ES2650444T3 - Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante seleccionado del grupo constituido por: a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 980 restos de aminoácidos y b. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 975 restos de aminoácidos.

Description

Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante
Campo de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos, específicamente polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante y a ácidos nucleicos que codifican a éstos, y sus usos en, p. ej. , productoslácteos.
Antecedentes de la invención
Los galactooligosacáridos (GOS) son hidratos de carbono que no son digeribles por seres humanos y animales que comprenden dos o más moléculas de galactosa, generalmente hasta nueve, unidas por enlaces glucosídicos. Los GOS también pueden incluir una o más moléculas de glucosa. Uno de los efectos beneficiosos de los GOS es su capacidad para actuar como compuestos prebióticos estimulando selectivamente la proliferación de microorganismos del colon beneficiosos tales como bacterias para dar beneficios fisiológicos al consumidor. Los efectos sanitarios demostrados han dado lugar a un creciente interés en los GOS como ingredientes alimentarios para diversos tipos de alimentos.
La enzima β-galactosidasa (EC 3.2.1.23) normalmente hidroliza la lactosa a los monosacáridos D-glucosa y Dgalactosa. En la reacción enzimática normal de las β-galactosidasas, la enzima hidroliza la lactosa y se une temporalmente al monosacárido galactosa en un complejo galactosa-enzima que transfiere galactosa al grupo hidroxilo del agua, dando como resultado la liberación de D-galactosa y D-glucosa. Sin embargo, a altas concentraciones de lactosa algunas β-galactosidasas son capaces de transferir galactosa a los grupos hidroxilo de D-galactosa o D-glucosa en un proceso denominado transgalactosilación, mediante el cual se producen galactooligosacáridos. Además a altas concentraciones de lactosa algunas β-galactosidasas son capaces de transferir galactosa a los grupos hidroxilo delactosa o de oligosacáridos de orden superior.
El género Bífídobacterium es uno de los tipos más generalmente empleados de cultivos bacterianos en la industria láctea para fermentar una variedad de productos lácteos. La ingestión de productos que contienen Bifidobacterium tiene además un efecto que fomenta la salud. Este efecto no sólo se consigue mediante una reducción del pH del contenido intestinal, sino también por la capacidad de Bifidobacterium para repoblar la flora intestinal con individuos que han tenido su flora intestinal alterada, por ejemplo, por el consumo de antibióticos. Bifidobacterium además tiene el potencial de desbancar posibles microorganismos intestinales dañinos.
Los galactooligosacáridos son conocidos por potenciar el crecimiento de Bifidobacterium. Este efecto se consigue probablemente a través de la capacidad única de Bifidobacterium de explotar galactooligosacáridos como fuente de carbono. Además, se cree que el complemento alimenticio de galactooligosacáridos tiene una serie de efectos protectores de enfermedades a largo plazo. Por ejemplo, se ha demostrado que el consumo de galactooligosacáridos es muy protector contra el desarrollo de cáncer colorrectal en ratas. Hay por lo tanto un gran interés en el desarrollo de métodos baratos y eficientes para producir galactooligosacáridos para empleo en la industria para mejorar complementos alimenticios y productos lácteos.
Se ha descrito una lactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215 truncada con aproximadamente 580 aminoácidos (BIF3-d3) como una enzima transgalactosilante en una solución que contiene lactosa disuelta en agua (Jørgensen et al., 2001), Appl. Microbiol., Biotechnol., 57: 647-652 ). El documento WO 01/90317 también describe una variante de truncamiento (OLGA347) como una enzima transgalactosilante y en el documentoWO 2012/010597 se demostró que OLGA347 transfiere un resto de galactosa a D-fucosa, N-acetil-galactosamina y xilosa.
En el documento WO 2009/071539 se describe un fragmento truncado de forma distinta en comparación con BIF3d3 que da como resultado hidrólisis eficiente y producciónmuy baja de GOS cuando se ensaya en leche.
Las enzimas lactasa de Bifidobacterium bifidum descritas anteriormente tienen el inconveniente de requerir altas concentraciones de lactosa tales como superiores al 10% (p/p) a fin de producir GOS, o un exceso elevado de otra molécula receptora para generar heterooligosacáridos. Además, se ha descrito una molécula que tiene predominantemente actividad beta-galactosilasa(hidrolasa).
Todavía hay necesidad de desarrollar enzimas que sean eficientes en la producción de GOS en aplicaciones con bajas concentraciones de sustrato de lactosa, tal como en laleche.
Compendio de la invención
Un objetivo de las realizaciones de la invención es proporcionar un polipéptido que tenga una proporción útil de transgalactosilación a actividad de hidrólisis y por lo tanto sean productores eficientes deGOS cuando se incuba con lactosa incluso a concentraciones bajas de lactosa tales como en un producto a lácteo. Otro objetivo de las realizaciones de la invención es proporcionar un método para la producción de galactooligosacáridos (GOS) in situ en productos lácteos. Otro objetivo de las realizaciones de la invención es proporcionar un método para desarrollar un método más económico y más eficiente para la producción de galactooligosacáridos (GOS) para su uso en la
industria. Otro objetivo de las realizaciones de la invención es proporcionar polipéptidos que sean estables frente a truncamiento adicional tal como por degradación proteolítica cuando se producen en un organismo adecuado tal como Bacillus subtilis, p. ej. Bacillus subtilis, cepa BG3594. Es todavía otro objeto de las realizaciones de la invención proporcionar polipéptidos que sean estables frente a truncamiento adicional durante el almacenamiento después de la formulación final.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los polipéptidos descritos en la presente memoria son productores eficientes de galactooligosacáridos, por ejemplo in situ cuando se incuban en una composición que contiene lactosa tal como leche, en la que tienen una conversión eficiente de lactosa en GOS dando lugar a una cantidad menor de lactosa. La presencia de galactooligosacáridos en productos lácteos u otros productos comestibles tiene la ventaja de potenciar el crecimiento de cepas microbianas beneficiosas (probióticos) tales como la Bifidobacterium sp. que fomenta la salud en el propio producto y/o en el ser humano o animal que consume el producto.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1 y en la que dicho polipéptido, cuando es un producto de expresión en una cepa BG3594 de Bacillus subtilis de una secuencia deácido nucleico, que codifica dicho polipéptido, es el único producto de expresión de polipéptido de dicha secuencia de ácido nucleico que presenta actividad transgalactosilante.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante seleccionado del grupo que consiste en:
a.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 980 restos de aminoácidos, y
b.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 975 restos de aminoácidos.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante seleccionado del grupo que consiste en:
c.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96,5% de identidad de secuencia conla SEQ ID nº: 3, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 1.300 restos de aminoácidos,
d.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de baja restricción con i) la secuencia de ácido nucleico comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifica el polipéptido de las SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4, o 5; o ii) la cadena complementaria dei),
e.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o la secuencia de nucleótidos comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifican un polipéptido maduro, y
f.
un polipéptido que comprende una supresión, inserción y/o sustitución conservativa de uno o más restos de aminoácidos delas SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante seleccionado del grupo que consiste en:
a.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96,5% de identidad de secuencia conla SEQ ID nº: 3, en donde dicho polipéptido consiste en como máximo 1.300 restos de aminoácidos,
b.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 980 restos de aminoácidos,
c.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de baja restricción con i) la secuencia de ácido nucleicos comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifica el polipéptido de las SEQ ID nº: 1, 2, 4, o 5; o ii) la cadena complementaria dei),
d.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o la secuencia de nucleótidos comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifican un polipéptido maduro, y
e.
un polipéptido que comprende una supresión, inserción y/o sustitución conservativa de uno o más restos de aminoácidos delas SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En la presente memoria se describe un polipéptido que es un fragmento truncado en el terminal C de SEQ ID nº: 22 que tiene actividad transgalactosilante y que es estable frente a truncamiento adicional tal como por degradación proteolítica cuando se produce en un organismo adecuado tal como Bacillus subtilis p. ej. Bacillus subtilis cepa
BG3594 y/o que son estables frente a truncamiento adicional durante el almacenamiento después de la formulación final.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 980 restos de aminoácidos.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 975 restos de aminoácidos.
Se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96,5% deIdentidad desecuencia con la SEQ ID nº: 3, en el quedicho polipéptido consta comomáximo de
1.300 restos de aminoácidos.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido según la invención.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un vector de expresión y/o un plásmido que comprende un nucleico como se describe en la presente memoria, o es capaz de expresar un polipéptido según la invención.
En un aspecto, se describe en la presentememoria una célula capaz de expresar un polipéptido según la invención.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un método para expresar un polipéptido, comprendiendo el método la obtención de una célula tal como se describe en la presente memoria y la expresión del polipéptido de la célula, y opcionalmente la purificación del polipéptido según la invención.
En un aspecto, se describe en la presente memoria una composición que comprende un polipéptido según la invención, preferiblemente una composición alimenticia, máspreferiblemente un producto lácteo.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un método para producir un producto alimenticio tal como un producto lácteo tratando un sustrato lácteo que comprende lactosa con un polipéptido según lainvención.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un galactooligosacárido o una composición de los mismos obtenidos por tratamiento de un sustrato que comprende lactosa con un polipéptido según la invención.
Leyendas en las figuras
La figura 1 muestra un mapa de plásmido para la variante BIF_1326 para expresión recombinada en Bacillus subtilis.
La figura 2 muestra SDS-PAGE que presenta variantes de truncado purificadas usando columna HyperQ eluida con un gradiente de NaCl.
La figura 3 muestra la relación de la actividad de transgalactosilación. La relación se calcula como la relación entre Abs420 con receptor presente dividido por Abs420 sin receptor presente por 100. Las variantes en o por debajo del índice 100 son variantes puramente hidrolíticas, mientras que el nivel por encima refleja la actividad transgalactosilante relativa .
La figura 4 muestra la eficacia de generación de galactooligosacáridos (GOS) de variantes seleccionadas en una matriz de yogur a 30°C durante 3 horas. En este ejemplo GOS es la cantidad acumulativa de oligosacáridos en y por encima de DP3.
La figura 5 muestra gel de SDS-PAGE presentando las diferentes variantes de la tabla 2 expresadas y los fragmentos de degradación detectados. El recuadro inferior muestra la ampliación e identificación de las bandas de degradación.
Listado de secuencias
SEQ ID nº: 1 (también denominada (BIF_917) en la presente memoria) es un fragmento truncado de 887 aminoácidos dela SEQ ID nº: 22.
SEQ ID nº: 2 (también denominada (BIF_995) en la presente memoria) es un fragmento truncado de 965 aminoácidos dela SEQ ID nº: 22.
SEQ ID nº: 3 (también denominada (BIF_1068) en la presente memoria) es un fragmento truncado de 1.038 aminoácidos dela SEQ ID nº: 22.
SEQ ID nº: 4 (también denominada (BIF_1172) en la presente memoria) es un fragmento truncado de 1.142 aminoácidos dela SEQ ID nº: 22.
SEQ ID nº: 5 (también denominada (BIF_1241) en la presente memoria) es un fragmento truncado de 1.211
aminoácidos de SEQ ID nº: 22. SEQ ID nº: 6 (también denominada (BIF_1326) en la presente memoria) es un fragmento truncado de 1.296 aminoácidos de SEQ ID nº: 22.
SEQ ID nº: 7 es el núcleo catalítico de glucósido hidrolasa de Bifidobacterium bifidum
SEQ ID nº: 8 es una secuencia de nucleótidos que codifica una lactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215 SEQ ID nº: 9 es la secuencia de nucleótidos que codifica BIF_917 SEC ID Nº: 10 es la secuencia de nucleótidos que codifica BIF_995 SEQ ID nº: 11 es la secuencia de nucleótidos que codifica BIF 1068 SEQ ID nº: 12 es la secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1172 SEQ ID nº: 13 es la secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1241 SEQ ID nº: 14 es la secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1326 SEQ ID nº: 15 es un cebador directo para la generación delas variantes de BIF anteriores SEQ ID nº: 16 es un cebador inverso para BIF917 SEQ ID nº: 17 es un cebador inverso para BIF995 SEQ ID nº: 18 es un cebador inverso para BIF1068 SEQ ID nº: 19 es un cebador inverso para BIF1241 SEQ ID nº: 20 es un cebador inverso para BIF1326 SEQ ID nº: 21 es un cebador inverso para BIF1478 SEQ ID nº: 22 es lactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215. SEQ ID nº: 23 es la secuencia señal delactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215
Descripción detallada de la invención
Definiciones
De acuerdo con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Debe tenerse en cuenta que, tal como se emplean en la presente memoria, las formas singulares "un", "una" "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluyeuna pluralidad dedichos polipéptidos, y la referencia a "la formulación" incluyereferencia a una o más formulaciones y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente memoria tienen el mismo significado que generalmente entiende un experto en la técnica. Los siguientes términos se proporcionan a continuación.
"Transgalactosilasa" significa una enzima que, entre otras cosas, es capaz de transferir galactosa a los grupos hidroxilo de D-galactosa o D-glucosa, por lo que se producen galactooligosacáridos. En un aspecto, se identifica una transgalactosilasa por reacción de la enzima sobre lactosa en la que la cantidad de galactosa generada es menor que la cantidad de glucosa generada en un momento dado.
En el presente contexto, la expresión "actividad transgalactosilante" significa la transferencia de un resto de galactosa a una molécula distinta del agua. La actividad se puede medir como [glucosa] -[galactosa] generada en cualquier momento dado durante la reacción o por cuantificación directa del GOS generado en cualquier momento dado durante la reacción. Esta medición puede realizarse de varias maneras, tal como por un método de HPLC como se muestra en los ejemplos. Cuando se comparan las mediciones de la actividad transgalactosilante, se han realizado a una concentración inicial dada delactosa, tal como, p. ej. , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10% (p/p).
En el presente contexto, la expresión “actividad β-galactosidasa” significa la capacidad de una enzima para hidrolizar β-galactósidos tales como por ejemplolactosa en monosacáridos, glucosa y galactosa.
En el contexto del cálculo de la actividad transgalactosilante:actividad β-galactosidasa, la actividad β-galactosidasa se mide como [galactosa] generada en cualquier momento dado durante la reacción. Esta medición puede realizarse de varias maneras, tal como por unmétodo de HPLC como se muestra en los ejemplos.
En el presente contexto, se calculó la expresión "relación de la actividad de transgalactosilación" usando ortonitrofenol-β-D-galactopiranósido (ONPG) de la forma siguiente: La relación se calcula como la relación entre Abs420 con el receptor presente dividido por Abs420 sin receptor por 100. Las variantes en o por debajo del índice 100 son variantes puramente hidrolíticas, mientras que el nivel anterior representa la actividad transgalactosilante relativa.
Relación de actividad de transgalactosilación = (Abs420+celobiosa / Abs420-celobiosa )*100%, donde Abs420+celobiosa es la absorbancia leída a 420 nm usando el método 3 descrito a continuación, incluida celobiosa en la reacción y Abs420celobiosa es la absorbancia leída a 420 nm usando el método 3 descrito a continuación pero sin celobiosa en la reacción. La ecuación anterior sólo es válida para diluciones en las que la absorbancia esté entre 0,5 y 1,0.
En un aspecto, la actividad se mide después de 15 min. de reacción, 30 min. de reacción, 60 min. reacción, 90 min. de reacción, 120 min. de reacción o 180 min. de reacción. De este modo, en un aspecto, como ejemplo, la actividad de transgalactosilación relativa semide 15 minutos después de la adición de enzimas, tal como 30 minutos después de la adición de enzimas, tal como 60minutos después de la adición de enzimas, tal como 90 minutos después de la adición de enzimas, tal como 120 minutos después de la adición de enzimas o tal como 180 minutos después de la adición de enzimas.
En el presente contexto, la expresión "relación de actividad transgalactosilante:actividad β-galactosidasa" significa ([Glucosa] – [Galactosa]/[Galactosa]).
En el presente contexto, el término [Glucosa] significa la concentración de glucosa en% en peso medida por HPLC.
En el presente contexto, el término [Galactosa] significa la concentración de galactosa en% en peso medida por HPLC.
En el presente contexto, la expresión "lactosa ha sido transgalactosilada" significa que una molécula de galactosa se ha unido por enlace covalente a la molécula de lactosa tal como por ejemplo unida por enlace covalente a cualquiera de los grupos hidroxilo libres en la molécula de lactosa o generada por transgalatosilación interna para ejemplo formando alolactosa.
En el presente contexto, se ensayó la evaluación del rendimiento de los polipéptidos descritos en la presente memoria en la producción de galactooligosacáridos (GOS) en un "ensayo basado en la leche" (simulador de aplicación deyogur). Serealizaron experimentos en lotes con un volumen de100 μl en placas de MTP de96 pocillos usando una mezcla de yogur, consistente en 98,60% (p/v) de leche baja en grasa pasteurizada fresca (Arla Minimælk) y 1,4% (p/v) de ingrediente de suero de leche Nutrilac YQ-5075 (Arla). Para hidratar completamente Nutrilac YQ-5075, la mezcla se dejó en agitación durante 20 horas y después se añadió fosfato Na 20 mM pH 6,5 para asegurar un pH de 6,5. Esta base de yogur se utilizó pura o con varios complementos tales como lactosa, fucosa, maltosa, xilosa o sales adicionales. Se mezclaron 90 μl del yogur con 10 μl de enzima purificada o fermento en bruto, se sellaron con cinta adhesiva y se incubaron a 43°C durante 3 horas. La reacción se detuvo con 100 μl de Na2CO3 al 10%. Las muestras se almacenaron a -20ºC. La cuantificación de galactooligosacáridos (GOS), lactosa, glucosa y galactosa se realizó por HPLC. El análisis de las muestras se llevó a cabo en un Dionex ICS 3000. Los parámetros del IC fueron los siguientes: Fase móvil: NaOH 150 mM, Caudal: Isocrático, 0,25 ml/min, Columna: Carbopac PA1, Temperatura de la columna: t.a., Volumen de inyección: 10 μl , Detector: PAD, Integración: Manual, Preparación de la muestra: dilución de 100 veces en agua Milli-Q (0,1 ml de muestra + 9,9 ml de agua) y filtración a través de filtros de jeringuilla de 0,45 μm, Cuantificación: áreas de los picos en porcentaje del área de pico del patrón. Se utilizó un jarabe de GOS (Vivanal GOS, Friesland Campina) como patrón para la cuantificación de GOS. Los resultados de esta evaluación semuestran en la figura 4, y se describe además en el ejemplo 2.
En el presente contexto, la expresión “cuyo polipéptido está liofilizado”, significa que el polipéptido se ha obtenido liofilizando un líquido del polipéptido a una presión apropiada y durante un período apropiado eliminando el agua.
En el presente contexto, la expresión "cuyo polipéptido está en solución" se refiere a un polipéptido que es soluble en un disolvente sin precipitar fuera de la solución. Un disolvente con esta finalidad incluye cualquier medio en el que puede encontrarse el polipéptido, tal como un tampón acuoso o solución salina, un caldo de fermentación, o el citoplasma de un anfitrión de expresión.
En el presente contexto, el término “estabilizante” significa cualquier estabilizante para estabilizar el polipéptido, p. ej., un poliol tal como, p. ej., glicerol o propilenglicol, un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico (p. ej., un éster de borato aromático). En un aspecto, el estabilizante es glicerol.
En el presente contexto, la expresión "sustrato de hidrato de carbono" significa un compuesto orgánico de fórmula general Cm(H2O)n, es decir, que consta únicamente de carbono, hidrógeno y oxígeno, los dos últimos en la relación atómica 2: 1 tal como un disacárido.
En el presente contexto, el término “disacárido” es dos unidades de monosacárido unidas entre sí por un enlace covalente conocido como un enlace glucosídico formado mediante una reacción de deshidratación, dando como resultado la pérdida de un átomo de hidrógeno de un monosacárido y un grupo hidroxilo del otro. La fórmula de los disacáridos no modificados es C12H22O11. En un aspecto, el disacárido es lactulosa, trehalosa, ramnosa, maltosa, sacarosa, lactosa, fucosa o celobiosa. En otro aspecto, el disacárido es lactosa.
El término “aislado” significa que el polipéptido está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el quela secuencia está naturalmente asociada en la naturaleza y tal como se encuentra en la naturaleza. En un aspecto, "polipéptido aislado" tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un polipéptido que es al menos un 30% puro, al menos un 40% puro, al menos un 60% puro, al menos un 80% puro, al menos un 90% y al menos un 95% puro, determinado por SDS-PAGE.
La expresión “polipéptido sustancialmente puro” significa en la presente memoria un preparado polipeptídico que contiene como máximo un 10%, preferiblemente como máximo un 8%, más preferiblemente como máximo un 6%, más preferiblemente como máximo un 5%, más preferiblemente como máximo un 4%, como máximo un 3%, aún más preferiblemente como máximo 2%, lo más preferiblemente como máximo un 1%, e incluso más preferiblemente como máximo 0,5% en peso de otro material polipéptido con el que está asociado de forma natural. Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos 92% puro, preferiblemente al menos 94% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente al menos 97% puro, más preferiblemente al menos 98% puro, incluso más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente al menos 99,5% puro, e incluso más preferiblemente 100% puro en peso del material polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos descritos en la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que el preparado de polipéptido esté esencialmente libre de otro material de polipéptido con el que esté asociado de forma natural. Esto puede conseguirse, por ejemplo, preparando el polipéptido por medio de procedimientos biotecnológicos bien conocidos o por procedimientos clásicos de purificación. En la presente memoria, la expresión “polipéptido sustancialmente puro” es sinónimo de las expresiones “polipéptido aislado” y “polipéptido en forma aislada”.
El término "purificado" o "puro" significa que un componente dado está presente en un estado de alta concentración
– p. ej., al menos aproximadamente 51% puro, tal como al menos 51% puro, o al menos aproximadamente 75% puro tal como al menos 75% en peso puro, o al menos aproximadamente 80% puro, tal como al menos 80% puro, o al menos aproximadamente 90% puro tal como al menos 90% puro, o al menos aproximadamente 95% puro tal como al menos 95% puro, o al menos al menos aproximadamente 98% de pureza tal como al menos 98% puro. Es conveniente que el componente sea el componente activo predominante presente en una composición.
El término "microorganismo" en relación con la presente invención incluye cualquier "microorganismo" que podría comprender una secuencia de nucleótidos según la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o productos obtenidos a partir de la misma. En el presente contexto, "microorganismo" puede incluir cualquier bacteria u hongo que sea capaz de fermentar un sustrato de leche.
La expresión "célula anfitriona" -en relación con la presente invención incluye cualquier célula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria o un vector de expresión como se ha descrito anteriormente y que se utiliza en la producción de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria. En un aspecto, la producción es una producción recombinada.
El término "leche", en el contexto de la presente invención, debe entenderse como la secreción láctea obtenida de cualquier mamífero, tal como vacas, ovejas, cabras, búfalos o camellos. En el presente contexto, la expresión "sustrato lácteo" significa cualquier material de leche en bruto y/o procesado o un material derivado de constituyentes de la leche. Los sustratos lácteos útiles incluyen, pero no se limitan a, soluciones/suspensiones de cualquier leche o productos lácteos que comprenden lactosa, tales como leche entera o baja en grasa, leche descremada, suero de leche, leche en polvo reconstituida, leche condensada, Leche UHT, suero de leche, suero de leche impregnado, suero ácido o crema. Preferiblemente, el sustrato lácteo es leche o una solución acuosa de leche desnatada en polvo. El sustrato lácteo puede estar más concentrado que la leche en bruto. En una realización, el sustrato lácteo tiene una proporción de proteína a lactosa de al menos 0,2, preferiblemente de al menos 0,3, al menos 0,4, al menos 0,5, al menos 0,6 o, aúnmás preferiblemente, al menos 0,7.
El sustrato lácteo puede homogeneizarse y/o pasteurizarse según métodos conocidos en latécnica.
"Homogeneización" tal como se utiliza en la presente memoria significa mezcla intensiva para obtener una suspensión o emulsión soluble. Puede realizarse para romper la grasa de la leche en tamaños más pequeños para que ya no se separa de la leche. Esto puede lograrse forzando la leche a alta presión a través de pequeños orificios.
"Pasteurización" tal como se emplea en la presente memoria significa reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tales como microorganismos, en el sustrato lácteo. Preferiblemente, la pasteurización se alcanza manteniendo
una temperatura especificada durante un período de tiempo especificado. La temperatura especificada se alcanza normalmente por calentamiento. La temperatura y la duración pueden seleccionarse para matar o inactivar ciertas bacterias, tales como bacterias perjudiciales, y/o para inactivar enzimas en la leche. Una etapa de enfriamiento rápido puede seguir. Un "producto alimenticio" o "composición alimenticia" en el contexto de la presente invención puede ser cualquier alimento o producto alimentario comestible adecuado para el consumo por un animal o un ser humano.
Un "producto lácteo" en el contexto de la presente invención puede ser cualquier producto alimenticio en el que uno de los constituyentes principales es lácteo. Preferible, el componente principal es lácteo. Más preferiblemente, el constituyente principal es un sustrato lácteo que ha sido tratado con una enzima que tiene actividad transgalactosilante.
En el presente contexto, "uno delos constituyentes principales" significa un constituyente que tiene una materia seca que constituye más del 20%, preferiblemente más del 30% o más del 40% de la materia seca total del producto lácteo, mientras que "el mayor constituyente "significa un componente que tiene una materia seca que constituye más del 50%, preferiblementemás del 60% omás del 70% de la materia seca total del productolácteo.
Por "producto lácteo fermentado" en el presente contexto debe entenderse como cualquier producto lácteo en donde cualquier tipo de fermentación forma parte del proceso de producción. Ejemplos de productos lácteos fermentados son productos como yogur, suero de leche, crema fresca, cuajada y queso fresco. Otro ejemplo de un producto lácteo fermentado es el queso. Un producto lácteo fermentado puede producirse por cualquier método conocido en la técnica.
El término “fermentación” significa la conversión de hidratos de carbono en alcoholes o ácidos a través de la acción de un microorganismo tal como un cultivo iniciador. En un aspecto, la fermentación comprende la conversión de lactosa en ácido láctico.
En el presente contexto, "microorganismo" puede incluir cualquier bacteria o hongo que sea capaz de fermentar un sustrato deleche.
En el presente contexto, la expresión "dominios Pfam" significa regiones dentro de una secuencia de proteínas que se identifican como Pfam-A o Pfam-B basadas en múltiples alineaciones de secuencias y la presencia demotivos de Markov ocultos ("The Pfam protein families database": R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:D211-222 .). Como ejemplos de dominios Pfam se pueden citar Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703), Glyco_hydro 2C (PF02836) y dominio similar a Ig bacteriano (grupo 4) (PF07532).
Como se emplea en la presente memoria, "una posición correspondiente a la posición" significa que se hace una alineación como la descrita en la presente memoria entre un polipéptido de consulta determinado y el polipéptido de referencia. La posición correspondiente a una posición específica en el polipéptido de referencia se identifica entonces como el aminoácido correspondiente en la alineación conla identidad de secuencia más alta.
Una "variante" o "variantes" se refiere a polipéptidos o ácidos nucleicos. El término "variante" puede emplearse indistintamente con el término "mutante". Las variantes incluyen inserciones, sustituciones, transversiones, truncamientos y/o inversiones en uno o más lugares en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente. Las expresiones "polipéptido variante", "variante de polipéptido", "polipéptido", "variante" y "enzima variante" significan un polipéptido/proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada o se modifica comparada a la secuencia de aminoácidos seleccionada, tal comola SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "enzimas de referencia", "secuencia de referencia", "polipéptido de referencia" significan enzimas y polipéptidos a partir de los cuales se basan cualquiera de los polipéptidos variantes,
p. ej., SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. Un "ácido nucleico de referencia" significa una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de referencia.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "secuencia de referencia" y "secuencia objeto" se emplean indistintamente.
Como se emplea en la presente memoria, "secuencia de consulta" significa una secuencia extraña, que está alineada con una secuencia de referencia para ver si cae dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, dicha secuencia de consulta puede ser, por ejemplo, una secuencia de la técnica anterior o una secuencia de del tercer grupo.
Como se emplea en este documento, el término "secuencia" puede referirse a una secuencia polipeptídica o una secuencia de ácido nucleico, dependiendo del contexto.
Como se emplean en la presente memoria, las expresiones "secuencia polipeptídica" y "secuencia de aminoácidos" se emplean indistintamente.
La secuencia señal de una "variante" puede ser la misma o puede diferir de la secuencia señal del péptido señal de Bacillus natural o cualquier secuencia señal que segregue el polipéptido. Una variante puede expresarse como una proteína de fusión que contiene un polipéptido heterólogo. Por ejemplo, la variante puede comprender un péptido señal de otra proteína o una secuencia diseñada para ayudar a la identificación o purificación de la proteína de fusión expresada, tal como una secuencia His-Tag.
Para describir las diversas variantes que se contemplan para ser abarcadas por la presente descripción, se adoptará la siguiente nomenclatura para facilitar la referencia. Cuando la sustitución incluye un número y una letra, por ejemplo, 592P, entonces se refiere a {posición según el sistema de numeración/aminoácido sustituido}. Por consiguiente, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido por prolina en la posición 592 se designa como 592P. Cuando la sustitución incluye una letra, un número y una letra, por ejemplo, D592P, entonces esto se refiere a {aminoácido/posición original según el sistema de numeración/aminoácido sustituido}.
Por consiguiente, por ejemplo, la sustitución de alanina por prolina en la posición 592 se designa como A592P.
Cuando son posibles dos o más sustituciones en una posición determinada, esto se designará mediante letras contiguas, que pueden separarse opcionalmente por barras oblicuas "/", p. ej., G303ED o G303E/D.
Las posiciones y sustituciones se enumeran con referencia, por ejemplo, a la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. Por ejemplo, se pueden encontrar posiciones equivalentes en otra secuencia alineando esta secuencia con la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 para encontrar una alineación con el mayor porcentaje de identidad y después determinar qué aminoácido se alinea para corresponder con un aminoácido de una posición específica de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. Dicha alineación y el uso de una secuencia como primera referencia es simplemente una cuestión de rutina para un experto en lamateria.
Como se emplea en la presente memoria, el término "expresión" se refiere al procedimiento mediante el cual se produce un polipéptido basado en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción comola traducción.
Tal como se emplea en la presente memoria, "polipéptido" se emplea indistintamente con la terminología "secuencia de aminoácidos", "enzima", "péptido" y/o "proteína". Tal como se emplea en la presente memoria, "secuencia nucleotídica" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una secuencia oligonucleotídica o secuencia polinucleotídica y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de las mismas. La secuencia nucleotídica puede ser de origen genómico, sintético o biotecnológico y puede ser bicatenaria o monocatenaria, ya sea que represente la cadena transcrita o complementaria. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia nucleotídica" incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético yARN.
"Homólogo" significa una entidad que tiene un determinado grado de identidad o "homología" con las secuencias de aminoácidos en cuestión y las secuencias de nucleótidos en cuestión. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos en cuestión es la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, y la secuencia de nucleótidos en cuestión preferiblemente es la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13.
Una "secuencia homóloga" incluye un polinucleótido o un polipéptido que tiene un cierto porcentaje, p. ej., 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, de identidad de secuencia con otra secuencia. El porcentaje de identidad significa que, cuando está alineado, ese porcentaje de bases o restos de aminoácidos son los mismos cuando se comparan las dos secuencias. Las secuencias de aminoácidos no son idénticas, donde un aminoácido es sustituido, suprimido o añadido en comparación con la secuencia objeto. El porcentaje de identidad de secuencia se mide generalmente con respecto a la secuencia madura de la proteína objeto, es decir, después de la eliminación de una secuencia señal, por ejemplo. Generalmente, los homólogos comprenderán los mismos restos del sitio activo que la secuencia de aminoácidos en cuestión. Los homólogos también conservan actividad enzimática, aunque el homólogo puede tener diferentes propiedades enzimáticas que el natural.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "hibridación" incluye el proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une a una cadena complementaria por emparejamiento de bases, ası como el proceso de amplificación llevado a cabo en tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ácido nucleico variante puede existir como ADN o ARN monocatenario o bicatenario, un heterodoble cadena de ARN/ADN o un copolímero de ARN/ADN. Como se emplea en la presente memoria, "copolímero" se refiere a una única cadena de ácido nucleico que comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. El ácido nucleico variante puede optimizarse con codones para aumentar más la expresión.
Como se emplea en este documento, un compuesto "sintético" se produce por síntesis química o enzimática in vitro. Ello incluye, pero no se limita a, ácidos nucleicos variantes preparados con un uso óptimo de codones para organismos anfitriones, tal como un anfitrión de células de levadura u otros anfitriones de expresión de elección.
Como se emplea en la presente memoria, "célula transformada" incluye células, incluidas tanto las células bacterianas como fúngicas, que han sido transformadas mediante el empleo de técnicas de ADN recombinado. La transformación se produce generalmente por inserción de una o más secuencias de nucleótidos en una célula. La secuencia nucleotídica insertada puede ser una secuencia nucleotídica heteróloga, es decir, es una secuencia que no es natural para la célula que se va a transformar, tal como una proteína de fusión.
Tal como se emplea en la presente memoria, "unido operativamente" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Por ejemplo, una secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias dereferencia.
Como se emplea en la presente memoria, el término "fragmento" se define en la presente memoria como un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos suprimidos del extremo amino y/o carboxilo en donde el fragmento tiene actividad.
En un aspecto, el término "fragmento" se define en la presente memoria como un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos suprimidos del extremo amino y/o carboxilo del polipéptido de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5; en donde el fragmento tiene actividad transgalactosilante.
La expresión "similar al dominio de unión a la galactosa" tal como se emplea en la presente memoria está abreviado y es intercambiable con el término "GBD".
Grado de identidad
El nexo entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad".
En una realización, el grado de identidad de secuencia entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia se determina: 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación por defecto y la penalización de discontinuidad predeterminada, 2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es donde el programa de alineación ha identificado un aminoácido o nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en la alineación y 3) dividiendo el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia de referencia.
En una realización, el grado de identidad de secuencia entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia se determina: 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación por defecto y la penalización de discontinuidad predeterminada, 2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es donde el programa de alineación ha identificado un aminoácido o nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en la alineación y 3) dividiendo el número de coincidencias exactas por la longitud de la máslarga delas dos secuencias.
En otra realización, el grado de identidad de secuencia entre la secuencia de consulta y la secuencia de referencia se determina 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación por defecto y la penalización de discontinuidad predeterminada, 2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es donde el programa de alineación ha identificado un aminoácido o nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en la alineación y 3) dividiendo el número de coincidencias exactas por la "longitud de alineación", donde la longitud de alineación es la longitud detoda la alineaciónincluyendo discontinuidades y partes sobresalientes delas secuencias.
Las comparaciones de identidad de secuencia pueden realizarse a simple vista, o más habitualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles en el mercado utilizan complejos algoritmos de comparación para alinear dos o más secuencias que reflejan mejor los casos evolutivos que podrían haber conducido a la(s) diferencia(s) entre las dos o más secuencias. Por lo tanto, estos algoritmos operan con un sistema de puntuación que recompensa la alineación de aminoácidos idénticos o similares y penalizan la inserción de espacios, ampliaciones de espacios y alineación de aminoácidos no similares. El sistema de puntuación de los algoritmos de comparación incluye:
i) asignación de puntuación de penalización cada vez que se inserta un espacio (puntuación de penalización de la ampliación),
ii) asignación de puntuación de penalización cada vez que se extiende un espacio existente con una posición adicional (puntuación de penalización dela ampliación),
iii) asignación de puntuaciones altas al alinear aminoácidos idénticos, y
iv) asignación de puntuaciones variables al alinear aminoácidos diferentes.
La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por espacio. Sin embargo, es preferible utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho programa informático para comparaciones de secuencias.
Las puntuaciones dadas para la alineación de aminoácidos no idénticos se asignan según una matriz de puntuación también denominada matriz de sustitución. Las puntuaciones proporcionadas en dichas matrices de sustitución están reflejando el hecho de que la probabilidad de que un aminoácido que es sustituido por otro durante la evolución varía y depende de la naturaleza física/química del aminoácido que va a ser sustituido. Por ejemplo, la probabilidad de que un aminoácido polar sea sustituido por otro aminoácido polar es mayor en comparación con que sea sustituido por un aminoácido hidrófobo. Por lo tanto, la matriz de puntuación asignará la puntuación más alta para aminoácidos idénticos, una puntuación menor para aminoácidos no idénticos pero similares e incluso una puntuación más baja para aminoácidos diferentes no similares. Las matrices de puntuación más frecuentemente utilizadas son las matrices PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), las matrices BLOSUM (Henikoff y Henikoff (1992) yla matrizGonnet (Gonnet et al. (1992)).
Los programas informáticos adecuados para llevar a cabo tal alineación incluyen, pero no se limitan a, Vector NTI (Invitrogen Corp.) y los programas ClustalV, ClustalW y ClustalW2 (Higgins DG y Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992) Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Una selección de diferentes herramientas de alineación está disponible en el servidor ExPASy Proteomics en www.expasy.org. Otro ejemplo de programa informático que puede realizar la alineación de secuencias es BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que está disponible en la página web del National Center for Biotechnology Information, que actualmente se puede encontrar en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y que se describió en primer lugar en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410.
En una realización preferida de la presente invención, el programa de alineación está realizando un programa de alineación global, que optimiza la alineación sobre toda la longitud de las secuencias. En una realización preferida adicional, el programa de alineación global se basa en el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, Saul B. y Wunsch, Christian D. (1970), "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins", Journal of Molecular Biology 48 (3):443-53 ). Ejemplos de programas actuales que realizan alineaciones globales utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch son los programas EMBOSS Needle y EMBOSS Stretcher, que están disponibles en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/.
EMBOSS Needle realiza una alineación óptima de secuencia global utilizando el algoritmo de alineación Needleman-Wunsch para encontrar la alineación óptima (incluyendo los espacios) de dos secuencias a lo largo de toda su longitud.
EMBOSS Stretcher utiliza una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch que permite que las secuencias más grandes estén alineadas globalmente.
En una realización, las secuencias están alineadas mediante un programa de alineación global y la identidad de secuencia se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineación", donde la longitud de alineación es la longitud de toda la alineación incluyendo espacios y partes sobresalientes delas secuencias.
En una realización adicional, el programa de alineación global utiliza el algoritmo Needleman-Wunsch y la identidad de secuencias se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineación", donde la longitud de alineación es la longitud de toda la alineación incluidos espacios y partes sobresalientes delas secuencias.
En otra realización más, el programa de alineación global se selecciona del grupo que consiste en EMBOSS Needle y EMBOSS Stretcher y la identidad de secuencia se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineación", donde la longitud de alineación es la longitud de toda la alineación incluidos los espacios y partes sobresalientes de las secuencias.
Una vez que el programa informático ha producido una alineación, es posible calcular el % de similitud y el % de identidad de secuencia. El programa informático normalmente lo hace como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
En una realización, es preferible usar el programa informático ClustalW para realizar alineaciones de secuencias. Preferiblemente, la alineación con ClustalW se lleva a cabo con los siguientes parámetros para la alineación por pares:
Matriz de sustitución:
Gonnet 250
Penalización abierta por espacio:
20
Penalización por ampliación con espacio:
0,2
Penalización por espacio final:
Ninguna
ClustalW2 se ha puesto a disposición, por ejemplo, en Internet por el Instituto Europeo de Bioinformática en la página web del EMBL-EBI www.ebi.ac.uk con herramientas -análisis de secuencias -ClustalW2. Actualmente, la dirección exacta de la herramienta ClustalW2 es www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.
En otra realización, se prefiere usar el programa Align X en el Vector NTI (Invitrogen) para realizar alineaciones de secuencias. En una realización, Exp10 se ha podido utilizar con los ajustes predeterminados: Penalización por apertura de espacio: 10 Penalización por ampliación de espacio: 0,05
Intervalo de penalización por separación de espacio: 8 En otra realización, la alineación de una secuencia de aminoácidos con, o a, otra secuencia de aminoácidos se determina mediante el uso de la matriz de puntuación: blosum62mt2 y las configuraciones de alineación por pares
VectorNTI Pair
Configuraciones
K-tuple 1
Número de mejores diagonales
5
Tamaño de ventana
5
Penalización por espacio
3
Penalización de abertura de espacio
10
Penalización por ampliación de espacio
0,1
En una realización, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos con, o a, otra secuencia de aminoácidos se determina mediante el uso de Blast con un tamaño de palabra de 3 y con BLOSUM 62 como matriz de sustitución.
Polipéptidos
En la presente invención se describe un polipéptido que tiene una relación de actividad transgalactosilante:actividad de β-galactosidasa de al menos 0,5, al menos 1, al menos 2, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 a una concentración de 3% p/p de concentración inicial delactosa.
En la presente memoria se describe un polipéptido, en donde el núcleo catalítico de la glucósido hidrolasa tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº: 7.
En la presente memoria se describe un polipéptido que contiene dominios Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703) y/oGlyco_hydro 2C (PF02836).
En la presente memoria se describe un polipéptido que contiene el dominio Ig-oide bacteriano (grupo 4) (PF07532).
En un aspecto, en la presente memoria se describe un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante seleccionada del grupo que consiste en:
a.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consiste en un máximo de 980 restos de aminoácidos y
b.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en el que dicho polipéptido consta comomáximo de 975 restos de aminoácidos.
En la presente memoria se da a conocer:
c.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96,5% de identidad de secuencia conla SEQ ID nº: 3, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 1.300 restos de aminoácidos,
d.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de baja restricción con i) la secuencia de ácido nucleico comprendida en la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifica el polipéptido de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5; o ii) la cadena complementaria de i),
e.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% deidentidad con la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o la secuencia de nucleótidos comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifican un polipéptido maduro, y
f.
un polipéptido que comprende una supresión, inserción y/o sustitución conservativa de uno o más restos de aminoácidos delas SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En la presente memoria se da a conocer un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante seleccionado del grupo que consiste en:
a.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96,5% de identidad de secuencia conla SEQ ID nº: 3, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 1.300 restos de aminoácidos,
b.
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 980 restos de aminoácidos,
c.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de baja restricción con i) la secuencia de ácido nucleico comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifica el polipéptido de las SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4, o 5; o ii) la cadena complementaria dei),
d.
un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o la secuencia de nucleótidos comprendida en la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifican un polipéptidomaduro, y
e.
un polipéptido que comprende una supresión, inserción y/o sustitución conservativa de uno o más restos de aminoácidos dela SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En un aspecto, en la presente memoria se describe un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos 98%, o 99%, deidentidad de secuencia conla secuencia de aminoácidos madura de SEQ ID nº: 1 o 2.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90% con la secuencia de aminoácidosmadura de la SEQ ID nº: 1.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 90% con la secuencia de aminoácidosmadura de la SEQ ID nº: 2.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene un 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidosmadura de la SEQ ID nº: 3.
En la presentememoria se describe un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 96,5% con la secuencia de aminoácidosmadura de la SEQ ID nº: 4.
En la presente memoria se describe un polipéptido que tiene un 96,5% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidosmadura de la SEQ ID nº: 5.
En la presente memoria se describe un polipéptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En una realización, se describe en la presentememoria un polipéptido, que procede de Bifidobacterium bifidum.
En una realización, se describe en la presentememoria un polipéptido quetiene un pH óptimo de 6,5-7,5.
En una realización, se describe en la presente invención un polipéptido quetiene un óptimo detemperatura de 30-60 tal como 42-60 grados Celcius.
Los polipéptidos que tienen actividad sobre los hidratos de carbono se pueden clasificar usando el sistema de clasificación IUBMB basado en su especificidad de sustrato o en la asignación de CaZy en una de las 125 familias de glucósido hidrolasa actuales. En la base de datos CaZy la asignación se basa tanto en información secuencial como estructural combinada con el conocimiento de la estereoquímica de los sustratos y productos.
En la presente memoria se describen polipéptidos que cuando se trata de un producto de expresión en un Bacillus subtilis cepa BG3594 de una secuencia de ácido nucleico, que codifica dicho polipéptido, es el único producto de expresión de polipéptido de dicha secuencia de ácido nucleico que presenta actividad transgalactosilante. Esto puede evaluarse utilizando las siguientes técnicas conocidas por un experto en la técnica. Las muestras a evaluar se someten a SDS-PAGE y se visualizan usando un colorante apropiado para la cuantificación de proteínas, tal como por ejemplo el sistema Criterion de Bio-Rad. El gel se escanea a continuación utilizando un escáner densitométrico apropiado tal como por ejemplo el sistema Criterion de Bio-Rad y se asegura que la imagen resultante esté en el intervalo dinámico. Las bandas correspondientes a cualquier variante/fragmento procedente de la SEQ ID nº: 8 se
cuantifican y el porcentaje de los polipéptidos se calcula como: Porcentaje de polipéptido en cuestión/(suma de todoslos polipéptidos que presentan actividad transgalactosilante)*100.
El número total de variantes/fragmentos de polipéptidos procedentes de la SEQ ID nº: 8 en la composición puede determinarse detectando el fragmento procedente de la SEQ ID nº: 8 por transferencia Western usando un anticuerpo policlonal por métodos conocidos por un experto en la técnica.
El polipéptido descrito en la presente invención comprende al menos dos dominios funcionales separados contenidos dentro de la enzima. En primer lugar, el polipéptido debe contener un núcleo catalítico de glucósido hidrolasa como se describe a continuación. El núcleo catalítico debe pertenecer al clan GH-A de familias de glucósido hidrolasa relacionadas. El clan GH-A se caracteriza por la escisión de enlaces glucosídicos mediante un mecanismo de retención y posee un dominio catalítico que se basa en un pliegue de barril TIM (Wierenga, 2001, FEBS Letters, 492 (3), págs. 193-8 ). El dominio catalítico contiene dos restos de ácido glutámico que actúan como donante de protones y nucleófilo, que eliminan de las cadenas 4 y 7 del dominio de barril (Jenkins, 1995, FEBS Letters, 362 (3), págs. 281-5). La estructura general del barril TIM es un (β/α) 8 veces que consta de 8 cadenas beta y 8 cadenas alfa. En un aspecto, el núcleo catalítico de glucósido hidrolasa descrito en la presente memoria pertenece a cualquiera de las familias GH-2 y -35 de glucósido hidrolasa que son todas las enzimas TIM-barril pertenecientes al clan GH-A. En otro aspecto, el núcleo catalítico de glucósido hidrolasa pertenece a la familia GH-2
o GH-35. En otro aspecto, el núcleo catalítico de glucósido hidrolasa pertenece a la familia GH-2. Un denominador común es que estas enzimas se denominan enzimas de retención, de modo que la estereoquímica del sustrato se conserva en el producto ( Henrissat, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol., 7(5), 637-44 ).
Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden tener actividad sobre enlaces de hidratos de carbono que tienen la configuración β(1→4). Esto efectivamente colocó las enzimas en la clase EC 3.2.1.23 de la IUBMB de βgalactosidasas. Esta actividad puede ser, pero no se limita a, determinada utilizando substratos sintéticos tales como para-nitrofenol-β-D-galactopiranósido (PNPG), orto-nitrofenol-β-D-galactopiranósido (ONPG) o β-Dgalactopiranósido con agluconas cromógenas (XGal). Como una forma alternativa de determinar si una enzima pertenece a la clase EC 3.2.1.23 de β-galactosidasas es incubar con un sustrato tal como la lactosa y medir la liberación de glucosa por un método tal como determinación enzimática, HPLC, TLC u otros métodos conocido por los expertos en la técnica.
Con objeto de predecir entidades funcionales de polipéptidos se pueden aplicar varios fondos públicos disponibles tales como, por ejemplo, Pfam ( Nucl. Acids Res. (2010) 38 (supl. 1): D211-D222. doi: 10.1093/nar/gkp985 ) e Interpro (Nucl. Acids Res. (2009) 37 (supl. 1): D211-D215, doi: 10.1093/nar/gkn785 ). Debe especificarse que al realizar dicho análisis, el análisis debería realizarse en la toda la secuencia del polipéptido disponible a partir de las bases de datos del fondo público.
Se proporciona un polipéptido que contiene uno o más dominios Pfam seleccionados de: Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703), Glyco_hydro 2C (PF02836) y dominio similar a Ig bacteriano (grupo 4) (PF07532). Se proporciona además un polipéptido que contiene los dominios Pfam Glyco_hidro2N (PF02837), Glyco_hidro (PF00703), Glyco_hidro 2C (PF02836) y dominio similar a IgBacteriano (grupo 4) (PF07532).
También se proporciona un polipéptido que contiene los dominios Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703) y Glyco_hydro 2C (PF02836) que constituye el dominio catalítico del polipéptido.
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Se proporciona un polipéptido como el descrito en la presente memoria y que tiene una relación de actividad transgalactosilante:actividad de β-galactosidasa de al menos 1, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12 medida a una concentración de 100 ppm en un ensayo basado en leche a 37ºC y 5% p/p de lactosa después de 15, 30 o 180, tal como 180 minutos dereacción. En una realización adicional, el polipéptido procede de Bifidobacterium bifidum.
En una realización, el polipéptido o los polipéptidos descritos en la presente memoria tienen una actividad transgalactosilante tal que más del 20%, más del 30%, más del 40%, hasta el 50% de la lactosa inicial está transgalactosilada, medida a una concentración de 100 ppm en un ensayo basado en leche a 37°C y 5% p/p de lactosa después de 15, 30 o 180, tal como 180minutos de reacción.
En una realización adicional, el o los polipéptidos descritos en la presente memoria tienen una actividad βgalactosidasa tal quemenos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30% menos de 20% de la lactosa se ha hidrolizado medida a una concentración de 100 ppm en un ensayo basado en leche a 37ºC y 5% p/p de lactosa después de 15, 30 o 180ºC, tal como 180 minutos de reacción.
En una realización, la actividad β-galactosidasa y/o la actividad transgalactosilante se miden a una concentración de 100 ppm correspondiente a 2.13 LAU como se especifica en el método 4.
En una realización adicional, el o los polipéptidos descritos en la presente memoria tienen una o más de las siguientes características:
a) una relación de actividad transgalactosilante:actividad β-galactosidasa de al menos 1, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, o al menos 12, medida a una concentración de 100 ppm en un ensayo basado en leche a 37ºC y 5% p/p de lactosa después de 15, 30 o 180ºC, tal como 180 minutos de reacción, y/o
b) tiene una actividad transgalactosilante tal que más del 20%, más del 30%, más del 40% y hasta el 50% de la lactosa inicial se ha transgalactosilado, medida a una concentración de 100 ppm en un ensayo basado en leche a 37ºC°C y 5% p/p de lactosa después de 15, 30 o 180ºC, tal como 180minutos de reacción.
Se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96,5% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 3, en el que dicho polipéptido consiste en un máximo de 1.300 restos de aminoácidos. En otro aspecto, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, tal como en donde dicha identidad de secuencia es al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia, y en donde dicho polipéptido consta como máximo de 980 restos de aminoácidos. En otro aspecto, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consiste en como máximo 980 restos de aminoácidos. En otro aspecto aún, se proporciona un polipéptido en el que dicho polipéptido tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, tal como en el que dicho polipéptido tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1. En otro aspecto, un polipéptido que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, tal como en donde dicho polipéptido tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2. En un aspecto, se proporcionan los polipéptidos descritos en el presente memoria que constan como máximo de 975 restos de aminoácidos, tales como, p. ej., como máximo 970 restos de aminoácidos, tales como 950 restos de aminoácidos como máximo, tales como 940 restos de aminoácidos como máximo, 930 restos de aminoácidos como máximo, 920 restos de aminoácidos como máximo, 910 restos de aminoácidos como máximo, 900 restos de aminoácidos como máximo, 895 restos de aminoácidos como máximo o 890 restos de aminoácidos como máximo. En un aspecto, se proporciona un polipéptido concreto constituido por 887 o 965 restos de aminoácidos. En un aspecto, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ. ID. nº: 2 tal como en donde dicha identidad de secuencia es al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia, en donde dicho polipéptido consta de 975 restos de aminoácidos como máximo, tal como, p. ej., como máximo 970 o al menos 965 restos de aminoácidos. En un aspecto, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en donde dicho polipéptido consta en un máximo de 975 restos de aminoácido.
En otro aspecto preferido, se proporciona un polipéptido que comprende la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. Todavía en un aspecto preferido, se proporciona un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, especialmente un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos dela SEQ ID nº: 1 o 2 .
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96,5% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 3, tal como en donde dicha identidad de secuencia es al menos 97%, tal como, p. ej., al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad de secuencia, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 1300 restos de aminoácidos.
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido en donde dicho polipéptido tiene al menos un 98,5%, tal como al menos 99% o al menos 99,5% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 5. En un aspecto, dicho polipéptido consiste en como máximo 1.290 restos de aminoácidos, tales como, p. ej., como máximo 1.280, como máximo 1.270, como máximo 1.260, como máximo 1.250, como máximo 1.240, como máximo 1.230, como máximo 1.220 o como máximo 1.215 restos de aminoácidos. En un aspecto preferido, se proporciona un polipéptido que consiste en
1.211 restos de aminoácidos.
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido en el que dicho polipéptido tiene al menos un 96%, tal como al menos 97%, tal como, p. ej., al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 4. En un aspecto, se proporciona un polipéptido que consiste en un máximo de 1.210 restos de aminoácidos, tal como, p. ej., como máximo 1.200, como máximo 1.190, como máximo 1.180, como máximo 1.170, como máximo 1.160, como máximo 1.150 o comomáximo 1.145 restos de aminoácidos, tal como 1.142 restos de aminoácidos.
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido en donde dicho polipéptido tiene al menos un 96,5%, tal como al menos 97%, tal como, p. ej., al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 3. En un aspecto, un polipéptido que consta como máximo 1.130 restos de aminoácidos, tales como, por ejemplo, como máximo 1.120, como máximo 1.110, como máximo 1.100, como máximo 1.090, como máximo 1.080, como máximo 1.070, comomáximo 1.060, comomáximo 1.050, como máximo 1.055 o como máximo 1.040 restos de aminoácidos. En un aspecto preferido, se proporciona un polipéptido que consiste en 1.038 restos de aminoácidos.
En otro aspecto, los polipéptidos descritos en la presente memoria tienen una relación de actividad de transgalactosilación superior al 100%, tal como superior al 150%, 175% o 200%.
Las proteínas generalmente están compuestas de una o más regiones funcionales, comúnmente denominadas dominios. La presencia de diferentes dominios en diversas combinaciones en diferentes proteínas da lugar al diverso repertorio de proteínas encontradas en la naturaleza. Una forma de describir los dominios es mediante la ayuda de la base de datos Pfam que es una gran colección de familias de dominio de proteínas como se describe en "The Pfam protein families database": R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database número 38: D211-222. Cada familia está representada por múltiples alineaciones de secuencia y modelos de Markov ocultos (HMM). En otro aspecto, los presentes inventores han descubierto que el/los polipéptido(s) proporcionado(s) contiene uno o más de los dominios Pfam Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703), Glyco_hydro 2C (PF02836) ) y (PF07532). En un aspecto, el polipéptido o polipéptidos proporcionados en la presente invención contienen Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703), Glyco_hydro 2C (PF02836) y dominio Ig-oide bacteriano (grupo 4) (PF07532).
En un aspecto, los polipéptidos tienen actividad transgalactosilante útil en un intervalo de pH de 4-9, tal como 5-8, tal como 5,5-7,5, tal como 6,5-7,5.
La presente invención abarca polipéptidos que tienen un cierto grado de identidad de secuencia o homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos definida en la presente memoria o con un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presentememoria. La presente invención abarca, en particular, péptidos que tienen un grado de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, que se definen a continuación, o uno de sus homólogos.
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos homóloga y/o la secuencia de nucleótidos debe proporcionar y/o codificar un polipéptido que conserva la actividad transgalactosilante funcional y/o potencia la actividad de transgalactosilación en comparación con un polipéptido delaSEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 66%, 70%, 75%, 78%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, idéntica a la secuencia en cuestión. Generalmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos en cuestión. Aunque la homología también se puede considerar desde el punto de vista de similitud (es decir, restos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar homología desde el punto de vista de identidad de secuencias.
Por lo tanto, la presente invención también abarca variantes, homólogos y derivados de cualquier secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido definidos en la presente memoria, en particular los de las SEC ID nº 1, 2, 3, 4 o 5 definidas a continuación.
Las secuencias, particularmente las de variantes, homólogos y derivados de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 que se definen a continuación, también pueden tener supresiones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio imperceptible y producen una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden hacerse basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, naturaleza hidrófoba, hidrófila y/o anfipática de los restos, siempre que se mantenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
La presente invención también abarca una sustitución conservadora (sustitución y reemplazo se emplean en la presente memoria en el sentido de intercambio de un resto de aminoácido existente, por un resto alternativo) que puede ocurrir es decir sustitución de similar por similar como básico por básico, ácido por ácido , polar por polar, etc. También puede ocurrir sustitución no conservadora, es decir, de una clase de resto por otro o, alternativamente, que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (denominada en adelante Z), ácido diaminobutírico ornitina (denominada en adelante B), norleucina ornitina (denominada en adelante O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Las sustituciones conservadoras que pueden realizarse son, por ejemplo, dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos alifáticos (alanina, valina, leucina, isoleucina), aminoácidos polares (glutamina, asparagina, serina, treonina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), hidroxilaminoácidos (serina, treonina), aminoácidos grandes (fenilalanina y triptófano) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina).
En un aspecto, la secuencia polipeptídica utilizada en la presente invención está en forma purificada. En un aspecto, el polipéptido o proteína para uso en la presente invención está en forma aislada.
En un aspecto, el polipéptido dela presente invención se produce de forma biotecnológica.
Los polipéptidos variantes incluyen un polipéptido que tiene un determinado porcentaje, p. ej., al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1 o 2.
Los polipéptidos variantes incluyen un polipéptido que tiene un determinado porcentaje, p. ej., al menos 96%, 97%, 98%, o 99%, deidentidad de secuencia conla SEQ ID nº: 3, 4 o 5.
En un aspecto, los polipéptidos descritos en la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro codificado por la secuencia de nucleótidos que codifica la transgalatosilasa contenida en Bifidobacterium bifidum DSM20215 mostrada en la presente memoria como SEQ ID nº: 22. Todas las consideraciones y limitaciones relativas a las identidades de secuencia y funcionalidad expuestas desde el punto de vista de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 se aplican haciendo los cambios necesarios a las identidades de secuencia y funcionalidad de estos polipéptidos y nucleótidos.
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos en cuestión es la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, y la secuencia de nucleótidos en cuestión preferiblemente es la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13.
En un aspecto, el polipéptido es un fragmento que tiene uno o más (varios) aminoácidos suprimidos del extremo amino y/o carboxilo del polipéptido de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5; en donde el fragmento tiene actividad transgalactosilante.
En un aspecto, un fragmento contiene al menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1.000 restos de aminoácidos.
En otro aspecto, la longitud de la variante de polipéptido es de 500 a 1.300 restos de aminoácidos. En otro aspecto, la longitud dela variante de polipéptido es de 600 a 1.300 aminoácidos. En otro aspecto, la longitud de la variante de polipéptido es de 700 a 1.300 aminoácidos. En otro aspecto, la longitud de la variante de polipéptido es de 800 a
1.300 aminoácidos. En otro aspecto, la longitud de la variante de polipéptido es de 800 a 1.300 aminoácidos.
Variantes de polipéptidos de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5
En un aspecto, se proporciona una variante de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 que tiene una sustitución en una o más posiciones que efectúa una propiedad alterada tal como transgalactosilación mejorada, con respecto a la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. Dichas variantes de polipéptidos se denominan también en este documento por conveniencia "polipéptido variante", "variante de polipéptido" o "variante". En un aspecto, los polipéptidos defidos en la presente memoria tienen una actividad transgalactosilante mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. En otro aspecto, los polipéptidos definidos en la presentememoria tienen una velocidad de reacción mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o5.
En un aspecto, los polipéptidos y variantes definidos en la presente memoria presentan actividad enzimática. En un aspecto, los polipéptidos y los polipéptidos variantes descritos en la presente memoria comprenden actividad de transgalactosilación.
En un aspecto, la proporción de actividad transgalactosilante:actividad β-galactosidasa es al menos 0,5, tal como al menos 1, tal como al menos 1,5, o tal como al menos 2 después de 30 minutos de reacción tal como superior a una concentración inicial delactosa del 3% p/p.
En un aspecto, la relación actividad transgalactosilante:actividad β-galactosidasa es al menos 2,5, tal como al menos 3, tal como al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7, tal como como al menos 8, tal como al menos 9, tal como al menos 10, tal como al menos 11 o tal como al menos 12 después de 30 min. de reacción tal como superior a una concentración inicial de lactosa del 3% p/p.
En un aspecto, los polipéptidos y las variantes como se definen en la presente memoria pueden proceder de fuentes microbianas, en particular de un hongo filamentoso o levadura, o de una bacteria. La enzima puede proceder, p. ej., de una cepa de Agaricus, p. ej. A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, p. ej. A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, p. ej. D. discoideum; Kluveromyces, p. ej. K. fragilis, K. lactis; Mucor, p. ej. M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, p. ej. N. crassa; Rhizomucor, p. ej. R. pusillus; Rhizopus, p. ej. R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, p. ej. S . libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, p. ej. T. rubrum; Whetzelinia, p. ej. , W. sclerotiorum; Bacillus p. ej. B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus B. thuringiensis; Bifidobacterium,
p. ej. B. Iongum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacterium; Citrobacter, p. ej. C . freundii; Clostridium, p. ej. C . perfringens; Diplodia, p. ej. D. gossypina; Enterobacter, p. ej. E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, p. ej. E. herbicola; Escherichia, p. ej. E. coli; Klebsiella, p. ej. K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, p. ej. N. crassa; Proteus, p. ej. P. vulgaris; Providencia, p. ej. P. stuartii; Pycnoporus, p. ej. Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, p. ej. R. torques; Salmonella, p. ej. S. typhimurium; Serratia, p. ej. S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, p. ej. S . flexneri; Streptomyces, p. ej. S .antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, p. ej. T. reesei, T. viride; Yersinia, p. ej. Y. Enterocolitica.
Se proporciona un polipéptido aislado y/o purificado que comprende un polipéptido o un polipéptido variante como se define en la presentememoria. En una realización, el polipéptido variante es una forma madura del polipéptido (SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5). En un aspecto, las variantes incluyen un dominio en el terminal C.
En un aspecto, un polipéptido variante como se define en la presente memoria incluye variantes en las que se han añadido o eliminado entre uno y aproximadamente 25 restos de aminoácidos con respecto a la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4
o 5. En un aspecto, un polipéptido variante definido en la presente memoria incluye variantes en las que entre uno y 25 restos de aminoácidos se han sustituido, añadido o eliminado con respecto a la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. En un aspecto, la variante tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, en donde se ha sustituido cualquier número entre uno y aproximadamente 25 aminoácidos. En otro aspecto, la variante tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, en dondeseha sustituido cualquier número entretres y doceaminoácidos. En otro aspecto, la variante tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, en donde se ha sustituido cualquier número entre cinco y nueve aminoácidos.
En un aspecto, se han sustituido al menos dos, en otro aspecto, al menos tres, y aún en otro aspecto, al menos cinco aminoácidos dela SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
En un aspecto, el o los polipéptido(s) descrito(s) tiene(n) la secuencia 1, 2, 3, 4 o 5.
En un aspecto, el o los polipéptido(s) descrito(s) en la presente invención tiene la secuencia SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, en donde se sustituyen y/o se suprimen el aminoácido 10, tal como el 9, tal como el 8, tal como el 7, tal como el 6, tal el 5, tal como el 4, tal el 3, tal como el 2, tal como el 1 en el extremo terminal N.
Las enzimas y sus variantes enzimáticas pueden caracterizarse por sus secuencias de ácido nucleico y polipéptido primario, por modelado estructural tridimensional, y/o por su actividad específica. Las características adicionales de las variantes de polipéptido o polipéptido definidas en la presente memoria incluyen, por ejemplo, estabilidad, intervalo de pH, estabilidad a la oxidación y estabilidad térmica. Los niveles de expresión y la actividad enzimática se pueden evaluar empleando ensayos normalizados conocidos por el especialista en este campo. En otro aspecto, las variantes demuestran características de comportamiento mejoradas con respecto al polipéptido con la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5, tal como una mejor estabilidad a altas temperaturas, p. ej., 65-85ºC.
Se proporciona una variante de polipéptido como se define en la presente memoria con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5.
Nucleótidos
En un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad transgalactosilante como se ha indicado anteriormente que están codificados por polinucleótidos que se hibridan en condiciones de muy baja severidad, preferiblemente condiciones de baja severidad, más preferiblemente condiciones de media severidad, más preferiblemente condiciones demedia-alta severidad incluso más preferiblemente condiciones de alta severidad y aún más preferiblemente condiciones de muy alta severidad con i) la secuencia de ácido nucleico comprendida en las SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 que codifican el polipéptido maduro de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5; ii) la secuencia de cDNA de i) o iii) la cadena complementaria de i) o ii), (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). Una subsecuencia de la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 contiene al menos 100 nucleótidos contiguos o preferiblemente al menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento polipeptídico que tiene actividad delactasa.
La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 o una subsecuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o un fragmento de la misma, pueden utilizarse para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifica polipéptidos que tienen actividad transgalactosilasa a partir de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, dichas sondas pueden utilizarse para la hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo procedimientos normalizados de transferencia Southern, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Dichas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben ser al menos de 14, preferiblemente al menos de 25, más preferiblemente al menos de 35 y lo más preferiblemente al menos de 70 nucleótidos de longitud. Es, sin embargo, se prefiere que la sonda de ácido nucleico tenga una longitud de al menos 100 nucleótidos. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser al menos de 200 nucleótidos, preferiblemente al menos de 300 nucleótidos, más preferiblemente al menos de 400 nucleótidos o aún más preferiblemente al menos de 500 nucleótidos de longitud. Pueden usarse sondas aún más largas, p. ej., sondas de ácido nucleico que son al menos de 600 nucleótidos, al menos preferiblemente al menos de 700 nucleótidos, más preferiblemente al menos de 800 nucleótidos o aún más preferiblemente al menos 900 nucleótidos de longitud. Pueden usarse sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas están generalmente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina). Dichas sondas están comprendidas por la presente invención.
Una genoteca de ADN genómico preparada a partir de dichos otros organismos puede rastrearse, por lo tanto, para ADN que se hibrida con las sondas descritas anteriormente y que codifica un polipéptido que tiene actividad de
lactasa. El ADN genómico u otro de dichos otros organismos puede separarse por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado puede transferirse e inmovilizarse sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con objeto de identificar un clon o ADN que es homólogo con la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13 o una de sus subsecuencias, el material portador se usa en una transferencia Southern.
Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de nucleótidos se hibrida con una sonda de ácido nucleico marcada que corresponde a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13, su cadena complementaria o una de sus subsecuencias, en condiciones de muy baja a muy alta severidad. Las moléculas a las que la sonda de ácido nucleico se hibrida en estas condiciones se pueden detectar usando película de rayos X.
En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la región codificante de polipéptido maduro de la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, se definen condiciones de muy baja a muy alta severidad como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, SDS al 0,3%, 200 g/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 25% de formamida para muy bajas y bajas severidades, 35% de formamida para medias y medias-altas severidades, o formamida al 50% para altas y muy altas severidades, siguiendo procedimientos normalizado de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas demanera óptima.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador se lava finalmente tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0,2% preferiblemente al menos a 45ºC (muy baja severidad), más preferiblemente al menos a 50ºC. Más preferiblemente al menos a 55ºC (severidad media), más preferiblemente al menos a 60ºC (severidad medio-alta), aún más preferiblemente al menos a 65ºC (alta severidad), y lo más preferible al menos a 70°C (muy alta severidad).
En una realización concreta, el lavado se lleva a cabo usando 0,2X SSC , SDS al 0,2% preferiblemente al menos a 45ºC (muy baja severidad), más preferiblemente al menos a 50ºC (baja severidad), más preferiblemente al menos a 55ºC (severidad media), más preferiblemente al menos a 60ºC (media-alta severidad), aún más preferiblemente al menos a 65ºC (alta severidad), y lo más preferiblemente al menos a 70ºC (muy alta severidad). En otra realización concreta, el lavado se lleva a cabo usando 0,1 X SSC, SDS al 0,2% preferiblemente al menos a 45ºC (muy baja severidad), más preferiblemente al menos a 50ºC (baja severidad), más preferiblemente al menos a 55ºC (media severidad), más preferiblemente al menos a 60ºC (media-alta severidad), aún más preferiblemente al menos a 65ºC (alta severidad), y lomás preferiblemente al menos a 70ºC (muy alta severidad).
Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de severidad se definen como prehibridación, hibridación y lavado después de la hibridación de aproximadamente 5ºC a aproximadamente 10ºC por debajo de la Tm calculado empleando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 al 0,5%, 1X solución de Denhardt, pirofosfato sódico 1 mM, fosfato sódicomonobásico 1 mM, ATP 0,1 mM y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos normalizados de transferencia Southern.
Para sondas cortas que tienen una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada 15 minutos usando 6X SSC a 5ºC a 10ºC inferior ala Tm calculada.
En condiciones de hibridación que contienen sal, la Tm eficaz es la que controla el grado de identidad deseado entre la sonda y el ADN unido al filtro para la hibridación con éxito. La Tm eficaz puede determinarse usando la fórmula siguiente para determinar el grado de identidad requerida para que dos ADN se hibriden en diversas condiciones de severidad.
Tm eficaz = 81,5 + 16,6(log M[Na+]) + 0,41(% G + C) -0,72(% de formamida) (Véase www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
El contenido de G + C de la SEQ ID nº: 10 es del 42% y el contenido deG + C de la SEQ ID nº: 11 es del 44%. Para una severidadmedia, la formamida es 35% y la concentración de Na+ para 5X SSPE es 0,75 M.
Otra relación relevante es que un desajuste del 1% de dos ADN disminuye la Tm en 1,4°C. Para determinar el grado de identidad requerido para que dos ADN se hibriden en condiciones de media severidad a 42ºC, se utiliza la siguiente fórmula:
% Homología = 100 -[(Tm eficaz -Temperatura de hibridación / 1,4]
(Véase www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
Los ácidos nucleicos variantes incluyen un polinucleótido que tiene un determinado porcentaje, p. ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, de identidad de secuencia con el ácido nucleico que codifica la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido como el descrito en la presente memoria. En otro aspecto, el ácido nucleico descrito en la presente memoria tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos 60%, tal como al menos 65%, tal como al menos 70%, tal como al menos 75%, tal como al menos 80% tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 99% de la SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13. En un aspecto, un plásmido que comprende un ácido nucleico tal como se describe en la presente memoria.
En un aspecto, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico como se describe en este documento, o capaz de expresar un polipéptido como se describe en la presentememoria.
Se proporciona un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico que codifica cualquiera de las variantes de polipéptidos definidos y expuestos en la presente memoria. Además, se proporciona un ácido nucleico capaz de hibridarse con el complemento. En otra realización, la secuencia para su utilización en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria es una secuencia sintética. Incluye, pero no se limita a, secuencias hechas con un uso óptimo de codones para expresión en organismos anfitriones, tales como levaduras. Las variantes de polipéptidos proporcionados en la presente invención pueden producirse por síntesis o por expresión recombinada en una célula anfitriona, según procedimientos bien conocidos en la técnica. En un aspecto, el o los polipéptido(s) descrito(s) en la presente memoria es o son el o los polipéptido(s) recombinado(s). La variante de polipéptido expresada como se define en la presente memoria se aísla opcionalmente antes de su uso.
En otra realización, la variante de polipéptido como se define en la presente memoria se purifica después de la expresión. Los métodos de modificación genética y producción biotecnológica de variantes de polipéptidos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 7.371.552 , nº 7.166.453; nº 6.890.572; y nº 6.667.065; y solicitudes de patente publicadas de EE.UU. n° 2007/0141693; nº 2007/0072270; nº 2007/0020731; nº 2007/0020727; nº 2006/0073583; nº 2006/0019347; nº 2006/0018997; nº 2006/0008890; nº 2006/0008888 y nº 2005/0137111.
Se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con un ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4
o 5. En una realización, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente 60%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98% o 99% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13.
Vectores
En un aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende un polinucleótido. En un aspecto, una célula bacteriana comprende el vector. En algunas realizaciones, un montaje de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una variante se transfiere a una célula anfitriona en un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras unidas operativamente a una secuencia codificadora. El vector puede ser cualquier vector que pueda ser integrado en un genoma de célula anfitriona fúngica y replicado cuando se introduce en la célula anfitriona. El Catálogo de Cepas de la FGSC, Universidad de Missouri, da una lista de vectores adecuados. Más ejemplos de vectores de expresión y/o integración adecuados se proporcionan en Sambrook et al., CLONING MOLECULAR: A LABORATORY MANUAL, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001 ); Bennett et al., MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991), págs. 396-428 ; y la patente de EE.UU. nº 5.874.276 . Los vectores ejemplares incluyen pFB6, pBR322, pUC18, pUC100 y pENTR/D, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z y pGEM®4Z. Ejemplos de utilización en células bacterianas incluyen pBR322 y pUC19, que permiten la replicación en E. coli, y pE194, por ejemplo, que permite la replicación en Bacillus.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica una variante está operativamente unido a un activador adecuado, que permite la transcripción en la célula anfitriona. El activador puede proceder de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula anfitriona. Ejemplos no restrictivos adecuados de activadores incluyen activadores cbh1, cbh2, egl1 y egl2 . En una realización, el activador es el que es innato a la célula anfitriona. Por ejemplo, cuando P. saccharophila es el anfitrión, el activador es un activador innato de P. saccharophila . Un "activador inducible" es un activador que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. En otra realización, el activador es el que es heterólogo para la célula anfitriona.
En algunas realizaciones, la secuencia codificadora está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal. En otro aspecto, un péptido señal representativo es la SEQ ID nº: 27. Un péptido señal representativo es la SEQ ID nº: 9 que es la secuencia señal natural del precursor aprE de Bacillus subtilis. En otras realizaciones, el ADN que codifica la secuencia señal se reemplaza por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal de otros precursores extracelulares de Bacillus subtilis. En una realización, el polinucleótido que codifica la secuencia señal está inmediatamente aguas arriba y en el marco del polinucleótido que codifica el polipéptido. La secuencia señal puede seleccionarse dela misma especie que la célula anfitriona.
En otras realizaciones, una secuencia señal y una secuencia activadora que comprende un montaje o vector de ADN que ha de introducirse en una célula anfitriona fúngica proceden de la misma fuente. En algunas realizaciones, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. En una realización, la secuencia de terminación y la secuencia activadora proceden de la misma fuente. En otra realización, la secuencia de terminación es homóloga a la célula anfitriona.
En algunas realizaciones, un vector de expresión incluye un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen aquellos que confieren resistencia a agentes antimicrobianos, p. ej., higromicina
o fleomicina. Los marcadores selectivos para nutrición también son adecuados e incluyen amdS, argB y pyr4. En una realización, el marcador selectivo es el gen amdS , que codifica la enzima acetamidasa; permite que las células transformadas crezcan en acetamida como fuente de nitrógeno. El uso de un gen amdS de A. nidulans como marcador selectivo se describe en Kelley et al., EMBO J. 4: 475-479 (1985 ) y Penttila et al., Gene 61: 155-164 (1987).
Un vector de expresión adecuado que comprende un montaje de ADN con un polinucleótido que codifica una variante puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse de forma autónoma en un organismo anfitrión dado
o de integrarse en el ADN del anfitrión. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un plásmido. En algunas realizaciones, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de genes. El primer vector de expresión comprende secuencias de ADN en las que el activador, la región codificadora y el terminador proceden todos del gen a expresar. En algunas realizaciones, el truncamiento del gen se obtiene eliminando secuencias de ADN no deseadas para dejar el dominio a expresar bajo el control de sus propias secuencias reguladoras detranscripción y traducción. El segundo tipo de vector de expresión está preensamblado y contiene las secuencias necesarias para la transcripción de alto nivel y un marcador seleccionable. En algunas realizaciones, la región codificadora para un gen o parte del mismo se inserta en este vector de expresión de uso general, demanera que está bajo el control de la transcripción de las secuencias activadora y terminadora del montaje de expresión. En algunas realizaciones, los genes o parte de losmismos se insertan aguas abajo del fuerte activador cbh1.
Anfitriones de expresión/células anfitrionas
En otro aspecto, se proporciona una célula anfitriona que comprende, preferiblemente transformada con, un plásmido como se describe en la presente memoria o un vector de expresión como se describe en la presente memoria.
En otro aspecto, se proporciona una célula capaz de expresar un polipéptido como se describe en la presente memoria.
En un aspecto, la célula anfitriona como se describe en la presente memoria, o la célula como se describe en la presente memoria es una célula bacteriana, fúngica o de levadura.
En otro aspecto, la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en Ruminococcus, Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torula, Torulopsis y Aspergillus.
En otro aspecto, la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en Ruminococcus hansenii, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium, longum, Bifidobacterium, infantis, Bifidobacterium bifidum y Lactococcus lactis.
En otra realización, las células anfitrionas adecuadas incluyen una bacteria Gram positiva seleccionada del grupo que consiste en Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B . circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans o S . murinus; o una bacteria Gram negativa, en la que dicha bacteria Gram negativa es Escherichia coli o una especie Pseudomonas. En un aspecto, la célula anfitriona es una B . subtilus o B . licheniformis. En una realización, la célula anfitriona es B . subtilis, y la proteína expresada está genéticamentemodificada para comprender una secuencia señal de B . subtilis , como se expone con más detalle a continuación. En un aspecto, la célula anfitriona expresa el polinucleótido como se expone en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, una célula anfitriona genéticamente modificada para expresar una variante de polipéptido como se define en la presente memoria con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% con el polipéptido de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica una variante de polipéptido como se define en la presente memoria tendrá una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente una identidad de secuencia de 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con un ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente 60%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,98% o 99% deidentidad de secuencia con el ácido nucleico de SEQ ID nº: 9, 10, 11, 12 o 13.
Métodos para producir polipéptidos
En otro aspecto, un método para expresar un polipéptido como se describe en la presente memoria comprende obtener una célula anfitriona o una célula tal como se describe en la presente memoria y expresar el polipéptido de la célula o célula anfitriona, y opcionalmente purificar el polipéptido.
Una expresión característica significa un nivel alterado de expresión de la variante, cuando la variante se produce en una célula anfitriona concreta. La expresión se refiere generalmente a la cantidad de variante activa que es recuperable de un caldo de fermentación empleando técnicas normalizadas conocidas en esta técnica durante un tiempo dado. La expresión también puede relacionarse con la cantidad o tasa de variante producida dentro de la célula anfitriona o segregada por la célula anfitriona. La expresión también puede relacionarse con la velocidad de traducción del ARNm que codifica el polipéptido variante.
Transformación, expresión y cultivo de las células anfitrionas
La introducción de un montaje o vector de ADN en una célula anfitriona incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transfección, p. ej., mediada por lipofección y transfección mediada por DEAE-Dextrina; incubación con precipitado de ADN con fosfato de calcio; bombardeo a alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN; y fusión de protoplastos. Las técnicas generales de transformación son conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Ausubel et al. (1987), anteriormente, capítulo 9; Sambrook et al. (2001), anteriormente; y Campbell et al., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989). La expresión de la proteína heteróloga en Trichoderma se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6.022.725 ; patente de EE.UU. nº 6.268.328; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991 ); Harkki et al., BioTechnol. 7: 596-603 (1989 ); EP
244.234 ; y EP 215.594 . En una realización, se construyen transformantes genéticamente estables con sistemas vectoriales por lo que el ácido nucleico que codifica una variante se integra de forma estable en un cromosoma de célula anfitriona. Los transformantes se purifican entonces mediante técnicas conocidas.
En un ejemplo no restrictivo, los transformantes estables que incluyen un marcador amdS se distinguen de los transformantes inestables por su velocidad de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un contorno liso, en vez de irregular en el medio de cultivo sólido que contiene acetamida. Además, en algunos casos se lleva a cabo una prueba adicional de estabilidad cultivando los transformantes en un medio sólido no selectivo, p. ej., un medio que carece de acetamida, recogiendo esporas de este medio de cultivo y determinando el porcentaje de estas esporas que posteriormente germinan y crecen el medio selectivo que contiene acetamida. Pueden usarse otros métodos conocidos en latécnica para seleccionar transformantes.
Identificación de actividad
Para evaluar la expresión de una variante en una célula anfitriona, los ensayos pueden medir la actividad la proteína expresada, del ARNm correspondiente o de la β-galactosidasa. Por ejemplo, los ensayos adecuados incluyen transferencia Northern y Southern, RT-PCR (reacción en cadena de transcriptasa polimerasa inversa), e hibridación in situ, utilizando una sonda de hibridación apropiadamente marcada. Los ensayos adecuados también incluyen la medición de la actividad en una muestra. Ensayos adecuados de la actividad de la variante incluyen, pero no se limitan a, ensayos basados en ONPG o la determinación de glucosa en mezclas de reacción tal como se describe por ejemplo en los métodos y ejemplos en la presentememoria.
Métodos para purificar los polipéptidos descritos en la presentememoria
En general, una variante producida en el cultivo celular se segrega en el medio y puede purificarse o aislarse, p. ej. , eliminando componentes no deseados del medio de cultivo celular. En algunos casos, una variante puede recuperarse de un lisado celular. En tales casos, la enzima se purifica en las células en las que se produjo usando técnicas habitualmente empleadas por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo cromatografía de afinidad, métodos cromatográficos de intercambio iónico, incluido intercambio iónico de alta resolución, cromatografía de interacción hidrófoba, separación bifásica, precipitación con etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatofocalización, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel usando Sephadex G-75. Dependiendo del uso pretendido, el o los polipéptido(s) descrito(s) puede(n), por ejemplo, ser liofilizado(s) o preparado(s) en una solución. En un aspecto, el o los polipéptido(s) descrito(s) en la presente memoria está(n) en forma liofilizada. En otro aspecto, el olos polipéptido(s) descrito(s) está(n) en solución.
Composiciones, aplicación y uso
Métodos de inmovilización y formulación de los polipéptidos descritos en la presente invención
Las composiciones de polipéptidos pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de granulado o microgranulado. El polipéptido a incluir en la composición puede estabilizarse según métodos conocidos en la técnica. A continuación se dan ejemplos de usos preferidos de los polipéptidos o composiciones polipeptídicas de la invención.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un método para producir un producto alimenticio tratando un sustrato que comprende lactosa con un polipéptido como sedescribe en la presente memoria.
En un aspecto, se describe en la presentememoria un método para producir un producto lácteo tratando un sustrato lácteo que comprende lactosa con un polipéptido como se describe en la presente memoria.
En un aspecto, el sustrato que comprende lactosa se trata además con una beta-galactosidasa hidrolizante.
El preparado enzimático, tal como en forma de ingrediente alimentario preparado según la presente invención, puede estar en forma de solución o en forma sólida -dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración. La forma sólida puede ser como polvo enzimático seco o como enzima granulada.
Entre los ejemplos de formulaciones enzimáticas anhidras se incluyen productos secados por pulverización, productos de granulación de mezcladores, productos en capas tales como gránulos de lecho fluido, productos comprimidos en gránulos extruidos o granulados, productos liofilizados.
El preparado enzimático, tal como en forma de un ingrediente alimentario preparado según la presente invención, puede estar en forma de solución o en forma sólida -dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración. La forma sólida puede ser como polvo enzimático seco o como enzima granulada.
En un aspecto, se proporciona una composición preferiblemente una composición alimenticia, más preferiblemente un producto lácteo que comprende una célula o un polipéptido como se describe en la presentememoria.
Además, en la presente memoria se describe una composición que comprende al menos 5%, tal como, p. ej., 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% p/p de uno o más polipéptido(s) como se describe en la presente memoria en base a la cantidad total de polipéptidos en la composición que tiene al menos 70%, p. ej., 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 22. Esto se puede evaluar usando las siguientes técnicas conocidas por un experto en la técnica. Las muestras a evaluar se someten a SDS-PAGE y se visualizan usando un colorante apropiado para la cuantificación de proteínas, tal como por ejemplo el sistema Criterion de Bio-Rad. El gel se escanea a continuación utilizando un escáner densiométrico apropiado tal como por ejemplo el sistema Criterion de Bio-Rad y se asegura que la imagen resultante esté en el intervalo dinámico. Las bandas correspondientes a cualquier variante/fragmento procedente de la SEQ ID nº: 8 se cuantifican y el porcentaje de los polipéptidos se calcula como: Porcentaje de polipéptido en cuestión = polipéptido en cuestión/(suma de todos los polipéptidos que presentan actividad transgalactosilante) * 100. El número total de variantes/fragmentos de polipéptidos procedente de la SEQ ID nº: 8 en la composición puede determinarse detectando el fragmento procedente de la SEQ ID nº: 8 por transferencia Western usando un anticuerpo policlonal por métodos conocidos por un experto en latécnica.
En un aspecto, la composición según la presente invención comprende uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consta de un polipéptido que consiste en la SEQ ID nº: 1, 2, 3, 4 y 5. En otro aspecto, la composición comprende uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consta de un polipéptido que consiste en SEQ ID nº: 1, 2 y 3. En aún otro aspecto, la composición comprende uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consta de un polipéptido que consiste en las SEQ ID nº: 1 y 2.
En un aspecto, la invención proporciona un preparado complejo enzimático que comprende el complejo enzimático según la invención, un vehículo enzimático y opcionalmente un estabilizante y/o un conservante.
En aún otro aspecto dela invención, el portador enzimático se selecciona del grupo que consiste en glicerol o agua.
En otro aspecto, el preparado/composición comprende un estabilizante. En un aspecto, el estabilizante se selecciona del grupo que consiste en sales inorgánicas, polioles, azúcares y una de sus combinaciones. En un aspecto, el estabilizante es una sal inorgánica tal como cloruro de potasio. En otro aspecto, el poliol es glicerol, propilenglicol o sorbitol. En otro aspecto todavía, el azúcar es un hidrato de carbono de molécula pequeña, en concreto cualquiera de varios de sabor dulce tales como glucosa, galactosa, fructosa y sacarosa.
Todavía en otro aspecto, el preparado comprende un conservante. En un aspecto, el conservante es metil-parabeno, propil-parabeno, benzoato, sorbato u otros conservantes aprobados para alimentos o una de sus mezclas.
El método de la invención puede practicarse con enzimas inmovilizadas, p. ej., una lactasa inmovilizada u otras enzimas productoras de galactooligosacáridos. La enzima puede inmovilizarse sobre cualquier soporte orgánico o inorgánico. Ejemplos de soportes inorgánicos incluyen alúmina, Celite, cloruro-Dowex-1, perlas de vidrio y gel de sílice. Ejemplos de soportes orgánicos incluyen DEAE-celulosa, hidrogeles de alginato o perlas de alginato o equivalentes. En diversos aspectos de la invención, la inmovilización de la lactasa puede optimizarse por adsorción física sobre el soporte inorgánico. Las enzimas utilizadas para poner en práctica la invención pueden inmovilizarse en diferentes medios, incluidos agua, tampón Tris-HCl y solución tamponada con fosfato. La enzima puede inmovilizarse en cualquier tipo de sustrato, p. ej., filtros, fibras, columnas, perlas, coloides, geles, hidrogeles, mallas y similares.
En un aspecto, se proporciona un método para producir un producto lácteo tratando un sustrato lácteo que comprende lactosa con un polipéptido como se describe en la presentememoria. En otro aspecto, se proporciona un método para producir un producto lácteo tratando un sustrato lácteo que comprende lactosa con un polipéptido que tiene una actividad de transgalactosilación relativa superior al 60%, tal como superior al 70%, tal como superior al 75% después de 15 min. de reacción. En un aspecto, la actividad de transgalactosilación relativa es superior a 3 después de 30 min. de reacción. En otro aspecto, la actividad de transgalactosilación relativa es superior a 6 después de 30 min. de reacción. Todavía en otro aspecto, la actividad de transgalactosilación relativa es superior a 12 después de 30 min. de reacción. En un aspecto, se proporciona un método, en donde el tratamiento con un polipéptido como se describe en este documento tiene lugar a una temperatura óptima para la actividad de la enzima. En otro aspecto, el polipéptido se añade al sustrato lácteo a una concentración de 0,01 a 1000 ppm. Aún en otro aspecto, el polipéptido se añade al sustrato lácteo a una concentración de 0,1 a 100 ppm. En otro aspecto, el polipéptido se añade al sustrato lácteo a una concentración de 1-10 ppm. En un aspecto, se proporciona un método que comprende además la fermentación de un sustrato tal como un producto lácteo con un microorganismo. En otro aspecto, el producto lácteo es yogur. En otro aspecto, el tratamiento con el polipéptido y el microorganismo se realiza esencialmente al mismo tiempo. En un aspecto, el polipéptido y el microorganismo se añaden al sustrato lácteo esencialmente al mismo tiempo. En un aspecto, se proporciona un producto lácteo que comprende una célula
o un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto, el polipéptido definido en la presente memoria se añade en una concentración de 0,01 a 1000 ppm. En un aspecto, se proporciona un producto lácteo que comprende un polipéptido inactivado como se define en la presente memoria. En un aspecto, se proporciona un producto lácteo que comprende un polipéptido inactivado como se define en la presente memoria en una concentración de 0,01 a 1.000 ppm. En un aspecto, se proporciona un producto lácteo que comprende GOS formado in situ por un polipéptido como se define en la presente memoria. En un aspecto, se proporciona un producto lácteo que comprende una célula como se define en la presente memoria. Un producto lácteo tal como se describe en la presente memoria puede ser, p. ej., leche descremada, leche baja en grasa, leche entera, crema, leche UHT, leche con vida útil prolongada, un producto lácteo fermentado, queso, yogur, mantequilla, producto lácteo para untar, suero de leche, bebida de leche acidificada, crema agria, bebida a base de suero, helado, leche condensada, dulce de leche o una bebida con leche aromatizada. Un producto lácteo puede prepararse por cualquier método conocido en la técnica.
Un producto lácteo puede comprender además componentes no lácteos, p. ej. componentes vegetales tales como,
p. ej., aceite vegetal, proteína vegetal y/o hidratos de carbono vegetales. Los productos lácteos también pueden comprender más aditivos tales como, p. ej., enzimas, agentes aromatizantes, cultivos microbianos tales como cultivos probióticos, sales, edulcorantes, azúcares, ácidos, frutas, zumos de frutas o cualquier otro componente conocido en la técnica como un componente de, o aditivo para, un productolácteo.
En una realización de la invención, uno o más componentes de leche y/o fracciones de leche representan al menos el 50% (peso/peso), tal como al menos el 70%, p. ej., al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, del producto lácteo.
En una realización de la invención, uno o más sustratos lácteos que han sido tratados con una enzima como se define en la presente memoria que tiene actividad transgalactosilante representan al menos 50% (peso/peso), tal como al menos 70%, p. ej. al menos 80% , preferiblemente al menos 90%, del productolácteo.
En una realización de la invención, el producto lácteo es un producto lácteo que no se enriquece por adición de galactooligosacáridos producidos previamente.
En una realización de la invención, el sustrato lácteo tratado con polipéptido no se seca antes de ser utilizado como ingrediente en el productolácteo.
En una realización de la invención, el producto lácteo es helado. En el presente contexto, el helado puede ser cualquier tipo de helado tal como helado sin descremar, helado bajo en grasa o helado de yogur u otros productos lácteos fermentados. El helado puede fabricarse por cualquier método conocido en la técnica.
En una realización dela invención, el producto lácteo es leche o leche condensada.
En una realización de la invención, el producto lácteo es leche UHT. La leche UHT en el contexto de la presente invención es leche que ha sido sometida a un procedimiento de esterilización que está destinado a matar a todos los microorganismos, incluidas las esporas bacterianas. El tratamiento UHT (ultra alta temperatura) puede ser, p. ej., tratamientotérmico durante 30 segundos a 130°C, otratamiento térmico durante un segundo a 145°C.
En una realización preferida de la invención, el producto lácteo es leche ESL. Leche ESL en el presente contexto es la leche que tiene una vida útil prolongada debido a la microfiltración y/o el tratamiento térmico y que es capaz de permanecer fresca durante al menos 15 días, preferiblemente durante al menos 20 días, en el estante de la tienda a 2-5ºC.
En otra realización preferida de lainvención, el producto lácteo es un producto lácteo fermentado, p. ej., yogur.
Los microorganismos utilizados para la mayoría de los productos lácteos fermentados se seleccionan del grupo de bacterias denominadas generalmente bacterias de ácido láctico. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "bacteria de ácido láctico" designa una bacteria gram-positiva, microaerófila o anaerobia, que fermenta azúcares con la producción de ácidos, incluidos el ácido láctico como ácido predominantemente producido, ácido acético y ácido propiónico. Las bacterias de ácido láctico más útiles industrialmente se encuentran dentro del orden "Lactobacillales" que incluye Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. y Propionibacterium spp. Además, las bacterias productoras de ácido láctico pertenecientes al grupo de bacterias anaerobias, bifidobacterias, es decir, Bifidobacterium spp., que se utilizan frecuentemente como cultivos alimentarios solas o en combinación con bacterias de ácido láctico, seincluyen generalmente en el grupo de bacterias de ácido láctico.
Las bacterias de ácido láctico se suministran normalmente a la industria láctea ya sea como cultivos congelados o liofilizados para propagación por iniciador en masa o comolos llamados cultivos "Direct Vat Set" (DVS), destinados a la inoculación directa en un recipiente o cuba de fermentación para la producción de un producto lácteo fermentado. Dichos cultivos se denominan en general "cultivos iniciadores" o "iniciadores".
Las cepas de bacterias de ácido láctico de cultivo iniciador usadas habitualmente se dividen generalmente en organismos mesófilos que tienen temperaturas óptimas de crecimiento a aproximadamente 30ºC y organismos termófilos que tienen temperaturas óptimas de crecimiento en el intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 45ºC. Los organismos típicos que pertenecen al grupo mesófilo incluyen Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei y Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Las especies bacterianas de ácido láctico termófilo incluyen como ejemplosStreptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus acidophilus.
También las bacterias anaerobias pertenecientes al género Bifidobacterium incluidas Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis y Bifidobacterium longum se usan habitualmente como cultivos iniciadores para productos lácteos y generalmente se incluyen en el grupo de bacterias de ácido láctico. Además, las especies de Propionibacteria se utilizan como cultivos iniciadores para productos lácteos, en particular en la fabricación de quesos. Además, los organismos que pertenecen al género Brevibacterium se utilizan habitualmente como cultivos iniciadores para alimentos.
Otro grupo de cultivos iniciadores microbianos son cultivos de hongos, incluidos cultivos de levaduras y cultivos de hongos filamentosos, que se utilizan particularmente en la fabricación de determinados tipos de queso y bebidas. Ejemplos de hongos incluyen Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir y Saccharomyces cerevisiae.
En una realización de la presente invención, el microorganismo utilizado para la fermentación del sustrato lácteo es Lactobacillus casei o unamezcla de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus.
Los procesos de fermentación a utilizar en un método de la presente invención son bien conocidos y el experto en la técnica sabrá cómo seleccionar condiciones de proceso adecuadas, tales como temperatura, oxígeno, cantidad y características de microorganismo/s, aditivos tales como p. ej. hidratos de carbono, saborizantes, minerales, enzimas y tiempo de proceso. Obviamente, las condiciones de fermentación se seleccionan de modo que apoyen la consecución dela presente invención.
Como resultado de la fermentación, el pH del sustrato lácteo se reducirá. El pH de un producto lácteo fermentado de la invención puede estar comprendido, p. ej., en el intervalo de 3,5 a 6, tal como en el intervalo de 3,5 a 5, preferiblemente en el intervalo de 3,8 a 4,8.
En un aspecto, se proporciona un método para usar los polipéptidos o usar uno o más de los tipos de células mencionados anteriormente para producir oligosacáridos. Los oligosacáridos comprenden, pero no se limitan a, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, isomaltooligosacáridos, maltooligosacáridos, lactosacarosa y xilooligosacáridos.
En una realización de la invención, los oligosacáridos se producen incubando la célula que expresa el polipéptido en un medio que comprende un sustrato disacárido tal como por ejemplo lactulosa, trehalosa, ramnosa, maltosa, sacarosa, lactosa o celobiosa. La incubación se lleva a cabo en condiciones en las que se producen oligosacáridos. Las células pueden ser parte de un producto seleccionado del grupo que consiste en yogur, queso, productos lácteos fermentados, complementos alimenticios y productos comestibles probióticos. Alternativamente, los oligosacáridos pueden recuperarse y posteriormente añadirse al producto de interés antes o después de su preparación.
En un aspecto, se proporciona el uso de una célula descrita en la presente memoria para producir un producto seleccionado del grupo que consiste en yogur, queso, producto de leche fermentado, complemento alimenticio y producto comestible probiótico.
En un aspecto, los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden usarse para preparar productos de queso y en métodos para elaborar los productos de queso. Los productos de queso pueden seleccionarse, p. ej., del grupo que consiste en queso cremoso, requesón y queso fresco. Mediante la adición de polipéptidos los quesos pueden contener cantidades significativamente aumentadas de galactooligosacáridos y cantidades reducidas de lactosa. En un aspecto, las cantidades de lactosa en el producto de queso final pueden reducirse en al menos aproximadamente 25 por ciento, preferiblemente al menos aproximadamente 50 por ciento, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75 por ciento. Los polipéptidos se pueden usar para reducir la lactosa en productos de queso a menos de aproximadamente 1 gramo por porción, una cantidad que puede ser tolerada por la mayoría de las personas intolerantes a la lactosa.
Los productos de queso proporcionados en la presente invención son productos de queso nutricionalmente mejorados que tienen un aumento en el contenido de fibra soluble, un contenido calórico reducido, excelentes propiedades organolépticas, mejor textura y sabor. Además, los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden reducir el índice glucémico de los productos de queso porque los GOS se absorben más lentamente que la lactosa o sus productos de hidrólisis. Por último, los polipéptidos pueden reducir el coste de producción de los productos de queso, en particular los productos de queso cremoso, debido a que los GOS proporcionan sorprendentemente una textura mejorada al producto de queso cremoso, permitiendo así el uso reducido de estabilizantes o permitiendo un aumento del contenido de humedad sin sinéresis.
En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria y un sustrato de hidrato de carbono. En otro aspecto, el sustrato de hidrato de carbono es un disacárido. En otro aspecto, el disacárido es por ejemplo lactulosa, trehalosa, ramnosa, maltosa, sacarosa, lactosa o celobiosa. En otro aspecto aún, el sustrato de hidrato de carbono es lactosa. La composición se prepara de manera que se producen oligosacáridos. El polipéptido como se describe en la presente memoria puede ser parte de un producto seleccionado del grupo que consiste en yogur, queso, productos lácteos fermentados, complementos alimenticios y productos comestibles probióticos. En un aspecto, se proporciona una composición que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria y un estabilizante. Ejemplos de estabilizantes son, p. ej., un poliol tal como, por ejemplo, glicerol o propilenglicol, un azúcar o un azúcar alcohol, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico (p. ej., un éster de borato aromático).
En un aspecto, se proporciona el uso de un polipéptido transgalactosilante como se describe en la presentememoria
o una célula como se describe en la presente memoria, para producir galactooligosacáridos. En un aspecto, se proporciona el uso de un polipéptido transgalactosilante como se describe en la presente memoria o una célula como se describe en la presente memoria, para producir galactooligosacáridos para formar parte de un producto seleccionado del grupo que consiste en yogur, queso, productos lácteos fermentados, complementos alimenticios y productos probióticos comestibles. En un aspecto, el producto es yogur, queso o productos lácteos fermentados. En un aspecto, se proporciona el uso de un polipéptido transgalactosilante como se describe en la presente memoria o una célula como se describe en la presente memoria, para producir galactooligosacáridos para aumentar el crecimiento de Bifidobacterium. En un aspecto, se proporciona el uso de un polipéptido transgalactosilante como se describe en la presente memoria o una célula como se describe en la presente memoria, para producir galactooligosacáridos para aumentar el crecimiento de Bifidobacterium en una fermentación de cultivomixto.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido transgalactosilante como se describe en la presente memoria, que comprende cultivar una célula como se describe en la presente memoria en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido resultante del cultivo. Se proporciona un procedimiento para producir galactooligosacáridos, que comprende poner en contacto un polipéptido como se describe en la presente memoria o una célula como se describe en la presente memoria con una soluciónláctea que comprende lactosa.
La adición de oligosacáridos puede aumentar el crecimiento de Bifidobacterium solo o de Bifidobacterium en un cultivo mixto.
El tratamiento de los productos lácteos con enzimas que convierten la lactosa en monosacáridos o GOS tiene varias ventajas. En primer lugar, los productos pueden ser consumidos por personas con intolerancia a la lactosa que de otro modo mostrarían síntomas tales como flatulencia y diarrea. En segundo lugar, los productos lácteos tratados con lactasa tendrán un dulzor mayor que los productos similares no tratados debido al mayor dulzor percibido de glucosa y galactosa en comparación con lactosa. Este efecto es particularmente interesante para aplicaciones tales como yogur y helado donde se desea un alto dulzor del producto final y esto permite una reducción neta de hidratos de carbono en el producto consumido. En tercer lugar, en la producción de helado a menudo se observa un fenómeno denominado arenado, cuando las moléculas de lactosa cristalizan debido a la relativa baja solubilidad de la lactosa. Cuando la lactosa se convierte en monosacáridos o GOS la sensación del helado en la boca es mucho mejor que en los productos no tratados. La presencia de una sensación arenosa debido a la cristalización de la lactosa puede eliminarse y los costes de la materia prima pueden disminuirse sustituyendo la leche desnatada en polvo por suero en polvo. Los principales efectos del tratamiento enzimático fueron el aumento del dulzor.
En un aspecto, el o los polipéptido(s) transgalactosilante(s) tal como se describe en la presente memoria puede(n) usarse junto con otras enzimas tales como proteasas tales como quimosina o renina, lipasas tales como
fosfolipasas, amilasas, transferasas y lactasas. En un aspecto, el o los polipéptido(s) transgalactosilante(s) tal como se describe en la presente memoria pueden usarse junto con lactasa. Esto puede ser especialmente útil cuando existe el deseo de reducir la lactosa residual después del tratamiento con el o los polipéptido(s) transgalactosilante(s) como se describe en la presente memoria, especialmente a bajas concentraciones de lactosa. Una lactasa en el contexto de la presente invención es cualquier glucósido hidrolasa con capacidad de hidrolizar el disacárido lactosa en monómeros constituyentes galactosa y glucosa. El grupo de lactasas comprende, pero no se limita a, enzimas asignadas a la subclase EC 3.2.1.108. Las enzimas asignadas a otras subclases, tales como, p. ej., EC 3.2.1.23, también pueden ser lactasas en el contexto de la presente invención. Una lactasa en el contexto de la invención puede tener otras actividades además de la actividad hidrolizante de lactosa, tal como por ejemplo una actividad transgalactosilante. En el contexto de la invención, la actividad hidrolizante de lactosa de la lactasa puede mencionarse como su actividad de lactasa o su actividad de beta-galactosidasa. Las enzimas que tienen actividad de lactasa a utilizar en un método de la presente invención pueden ser de origen animal, vegetal o microbiano. Las enzimas preferidas se obtienen a partir de fuentes microbianas, en particular de un hongo filamentoso o levadura, o de una bacteria. La enzima puede proceder, p. ej., de una cepa de Agaricus, p. ej. A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, p. ej. A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, p. ej. D. discoideum; Kluveromyces, p. ej. K. fragilis, K. lactis; Mucor, p. ej. M. javanicus, M. mucedo,
M. subtilissimus; Neurospora, p. ej. N. crassa; Rhizomucor, p. ej. R. pusillus; Rhizopus, p. ej. R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, p. ej. S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, p. ej. T. rubrum; Whetzelinia,
p.
ej., W. sclerotiorum; Bacillus, p. ej., B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus,
B.
stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, p. ej. B. longum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacterium; Citrobacter, p. ej. C. freundii; Clostridium, p. ej. C. perfringens; Diplodia, p. ej. D. gossypina; Enterobacter, p. ej. E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, p. ej. E. herbicola; Escherichia, p. ej. E. coli; Klebsiella, p. ej.
K.
pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, p. ej. N. crassa; Proteus, p. ej. P. vulgaris; Providencia, p. ej. P. stuartii; Pycnoporus, p. ej., Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus,
p.
ej. R. torques; Salmonella, p. ej. S. typhimurium; Serratia, p. ej. S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, p. ej. S. flexneri; Streptomyces, p. ej. S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, p. ej.
T.
reesei, T. viride; Yersinia, p. ej. Y. enterocolitica. En una realización, la lactasa es un componente intracelular de microorganismos como Kluyveromyces y Bacillus. Kluyveromyces, especialmente K. fragilis y K. lactis, y otros hongos como los de los géneros Candida, Torula y Torulopsis, son una fuente común de lactasas fúngicas, mientras que B. coagulans y B. circulans son fuentes bien conocidas de lactasas bacterianas. Están disponibles varios preparados comerciales de lactasa procedentes de estos organismos, tales como Lactozym® (disponible en Novozymes, Dinamarca), HA-Lactasa (disponible en Chr. Hansen, Dinamarca) y Maxilact® (disponible en DSM, Holanda), todos a partir de K. lactis. Todas estas lactasas se denominan lactasas neutras que tienen un pH óptimo entre pH 6 y pH 8. Cuando dichas lactasas se usan en la producción de, p. ej., yogur bajo en lactosa, el tratamiento enzimático tendrá que realizarse en una etapa independiente antes la fermentación o tendrán que utilizarse dosis enzimáticas bastante elevadas, porque su reducción de actividad como el pH disminuye durante la fermentación. Además, estas lactasas no son adecuadas para la hidrólisis de la lactosa en la leche realizada a alta temperatura, que en algunos casos sería beneficiosa para mantener el recuento microbiano bajo y garantizar de este modo la buena calidad dela leche.
En una realización, la enzima es una lactasa de una bacteria, p. ej. de la familia Bifidobacteriaceae, tal como del género Bifidobacterium tal comola lactasa descrita en el documentoWO 2009/071539.
Materiales y procedimientos
Procedimiento 1
Producción de polipéptido
Los genes sintéticos diseñados para codificar el gen Bifidobacterium bifidum completo (1752 restos) con codones optimizados parala expresión en Bacillus subtilis se adquirieron deGeneART (Regensburg, Alemania) SEC ID Nº 8.
Los mutantes por truncamiento de Bifidobacterium bifidum se construyeron utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores inversos que permitieron la amplificación específica de la región seleccionada del gen sintético,
cebador directo: GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG (deletreo subrayado) (SEQ ID nº: 15).
Cebadores inversos:
Mutante por truncamiento
Secuencia del cebador
BIF917 (SEQ ID nº: 9)
GCGCTTAATTAATTATTATGTTTTTTCTGTGCTTGTTC SEQ ID nº: 16
BIF995 (SEQ ID nº: 10)
GCGCTTAATTAATTACAGTGCGCCAATTTCATCAATCA SEQ ID nº: 17
BIF1068 (SEQ ID nº: 11)
GCGCTTAATTAATTATTGAACTCTAATTGTCGCTG SEQ ID nº: 18
BIF1241 (SEQ ID nº: 12)
GCGCTTAATTAATTATGTCGCTGTTTTCAGTTCAAT SEQ ID nº: 19
BIF1326 (SEQ ID nº: 13)
GCGCTTAATTAATTAAAATTCTTGTTCTGTGCCCA SEQ ID nº: 20
BIF1478 (SEQ ID nº: 14)
GCGCTTAATTAATTATCTCAGTCTAATTTCGCTTGCGC SEQ ID nº: 21
El gen sintético se clonó en el vector de expresión pBNspe Bacillus subtilis utilizando las secuencias de restricción únicas SpeI y PacI (figura 1) y los plásmidos aislados se transformaron en la cepa BG3594 de Bacillus subtilis . Los transformantes se volvieron a rayar en placas LB que contenían 10 μg/ml de neomicina como selección.
5 Se preparó un precultivo en medio LB que contenía 10 μg/ml de neomicina y se cultivó durante 7 horas a 37ºC y agitación a 180 rpm. Se utilizaron 500 μl de esta precultivo para inocular 50 ml de medio modificado de Grant que contenía 10 μg/ml de neomicina, dejando cultivar durante 68 horas a 33ºC y agitando a 180 rpm.
Las células se lisaron por adición directamente a los medios de cultivo de 1 mg/ml de Lisozima (Sigma-Aldrich) y 10 U/ml deconcentraciones finales deBenzonasa (Merck) y seincubaron durante1 hora a 33ºC a 180 rpm. Los lisados
10 sepurificaronporcentrifugacióna10.000xgdurante20minutosyposteriormentesefiltrarondeformaestéril.
El mediomodificado deGrant se preparó según las siguientes instrucciones:
ParteI (Autoclave)
Soytone 10 g
Llevar a 500 ml por litro
ParteII
K2HPO41M 3ml Glucosa 75 g Urea 3,6 g 10XMOPS de Grant 100 ml Llevar a 400 ml por litro
Se preparó la parte I (2% p/p de Soytone) y se sometió al autoclave durante 25 minutos a 121ºC. La parte II se preparó y semezcló con la parte 1 y el pH se ajustó a pH a 7,3 con HCl/NaOH.
15 ElvolumensellevóavolumencompletoyseesterilizóatravésdeunfiltroPESde0,22μm. Se preparó 10 x tampón MOPS según las siguientes instrucciones:
83,72 g Tricina 7,17 g Píldoras de KOH 12 g NaCl 29,22 g K2SO4 0,276 M
10 ml MgCl2 0,528 M 10ml 100XMicronutrientesdeGrant Llevar a aprox. 900 ml con agua y disolver. Ajustar el pH a 7,4 con KOH, llenar hasta 1 l y esterilizar la solución a
través del filtro PES de 0,2 μm. Se preparó 100 x Micronutrientes según las siguientes instrucciones:
Citrato sódico·2H2O CaCl2·2H2O FeSO4·7H2O MnSO4·H2O ZnSO4·H2O
1,47 g 1,47 g 0,4 g 0,1 g 0,1 g
CuCl2·2H2O CoCl2·6H2O Na2MoO4·H2O
0,05 g 0,1 g 0,1 g
Disolver y ajustar el volumen a 1 l con agua. La esterilización fue a través de un filtro PES de 0,2 μm. El almacenamiento fue a 4°C evitando la luz.
Método 2
Purificación y preparados enzimáticos
La cepa enzimática filtrada se concentró utilizando un dispositivo de ultrafiltración VivaSpin con un límite del PM de 10 kDa (Vivaspin 20, Sartorius, lote nº 12VS2004) y el concentrado se cargó en una columna de desalado PD10 (GE Healthcare, lote nº 6284601) y se eluyó en Tris-HCl 20 mM, pH 8,6. La cromatografía se realizó manualmente en unsistema FPLC de Äkta (GE Healthcare). Se cargaron 4 ml de la muestra desalada, que contenía aproximadamente 20 mg de proteína en una columna HyperQ de 2 ml (HyperCel™, Q sorbent) equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 8,6 a un caudal de 1 ml/min. La columna se lavó en profundidad con 30 VC (volúmenes de columna) de tampón de lavado y la β-galactosidasa unida se eluyó con un gradiente largo de 100 CV en Tris-HCl 20 mM, pH 8,6 NaCl 250 mM. Las impurezas restantes en la columna se eliminaron con una elución en una etapa utilizando Tris-HCl 20 mM, pH 8,6 NaCl 500 mM. En la proteína en el flujo a través y elución se analizó la actividad de β-galactosidasa y por SDS-PAGE.
Se utilizaron geles de SDS-PAGE con el gel Bis-Tris 4-12% NuPage® Novex de Invitrogen 1,0 mm, 10 pocillos (Cat nº NP0321box), patrón previamente teñido See-Blue® Plus2 (Cat nº LC5925) y tampón corriente NuPAGE® MES SDS (Cat nº NP0002) según el protocolo del fabricante. Los geles se tiñeron con Simply Blue Safestain (Invitrogen, Cat #nº LC6060) (figura 2).
Método 3
Medición de la actividad β-galactosidasa
La actividad enzimática se midió utilizando el sustrato 2-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) (Sigma N1127) disponible en el mercado.
ONPG sin receptor
100 mM KPO4 pH 6,0
12,3 mM ONPG
ONPG enriquecido con receptor
100
mM KPO4 pH 6,0
20
mM Celobiosa
12,3
mM ONPG
Solución STOP
10% de Na2CO3
Se añadieron 10 μl de series de dilución de enzima purificada en pocillos de placas de microvaloración que contenían 90 μl de tampón ONPG con o sin receptor. Las muestras se mezclaron y se incubaron durante 10 min a 37ºC, posteriormente se añadieron 100 μl de solución STOP a cada pocillo para terminar la reacción. Las mediciones de absorbancia se registraron a 420 nm en un dispositivo Molecular Device SpectraMax platereader controlado por el paquete de programa informático Softmax.
La relación de actividad de transgalactosilación se calculó de laforma siguiente:
(Abs 420+Celobiosa / Abs 420-Celobiosa) *100 , Relación de actividad detransgalctosilación =
para diluciones en las quela absorbancia estaba comprendida entre 0,5 y 1,0 (figura 3).
Método 4
Determinación de la actividad de LAU
Principio:
El principio de este método analítico es que la lactasa hidroliza 2-o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) en 2-onitrofenol (ONP) y galactosa a 37°C. La reacción se interrumpe con el carbonato sódico y el ONP liberado se mide en espectrofotómetro o colorímetro a 420 nm.
Reactivos:
Tampón MES pH 6,4 (MES 100 mM pH 6,4, CaCl2 10 mM): Disolver 19,52 g de hidrato de MES (Pm: 195,2 g/mol, Sigma-Aldrich nº M8250-250G) y 1,470 g de dihidrato de CaCl2 (Pm: 147,01 g/mol, Sigma-Aldrich) en 1.000 ml de H2Odd, ajustar el pH a 6,4 con NaOH 10 M. Filtrar la solución a través de filtro de 0,2 μm y almacenar a 4°C hasta 1 mes.
Sustrato ONPG pH 6,4 (ONPG 12,28 mM, MES 100 mM pH 6,4, CaCl2 10 mM): Disolver 0,370 g de 2-o-nitrofenil-βD-galactopiranósido (ONPG, Pm: 301,55 g/mol, Sigma-Aldrich nº N1127) en 100 ml de tampón MES pH 6,4 y almacenar en la oscuridad a 4ºC durante unmáximo de 7 días.
Interrumpir el reactivo (10% de Na2CO3): Disolver 20,0 g de Na2CO3 en 200 ml de H2Odd, filtrar la solución a través de filtro de 0,2 μm y almacenar a T.A. hasta 1 mes.
Procedimiento:
Se hicieron series de dilución de la muestra enzimática en el tampón MES a pH 6,4 y se transfirieron 10 μl de cada dilución de muestra a los pocillos de una placa de microvaloración (formato de 96 pocillos) que contenía 90 μl de sustrato ONPG de pH 6,4. Las muestras semezclaron y se incubaron durante 5 min a 37°C usando un Thermomixer (Comfort Thermomixer, Eppendorf) y posteriormente se añadieron 100 μl de reactivo Stop a cada pocillo para terminar la reacción. Se construyó un blanco usando tampón MES de pH 6,4 en lugar de la muestra enzimática. El aumento de la absorbancia a 420 nm se midió con un lector ELISA (SpectraMax platereader, Molecular Device) frente al blanco.
Cálculo de la actividad enzimática:
Se determinó el coeficiente de extinción molar de 2-o-nitrofenol (Sigma-Aldrich nº 33444-25G) en tampón MES pH 6,4 (0,5998 x 10-6 M-1 x cm-1 ). Se definió una unidad (U) de actividad de lactasa (LAU) como la correspondiente a la hidrólisis de 1 nmol de ONPG por minuto. Utilizando placas de microvaloración con un volumen de reacción total de 200 μl (trayectoria de luz de 0,52 cm), la actividad de lactasa por ml de la muestra de enzima se puede calcular usando la siguiente ecuación:
Cálculo de la actividad específica para BIF917 mostrada en la presentememoria como SEQ ID nº: 1:
Determinación de la concentración de BIF917:
La cuantificación de la enzima diana (BIF917) y los productos de truncamiento se determinaron usando el sistema
5 PAGE sin Criterion Stain (BioRad). Se utilizó gel prefundido 4-20% de Tris-HCl sin tinte de cualquier kD, 18 pocillos (Comb. Nº 345-0418) con un tampón Serva Tris-Glicina/SDS (BioRad cat. nº 42529). Se utilizaron geles con los siguientes parámetros: 200 V, 120 mA, 25 W, 50 min. Se utilizó BSA (1,43 mg/ml) (Sigma-Aldrich, nº de cat. 5000007) como proteina patrón y se utilizó Criterion Stain Free Imager (BioRad) con el programa informático Image Lab (BioRad) para análisis cuantitativo usando intensidad de banda con correlación del contenido de triptófano.
10 La actividad específica LAU de BIF917 se determinó en fermento en bruto (concentrado de ultrafiltración) de dos fermentaciones independientes (como se describe en el método 1) y utilizando 5 diluciones diferentes (véase la tabla 1).
Se encontró que la actividad específica de BIF917 era 21,3 LAU/mg o 0,0213 LAU/ppm.
Tabla 1: Determinación dela actividad específica de BIF917
Identificación de muestras
Enzima Fermentación Factor de dilución Actividad Concentración de proteína (BIF917) Concentración de proteína (BIF917) Actividad específica Actividad específica
LAU/ml
mg/ml ppm LAU/mg LAU/ppm
1
BIF 917 a 5 26,9 1,23 1.232 21,9 0,0219
2
BIF 917 a 10 53,9 2,44 2.437 22,1 0,0221
3
BIF 917 a 10 75,4 3,56 3.556 21,2 0,0212
4
BIF 917 a 20 163,9 7,78 7.778 21,1 0,0211
5
BIF 917 a 30 233,6 11,06 11.065 21,1 0,0211
6
BIF 917 b 5 30,26825 1,34 1.342 22,6 0,0226
7
BIF 917 b 10 55,91536 2,61 2.607 21,4 0,0214
8
BIF 917 b 10 76,96056 3,70 3.697 20,8 0,0208
9
BIF 917 b 20 156,986 7,75 7.755 20,2 0,0202
10
BIF 917 b 30 236,9734 11,45 11.452 20,7 0,0207
Arg
21,3 0,0213
Patrón
0,700976 0,000701
32 5
Ejemplos
Ejemplo 1
Determinación de la actividad de β-galactosidasa de variantes de truncamiento BIF
Se construyeron ocho variantes de truncamiento diferentes: BIF_917, BIF_995, BIF_1068, BIF_1172, BIF_1241, BIF1326, BIF_1400 y BIF_1478 como se describe usando el método 1 y se purificaron como se describe en el método 2 (véase la figura 2).
Se determinó la actividad de β-galactosidasa de todas las variantes de truncamiento en presencia y ausencia de celobiosa usando el método 3 descrito anteriormente.
Resultados
Se calculó la relación de actividad de transgalactosilación ((Abs420+Cellobiose/Abs420-Celobiose) * 100) a partir de la actividad de β -galactosidasa medida para cada variante y se muestra en la figura 3. Las variantes que tienen una longitud de 1.241 restos o menos muestran una relación de actividad de transgalactosilación superior al 100%, lo que indica que estas variantes son predominantemente transgalactosilantes. Las variantes con una longitud de más de 1.241 restos muestran una relación de actividad de transgalactosilación inferior al 100%, lo que indica que estas variantes son predominantemente hidrolíticas. BIF_917 y BIF_995 tienen la proporción mayor de actividad de transgalactosilación alrededor del 250%.
Ejemplo 2
GOS generado en una matriz de yogur
La evaluación de las enzimas BIF en la producción de GOS se probó en una simulación de la aplicación de yogur. Ambos experimentos en lotes con un volumen de 100 μl se realizaron en placas MTP de 96 pocillos usando una mezcla de yogur, consistente en 98,60% (p/v) de leche baja en grasa pasteurizada fresca (Mini-mælk, Arla Foods, Dinamarca) y 1,4% (p/v) de ingrediente de suero de leche Nutrilac YQ-5075 (Arla). Para hidratar completamente Nutrilac YQ-5075, la mezcla se dejó en agitación durante 20 horas y después se añadió fosfato Na 20 mM pH 6,5 para asegurar un pH de 6,5. Esta base de leche se usó pura y se determinó la concentración de lactosa que era de 5,5% (p/v), lo que corresponde a 5,3% (p/p) en esta solución. La siguiente correlación es válida en el presente ejemplo: lactosa al 1% (p/v) = 0,9587% (p/p) de lactosa. Se mezclaron 90 μl de la base de leche con 10 μl de las enzimas purificadas, se sellaron con cinta adhesiva y se incubaron a 43°C durante 3 horas. La reacción se interrumpió con 100 μl de Na2CO3 al 10%. Lasmuestras se almacenaron a -20°C.
Método de HPLC
El análisis cuantitativo de galactooligosacáridos (GOS), lactosa, glucosa y galactosa se realizó por HPLC. El análisis de las muestras se llevó a cabo en un Dionex ICS 3000. Los parámetros del IC fueron los siguientes: Fase móvil: NaOH 150 mM, caudal: Isocrático, 0,25 ml/min, columna: Carbopac PA1, temperatura de la columna: T.A., volumen de inyección: 10 μl, detector: PAD, integración: manual, preparación de la muestra: dilución de 100 veces en agua Milli-Q (0,1 ml de muestra + 9,9 ml de agua) y filtración a través de filtros de jeringuilla de 0,45 μm, cuantificación: áreas de los picos en porcentaje de área del pico del patrón. Se utilizó un jarabe de GOS (Vivanal GOS, Friesland Campina) como patrón para la cuantificación de GOS. En este ejemplo, el término "GOS" se define como galactooligosacáridos con un grado de polimerización (GP) de 3 o superior.
Resultados
La cantidad cuantificada de GOS generada en la base de leche por BIF_917, BIF_995 y BIF_1326 se muestra en la figura 4. Se puede ver que las variantes más cortas BIF_917y BIF_995 tienen una producción de GOS (determinada por una prueba de la T de Student con 95% de confianza) significativamente mayor alrededor del 1,2% (p/v)) en comparación con BIF_1326 que genera menos del 0,1% (p/v).
Ejemplo 3
Modelo de degradación de variantes de truncamiento
Se ordenó una biblioteca que cubría la región entre BIF1230 y BIF1325 de GeneART (Regensburg, Alemania) (véase la tabla 2). Las variantes de truncamiento se produjeron como se describe en el método 1. Los péptidos resultantes se sometieron a análisis SDS_PAGE y se visualizaron con Simply Blue Safestain (Invitrogen, Cat nº LC6060) (figura 5).
Resultados
Sorprendentemente, la mayoría de las variantes se modificaron mediante proteólisis en el caldo final con cantidades variables de banda diana que aparecen al final de la fermentación. Las variantes generaron tres bandas distintas con
intensidades variables que se verificaron mediante espectrometría de masas. Las variantes tienen truncamiento en el terminal C con BIF917 correspondiente a los extremos de la SEQ ID nº: 1, BIF995 correspondientes a los extremos de SEQ ID nº: 2 y BIF1068 correspondientes a los extremos de la SEQ ID nº: 3.
Las bandas de proteínas cortadas del gel (marcadas con flechas en la figura 5) se digieren utilizando tres enzimas 5 diferentes, como preparación para el análisis de espectrometría de masas. La tripsina hidroliza los enlaces peptídicos específicamente en el lado carboxilo de los restos de arginina (R) y lisina (K) excepto cuando una prolina
(P) está en el lado carboxilo. La α-quimotripsina hidroliza enlaces peptídicos específicamente en el lado carboxilo de la tirosina (Y), fenilalanina (F), triptófano (W) y leucina (L) excepto cuando una prolina (P) está en el lado carboxilo. Glu-C escinde preferentemente en el lado carboxilo de glutamilo (E) en tampón de bicarbonato de amonio pH 8, pero
10 tambiénescindeenelladocarboxilodeaspartilo(D)silahidrólisissellevaacaboenuntampóndefosfatopH8.
Con el fin de detectar el terminal C, la proteína de interés se prepara para su análisis utilizando el procedimiento básico de los inventores para caracterización de proteínas (A2963), con un cambio que utiliza 40% de 18O-agua en el tampón de digestión. La teoría es que la escisión proteolítica incorporará tanto 18O-agua como 16O-agua en los péptidos resultantes, que consecuentemente aparecerán como dobletes. El terminal C de la proteína, aunque sólo
15 aparecerá como un único péptido con 16O-agua, ya que no está escindido, sino sólo el "último péptido" a la izquierda de la proteína. De esta manera, el terminal C se cartografía usando análisis MS/MS.
Tabla 2:
Variantes
Nombre
Fragmento de SEQ ID nº: 6 Pocillo
BIF1230
1 1.201 A01
BIF1.231
1 1.202 B01
BIF1232
1 1.203 C01
BIF1233
1 1.204
BIF1234
1 1.205
BIF1235
1 1.206 D01
BIF1236
1 1.207
BIF1237
1 1.208 E01
BIF1238
1 1.209 F01
BIF1239
1 1.210 G01
BIF1240
1 1.211 A02
BIF1241
1 1.212 B02
BIF1242
1 1.213 C02
BIF1243
1 1.214
BIF1244
1 1.215 E02
BIF1245
1 1.216 F02
BIF1246
1 1.217 G02
BIF1247
1 1.218 H02
BIF1248
1 1.219 A03
Variantes
Nombre
Fragmento de SEQ ID nº: 6 Pocillo
BIF1249
1 1.220 B03
BIF1250
1 1.221 C03
BIF1251
1 1.222 D03
BIF1252
1 1.223 E03
BIF1253
1 1.224
BIF1254
1 1.225 F03
BIF1255
1 1.226 G03
BIF1256
1 1.227 H03
BIF1257
1 1.228 A04
BIF1258
1 1.229 B04
BIF1259
1 1.230 C04
BIF1260
1 1.231 D04
BIF1261
1 1.232
BIF1262
1 1.233 E04
BIF1263
1 1.234 F04
BIF1264
1 1.235 G04
BIF1265
1 1.236 H04
BIF1266
1 1.237 A05
BIF1267
1 1.238 B05
BIF1268
1 1.239 C05
BIF1269
1 1.240 D05
BIF1270
1 1.241 E05
BIF1271
1 1.242 F05
BIF1272
1 1.243 G05
BIF1273
1 1.244 H05
BIF1274
1 1.245 A06
BIF1275
1 1.246 B06
BIF1276
1 1.247 C06
BIF1277
1 1.248 D06
Variantes
Nombre
Fragmento de SEQ ID nº: 6 Pocillo
BIF1278
1 1.249 E06
BIF1279
1 1.250
BIF1280
1 1.251 F06
BIF1281
1 1.252 G06
BIF1282
1 1.253 H06
BIF1283
1 1.254 A07
BIF1284
1 1.255
BIF1285
1 1.256
BIF1286
1 1.257
BIF1287
1 1.258 B07
BIF1288
1 1.259
BIF1289
1 1.260 C07
BIF1290
1 1.261 D07
BIF1291
1 1.262
BIF1292
1 1.263 E07
BIF1293
1 1.264
BIF1294
1 1.265
BIF1295
1 1.266 F07
BIF1296
1 1.267 G07
BIF1297
1 1.268
BIF1298
1 1.269 H07
BIF1299
1 1.270 A08
BIF1300
1 1.271 B08
BIF1301
1 1.272 C08
BIF1302
1 1.273 D08
BIF1303
1 1.274 E08
BIF1304
1 1.275 F08
BIF1305
1 1.276 G08
BIF1306
1 1.277 H08
Variantes
Nombre
Fragmento de SEQ ID nº: 6 Pocillo
BIF1307
1 1.278 A09
BIF1308
1 1.279 B09
BIF1309
1 1.280
BIF1310
1 1.281
BIF1311
1 1.282
BIF1312
1 1.283 C09
BIF1313
1 1.284
BIF1314
1 1.285
BIF1315
1 1.286 D09
BIF1316
1 1.287 E09
BIF1317
1 1.288 F09
BIF1318
1 1.289 G09
BIF1319
1 1.290 H09
BIF1320
1 1.291 A10
BIF1321
1 1.292 B10
BIF1322
1 1.293 C10
BIF1323
1 1.294 D10
BIF1324
1 1.295 E10
BIF1325
1 1.296 F10
Ejemplo 4
GOS generados por vía enzimática in situ en base de leche y yogures
En este ejemplo, el término "GOS" se define como galactooligosacáridos con un grado de polimerización (GP) de 3 o superior.
5 La evaluación de la producción de GOS por BIF917 y BIF995 se ensayó mediante aplicación in situ en diferentes yogures al estilo balcánico. La β-glactosidasa se añadió a la base de leche a la vez que la adición de los cultivos de yogur específicos, dando como resultado la reacción de transgalactosilación que se ejecuta junto con el proceso de fermentación del yogur.
Los experimentos iniciales de lotes de yogur (estilo balcánico) se realizaron con una base de leche de 100 ml
10 (mezcla de yogur). La base de leche consistió en 98.60% (p/v) de leche convencional pasterizada fresca (no orgánica) baja en grasa (Mini-mælk 0,5% de grasa, Arla Foods Amba, Dinamarca) y 1,4% (p/v) de ingrediente de suero Nutrilac YQ-5075 (Arla Foods Ingredients, Dinamarca), dando como resultado una concentración de lactosa del 5,5% (p/v), correspondiente a 5,3% (p/p) de lactosa al 1% (p/v) = 0,9587% (p/p) en esta solución). Para hidratar completamente Nutrilac YQ-5075, la mezcla se dejó en agitación suave durante 20 horas a 4ºC. En el experimento
15 inicial se usó un cultivo YO-MIX 485LYO liofilizado consistente en Lactobacillus delbrüeckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus (DuPont Nutrition Biosciences, Dinamarca). Se preparó una dilución inicial del cultivo, añadiendo 10 g de YO-MIX 485LYO a 400 ml de leche UHT convencional (no orgánica) (Let-mælk 1,5% de grasa,
Arla Foods Amba, Dinamarca). Se añadieron 1,43 ml del cultivo diluido por litro de base de leche. 100 ml de base de leche se distribuyeron en botellas con tapa azul de 250 ml yse añadieron enzimas en concentraciones variables (10, 20 y 40 ppm, correspondientes a 0,213, 0,426 y 0,853 LAU como se describe en el método 4) 1% de constitución (v/v) de la mezcla de yogur final. La fermentación con yogur se realizó a 43ºC y terminó después de 10 h por
5 enfriamiento rápido en hielo. Las fermentaciones se realizaron siempre en duplicados y la composición de azúcar/oligosacáridos del yogur se analizó por HPLC el día después de la fermentación (véase el método de HPLC más adelante). Lasmuestras de yogur fermentado se almacenaron siempre a 4°C.
Los resultados del experimento inicial de yogur se muestran en la tabla 3. Puede observarse que el aumento de la dosis de BIF917 o BIF995 de 10 ppm a 40 ppm lleva a un aumento del contenido de GOS y una disminución de la
10 cantidad de DP2 (incluida la lactosa) en el yogur final. La diferencia en el rendimiento de las dos variantes está dentro de la variancia de la determinación por HPLC y se puede concluir que tienen un comportamiento similar dentro delas dosificaciones investigadas.
Tabla 3. Contenido de sacáridos DP2 (principalmente lactosa) yGOS (DP3 +) en un yogur fermentadotratado con dosis crecientes de BIF917 y BID995. Todos los resultados se calculan como un promedio de tres mediciones 15 independientes.
Cantidad p/v% DP2 incl. Lactosa
Patrón Cantidad p/v% GOS (DP3 +) Patrón
Yogur
BIF917_10 ppm 2,191 0,092 1,249 0,051
BIF917_20 ppm
1,296 0,047 1,882 0,056
BIF917_40 ppm
0,970 0,019 2,346 0,047
BIF995_10ppm
2,787 0,139 1,158 0,035
BIF995_20ppm
1,494 0,075 1,649 0,082
BIF995_40ppm
0,931 0,028 2,392 0,063
H20
4,219 0,127 0,000 0,000
Base de leche
5,500 0,156 0,000 0,000
Se preparó un yogur al estilo balcánico con una concentración inicial de lactosa de 7,5% p/v (correspondiente al 7,1% p/p, como lactosa al 1% p/v = 0,9423% p/p en esta solución) para investigar su efecto sobre la concentración de GOS alcanzada en el yogur final. Se aplicó el siguiente procedimiento:
1.
Semezclantodoslos ingredientes en polvo (enumerados en la tabla 4) y lamezcla anhidra se añade a la 20 leche/agua con buena agitación a 4-5°C, se deja hidratar durante 20 horas a 4°C.
2.
La base de leche se precalienta a 65°C (P1)
3.
La base de leche se homogeneiza a 65°C/200 bar
4.
La base de leche se pasteuriza a 95°C durante 6minutos (P3)
5.
La base de leche se enfría a 5°C (K2) 25 Tabla 4. Lista de ingredientes de yogur al estilo balcánico en % (p/p)
Ingredientes en % (p/p)
Nombre del ingrediente
Leche desnatada (Skummet-mælk 0,1% de grasa, Arla Foods Amba, Dinamarca)
93,533
Crema 38% de grasa (Arla Foods Amba, Dinamarca)
1,067
Nutrilac YQ5075 (Arla Foods Ingredients, Dinamarca)
1,400
Ingredientes en % (p/p)
Nombre del ingrediente
Lactosa (Variolac® 992 BG100, Arla Foods Amba, Dinamarca)
3,000
Enzima/H20
1,000
Total%
100
A continuación, la base de leche se calienta a 43ºC (K1). La dilución del cultivo YO-MIX 495 consistente en Lactobacillus delbrüeckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus(DuPont Nutrition Biosciences, Dinamarca) se realizó a la temperatura de fermentación. 250ml de la base de leche se distribuyeron en botellas con tapa azul de 500 ml y se añadieron enzimas en constitución de concentración variable 1% (v/v) de la mezcla final de yogur. El cultivo iniciador, YO-Mix 495, se añadió a una dosis de 20 DCU (Unidades de cultivo Danisco) por 100 litros, donde una DCU es de 100 mil millones de células medidas como unidades formadoras de colonias. Para cada ensayo se prepararon tres muestras. La fermentación se llevó a cabo a pH 4,6 a 43ºC y después se interrumpió por enfriamiento rápido a 5ºC. La composición de azúcar/oligosacáridos en el yogur se analizó por HPLC el día después de la fermentación (véase el método de HPLC más adelante). Las muestras de yogur fermentado se almacenaron siempre a 4°C.
Los resultados del experimento en yogur se muestran en la tabla 5. Se puede observar que una lactosa inicial más alta (7,5% p/v) aumentaba el GOS total generado en el yogur en comparación con el GOS conseguido con 5,5% (p/v) de lactosa inicial, como semuestra en la tabla 3. Se alcanza una concentración final de GOS de 2,954% con la dosis de 50 ppm de BIF917 probada, mientras que se produjo 2,662% de GOS con 25 ppm de BIF917. En comparación, la β-galactosidasa hidrolizante convencional de Kluyveromyces lactis (GODO-YNL2, GODO SHUSEI Co., Ltd., Japón) produjo 0,355% de GOS a una dosis de 25 ppm. Se observó una disminución en la concentración de lactosa de 2.127% en el blanco de yogur, donde se añadió la misma cantidad de H2O en lugar de enzima.
Tabla 5. Contenido de sacáridos DP2 (principalmente lactosa) yGOS (DP3+) en un yogur fermentado tratado con dosis crecientes de BIF917 y β-gal de K. lactis.
Cantidad % p/v DP2 incl. lactosa
Patrón Cantidad % p/v DP3 + (GOS) Patrón
Yogur
BIF917_12,5 ppm 3,295 0,224 1,525 0,197
BIF917_25 ppm
2,090 0,045 2,662 0,003
BIF917_50 ppm
1,395 0,090 2,954 0,202
β-Gal_de K. lactis 25ppm
0,425 0,040 0,355 0,006
H2O
5,431 0,099 0,000 0,000
Base de leche
H2O 7,558 0,265 0,000 0,000
Para probar la influencia de la acidificación en la fermentación del yogur en BIF917 se realizaron estudios de rendimiento con tres cultivos diferentes de YO-mix, todos constituidos por Lactobacillus delbrüeckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus (DuPont Nutrition Biosciences, Dinamarca): YO-MIX 495 con un tiempo relativo de fermentación lenta; YO-MIX 495 con un tiempo relativo de fermentación rápida y YO-MIX 601 con fase log prolongada y una fermentación acidificante fuerte. Todas las fermentaciones se realizaron a 43ºC con la misma cantidad de BIF917 (25 ppm).
Además de ensayar la influencia de la temperatura en el rendimiento de BIF917, la fermentación con YO-MIX 495 y 25 ppm de BIF917 sellevó a cabo a 43ºC, 45ºC y 47ºC.
El siguiente procedimiento se aplicó para producir yogures al estilo balcánico con una concentración inicial de lactosa del 7,5% (p/v) (correspondiente al 7,1% p/p, como 1% p/v de lactosa = 0,9423% p/p en esta solución):
1.
Semezclan todos los ingredientes en polvo (enumerados en la tabla 6) y la mezcla seca se añade a la leche/agua bajo buena agitación a 4-5°C, se deja hidratar durante 20 horas a 4°C.
2.
La base de leche se precalienta a 65°C (P1)
3.
La base de leche se homogeneiza a 65°C/200 bar
4.
La base de leche se pasteuriza a 95°C durante 6minutos (P3)
5.
La base de leche se enfría a 5°C (K2)
6. La base de leche se calienta a 43°C (K1). La dilución de los cultivos YO-MIX 495, 485 y 601 (DuPont Nutrition 5 Biosciences, Dinamarca) se realizó a la temperatura de fermentación.
7.
Se distribuyeron 100 ml de base de leche en botellas con tapa azul de 250 ml y se añadieron enzimas en constitución de concentración variable 1% (v/v) dela mezclade yogur final.
8.
El cultivo iniciador, ya sea YO-Mix 495, 485 o 601 se añadió en una dosis de 20 DCU (Danisco Culture Units) por 100 litros. Para cada ensayo se prepararon tres muestras.
10 9. La fermentación se llevó a cabo a pH 4,6 a 43°C (para estudios de temperatura a 43°C, 45°C y 47°C respectivamente) y después se interrumpió por enfriamiento rápido a 5°C.
10. La composición de azúcar/oligosacáridos del yogur se analizó por HPLC el día después de la fermentación (véase el método de HPLC más adelante). Las muestras de yogur fermentado se almacenaron siempre a 4°C.
Tabla 6. Lista de ingredientes de yogur al estilo balcánico en % (p/p)
Ingredientes en % (p/p)
Nombre del ingrediente
Leche desnatada (Skummet-mælk 0,1% de grasa, Arla Foods Amba, Dinamarca)
93,533
Crema 38% de grasa (Arla Foods Amba, Dinamarca)
1,067
Nutrilac YQ5215 (Arla Foods Ingredients, Dinamarca)
1,400
Lactosa (Variolac® 992 BG100, Arla Foods Amba, Dinamarca)
3,000
Enzima/H20
1,000
Total %
100
15 Los resultados del experimento en yogur se muestran en la tabla 7. Puede observarse que los diferentes cultivos YO-mix, que tienen diferentes perfiles de acidificación, no ejercen ningún efecto significativo sobre el rendimiento final de GOS. Por término medio se genera 3,22% de (p/v) de GOS y la concentración de GOS más alta (3,300%) encontrada en el yogur producida con YO-mix 485 está dentro de la variancia de cuantificación. El cambio en la temperatura de fermentación de 43°C a 45°C y 47°C no cambia significativamente (utilizando una prueba de la T de
20 Studentconlímitesdeconfianzadel95%)lacantidaddeGOSproducidaencualquieradelosyogures:3,258%p/va 43°C, 3,375% p/v a 45°C y 3,236% p/v a 47°C. Por lo tanto, se puede concluir que la acción de BIF917 en las condiciones investigadas son robustas para la generación in situ de GOS en yogur empleando diversas condiciones de cultivo ytemperatura.
Tabla 7. Contenido de DP2, DP3, DP4, DP5, DP6, glucosa ygalactosa en un yogur fermentado tratado con BIF917.
muestra
Dosis de enzima Cultivo de fermentación Temperatura de fermentación Cantidad % p/v Cantidad % p/v Cantidad % p/v Cantidad % p/v Cantidad % p/v Cantidad % p/v Cantidad % p/v Cantidad % p/v
Lactosa
Glucosa galactosa DP3 (GOS) DP4 (GOS) DP5 (GOS) DP6 (GOS) DP3+ (GOS)
Base de leche
7,259 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
yogur
BIF917_25ppm YM 495 43ºC 5,466 0,000 0,448 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
BIF917_25ppm
YM 495 43ºC 1,770 1,368 0,648 2,067 0,793 0,260 0,074 3,194
BIF917_25ppm
YM 485 43ºC 1,860 1,259 0,609 2,065 0,830 0,302 0,103 3,300
BIF917_25ppm
YM 601 43ºC 1,712 1,418 0,832 2,094 0,780 0,248 0,068 3,189
BIF917_25ppm
YM 495 43ºC 1,761 1,344 0,642 2,086 0,813 0,275 0,084 3,258
BIF917_25ppm
YM 495 45ºC 1,838 1,323 0,625 2,128 0,848 0,301 0,099 3,375
BIF917_25ppm
YM 495 47ºC 1,739 1,406 0,722 2,106 0,799 0,257 0,074 3,236
Patrón
Base de leche
0,252 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
yogur
BIF917_25ppm YM 495 43ºC 0,225 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
BIF917_25ppm
YM 495 43ºC 0,075 0,067 0,039 0,080 0,031 0,010 0,002 0,123
BIF917_25ppm
YM 485 43ºC 0,090 0,063 0,015 0,084 0,033 0,012 0,008 0,136
BIF917_25ppm
YM 601 43ºC 0,013 0,014 0,017 0,018 0,010 0,006 0,002 0,037
BIF917_25ppm
YM 495 43ºC 0,042 0,031 0,014 0,046 0,016 0,005 0,001 0,067
BIF917_25ppm
YM 495 45ºC 0,071 0,050 0,013 0,061 0,028 0,012 0,007 0,108
BIF917_25ppm
YM 495 47ºC 0,009 0,015 0,004 0,003 0,002 0,003 0,003 0,011
Método de HPLC
Todos los productos químicos utilizados fueron de calidad analítica. D-(+)-Lactosa (min 99%, nº 17814), D-(+)glucosa (min 99,5%, nº G8270-100G, lote nº 036K0137) y D-(+)-galactosa (min 99 %, nº G0750-25G, lote nº 031M0043V) se adquirieron en Sigma (St. Louis, Mo, EE.UU.). Vivinal GOS Syrup (Prod. nº 502675 Lote nº 649566) se adquirió en Friesland Campina Domo (Amersfoort, Holanda) que contenía 57% de materia seca (MS) de
galactooligosacáridos, 21% de MS de lactosa anhidra, 20% de MS de glucosa anhidra y 0,8% de MS de galactosa anhidra.
Preparación de lamuestra
Todos los patrones: Lactosa, glucosa, galactosa y GOS se prepararon en agua destilada doble (H20dd) y se filtraron a través de filtros de jeringuilla de 0,45 μm. Se preparó un conjunto de cada patrón que oscila en concentración de 10 a 200.000 ppm.
Para evaluar la cuantificación del conjunto de azúcares anterior en una matriz de yogur/leche, los patrones anteriores se inyectaron en una muestra de leche y yogur como referencias internas. Todas las muestras de leche y yogur que contenían β-galactosidasa activa se inactivaron calentando la muestra a 95ºC durante 10 min. Todas las muestras de leche se prepararon en placas de MTP de 96 pocillos (Corning, NY, EE.UU.), se diluyeron al menos 20 veces y se filtraron a través de filtros de placa de 96 pocillos de 0,20 μm antes del análisis (placa de filtro Corning, membrana hidrófila PVDF, NY, EE.UU.). Las muestras que contenían más de 50.000 ppm (5% p/v) de lactosa se calentaron a 30ºC para asegurar una disolución adecuada. Todas las muestras de yogur se pesaron y diluyeron 10 veces en H2Odd antes de la homogeneización de la muestra utilizando af Ultra turrax TP18/10 durante unos minutos (Janke y Kunkel Ika-labortechnik, Bie & Berntsen, Dinamarca). La β-galactosidasa se inactivó por tratamiento térmico y las muestras se diluyeron más en placas de MTP de 96 pocillos filtradas a través de filtros de 0,20 μm antes del análisis (placa filtrante Corning, membrana hidrófila PVDF, NY, EE.UU.). Todas lasmuestras se analizaron en placas de MTP de 96 pocillos selladas con cinta.
Instrumentación
El análisis cuantitativo de galactooligosacáridos (GOS), lactosa, glucosa y galactosa se realizó por HPLC. El análisis de muestras se llevó a cabo en un sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific) equipado con una bomba analítica de doble gradiente DGP-3600SD, un muestreador automático termostatizado WPS-3000TSL, un horno de columna termostática TCC-3000SD y un detector de índice de refracción RI-101 (Shodex, JM Science). El programa informático del sistema de datos de Chromeleon (Versión 6.80, DU10A Build 2826, 171948) se utilizó para la adquisición y análisis de datos.
Condiciones cromatográficas
Las muestras se analizaron por HPLC utilizando una columna de oligosacáridos RSO, Ag+ 4% reticulada (Phenomenex, Holanda) equipado con una columna analítica de protección (Carbo-Ag+ neutral, AJ0-4491, Phenomenex, Holanda) a 70ºC. La columna se eluyó con agua doblemente destilada (filtrada a través de una membrana de celulosa regenerada de 0,45 μm y purgada con gas helio) a un caudal de 0,3ml/min.
Se mantuvo un caudal isocrático de 0,3 ml/min durante todo el análisis con un tiempo total de ejecución de 37 min y el volumen de inyección se ajustó a 10 μl. Las muestras se mantuvieron a 30°C en el compartimiento del muestreador automático termostatizado para asegurar la disolución de la lactosa. El eluyente se controló por medio de un detector de índice de refracción y se realizó la cuantificación se hizo por el área del pico con relación al área del pico del patrón dado. Los picos con un grado de tres o superior (DP3+) en el jarabe Vivinal GOS (Friesland Food Domo, Holanda) se utilizaron como patrón para el análisis cuantitativo de GOS después de la declaración de las producciones sobre el contenido de GOS en el producto.
Lista de secuencias
>SEQ ID Nº: 1 (BIF_917)
>SEQ ID Nº: 2 (BIF_995)
>SEQ ID Nº: 3 (BIF_1068)
>SEQ ID Nº: 4 (BIF_1172)
>SEQ ID Nº: 5 (BIF_1241)
>SEQ ID Nº: 6 (BIF_1326)
>SEQ ID Nº: 7 núcleo catalítico de glucósido hidrolasa de Bifidobacterium bifidum
>SEQ ID Nº: 8 secuencia de nucleótidos que codifica la longitud completa
>SEQ ID Nº: 9 secuencia de nucleótidos que codifica BIF_917
>SEQ ID Nº: 10 secuencia de nucleótidos que codifica BIF_995
>SEQ ID Nº: 11 secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1068
>SEQ ID Nº: 12 secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1172
>SEQ ID Nº: 13 secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1241
>SEQ ID Nº: 14 secuencia de nucleótidos que codifica BIF_1326
>SEQ ID Nº: 15 cebador directo para la generación de las variantes de BIF
GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG
>SEQ ID Nº: 16 cebador inverso para BIF917
5 GCGCTTAATTAATTATGTTTTTTCTGTGCTTGTTC
>SEQ ID Nº: 17 cebador inverso para BIF995
GCGCTTAATTAATTACAGTGCGCCAATTTCATCAATCA
>SEQ ID Nº: 18 cebador inverso para BIF1068
GCGCTTAATTAATTATTGAACTCTAATTGTCGCTG 10 >SEQ ID Nº: 19 cebador inverso para BIF1241
GCGCTTAATTAATTATGTCGCTGTTTTCAGTTCAAT
>SEQ ID Nº: 20 cebador inverso para BIF1326
GCGCTTAATTAATTAAAATTCTTGTTCTGTGCCCA
>SEQ ID Nº: 21 cebador inverso para BIF1478
GCGCTTAATTAATTATCTCAGTCTAATTTCGCTTGCGC
>SEQ ID Nº: 22 Bifidobacterium bifidum BIF1750
>SEQ ID Nº: 23 la secuencia señal de lactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215
10 Vrskklwisllfalaliftmafgstssaqa
Listado de secuencias
<110> DuPont Nutrition BioSciences ApS
<120> Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante
<130> NB40269WOPCT 15 <160> 23
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 887
<212> PRT 20 <213> Bifidobacterium bifidum
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..887
<223> /tipo de molécula ="proteína" /organismo ="Bifidobacterium bifidum" 25 <400> 1
5
<210> <211> <212> <213> 2 965 PRT Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
FUENTE 1..965 /tipo de molécula="proteína" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 2
5
<210> <211> <212> <213> 3 1038 PRT Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
FUENTE 1..1038 /tipo de molécula="proteína" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 3
5
<210> <211> <212> <213> 4 1142 PRT Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
FUENTE 1..1142 /tipo de molécula ="proteína" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 4
5
<210> <211> <212> <213> 5 1211 PRT Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
FUENTE 1..1211 /tipo de molécula ="proteína" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 5
5
<210> <211> <212> <213> 6 1296 PRT Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
FUENTE 1..1296 /tipo de molécula="proteína" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 6
<210> 7
<211> 453
<212> PRT 5 <213> Bifidobacterium bifidum
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..453
<223> /tipo de molécula ="proteína" /nota="Núcleo catalítico de glucósido hidrolasa "/organismo="Bifidobacterium 10 bifidum"
<400> 7
5
<210> <211> <212> <213> 8 5160 ADN Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
fuente 1..5160 /tipo de molécula="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 8
5
<210> <211> <212> <213> 9 2661 ADN Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
fuente 1..2661 /tipo de molécula="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 9
5
<210> <211> <212> <213> 10 2895 ADN Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
fuente 1..2895 /tipo de molécula ="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400>
10
5
<210> <211> <212> <213> 11 3114 ADN Bifidobacterium bifidum
<220> <221>
fuente
75
<222>
1..3114
<223>
/tipo de molécula ="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
<400>
11
5
<210> <211> <212> <213> 12 3426 ADN Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
fuente 1..3426 /tipo de molécula ="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 12
5
<210> <211> <212> <213> 13 3633 ADN Bifidobacterium bifidum
<220> <221> <222> <223>
fuente 1..3633 /tipo de molécula="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
10
<400> 13
5
<210> <211> <212> <213> 14 3888 ADN Bifidobacterium bifidum
81
<220> <221> <222> <223>
fuente 1..3888 /tipo de molécula="ADN" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
5
<400> 14
<210> 15
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..30
<223> /tipo de molécula="ADN" /nota="Cebador de ADN sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 15
ggggtaacta gtggaagatg caacaagaag 30
<210> 16
<211> 35
<212> ADN
<213> secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..35
<223> /tipo de molécula ="ADN" /nota="Cebador de ADN sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 16
gcgcttaatt aattatgttt tttctgtgct tgttc 35
<210> 17
<211> 38
<212> ADN
<213> secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /tipo de moléculas ="ADN" /nota="Cebador de PCR sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 17
gcgcttaatt aattacagtg cgccaatttc atcaatca 38
<210> 18
<211> 35
<212> ADN
<213> secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..35
<223> /tipo de moléculas ="ADN" /nota="Cebador de PCR sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 18
gcgcttaatt aattattgaa ctctaattgt cgctg 35
<210> 19
<211> 36
<212> ADN
<213> secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..36
<223> /tipo de moléculas ="ADN" /nota="Cebador de PCR sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 19
gcgcttaatt aattatgtcg ctgttttcag ttcaat 36
<210> 20
<211> 35
<212> ADN
<213> secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..35
<223> /tipo de moléculas="ADN" /nota="Cebador de PCR sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 20
gcgcttaatt aattaaaatt cttgttctgt gccca 35
<210> 21
<211> 38
<212> ADN
<213> secuencias artificiales
<220>
<221> fuente
<222> 1..38
<223> /tipo de molécula="ADN" /nota="Cebador de PCR sintético" /organismo="secuencias artificiales"
<400> 21
gcgcttaatt aattatctca gtctaatttc gcttgcgc 38
<210> 22
<211> 1720
<212> PRT
<213> Bifidobacterium bifidum
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..1720
<223> /tipo de molécula="proteína" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
<400> 22
<210> 23
<211> 30
<212> PRT 5 <213> Bifidobacterium bifidum
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..30
<223> /tipo de molécula="proteína" /nota="Secuencia señal de lactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum 10 DSM20215" /organismo="Bifidobacterium bifidum"
<400> 23

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido quetiene actividadtransgalactosilante seleccionado del grupo constituido por:
    a.
    un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 980 restos de aminoácidos y
    b.
    un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en donde dicho polipéptido consta comomáximo de 975 restos de aminoácidos.
  2. 2.
    El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 1, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 980 restos de aminoácido.
  3. 3.
    El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID nº: 2, en donde dicho polipéptido consta como máximo de 975 restos de aminoácidos.
  4. 4.
    El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que consiste en la secuencia de aminoácidos dela SEQ ID nº: 1 ola SEQ ID nº: 2.
  5. 5.
    El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polipéptido tiene una relación de actividad de transgalactosilación superior al 100%.
  6. 6.
    Un ácido nucleico que codifica un polipéptido según una cualquiera delas reivindicaciones precedentes.
  7. 7.
    Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 6, o que expresa un polipéptido según cualquiera delas reivindicaciones 1-5.
  8. 8.
    Una célula capaz de expresar un polipéptido según una cualquiera delas reivindicaciones 1-5.
  9. 9.
    Un método para expresar un polipéptido, comprendiendo el método la obtención de una célula según la reivindicación 8 y expresando el polipéptido en la célula, y opcionalmente purificando el polipéptido.
  10. 10.
    Una composición que comprende un polipéptido como se define en una cualquiera de lasreivindicaciones 1-5.
  11. 11.
    Una composición según la reivindicación 10, en la que lacomposición es una composición alimenticia.
  12. 12.
    La composición según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en dondela composición es un producto lácteo.
  13. 13.
    Un método para producir un producto alimenticio mediante tratamiento de un sustrato lácteo que comprende lactosa con un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el sustrato lácteo es cualquier material de leche cruda y/o procesada.
  14. 14.
    El método según la reivindicación 13 para producir un producto lácteo tratando un sustrato lácteo que comprende lactosa con un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el sustrato lácteo es cualquier material de leche en bruto y/o procesada.
  15. 15.
    Un procedimiento para producir galactooligosacáridos, que comprende poner en contacto un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una célula de la reivindicación 8 con una solución láctea que comprende lactosa.
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