FR3034626A1 - Solvant eutectique d'extraction, procede d'extraction par eutectigenese utilisant ledit solvant, et extrait issu dudit procede d'extraction. - Google Patents

Abstract

Solvant eutectique d'extraction de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote caractérisé en ce qu'il est constitué d'un mélange limpide, stable et fluide comprenant : - de la bétaïne ou une forme hydratée de la bétaïne, et - au moins un composé donneur de liaisons hydrogène choisis parmi le groupe des polyols ou des acides organiques, et - de l"eau mais excluant tout sucre et/ou sel d'amine et/ou anion exogènes

Description

1 Solvant eutectique d'extraction, procédé d'extraction par eutectigénèse utilisant ledit solvant, et extrait issu dudit procédé d'extraction D'une manière générale, la présente invention concerne : - un solvant eutectique d'extraction de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote - l'utilisation dudit solvant eutectique d'extraction pour la mise en oeuvre d'un procédé d'extraction de composés biologiques naturels - un procédé d'extraction de composés biologiques naturels tels que les composés phénoliques, utilisant ledit solvant - l'extrait liquide biologique naturel issu de la mise en oeuvre dudit procédé d'extraction - l'utilisation dudit extrait liquide biologique naturel Plus particulièrement, la mise en oeuvre de l'invention est permise par un mélange dosé de bétaïne ou de formes hydratées de la bétaïne, d'au moins un donneur de liaisons hydrogène choisis parmi le groupe des polyols ou le groupe des acides organiques, et de l'eau, en vue de l'obtention d'une synergie d'extraction des composés naturels du matériel biologique utilisé. 1. ART ANTÉRIEUR La bétaïne est une forme triméthylée de glycine découverte pour la première fois dans le jus de betterave à sucre. De par sa structure et ses propriétés physico-chimiques, cette molécule naturelle revêt un intérêt particulier dans le secteur de la cosmétique, de la pharmaceutique, de l'alimentation et de la nutrition/santé. Elle est notamment utilisée pour ses propriétés hydratantes, émollientes et humectantes dans le maintien de la teneur en eau d'un produit cosmétique, mais également dans la préservation d'une balance hydrique optimale de la peau. Cet effet bénéfique résulte d'un positionnement particulier à l'interface des cellules du derme humain. En outre, la bétaïne est un osmolyte naturel qui protège les cellules humaines tout comme celles des plantes - du stress osmotique. Lorsqu'apportée 3034626 2 par l'alimentation ou par supplémentation nutraceutique, cette molécule joue un rôle protecteur au niveau hépatique en permettant une méthylation suffisante de certaines enzymes du foie. Des troubles liés au métabolisme hépatique des lipides ont également été relevés lors d'un apport insuffisant en bétaïne pouvant conduire à une stéatose (Craig, 5 2004.) En marge de son rôle physiologique et technologique, la bétaïne est peu chère (- 10 euros/kg), bio-sourcée et non toxique. C'est un métabolite primaire produit en quantités considérables lors du traitement de la betterave à sucre pour la production de saccharose, représentant jusqu'à 30 % de la mélasse ainsi obtenue. Compte tenu de ces quantités 10 industrielles, des stocks de bétaïne non valorisée ou faiblement valorisée demeurent. Le déglaçage des routes avec du jus de betteraves riche en bétaine obtenus après extraction du sucre est un exemple parmi d'autres de l'emploi de ce composé dans des secteurs à très faible valeur ajoutée. De nouvelles applications sont donc recherchées sur des marchés de niche. La bétaïne est certes valorisée dans la préparation de cocamidopropyl bétaïne, 15 utilisée en cosmétique comme agent tensioactif, mais ce produit chimique est issu d'une synthèse organique. Dans un contexte où l'artificialité est de plus en plus décriée, cette voie de valorisation apparait plus que jamais compromise. Ainsi, les évolutions sociétales, économiques et réglementaires associées aux souhaits des consommateurs d'aller vers plus de naturalité poussent à l'utilisation de substances naturelles dans des procédés peu 20 coûteux en énergie (faible température) et respectueux de l'environnement. Sur ce dernier point, d'ailleurs, un problème connexe souvent rencontré par l'homme de l'art est celui de la thermosensibilité élevée de molécules d'intérêt, au premier rang desquelles les composés naturels contenant des noyaux aromatiques substitués par des groupements hydroxyles (composés phénoliques, alcools, acides et esters phénoliques, 25 flavonoïdes, tannins, stilbènes et terpènes phénoliques). Citons également la partie saccharidique des saponines et des triterpènes ainsi que les systèmes insaturés conjugués des terpènes et des caroténoïdes qui s'isomérisent ou s'oxydent au-delà de 60-70 °C. Une caractéristique essentielle de la bétaïne est la combinaison d'une fonction ammonium quaternaire avec un acide carboxylique, lesquels sont particulièrement bien 30 adaptés à la solubilisation et à l'extraction de substances polaires ou amphiphiles, notamment par formation de liaisons hydrogène et/ou ioniques avec le soluté à extraire. Dans une approche guidée par les principes de la chimie verte et de l'éco-extraction, il serait 3034626 3 avantageux de pouvoir l'utiliser à la fois comme principe actif et comme fluide extractant en mélange avec d'autres constituants. À notre connaissance, il n'existe aucune application de la bétaïne pour l'extraction de substances naturelles à intérêt cosmétique, pharmaceutique, ou nutritionnelle, tels que les composés phénoliques, les antioxydants, les saponines, les 5 caroténoïdes, les terpènes ou autres, pour la bonne raison que la bétaine existe sous forme solide à température ambiante et qu'elle ne permet d'extraire aucune substance naturelle du fait de son état physique. Des progrès récents en chimie montrent cependant qu'un solide peut être amené à l'état liquide lorsqu'il est formulé de façon précise en mélange avec un ou plusieurs autres 10 composés spécifiques dans les proportions idoines. C'est notamment le cas des solvants eutectiques profonds qui sont des mélanges de composés présentant des points de fusion beaucoup plus bas que ceux de leurs constituants pris isolément. Ils tirent leur nom du grec « eutektos » signifiant « qui fond bien », terme qui fut employé pour la première fois par le physicien anglais Guthrie en 1884. Ces solvants, décrits par Abbott et al. dans le document 15 EP 1 324 979, sont généralement liquides à température ambiante, alors même qu'ils sont constitués de composés solides lorsqu'ils sont considérés séparément. Ce phénomène de dépression des points de fusion par la formation d'un mélange eutectique serait dû à l'établissement de liaisons hydrogène inter-moléculaires, ce qui aurait pour effet d'augmenter le volume de vide entre les espèces chimiques et donc d'accroitre leur mobilité 20 jusqu'à les rendre liquides. Ces dernières années, une attention particulière a été portée à l'utilisation de substances naturelles pour entrer dans la composition de ces solvants eutectiques, alors appelés solvants eutectiques profonds naturels. Ils sont constitués d'acides organiques, d'acides aminés, de sucres, de polyols, de choline et d'urée (Choi et al., 2011). Ces 25 substances naturelles sont des constituants idéaux pour préparer des mélanges eutectiques en raison de leur abondance dans la biomasse, de leur grande diversité structurale, de leur biodégradabilité, de leur faible toxicité, de leur comestibilité pour la plupart et de leur naturalité. Ils sont notamment décrits dans les documents de la famille W0201155829. Ces solvants eutectiques naturels présentent néanmoins un certain nombre 30 d'inconvénients pour leur utilisation au niveau industriel. Citons en premier lieu l'emploi concomitant de sucres et d'acides aminés, lesquels sont connus de l'homme de l'art pour former des composés odoriférants et colorés issus du brunissement non enzymatique. De 3034626 4 tels extraits ne répondent pas aux nécessités industrielles des marchés cosmétique, pharmaceutique, alimentaire et nutraceutique. Bien que des sucres puissent être utilisés sans être nécessairement combinés avec des amines, ou vice versa, le matériel biologique est susceptible d'apporter le partenaire ici des sucres, là des amines, permettant d'initier la 5 réaction de brunissement non enzymatique et empêchant par la même l'utilisation des extraits ainsi obtenus pour la formulation de produits de consommation. D'autre part, les constituants des mélanges eutectiques naturels décrits dans la famille de brevet W0201155829 peuvent ne pas toujours convenir du point de vue réglementaire. C'est notamment le cas de la choline et de ses dérivés qui sont interdits en cosmétique d'après le 10 règlement européen N°1223/2009. À quoi s'ajoute que dans l'exemple des mélanges eutectiques formés à partir de sucres, la stabilité microbienne des extraits correspondants n'est généralement pas suffisante pour envisager leur intégration dans des produits de consommation courante stockés pendant un laps de temps suffisamment long pour permettre le développement d'une flore d'altération ou de microorganismes pathogènes.

15 Par ailleurs, nous insistons sur le fait que les mélanges eutectiques sont seulement formés pour des proportions bien précises de constituants définis, ce qui signifie qu'il ne suffit pas de mélanger telle ou telle molécule, fut-elle naturelle, pour obtenir une dépression du point de fusion du mélange, qui soit en outre stable du point de vue de la cristallisation (par stabilité nous entendons au moins une semaine). Enfin, ces solvants présentent 20 l'inconvénient d'être très visqueux à température ambiante (généralement au-dessus de 100 cP). Par exemple, le mélange de chlorure de choline et d'urée (ratio molaire 1 :2) présente une viscosité de près de 500 cP à 30 °C (Abbott et aL, 2003), ce qui n'est pas sans poser problème quant aux rendements d'extraction et rend impossible son utilisation industrielle en tant que solvant d'extraction. Au niveau des interactions moléculaires, cette viscosité 25 élevée est attribuée à la présence d'un réseau de liaisons hydrogène très dense entre les constituants des mélanges eutectiques, réduisant ainsi la mobilité des espèces libres présentes dans ces solvants. Cette viscosité découle aussi de la grosseur des ions (si présents), du faible volume de vide entre les molécules, de l'électrostatisme et des interactions de Van der Waals. Tous ces facteurs réunis constituent un frein à l'utilisation des 30 mélanges eutectiques à des fins d'extraction de substances végétales, car les forces de cisaillement nécessaires pour mettre en mouvement le fluide extractant et pour le faire pénétrer au sein du matériel biologique dont on veut extraire tout ou partie des substances, 3034626 5 ne seront pas suffisantes pour permettre une extraction optimale. En corollaire, la faible mobilité des espèces chimiques au sein du mélange eutectique est problématique pour solubiliser les substances à extraire, conduisant à de faibles rendements d'extraction, à un fort coût énergétique, à des durées d'extraction prolongées et/ou des quantités de solvants 5 importantes. Ainsi, à notre connaissance, il n'existe pas actuellement de solution permettant d'extraire d'un matériel biologique des ingrédients ou principes actifs tels que des composés phénoliques, des antioxydants, des saponines, des caroténoïdes, des terpènes ou autres, à partir de solvants eutectiques fluides et peu visqueux basés sur la bétaïne et dans lesquels 10 cette dernière puisse également jouer un rôle d'ingrédient ou de principe actif (par ingrédient actif nous entendons une substance ayant une action technologique, tandis qu'un principe actif désignera toute substance pouvant exercer une action cosmétique, pharmacologique ou nutritionnelle). 15 2. OBJET DE L'INVENTION La présente invention repose sur la découverte de combinaisons précises comprenant de la bétaïne ou une forme hydratée de la bétaïne, et de l'eau avec au moins un donneur de liaisons hydrogène parmi les acides organiques et/ou les polyols permettant d'obtenir une 20 synergie lors de l'étape d'extraction de composés d'intérêt industriel, de préférence cosmétique, pharmaceutique ou nutritionnel et pouvant être thermosensibles, à partir d'un matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote, et de préférence végétal. Parmi ces composés d'intérêt citons en particulier les composés phénoliques dont les acides et esters phénoliques, les flavonoïdes, les sécoiridoïdes, les stilbènes et les alcools phénoliques, 25 ainsi que les antioxydants, les caroténoïcles, les alcaloïdes, les lipides, les phénylpropanoïdes, les arômes et modificateurs de goût, les parfums, les biocides, les antimicrobiens, les protéines, les enzymes, les colorants, les pigments, les agents tensioactifs et les terpenoïdes comprenant les saponines.

30 Dans un premier temps, l'invention consiste en un solvant eutectique d'extraction de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote constitué d'un mélange limpide, stable et fluide comprenant: 3034626 6 - de la bétaïne ou une forme hydratée de la bétaïne, et au moins un composé donneur de liaisons hydrogène choisis parmi le groupe des polyols ou des acides organiques, et - de l'eau 5 mais excluant tout sucre et/ou sel d'amine et/ou anion exogènes De manière avantageuse, le composé donneur de liaisons hydrogène choisis parmi le groupe des polyols sera : le glycérol, l'érythritol, le mannitol, le sorbitol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, le ribitol, l'aldonitol, le propanediol, ou le pentylene glycol.

10 De manière préférée, le composé donneur de liaisons hydrogène choisis parmi le groupe des acides organiques sera : l'acide lactique, l'acide malique, l'acide maléique, l'acide pyruvique, l'acide fumarique, l'acide succinique, l'acide citrique, l'acide acétique, l'acide aconitique, l'acide tartrique , l'acide ascorbique, l'acide malonique, l'acide oxalique, l'acide glucuronique, l'acide neuraminique, l'acide sialique, l'acide shikimique, l'acide phytique, 15 l'acide galacturonique, l'acide iduronique, l'acide hyaluronique, hydroxycitrique, ou les dérivés lactones. Pour la mise en oeuvre du solvant eutectique d'extraction selon l'invention, le ratio molaire critique bétaïne(ou forme hydratée de la bétaïne):polyols, ou bétaïne(ou forme 20 hydratée de la bétaïne):acicles organiques est compris entre 1:1,5 et 1:3, et est préférentiellement de 1:2. La proportion massique d'eau ajoutée au mélange pour l'obtention du solvant selon l'invention est de 1 à 50 %, et de préférence 15 à 30 %. L'invention a également trait à l'utilisation du solvant eutectique d'extraction pour la mise en oeuvre d'un procédé d'extraction de composés biologiques naturels tels que les 25 composés phénoliques dont les acides et esters phénoliques, les flavonoïdes, les sécoiridoïdes, les stilbènes et les alcools phénoliques, ainsi que les antioxydants, les caroténoïdes, les alcaloïdes, les lipides, les phénylpropanoïdes, les arômes et modificateurs de goût, les parfums, les biocides, les antimicrobiens, les protéines, les enzymes, les colorants, les pigments, les agents tensioactifs et les terpenoïdes comprenant les saponines, 30 à partir de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote, et de préférence à partir de matériel biologique végétal.

3034626 7 La synergie obtenue avec le solvant selon l'invention, procède d'un phénomène physico-chimique naturel que nous qualifions ici pour la première fois d' « eutectigénèse » et qui correspond à la formation d'un mélange eutectique se produisant lorsque les 5 proportions critiques du mélange correspondant au point eutectique sont atteintes. Pour rappel, le point eutectique est le point du diagramme de phase à l'intersection des deux courbes du liquiclus, donnant la composition à laquelle le mélange est à sa température minimale en phase liquide.

10 De façon totalement inattendue, nous avons découvert que la combinaison de trois composés - bétaïne (ou forme hydratée de la bétaïne), donneur de liaisons hydrogène et eau - dans des proportions bien définies, permet d'extraire des substances naturelles de manière synergique. L'absence de l'un d'entre eux est absolument critique puisqu'elle conduit à un effondrement du taux de recouvrement. Cette découverte est d'autant plus 15 significative qu'il n'existait jusqu'alors ni modèle théorique, ni règle empirique, ni mécanisme d'action connu permettant d'inférer ou de prédire une quelconque synergie d'extraction pour des mélanges eutectiques à base de bétaïne. Tout au plus est-il décrit dans la famille de documents W0201155829 que les solvants eutectiques profonds sont souvent formés de deux composés présents dans un ratio équimolaire (1:1). Or, nous montrons dans 20 la suite de ce document que ce point critique est systématiquement atteint pour un ratio molaire bétaïne(ou forme hydratée de la bétaïne):cionneur de liaisons hydrogène de 1:1,5 à 1:3, et préférentiellement 1:2. Ainsi, le point critique du diagramme de phase correspond à la composition critique du mélange extractant pour laquelle le rendement d'extraction en substances naturelles est optimal, ce qu'aucun travail antérieur, à notre connaissance, 25 n'était parvenu à démontrer jusqu'à présent. De plus, le mécanisme de formation des mélanges eutectiques décrit par Abbott et al. (famille de brevet US 7183433; Abbott et al., 2003) postule que la dépression du point de fusion est consécutive à l'établissement d'une liaison hydrogène entre un donneur de liaison hydrogène et l'anion (ion chargé négativement) d'un sel d'amine. Il est surprenant de constater dans les résultats présentés 30 ci-après que nous obtenons une dépression du point de fusion alors qu'aucun anion n'est apporté de manière exogène. C'est une avancée sur le plan des connaissances scientifiques qui tire profit du caractère amphotérique de la bétaïne. Alors qu'un grand nombre d'auteurs 3034626 8 s'encombrent de sels d'amines, en particulier dans les mélanges eutectiques et les liquides ioniques décrits dans le document de la famille US 7183433, les mélanges eutectiques naturels couverts par la présente invention comprennent systématiquement une amine sans anion (apportée de manière exogène), puisque ces derniers ne sont pas nécessaires au 5 mécanisme d'eutectigénèse. Au niveau de la composition d'extraction, l'invention concerne l'ajout d'une proportion massique d'eau exogène (c'est-à-dire apportée et non déjà présente dans le mélange) comprise entre 5 et 50 %, préférentiellement entre 15 et 30 % dans les mélanges binaires 10 bétaine:glycérol et bétaïne:acide lactique, lesquels respectent un ratio molaire critique compris entre 1:1,5 à 1:3, et préférentiellement égal à 1:2, afin d'abaisser la viscosité à un seuil qui soit à la fois compatible avec une utilisation industrielle et avec la dénomination de mélange eutectique. Il est en effet connu de l'homme de l'art que les liaisons hydrogène permettant la formation de complexes supramoléculaires caractéristiques des solvants 15 eutectiques se cassent pour des proportions volumiques en eau supérieures à 50 % (Gutiérrez et aL, 2009). Le procédé d'extraction décrit avec les mélanges ternaires contenant de l'eau, de la bétaine et un donneur de liaisons hydrogène parmi les polyols et les acides organiques conserve le ratio molaire critique d'eutectigénèse 1:1,5 à 1:3, et préférentiellement 1:2 entre la bétene et le donneur de liaisons hydrogène ; ratio qui est 20 générique des mélanges binaires (bétaïne:donneur de liaisons hydrogène) et des mélanges ternaires (eau:bétaïne:donneur de liaisons hydrogène). Une amélioration spectaculaire du taux d'actifs - permettant de multiplier jusqu'à 45 fois le taux de recouvrement - et de la richesse des profils chromatographiques a ainsi été 25 obtenue grâce à différents mélanges eutectiques liquides à température ambiante et basés sur des composés naturels agro- et/ou bio-sourcés disponibles en quantités industrielles comme la bétaïne, les polyols (tel le glycérol) et les acides organiques (tel l'acide lactique) en tant que sous-produits des filières sucrière, de l'oléochimie et de la biotechnologie. Le procédé d'extraction revendiqué consiste en une macération, une percolation, une infusion, 30 entre 20 et 60 °C, à pression atmosphérique ou sous pression, d'un matériel biologique broyé ou non en immersion dans un solvant eutectique sous agitation pendant 1 à 5 heures, de préférence pendant 2 h. La phase d'extraction n'implique aucune transformation 3034626 9 chimique de ces composés qui restent totalement inertes vis-à-vis du matériel biologique et des substances naturelles à extraire, en ce qu'elle ne réagit pas avec eux de manière covalente ; aux températures d'extraction décrites dans cette invention (<60 °C), seules des interactions non covalentes entre les substances naturelles ont lieu.

5 Le procédé d'extraction par eutectigénèse décrit ici a été spécifiquement élaboré pour obtenir une stabilité microbienne optimale sans adjonction de conservateurs exogènes que ce soit au niveau du fluide extractant ou des extraits liquides. Ces derniers obtenus après macération du matériel biologique dans les solvants eutectiques, et une fois les opérations 10 de filtration et de conditionnement réalisées, ont été trouvés stables du point de vue microbiologique malgré la charge microbienne du matériel biologique apportée lors de l'étape initiale d'extraction. Ainsi, les mélanges eutectiques et les extraits obtenus sont-ils exempts d'agents conservateurs qui sont connus par l'homme de l'art comme pouvant exercer, dans certains cas avérés, un effet toxique chez l'homme, notamment en termes de 15 perturbateurs endocriniens. La bonne stabilité microbienne de ces solvants permet d'améliorer de manière indirecte leur innocuité, ce qui est d'autant plus important qu'il aurait semblé antinomique d'utiliser un solvant eutectique non toxique pour ajouter des antimicrobiens potentiellement toxiques au final.

20 Le procédé d'extraction de composés biologiques naturels selon l'invention comprendra donc les étapes suivantes : a. Immersion sous agitation d'un matériel biologique broyé ou non dans le solvant d'extraction selon l'invention puis b. macération ou percolation ou infusion à une température comprise entre 25 20 et 60 °C, du mélange obtenu puis c. Filtration du produit d'extraction obtenu en b. ce par quoi on obtient un extrait liquide biologique naturel issu du matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote 30 Le procédé d'extraction selon l'invention est particulièrement remarquable en ce qu'il exerce une action synergique sur le processus d'extraction du matériel biologique. En outre, 3034626 10 l'extrait liquide biologique naturel obtenu par la mise en oeuvre dudit procédé d'extraction renforce l'activité biologique et/ou physicochimique des composés compris dans ledit extrait. À titre d'exemple, les résultats obtenus sur les fleurs de cerisier montrent clairement la supériorité des mélanges eutectiques étudiés (comparés à des solvants plus conventionnels 5 tels que des mélanges hydroglycérinés qui sont largement utilisés dans l'industrie cosmétique et aromatique) sur une large gamme d'activité biologiques telles que la photo-protection, la synthèse de collagène, la lutte contre l'inflammation (voie du TNFa), ou bien encore, l'inhibition de la libération de métallo protéinases matricielles de type 1 (MMP-1) après stimulation UV (protection contre le photo-vieillissement). Nous pouvons également citer la 10 forte inhibition de la synthèse de mélanine (effet hypo-pigmentant) exercée par les extraits eutectiques de fleurs de safran, de criste-marine et de rose de Jéricho (environ 55, 33 et 36 %, respectivement) comparés à leurs homologues hydroglycérinés dénués de toute activité. Par ailleurs, l'inhibition du TNFOE (réponse anti-inflammatoire) pour les extraits eutectiques de prêle, ainsi que leurs activités antioxydantes, sont bien supérieures à celles des extraits 15 hydroglycérinés de la même plante. C'est également le cas du romarin dont l'extraction utilisant des solvants eutectiques à base de bétaïne induit une activité antioxydante supérieure d'un facteur 2 aux extraits issus d'un procédé employant un mélange massique eau:glycérol (1:1). De plus, les exemples montrent que la synthèse de collagène sur modèle fibroblastique ainsi que la photo-protection sont meilleures avec les extraits eutectiques de 20 feuilles d'olivier comparés aux extraits hydroglycérinés. Nous avons découvert que ces activités biologiques et/ou physico-chimiques renforcées par l'utilisation de solvants eutectiques à des fins extractives étaient relativement bien corrélées aux profils chromatographiques correspondants. En effet, les profils obtenus par extraction eutectique sont généralement « inatteignables » par des solvants plus 25 traditionnels. Les profils ne différèrent pas seulement en termes quantitatifs, sur la teneur spécifique de telle ou telle molécule, mais bien plus significativement de manière qualitative : si la plupart des molécules habituellement extractibles par des solvants conventionnels sont présentes dans les extraits eutectiques, ces derniers, en revanche, renferment de nouvelles substances actives absentes des extraits hydroglycérinés. À titre d'exemples, citons le cafféoyl 30 glucoside, l'acide chlorogénique et l'acide dicafféoylquinique identifiés pour la première fois grâce aux solvants eutectiques dans les fleurs de cerisier, ainsi que les isomères de 3034626 11 kaempférol-3-O-lactyl-sophoroside chez la fleur de safran. Ces nouveaux phyto-actifs confèrent aux extraits eutectiques des propriétés renforcées pour celles déjà connues (qu'il s'agisse de propriétés biologiques ou physico-chimiques), mais ils permettent surtout d'ouvrir de nouvelles voies de valorisation des extraits pour des activités inédites à forte valeur 5 ajoutée. Par exemple, l'acide dicafféoylquinique découvert dans la présente invention dans les extraits eutectiques de fleurs de cerisier est un inhibiteur sélectif et très efficace du virus de type 1 de l'immunodéficience humaine (VII-I-1) impliqué dans l'étiologie du syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA (Robinson et aL, 1996).

10 L'invention vise également l'utilisation dudit extrait liquide pour la fabrication d'une composition nutraceutique, d'un produit diététique ou alimentaire chez l'humain ou l'animal, d'un complément nutritionnel, d'un parfum ou d'un arôme, d'une composition pharmaceutique, oenologique ou cosmétique, destinée à une administration par voie orale ou parentérale, ou à une application par voie topique, rectale, nasale, auriculaire, vaginale et/ou 15 oculaire. Les données présentées dans ce document montrent que la formulation d'extraits liquides eutectiques dans l'eau, par exemple, permet d'obtenir un niveau d'activité biologique et/ou physico-chimique élevée entre 0,001 et 10 %, préférentiellement entre 0,01 et 1 % (y). Un certain nombre des extraits eutectiques revendiqués dans la présente invention exercent une activité plus élevée que celle de leurs homologues hydroglycérinés, quand bien même ces 20 derniers seraient dix fois plus concentrés dans la formulation liquide finale. D'autres compositions de fluides extractants montrées dans le Tableau 4 ont été testées, lesquelles conduisent généralement à la formation d'un mélange cristallisant à température ambiante, à froid ou à chaud, ce qui rend impossible toute extraction à partir 25 d'un quelconque matériel biologique. Par ailleurs, des essais avec l'acide citrique démontrent également la difficulté d'obtenir des mélanges eutectiques extractants et stables à partir de bétene. Le Tableau 3 permet d'observer l'influence de la composition du mélange binaire bétaine:acide citrique sur l'aspect macroscopique du milieu. Si un ratio molaire de 50:50 ou 40:60 permet de retarder la formation d'une phase cristalline après une 3034626 12 semaine par rapport au ratio 20:80, notons toutefois qu'il ne s'agit pas de conditions aptes à envisager un développement industriel. Enfin, nous démontrons dans cette invention qu'un grand nombre de mélanges 5 eutectiques généralement présentés comme potentiellement intéressants d'un point de vue industriel, et comportant souvent des sucres mais pas seulement, se colore en jaune, orange, marron ou brun à 50 °C, polymérise, se trouble ou cristallise (Tableau 4). Un faible nombre de mélanges reste liquide et transparent pendant plus d'un mois à 4 °C, température ambiante et 50 °C; les mélanges ternaires bétaïne:glycérol:eau (2:3, molaire 10 plus 25 % massique d'eau) et bétaïne:acide lactique:eau (2:3, molaire plus 25 % massique d'eau) font partie des fluides qui n'ont, par eux-mêmes, aucun impact sur la couleur des formulations à finalité cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire. Autrement dit, ne viendra s'ajouter à la coloration déjà apportée par l'extraction de substances colorantes d'un matériel biologique, aucune charge colonelle intrinsèque du fluide extractant.

15 En définitive, les extraits liquides obtenus par l'application du procédé d'extraction par eutectigénèse revendiqué dans la présente invention possèdent une teneur en composés d'intérêt accrue par rapport à des solvants plus conventionnels comme l'eau ou les mélanges hydroglycérinés communément utilisés dans l'industrie cosmétique, nutraceutique et pharmaceutique. Qui plus est, ces mélanges eutectiques peuvent faire aussi bien, voire 20 mieux, que des technologies d'extraction intensifiée de pointe utilisant l'eau subcritique par exemple. En outre, les extraits eutectiques obtenus sur un grand nombre de matériels biologiques ont un potentiel applicatif en tant que photo-protecteurs, agents de lutte contre le photo-vieillissement, hypo-pigmentants et agents blanchissants, anti-âge, antioxydants, 25 antiradicalaires, réducteurs d'espèces réactives de l'oxygène, inhibiteurs de la libération de métalloprotéinases, anti-inflammatoires, apaisants cutanés, activateurs de la synthèse de collagène, hydratants ou restaurateurs de la fonction barrière de la peau. Du fait de la capacité d'extraction des dits solvants eutectiques, de nouvelles propriétés biologiques émergent des matériels biologiques extraits. Notons plus 30 particulièrement l'activité découverte sur l'extrait eutectique de fleurs de cerisier en tant qu'agent cosmétique, nutraceutique et/ou alimentaire ayant des propriétés protectrices sur le photo-vieillissement. Pour rappel, les radiations lumineuses de longueur d'onde comprise 3034626 13 entre 280 et 400 nm sont connues de l'homme de l'art pour induire le brunissement de l'épiderme humain. Ceux compris entre 280 et 320 nm (UV-B) provoquent des érythèmes et des brûlures cutanées nuisant au bronzage naturel. Enfin, les rayons UV-A compris entre 320 et 400 nm entraînent une altération de la peau se manifestant par une perte d'élasticité et 5 l'apparition d'un vieillissement prématuré, notamment via la dégradation de la matrice extra-cellulaire. Une forte demande de moyens de contrôle de ces désagréments existe donc pour des raisons esthétiques et sanitaires. L'extrait de fleurs de cerisier décrit dans la présente invention est capable d'agir (i) en tant qu'agent de contrôle de la réaction inflammatoire induite par le rayonnement UV, (ii) en tant qu'inhibiteur de la dégradation de 10 la matrice extra-cellulaire après exposition UV, (iii) ainsi qu'en tant que protecteur de la viabilité cellulaire des cellules exposés aux UV. Enfin, comme il s'agit de solvants eutectiques comestibles et non toxiques, l'extrait correspondant pourra être directement formulable dans des aliments et des boissons (chez l'humain ou l'animal), ainsi que dans des produits cosmétiques, nutraceutiques, 15 cosméceutiques, oenologique, aromatiques (parfums et arômes) et pharmaceutiques dans des proportions d'incorporation dans le produit fini variant de 0,001 à 20 %, préférentiellement de 0,01 à 10 % et idéalement de 0,05 à 5 %. Des extraits liquides enrichis en composés d'intérêt en solution dans un mélange eutectique pourront également être consommé directement par voie orale, parentérale ou appliqué par voie topique, rectale, 20 nasale, auriculaire, vaginale et/ou oculaire. 3. MATÉRIEL ET MÉTHODES 3.1. Préparation des solvants eutectiques 25 Les différents constituants des mélanges eutectiques (glycérol, acide lactique, acide citrique et bétaïne) sont pesés dans un erlenmeyer sans ordre particulier. De l'eau communale, mais préférentiellement de l'eau déminéralisée ou distillée, est ensuite ajoutée à la concentration massique permettant de préserver l'intégrité physico-chimique et 30 microbienne entre 1 et 50 %, préférentiellement entre 15 et 35 % et idéalement représentant 25 % massique du mélange. Les mélanges eutectiques choisis dans le présent document sont bétaïne:acide citrique (2:3, mol), bétaïne:glycérol (2:3, mol) et bétaïne:acide 3034626 14 lactique (2:3, mol), chacun contenant 25 % massique d'eau. L'ensemble est chauffé à 50 °C +/- 2 °C et homogénéisé sous agitation magnétique. Lorsque le milieu est totalement dissous et fondu, il est mis à température ambiante puis conditionné jusqu'à utilisation. 5 3.2. Extraction solide/liquide par macération à 50 °C Les différentes matrices végétales préalablement séchées sont broyées (broyeur manuel IKA), à l'exception du romarin, puis immergées dans un solvant conventionnel (eau, eau/glycérol, eau/acide lactique, eau/acide citrique) ou eutectique (cf. section 3.1). Un ratio 10 de 5 % de matrice végétale (20 M) a été appliqué pour toutes les extractions. L'ensemble est chauffé à 50 °C pendant 2 h sous agitation magnétique dans un bécher de 100 mL en verre. Une seule passe est réalisée, après quoi le milieu est filtré à chaud sur poche filtrante ou filtre plaque 25 pm puis de nouveau sur un filtre plaque 5-7 gm. 15 3.3. Intensification de l'extraction par eau subcritique La matrice végétale préalablement séchée est broyée (broyeur manuel IKA) puis immergée dans l'eau à l'intérieur d'un réacteur de 150 mL en verre. Un ratio de 5 % de matrice végétal (20 M) a été appliqué pour les extractions. Pour homogénéiser la 20 température, le réacteur est environné d'eau distillée (700 mL) et est introduit dans une cavité à microondes. L'extraction est réalisée par l'intermédiaire d'un réacteur microonde à hautes performances (1,2 kW, UltraClave, Milestone, Italy). Avant de débuter l'extraction, l'oxygène est éliminé par une mise sous vide, puis l'ambiance du réacteur et le milieu d'extraction sont saturés en azote à une pression initiale de 30 bars. La pression et la 25 température de consigne sont atteintes grâce aux flux d'azote et au chauffage microonde, respectivement. La température d'extraction est fixée à 125 °C et la pression initiale à 30 bars. Ces deux grandeurs sont contrôlées par des capteurs externes. Lorsque la température atteint la valeur de consigne 125 °C (en 15 minutes dans nos expériences), l'extraction est réalisée durant 30 min en une seule passe. Une fois l'extraction terminée, le milieu est filtré 30 à chaud sur poche filtrante ou filtre plaque 25 pm puis de nouveau sur un filtre plaque 5-7 p.m. 3034626 15 3.4. Quantification des composés d'intérêt par chromatographie liquide haute performance (HPLC) Les extraits liquides ainsi obtenus sont directement analysés par HPLC sans 5 concentration ou séchage préalable. 3.4.1. Dosage de l'acide rosmarinique dans les extraits liquides de romarin La quantification et l'identification de l'acide rosmarinique sont réalisées à partir d'un 10 standard analytique (Extrasynthèse - référence : 49575) et de la réalisation d'une courbe de calibration. L'appareillage HPLC Agilent 1100 est équipé d'un détecteur UV-Visible DAD ou équivalent. Un gradient d'élution est utilisé via un mélange d'acétonitrile de grade HPLC et d'eau de grade HPLC additionné d'acide trifluoroacétique 99 % (TFA). Les conditions chromatographiques suivantes sont utilisées : 15 Colonne Zorbax Eclipse XDB C18, 1.8 gm, 4.6 mm x 50 mm ou équivalent. Phase mobile : Temps (min) % acétonitrile 0.1% TFA % eau 0.1% TFA 0 15 85 2 15 85 2,5 18 82 2,7 100 0 3,5 100 0 - Débit : 2 mL/minute 20 - Détection : 328 nm - Temperature : 60 °C Volume d'injection : 2 pl 3034626 16 Pression : 210 bars ± 5 bars Les temps de rétention suivants sont observés : Composé Temps de rétention (minute) Acide rosmarinique 2,0 3-glucuronide lutéoline 2,3 5 3.4.2. Dosage de l'oleuropéine dans les extraits liquides de feuilles d'olivier : La quantification et l'identification de l'oleuropéine sont réalisées à partir d'un standard analytique (Extrasynthèse - référence : 0204) et de la réalisation d'une courbe de calibration. L'appareillage HPLC Agilent 1100 est équipé d'un détecteur UV-Visible DAD ou 10 équivalent. Un gradient d'élution est utilisé via un mélange d'acétonitrile de grade HPLC et d'eau de grade HPLC additionné d'acide trifluoroacétique 99 % (TFA). Les conditions chromatographiques suivantes sont utilisées : Colonne Zorbax Eclipse XDB C18, 1.8 11m, 4.6 mm x 50 mm ou équivalent. 15 - Phase mobile : Temps (min) % acétonitrile + 0.1% TFA % eau + 0.1% TFA 0 20 80 2,6 20 80 2,7 100 0 3,5 100 0 Débit : 1,5 mL/minute Détection : 230 nm 3034626 17 Temperature : 40 °C Volume d'injection : 2 jiL Pression : 210 bars ± 5 bars Les temps de rétention suivants sont observés : Composé Temps de rétention (minute) Oleuropéine 2,6 3.5 Caractérisation chimique des extraits liquides par chromatographie liquide haute 10 performance Les conditions chromatographiques ci-dessous ont été mises en oeuvre afin d'identifier et quantifier les composés présents dans les différents extraits réalisés. - Colonne analytique : Atlantis T3 150 x 4.6mm C18 - 5 um ou équivalent 15 - Température : 30 °C - Débit : 0,6 mijmin - Pression : 60-100 bars - Détection : selon les composés à quantifier - 350 ou 280 nm. - Volume d'injection : 7 III 20 - Phase mobile : A : Acétonitrile:H20 (450/50 v:v) + 0,1 % acide acétique B: H20 + 0,1% acide acétique Temps (min) Solvant A (%) Solvant B (%) 5 5 95 15 5 95 20 70 30 30 80 20 25 3.6. Test de stabilité Après obtention des mélanges eutectiques, leur évolution dans le temps est suivi à trois températures différentes (4 °C, température ambiante, 50 °C) afin d'apprécier leur - 5 3034626 18 impact dans une formulation par exemple à usage cosmétique. En effet, dans un contexte industriel, un extrait doit être capable de conserver son intégrité colonelle au cours d'un procédé industriel ainsi qu'au cours de son usage par les consommateurs. 5 3.7. Test d'efficacité physico-chimique en tant qu'antioxydant La capacité des extraits à piéger les peroxyradicaux est déterminée en utilisant la méthode de référence publiée par Ou et al. (2013) au journal officiel de l'AOAC. Pour rappel, l'AOAC est l'Association of Official Agricultural Chemists du Département d'Agriculture des 10 États-Unis (USDA). Toutes les solutions de tampon phosphate (pH 7,2) contenant les concentrations désirées d'antioxydants (de 0 à 40 pM) sont préparées extemporanément. Cinquante millilitres de chaque solution sont transférés grâce à une pipette multi-canaux dans une microplaque de 96 puits Fluotrac (Greiner). Chaque puits est ensuite complété avec 100 pl_ de solution de tampon phosphate, pH 7,2, contenant 0,126 MM de sel disodique 15 de fluorescéine. Pour améliorer la répétabilité, la microplaque est préchauffée à 37°C sous agitation orbitale à 1200 rpm dans un agitateur thermostaté (PHMT Grant Instruments Ltd, Shepreth, Angleterre) pendant 20 min. Par la suite, 50 gi. de solution d'AAPH en solution tampon phosphate fraîchement préparée sont ajoutés grâce à une pipette multi-canaux. Finalement, chaque puits contient 200 gl. de mélange final composé de 0,063 M de sel 20 disodique de fluorescéine, 12,7 mM d'AAPH et des concentrations croissantes d'antioxydants (de 0 à 10 MM) en solution de tampon phosphate. La chute de fluorescence à 515 nm (Xex : 490nm) est immédiatement enregistrée. Les mesures sont réalisées chaque min pendant 2 h à 37 ± 0,1°C avec 5 sec d'agitation avant chaque mesure avec un lecteur de microplaque. Les résultats sont alors calculés selon Ou et al. (2001) en gmoi d'équivalent 25 Trolox par g d'extrait liquide (valeur ORAC). 3.8. Tests d'efficacité biologique L'ensemble des tests d'efficacité a été réalisé pour des concentrations non 30 cytotoxiques selon chaque type cellulaire mis en oeuvre. 3.8.1. Activité anti-inflammatoire (inhibition du TNFa) 3034626 19 Le test in vitro d'activité anti-inflammatoire est basé sur la forte réponse inflammatoire que les kératinocytes sont capables d'induire après exposition solaire. Les cellules HaCaT (Human immortalizecl keratinocytes, Life-technology, N° P612451, Lot. 5 09543), avec un repiquage inférieur à 50, ont été utilisées. Les cellules ont été mises en culture dans le milieu cellulaire suivant: DMEM avec L-glutamine (Dulbecco's Minimum Essential Medium, PAN BIOTECH. Lot 97487) supplémenté en pénicilline (100 IU/mL) et streptomycine (100 ilg/mL ; PAN BIOTECH, Lot 20145241), ainsi qu'avec 10 % de sérum de veau foetal inactivé 10 (PAN BIOTECH, Lot P440011), pH 7,2. Un contrôle négatif à l'aide d'une solution saline (HBSS, SIGMA), ainsi qu'un contrôle positif au dexaméthasone à 10 gM, ont été mis en place. 1.10s cellules/mL (500 g/puits) sont mis en culture dans des plaques de culture 48 15 puits et incubés à 37 °C (5 % CO2) pendant 24 h. À la fin de cette période d'incubation, les cellules sont mises en culture avec un milieu sans sérum contenant les extraits à tester pendant 1 heure précédant la stimulation UV. L'irradiation est réalisée à l'aide d'un simulateur Suntest CPS+ (Atlas Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) équipé d'une lampe au xénon (1100 W). L'irradiance est fixée à 750 W/m2 avec une dose de 20 lumière combinée de l'ordre de 15 m.1/cm2 pendant 1 min. Les cellules sont ensuite remises en culture durant 24 h. À la suite de cette période d'incubation, le surnageant de culture est récupéré afin de doser le TNF-alpha libéré par les cellules. Pour cela, le kit ELISA RAB068 Human TNF-alpha (SIGMA-ALDRICH) a été mis en oeuvre. Les densités optiques (DO) de chaque puits sont alors 25 mesurées à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (TECAN). Les résultats obtenus sont ensuite comparés au puits non traité afin d'exprimer le gain de protection par rapport au contrôle positif (en %) : Gain de protection = Moyenne DO contrôle positif - Moyenne DO contrôle négatif 30 3.8.2. Activité d'inhibition de la mélanogénèse (effet hypo-pigmentant) 100 - 100 * (Moyenne DO puit test - Moyenne DO contrôle négatif) 3034626 20 Le modèle biologique mis en place pour ce test est le type cellulaire NHEM-LP (pour mélanocyte humain, légèrement pigmenté). Ces cellules sont mise en culture à 37 °C et 5 % de CO2 dans du milieu M254 supplémenté en HMGS-2 (sans PMA), en insuline (5 pig/mL), en 5 pénicilline (50 pg/mL), en streptomycine (50 pg/mL) et en gentamycine (25 ug/mL). Dans un premier temps, les concentrations non cytotoxiques des extraits eutectiques testés ont été évaluées. Pour cela, différentes durées d'incubation ont été testées. À la suite de ces stimulations successives, les cellules NHEM-LP ont été incubées avec le MU (sel de tétrazolium), qui est réduit en cristaux bleus de formazan par l'enzyme mitochondriale 10 succinate déshydrogénase. La densité optique après dissolutions des cristaux de formazan par le DMSO est mesurée à l'aide d'un lecteur micro-plaque (VERSAmax, Molecular Devices). Les mélanocytes sont mis en culture dans des plaques 24 puits pendant 24 h. Le milieu est changé après 24 h et remplacé par du milieu ayant (ou non) été préalablement stimulé. Le contrôle positif consiste en une stimulation des cellules par de l'acide lipoïque (5 ptg/mL) 15 en présence de L-tyrosine (1mM). Un contrôle (puits non stimulé) est également présent sur la plaque. Les cellules sont ensuite incubées pendant 10 jours avec un renouvellement de deux traitements après 3 et 7 jours d'incubation. À la fin de l'incubation, les surnageants sont retirés et la quantification de la synthèse de mélanine a lieu sur les couches cellulaires. Pour cela, la mélanine est extraite par lyse cellulaire utilisant une solution de NaOH à 0,5 N.

20 La densité optique est ensuite mesurée à 405 nm. La quantification est réalisée via une courbe de calibration préalablement validé selon un standard (courbe standard de 0,39 à 1001.1g/mL). Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule suivante : Moyenne du contrôle stimulé - Condition test inhibition (%)= x 100 Moyenne du contrôle stimulé - Moyenne du contrôle non stimulé 25 3.8.3. Effets photo-protecteurs Le test d'évaluation in vitro de l'effet photo-protecteur est utilisé afin d'identifier des composés ou extraits ayant des propriétés photo-protectrices sur la viabilité cellulaire de cellules exposées à une dose cytotoxique d'irradiations solaires.

30 Deux protocoles ont été mis en oeuvre: 3034626 21 Pré-traitement des cellules avec l'extrait à tester avant exposition à l'irradiation solaire _ Post-traitement des cellules avec l'extrait après exposition à l'irradiation solaire 5 La cytotoxicité est mesurée 24 h après exposition à l'aide du rouge neutre qui est un colorant cationique faible pénètrant les membranes cellulaires et s'accumulant dans les lysosomes intracellulaires. Ce test in vitro a été mis en oeuvre sur une lignée cellulaire de kératinocytes HaCaT (Human immortalized keratinocytes, Life-technology, N° P6110401, Lot. 091006) avec un repiquage inférieur à 50. Les cellules ont été mises en culture dans le milieu 10 suivant: DMEM avec L-glutamine (Dulbecco's Minimum Essential Medium, PAN BIOTECH. Lot 5530513) supplémenté en pénicilline (100 IU/mL) et streptomycine (100 ptg/mL ; PAN BIOTECH, Lot 9230112), ainsi qu'avec 10 % de sérum de veau foetal inactivé (PAN BIOTECH, Lot P290907), pH 7.2.

15 Un contrôle négatif à l'aide d'une solution saline (HBSS, SIGMA), ainsi qu'un contrôle positif Trolox (SIGMA) - concentrations de 10, 20 et 50 gg/m1-, ont été mis en place. 1.105 cellules/mL (500 ilL/puits) sont mis en culture dans des plaques de culture 48 puits et incubés à 37 °C (5 % CO2) pendant 24 h. Dans le protocole de pré-traitement, le 20 milieu de culture est remplacé par 100 pil_ de solution saline contenant l'extrait à différentes concentrations, en contact avec les cellules pendant 1 h à 37 °C (5 % CO2). À la fin de cette période d'incubation, la stimulation est retirée pour être remplacée par 100 'il_ d'HBSS. L'irradiation est ensuite réalisée à l'aide d'un simulateur Suntest CPS+ (Atlas Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) équipé d'une lampe au xénon (1100 W). L'irradiance 25 est fixée à 750 W/m2 avec une dose de lumière combinée de l'ordre de 20 mi/cm' pendant 4 min. Les cellules sont ensuite remises en culture durant 18-22 h dans le milieu de culture habituel. Dans le protocole de post-traitement, le milieu de culture est remplacé par 100 gL de solution saline HBSS. L'irradiation est ensuite réalisée à l'aide d'un simulateur Suntest CPS+ (Atlas Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) équipé d'une lampe au 30 xénon (1100 W). L'irradiance est fixée à 750 W/m2 avec une dose de lumière combinée de l'ordre de 20 mi/cm2 pendant 4 min. Les cellules sont ensuite stimulées à l'aide des extraits à différentes concentrations non cytotoxiques et remises en culture durant 18-22 h dans le milieu de culture habituel.

3034626 22 Dans les deux protocoles, après 18-22 h d'incubation, les cellules sont lavées puis placées dans un milieu contenant 50 pg/mL de rouge neutre et incubées à 37 oc et 5 % CO2 pendant 3 h. Le milieu est ensuite retiré pour laver les cellules et éliminer l'excédent de rouge neutre. Une solution décolorante (50 % éthanol, 1 % acide acétique, 49 % eau distillée ; 50 jil par 5 puits) est ajoutée aux cellules. Les plaques 48 puits sont ensuite agitées durant 15-20 min à température ambiante dans l'obscurité. Le degré de dommage membranaire des cellules (augmentation de la libération du rouge neutre) est mesuré à 540 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (TECAN). Les densités optiques (DO) de chaque puits sont alors mesurées. Les résultats obtenus sont ensuite comparés au puits non traité (HBSS, 10 100% viabilité cellulaire) afin d'exprimer le gain de protection par rapport contrôle positif (en %) : Gain de protection (%) = % viabilité cellulaire du puit test - % viabilité cellulaire du puit irradié 15 3.8.4. Inhibition de la libération de métalloprotéinase matricielle de type 1 (effet protecteur contre le photo-vieillissement) Les métalloprotéinases matricielles de type 1 sont des collagénases interstitielles impliquées dans divers mécanismes physiologiques de remodelage tissulaire. Entre autres, 20 elles sont responsables de la rupture de l'architecture et de l'organisation tissulaire cutanée en réponse aux UV dans le photo-vieillissement. Le test in vitro anti-MMP-1 est basé sur la capacité des kératinocytes à libérer des MMP-1 suite à une stimulation par UV. Les cellules HaCaT (Human immortalized 25 keratinocytes, Life-technology, N° P6110401, Lot. 091006), avec un repiquage inférieur à 50, ont été mises en culture dans le milieu cellulaire suivant : DMEM avec L-glutamine (Dulbecco's Minimum Essential Medium, PAN B1OTECH. Lot 97487) supplémenté en pénicilline (100 IU/mL) et en streptomycine (100 1.1g/mL ; PAN B1OTECH, Lot 20145241), ainsi qu'avec 10 % de sérum de veau foetal inactivé (PAN BIOTECF1, Lot P440011) 30 à pH 7,2. Un contrôle négatif à l'aide d'une solution saline (HBSS, SIGMA), ainsi qu'un contrôle positif d'acide ascorbique (251.1M), ont été mis en place. 3034626 23 1.105 cellules/mL (500 .il/puits) sont mis en culture dans des plaques de culture 48 puits et incubés à 37 °C (5 % CO2) pendant 24 h. À la fin de cette période d'incubation, les cellules sont mises en culture avec un milieu sans sérum contenant les extraits à tester pendant 1 h précédant la stimulation UV. L'irradiation est réalisée à l'aide d'un simulateur 5 Suntest CPS+ (Atlas Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) équipé d'une lampe au xénon (1100 W). L'irradiance est fixée à 750 W/m2 avec une dose de lumière combinée de l'ordre de 15 ni/cm' pendant 1 min. Les cellules sont ensuite remises en culture durant 24 h. À la suite de cette période d'incubation, le surnageant de culture est récupéré afin de 10 doser le MM P-1 libéré par les cellules. Pour cela, le kit ELISA RayBio Human MMP-1 (SIGMA- ALDRICH) a été employé. Les densités optiques (DO) de chaque puit sont alors mesurées à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaque Infinite M200 Pro (TECAN). Les résultats obtenus sont ensuite comparés au puits non traité afin d'exprimer le gain de protection en % par rapport au contrôle positif : 15 100 - 100 * (Moyenne DO puit test - Moyenne DO contrôle négatif) Gain de protection = Moyenne DO contrôle positif - Moyenne DO contrôle négatif 3.8.5. Activation de la synthèse de collagène Le collagène est une protéine structurelle majeure de la matrice extra-cellulaire jouant 20 un rôle dans le maintien de l'intégrité de la peau en lui donnant, notamment, sa longévité, sa densité et en jouant sur son apparence pour une peau saine et jeune. Le test de mesure du collagène permet de quantifier le collagène soluble de la matrice extra-cellulaire synthétisé au sein des cellules cutanées traitées avec les extraits à évaluer. Le collagène est détecté via le test Sircol (Biocolor, UK), utilisant ainsi le pouvoir de coloration et liaison du Sirius Red sur 25 les résidus d'hydroxyproline. Des cellules humaines primaires de fibroblastes (Biopredic), avec un repiquage inférieur à 5, ont été mises en culture dans le milieu suivant : DMEM avec de la L-glutamine (Dulbecco's Minimum Essential Medium, PAN BIOTECH. Lot 5842156) supplémenté en pénicilline (100 IU/mL) et streptomycine (100 ug/mL ; PAN 30 BIOTECH, Lot 9870214), ainsi qu'avec 10 % de sérum de veau foetal inactivé (PAN BIOTECH, Lot P342518) à pH 7,2.

3034626 24 Un contrôle négatif à l'aide d'une solution saline (HBSS, SIGMA), ainsi qu'un contrôle positif d'acide ascorbique (50 pg/mL), ont été mis en place. 5.105 cellules/mL (1000 pL/puits) sont mis en culture dans des plaques de culture 24 puits et incubés à 37 °C (5 % CO2) pendant 24 h jusqu'à confluence. À la fin de cette période 5 d'incubation, les cellules sont mises en culture dans un milieu sans sérum contenant les extraits à tester pendant 72 h à différentes concentrations. Le protocole de détection par la méthode Sircol est ensuite mis en oeuvre. Plus précisément, le milieu de culture est recueilli pour être centrifugé avec 100 41 de polyéthylène glycol dans un tampon TRIS-HCI (pH 7,6) puis incubé une nuit entre 0 et 4 °C. Les échantillons sont ensuite centrifugés à 12000 tr/min 10 pendant 10 min afin de recueillir les surnageants pour y ajouter 1 ml de réactif colorant Sircol. Après agitation pendant 30 min à température ambiante, les tubes sont de nouveau centrifugés à 12000 tr/min pendant 10 min. Après élimination du surnageant, 750 111 d'un réactif contenant un mélange d'acide acétique/chlorure de sodium/détergent sont ajoutés. Après une nouvelle centrifugation, le surnageant est éliminé pour y ajouter 250 pl d'un 15 réactif alcalin (hydroxyde de sodium à 0,5 M). Après agitation, 200 pl de chaque puits sont transférés dans une microplaque 96 puits afin de mesurer les absorbances à 555 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (TECAN). Les résultats obtenus sont ensuite comparés au puit non traité afin d'exprimer le gain de protection par rapport au contrôle positif (en %) : 20 Gain de collagène(%) = 100 . (Moyenne DO puit test - Moyenne DO contrôle négatif) - (Moyenne DO contrôle positif - Moyenne DO contrôle négatif) Moyenne DO contrôle positif - Moyenne DO contrôle négatif 4. EXEMPLES Les réalisations décrites ci-après constituent des exemples intéressants, bien que 25 nullement limitatifs, de réalisation et de mise en oeuvre du solvant, du procédé et de l'extrait selon l'invention.

3034626 25 II doit être retenu que ces exemples montrent une synergie d'extraction pour un ratio bétaïne:donneur de liaisons hydrogène de 2:3. Toutefois, lorsque les valeurs obtenues sont arrondies aux entiers, le ratio 2:3 devient 1:2.

5 Exemple 1. Criticité du ratio molaire du mélange binaire bétaïne:acide lactique Tableau L Aspect visuel des mélanges binaires bétaïne:acide lactique en fonction du ratio molaire Bétaï Ac. Limpidité ne (%) lactique (%) 70 30 Formation immédiate d'un précipité 60 40 Formation immédiate d'un précipité 50 50 Formation de cristaux après une semaine 40 60 Liquide et limpide 30 70 Liquide et limpide 20 80 Formation de cristaux après un jour 10 Lorsque l'on fait varier les proportions molaires de bétaïne et d'acide lactique, on observe une étroite plage de composition entre 40:60 et 30:70 %, respectivement, pour laquelle le mélange est limpide. En deçà et au-delà de ce seuil, le mélange présente les 15 caractéristiques des milieux instables avec formation de cristaux immédiatement après mélange (ratios molaires bétaïne:acide lactique de 70:30, 60:40 et 50:50) ou après une semaine de stockage à température ambiante (ratio 20:80). Il est intéressant de constater que cette plage de composition correspond exactement à l'apparition d'une dépression maximale du point de fusion sur le diagramme de phase du mélange (Figure 1). Cette 20 dépression maximale (ou point eutectique) est dû au phénomène complexe de l'eutectigénèse dont le mécanisme d'action n'a jamais été élucidé à notre connaissance pour les mélanges de bétaïne et de donneurs de liaisons hydrogène. Nous pouvons néanmoins avancer l'hypothèse que des assemblages supramoléculaires se formant par l'établissement 3034626 26 de liaisons hydrogène et/ou ionique entre la bétaïne et l'acide lactique permettent de réarranger le réseau de molécules en augmentant le volume de vide. La figure 1 est un diagramme de phase binaire entre la bétaïne monohydrate et l'acide lactique (donneur de liaison hydrogène). Les proportions sont données en % molaires. Cette figure montre 5 clairement que l'eutectigénèse apparait pour un ratio bétaïne:acide lactique d'environ 33:66, ce qui implique qu'une molécule de bétaïne interagit de manière non covalente avec deux molécules d'acide lactique. On comprend ainsi qu'un ratio s'éloignant de cet équilibre conduise à la déstabilisation du mélange et à une augmentation considérable du point de fusion. À des fins extractives, il est donc nécessaire d'utiliser des mélanges molaires 10 précisément compris entre 50:50% et 30:70 %, préférentiellement entre 40:60 et 30:70 % de bétaïne et d'acide lactique, respectivement. Ces ratios molaires présentent des points de fusion compris entre la température ambiante et - 40 °C et sont préférentiellement liquides et limpides à température ambiante et à 50 °C, ce qui est un prérequis pour leur utilisation en tant que fluide extractant.

15 Exemple 2. Criticité du ratio molaire du mélange binaire bétaïne:glycérol Tableau 2. Aspect visuel des mélanges binaires bétene:glycérol en fonction du ratio molaire 20 Bétaine 00 Glycérol VO Aspect visuel 70 30 Formation immédiate d'un précipité puis cristallisation 60 40 Formation immédiate d'un précipité puis cristallisation 50 50 Formation immédiate d'un précipité puis cristallisation 40 60 Liquide et limpide 30 70 Liquide et limpide 20 80 Liquide et limpide 3034626 27 L'observation macroscopique des mélanges bétaïne:glycérol à différents ratios molaires montre qu'un minimum de 60 % de glycérol est nécessaire pour obtenir un mélange limpide qui puisse être utilisé en extraction solide/liquide (Tableau 2). Les ratios 5 molaires bétaïne:glycérol 70:30, 60:40 et 50:50 conduisent tous à la formation immédiate de particules solides visibles à l'oeil nu, lesquelles déstabilisent le milieu pour rapidement cristalliser. Ces résultats sont par ailleurs confirmés par le diagramme de phase de ce mélange qui laisse apparaitre un point eutectique pour un ratio bétaïne:glycérol de 40:60 respectivement (Figure 2). La Figure 2 est un diagramme de phase binaire entre la bétaïne 10 monohydrate et le glycérol (donneur de liaison hydrogène). Les proportions sont données en % molaires. La criticité de l'eutectigénèse pour former un mélange limpide n'est pas fortuite et résulte probablement - comme dans l'exemple 1 - d'assemblages supramoléculaires caractéristiques des mélanges eutectiques qui ne peuvent se former que dans des rapports quantitatifs précis entre les espèces moléculaires en jeu. Dans l'exemple présenté ici, une 15 molécule de bétaine monohydrate interagit avec deux molécules de glycérol, comme le montre la Figure 2. L'ajout de 60 % de glycérol permet finalement d'abaisser le point de fusion de la bétaïne et d'obtenir un mélange eutectique liquide jusqu'à - 40 °C. Exemple 3. Absence de criticité du ratio molaire du mélange binaire bétaïne:acide 20 citrique Tableau 3. Aspect visuel des mélanges binaires bétaïne:acide citrique en fonction du ratio molaire Bétaine (%) Ac. citrique (%) Limpidité 70 30 Formation de cristaux après une semaine 60 40 Formation de cristaux après une semaine 50 50 Formation de cristaux après une semaine 40 60 Formation de cristaux après une semaine 30 70 Formation de cristaux après une semaine 20 80 Formation immédiate de cristaux 3034626 28 Au contraire des mélanges présentés dans les exemples 1 et 2, les mélanges binaires bétaïne:acide citrique ne présentent aucune criticité au regard du ratio molaire et de l'aspect macroscopique. Comme on peut s'en apercevoir sur le Tableau 3, pratiquement toutes les plages de composition du mélange conduisent à des milieux instables cristallisant 5 après une semaine. Leur emploi à des fins d'extraction à systématiquement abouti à la prise en masse soit du mélange seul, soit du mélange avec le matériel biologique, ou même encore de l'extrait liquide après filtration. La Figure 3 est un diagramme de phase binaire entre la bétaïne monohydrate et l'acide citrique (donneur de liaison hydrogène). Les proportions sont données en % molaires. Cette figure montre néanmoins qu'un abaissement 10 du point de fusion est obtenu sur une large plage de composition par rapport aux constituants purs pris isolément. lis répondent de ce fait à l'un des critères essentiels des mélanges eutectiques. Cet exemple illustre non seulement la difficulté d'obtenir des mélanges eutectiques stables à partir de la bétaïne, mais il établit aussi que tous les solvants eutectiques ne sont pas adaptés à l'extraction solide/liquide contrairement à ce qui est 15 souvent avancé dans la littérature. Exemple 4. Essai d'obtention et étude de stabilité à 50 °C de quelques mélanges eutectiques 20 La mise en stabilité, notamment à 50 °C, a permis de mettre en avant l'instabilité et la détérioration de certains mélanges eutectiques, par exemple ceux comprenant au moins un sucre parmi le glucose, le fructose, le saccharose et leurs mélanges.

3034626 29 Tableau 4. Suivi de stabilité de mélanges eutectiques comprenant au moins un sucre Mélanges eutectiques (ratio molaire) Aspect visuel lors de la formation Aspect visuel après 1 semaine à 50 °C Aspect visuel après 2 semaines à 50°C Saccharose/glycine/eau - / / (1:1:6) ; (1:1:10) Fructose/glycine/eau / / (1:1:4) ; (2:1:10) Fructose/chlorure de choline/eau (1:1:4) + - - Fructose/acide citrique/eau (1:1:6) + --- Fructose/acide lactique/eau (1:1:6) + -- --- Saccharose/ chlorure de choline/eau (1:1:10) / / + : stable, incolore ; - : instable, cristallisation ; : instable, coloration jaune/orange ; -- 5 -: instable, coloration brune Exemple 5. Influence de l'eutectigénèse sur la capacité du mélange ternaire bétaïne:acide lactique:eau à extraire l'acide rosmarinique du romarin Les résultats présentés dans cet exemple mettent clairement en évidence la synergie obtenue suite à la formation du mélange eutectique (Figure 4). La Figure 4 montre le taux de 10 recouvrement d'acide rosmarinique en fonction du fluide extractant constitué d'eau et/ou de bétaïne et/ou d'acide lactique (matériel biologique : romarin ; ratio massique). En particulier, le taux de recouvrement d'acide rosmarinique extrait du romarin en conditions de macération à 50 °C pendant 2 heures en une seule passe est maximal pour le mélange eutectique ternaire bétaine:acide lactique:eau (2:3, mol ; 25 % massique d'eau). Le ratio 15 molaire entre la bétaine et l'acide lactique est ici équivalent à celui pour lequel un eutectique se formait dans l'exemple 1. L'ajout de 25 % d'eau au mélange permet de 3034626 30 maintenir les complexes supramoléculaires responsables de la synergie tout en abaissant considérablement la viscosité du mélange pour faciliter le procédé d'extraction. Des extractions témoins à l'eau et avec des mélanges binaires eau/bétaïne et eau:acide lactique (réalisées dans les mêmes conditions et avec la même concentration massique en bétaïne ou 5 en acide lactique) démontrent par ailleurs que la synergie est seulement obtenue lorsque le romarin est mis en présence du mélange eutectique. Ce dernier permet une amélioration spectaculaire du rendement d'extraction de l'acide rosmarinique d'environ 47, 31 et 2.5 fois par rapport à l'eau et aux mélanges eau:bétaine et eau:acide lactique, respectivement.

10 Exemple 6. Influence de l'eutectigénèse sur la capacité du mélange ternaire bétaïne:glycérol:eau à extraire l'acide rosmarinique du romarin L'exemple 6 met en évidence la synergie obtenue avec le mélange eutectique ternaire de bétaïne et de glycérol (à raison d'un ratio molaire 2:3) avec 25 % massique d'eau sur le 15 taux d'acide rosmarinique extrait à partir du romarin en conditions de macération à 50 °C pendant 2 heures (Figure 5). La Figure 5 montre le taux de recouvrement de l'acide rosmarinique en fonction du fluide extractant constitué d'eau et/ou de bétaïne et/ou de glycérol (matériel biologique : romarin ; ratio massique). Le ratio molaire entre la bétaïne et le glycérol est équivalent à celui pour lequel un eutectique se formait dans l'exemple 2.

20 L'ajout de 25 % d'eau au mélange permet de maintenir les complexes supramoléculaires responsables de la synergie tout en abaissant considérablement la viscosité du mélange pour faciliter le procédé d'extraction. Par ailleurs, des extractions témoins à l'eau et avec des mélanges binaires eau/bétaïne et eau:glycérol (réalisées dans les mêmes conditions et avec la même concentration massique en bétaïne ou en glycérol) démontrent que la synergie est 25 seulement obtenue lorsque le romarin est mis en présence du mélange eutectique. Ce dernier permet une amélioration spectaculaire du rendement d'extraction de l'acide rosmarinique d'environ 22 fois par rapport à l'eau et de 15 fois par rapport aux mélanges eaulétaine et eau:glycérol, respectivement.

30 Exemple 7. Comparaison des profils chimiques et de l'activité antioxydante d'extraits de romarin obtenus en utilisant un mélange ternaire bétaïne:acide lactique:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvant d'extraction 3034626 31 La Figure 6 montre les profils chromatographiques (LC/UV, 230 nm) des extraits liquides de romarin (tracé noir : solvant eutectique ; tracé gris : eau :glycérol ; composés 1: non identifié ; 2: Ac. Rosmarinique, 3: Lutéoline-3-0-glucuronide, 4: Isomère de lutéoline-3'- 5 (4"-acétylgiucuronide) ; 5: Rosmanol, 6: Carnosol, 7: Carnosate de méthyle). Comme le montre la Figure 6, le profil de l'extrait de romarin obtenu avec le mélange eutectique bétaïne:acide lactique:eau est beaucoup plus riche en diterpènes (141 vs. 8 pg/mL), en composés phénoliques (850 vs. 232 gen) et en acide rosmarinique (340 vs. 3 gg/mL) que celui des extraits hydroglycérinés. Conséquemment, les extraits eutectiques enrichis en 10 composés d'intérêt, notamment en antioxydants polyphénoliques, présentent une activité antioxydante bien supérieure aux extraits hydroglycérinés (Figure 7 : capacités antioxydantes des extraits liquides de romarin exprimées en valeur ORAC (gmol Troloe eq/g d'échantillon) pour Oxygen Radical Absorbance Capacity). Cette activité a été déterminée en utilisant un test de référence de mesure du pouvoir antioxydant (i.e. la méthode ORAC pour 15 Oxygen Radical Absorbance Capacity). Soulignons, entre autre, la présence d'acide rosmarinique en forte concentration dans l'extrait eutectique de romarin considéré (bétaïne:acide lactique:eau). Cette molécule présente la particularité structurale de posséder deux noyaux catéchols (ortho-diphénols) qui sont des structures moléculaires optimales au regard de l'activité antioxydante en ce 20 qu'elles favorisent l'établissement d'une liaison hydrogène intramoléculaire entre les hydroxyles phénoliques. Aussi, nous avons montré (Tableau ci-après) que le passage à l'échelle industrielle de ce procédé d'obtention d'extraits eutectiques était possible et donnait, par ailleurs, des résultats comparables à ceux observés avec le procédé à l'échelle du laboratoire, ce qui 25 constitue un critère important quant à la reproductibilité du procédé revendiqué dans la présente invention. Batch Ac. Rosmarinique Total diterpènes Phénoliques (gg/mL) (gg/mL) (lig/mi) Eau:glycerol (50:50 ; w:w) 2.7 8.1 232.1 Bétaine:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) (échelle labo) 399.8 141.3 849.8 3034626 32 Bétaïne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) (échelle indus) 327.8 156.6 784.2 Enfin, ces différents résultats montrent le potentiel des extraits eutectiques de romarin pour des applications cosmétiques, alimentaires (alimentation humaine et animale), pharmaceutiques, ou encore nutraceutiques, en tant qu'agents antioxydants.

5 Exemple 8. Influence de l'eutectigénèse sur la capacité du mélange ternaire bétaine:glycérol:eau à extraire l'oleuropéine des feuilles d'olivier Les résultats présentés dans cet exemple mettent en évidence la synergie obtenue 10 suite à la formation du mélange eutectique entre la bétaine et le glycérol (à raison d'un ratio molaire 2:3) avec 25 % massique d'eau (Figure 8 : taux de recouvrement de l'oleuropéine en fonction du fluide extractant constitué d'eau et/ou de béteine et/ou de glycérol ; matériel biologique : feuilles d'olivier ; ratio massique). Le ratio molaire bétaïne:glycérol est équivalent à celui pour lequel un eutectique se formait dans l'exemple 2. L'ajout de 25 % 15 d'eau au mélange permet de maintenir les complexes supramoléculaires responsables de la synergie tout en abaissant considérablement la viscosité du mélange pour faciliter le procédé d'extraction. Par ailleurs, des extractions témoins avec des mélanges binaires eau:bétaïne (65:35, massique) et eau:glycérol (60:40, massique), bien que réalisées dans les mêmes conditions et les mêmes concentrations massiques, démontrent que la synergie est 20 seulement obtenue lorsque les feuilles d'olivier sont mises en présence du mélange eutectique. Ce dernier permet une amélioration spectaculaire du recouvrement en oleuropéine (entre 2,8 et 9 fois) par rapport aux mélanges eau:bétaine et eau:glycérol, et à l'eau, respectivement.

25 Exemple 9. Comparaison de l'eau subcritique et des mélanges eutectiques pour l'extraction d'oleuropéine à partir de feuilles d'olivier Le procédé d'extraction par eutectigénèse a été comparé à une technologie extractive de pointe comme l'eau subcritique qui consiste en une phase aqueuse surchauffée à 125 °C 30 et maintenue liquide par application d'une pression de 30 à 45 bars. La Figure 9 montre le 3034626 33 taux de recouvrement de l'oleuropéine en fonction du fluide et de la technologie d'extraction (matériel biologique : feuilles d'olivier). Cette figure montre que les mélanges eutectiques ternaires constitués de bétaïne et d'acide lactique ou de glycérol (2:3, mol) avec 25 % massique d'eau permettent d'extraire davantage d'oleuropéine d'une matrice végétale 5 comme les feuilles d'olivier que de l'eau subcritique. Ce résultat est intéressant car l'oleuropéine, comme la plupart des composés phénoliques, est thermosensible et donc sujette à la thermo-oxydation. Par ailleurs, du point de vue de l'éco-extraction et de la chimie verte, il est avantageux d'abaisser à la fois la température et la pression du procédé dans un souci d'économie d'énergie et de mise en oeuvre de procédés respectueux de 10 l'environnement. Exemple 10. Comparaison des profils chimiques et de l'activité biologique d'extraits de feuilles d'olivier obtenus en utilisant un mélange ternaire bétaïne:glycérol:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvant d'extraction 15 Les profils chromatographiques montrés sur la Figure 10 (profils chromatographiques (LC/UV, 280 nm) des extraits liquides de feuilles d'olivier - tracé noir : solvant eutectique tracé gris : eau:glycérol Composés 1: Hydroxytyrosol, 2: Lutéoline-7-0-glucoside, 3: Non identifié, 4: Lutéoline-glucoside, 5: Oleuropéine, 6: Isomère d'oleuropéine) rendent 20 compte de la plus forte concentration en actifs végétaux des extraits eutectiques (bétaïne:glycérol:eau) comparée aux extraits hyclroglycérinés. Ce résultat est particulièrement saillant pour l'oleuropéine. À l'échelle du laboratoire, l'ajout de bétaïne dans un mélange eau:glycérol permet - par le phénomène d'eutectigénèse montré dans l'exemple 2 - de tripler (voire de quadrupler) la concentration d'oleuropéine. Lorsque 25 l'extraction par eutectigénèse est mise à l'échelle industrielle, cet accroissement atteint même un facteur 5,4. De manière similaire, la teneur total en composés phénoliques est 2,6 et 3,4 fois plus importante pour les extraits eutectiques de feuilles d'olivier respectivement obtenus à l'échelle laboratoire et industrielle que pour les extraits liquides conventionnels utilisant un mélange eau:glycérol (50:50; w:w) : Batch Oleuropéine Total Phénoliques (p.g/mL) (.g/ml) Eau:glycerol (50:50 ; w:w) 447.7 894.8 3034626 34 Bétaïne:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) (échelle labo) 1721.6 2367.1 Bétaïne:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) (échelle indus) 2303.3 3017.2 Ces résultats sont de nature à expliquer l'accroissement spectaculaire de la synthèse de collagène sur fibroblastes du derme humain (Figure 11A * p<0,05; **p<0,01 ;*** p<0,001) et de la photo-protection sur cellules Hacat (Figure 11B) suivant l'incubation 5 d'extraits eutectiques de feuille d'olivier à des teneurs allant de 0,01 à 0,1 'M. À titre d'exemple, une formulation aqueuse d'extrait eutectique à 0,1 % est 18 fois plus active en termes de synthèse de collagène que la même formulation utilisant un extrait hydroglycériné. Cette efficacité améliorée permet donc d'abaisser les concentrations requises d'extraits eutectiques, ce qui n'est pas sans présenter un certain nombre 10 d'avantages. En effet, lorsqu'une formulation dix fois moins concentré d'extraits eutectique est utilisée (0,01 %), son efficacité biologique relative au gain de collagène dans la matrice extracellulaire est équivalente, et bien souvent même supérieure, aux extraits hydroglycérinés pourtant dix fois plus concentrés. Enfin, concernant la photo-protection préventive -traitement des cellules avec les extraits en amont de l'irradiation par des rayons 15 UVA - montrée sur la Figure 11B, nous constatons une augmentation de l'activité biologique d'un facteur 4,7, ce qui est considérable. Ces données illustrent le potentiel des extraits eutectiques en tant qu'agents photo-protecteurs, filtres UV, anti-âges, hydratants (le collagène à la propriété de retenir l'eau et exerce par ailleurs une fonction barrière pour la peau). Enfin, compte tenu de l'activité 20 antioxydante connue de l'oleuropéine (Laguerre et al., 2009), les profils chromatographiques présentés sur la Figure 10 laissent entrevoir la possibilité d'utiliser ces extraits améliorés comme antioxydants dans diverses formulations.

25 Exemple 11. Comparaison des profils chimiques et de l'activité biologique d'extraits de fleurs de cerisier obtenus en utilisant des mélanges ternaires bétaïne:glycéroLeau et bétaïne:acide lactique:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvants d'extractions 3034626 Les résultats présentés dans cet exemple illustrent parfaitement le fait que l'utilisation des solvants eutectiques revendiqués dans la présente invention pour l'extraction de substances végétales permet d'obtenir des extraits « inatteignables » par des solvants 5 conventionnels de type eau:glycérol. C'est particulièrement le cas du profil chromatographique montré sur la Figure 12 (Profils chromatographiques (LC/UV, 350 nm) des extraits liquides de fleurs de cerisier - tracé noir : solvant eutectique ; tracé gris : eau:glycérol - Composés 1: Caféoyl glucoside, 2: Ac. Chlorogénique, 3: Coumaroyl glucoside, 4: Rutine, 5: Kaempférol rutinoside, 6: Ac. Dicaféoylquinique, 7: Non identifié, 10 8: isorhamnétine, 9: Flavonoïde (C17141407), 10: Flavonoïde (C18F4608)) entre une extraction avec un mélange eutectique et un mélange hydroglycériné. Les extraits sont totalement différents. L'extraction par eutectigénèse permet dans ce cas de générer un extrait de fleurs de cerisier inédit comportant de nombreux composés nouveaux (par rapport aux extraits conventionnels) comme l'acide chlorogénique identifié par spectrométrie de masse ou 15 encore un glucoside d'acide coumarique, de la rutine, de l'acide dicafféoylquinique ou encore de l'isorhamnétine. Au niveau quantitatif, une augmentation drastique de la teneur en polyphénols a été enregistrée pour les solvants eutectiques bétaTne:glycérokeau et bétaïne:acide lactique:eau par rapport aux extraits hydroglycérinés (4,3 et 13,7 fois plus concentrés, respectivement) : Batch Caféoyl glucosides Total Phénoliques (ggfmL) (ptg/mL) Eau:glycerol (50:50; w:w) nd 45.58 Bétaïne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) 332.68 625.55 Bétaïne:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) 63.94 196.99 20 Sur le plan des activités biologiques, les extraits eutectiques montrent encore une fois une supériorité spectaculaire quant à la photo-protection, l'inhibition de la libération de metalloprotéinase matricielles 1 (MMP-1), l'activité anti-inflammatoire ainsi que la synthèse de collagène. Seuls les résultats sur les extraits obtenus à partir d'un mélange 25 bétaïne:glycéroleau sont montrés ici, bien que des données similaires ont été constatées avec le mélange bétaine:acide lactique:eau. Comme le montre la Figure 13A (Photo- 3034626 36 protection après irradiation UV suivant l'exposition des cellules aux extraits liquides de fleurs de cerisier - *** p<0,001), les extraits eutectiques sont beaucoup plus actifs que les extraits hydroglycérinés en tant qu'agents photo-protecteurs ; on peut même dire que ces derniers extraits sont dénués de toute efficacité. Une conclusion similaire peut d'ailleurs être établie 5 sur la base des résultats relatifs à l'inhibition de la libération des métalloprotéinases de la matrice extracellulaire de type 1 (MMP-1) impliquées dans le photo-vieillissement (Figure 13B: inhibition de la libération de métalloprotéinases matricielles de type 1 (MMP-1) suivant l'exposition des cellules aux extraits liquides de fleurs de cerisier - *** p<0,001), à l'inhibition du TNFa qui signe une voie d'inflammation importante (Figure 13C: activité anti- 10 inflammatoire vis-à-vis du TNFa suivant l'exposition des cellules aux extraits liquides de fleurs de cerisier - *p<0,05, *** p<0,001), et enfin, à la synthèse de collagène soluble dans la matrice extracellulaire (Figure 13D: synthèse de collagène suivant l'exposition des cellules aux extraits liquides de fleurs de cerisier, **p<0,01). Pour chacune de ces activités, des gains quantitatifs très significatifs ont été obtenus en utilisant les solvants et les méthodes 15 d'extraction revendiqués dans la présente invention. Ces résultats ouvrent de nouvelles applications pour ces extraits en tant qu'agents anti-inflammatoires, apaisants, anti-âges, photo-protecteurs, antioxydants, filtres UV, hydratants, ou bien encore, agents de lutte contre le photo-vieillissement.

20 Exemple 12. Comparaison des profils chimiques et de l'activité biologique et physicochimique d'extraits de prêle obtenus en utilisant un mélange ternaire bétaïne:acide lactique:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvant d'extraction À l'instar des fleurs de cerisier, l'exemple de la prêle illustre le fait que l'extraction par 25 eutectigénèse conduise à l'obtention d'extraits inédits. La Figure 14 montre les profils chromatographiques (LC/UV, 280 nm) d'extraits liquides de prêle (tracé noir : solvant eutectique ; tracé gris : eau :glycérol - Composés 1: Composé phénolique non identifié, 2: Alcaloïde non identifié, 3: Kaempférol rhamnoside (dihexoside), 4 : Tartrate de caféoyle, 5: Isomère de tartrate de caféoyle, 6: Ac. Phaséolique, 7: Gossypitrine, 8: Protogenkwanine- 30 4'43-glucoside, 9: Ac. Coumarique, 10: Dérivé d'ac. Férulique, 11: Non identifié, 12: Non identifié, 13: Kaempférol rhamnoside (trihexoside)). Elle permet de comparer deux tracés chromatographiques dont le moins qu'on puisse dire est qu'ils ne se superposent pas.

3034626 37 Entres autres différences, citons le kaempférol dihexoside rhamnoside, la gossypitrine, le protogenkwanin-4'-O-glucoside et l'acide phaséolique présents à plus forte teneur dans l'extrait eutectique (béteine:acide lactique:eau) par rapport à l'hydroglycériné. Batch Total Phénoliques (i.terni.) Eau:glycerol (50:50; w:w) 395.1 Bétaïne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) 387.4 Répétition de bétaïne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) 328.9 5 Il est néanmoins difficile de conclure sur la supériorité de tel ou tel extrait sur la seule base de profils aussi différenciés. C'est pourquoi des essais d'activité biologique ont été réalisés sur l'action inhibitrice des substances naturelles extraites de la prêle sur la cascade 10 pro-inflammatoire conduisant à la production du TNFa (Figure 15: activité anti-inflammatoire des extraits de prêle : inhibition de la libération de TNF-alpha après exposition UV des kératinocytes HaCaT). À concentration massique équivalente (0,01 %), il apparait clairement que l'extrait eutectique de prêle est plus actif que celui issu d'un simple mélange eau:glycérol. Une dose-réponse est également constatée, ce qui est avantageux pour ajuster 15 la formulation en fonction du niveau d'efficacité biologique recherché. Globalement, l'activité augmente d'un facteur 5 en augmentant la concentration d'un facteur 10. Une analyse comparative de l'activité antioxydante a également été établie entre les extraits. La Figure 16 (Capacités antioxydantes des extraits liquides de prêle exprimées en valeur ORAC (mol Trolox® eq/g d'échantillon) pour Oxygen Radical Absorbance Capacity). montre une 20 efficacité à réduire les peroxyradicaux issus d'un initiateur azo supérieur d'un facteur 1,6 pour l'extrait eutectique de prêle par rapport à l'extrait hydroglycériné. Les extraits eutectiques de prêle apparaissent donc prometteurs pour des applications en tant qu'agents anti-inflammatoires et antioxydants pour un grand nombre de domaines (pharmaceutique, nutraceutique et cosmétique principalement). Concernant le domaine 25 cosmétique, ces extraits pourront être utilisés comme apaisants (via leur propriétés anti- TNFa), antioxydants et anti-âges (via leurs propriétés réductrices de radicaux libres).

3034626 38 Exemple 13. Comparaison des profils chimiques et de l'activité biologique d'extraits de criste-marine (perce-pierre) obtenus en utilisant un mélange ternaire bétaïne:glycérol:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvant d'extraction 5 À première vue, de tous les profils chromatographiques présentés dans ce document, ceux de la criste-marine sont les moins différenciés entre l'approche extractive par eutectigénèse et celle employant des solvants conventionnels comme l'eau et le glycérol (50 :50; w:w). Au niveau des composés phénoliques, globalement, les deux extraits sont 10 équivalents avec des teneurs de 195 et 181 iigimL, respectivement pour les extraits hydroglycérinés et eutectiques (Figure 17: Profils chromatographiques (LC/UV, 280 nm) des extraits liquides de criste-marine - tracé noir : solvant eutectique ; tracé gris : eau :glycérol - Composés 1: Ac. 3-caféoylquinique, 2: Ac. 5-caféoylquinique, 3: Ac. 4-caféoylquinique, 4: Ac. 1-caféoylquinique, 5: Ac. 5-p-coumaroylquinique, 6: Ac. 5-feruloylquinique, 7: Rutine, 15 8: Quercétine-3-0-glucoside, : Isomère d'ac. Dicaféoylquinique, 10: Flavone non identifiée). Batch Total Phénoliques (p.g/mL) Eau:glycerol (50:50; w:w) 195.07 Bétoine:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) 181.2 L'extrait eutectique contient moins d'acides 1-cafféoylquinique et 5-coumaroylquinique, 20 mais plus d'acide dicafféoylquinique et 5- féruloylquinique que l'extrait à l'eau et le glycérol. Pour d'autres composés, en revanche, comme l'acide 5-cafféoylquinique, les deux extraits présentent des concentrations sensiblement similaires. Puisque ces différentes molécules présentes des noyaux phénoliques en nombre (un ou deux cycle par molécule) et en structure (férulique vs. coumarique vs. cafféique) différentes, des variations de profils, 25 même d'apparence modeste, peuvent engendrer des différences d'activité biologique et/ou physicochimique très marquées. C'est ce que l'on peut observer sur la Figure 18 (Inhibition de la synthèse de mélanine après exposition aux extraits liquides de criste-marine sur mélanocytes de l'épiderme humain faiblement pigmenté (stimulé en présence cri mM de L- 3034626 39 tyrosine) - *** p<0,001, t-test) où une formulation aqueuse d'un extrait eutectique de criste-marine à 0,1 % présente une inhibition de la synthèse de mélanine sur mélanocytes de l'épiderme humain (faiblement pigmenté) de 33 %, alors que l'extrait hydroglycériné est dénué de toute activité.

5 Il s'agit d'un résultat important dans la mesure où l'arbutine - qui est l'agent hypo- pigmentant naturel le plus utilisé en cosmétique - libère un composé toxique (l'hydroquinone) (ref). C'est un contexte favorable pour le développement de nouveaux agents blanchissants qui soient à la fois naturels et exempts d'arbutine. Dans ce sens, les résultats présentés dans cet exemple démontrent pleinement le potentiel des extraits 10 eutectiques de criste-marine revendiqués dans cette invention pour des applications dans le blanchiment cutané. Par ailleurs, du fait de la réactivité avérée des noyaux catéchols des esters quiniques d'acides hydroxycinamiques (cafféique, férulique, coumarique, etc.) présents dans les extraits eutectiques, ces derniers sont tout indiqués pour des applications en cosmétique, nutraceutique, pharmaceutique ou alimentaire en tant qu'antioxydants.

15 Exemple 14. Comparaison des profils chimiques d'extraits de plantain obtenus en utilisant un mélange ternaire bétaïne:glycérol:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvant d'extraction 20 L'exemple 19 met en évidence le fait que l'extraction mettant en oeuvre un mélange eutectique bétaïne:glycérol:eau conduit à l'obtention d'un profil chromatographique globalement plus riche en verbascosides totaux comparé à celui de l'extrait hydroglycériné (Figure 19: profils chromatographiques (LC/UV, 350 nm) des extraits liquides de plantain - tracé noir : solvant eutectique ; tracé gris : eau:glycérol - Composés 1: Cistanoside F, 2: 25 Hydroxyverbascoside, 3: Dihydroxyverbascoside, 4: Isomère d'hydroxyverbascoside, 5: Phényléthanol glycoside, 6: Verbascoside, 7: lsoverbascoside, 8: Lutéoline diglucuronide, 9: Lutéoline glucuronide , 10: Scuttélaréine). On passe d'une concentration en verbascosides totaux de 197 à 397 lig/mL (soit le double) en ajoutant de la bétaïne au mélange eau-glycérol. En l'occurrence, le composé 6 - le verbascoside - est un antioxydant 30 très puissant (Laguerre et al., 2009) contenant deux noyaux catéchols - à l'instar de l'acide rosmarinique présenté dans les exemples 6 et 7. Plus précisément, il s'agit d'un ester hétérosidique d'acide cafféique et d'hydroxytyrosol impliqué dans un grand nombre 3034626 d'activités biologiques et/ou physicochimiques. Par ailleurs, de manière spectaculaire, l'adaptation de la méthode d'extraction à l'échelle industrielle permet de multiplier la teneur en verbascosides totaux par plus de trois et celle en composés phénoliques par près de deux. Enfin, une comparaison des composés phénoliques totaux entre l'extrait eutectique 5 de plantain obtenu à l'échelle du laboratoire et l'extrait hydroglycériné montre un écart d'un facteur 2,3 au profit de l'extrait eutectique. Batch Total verbascosides Total Phénoliques (pg/mL) (pg/mL) Eau:glycerol (50:50 ; w:w) 197.1 211.2 Bétaïne:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) (échelle labo) 397 486.4 Bétaïne:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25% w) (échelle indus) 646.7 842.1 Exemple 15. Comparaison des profils chimiques d'extraits de fleurs de safran obtenus 10 en utilisant un mélange ternaire bétaïne:acide lactique:eau ou un mélange hydroglycériné comme solvant d'extraction Les profils chromatographiques montrés sur la Figure 20 (Profils chromatographiques (LC/UV, 280 nm) des extraits liquides de fleurs de safran - tracé noir : solvant eutectique ; 15 tracé gris : eau :glycérol - Composés 1: Kaempférol-3-0-sophoroside-7-0-glucoside, 2: Kaempférol-3-0-sophoroside, 3: Kaempférol-3-0-lactyl-sophorosicle, 4: Isomère de kaempférol-3-0-lactyl-sophoroside, 5: Kaempférol glycosyl-glycéryl-rhamnoside) diffèrent principalement quant à la présence de kaempférol glycosyl-glycéryl rhamnoside et de deux isomères de kaempférol-3-0-lactyl sophoroside. Batch Crocins Total flavonoides (gg/mL) (pg/mL) Eau:glycerol (50:50 ; w:w) 14.43 2349 Bétaîne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) (échelle labo) 6.35 2414 Répétition de bétaîne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + 6.06 2412.8 3034626 41 eau (25 % w) (échelle labo) Ces composés actifs des fleurs de safran ont pu être identifiés grâce à la technique de spectrométrie de masse en mode ionisation par électronébuliseur couplée à de la chromatographie liquide haute performance (LC-ESI/MS). Ils sont quasiment absents des 5 profils obtenus à partir de l'extrait hydroglycériné, ce qui pourrait expliquer les résultats présentés sur les Figures 21A et 21B (Inhibition de la synthèse de mélanine (Figure 21A) et de la libération de métalloprotéinases matricielles de type 1 (MMP-1) (Figure 21B) par les extraits liquides de fleurs de safran (après exposition UV des cellules) - *** p<0,001, t-test) montrant une efficacité accrue de l'extrait eutectique sur l'inhibition de la synthèse de 10 mélanine et sur la libération de métalloprotéinases dans la matrice extracellulaire -quoi que de manière plus modeste pour cette dernière. Si l'on suppose que la fraction flavonoïdique est la seule impliquée dans le déterminisme biochimique de ces deux activités, on peut alors suggérer que la présence de kaempférol glycosyl-glycéryl rhamnoside et des formes isomères de kaempférol-3-0-lactyl sophoroside est de prime importance pour obtenir des 15 extraits doués d'une activité biologique renforcée par rapport à des extraits conventionnels de type hydroglycérinés. Ces résultats démontrent également le potentiel des extraits eutectiques de fleurs de safran en tant qu'agents hypo-pigmentants, photo-protecteurs et anti-âges. Par ailleurs, compte tenu de la nature chimique des molécules qui le composent (flavonoïdes), ces extraits eutectiques laissent présager des activités de stabilisateurs de 20 radicaux libres plus élevées que celles d'extraits conventionnels et donc une utilisation en tant qu'antioxydants. Exemple 16. Comparaison des profils chimiques d'extraits de rose de Jéricho obtenus en utilisant des mélanges ternaires bétaïne:glycérol:eau et bétaïne:acide lactique:eau ou un 25 mélange hydroglycériné comme solvants d'extractions Les extraits obtenus à partir d'une extraction par eutectigénèse (qu'il s'agisse de bétaïne:glycérol:eau ou de bétaïne:acide lactique:eau) présentent des profils totalement différents de ceux observés par chromatographie et issus d'une extraction à l'eau et à la 30 glycérine (Figure 22: Profils chromatographiques (LC/UV, 280 nm) des extraits liquides de 3034626 42 roses de Jéricho - tracé noir : solvant eutectique ; tracé gris : eau:glycérol - Composés 1: Non identifié, 2 : Ac. Protocatéchuique, 3 : Picéine, 4: Non identifié, 5 : Taxifoline, 6: Éther méthylique de taxifoline, 7: Silybine, 8: Isosilybine). Ces données témoignent du caractère différenciant induit par l'emploi des solvants eutectiques profonds tel que revendiqué dans 5 la présente invention en comparaison d'un procédé plus classique. En l'occurrence, l'extrait eutectique montré sur la Figure 22 contient beaucoup plus de taxifoline (et de son éther méthylique), d'acide protocatéchique ainsi que de flavonolignanes tels que la sylibine et l'isosylibine. Il est intéressant de noter que la concentration totale en composés phénoliques est respectivement 2 et 3 fois plus élevée pour les extraits issus de l'emploi des mélanges 10 bétaïne:acide lactique:eau et bétaïne:glycérol:eau que pour l'utilisation d'un mélange eau:glycérol. Batch Taxifoline Total phénoliques (p.g/mL) (1.1.g/mL) Eau:glycerol (50:50; w:w) 14.4 28.03 Bétaïne:glycérol (40:60; mol:mol) + eau (25 % w) 25.8 83.9 Bétaïne:ac. lactique (40:60; mol:mol) + eau (25% w) 28.3 53.8 En termes d'activité biologique, l'extrait eutectique dont le profil chrornatographique est montré sur la Figure 22 (bétaïne:glycérol:eau) induit une inhibition de la synthèse de 15 mélanine de près de 36 %, alors que l'extrait hydroglycériné est dénué de toute activité (Figure 23: Inhibition de la synthèse de mélanine après exposition aux extraits liquides de rose de Jéricho sur mélanocytes de l'épiderme humain faiblement pigmenté (stimulé en présence d'1 mM de L-tyrosine) - *** p<0,001, t-test). C'est un résultat logique au vu du profil, la taxifoline étant connue pour inhiber la mélanogénèse cellulaire (An et ai., 2008), 20 aussi efficacement, d'ailleurs, que l'arbutine qui est très utilisé en cosmétique en tant qu'agents hypo-pigmentant. Sur ce point, il nous faut rappeler que l'arbutine n'est pas un actif satisfaisant car elle libère de l'hydroquinone dont la présence est interdite (notamment en cosmétique au-dessus de 1 ppm). Ce type d'activité en absence d'arbutine démontre ainsi le fort potentiel de l'extrait eutectique de rose de Jéricho pour le secteur cosmétique, dans 25 la gamme des agents hypo-pigmentants, mais également en tant qu'antioxydants et anti-âge puisque l'acide protocatéchique et la taxifoline sont de bons réducteurs de radicaux libres, possédant chacun un noyau catéchol dont nous avons explicité ci-avant le mécanisme 3034626 43 d'action pour lutter contre le stress oxydant. Enfin, l'exemple 16 met en évidence le fait que les solvants eutectiques sont parfaitement adaptés à l'extraction de composés bio- ou chimio-actifs à partir de plantes de résurrection. BIBLIOGRAPHIE Abbott AP, Capper G, Davies DL, Rasheed RK, Tambyrajah V. Novel solvent properties of choline chloride/urea mixtures. Chem. Commun. 2003, 7, 70-71.

10 An SM, Kim HJ, Kim JE, Boo YC. Flavonoids, taxifolin and luteolin attenuate cellular melanogenesis despite increasing tyrosinase protein levels. Phytother. Res. 2008, 22, 12001207. Craig SAS. Betaine in human nutrition. Am. J. Clin. Nutr. 2004, 80, 539-549.

15 Choi YH, van Spronsen J, Dai Y, Verberne M, Hollmann F, Arends IWCE, Witkamp GJ, Verpoorte R. Are natural deep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolism and physiology?Plant Physiol. 2011, 156, 1701-1705.

20 Gutiérrez MC, Ferrer ML, Mateo CR, del Monte F. Freeze-drying of aqueous solutions of deep eutectic solvents: a suitable approach to deep eutectic suspensions of selfassembled structures. Langmuir 2009, 25, 5509-5515. Laguerre M, Lopez Giraldo 1..1, Piombo G, Figueroa-Espinoza IV1C, Pina M, Benaissa M, 25 Combe A, Rossignol Castera A, Lecomte .1, Villeneuve P. Characterization of olive leaf phenolics by ESI-MS and evaluation of their antioxidant capacities by the CAT assay. J. Am. Oil Chem. Soc. 2009, 86, 1215-1225. Ou B, Hampsch-Woodill M, Prior RL. Development and validation of an improved 30 oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4619-4626.

3034626 44 Ou B, Chang T, Huang D, Prior RL. Determination of total antioxidant capacity by oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using fluorescein as the fluorescence probe: First action 2012.23. Journal of AOAC International, 2013, 96, 1372-1376.

5 Règlement (CE) européen N°1223/2009 du parlement européen et du conseil du 30 novembre 2009 relatif aux produits cosmétiques (refonte). Robinson Jr WE, Cordeiro M, Abdel-Malek S, Jia Q, Chow SA, Reinecke MG, Mitchell 10 WM. Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodeficiency virus integrase: inhibition of the core catalytic domain of human immunodeficiency virus integrase. Mol. Pharmacol. 1996, 50, 846-855.

Claims (16)

1. REVENDICATIONS1. Solvant eutectique d'extraction de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote caractérisé en ce qu'il est constitué d'un mélange limpide, stable et fluide comprenant : de la bétaïne ou une forme hydratée de la bétaïne, et au moins un composé donneur de liaisons hydrogène choisis parmi le groupe des polyols ou des acides organiques, et de 1"eau mais excluant tout sucre et/ou sel d'amine et/ou anion exogènes
2. 2. Solvant eutectique d'extraction selon la revendication 1 caractérisé en ce que les polyols sont choisis parmi le glycérol, l'érythritol, le mannitol, le sorbitol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, le ribitol, l'aldonitol, le propanediol, ou le pentylène glycol
3. 3. Solvant eutectique d'extraction selon la revendication 1 caractérisé en ce que les acides organiques sont choisis parmi l'acide lactique, l'acide malique, l'acide maléique, l'acide pyruvique, l'acide fumarique, l'acide succinique, l'acide citrique, l'acide acétique, l'acide aconitique, l'acide tartrique , l'acide ascorbique, l'acide malonique, l'acide oxalique, l'acide glucuronique, l'acide neuraminique, l'acide sialique, l'acide shikimique, l'acide phytique, l'acide galacturonique, l'acide iduronique, l'acide hyaluronique, l'acide hydroxycitrique, ou les dérivés lactones
4. 4. Solvant eutectique d'extraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le ratio molaire critique bétaïne(ou forme hydratée de la bétaïnepolyols, ou bétaïne(ou forme hydratée de la bétaïne):acides organiques est compris entre 1:1,5 et 1:3
5. 5. Solvant eutectique d'extraction selon la revendication 4 caractérisé en ce que le ratio molaire critique bétaïne(ou forme hydratée de la bétaïne):polyols, ou bétaïne(ou forme hydratée de la bétaïne):acides organiques est de 1:2 3034626 46
6. 6. Solvant eutectique d'extraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la proportion massique d'eau est de 1 à 50 %, et de préférence de 15 à 30 % 5
7. 7. Utilisation du solvant eutectique d'extraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la mise en oeuvre d'un procédé d'extraction de composés biologiques naturels tels que les composés phénoliques dont les acides et esters phénoliques, les flavonoïdes, les sécoiridoïdes, les stilbènes et les alcools phénoliques, ainsi que les antioxydants, les caroténoïdes, les alcaloïdes, les lipides, 10 les phénylpropanoïdes, les arômes et modificateurs de goût, les parfums, les biocides, les antimicrobiens, les protéines, les enzymes, les colorants, les pigments, les agents tensioactifs et les terpenoïdes comprenant les saponines, à partir de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote, et de préférence à partir de matériel biologique végétal 15
8. 8. Procédé d'extraction de composés biologiques naturels tels que les composés phénoliques dont les acides et esters phénoliques, les flavonoïdes, les sécoiridoïdes, les stilbènes et les alcools phénoliques, ainsi que les antioxydants, les caroténoïdes, les alcaloïdes, les lipides, les phénylpropanoïdes, les arômes et modificateurs de 20 goût, les parfums, les biocides, les antimicrobiens, les protéines, les enzymes, les colorants, les pigments, les agents tensioactifs et les terpenoïdes comprenant les saponines, à partir de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote, et de préférence à partir de matériel biologique végétal, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 25 a. Immersion sous agitation d'un matériel biologique broyé ou non dans le solvant d'extraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 puis b. macération ou percolation ou infusion à une température comprise entre 20 et 60 °C, du mélange obtenu puis 3034626 47 c. Filtration du produit d'extraction obtenu en b. ce par quoi on obtient un extrait liquide biologique naturel issu du matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote 5
9. 9. Procédé d'extraction selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le solvant d'extraction exerce une action synergique sur le processus d'extraction du matériel biologique
10. 10. Extrait liquide biologique naturel de matériel biologique végétal et/ou animal et/ou procaryote obtenu par la mise en oeuvre du procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications 7 à 9
11. 11. Utilisation de l'extrait liquide biologique naturel selon la revendication 10 pour renforcer l'activité biologique et/ou physicochimique des composés compris dans ledit 15 extrait
12. 12. Utilisation de l'extrait liquide selon la revendication 10 ou 11 pour la fabrication d'une composition nutraceutique, d'un produit diététique ou alimentaire chez l'humain ou l'animal, d'un complément nutritionnel, d'un parfum ou d'un arôme, d'une 20 composition pharmaceutique, oenologique ou cosmétique, destinée à une administration par voie orale ou parentérale, ou à une application par voie topique, rectale, nasale, auriculaire, vaginale et/ou oculaire
13. 13. Utilisation d'un extrait liquide pour la fabrication d'une composition selon la 25 revendication 12 pour des applications nutraceutiques, diététiques, alimentaires, pharmaceutiques, oenologiques ou cosmétiques chez l'humain ou l'animal, en tant que photo-protecteurs, agents de lutte contre le photo-vieillissement, hypo-pigmentants et agents blanchissants, anti-âge, antioxydants, antiradicalaires, réducteurs d'espèces réactives de l'oxygène, inhibiteurs de la libération de métalloprotéinases, anti- 30 inflammatoires, apaisants cutanés, activateurs de la synthèse de collagène, hydratants ou restaurateurs de la fonction barrière de la peau 3034626 48
14. 14. Extrait liquide biologique naturel selon la revendication 10 ou 11 ou extrait liquide biologique naturel utilisé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le matériel biologique végétal dont il est issu est de la fleur de cerisier, de la prêle, du romarin ou de l'olivier 5
15. 15. Utilisation de l'extrait liquide biologique naturel issu de fleurs de cerisier selon la revendication 14 en tant qu'agent photo-protecteur et anti-photovieillissement
16. 16. Extrait liquide biologique naturel selon la revendication 10 ou extrait liquide biologique 10 naturel utilisé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le matériel biologique végétal dont il est issu est de la fleur de safran, de criste-marine ou de rose de Jéricho 15 20 25 30