4-DNA-polymeraasin avulla, jolloin muodostui pUCAPGlu 20 A/R pyr (kuvio 3B).
Esimerkki 12
Protoplastien eristys
Myseeli saatiin inokuloimalla 100 ml :11a YEG:ia (0,5 % hiivauutetta, 2 % glukoosia) 500 ml:n pullossa, jo-25 ka sisälsi 5xl07 Ih_ reesei -solua. Pulloa inkuboitiin sitten 37 °C:ssa sekoittaen 16 tuntia. Myseeli otettiin tal-S teen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 2 750 x g. Talteen-
CVJ
^ otetut myseelit pestiin vielä 1,2 M sorbitoliliuoksella ja ^ suspendoitiin uudelleen 40 ml:aan Novozym :iin (Novo Bio- 0X1 30 labs, Danbury, Ct.), joka on kauppanimi usean komponentin x £ entsyymijärjestelmälle, joka sisältää 1,3-a-glukanaasia, co 1,3^-glukanaasia, laminarinaasia, xylanaasia, kitinaasia
CO
^ ja proteaasia, liuokseen, joka sisältää 5 mg/ml NovozymR
co 05 234 :ää, 5 mg/ml MgSCg x 7H20:ta; 0,5 mg/ml naudan seerumin 35 albumiinia, 1,2 M sorbitolia. Protoplastit poistettiin solun kiinteästä aineesta suodattamalla Miraclothin (Cac- 50 biochem Corp.) läpi ja kerättiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 2 000 x g. Proplastit pestiin kolme kertaa 1,2 M sorbitolilla ja kerran 1,2 M sorbitolilla, 50 mM CaCl2:lla, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen. Lo-5 puksi protoplastit suspendoitiin jälleen 2 x 108 proto-plastia ml:aa kohti 1,2 M sorbitolia, 50 mM CaCl2:ia.
Esimerkki 13
Homeprotoplastien transformaatio pSASp-glu:11a 200 μΐ esimerkissä 12 valmistettua protoplastisus-10 pensiota lisättiin 20 μΐ:aan (20 pg) pSASp-glua:a TE-pus-kurissa (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) ja 50 μΐ:aan poly-etyleeniglykoliliuosta (PEG), joka sisälsi 25 % PEG 4000:a, 0,6 M KCL:ia ja 50 mM CaCl2:a. Tätä seosta inku- boitiin jäiden päällä 20 minuuttia. Tämän inkubointijakson 15 jälkeen siihen lisättiin 2,0 ml edellä kuvattua PEG-liuosta, liuos sekoitettiin vielä ja sitä inkuboitiin huoneenlämmössä viisi minuuttia. Tämän toisen inkuboinnin jälkeen siihen lisättiin 4,0 ml liuosta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolia ja 50 mM CaCl2:ia ja tätä liuosta sekoitettiin 20 vielä. Protoplastiliuos lisättiin sitten välittömästi sulatettuun Vogels Medium N -erään (3 g natriumsitraattia, 5 g KH2PO4: ia, 2 g NH4NO3: ia, 0,2 g MgS04 x 7H20:ia, 0,1 g
CaCl2 x 2H20:ia, 5 pg a-biotiinia, 5 mg sitruunahappoa, 5 mg ZnSCh x 7H20:ia, 1 mg Fe(NH4)2 x 6H20:ia, 0,25 mg CUSO4 x 25 5H20:ia, 50 pg MnS04 x 4H:ia sisältäen lisäksi 1 %:n glu koosia, 1,2 M sorbitolia ja 1 %:n agaroosia. Protoplasmic ti/alustaseos kaadettiin sitten kiinteälle alustalle, joka
(M
^ sisälsi samaa edellä kuvattua Vogelin alustaa ja lisäksi ° asetamidia typenlähteenä. Koska T. reeseissä ei ole amdS- 00 0X1 30 geenille toimivaa ekvivalenttia geeniä, vain transforman- £ tit kasvavat tällä alustalla. Seuraavaksi nämä pesäkkeet cr, siirrettiin ja puhdistettiin kiinteällä Vogelin alustalla co £0 N, joka sisälsi lisänä 1 %:n glukoosia. Transformanttikan-
CO
σ> taa, jossa on bgll-geeni, kutsutaan A83pSASPGlu:ksi.
51
Kiinteällä kasvualustalla stabiilit transformantit voidaan erottaa epästabiileista transformanteista nopeamman kasvunopeutensa perusteella ja niiden muodostamien sirkulaaristen pesäkkeiden perusteella, jotka ovat parem-5 minkin sileitä kuin epätasaisia reunoiltaan. Lisäksi joissakin tapauksissa voidaan tehdä lisäksi stabiilisuustesti kasvattamalla transformantteja kiinteällä epäselektiivi-sellä alustalla, keräämällä itiöt tältä kasvualustalta ja määrittämällä niiden itiöiden prosentuaalinen osuus, jotka 10 tämän jälkeen lisääntyvät ja kasvavat selektiivisellä alustalla.
Kuviossa 6 on autoradiogrammi erilaisista ylimääräisiä kopioita bgll-geeniä sisältävistä transformanteista (pystyrivit 1-8) tehdystä Southern-blotista, joka on 15 tutkittu käyttäen P32-leimattua 700 emäsparin fragmenttia koettimena ja jossa kontrollina on genomista ylituottokan-nan tuottamaa lh_ reeseitä, joka on Hind III :11a pilkottu (pystyrivi 9). Tämä autoradiogrammi osoittaa selvästi, että transformantit sisältävät kontrolliin verrattuna yli-20 määräisiä bgll-kopioita.
Kuvio 4 on autoradiogrammi Northern-blotista, joka on tehty RNA:sa, joka on eristetty eräistä esillä olevassa keksinnössä tuotetuista transformoiduista kannoista sofo-roosi-induktion jälkeen (rivi A) ja se kuvaa vastaavaa 25 nousua bgll-lähetin tasoissa verrattuna Th_ reesein emokan-taan (rivi B).
q Transformanttien visuaalisen analyysin lisäksi teh- c\i ^ tiin myös kvantitatiivinen analyysi leikkaamalla määrätyt ^ juovat NytranR-membraanilta ja laskemalla siinä oleva ra- oo 30 dioaktiivinen leima nestetuikelaskimessa. Tämä koe teh- £ tiin, jotta saataisiin tarkempi arvio lähetin suhteelli- oo sista määristä, kuten näkyy alla olevasta taulukosta III: oo
CO
C\l 00 <J> 52
Taulukko III
CPM Trichoderma Transformoitu Trichoderma reesei -emokanta reesei -kanta CPM 14,4 25,4 5 β-glu lähetti CPM 227,1 95,2
CBHII
CPM 0,0634 0,26668 10 p-glu/
CBHII
Taulukko III kuvaa sitä, että esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetulla transformantilla 15 on ylimääräistä β-glukosidaasi-RNA:ta ja näin ollen enem män β-glukosidaasientsyymiä, mistä seuraa spesifisen aktiivisuuden nousu.
Esimerkki 14
Homeprotoplastien transformaation pUCApGlu A/R 2 0 pyr4:llä T. reesein mutantit, joilta puuttuu ekstrasellu-laarisen β-glukosidaasigeenin, bgll:n, koodaava sekvenssi, saatiin kohdennetulla geeninkorvaamismenetelmällä. ρΙ^ΔβΘΙυ A/R pyr4 -plasmidi pilkottiin Hind III :11a, jolloin saa-25 tiin lineaarinen Hind III -fragmentti, jossa bgll:tä koo- daavat sekvenssit korvattiin Aspergillus nigerin pyrG-5 geenillä. Protoplastit transformoitiin esimerkkien 12 ja
(M
^ 13 menetelmillä lineaarisella DNA-fragmentilla, joka si- ° sälsi bgll-alueen ja pyr4:n. Deleetiotransformantteja kut oo ^ 30 suttiin A12:ksi ja A36:ksi. Transformaation jälkeen proto-
£ plastiliosta li sättiin sitten sulatettuun Vogel's Medium N
co -erään, joka sisälsi lisäksi 1 %:n glukoosia, 1,2 M sorbi- oo tolia ja 1 %:n agaroosia. Protoplastin ja alustan seos oo σι kaadettiin sitten kunteälle alustalle, joka sisälsi samaa 35 Vogel's Medium N:ää. Alustassa ei ollut uridiinia ja siksi vain transformoidut pesäkkeet kykenivät kasvavaan sen seu- 53 rauksena, että reesei -kannan RL-P37 pyr4 -mutaatio oli korvattu villityyppisellä DNA-fragmenttiin viedyllä pyr4-geenillä. Sen jälkeen valittiin stabiilit transformantit esimerkki 13:ssa kuvatulla tavalla.
5 Esimerkki 15
Transformanttien analyysi
Transformantit analysoitiin bgll-geenin läsnäolon tai puuttumisen suhteen edellä kuvatulla 700 emäsparin cDNA-koettimella. Transformantit pilkottiin Hind III:lla. 10 Valittujen transformanttien koko genominen DNA pilkottiin Hindlll-restriktioentsyymillä, ajettiin l-%:isella agaroo-silla, siirrettiin NitranR-membraanille ja tutkittiin edellä kuvatulla P32-leimatulla 700 emäsparin cDNA:lla ja visualisoitiin autoradiografiän avulla röntgenfilmillä. Tämän 15 analyysin tulokset kuviossa 5A osoittavat, että transfor-manteista (Δ12 ja Δ36) ei saatu bgll-geenin juovaa, kun taas villityypin kannasta (RL-37 eli 37) saatiin.
mRNA eristetty esimerkin 14 transformantista ja analysoitu Northern-blotissa, kuten esimerkissä 2. Kuten 20 kuviosta 5B nähdään, Northern-blot -analyysi käyttäen 2,2 kiloemäksen Apal/EcoRV bgll -koetinta osoitti, että bgll-spesifistä mRNA:ta oli T^ reesein RL-P37 pyrG69:ssä, kun taas transformanteissa Δ12 ja Δ36 ei ollut.
Proteiini otettiin talteen esimerkin 8 mukaan ja 25 analysoitiin sitten β-glukosidaasin suhteen käyttäen poly-klonaalisia vasta-aineita (puhtaalla β-glukosidaasilla im- o munisoiduista kaneista), joihin oli kiinnitetty piparjuu- c\j pjj riperoksidaasi detektiota varten. Vasta-aineita käytettiin ^ tunnistamaan puhdas β-glukosidaasi (100 ng - sarake A; 0X1 30 1 000 ng - sarake B) ; villityyppisen τν_ reesein tuottama x £ sellulaasi (sarake C); ja sellulaasi, joka on tuotettu gee- co niteknologisesti T. reesein kannasta deletoidusta β-gluko- oo — - ^ sidaasigeenin poistamiseksi (sarake D) . Tämän analyysin oo σ> tulokset esitetään kuviossa 5C, ja ne osoittavat, että 35 vain sarake D ei sisältänyt β-glukosidaasia.
54
Vaikka keksintö on kuvattu erilaisten edullisten suoritusmuotojen avulla, alan ammattimies ymmärtää sen, että erilaisia modifikaatioita, substituutioita, poistoja ja muutoksia voidaan tehdä poikkeamatta sen suojapiiristä.
5 Tämän mukaan on tarkoitus, että esillä olevan keksinnön suojapiiriä rajoittaa vain seuraavien patenttivaatimusten suojapiiri mukaan lukien sen ekvivalentit.
δ
(M
00 cp 00
(M
X
cc
CL
00 00
CO
CM
00
CD

Claims (24)

1. Menetelmä ekstrasellulaarisen β-glukosidaasin ekspression modifioimiseksi filamenttihomeessa, tunnet- 5 tu siitä, että transformoidaan mainittu filamenttihome ekspressiovektorilla, joka sisältää homeen DNA sekvenssin, j oka: kykenee parantamaan ekstrasellulaarisen β-glukosidaasin ekspressiota sen tähden, että se sisältää ainakin 10 yhden ylimääräisen kopion homeen β-glukosidaasigeenistä, jolloin filamenttihome on Trichoderma reesei ja mainittu homeen ekstrasellulaarinen β-glukosidaasigeeni on Trichoderma reeseistä peräisin oleva bgll-geeni.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä ekst- 15 rasellulaarisen β-glukosidaasin ekspression parantamisek si, tunnettu siitä, että mainittu ekspressiovektori sisältää koko home^-glukosidaasigeenin koodaavan alueen ja sekvenssit, joita tarvitaan β-glukosidaasigeenin transkriptioon ja translaatioon.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu f ilamenttihome valitaan Trichoderma-, Aspergillus-, Neurospora-, Humicola- ja Pe-nicillium-suvuista.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tun-25 nettu siitä, että mainittu f ilamenttihome on Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Asper-5 gillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, C\l ^ Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora ^ crassa, Humicola grisea, Penicillium pinophilum tai Peni- oo - - - - ^ 30 cillium oxalicum. £ 5. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen co mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu β-glu- co ^ kosidaasigeeni on bgll-geeni, joka on saatu Trichoderma co σ> reesersta.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu bgll-geeni käsittää aminohapot, joita koodittaa kuvion 1 mukainen nukleotidisekvenssi 311 - 2 679.
7. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää vaiheen, jossa eristetään transformantit, joilla on modifioitu β-glukosidaasin ekspressio.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tun-10 nettu siitä, että se lisäksi sisältää vaiheet, joissa (a) kasvatetaan mainittuja transformantteja olosuhteissa, jotka sallivat mainittujen transformanttien kasvun; ja (b) eristetään mainittujen transformanttien tuot-15 tama rekombinantti homesellulaasikoostumus.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu rekombinantti homesellulaasikoostumus eristetään seuraavalla tavalla: (a) sentrifugoidaan mainittu kasvatusalusta, joka 20 sisältää mainittuja transformantteja, supernatantin ja pelletin muodostamiseksi, ja (b) suodatetaan mainittu supernatantti rekombinan-tin homesellulaasikoostumuksen saamiseksi.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tun- 25 nettu siitä, että antimikrobiaalista ainetta lisätään mainittuun rekombinanttiin homesellulaasikoostumukseen 5 suodatuksen jälkeen. (M ^ 11. Jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukainen me- ° netelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää vai- 00 ^ 30 heen, jossa ekspressiotuote puhdistetaan mainitusta eris- £ tetystä rekombinantista homesellulaasikoostumuksesta. orj 12. Homesellulaasikoostumus, tunnettu siitä, oo että se on saatu filamenttihomeesta, joka käsittää rekom-oo σ> binanttia muunneltua β-glukosidaasia, joka on tuotettu 35 jonkin vaatimuksen 8-10 mukaisella menetelmällä.
13. Menetelmä glukoosin tuottamiseksi selluloosasta tai heteroglykaaneista, tunnettu siitä, että käytetään jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukaisella menetelmällä tuotettua rekombinanttia homesellulaasikoostumusta, 5 jonka β-glukosidaasiaktiivisuus on parantunut.
14. Menetelmä rehun, biomassan tai lietteen sisältämän selluloosa-aineksen hajottamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukaisella menetelmällä tuotettua rekombinanttia homesellu- 10 laasikoostumusta, jonka β-glukosidaasiaktiivisuus on pa rantunut .
15. Menetelmä selluloosan hajottamiseksi glukoosiksi, tunnettu siitä, että käytetään jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukaisella menetelmällä tuotettua re- 15 kombinanttia homesellulaasikoostumusta, jonka β-glukosi- daasiaktiivisuus on parantunut.
16. Patenttivaatimuksen 8-10 mukaisella menetelmällä tuotetun rekombinantin homesellulaasikoostumuksen, jonka β-glukosidaasiaktiivisuus on parantunut, tai patent- 20 tivaatimuksen 11 mukaisella menetelmällä tuotetun puhdistetun β-glukosidaasin käyttö elintarvikelisäaineissa elintarvikkeiden maun ja aromin parantamiseksi.
17. Detergenttikoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää puhdistavan tehokkaan määrän pinta-aktiivista 25 ainetta ja ainakin 0,0001 painoprosenttia jonkin patentti vaatimuksen 8-10 mukaisella menetelmällä tuotettua re- q kombinanttia homesellulaasikoostumusta, jonka β-glukosi- <M ^ daasiaktiivisuus on parantunut. ^ 18. Transformantit, tunnettu siitä, että ne on oo ^ 30 tuotettu patenttivaatimuksen 7 mukaisella menetelmällä.
19. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jol- orj loin mainittua sellulaasikoostumusta tai patenttivaatimuk- oo sen 18 mukaisia transformantteja lisätään biomassaan seok-oo σ> sen muodostamiseksi etanolin fermentoimista varten.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentoinnissa käytetään hiivaa B. clausenii, S. cerevisiae, Cellulolyticus acidother-mophilium, C. brassicae, C. lustinaniae, S. uvarum tai
5 Schizosaccharomyces pombe. 21. bgll-geenin nukleotidisekvenssi, joka koko sekvenssi tai osa siitä on leimattu käytettäväksi koettimena, tunnettu siitä, että bgll-geenillä on kuvion 1 mukainen nukleotidisekvenssi.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukaisen nukleotidisek- venssin käsittävän koettimen käyttö filamenttihomeesta peräisin olevan β-glukosidaasigeenin tunnistamiseksi.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kyseinen koetin on saatu Trichoderma 15 reeseistä.
24. Patenttivaatimuksen 22 tai 23 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että yhtä tai useampia koettimia voidaan käyttää mainitun β-glukosidaasigeenin tunnistamiseksi filamenttihomeesta. δ (M 00 cp 00 CM X en CL 00 00 CD CM 00 σ>
FI932633A 1990-12-10 1993-06-09 Parannettu selluloosan sakkarifikaatio Trichoderma reesein b-glukosidaasi-geenin kloonauksen ja amplifikaation avulla FI121925B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62514090A 1990-12-10 1990-12-10
US62514090 1990-12-10
US9109285 1991-12-10
PCT/US1991/009285 WO1992010581A1 (en) 1990-12-10 1991-12-10 IMPROVED SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI932633A0 FI932633A0 (fi) 1993-06-09
FI932633A FI932633A (fi) 1993-06-09
FI121925B true FI121925B (fi) 2011-06-15

Family

ID=24504759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI932633A FI121925B (fi) 1990-12-10 1993-06-09 Parannettu selluloosan sakkarifikaatio Trichoderma reesein b-glukosidaasi-geenin kloonauksen ja amplifikaation avulla

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6022725A (fi)
EP (3) EP0562003B2 (fi)
JP (2) JPH06503960A (fi)
AT (2) ATE223490T1 (fi)
CA (1) CA2097180C (fi)
DE (2) DE69133612D1 (fi)
DK (2) DK1225227T3 (fi)
ES (2) ES2182818T5 (fi)
FI (1) FI121925B (fi)
WO (1) WO1992010581A1 (fi)

Families Citing this family (248)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9408573D0 (en) * 1994-04-29 1994-06-22 Gatsby Charitable Foundation Identification, production and use of saponin gylcosyl hydrolases
US5811381A (en) * 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US7883872B2 (en) * 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US6015703A (en) * 1998-03-10 2000-01-18 Iogen Corporation Genetic constructs and genetically modified microbes for enhanced production of beta-glucosidase
DE69922978T2 (de) * 1998-10-06 2005-12-08 Emalfarb, Mark Aaron, Jupiter Transformationsystem in filamentösen fungiziden chrysosporium-wirtszellen
AU2001292292A1 (en) 2000-09-29 2002-04-08 Meiji Seika Kaisha Ltd. Novel enzyme having beta-glucosidase activity and use thereof
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
KR20030046570A (ko) * 2001-12-05 2003-06-18 학교법인 경희대학교 트리코데르마 속 미생물로부터 유래한 베타-글루코시다제유전자 및 상기 유전자가 도입된 효모 형질전환체
US7045332B2 (en) * 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
DK1556512T3 (en) * 2002-11-07 2016-09-12 Danisco Us Inc BGL6 BETA-GLUCOSIDASE AND NUCLEIC ACIDS THEREOF CODED
US8278079B2 (en) 2002-11-07 2012-10-02 Danisco Us Inc. BGL6 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
WO2004078919A2 (en) 2003-02-27 2004-09-16 Midwest Research Institute Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from penicillium funiculosum
US7960148B2 (en) 2003-07-02 2011-06-14 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN1875099B (zh) * 2003-11-21 2011-05-04 金克克国际有限公司 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法
CN101123883B (zh) * 2004-02-23 2013-03-13 金克克国际有限公司 高纯度稻米蛋白浓缩物的制备方法
WO2005100582A2 (en) 2004-03-25 2005-10-27 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
US7037704B2 (en) * 2004-05-27 2006-05-02 Genencor International, Inc. Heterologous expression of an Aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
WO2005117756A2 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
US7332319B2 (en) * 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
US7413887B2 (en) * 2004-05-27 2008-08-19 Genecor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
CN1989254B (zh) 2004-07-27 2013-07-10 旭化成化学株式会社 生产纤维寡糖的方法
WO2006060062A2 (en) 2004-11-30 2006-06-08 Genencor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
JP2008525027A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 ジェネンコー・インターナショナル・インク 中性セルラーゼ触媒コア及びそれを生産する方法
JP5087407B2 (ja) 2004-12-30 2012-12-05 ジェネンコー・インターナショナル・インク 酸性真菌プロテアーゼ
WO2006089107A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Genencor International, Inc. Polypeptides having alpha-amylase and granular starch hydrolyzing activity
JP5343212B2 (ja) * 2005-03-15 2013-11-13 ヴェレニウム コーポレイション セルラーゼ、それらをコードする核酸、並びにそれらを作製及び使用する方法
EP2333045B1 (en) * 2005-04-12 2016-11-09 Danisco US Inc. Gene inactivated mutants with altered protein production
JP4789501B2 (ja) * 2005-04-25 2011-10-12 旭化成ケミカルズ株式会社 セルラーゼの製造方法
JP5049489B2 (ja) * 2005-12-16 2012-10-17 サントリーホールディングス株式会社 β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ阻害活性を有する化合物
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
MY160710A (en) 2006-02-10 2017-03-15 Verenium Corp Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2004819T3 (en) * 2006-04-05 2015-10-05 Danisco Us Inc FILAMENTOUS FUNGI WITH REDUCED CONTENT OF UDP-GALACTOFURANOSE
US8198046B2 (en) * 2006-07-11 2012-06-12 Danisco Us Inc. KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
US20080026376A1 (en) 2006-07-11 2008-01-31 Huaming Wang KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
CN101528766A (zh) * 2006-08-04 2009-09-09 维莱尼姆公司 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
DK2069512T3 (da) * 2006-09-22 2010-09-20 Danisco Us Inc Genencor Div Acetolaktat-syntase fra Trichoderma reesei som selektionsmarkør
EP2069494B1 (en) * 2006-10-06 2015-11-18 Danisco US Inc. Cellulase-free enzyme compositions and host cells for producing the same
US9447397B2 (en) 2006-10-10 2016-09-20 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
PT2082054E (pt) † 2006-11-13 2012-08-03 Danisco Us Inc Método para melhorar o rendimento de processos de conversão de celulose
US9862956B2 (en) 2006-12-10 2018-01-09 Danisco Us Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
US8680252B2 (en) 2006-12-10 2014-03-25 Dyadic International (Usa), Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
NZ598285A (en) * 2007-01-30 2013-10-25 Syngenta Participations Ag Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US20080220498A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US20100137184A1 (en) * 2007-02-28 2010-06-03 Mcdonald Hugh C Cleaning Compositions Comprising Alpha-Galactosidase
CN101636490B (zh) 2007-03-14 2012-05-16 丹尼斯科美国公司 里氏木霉α-淀粉酶是一种生麦芽糖酶
DK2147104T3 (en) * 2007-05-21 2015-12-14 Danisco Us Inc USING A ASPARAGINPROTEASE- (NSP24) SIGNAL SEQUENCE FOR heterologous protein EXPRESSION
WO2009033071A2 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
CN101796195A (zh) * 2007-09-07 2010-08-04 丹尼斯科美国公司 β-葡糖苷酶增强的丝状真菌全纤维素酶组合物和使用方法
EP2195435B1 (en) 2007-09-12 2012-10-10 Danisco US Inc. Trichoderma promoter
PL2514818T3 (pl) 2007-10-09 2014-11-28 Danisco Us Inc Odmiany glukoamylazy
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
EP2209901B1 (en) * 2007-10-12 2016-02-17 Danisco US Inc. Methods and compositions for enhanced production of organic sustances from fermenting microorganisms
CN101842479A (zh) * 2007-11-01 2010-09-22 丹尼斯科美国公司 用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣
ES2527586T3 (es) 2007-11-20 2015-01-27 Danisco Us Inc. Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas
SG162265A1 (en) 2007-12-13 2010-07-29 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene
EP2546338A1 (en) 2008-01-02 2013-01-16 Danisco US Inc. A process of obtaining ethanol without glucoamylase using pseudomonas saccharophila g4-amylase and variants thereof
EP2268806B1 (en) * 2008-02-11 2013-04-10 Danisco US Inc. Enzyme with microbial lysis activity from Trichoderma reesei
WO2009114380A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-17 Danisco Us Inc., Genencor Division Expression of catalase in trichoderma
EP2271766A2 (en) 2008-03-27 2011-01-12 Novozymes A/S Producing fermentation product from lignocellulose-containing material
US20090253173A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-08 Danisco Us Inc., Genencor Division Filamentous fungi with inactivated protease genes for altered protein production
US8709386B2 (en) * 2008-04-11 2014-04-29 Danisco Us Inc. Method of making and using an alpha-glucanase composition to reduce or remove biofilm
EP3118309B1 (en) 2008-04-18 2020-09-16 Danisco US Inc. Buttiauxella sp. phytase variants
CA2722189A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Chromatin, Inc. Methods and materials for processing a feedstock
US8173410B2 (en) 2008-04-23 2012-05-08 Danisco Us Inc. Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
MY156256A (en) * 2008-07-02 2016-01-29 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene free of c5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges
CN102482656A (zh) * 2008-08-29 2012-05-30 埃欧金能源公司 具有提高的稳定性的经修饰的β-糖苷酶
WO2010031062A1 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
CA2737195A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 The Goodyear Tire & Rubber Company Conversion of prenyl derivatives to isoprene
SG169640A1 (en) * 2008-09-15 2011-04-29 Danisco Us Inc Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase
BRPI0918453A2 (pt) 2008-09-15 2019-12-17 Danisco Us Inc sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno
WO2010031068A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
CN102171350B (zh) 2008-09-30 2013-09-11 诺维信北美公司 对用干酒糟预处理含木素纤维素材料的酶水解的改进
WO2010074999A1 (en) 2008-12-15 2010-07-01 Danisco Us Inc. Hybrid alpha-amylases
WO2010078391A2 (en) 2008-12-30 2010-07-08 Novozymes North America, Inc. Improvement of enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulose-containing material with dissolved air flotation sludge
CA2748887A1 (en) 2008-12-30 2010-07-08 Danisco Us Inc. Methods of producing isoprene and a co-product
WO2010078392A2 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Novozymes North America, Inc. Processes of producing fermentation products
CA2749190C (en) 2009-01-16 2017-10-24 Danisco A/S Enzymatic generation of oligasaccharides from cereals or cereal bi-streams
MX363668B (es) 2009-01-16 2019-03-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Generacion enzimatica de lipidos funcionales a partir de cereales o bi-corrientes de cereal.
BRPI1008890A2 (pt) 2009-02-20 2015-08-25 Danisco Us Inc Formulações de caldos de fermentação
JP5528535B2 (ja) 2009-03-31 2014-06-25 ダニスコ・アクティーゼルスカブ 植物細胞壁材料の可溶化の際の抽出物の暗色化および悪臭形成の防止
WO2010124146A2 (en) 2009-04-23 2010-10-28 Danisco Us Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
DK3591046T3 (da) 2009-05-19 2021-07-26 Dupont Nutrition Biosci Aps Amylasepolypeptide
TW201120213A (en) 2009-06-17 2011-06-16 Danisco Us Inc Polymerization of isoprene from renewable resources
TW201412988A (zh) * 2009-06-17 2014-04-01 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
CN102498401B (zh) 2009-07-17 2015-12-02 诺维信公司 在纤维素材料水解中分析纤维素衰变的方法
CN102712915B (zh) 2009-08-19 2014-12-10 丹尼斯科美国公司 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体
PE20121504A1 (es) 2009-08-19 2012-11-05 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes de glucoamilasa
EP3296394B1 (en) 2009-09-23 2020-11-04 Danisco US Inc. Novel glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof
CN105316303B (zh) * 2009-11-20 2019-05-31 丹尼斯科美国公司 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
US20120276585A1 (en) 2009-12-21 2012-11-01 Cofco Corporation Method for producing fermentation products from lignocellulose-containing material
WO2011079048A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
US9107440B2 (en) 2010-03-29 2015-08-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having transgalactosylating activity
EP3070171B1 (en) 2010-03-30 2018-06-13 Novozymes A/S Process for enhancing by-products from fermentation processes
US8933282B2 (en) 2010-06-17 2015-01-13 Danisco Us Inc. Fuel compositions comprising isoprene derivatives
CN103443281B (zh) 2010-07-07 2016-08-10 诺维信北美公司 发酵方法
WO2012012590A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
US20120034659A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. NEUTRAL pH SACCHARIFICATION AND FERMENTATION
US20120045812A1 (en) 2010-08-06 2012-02-23 Danisco Us Inc. PRODUCTION OF ISOPRENE UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS
EP2608682B1 (en) 2010-08-24 2017-12-13 Danisco US Inc. Method of making a snack bar comprising a low temperature rice protein concentrate
CN103443271A (zh) 2010-10-27 2013-12-11 丹尼斯科美国公司 用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体
US8691541B2 (en) 2010-12-22 2014-04-08 Danisco Us Inc. Biological production of pentose sugars using recombinant cells
WO2012088462A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Danisco Us Inc. Compositions and methods for improved isoprene production using two types of ispg enzymes
AU2012229063A1 (en) 2011-03-15 2013-09-19 The Regents Of The University Of California Mutant cells for protein secretion and lignocellulose degradation
CN103492561A (zh) 2011-03-17 2014-01-01 丹尼斯科美国公司 纤维素酶组合物和使用相同组合物用于改善木质纤维素生物质转化成可发酵糖的方法
RU2013146240A (ru) 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Ферменты гликозил-гидролазы и их применение для гидролиза биомассы
BR112013023757A2 (pt) 2011-03-17 2017-06-06 Danisco Us Inc método para redução de viscosidade no processo de sacarificação
CN103732756A (zh) 2011-04-29 2014-04-16 丹尼斯科美国公司 用于高密度葡萄糖浆的淀粉液化和糖化的单pH工艺
CN102268421B (zh) * 2011-08-03 2012-12-12 山西恩泽生物技术有限公司 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用
US8951764B2 (en) 2011-08-05 2015-02-10 Danisco Us Inc. Production of isoprenoids under neutral pH conditions
AU2012328562A1 (en) 2011-10-28 2014-03-13 Danisco Us Inc. Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
WO2013067026A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
US20130109055A1 (en) 2011-10-31 2013-05-02 Bp Corporation North America Inc. Use of mammalian promoters in filamentous fungi
WO2013070949A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 The Regents Of The University Of California Consolidated bioprocess for biofuel and chemical production from lignocellulosic biomass
DK2788491T3 (en) 2011-12-09 2019-04-01 Danisco Us Inc RIBOSOMAL PROMOTERS FROM B. SUBTILIS FOR PROTEIN PRODUCTION IN MICRO-ORGANISMS
JP5875922B2 (ja) * 2012-03-29 2016-03-02 日本製紙株式会社 セルロース含有廃棄物の糖化方法
US9163263B2 (en) 2012-05-02 2015-10-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene
MX2014013402A (es) 2012-05-11 2014-11-26 Danisco Inc Uso de alfa-amilasa de aspergillus clavatus para sacarificacion.
DK2859098T3 (en) 2012-06-08 2017-12-11 Dupont Nutrition Biosci Aps POLYPEPTIDES WITH TRANSGALACTOSYLATION ACTIVITY
DK2825643T3 (da) 2012-06-08 2021-11-08 Danisco Us Inc Variant-alfa-amylaser med forbedret aktivitet over for stivelsespolymerer
WO2014028434A2 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
FR2994981B1 (fr) 2012-09-05 2014-09-12 Centre Nat Rech Scient Polypeptide a activite beta-glucosidase renforcee a basse temperature
FR2995319B1 (fr) 2012-09-10 2016-04-29 Agronomique Inst Nat Rech Preparation multi-enzymatique contenant le secretome d'une souche d'aspergillus japonicus
US20150376590A1 (en) 2012-11-02 2015-12-31 Bp Corporation North America Inc. Thermotolerant Beta-Glucosidase Variants
WO2014081622A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Danisco Us Inc. Amylase with maltogenic properties
WO2014092960A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei host cells expressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof
CA2894513A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification
US20160010128A1 (en) 2012-12-20 2016-01-14 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
WO2014099523A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Danisco Us Inc. Alpha-amylase variants
WO2014099525A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Danisco Us Inc. Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof
ES2676895T5 (es) 2013-03-11 2022-04-27 Danisco Us Inc Variantes combinatorias de alfa-amilasa
WO2014145768A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bp Corporation North America Inc. Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
EP3011020A1 (en) 2013-06-17 2016-04-27 Danisco US Inc. Alpha-amylase from bacillaceae family member
EP3052622B1 (en) 2013-10-03 2018-09-19 Danisco US Inc. Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
WO2015050723A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
WO2015057517A1 (en) 2013-10-17 2015-04-23 Danisco Us Inc. Use of hemicellulases to improve ethanol production
BR112016009365A2 (pt) 2013-10-28 2017-09-19 Danisco Us Inc Método para aumentar, melhorar e estender a produção de etanol e método para diminuir as concentrações finais de dp2 em um produto de fermentação
WO2015066667A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Danisco Us Inc. Proteases in wheat processing
WO2015066669A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Danisco Us Inc. Proteases in corn processing
MX2016006489A (es) 2013-11-20 2016-08-03 Danisco Us Inc Alfa-amilasas variantes que tienen susceptibilidad reducida a la escision por proteasas y metodos de uso.
MX2016007636A (es) 2013-12-11 2016-10-13 Dupont Nutrition Biosci Aps Metodo para preparar un producto lacteo que tiene un contenido estable de galactooligosacarido(s).
WO2015094809A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Danisco Us Inc. Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof
WO2015094714A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Danisco Us Inc. Proteases in grain processing
US20170006902A1 (en) 2014-02-13 2017-01-12 Danisco Us Inc. Strategy for sucrose reduction and generation of insoluble fiber in juices
FR3019558A1 (fr) 2014-04-08 2015-10-09 Agronomique Inst Nat Rech Preparation multi-enzymatique contenant le secretome d'une souche de laetisaria arvalis
JP6315807B2 (ja) * 2014-08-04 2018-04-25 本田技研工業株式会社 Ｇｈファミリー１２に属する超耐熱性エンドグルカナーゼ
WO2016026977A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Danmarks Tekniske Universitet A process for producing a fermentation product from a lignocellulose-containing material
EP3214942B1 (en) 2014-11-07 2021-02-24 DuPont Nutrition Biosciences ApS Recombinant host cell expressing beta-galactosidase and/or transgalactosylating activity deficient in mannanase, cellulase and pectinase.
CA2973303C (en) 2015-01-28 2023-01-03 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
PL3250698T3 (pl) 2015-01-28 2020-06-29 Dsm Ip Assets B.V. Sposób enzymatycznej hydrolizy materiału lignocelulozowego i fermentacji cukrów
WO2016120298A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN108064267A (zh) 2015-02-09 2018-05-22 丹尼斯科美国公司 真菌菌株及使用方法
DK3259358T3 (da) 2015-02-19 2024-09-09 Danisco Us Inc Forøget proteinekspression
WO2016138315A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Danisco Us Inc Alpha-glucosidase, compositions & methods
CN107404915A (zh) 2015-03-04 2017-11-28 杜邦营养生物科学有限公司 谷粒加工
WO2016169893A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Whole fermentation broth
WO2016169892A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3298138B1 (en) 2015-05-22 2022-08-10 DuPont Nutrition Biosciences ApS Acetolactate decarboxylase
WO2016207144A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3320106A1 (en) 2015-07-07 2018-05-16 Danisco US Inc. Induction of gene expression using a high concentration sugar mixture
JP6937740B2 (ja) 2015-07-28 2021-09-22 ダニスコ・ユーエス・インク ゲノム編集システムおよび使用方法
EP3344282B8 (en) 2015-09-02 2020-12-23 DuPont Nutrition Biosciences ApS Glycoside hydrolases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal
WO2017144670A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 Danmarks Tekniske Universitet Improved process for producing a fermentation product from a lignocellulose-containing material
CN109071615A (zh) 2016-03-04 2018-12-21 丹尼斯科美国公司 用于在微生物中产生蛋白质的工程化核糖体启动子
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017211957A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Seed train for large scale enzyme production
CN109642226A (zh) 2016-06-30 2019-04-16 丹尼斯科美国公司 天冬氨酸蛋白酶
US10913938B2 (en) 2016-07-29 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
WO2018053058A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Danisco Us Inc. Lignocellulosic biomass fermentation-based processes
CA3037083A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Dupont Nutrition Biosciences Aps Acetolactate decarboxylase variants having improved specific activity
RU2763378C2 (ru) 2016-09-23 2021-12-28 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА
EP3523415A1 (en) 2016-10-04 2019-08-14 Danisco US Inc. Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates
WO2018093752A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danisco Us Inc. Filamentous fungi with improved protein production
EP3545100A1 (en) 2016-11-24 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
US20190276809A1 (en) 2016-11-24 2019-09-12 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
EP3558026A1 (en) 2016-12-21 2019-10-30 DuPont Nutrition Biosciences ApS Methods of using thermostable serine proteases
CN110114455A (zh) * 2016-12-27 2019-08-09 国立大学法人鹿儿岛大学 真菌中蛋白质的选择性分泌技术
BR112019018381A2 (pt) 2017-03-06 2020-04-07 Dupont Nutrition Biosci Aps fucosidases fúngicas e seu uso na prevenção e/ou no tratamento de uma infecção patogênica em um animal
CN110621777A (zh) 2017-03-15 2019-12-27 杜邦营养生物科学有限公司 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途
CN110621778A (zh) 2017-03-15 2019-12-27 丹尼斯科美国公司 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途
WO2018169780A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods of using an archaeal serine protease
WO2018185071A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019047199A1 (en) 2017-09-11 2019-03-14 Danisco Us Inc. GLUCOAMYLASE AND METHODS OF USE THEREOF
US20200216787A1 (en) 2017-09-18 2020-07-09 Dupont Nutrition Biosciences Aps Riboflavinase enzymes and their use to prevent off flavor in brewing
WO2019074828A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Danisco Us Inc CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE
FI3695001T3 (fi) 2017-10-09 2024-02-14 Versalis Spa Menetelmä lignoselluloosamateriaalin entsymaattista hydrolyysiä ja sokerien fermentointia varten
WO2019086370A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019086369A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
BR112020009525A2 (pt) 2017-11-14 2020-11-03 Danisco Us Inc. alfa-amilase, composição e método
BR112020012431A2 (pt) 2017-12-19 2020-11-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps modificação enzimática melhorada de fosfolipídios em alimento
EP3762504A1 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Danisco US Inc. Glucoamylases and methods of use thereof
WO2019185681A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
EP3775189A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
BR112020023198A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. processo para produção de um polipeptídeo
WO2019229108A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Dsm Ip Assets B.V. Process for producing sugars from carbohydrate materials
KR102155049B1 (ko) * 2018-06-18 2020-09-11 국민대학교산학협력단 트리코더마 속 kmf006 균주를 이용한 셀룰레이스 생산 방법
EP3818154A1 (en) 2018-07-06 2021-05-12 DuPont Nutrition Biosciences ApS Xylanase-containing feed additives for cereal-based animal feed
US20210315238A1 (en) 2018-07-31 2021-10-14 Dupont Nutrition Biosciences Aps Proline specific endopeptidases
WO2020058253A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058249A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058248A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
CN112912511A (zh) 2018-10-24 2021-06-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于碳水化合物材料酶促水解和糖发酵的方法
WO2020106796A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Dupont Nutrition Biosciences Aps ENGINEERED ROBUST HIGH Tm-PHYTASE CLADE POLYPEPTIDES AND FRAGMENTS THEREOF
CN113646428A (zh) 2019-02-25 2021-11-12 杜邦营养生物科学有限公司 具有增加的n-末端氨基酸产率的蛋白质水解产物
EP3938525A1 (en) 2019-03-12 2022-01-19 DSM IP Assets B.V. Process for producing a fermentation broth
EP4028536A1 (en) 2019-09-10 2022-07-20 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
CN114667350A (zh) 2019-11-08 2022-06-24 丹尼斯科美国公司 包含蛋白质生产率提高表型的真菌菌株及其方法
US20230009832A1 (en) 2019-11-20 2023-01-12 Dupont Nutrition Biosciences Aps Thermostable phytase variants
JP2023506284A (ja) 2019-12-19 2023-02-15 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ファインケミカルを生成する際の空時収率、炭素変換効率、及び炭素基質適応性の増加
EP4076002A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 DuPont Nutrition Biosciences ApS Diet formulations
US20230041211A1 (en) 2019-12-20 2023-02-09 Basf Se Decreasing toxicity of terpenes and increasing the production potential in micro-organisms
US20230240334A1 (en) 2020-02-28 2023-08-03 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed compositions
WO2021212095A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Danisco Us Inc. Glucoamylase and methods of use thereof
US20230174998A1 (en) 2020-04-22 2023-06-08 Danisco Us Inc. Compositions and methods for enhanced protein production in filamentous fungal cells
WO2022013148A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of biogas
FR3113291A1 (fr) 2020-08-06 2022-02-11 IFP Energies Nouvelles Procédé de production d’alcool par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique
BR112023005131A2 (pt) 2020-09-21 2023-04-25 Dupont Nutrition Biosci Aps Processo para fazer um produto de panificação com resiliência melhorada, produto de panificação, uso de uma exoamilase não maltogênica e uma glucoamilase, composição melhoradora para uma massa e massa
WO2022178214A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Dupont Nutrition Biosciences Aps Compositions for gut health
WO2022214459A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
EP4320252A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
CA3213845A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
BR112023014100A2 (pt) 2021-04-08 2023-10-17 Versalis Spa Processo para a preparação de um produto de açúcar e um produto de fermentação
EP4071763A1 (en) 2021-04-08 2022-10-12 DuPont Nutrition Biosciences ApS A method for measuring galactooligosaccharides
US20240228917A1 (en) 2021-06-18 2024-07-11 International N&H Denmark Aps Proteases for beer haze reduction
WO2023003683A2 (en) 2021-07-19 2023-01-26 Danisco Us Inc. Compositions and methods for enhanced protein production in fungal cells
WO2023064905A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants and methods for use thereof
CN118434285A (zh) 2021-11-17 2024-08-02 国际N&H丹麦有限公司 半乳糖脂在食品中的改善的酶促修饰
KR20240110854A (ko) 2021-12-01 2024-07-16 다니스코 유에스 인크. 진균 세포에서의 향상된 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법
CA3242135A1 (en) 2021-12-24 2023-06-29 Zhongmei TANG Hybrid glucoamylases and methods of use thereof
WO2023225510A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive comprising enzyme combinations
WO2024015974A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Improved enzymatic modification of phospholipids in food
WO2024102556A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Danisco Us Inc. Filamentous fungal strains comprising enhanced protein productivity phenotypes and methods thereof
WO2024124013A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 International N&H Denmark Aps Feed formulations comprising a phytase for dairy ruminant animals
WO2024137350A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Danisco Us Inc. Recombinant fungal strains and methods thereof for producing consistent proteins
WO2024145191A2 (en) 2022-12-29 2024-07-04 International N&H Denmark Aps Methods for producing plant based food alternatives
WO2024163288A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 International N&H Denmark Aps Novel methods and compositions for improving mash filterabililty and yield in brewing
WO2024167695A1 (en) 2023-02-08 2024-08-15 Danisco Us Inc. Compositions and methods for producing heterologous globins in filamentous fungal cells

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275163A (en) 1978-11-20 1981-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Cellulase-producing microorganism
AU8496382A (en) * 1981-07-16 1983-01-20 Unisearch Limited Enzymic process to hydrolyze celluloses
US4472504A (en) 1983-03-28 1984-09-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Hyperproducing cellulase microorganism
FR2556008B1 (fr) * 1983-12-06 1987-06-26 Centre Nat Rech Scient Vecteurs plasmidiques de clonage et d'expression d'une proteine dans un micro-organisme, comportant au moins le promoteur d'expression de la b-glucosidase dans les levures; micro-organismes les contenant; procede de fermentation et enzymes obtenues
US4892819A (en) * 1985-11-25 1990-01-09 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum
US4935349A (en) * 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8610600D0 (en) † 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5298405A (en) 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
JPH0683674B2 (ja) 1987-03-17 1994-10-26 味の素株式会社 セロビオ−スの製造法
FR2615527B1 (fr) 1987-05-22 1989-08-18 Lesaffre Soc Ind Procede d'integration d'une sequence connue d'adn dans les levures ascosporogenes, vecteurs mis en oeuvre et nouvelles souches de levures
DD263571B5 (de) * 1987-08-27 1996-08-22 Inst Fuer Tech Textilien Gmbh Dichtstrick
US4885252A (en) * 1987-09-08 1989-12-05 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from aspergillus nidulans
DK115890D0 (da) † 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
WO1992006210A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-16 Genencor International, Inc. Detergent compositions containing cellulase compositions enriched in acidic endoglucanase type components
DK0551386T3 (da) * 1990-10-05 2004-05-10 Genencor Int Fremgangsmåde til behandling af bomuldsholdige stoffer med cellulase
JP3075609B2 (ja) * 1991-10-29 2000-08-14 株式会社ニチレイ セロオリゴ糖の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK0562003T3 (da) 2003-01-13
EP0562003B1 (en) 2002-09-04
DK0562003T4 (en) 2015-07-13
EP0562003A4 (en) 1994-08-24
JP2001245679A (ja) 2001-09-11
DE69133100T3 (de) 2015-09-03
WO1992010581A1 (en) 1992-06-25
EP2075338A2 (en) 2009-07-01
DE69133100T2 (de) 2003-05-22
FI932633A0 (fi) 1993-06-09
ES2322032T3 (es) 2009-06-16
EP0562003B2 (en) 2015-04-01
ES2182818T5 (es) 2015-07-06
JPH06503960A (ja) 1994-05-12
ATE423207T1 (de) 2009-03-15
CA2097180C (en) 2007-08-14
FI932633A (fi) 1993-06-09
US6022725A (en) 2000-02-08
EP1225227B1 (en) 2009-02-18
DE69133100D1 (de) 2002-10-10
EP1225227A1 (en) 2002-07-24
EP0562003A1 (en) 1993-09-29
ATE223490T1 (de) 2002-09-15
EP2075338A3 (en) 2010-03-03
DK1225227T3 (da) 2009-06-22
CA2097180A1 (en) 1992-06-11
DE69133612D1 (de) 2009-04-02
ES2182818T3 (es) 2003-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121925B (fi) Parannettu selluloosan sakkarifikaatio Trichoderma reesein b-glukosidaasi-geenin kloonauksen ja amplifikaation avulla
US6103464A (en) Method of detecting DNA encoding a β-glucosidase from a filamentous fungus
JP4769724B2 (ja) 新規トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）遺伝子
EP0828840B1 (en) Alkaline cellulase and method for producing the same
US5874276A (en) Cellulase enzymes and systems for their expressions
Kun et al. Developments and opportunities in fungal strain engineering for the production of novel enzymes and enzyme cocktails for plant biomass degradation
KR100618495B1 (ko) 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
CA2232245C (en) Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
JP2010501189A (ja) 増加した耐熱性、好熱性および好アルカリ性を備えたファミリー６セルラーゼ
CA2755417A1 (en) New fungal production system
EP2630249B1 (en) Thermostable trichoderma cellulase
JP3522744B2 (ja) セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法
Zhao et al. Expression and characterization of GH3 β-Glucosidase from Aspergillus niger NL-1 with high specific activity, glucose inhibition and solvent tolerance
MX2011000552A (es) Glicosidasa modificadas de la familia 6 con especificidad alterada del sustrato.
Wang et al. Co-expression of beta-glucosidase and laccase in Trichoderma reesei by random insertion with enhanced filter paper activity
Lee et al. Characterization of cellobiohydrolase from a newly isolated strain of Agaricus arvencis
Ogawa et al. Intraspecific hybridization of Trichoderma reesei by protoplast fusion
US11371032B2 (en) Beta glucosidase with high glucose tolerance, high thermal stability and broad PH activity spectrum
Lee et al. Molecular cloning and expression of an endo-β-1, 4-d-glucanase I (avicelase I) gene from Bacillus cellulyticus K-12 and characterization of the recombinant enzyme
EP2450438B1 (en) Cellulase preparation containing endoglucanases derived from two different types of microorganisms
AU2006249202A1 (en) High-throughput screening of expressed DNA libraries in filamentous fungi

Legal Events

Date Code Title Description
FC Application refused
RF Appeal filed
RFK Appeal accepted

Free format text: PATENT IN FORCE

FG Patent granted

Ref document number: 121925

Country of ref document: FI

MA Patent expired