KR102577069B1 - 공융 추출 용매, 상기 용매를 사용한 공융생성에 의한 추출 방법, 및 상기 추출 방법으로부터 유래된 추출물 - Google Patents
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Abstract
식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 추출하기 위한 공융 추출 용매로서, 상기 용매는 (a) 베타인 또는 베타인의 수화 형태; (b) 폴리올 및 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 수소 결합 주개 화합물; 및 (c) 물을 포함하는 투명하고, 안정한 유체 혼합물이되, 단, 상기 공융 추출 용매는 임의의 외인성 당 및/또는 아민염 및/또는 음이온을 함유하지 않는다.
Description
일반적인 방식으로 본 발명은 하기에 관한 것이다:
- 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 추출하기 위한 공융 용매(eutectic solvent);
- 자연 생물 화합물을 추출하기 위한 방법을 실행하기 위한 상기 공융 추출 용매의 용도;
- 상기 용매를 사용한, 자연 생물 화합물, 예컨대 페놀 화합물을 추출하는 방법;
- 상기 추출 방법의 실시로부터 유래된 자연 생물 액체 추출물; 및
- 상기 자연 생물 액체 추출물의 용도.
보다 특별하게, 본 발명의 실시는 베타인(트라이메틸 글리신) 또는 베타인의 수화 형태, 폴리올 및 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 수소 결합 주개, 및 물의 균형잡힌 혼합물에 의해서 가능해지며, 이것은 사용된 생물 물질로부터의 자연 화합물의 개선된 추출을 제공하기에 유용하다.
베타인은 사탕무즙에서 처음 발견된 글리신의 트라이메틸화 형태이다. 이의 구조 및 물리-화학적 특성으로 인해서, 이러한 자연 분자는 화장품, 약제학, 식품 및 영양/건강 분야에서 특히 흥미롭다. 이것은 특히 화장품의 수분 함량을 유지시키고, 피부의 최적의 수분 균형을 유지시키는 데 있어서의 이의 수화, 연화 및 보습 특성을 위해서 사용된다. 이러한 이로운 효과는 인간 피부 세포의 계면에서의 특정 위치 결정으로부터 유발된다. 또한, 베타인은 - 그것이 세포를 보호하는 바와 같이 - 삼투성 스트레스에 대해서 인간 세포를 보호하는 자연 삼투물질(osmolyte)이다 음식으로 또는 뉴트라슈티컬 보충물(nutraceutical supplementation)에 의해서 섭취되는 경우, 이 분자는 특정 간 효소의 충분한 메틸화를 가능하게 함으로써 간 보호 역을 한다. 지질의 간 대사와 연관된 병태는 지방증으로 이어질 수 있는 베타인의 불충분한 흡수의 결과로서 또한 식별되어 왔다(Craig, S.A.S., Betaine in human nutrition, Am. J. Clin. Nutr., 2004, 80, 539-549).
이의 생리학적 역할 및 기술적인 역할에 더하여, 베타인은 값이 싸고(약 10유로/kg), 생물로부터 유래되고, 비독성이다. 이것은 사카로스의 제조를 위한 사탕무의 가공 동안 상당한 양으로 생성되는 주요 대사산물이고, 이렇게 수득된 당밀의 최대 30%를 차지한다. 동반되는 산업적인 양을 고려하면, 개발 가치가 거의 없거나 전혀 없는 대량의 베타인이 존재한다. 당(sugar)을 추출한 후 수득된 베타인-풍부 사탕무즙을 사용하여 길을 제빙(deicing)시키는 것이 매우 낮은 가치-부가 분야에서 이러한 화합물을 사용한 다수의 예 중 하나이다. 따라서 틈새 시장에서의 새로운 응용이 요구된다. 베타인은 화장품 산업에서 계면활성제로서 사용되는 코카마이도프로필 베타인의 제조에서 의심할 여지 없이 가치가 있지만, 이러한 화학 제품은 유기 합성법으로부터 유래된다. 인공이 점점 더 선호되지 않는다는 맥락에서, 이러한 개발의 길은 이전보다 더 축소될 것이다. 따라서, 보다 자연적인 선택으로 이동하는 소비자의 욕구에 의해서 유래되는 사회적, 경제적 및 규제 변화는 낮은 에너지 투입(예를 들어, 저온)을 사용하는 환경 친화적인 공정에서 자연 재료를 사용하려는 자극을 제공하여 왔다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자가 흔히 직면하는 문제점은 관심 분자, 즉 가장 중요하게는 하이드록실기에 의해서 치환된 방향족 코어를 함유하는 자연 화합물(페놀 화합물, 알코올, 페놀산 및 에스터, 플라보노이드, 탄닌, 스틸벤 및 페놀 터펜)의 높은 열 민감성의 문제이다. 사포닌 및 트라이터펜뿐만 아니라 터펜 및 카로테노이드의 연관된 컨주게이팅된 시스템의 사카라이드 부분은 60 내지 70℃ 초과에서 이성질체화되거나 또는 산화될 수 있다고 공지되어 있다.
베타인의 본질적인 특징부는 4차 암모늄기와 카복실산의 조합인데, 이것은 특히 추출될 용질과 수소 및/또는 이온 결합을 형성함으로써, 극성 또는 양친매성 재료를 가용화 및 추출하는 데 특히 적합하다. 녹색 화학 및 에코-추출의 원칙이 안내하는 접근법에서, 다른 구성성분과 혼합하여 유효 성분 및 추출 유체 둘 모두로서 베타인을 사용할 수 있는 것이 이로울 것이다. 그러나, 베타인이 대기 온도에서 고체 형태로 존재하고, 이의 물리학적 상태로 인해서 임의의 자연 재료의 추출에 사용 가능하지 않다는 타당한 이유로 인해서, 화장품, 약제학 또는 영양학적으로 관심이 있는 자연 재료, 예컨대 페놀 화합물, 항산화제, 사포닌, 카로테노이드, 터펜 등을 추출하기 위한 베타인의 응용은 존재하지 않는 것 같다.
그러나, 화학에서의 최근의 진전은, 고체가 적합한 비율의 1종 이상의 다른 특정 화합물과 혼합되어 정밀한 방식으로 제형화되는 경우 액체 상태가 될 수 있다는 것을 나타낸다. 이것은 특히 단리물로 취한 이의 구성성분의 용융점보다 훨씬 낮은 용융점을 갖는 화합물의 혼합물인 깊은 공융 용매(deep eutectic solvent)에 적용된다. 이것은 "쉽게 용해되는"이라는 의미의 그리스어 "eutektos" 로부터 이의 이름을 따왔는데, 이 용어는 문헌[English physician Guthrie in 1884]에서 처음 사용되었다. 문헌 유럽 특허 제EP 1 324 979호에서 애봇(Abbott) 등에 의해서 기술된 이들 용매는, 대기 온도에서 일반적으로 액체인 반면, 혼합물이 구성된 이 화합물은 별도로 고려되는 경우 고체 화합물이다. 공융 혼합물의 형성에 의해서 용융점이 낮아지는 이러한 현상은 분자간 수소 결합의 확립에 기인하는데, 이것은 화학 종들간의 공간의 부피를 증가시켜서, 이들이 액체가 되도록 이들의 이동성을 증가시키는 효과를 갖는다.
최근에 이들 공융 용매의 조성물 중에 포함시키기 위한 자연 재료의 용도가 특히 주목되고 있고, 이것은 이제 자연 깊은 공융 용매(NADES)라 지칭된다. 이것은 유기산, 아미노산, 당, 폴리올, 콜린 및 우레아로 구성된다(Choi, Y. H., van Spronsen, J., Dai, Y., Verberne, M., Hollmann, F., Arends, I. W. C. E., Witkamp, G. J., Verpoorte, R., Are natural deep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolism and physiology, Plant Physiol., 2011, 156, 1701-1705). 이들 자연 재료는 이들이 바이오매스에 풍부하고, 이들이 넓은 구조적 다양성을 나타내고, 이들이 생분해성이고, 이들이 낮은 독성을 나타내고, 이들이 대부분 식용 가능하고, 이들이 자연적이라는 사실로 인해서 공융 혼합물을 제조하기 위한 이상적인 구성성분이다. 이들은 특히 패밀리 특허 제WO 2011/55829호 문헌에 기술되어 있다.
그러나, 이들 자연 공융 용매는 산업 규모의 용도를 위해서는 특정 수의 단점을 갖는다. 예를 들어, 당 및 아미노산의 동반 사용은 비-효소적 갈변의 결과로서 냄새 나는 유색 화합물을 형성한다고 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이러한 추출물은 화장품, 약제학, 식품 및 뉴트라슈티컬 시장의 산업적인 요구를 충족시키지 못한다. 당이 아민과 필수적으로 배합되지 않거나, 또는 그 역으로 사용될 수 있지만, 생물 물질은 한편으로는 당과, 다른 한편으로는 아민과 동반될 수 있어서, 비-효소적 갈변 반응의 개시가 가능해져서 소비재를 제형화하기 위해서 이렇게 수득된 추출물의 사용이 방지된다. 추가로, 패밀리 특허 제WO 2011/55829호에 기술된 자연 공융 혼합물의 구성성분은 규제 관점으로부터 항상 적합한 것은 아닐 수 있다. 이것은 유럽 규제 N° 1223/2009에 따라서 화장품에서의 사용이 금지된 콜린 및 이의 유도체에 적용된다. 당으로부터 형성된 공융 혼합물의 경우에, 부패 식물상 또는 병원성 미생물의 발생을 허용하기에 충분히 긴 기간 동안 저장되는 일반적인 소비재 내에 이것을 혼입시키는 것을 예상하기에는 상응하는 추출물의 미생물 안정성이 일반적으로 불충분하다는 사실이 추가된다.
추가로, 공융 혼합물은 전형적으로 정의된 구성성분의 매우 정확한 비율에 대해서만 형성되는데, 이는 혼합물의 용융점을 낮추고, (본 발명자들이 적어도 1주를 이해하는 안정성에 의해서) 결정화의 관점으로부터 혼합물을 안정하다고 예상하기 위해서는, 비록 자연적이기는 하지만, 이러한 분자를 이렇게 혼합하는 것이 충분하지 않다는 것을 의미한다. 또한, 이들 용매는 대기 온도에서는 매우 점성(일반적으로 100cP 초과)이라는 단점을 나타낸다. 예를 들어, 콜린 클로라이드와 우레아의 혼합물(몰비 1:2)은 30℃에서 거의 500cP의 점도를 갖고(Abbott, A. P., Capper, G., Davies, D. L., Rasheed, R. K., Tambyrajah, V., Novel solvents properties of choline chloride/urea mixtures, Chem. Commun., 2003, 7, 70-71), 이것은 추출 수율과 관련하여 문제가 없는 것은 아니고, 추출 용매로서 산업적으로 사용하는 것을 불가능하게 만든다. 분자 상호 작용과 관련하여, 이러한 높은 점도는 공융 혼합물의 구성성분들간의 수소 결합의 매우 조밀한 네트워크의 존재에 기인하여, 이들 용매 중에 존재하는 유리 종의 이동성을 감소시킨다. 이러한 점도는 (존재한다면) 분자들간의 공간의 낮은 부피, 정전기 효과, 및 반 데르 발스 상호 작용으로부터의 이온이 크기에 기인한다. 이동성 추출 유체를 배치하고, 그것이 재료의 전부 또는 부분을 추출하고자 하는 생물 물질 내로 관통하게 만들기 위해서 필요한 전단력이 최적의 추출을 허용하기에 충분하지 않을 것이라는 것을 고려하면, 조합된 이들 모든 인자는 식물(예를 들어, 식물성) 재료를 추출하는 목적을 위한 공융 혼합물의 사용을 방해한다. 필연적인 결과로서, 공융 혼합물 중의 화학 종의 낮은 이동성은 추출될 재료를 용해시키는 데 문제가 있어서, 낮은 추출 수율, 높은 에너지 비용, 연장된 추출 시간 및/또는 많은 양의 용매로 이어진다.
따라서, 베타인을 기재로 하는 유체 및 저 점도 공융 용매를 사용하여, 생물 물질 성분 또는 유효 성분, 예컨대 페놀 화합물, 항산화제, 사포닌, 카로테노이드, 터펜 등으로부터 추출하기 위한 용매는 현재 존재하지 않는 것 같고, 여기서 후자는 또한 활성 성분 또는 유효 성분의 역할을 할 수 있다(활성 성분이라는 것은 본 발명자들은 기술적인 작용을 갖는 재료인 것으로 이해하는 반면, 유효 성분은 화장품, 약제학 또는 영양학적 작용을 발휘할 수 있는 임의의 재료를 지칭한다).
보태니컬 추출물에 대한 강한 활성을 입증하고, 찾기 위한 자연 추출 용매 대체품에 대한 필요성이 또한 계속적으로 존재한다.이는 상이한 용매는 이의 추출 능력이 상이하여, 사용된 용매에 따라서 다양한/상이한 이점을 유도하기 위한 잠재력을 야기할 수 있기 때문이다. 추가로, 신규 추출 용매, 예컨대 본 명세서에 기술된 공융 용매의 사용은, 보태니컬 물질에 대한 신규 활성 및 응용의 발견을 가능하게 할 수 있다.
인간 질환에서 반응성 산소 종(reactive oxygen species: ROS)의 역할은 질환의 예방과 관련하여 광범위한 연구의 대상이었다. 항산화제 시스템과 산화제의 생산 간의 불균형으로 인해서 유발되는, ROS를 비롯한, 산화성 스트레스는 많은 다인성 질환, 특히 암, 심혈관 질환, 및 염증성 장애와 연관된 것 같다. 이러한 질환이 발생하는 기전은 일반적으로 유전자 발현 및 염증성 반응 둘 모두의 조절과 함께, 단백질, 지질, 탄수화물 및 핵산을 비롯한, 생리학적으로 중요한 분자의 산화성 변형을 포함한다. 유기체 항산화성 방어에 더하여, 항산화제의 흡수가 산화성 손상으로부터 중요한 생물 분자를 보호하여, ROS에 관련된 다수의 만성 질환의 위험을 감소시킬 수 있다는 것을 제안하는 증거가 늘어나고 있다.
태양 자외(UV) 방사선에 대한 노출은 피부 광손상 및 발암의 원인 인자이고, 광자 흡수와 상이한(또는 광자 흡수로의 상승작용적인) 개선된 분자 광보호 전략에 대한 긴급한 필요성이 존재한다(Watson et al, 2014).진피 세포외 기질(ECM)의 조성물 및 구성물에 대한 UVR 노출의 시공간적 결과는 상당히 특징분석되어 있지만, 광노화의 발병기전은 대략적으로 규정되어 있다. 몇몇 마커 및 경로가 함께 존재한다:
- ROS가 노화 과정에 관련되어 있음
- 세포-외 기질 분해
- 피부 장벽 기능의 손실
- 등.
최근 연구는 전사 인자 NRF2(핵 인자-E2-관련 인자(nuclear factor-E2-related factor 2)) 및 단백질 DJ-1에 의해서 조직된 피부 유전자 발현의 광보호 역할을 제안한다. 사실, DJ-1의 하향 조절은 Nrf2의 핵 전좌를 손상시킨다(Liu et al, 2014). DJ-1/NRF2 경로는 명백히 세포에 의해서 활성화되어 산화성 스트레스-유도된 손상과 싸우고, 이러한 경로는 산화성 스트레스의 단백질 세포 마커로서 작용하고, 세포에 이미 존재하는 산화성 스트레스를 강조하여, 세포에 영향을 준다. 활성 및 보태니컬 추출물은 이러한 경로를 방해할 수 있고, 따라서 활성 및 보태니컬 추출물의 사용은 이러한 경로의 활성화 전에 작용하여 산화성 스트레스-유도된 손상에 대해서 보호할 수 있다.
따라서, 국소적 항산화제 및 유해한 세포 신호전달의 저해제 둘 모두는 표피 및 진피에서 특이적인 UV-매개된 단백질 분해의 효과를 제거하는 데 효과적일 수 있다.
본 명세서에서 명백한 이미-공개된 문헌의 목록 또는 논의는 그 문헌이 최신 기술 또는 공통적인 일반적인 지식의 일부인 것을 인정하는 것으로서 반드시 받아들여져서는 안 된다.
본 발명은 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질, 바람직하게는 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질로부터, 열 민감성일 수 있는 관심 산업의 화합물, 바람직하게는 화장품, 약제학적 또는 영양학적 화합물을 추출하는 단계 동안 상승작용/개선을 수득하도록 하는, 베타인 또는 베타인의 수화 형태, 및 물을, 유기산 및/또는 폴리올 중에서의 적어도 1종의 수소 결합 주개와 함께 포함하는 정확한 조합물의 발견을 기초로 한다.
의심의 여지를 없애기 위해서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "식물"이 전형적으로는 영구적인 자리에서 성장하고, 그의 뿌리로부터 물 및 무기물을 흡수하고, 녹색 색소 엽록소를 사용하여 광합성에 의해서 그의 잎에서 영양분을 합성하는 나무, 관목, 약초, 풀, 양치식물, 및 이끼에 의해서 예시되는 종류의 생물체(living organism)를 의미한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 용어 식물은 꽃 및 채소(예를 들어, 채소)를 지칭할 수 있다.
이들 관심 화합물 중에서, 본 발명자들은 특히 페놀산 및 에스터를 비롯한, 페놀 화합물, 플라보노이드, 세코이리도이드, 스틸벤 및 페놀 알코올, 뿐만 아니라 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료 및 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 색소, 안료, 계면활성제 및 사포닌을 비롯한 테르페노이드를 주목할 수 있다.
보다 특별하게는,관심 화합물은 페놀산 및 에스터, 플라보노이드, 세코이리도이드, 페놀 알코올, 뿐만 아니라 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료 및 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 색소, 안료, 및 사포닌을 비롯한 테르페노이드를 포함한다.
제1 양상에서, 본 발명은 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 추출하기 위한 공융 용매를 제공하며, 여기서 용매는,
(a) 베타인 또는 베타인의 수화 형태;
(b) 폴리올 및 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 수소 결합 주개 화합물; 및
(c) 물
을 포함하는 투명하고, 안정한 유체 혼합물이되,
단 공융 추출 용매는 임의의 외인성 당 및/또는 아민염 및/또는 음이온을 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "투명한"이 용매가 투과적이고, 육안으로 가시적인 고체 입자를 함유하지 않는 것을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "안정한"이 고체상, 예를 들어 결정상이 1주일 내에 용매 내에 형성되지 않는 것을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "유체"가 용매가 유동을 나타낸다는 것을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.예를 들어, 약 10℃ 내지 약 80℃, 예컨대 약 20℃ 내지 약 60℃, 또는 약 25℃ 내지 약 45℃의 온도에서 유동을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "외인성"이 명시된 화합물/성분이 공융 용매 내에 이미 존재하지 않는 것, 즉 추가로 제공되지 않은 것을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "당"이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 임의의 당 화합물을 의미할 수 있고, 이것은 화합물 당, 예컨대 글루코스, 프룩토스 및 갈락토스를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "아민염"이 별개의 반대 이온을 갖는 임의의 양으로 하전된 아민 종을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.예를 들어, 용어 "아민염"은 4차 암모늄 염, 예컨대 콜린을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "음이온"이 임의의 음으로 하전된 종을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 용어 "음이온"은 NO3 -, F-, Cl-, Br-, I-, BF4 -, ClO4 -, CN-, SO3CF3 - 또는 COOCF3 -를 지칭할 수 있다.
특정 실시형태에서, 발명은 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 추출하기 위한 공융 용매를 제공하며, 여기서 용매는
(a) 베타인 또는 베타인의 수화 형태;
(b) 폴리올 및 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 수소 결합 주개 화합물; 및
(c) 물로 본질적으로 이루어진 투명하고, 안정한 유체 혼합물이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "본질적으로 이루어진"이, 본 발명의 공융 용매가 어떤 다른 성분, 특히 공융 용매에서 사용된다고 공지된 어떤 추가 수소 결합 주개도 실질적으로 함유하지 않는 것을 의미한다는 것을 이해할 것이다.
추가 특정 실시형태에서, 발명은 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 추출하기 위한 공융 용매를 제공하며, 여기서 용매는
(a) 베타인 또는 베타인의 수화 형태;
(b) 폴리올 및 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 수소 결합 주개 화합물; 및
(c) 물로 이루어진 투명하고, 안정한 유체 혼합물이다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 수소 결합 주개 화합물은 글리세롤, 에리트리톨, 만니톨, 소르비톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리비톨, 알도니톨, 프로판다이올, 및 펜틸렌 글리콜로 이루어진 폴리올 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 수소 결합 주개 화합물은 락트산, 말산, 말레산, 피루브산, 푸마르산, 석신산, 시트르산, 아세트산, 아코니트산, 타트르산, 아스코르브산, 말론산, 옥살산, 글루쿠론산, 뉴라민산, 시알산, 시킴산, 피트산, 갈락투론산, 이두론산, 히알루론산, 하이드록시시트르산, 및 락톤 유도체로 이루어진 유기산 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 수소 결합 주개는 시트르산이 아니다.
본 발명의 실시형태에서, 베타인(또는 베타인의 수화 형태) 대 적어도 1종의 수소 결합 주개 화합물(폴리올, 또는 유기산)의 임계 몰비는 1:1.5 내지 1:3이고, 바람직하게는 1:2이다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 용매를 수득하기 위해서 첨가된 물 대 혼합물의 중량 비율은 1 내지 50%, 바람직하게는 15 내지 30% 또는 20 내지 30%이다.
본 발명의 양상에서, 공융 추출 용매는 1:1.5 내지 1:3, 예컨대 1:2의 베타인 또는 베타인의 수화 형태 대 적어도 1종의 수소 결합 주개의 비를 가질 수 있고; 1 내지 50%, 바람직하게는 15 내지 30% 또는 20 내지 30%의 혼합물에 첨가된 물의 비율을 가질 수 있다.예를 들어, 용매는 1:1.5 내지 1:3의 베타인 또는 베타인의 수화 형태 대 적어도 1종의 수소 결합 주개의 비를 가질 수 있고; 15 내지 30%의 혼합물에 첨가된 물의 비율을 가질 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터, 바람직하게는 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질로부터 자연 생물 화합물, 예컨대 페놀산 및 에스터를 비롯한 페놀 화합물, 플라보노이드, 세코이리도이드, 스틸벤 및 페놀 알코올, 뿐만 아니라 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료 및 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 색소, 안료, 계면활성제 및 사포닌을 비롯한 테르페노이드를 추출하기 위한 이전에 정의된 바와 같은 공융 추출 용매의 용도를 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터, 바람직하게는 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질로부터 자연 생물 화합물, 예컨대 페놀산 및 에스터를 비롯한 페놀 화합물, 플라보노이드, 세코이리도이드, 페놀 알코올, 뿐만 아니라 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료 및 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 색소, 안료, 및 사포닌을 비롯한 테르페노이드를 추출하기 위한 이전에 정의된 바와 같은 공융 추출 용매의 용도를 제공한다.
본 발명의 용도의 실시형태에서, 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인(plantain), 샤프란 꽃, 크리스멈(chrismum), 제리코 장미, 로즈마리, 점상권백(Selaginella pulvinata), 틸란드시아 유스노이데스(Tillandsia usnoides) 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 용도의 추가 실시형태에서, 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 발명에 따른 용매를 사용하여 수득된 상승작용/개선은 이하에서 "공융발생 ( eutectigenesis )"이라 지칭될 것이고, 공융점에 상응하는 혼합물의 임계 비율에 도달되는 경우 생성되는 공융 혼합물의 형성에 상응하는 자연적 물리-화학적 현상으로부터 유래하는 것으로 보인다. 공융점은 2개의 액체 곡선의 교차점에서의 상 다이어그램 상의 지점이고, 이것은 혼합물이 액체상에서 이의 최저 온도에 존재하는 조성을 제공한다.
완전히 예상되지 않는 방식으로, 명확한 비율, 예컨대 1:1.5 내지 1:3 또는 1:2의 3종의 화합물 - (a) 베타인(또는 베타인의 수화 형태), (b) 수소 결합 주개 및 (c) 물 -의 조합이 자연 재료를 상승작용적/개선된 방식으로 추출하는 것을 가능하게 한다는 것을 발견하였다. (a) 내지 (c) 중 하나의 부재는 회수율의 붕괴로 이어진다. 이러한 발견은 지금까지 베타인을 기재로 하는 공융 혼합물에 대해서 임의의 추출 상승작용을 추론 또는 예측하는 어떠한 공지된 이론적인 모델, 경험 법칙, 또는 작용 기전이 존재하지 않았다는 점에서 더 큰 의미를 갖는다. 기껏해야, 패밀리 특허 제WO 2011/55829호에 깊은 공융 용매가 동일몰비(1:1)로 존재하는 2종의 화합물로부터 흔히 형성된다는 것이 언급되어 있다.
본 발명자들은 놀랍고도 예상치 못하게 이러한 임계점이 1:1.5 내지 1:3, 바람직하게는 1:2의 베타인(또는 베타인의 수화 형태):수소 결합 주개의 몰비에 대해서 시스템적으로 도달된다는 것을 발견하였다. 따라서, 상 다이어그램 상의 임계점은 자연 재료에 대한 추출 효율이 최적인, 추출 혼합물의 임계 조성에 상응하고, 이것은 지금까지 선행 작업이 설명할 수 없는 것으로 보인다.
또한, 애봇 등(특허 패밀리 제US 7183433호; Abbott, A. P., Capper, G., Davies, D. L., Rasheed, R. K., Tambyrajah, V., Novel solvents properties of choline chloride/urea mixtures, Chem. Commun., 2003, 7, 70-71)에 의해서 기술된 공융 혼합물의 형성 메커니즘은, 용융점의 하강이 수소 결합 주개와 아민염의 음이온(음으로 하전된 이온) 간의 수소 결합의 확립의 결과라고 가정한다. 따라서, 용융점의 하강이 어떤 음이온도 외인성으로 제공되지 않은 경우에 수득되는 하기에 제시된 결과를 발견한 것은 놀라운 것이다. 이는 베타인의 양쪽성 특징을 이용하는 과학적인 지식과 관련된 발전을 나타낸다. 많은 저자가 특히 패밀리 특허인 미국 특허 제7183433호에 기술된 공융 혼합물 및 이온성 액체 중의 아민염에 대해서 과도하게 초점을 맞춘 반면, 본 발명에 의해서 보호되는 자연 공융 혼합물은 (외인성으로 제공된) 음이온이 없이 아민을 시스템적으로 포함하는데, 그 이유는 음이온이 공융발생의 기전에 필수적이지 않기 때문이다.
추출 조성물과 관련하여, 본 발명은 점도를 공융 혼합물의 산업적인 용도 및 지정 둘 모두와 상용성인 역치로 낮추도록, 2원 혼합물 베타인:글리세롤 및 베타인:락트산(1:1.5 내지 1:3, 바람직하게는 1:2의 베타인:수소 결합 주개의 임계 몰비를 가짐) 중에 1 내지 50%, 바람직하게는 15 내지 30% 또는 20 내지 30%로 포함되는 외인성 물(즉, 제공되지 않아서, 베타인과 수소 결합 주개의 혼합물 중에 이미 존재하지 않음)의 중량 비율의 첨가를 개시한다. 구체적으로, 공융 용매의 초분자 복합체 특징부의 형성을 가능하게 하는 수소 결합은 50%를 초과하는 물의 부피 비율에 대해서는 파괴된다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. (Gutierrez M. C., Ferrer, M. L., Mateo, C. R., del Monte, F. Freeze-drying of aqueous solutions of deep eutectic solvents: a suitable approach to deep eutectic suspensions of self-assembled structures, Langmuir, 2009, 25, 5509-5515).
본 명세서에 정의된 바와 같이 물, 베타인, 및 폴리올과 유기산으로부터의 수소 결합 주개를 함유하는 3원 혼합물을 사용한 기술된 본 발명의 추출 방법은 베타인과 수소 결합 주개 간에는 1:1.5 내지 1:3, 바람직하게는 1:2의 임계 공융발생 몰비를 유지하고; 2원 혼합물(베타인:수소 결합 주개) 및 3원 혼합물(물:베타인:수소 결합 주개)에 대해서 일반적인 비를 유지하고, 본 발명의 추출 방법을 사용하여 수득된 추출물 내에 함유된 활성물질에서 상당한 개선을 제공한다.따라서, 방법은 대기 온도, 예컨대 약 10℃ 내지 약 80℃, 예컨대 약 20℃ 내지 약 60℃, 또는 약 25℃ 내지 약 45℃에서 액체이고, 당 생산, 석유 화학 및 생명공학의 부산물로서 산업적인 양으로 입수 가능한 농업- 및/또는 생물-기원의 자연 화합물, 예컨대 베타인, 폴리올(예컨대 글리세롤) 및 유기산(예컨대 락트산)을 기재로 하는 상이한 공융 혼합물에 의해서 수득될 크로마토그래피 프로파일의 풍부함을 개선시키고, 활성물질의 수율을 최대 45배 증대시키는 것이 가능하다.
본 발명의 추출 방법은 1 내지 5시간 동안, 바람직하게는 2시간 동안 교반하면서, 20 내지 60℃, 예컨대 약 25℃ 내지 약 45℃에서, 대기압 또는 저압, 예를 들어, 약 100 내지 약 500kPa의 압력에서 공융 용매 중에 침지된 분쇄되거나 분쇄되지 않은 생물 물질을 마서레이션(maceration), 퍼콜레이션(percolation) 및/또는 인퓨젼(infusion)하는 것으로 이루어진다. 추출상은 추출될 생물 물질 및 자연 재료에 대해서 완전히 불활성으로 유지되는 공융 추출 용매 중에 존재하는 화합물들 중 임의의 것들 간에서 임의의 화학적 변형을 수반하지 않는다.예를 들어, 공융 추출 용매 중에 존재하는 화합물 중 어느 것도 본 명세서에 기술된 추출 온도(< 60℃)에서 추출될 생물 물질 및 자연 재료와 공유 방식으로 반응하지 않고, 자연 재료들 간의 비-공유 상호 작용 만이 일어난다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "분쇄된"이 생물 물질이 공융 추출 용매 중에서 마서레이션, 퍼콜레이션 및/또는 인퓨젼되기 전에 마찰에 의해서 바수거나, 빻거나, 분말로 감소시키는 기계적인 힘에 적용된 것을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 통상의 기술자는 용어 "분쇄되지 않은"이 생물 물질이 공융 추출 용매 중에서 마서레이션, 퍼콜레이션 및/또는 인퓨젼되기 전에 임의의 기계적인 힘에 적용되지 않은 것을 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에 기술된 공융발생에 의한 본 발명의 추출 방법은 구체적으로 추출 유체 또는 액체 추출물에 외인성 보존제를 첨가하지 않고 최적의 미생물 안정성을 수득하도록 개발되었다. 공융 용매 중에서의 생물 물질의 마서레이션, 퍼콜레이션 및/또는 인퓨젼 후에, 여과 및 컨디셔닝 작업, 예를 들어, 백 및/또는 플레이트를 통한 여과의 완결 시에 수득된, 상기 추출물은 미생물학적 관점으로부터 안정한 것을 발견하였고, 즉 수득된 추출물은 초기 추출 단계에서 생물 물질 투입물의 미생물 하중에도 불구하고 인간 건강에 유해하고/거나 유독하다고 고려될 미생물 하중을 포함하지 않았다. 따라서, 수득된 공융 혼합물 및 추출물은 특별히 확인된 경우에, 특히 내분비 교란물질과 관련하여, 인간에서 독성 효과를 발휘할 수 있다고 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 보존제가 존재하지 않는다. 이들 용매의 양호한 미생물 안정성은 특히 비-독성 공융 용매 만을 사용하고, 이어서 잠재적으로 독성이 있는 항미생물제를 첨가하는 모순이 일어날 것이라는 사실을 고려할 때, 이의 안전성을 간접적으로 개선시키는 수단을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 자연 생물 화합물을 추출하는 방법을 제공한다:
a. 교반하면서, 분쇄되거나 또는 분쇄되지 않은 생물 물질을 본 발명에 따른 추출 용매 중에 침지시키는 단계, 이어서
b. 단계 a.에서 수득된 혼합물을 20 내지 60℃의 온도에서 마세레이션 또는 퍼콜레이션 또는 인퓨젼시키는 단계, 이어서
c. b.에서 수득된 추출 생성물을 여과하여, 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터 유래된 자연 생물 액체 추출물을 수득하는 단계.
b.에서 수득된 추출 생성물을 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 단계 c.에서 여과할 수 있다.
따라서, 추가 양상에서, 본 발명은 또한 이미 정의된 추출 방법 또는 용도에 의해서 수득되거나 수득 가능한 식물(예를 들어, 식물성) 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 포함하는 자연 생물 액체 추출물을 제공한다.
자연 생물 액체 추출물은 사용 전에 추가로 정제될 수 있거나 추출물은 임의의 추가 정제 없이 사용될 수 있다.사용될 수 있는 정제법의 예는 크로마토그래피, 증류, 및/또는 증발을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
특정 양상에서, 본 발명은 자연 생물 추출물 및 본 명세서에 정의된 바와 같은 공융 용매를 제공한다.전형적으로, 공융 용매는 약 0.01 내지 약 50중량%, 또는 약 0.1 내지 약 25중량%의 양으로 존재할 수 있다.
자연 생물 액체 추출물이 본 발명의 방법에 의해서 수득되는 경우, 여과 단계 c.가 존재하는 공융 용매 전부를 제거할 수 있다.대안적으로, 여과 단계는 추출 생성물 내에 존재하는 잔류하는 용매를 남길 수 있다.
따라서, 추가 실시형태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 공융 용매를 포함하는 자연 생물 액체 추출물을 제공한다.전형적으로, 공융 용매는 약 0.01 내지 약 50중량%, 또는 약 0.1 내지 약 25중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 방법에 의해서 추출될 수 있는 자연 생물 화합물은 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터의 페놀산 및 에스터, 플라보노이드, 세코이리도이드, 스틸벤 및 페놀 알코올, 뿐만 아니라 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료 및 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 색소, 안료, 계면활성제 및 사포닌을 비롯한 테르페노이드를 포함할 수 있다.
예를 들어,발명에 방법에 의해서 추출될 수 있는 자연 생물 화합물은 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터의 페놀산 및 에스터, 플라보노이드, 세코이리도이드, 페놀 알코올, 뿐만 아니라 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료 및 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 색소, 안료, 사포닌을 비롯한 테르페노이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 실시형태에서, 식물 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리, 점상권백, 틸란드시아 유스노이데스 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 식물 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리, 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 유래된 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질이 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리, 점상권백, 틸란드시아 유스노이데스 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 자연 생물 액체 추출물을 제공한다.예를 들어, 식물(예를 들어, 식물성) 생물 물질은 샤프란 꽃, 크리스멈 또는 제리코 장미로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 추출 방법은, 그것이 생물 물질을 추출하는 공정에 상승작용적/개선된 작용을 발휘한다는 점에서 특히 주목할 만하다. 또한, 상기 추출 방법을 실행함으로써 수득된 자연 생물 액체 추출물은 상기 추출물 중에 포함된 화합물의 생물학적 및/또는 물리-화학적 활성을 강화시킨다. 예를 들어, 벚꽃으로부터 수득된 결과는, 연구된 공융 혼합물을 사용하여 수득된 추출물이 (보다 통상적인 용매, 예컨대 화장품 산업 및 향료 산업에서 널리 사용되는 하이드로글리세린 혼합물과 비교할 때) 다양한 범위의 생물학적 활성, 예컨대 광-보호, 콜라겐 합성, 항-염증성 작용(TNFα 경로), 또는 UV 자극 이후의 제1형 매트릭스 메탈로프로테이나제(type 1 matrix metalloproteinases(MMP-1)의 방출 저해(광-노화에 대한 보호)에 걸쳐서 우수함을 명백히 보여준다.
샤프란 꽃, 크리스멈 및 제리코 장미를 사용하여 수득된 결과는, 어떤 활성도 없는 이의 하이드로글리세린 유사체와 비교되는 샤프란 꽃, 크리스멈 및 제리코 장미의 공융 추출물에 의해서 발휘되는 멜라닌 합성에 대한 강한 저해(저-착색 효과(hypo-pigmenting effect))(각각 대략 55, 33 및 36%)를 예증한다. 더욱이, 쇠뜨기의 공융 추출물에 대한 TNFα 저해(항-염증성 반응) 및 이의 항산화 활성은 동일한 식물의 하이드로글리세린 추출물의 것보다 훨씬 우수하다. 이것은 로즈마리에도 적용되는데, 베타인을 기재로 하는 공융 용매를 사용한 추출이 중량 기준으로 (1:1)의 물:글리세롤 혼합물을 사용하는 공정으로부터 유래된 추출물보다 2배 더 높은 항산화 활성을 유도한다. 추가로, 실시예는, 올리브 잎의 하이드로글리세린 추출물에 비해서 올리브 잎의 공융 추출물이 섬유모세포 모델에 대한 콜라겐 합성 및 광-보호가 더 양호함을 나타낸다.
본 발명자들은 추출 목적을 위해서 공융 용매를 사용함으로써 강화된 이들 생물학적 및/또는 물리-화학적 활성이 상응하는 크로마토그래피 프로파일에 비교적 정확하게 연관되었다는 것을 놀랍고도 예상치 못하게 발견하였다. 구체적으로, 공융 추출에 의해서 수득된 프로파일은 보다 통상적인 용매에 의해서 일반적으로 "달성 불가능"하다. 프로파일은 추출물 내의 특정 분자의 구체적인 양인 정량적인 관점에서, 뿐만 아니라 정성적인 관점에서 보다 더 상당히 상이하다.예를 들어, 통상적인 용매에 의해서 일반적으로 추출 가능한 분자의 대부분이 공융 추출물 중에 존재하지만, 후자는 하이드로글리세린 추출물로부터는 존재하지 않는 새로운 활성 재료를 함유한다. 예를 들어, 공융 용매의 사용으로 인해서 벚꽃에서는 카페오일 글루코사이드, 클로로겐산 및 다이카페오일퀸산이 처음으로 식별되었고, 뿐만 아니라 샤프란 꽃에서는 켐페롤-3-O-락틸-소포로사이드 이성질체가 처음으로 식별되었다. 이러한 새로운 피토(phyto)-활성물질의 발견은 공융 추출물의 개선된 특성(그것이 생물학적 특성이든지 물리-화학적 특성이든 관계없음)을 강조하고, 신규 활성을 나타내는 추출물의 사용에 대한 길을 열어둔다. 예를 들어, 벚꽃의 공융 추출물에서 발견된 다이카페오일퀸산은 후천성 면역결핍 증후군 또는 AIDS의 병인에 관여된 제1형 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1)의 선택적이고 상당히 효과적인 저해제이다(Robinson et al., Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodeficiency virus integrase: inhibition of the core catalytic domain of human immunodeficiency virus integrase, Mol. Pharmacol. 1996, 50, 846-855).
추가 양상에서, 본 발명은 경구, 비경구로 투여되려는 의도이거나, 또는 국소, 직장, 코, 귀, 질 및/또는 눈 적용을 위한 의도인, 뉴트라슈티컬 조성물, 인간 또는 동물용 식이 또는 식품, 영양 보충제, 향제, 약제학적 제형, 포도주 양조학적 제형 또는 화장품 제형의 제조를 위한 본 명세서에 정의된 자연 생물 액체 추출물의 용도를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 뉴트라슈티컬 조성물, 인간 또는 동물용 식이 또는 식품, 영양 보충제, 향제 또는 향미제, 약제학적 조성물, 포도주 양조학적 조성물 또는 화장품 조성물의 제조를 위한 상기 자연 생물 액체 추출물의 용도를 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 뉴트라슈티컬 조성물, 식이 또는 식품, 영양 보충제, 약제학적 조성물, 또는 화장품 조성물의 제조를 위한 상기 자연 생물 액체 추출물의 용도를 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 또한 뉴트라슈티컬 조성물, 인간 또는 동물용 식이 또는 식품, 영양 보충제, 향제 또는 향미제, 포도주 양조학적 제형 또는 화장품 제형에서의 액체 추출물의 용도를 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 자연 생물 액체 추출물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 약제학적 조성물에서 사용하기 위해서 정의된 바와 같은 액체 추출물을 제공하고, 추가로 광-보호, 항-광-노화, 저-착색(hypo-pigmenting), 미백(bleaching), 항-노화, 항-산화, 항-라디칼, 산소 반응성 종 감소제, 발전된 당화(glycation) 최종-산물 감소제, 메탈로프로테이나제 저해제, 항-염증제, 피부 수딩제(skin soothing agent), 콜라겐 합성 활성화제, 수화제(hydrating agent), 피부를 위한 장벽 기능 복원제 또는 세포 접착 및 응집 개선제로서 사용하기 위한 액체 추출물 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
예를 들어, 액체 추출물 또는 약제학적 조성물은 광-보호, 항-광-노화, 저-착색, 미백, 항-노화, 항-산화, 항-라디칼, 산소 반응성 종 감소제, 메탈로프로테이나제 저해제, 항-염증제, 피부 수딩제, 콜라겐 합성 활성화제, 수화제, 또는 피부를 위한 장벽 기능 복원제로서 사용될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 조성물 또는 제형은 경구 또는 비경구로 투여되려는 의도이거나, 또는 국소, 직장, 코, 귀, 질 및/또는 눈 적용을 위한 의도이다.
추가 양상에서, 본 발명은 광-보호제, 장벽 기능 보호제, 항-산화제 및 항-광-노화제로서의 벚꽃으로부터 유래된 자연 생물 액체 추출물을 제공한다.예를 들어, 벚꽃으로부터 유래된 자연 생물 액체 추출물은 광-보호제 및 항-광-노화제로서 작용할 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 광-보호제, 장벽 기능 보호제, 항-산화제 및 항-광-노화제로서의 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리, 점상권백, 틸란드시아 유스노이데스 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 유래된 자연 생물 액체 추출물을 제공한다.
본 명세서에 제공된 데이터는 물 중의 공융 액체 추출물의 제형이 예를 들어 0.001 내지 10%, 바람직하게는 0.01 내지 1%(v)의 생물학적 및/또는 물리-화학적 활성의 높은 수준을 얻는 것을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 본 명세서에 청구된 특정 수의 공융 추출물은 이의 하이드로글리세린 유사체의 추출물보다 더 높은 활성을 발휘하는데, 이의 하이드로글리세린 유사체의 추출물이 최종 액체 제형 중에 10배 더 농축되는 경우에도 그러하다.
표 4에 제시된 추출 액체의 다른 조성물을 시험하였고, 이는 일반적으로 대기 온도, 그리고 저온 또는 고온인 경우에서 결정화하는 혼합물의 형성으로 이어졌기 때문에, 임의의 생물 물질로부터의 임의의 추출이 불가능하였다. 추가로, 시트르산을 사용한 시험 또한 베타인으로부터 안정한 추출 공융 혼합물을 수득하는 것의 어려움을 나타낸다. 표 3은 매질의 거시적인 외관에 대한 2원 혼합물 베타인:시트르산의 조성물의 영향을 나타낸다. 50:50 또는 40:60의 몰비는 비 20:80과 비교할 때 결정상의 형성을 1주일 이후로 연장시키는 것이 가능하지만, 그러나 본 발명자들은 이러한 조건이 산업적인 발전에 도움이 되지 않는다는 것을 주목한다.
본 명세서 실시예 4에서는, 당뿐만 아니라, 산업적인 관점으로부터 잠재적으로 흥미가 있는 것으로서 일반적으로 제공되고, 흔히 당을 포함하는, 다수의 공융 혼합물은 50℃에서 황색, 주황색 또는 갈색으로 변하고, 중합되고, 탁해지거나 결정화된다는 것이 또한 인지될 수 있다(표 4). 적은 수의 혼합물이 4℃, 대기 온도 및 50℃에서 1개월 초과 동안 액체이고, 투명하게 남아있고; 3원 혼합물 베타인:글리세롤:물(2:3, 몰량 및 25중량%의 물) 및 베타인:락트산:물(2:3, 몰량 및 25중량%의 물)은 유체의 부분을 형성하고, 이들 자체는 화장품, 약제학적 또는 식품 용도를 위해서 의도되는 제형의 색상에 대해서 영향을 갖지 않는다. 다시 말해서, 생물 물질로부터 색소 재료를 추출함으로써 이미 부여된 색상에 추출 유체에 내재하는 임의의 색상 하중이 추가되지 않을 것이다.
추가 양상에서, 본 발명은 상기 추출물 중에 포함된 화합물의 생물학적 및/또는 물리-화학적 활성을 강화시키는 것을 특징으로 하는, 정의된 바와 같은 자연 생물 액체 추출물을 제공한다.
궁극적으로, 본 발명에 청구된 공융발생에 의한 추출 방법의 적용에 의해서 수득된 액체 추출물은 보다 통상적인 용매, 예컨대 화장품, 뉴트라슈티컬 및 약제학적 산업에서 일반적으로 사용되는 물 또는 하이드로-글리세린 혼합물과 비교할 때 증가된 관심 화합물 함량을 갖는다. 더욱이, 본 발명의 공융 용매 및 방법은 또한 예를 들어, 임계 미만(subcritical)의 물을 사용하는 최신의 심화된 추출 기술을 수행할 뿐만 아니라 그것보다 훨씬 더 양호하게 수행할 수 있다.
상당히 많은 수의 생물 물질로부터 수득된 공융 추출물은 광-보호제, 항-광-노화제, 저-착색제, 미백제, 항-노화제, 항산화제 및 항라디칼제, 산소 반응성 종 감소제, 발전된 당화 최종-산물 감소제, 메탈로프로테이나제 저해제, 항-염증제, 피부 수딩제, 콜라겐 합성 활성화제, 수화제, 피부의 장벽 기능 복원제 또는 세포 접착 및 응집 개선제로서 잠재적인 응용을 갖는다.
예를 들어, 수득된 추출물은 광-보호제, 항-광-노화제, 저-착색제, 미백제, 항-노화제, 항산화제, 항라디칼제, 산소 반응성 종 감소제, 메탈로프로테이나제 저해제, 항-염증제, 피부 수딩제, 콜라겐 합성 활성화제, 수화제, 또는 피부를 위한 장벽 기능 복원제로서 사용될 수 있다.
상기 공융 용매의 추출 능력으로 인해서, 추출된 생물 물질로부터 새로운 생물학적 특성이 발휘될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은, 벚꽃의 공융 추출물에 대해서 발견된 활성은 광-노화와 관련하여 보호 특성을 갖고, 화장품, 뉴트라슈티컬 및/또는 식품 제제로서 사용될 수 있는 것을 발견하였다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 280 내지 400nm를 포함하는 파장 범위의 광 방사선이 인간 표피의 갈변을 유도한다고 알려진 것을 알고 있다. 280 내지 320nm(UV-B)를 포함하는 범위의 방사선은 자연 태닝에 악영향을 미치는 피부의 홍반 및 화상을 유발한다. 320 내지 400nm의 UV-A 선은 특히, 세포외 기질의 와해를 통한 탄력 손실 및 조기 노화의 외관으로서 나타나는 피부의 변화를 유발한다. 따라서 심미적인 이유 및 건강 이유를 위해서 이러한 만족스럽지 않은 효과를 제어하는 수단에 대한 요구가 매우 높다. 본 발명에 기술된 벚꽃 추출물은 (i) UV 방사선에 의해서 유도된 염증성 반응을 제어하기 위한 작용제로서, (ii) UV 노출 이후의 세포외 기질의 와해의 저해제로서, 그리고 (iii) UV에 노출된 세포의 세포 생존력의 보호제로서 작용할 수 있다.
추가로, 공융 용매는 식용 가능하고, 비-독성이기 때문에, 상응하는 추출물은 0.001 내지 20% 또는 0.01 내지 20%, 바람직하게는 0.01 내지 10% 또는 0.1 내지 10%, 이상적으로는 0.05 내지 5% 또는 1 내지 5% 범위의 최종 제품 중의 혼입 비율로 (인간 및 동물용) 식품 및 음료, 뿐만 아니라 화장품 제품, 뉴트라슈티컬 제품, 약용 화장품, 포도주 양조 제품, 방향 제품(향제 및 향미료) 및 약제학적 제품으로 직접 제형화될 수 있다. 공융 혼합물 중의 용액 중에 관심 화합물이 풍부한 액체 추출물은 또한 경구 또는 비경구 경로를 통해서, 또는 국소, 직장, 코, 귀, 질 및/또는 눈 적용을 통해서 직접 소비될 수 있다.
통상의 기술자는 본 발명의 특정 양상에 대한 본 명세서에서의 모든 언급은 모든 실시형태에 대한 언급 및 본 발명의 이러한 양상의 하나 이상의 실시형태의 조합에 대한 언급을 포함한다는 것을 이해할 것이다.따라서, 본 발명의 특정 양상의 모든 실시형태는 본 발명의 이러한 양상의 하나 이상의 다른 실시형태와 조합되어 본 발명의 교시로부터 벗어나지 않으면서 추가 실시형태를 형성할 수 있다.
실험 방법
1.
공융
용매의 제조
공융 혼합물의 상이한 구성성분(글리세롤, 락트산, 시트르산 및 베타인)을 특별한 순서 없이 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 칭량하였다. 이어서, 수돗물, 그러나 바람직하게는 탈미네랄수 또는 증류수를 물리-화학적 온전성 및 미생물 온전성을 보존할 중량 기준 농도, 1 내지 50%, 바람직하게는 15 내지 35%로, 이상적으로는 혼합물의 25중량%를 차지하게 첨가한다. 본 명세서에서 선택된 공융 혼합물은 베타인:시트르산(2:3, ㏖), 베타인:글리세롤(2:3, ㏖) 및 베타인:락트산(2:3, ㏖)이고, 각각은 25중량%의 물을 함유하지만, 베타인 및 본 명세서에 정의된 수소 결합 주개의 다른 조합이 사용될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 혼합물을 자석 교반하에서 50℃ +/- 2℃로 가열하여, 균질화시킨다. 매질이 완전히 용해 및 용융된 후, 그것을 대기 온도에 놓고, 이어서 사용시까지 용기에 저장한다.
2.
50℃에서
마서레이션에
의한 고체/액체 추출
로즈마리를 제외한, 다양한 미리-건조된 식물(예를 들어, 식물성)매트릭스를 분쇄하고(IKA 수동 분쇄기), 이어서 통상적인 용매(물, 물/글리세롤, 물/락트산, 물/시트르산) 또는 공융 용매(실시예 참고) 중에 침지시켰다. 5%의 식물(예를 들어, 식물성) 매트릭스(20M)의 비를 추출 모두에 대해서 적용하였다. 혼합물을 100㎖ 유리 비커에서 자석 교반 하에서 50℃에서 2시간 동안 가열하였다. 1회 경로를 수행하고, 그 후 매질을 25㎛ 백 필터 또는 플레이트 필터를 통해서 고온 여과하고, 이어서 다시 5 내지 7㎛ 플레이트 필터에 통과시킨다.
3.
임계미만
물에 의한 추출의 증대
미리-건조된 식물(예를 들어, 식물성) 매트릭스를 분쇄하고(IKA 수동 분쇄기), 이어서 150㎖ 유리 반응 용기에서 물 중에 침지시켰다. 5%의 식물(예를 들어, 식물성) 매트릭스(20M)의 비를 추출에 대해서 적용하였다. 온도를 균질화시키기 위해서, 반응기를 증류수(700㎖)로 둘러싸고, 마이크로파 공동부에 넣는다. 고성능 마이크로파 반응기(1.2kW, 이탈리아 마일스톤 소재의 울트라클레이브(UltraClave))에 의해서 추출을 수행한다. 추출을 시작하기 전에, 진공하에 용기를 둠으로써 산소를 제거하고, 이어서 반응기 공간 및 추출 매질을 30bar의 초기 압력에서 질소로 포화시킨다. 각각 질소 유동 및 마이크로파 가열에 의해서 설정치 압력 및 온도에 도달한다. 추출 온도를 125℃로 설정하고, 초기 압력은 30bar이다. 이들 두 파라미터를 외부 센서에 의해서 제어한다. 온도가 125℃의 설정치 값에 도달할 때(본 발명자의 경험에서 15분 이내), 추출을 단일 경로로 30분 동안 수행한다. 추출이 완결되면, 매질을 25㎛ 백 필터 또는 플레이트 필터를 통해서 고온 여과하고, 이어서 다시 5 내지 7㎛ 플레이트 필터에 통과시킨다.
4.
고 성능
액체 크로마토그래피(
HPLC
)에 의한 관심 화합물의 정량분석
이렇게 수득된 액체 추출물을 예비 농축 또는 건조 없이 HPLC에 의해서 직접 분석한다.
4.1.
로즈마리의
액체 추출물 중의 로즈마린산의 비율
분석 표준(Extrasynthese - reference: 4957S)을 사용하고, 검정선을 플로팅함으로써 로즈마린산의 정량분석 및 식별을 수행한다. 앨리전트(Agilent) 1100 HPLC 장치에 UV-Visible DAD 검출기 또는 등가물을 장치한다. 99% 트라이플루오로아세트산(TFA)이 첨가된 HPLC 등급 아세토나이트릴과 HPLC 등급 물의 혼합물을 통한 용리 구배를 사용한다. 하기 크로마토그래피 조건을 사용한다:
- 조르박스 에클립스(Zorbax Eclipse) XDB C18 칼럼, 1.8㎛, 4.6mm x 50mm 또는 등가물.
- 이동상:
- 유량: 2㎖/분
- 검출: 328nm
- 온도: 60℃
- 주입 부피: 2㎕
- 압력: 210bar ± 5bar
하기 체류 시간이 관찰된다:
4.2. 올리브 잎 액체 추출물 중의
올러유러핀(oleuropein)의
비율:
분석 표준(Extrasynthese - reference: 0204)을 사용하고, 검정선을 플로팅함으로써 올러유러핀의 정량분석 및 식별을 수행한다. 앨리전트 1100 HPLC 장치에 UV-Visible DAD 검출기 또는 등가물을 장치한다. 99% 트라이플루오로아세트산(TFA)이 첨가된 HPLC 등급 아세토나이트릴과 HPLC 등급 물의 혼합물을 통한 용리 구배를 사용한다. 하기 크로마토그래피 조건을 사용한다:
- 조르박스 에클립스 XDB C18 칼럼, 1.8㎛, 4.6mm x 50mm 또는 등가물.
- 이동상:
- 유량: 1.5㎖/분
- 검출: 230nm
- 온도: 40℃
- 주입 부피: 2㎕
- 압력: 210bar ± 5bar
하기 체류 시간이 관찰된다:
5. 고-성능 액체 크로마토그래피에 의한 액체 추출물의 화학적 특징분석
생성된 다양한 추출물 중에 존재하는 화합물의 식별 및 정량분석을 위해서 본 명세서 하기의 크로마토그래피 조건을 적용하였다.
· 분석 칼럼: 아틀란티스(Atlantis) T3 150 x 4.6mm C18 - 5㎛ 또는 등가물
· 온도: 30℃
· 유량: 0.6㎖/분
· 압력: 60 내지 100bar
· 검출: 정량분석될 화합물에 따라서 - 350 또는 280nm.
· 주입 부피: 7㎕
· 이동상:
A : 아세토나이트릴:H2O(450/50 v:v) + 0.1% 아세트산
B : H2O + 0.1% 아세트산
6. 안정성 시험
공융 혼합물을 수득한 후, 예를 들어 화장품 용도를 위해서 제형 중에서의 이의 영향을 평가하기 위해서, 시간에 따른 이의 거동을 상이한 3개의 온도(4℃, 대기 온도, 50℃)에서 모니터링한다. 구체적으로, 산업적인 맥락에서, 추출물은 산업 공정 동안 그리고 소비자가 사용하는 동안 이의 색상 온전성을 유지할 수 있어야 한다.
7. 항산화제로서의 물리-화학적 효능의 시험
AOAC 공식 저널에 우(Ou) 등에 의해서 공개된 표준 방법(Ou et al. Determination of total antioxidant capacity by oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using fluorescein as the fluorescent probe: First action 2012.23. Journal of AOAC International, 2013, 96, 1372-1376)을 사용하여 퍼옥시라디칼을 포획하는 추출물의 능력을 측정한다. 정보를 위해서, AOAC는 미국 농무부(United States Department of Agriculture: USDA)의 공식 농화학자 협회(Association of Official Agricultural Chemists)이다. 목적하는 항산화제 농도(0 내지 40μM)를 함유하는 모든 인산염 완충제 용액(pH 7.2)을 즉석으로 제조한다. 각각의 용액 50밀리리터를 멀티-채널 피펫에 의해서 플루오트랙(Fluotrac) 96-웰 마이크로플레이트(그레니어(Greiner))로 옮긴다. 이어서 각각의 웰을 0.126μM의 플루오레세인 다이소듐염을 함유하는 100㎕의 인산염 완충제 용액, pH 7.2으로 채운다. 반복성을 개선시키기 위해서, 마이크로플레이트를 온도-제어되는 써모쉐이커(thermoshaker)(PHMT 시리즈, 영국 쉐프레트 소재의 그랜트 인스트루먼츠 엘티디(Grant Instruments Ltd))에서 1200rpm에서의 궤도 교반 하에서 37℃에서 예열한다. 이어서, 새로 제조된 인산염 완충제 용액 중의 AAPH 용액 50㎕를 다중-채널 피펫을 사용하여 첨가한다. 궁극적으로, 각각의 웰은 인산염 완충제 용액 중의 0.063M의 플루오레세인 다이소듐염, 12.7mM의 AAPH 및 증가하는 농도의 항산화제(0에서 10μM까지)로 구성된 최종 혼합물 200㎕를 함유한다. 515nm(λex: 490nm)에 대한 형광의 감소를 즉시 기록한다. 각각의 측정 전에 5초 교반하면서, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 2시간 동안 37 ± 0.1℃에서 매분 마다 측정을 수행한다. 이어서, 문헌[Ou et al. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity using fluorescein as the fluorescent probe. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4619-4626]에 따라서 액체 추출물 g 당 트롤록스(Trolox) 등가물의 μ㏖(ORAC 값) 단위로 결과를 계산한다.
8. 생물학적 효능 시험
사용된 각각의 세포 유형에 따라서 비-세포독성 농도에 대해서 모든 효능 시험을 수행하였다.
8.1. 항-염증 활성(
TNFα의
저해)
항-염증 활성의 시험관내 시험은, 각질세포가 태양 노출 후 유도될 수 있는 강한 염증성 반응을 기반으로 한다. 패시지 넘버(passage number)가 50 미만인 HaCaT 세포(인간 불멸성 각질세포(human immortalized keratinocyte), 라이프-테크놀로지(Life-technology), N° P612451, 배취 09543)를 사용하였다. 하기 세포 배지에서 세포를 배양하였다: 페니실린(100IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖; 팬 바이오테크(PAN BIOTECH), 배취 20145241), 및 10% 불활성화 우태 혈청(팬 바이오테크, 배취 P440011)(pH 7.2)이 보충된 L-글루타민을 갖는 DMEM(둘베코 최소 필수 영양 배지(Dulbecco's Minimum Essential Medium), 팬 바이오테크. 배취 97487).
염수 용액(HBSS, 시그마)을 사용한 음성 대조군 및 10μM의 덱사메타손을 사용한 양성 대조군을 준비하였다.
1.105세포/㎖(500㎕/웰)를 48-웰 배양 플레이트 내의 배양물에 넣고, 37℃(5% CO2)에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 기간 이후에, UV 자극 전에 세포를 시험될 추출물을 함유하는 무-혈청 배지를 갖는 배양물 중에 1시간 동안 넣었다. 제논 램프(1100W)가 장치된 선테스트 CPS+ 자극기(Suntest CPS+ simulator)(프랑스 무지 르 네프 소재의 아틀라스 머티리얼 테스팅 테크놀로지 비브이(Atlas Material Testing Technology BV))를 사용하여 조사를 수행하였다. 복사 조도를 15mJ/cm2 정도의 조합된 광 용량을 갖는 750W/m2에서 1분 동안 설정하였다.이어서 세포를 24시간 동안 재-배양하였다.
이 인큐베이션 기간 이후에, 세포에 의해서 방출된 TNF-알파를 측정하기 위해서 상청액을 배양물로부터 회수하였다. 엘리자 랩068(ELISA RAB068) 인간 TNF-알파 키트(시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH))를 이러한 목적을 위해서 사용하였다. 이어서 인피니트 M200 프로 마이크로플레이트 리더(Infinite M200 Pro microplate reader)(테칸(TECAN))를 사용하여 450nm에서 각각의 웰의 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 이어서, 양성 대조군에 관련하여 보호 증가(% 단위)를 표현하기 위해서 수득된 결과를 미처리 웰과 비교하였다:
8.2. 멜라닌형성 저해 활성(저-착색 효과)
이 시험에 대해서 설정된 생물학적 모델은 NHEM-LP 세포 유형(인간 멜라닌세포용, 약간 착색됨)이었다. 이들 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 HMGS-2(PMA 없음), 인슐린(5㎍/㎖), 페니실린(50㎍/㎖), 스트렙토마이신(50㎍/㎖) 및 젠타마이신(25㎍/㎖)이 보충된 M254의 배지 중의 배양물 중에 넣었다.
제1 예에서, 시험하에서 공융 추출물의 비-세포독성 농도를 평가하였다. 이러한 목적을 위해서, 상이한 인큐베이션 시간을 시험하였다. 이러한 연속적인 자극의 완결 시에, NHEM-LP 세포를, 미토콘드리아 효소 석시네이트 탈수소효소에 의해서 청색 포르마잔 결정으로 환원되는 MTT(테트라졸륨 염)과 함께 인큐베이션시켰다. DMSO에 의해서 포르마잔 결정을 용해시킨 후에 광학 밀도를 마이크로-플레이트 리더(버사맥스(VERSAmax), 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 측정하였다.
멜라닌세포를 24-웰 플레이트 내의 배양물 중에 24시간 동안 넣었다. 24시간 후에 배지를 변화시켰고, 미리-자극된(또는 미리-자극되지 않은) 배지에 의해서 교체하였다. 양성 대조군은 L-티로신(1mM)의 존재하에서 리포산(5㎍/㎖)에 의한 세포의 자극으로 이루어졌다.대조군(비-자극 웰)이 또한 플레이트 상에 존재하였다. 이어서 세포를 10일 동안 인큐베이션시켰는데, 인큐베이션 3일 및 7일 이후에 2번 새롭게 처리하였다. 인큐베이션이 끝난 후에, 상청액을 회수하고, 세포 층 상에서 멜라민 합성을 정량분석하였다. 이러한 목적을 위해서, 0.5N의 NaOH 용액을 사용한 세포 용해에 의해서 멜라닌을 추출하였다. 이어서, 광학 밀도를 405nm에서 측정하였다. 표준법에 따라서 미리 검정된 검정선(0.39 내지 100㎍/㎖의 표준선)을 사용하여 정량분석을 수행하였다.
저해 백분율을 하기 수학식에 의해서 계산하였다:
8.3. 광-보호 효과
광-보호 효과를 평가하기 위한 시험관내 시험을 사용하여 태양 방사선의 세포독성 용량에 노출된 세포 생존력에 대해서 광-보호 특성을 갖는 화합물 또는 추출물을 식별하였다.
2종의 프로토콜을 사용하였다:
- 태양 방사선에 노출시키기 전에 시험하에서 세포를 추출물로 사전-처리함,
- 태양 방사선에 노출시킨 후 세포를 추출물로 사후-처리함.
세포막을 관통하여, 세포내 리소좀에 축적되는 약한 양이온성 염료인 뉴트럴 레드(neutral red)를 사용하여 노출 24시간 후에 세포 독성을 측정하였다. 이러한 시험관내 시험은 패시지 넘버가 50 미만인 HaCaT 각질세포(인간 불멸성 각질세포, 라이프-테크놀로지, N° P6110401, 배취 09I006)의 세포주 상에서 수행하였다. 하기 배지에서 세포를 배양하였다: 페니실린(100IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖; 팬 바이오테크, 배취 9230112), 및 10% 불활성화 우태 혈청(팬 바이오테크, 배취 P290907)(pH 7.2)이 보충된 L-글루타민을 갖는 DMEM(둘베코 최소 필수 영양 배지, 팬 바이오테크. 배취 5530513).
염수 용액(HBSS, 시그마)을 사용한 음성 대조군 및 10, 20 및 50㎍/㎖ 농도의 트롤록스(시그마)를 사용한 양성 대조군을 준비하였다.
1.105세포/㎖(500㎕/웰)를 48-웰 배양 플레이트 내의 배양물에 넣고, 37℃(5% CO2)에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 사전-처리 프로토콜에서, 배양 배지를 1시간 동안 37℃(5% CO2)에서 세포와 접촉한, 상이한 농도의 추출물을 함유하는 염수 용액 100㎕로 대체하였다. 이러한 인큐베이션 시간이 끝난 후에, 자극을 제거하여 HBSS 100㎕로 대체하였다. 이어서, 제논 램프(1100W)가 장치된 선테스트 CPS+ 자극기(프랑스 무지 르 네프 소재의 아틀라스 머티리얼 테스팅 테크놀로지 비브이)를 사용하여 조사를 수행하였다. 복사 조도를 20mJ/cm2 정도의 조합된 광 용량을 갖는 750W/m2에서 4분 동안 설정하였다.이어서, 세포를 종래의 배양 배지 중에서 18 내지 22시간 동안 배양물 중에서 대체하였다. 사후-처리 프로토콜에서, 배양 배지를 HBSS 염수 용액 100㎕로 대체한다. 이어서, 제논 램프(1100W)가 장치된 선테스트 CPS+ 자극기(프랑스 무지 르 네프 소재의 아틀라스 머티리얼 테스팅 테크놀로지 비브이)를 사용하여 조사를 수행하였다. 복사 조도를 20mJ/cm2 정도의 조합된 광 용량을 갖는 750W/m2에서 4분 동안 설정하였다. 이어서, 세포를 상이한 비-세포독성 농도를 갖는 추출물을 사용하여 자극시켰고, 종래의 배양 배지 중에서 18 내지 22시간 동안 배양물 중에서 대체하였다.
두 프로토콜 모두에서, 인큐베이션 18 내지 22시간 후에, 세포를 세척하고, 이어서 뉴트럴 레드 50㎍/㎖를 함유하는 배지 중에 넣고, 37℃ 및 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 배지를 제거하여 세포를 세척하고, 과량의 뉴트럴 레드를 제거하였다. 탈색 용액(50% 에탄올, 1% 아세트산, 49% 증류수; 웰 당 50㎕)을 세포에 첨가하였다. 이어서 48-웰 플레이트를 광을 피해서 대기 온도에서 15 내지 20분 동안 아지테이션하였다. 세포 막 손상 정도(레드 뉴트럴의 방출 증가)를 인피니트 M200 프로 마이크로플레이트 리더(테칸)를 사용하여 540nm에서 측정하였다. 이어서, 각각의 웰의 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 이어서, 양성 대조군에 관련하여 보호 증가(% 단위)를 표현하기 위해서 수득된 결과를 미처리 웰과 비교하였다(HBSS, 100% 세포 생존력):
8.4. 제1형 매트릭스
메탈로프로테이나제의
방출 저해(광-
노화에 대한 보호 효과
)
제1형 매트릭스 메탈로프로테이나제는 조직 리모델링의 다양한 생리학적 기전에 관여된 사이질 콜라게나제(interstitial collagenase)이다. 이것은 특히 광-노화에서 UV에 반응하여 피부 조직의 구조 및 구성을 파괴하는 역할을 한다.
항-MMP-1 시험관내 시험은 UV에 의한 자극 후에 MMP-1을 방출하는 각질세포의 능력을 기초로 한다. 패시지 넘버가 50 미만인 HaCaT 세포(인간 불멸성 각질세포, 라이프-테크놀로지, N° P6110401, 배취 091006)를 하기 세포 배지에서 사용하였다:
페니실린(100IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖; 팬 바이오테크, 배취 20145241), 및 10% 불활성화 우태 혈청(팬 바이오테크, 배취 P440011)(pH 7.2)이 보충된 L-글루타민을 갖는 DMEM(둘베코 최소 필수 영양 배지), 팬 바이오테크. 배취 97487).
염수 용액(HBSS, 시그마)을 사용한 음성 대조군 및 아스코르브산(25μM)을 사용한 양성 대조군을 준비하였다.
1.105세포/㎖(500㎕/웰)를 48-웰 배양 플레이트 내의 배양물에 넣고, 37℃(5% CO2)에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 기간 이후에, UV 자극 전에 세포를 시험하의 추출물을 함유하는 무-혈청 배지를 갖는 배양물 중에 1시간 동안 넣었다. 제논 램프(1100W)가 장치된 선테스트 CPS+ 자극기(프랑스 무지 르 네프 소재의 아틀라스 머티리얼 테스팅 테크놀로지 비브이)를 사용하여 조사를 수행하였다. 복사 조도를 15mJ/cm2 정도의 조합된 광 용량을 갖는 750W/m2에서 1분 동안 설정하였다.이어서 세포를 24시간 동안 재-배양하였다.
이 인큐베이션 기간 이후에, 세포에 의해서 방출된 MMP-1을 측정하기 위해서 상청액을 배양물로부터 회수하였다. 엘리자 레이바이오(ELISA RayBio) 인간 MMP-1 키트(시그마-알드리치)를 이러한 목적을 위해서 사용하였다. 이어서 인피니트 M200 프로 플레이트 리더(테칸)를 사용하여 450nm에서 각각의 웰의 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 이어서, 양성 대조군에 대한 %로 보호 증가를 표현하기 위해서 수득된 결과를 미처리 웰과 비교하였다:
8.5. 콜라겐 합성의 활성화
콜라겐은 피부의 온전성을 유지하고, 특히 피부에 이의 지속성 및 밀도를 제공하고, 이것에 건강하고 젊은 외관을 부여하는 역할을 하는, 세포외 기질의 주요 구조 단백질이다. 콜라겐 측정 시험은 평가될 추출물로 처리된 피부 세포 내에서 합성된 세포외 기질 내의 가용성 콜라겐을 정량분석하는 수단을 제공한다. 서콜 시험(Sircol test)(영국 소재의 바이오컬러(Biocolor))을 통해서, 따라서 하이드록시프롤린 잔기에 대한 시리어스 레드(Sirius Red)의 염색 및 결합 능력을 사용하여 콜라겐을 검출하였다.
패시지 넘버가 5 미만인, 1차 인간 섬유모세포(바이오프레딕(Biopredic))를 하기 배지 중의 배양물 중에 넣었다:
페니실린(100IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖; 팬 바이오테크, 배취 9870214), 및 10% 불활성화 우태 혈청(팬 바이오테크, 배취 P342518)(pH 7.2)이 보충된 L-글루타민을 갖는 DMEM(둘베코 최소 필수 영양 배지), 팬 바이오테크. 배취 5842156).
염수 용액(HBSS, 시그마)을 사용한 음성 대조군 및 아스코르브산(50㎍/㎖)을 사용한 양성 대조군을 준비하였다.
5.105세포/㎖(1000㎕/웰)를 24-웰 배양 플레이트 내의 배양물에 넣고, 37℃(5% CO2)에서 24시간 동안 융합에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 기간 이후에, 세포를 상이한 농도에서 72시간 동안 시험하의 추출물을 함유하는 무-혈청 배지를 갖는 배양물 중에 넣었다. 이어서, 서콜 방법을 사용하는 검출 프로토콜을 적용하였다. 보다 정확하게는, 배양 배지를 트리스(TRIS)-HCl 완충제(pH 7.6) 중의 폴리에틸렌 글리콜 100㎕와의 원심분리를 위해서 수집하였고, 이어서 0 내지 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서, 서콜 염료 시약 1㎖를 첨가하기 위한 상청액을 회수하기 위해서 샘플을 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 대기 온도에서 30분 동안 아지테이션 후, 튜브를 12000rpm에서 10분 동안 다시-원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 아세트산/염화나트륨/세제의 혼합물을 함유하는 시약 750㎕를 첨가하였다. 다시-원심분리한 후, 알칼리 시약(0.5M의 수산화나트륨) 250㎕를 첨가하기 위해서 상청액을 제거하였다. 아지테이션 후, 인피니트 M200 프로 마이크로플레이트 리더(테칸)을 사용하여 555nm에서 흡광도를 측정하기 위해서 200㎕를 각각의 웰로부터 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 이어서, 양성 대조군에 관련하여 보호 증가(% 단위)를 표현하기 위해서 수득된 결과를 미처리 웰과 비교하였다:
도면
도 1은베타인 일수화물과 락트산(수소 결합 주개) 간의 2상 다이어그램으로서 하기에 기술된 바와 같은 실시예 1로부터 수득된 결과를 나타낸 도면. 베타인 일수화물과 락트산의 비율은 몰%로 제공된다.
도 2는베타인 일수화물과 글리세롤(수소 결합 주개) 간의 2상 다이어그램으로서 하기에 기술된 바와 같은 실시예 2로부터 수득된 결과를 나타낸 도면. 베타인 일수화물과 글리세롤의 비율은 몰%로 제공된다.
도 3은베타인 일수화물과 시트르산(수소 결합 주개) 간의 2상 다이어그램으로서 하기에 기술된 바와 같은 실시예 3으로부터 수득된 결과를 나타낸 도면. 베타인 일수화물과 시트르산의 비율은 몰%로 제공된다.
도 4는 물 및/또는 베타인 및/또는 락트산으로 구성된 추출 유체에 따른 로즈마린산의 회수 수율을 나타내는 하기에 기술된 바와 같은 실시예 5로부터 수득된 결과를 나타낸 도면.
도 5는 물 및/또는 베타인 및/또는 글리세롤로 구성된 추출 유체에 따른 로즈마린산의 회수 수율을 나타내는 하기에 기술된 바와 같은 실시예 6로부터 수득된 결과를 나타낸 도면.
도 6은 하기에 기술된 바와 같은 실시예 7에서 수득된 로즈마리의 액체 추출물로부터 수득된 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 230nm)을 나타낸 도면, 여기서 1은 식별되지 않은 화합물이고, 2는 로즈마린산이고, 3은 루테올린-3-O-글루쿠로나이드이고, 4는 루테올린-3'-(4"-아세틸글루쿠로나이드) 이성질체이고, 5는 로즈마놀이고, 6은 카르노솔이고, 7은 메틸 카르노세이트이다.공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 7은 산소 라디칼 흡수 능력에 대해서 ORAC 값(μ㏖ 트롤록스 당량/샘플 g)으로서 표현되는, 하기에 기술된 바와 같은 실시예 7에서 수득된 로즈마리의 액체 추출물의 항산화 능력을 나타낸 도면.
도 8은 하기 실시예 8에 기술된 바와 같은 물 및/또는 베타인 및/또는 글리세롤로 구성된 추출 유체에 따른 올리브 잎의 올러유러핀의 회수 수율을 나타낸 도면.
도 9는 실시예 10에 기술된 바와 같은 임계미만 물을 사용한 올리브 잎으로부터의 올러유러핀의 회수 수율을 나타낸 도면.
도 10은 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 11에서 수득된 올리브 잎의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 280nm)을 나타낸 도면.1은 하이드록시티로솔이고, 2는 루테올린-7-O-글루코사이드이고, 3은 식별되지 않은 것이고, 4는 루테올린-글루코사이드이고, 5는 올러유러핀이고, 6은 올러유러핀 이성질체이다.공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 11a 및 도 11b는 상이한 추출 용매를 사용하여 실시예 11에서 수득된 올리브 잎의 액체 추출물과 함께 세포를 인큐베이션시킨 후 세포에 의해서 달성된 콜라겐 증가(A) 및 보호 증가(B)를 나타낸 도면.*p<0.05; **p<0.01, *** p<0.001, t-시험.
도 12는 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물, 베타인:락트산:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 12에서 수득된 벚꽃의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 350nm)을 나타낸 도면.1은 카페오일 글루코사이드이고, 2는 클로로겐산이고, 3은 쿠마로일 글루코사이드이고, 4는 루틴이고, 5는 켐페롤 루티노사이드이고, 6은 다이카페오일 퀸산이고, 7은 식별되지 않은 것이고, 8은 아이소함네틴이고, 9는 플라보노이드 C17H14O7이고, 10은 플라보노이드 C18H16O8이다.공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 13a, 13b, 13c 및 13d는 실시예 12에서 수득된 벚꽃의 액체 추출물을 기재로 하는 벚꽃의 액체 추출물에 세포를 노출 시킨 후, UV 조사 후 광-보호(A), 제1형 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP-1)의 저해(B), TNFα에 대한 항-염증 활성(C), 콜라겐 합성(D)을 나타낸 도면.
*p<0.05; **p<0.01, ***p<0.001, t-시험.
도 14a, 14b, 14c 및 14d는 실시예 12에서 수득된 벚꽃의 액체 추출물을 기재로 하는 벚꽃의 액체 추출물에 인간 피부 외식편을 노출 시킨 후, 밀착-연접 단백질(tight-junction protein) ZO-1 합성을 통한 UV 조사 후 광-보호(A), 로리크린 합성(B), 및 DJ-1/NRF2 경로의 세포 모집(cell recruitment) 전의 항산화제 활성을 나타낸 도면.
*p<0.05; **p<0.01, ***p<0.001, t-시험.
도 15는 추출 용매로서 베타인:락트산:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 13에서 수득된 쇠뜨기의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 280nm)을 나타낸 도면. 1은 식별되지 않은 페놀이고, 2는 식별되지 않은 알칼로이드이고, 3은 켐페롤 다이헥소사이드 람노사이드이고, 4는 카페오일 타르타르산이고, 5는 카페오일 타르타르산 이성질체이고, 6은 파세올산이고, 7은 고수피트린(Gossupitrin)이고, 8은 프로토게콰닌(Protogenkwanin)-4'-O-글루코사이드이고, 9는 쿠마르산이고, 10은 페룰산 유도체이고, 11은 식별되지 않은 것이고, 12는 식별되지 않은 것이고, 12는 켐페롤 트라이헥소사이드 람노사이드이다.공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 16은 각질세포 HaCaT의 UV 노출 후 TNF-알파의 방출의 저해를 나타냄으로써 상이한 추출 용매를 사용하여 실시예 13에서 수득된 쇠뜨기 추출물의 항-염증 활성을 나타낸 도면.
도 17은 산소 라디칼 흡수 능력에 대해서 ORAC 값(μ㏖ 트롤록스 당량/샘플 g)으로서 표현되는 상이한 추출 용매를 사용하여 실시예 13에서 수득된 쇠뜨기의 액체 추출물의 항산화 능력을 나타낸 도면.
도 18은 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 14에서 수득된 크리트뭄(crithmum)(록 삼피어(rock samphire) 잎의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 280nm)을 나타낸 도면.1은 3-카페오일퀸산이고, 2는 5-카페오일퀸산이고, 3은 4-카페오일퀸산이고, 4는 1-카페오일퀸산이고, 5는 5-p-쿠마로일퀸산이고, 6은 5-페룰로일퀸산이고, 7은 루이틴이고, 8은 쿼세틴-3-O-글루코사이드이고, 9는 다이카페오일퀸산 이성질체이고, 10은 식별되지 않은 플라본이다.공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 19는 약간 착색된 인간 피부의 멜라닌세포 상에서, 상이한 추출 용매를 사용하여 실시예 14에서 수득된 크리트뭄의 액체 추출물에 노출한 후 멜라민 합성을 나타낸 도면(L-티로신 1mM의 존재하에서 자극됨).
*** p<0.0001, t-시험.
도 20은 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 15에서 수득된 플랜테인의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 350nm)을 나타낸 도면.1은 시스타노사이드 F이고, 2는 하이드록시베르바스코사이드이고, 3은 다이하이드록시베르바스코사이드이고, 4는 하이드록시베르바스코사이드 이성질체이고, 5는 페닐에타노이드 글리코사이드이고, 6은 베르바스코사이드이고, 7은 아이소베르바스코사이드이고, 8은 루테올린 다이글루쿠로나이드이고, 9는 루테올린 글루쿠로나이드이고, 10은 스쿠텔라레인이다.공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 21은 추출 용매로서 베타인:락트산:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 16에서 수득된 샤프란 꽃의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 350nm)을 나타낸 도면.1은 켐페롤-3-O-소포로사이드-7-O-글루코사이드이고, 2는 켐페롤-3-O-소포로사이드이고, 3은 켐페롤-3-O-락틸-소포로사이드이고, 4는 켐페롤-3-O-락틸-소포로사이드 이성질체이고, 5는 켐페롤 글리코실-글리세릴 람노실이다. 공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 22는 (세포의 UV 노출 후) 상이한 추출 용매를 사용하여 실시예 16에서 수득된 샤프란 꽃의 액체 추출물에 의한 멜라닌 합성의 저해(A) 및 제1형 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP-1)의 방출(B)을 나타낸 도면.
*** p<0.001, t-시험.
도 23은 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물,베타인:락트산:물 또는 하이드로글리세린을 사용하여 실시예 17에서 수득된 제리코 장미의 액체 추출물의 크로마토그래피 프로파일(LC/UV, 280nm)을 나타낸 도면. 1은 식별되지 않은 것이고, 2는 프로토카테츄산이고, 3은 피세인이고, 4는 식별되지 않은 것이고, 5는 탁시폴린이고, 6은 탁시폴린 메틸 에터이고, 7은 실리빈이고, 8은 아이소실리빈이다. 공융 용매를 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 흑색 트레이스이고, 물:글리세롤을 추출을 위해서 사용한 경우 수득된 결과는 회색 트레이스이다.
도 24는 약간 착색된 인간 피부의 멜라닌세포 상에서, 상이한 추출 용매를 사용하여 실시예 17에서 수득된 제리코 장비의 액체 추출물에 노출한 후 멜라민 합성을 나타낸 도면(L-티로신 1mM의 존재하에서 자극됨).
*** p<0.001, t-시험.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기술된 본 발명의 방법의 단지 설명적인 실시예이다. 사용된 모든 장비, 시약 및 용매는 표준 실험실 장비, 예를 들어 유리 제품, 가열 장치 및 HPLC 장치이다.
이들 실시예는 2:3의 베타인:수소 결합 주개 비에 대한 추출 상승작용을 나타낸다는 것을 주목해야 한다. 그러나, 수득된 값이 정수로 반올림되는 경우, 비 2:3은 1:2가 된다.
실시예 1. 베타인:락트산 2원 혼합물의 몰비 임계성
베타인과 락트산의 몰 비율이 달라지는 경우, 혼합물이 투명하기 위해서는 각각 40:60 내지 30:70%의 좁은 범위의 조성물이 관찰된다. 이러한 역치보다 낮거나 높은 경우, 혼합물은 혼합 직후(베타인:락트산 몰비 70:30, 60:40 및 50:50) 또는 대기 온도에서 1주일 저장 후(비 20:80)에 결정 형성을 갖는 불안정한 매질의 특징을 나타낸다. 이러한 조성 범위는 혼합물의 상 다이어그램 상의 용융점의 최대 하강의 외관에 정확히 상응한다는 것을 주목하면 흥미롭다(도 1). 이러한 최대 하강(또는 공융점)은 작용 기전이 베타인과 수소 결합 주개의 혼합물에 대해서 설명된 본 발명자의 지식이 아닌 공융 발생의 복잡한 현상으로 인한 것이다. 그럼에도 불구하고 본 발명자들은, 베타인과 락트산 간의 수소 및/또는 이온 결합의 확립에 의해서 형성된 초분자 집합체(assemblage)가 빈 공간의 부피를 증가시킴으로써 분자 네트워크의 재배열에 공헌한다는 가설을 발전시킬 수 있다. 도 1은 공융발생이 대략 33:66의 베타인:락트산 비에 대해서 일어난다는 것을 명백히 나타내고, 이것은 베타인 한 분자가 락트산 두 분자와 비-공유 방식으로 상호 작용한다는 것을 암시한다. 따라서, 이러한 평형으로부터 벗어난 비는 혼합물의 탈안정화 및 용융점에서의 상당한 증가로 이어진다고 이해될 것이다. 추출 목적을 위해서, 따라서, 정확히 50:50% 내지 30:70%, 바람직하게는 40:60 내지 30:70%의 베타인과 락트산 각각의 몰 혼합물을 사용하는 것이 필수적이다. 이들 몰비는 대기 온도 내지 -40℃의 용융점을 갖고, 바람직하게는 대기 온도 및 50℃에서 액체이고, 투명한데, 이는 추출 유체로서의 이의 용도에 대한 전제 조건이다.
실시예 2. 베타인:글리세롤 2원 혼합물의 몰비 임계성
상이한 몰비를 갖는 베타인:글리세롤 혼합물의 거시적인 관찰은, 고체/액체 추출에서 사용될 수 있는 투명한 혼합물을 수득하기 위해서는 최소 60%의 글리세롤이 필수적임을 나타낸다(표 2). 70:30, 60:40 및 50:50의 베타인:글리세롤 몰비 모두는 육안으로 가시적인 고체 입자의 즉각적인 형성으로 이어지는데, 이는 매질을 탈안정화시키고, 이어서 신속하게 결정화시킨다. 이러한 결과는 또한 각각 40:60의 베타인:글리세롤 비에 대한 공융점을 나타내는 이 혼합물의 상 다이어그램에 의해서 확인된다(도 2). 투명한 혼합물을 형성하는 공융발생의 임계성은 우연한 것이 아니고, - 실시예 1에서와 같이 - 아마도 포함된 분자 종들 간의 정확한 정량 비에서만 형성될 수 있는 공융 혼합물의 초분자 집합체 특징으로부터의 결과이다. 본 명세서에 제공된 실시예에서, 도 2에서 나타난 바와 같이, 베타인 일수화물 한 분자가 글리세롤 두 분자와 상호작용한다. 마지막으로, 60% 글리세롤의 첨가는 베타인의 용융점을 낮추고, -40℃에 이르는 액체 공융 혼합물을 수득하는 것을 가능하게 한다.
실시예 3. 베타인:시트르산 2원 혼합물의 몰비 임계성의 부재
실시예 1 및 실시예 2에 기술된 혼합물과 달리, 베타인:시트르산 2원 혼합물은 몰비 및 거시적인 외관과 관련하여 임계성을 나타내지 않는다. 표 3에서 인지할 수 있는 바와 같이, 실제로 혼합물의 모든 조성 범위가 1주일 후에 불안정한 매질 결정화로 이어진다. 추출 목적을 위한 이의 사용은, 시스템적으로 혼합물 단독 또는 혼합물과 생물 물질, 또는 심지어는 여과 후 액체 추출물의 덩어리 생성(mass setting)으로 이어진다. 그럼에도 불구하고, 도 3은 단리물로 수득된 순수한 구성성분과 비교할 때 넓은 조성 범위에 걸쳐서 용융점의 하강이 수득되는 것을 나타낸다. 이러한 사실로 인해서, 이것은 공융 혼합물의 본질적인 기준 중 하나를 충족한다. 본 실시예는, 문헌에서 흔히 제안된 것과 상반되게, 베타인으로부터 안정한 공융 혼합물을 수득하는 것의 어려움을 설명할 뿐만 아니라, 모든 공융 용매가 고체/액체 추출에 적합한 것은 아니라는 것을 확립한다.
실시예 4. 몇몇 공융 혼합물을 수득하기 위한 시험 및 50℃에서의 안정성 시험
특히 50℃에서의 안정성 시험은, 특정 공융 혼합물, 예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 사카로스 및 이들의 혼합물로부터의 적어도 1종의 당을 포함하는 것의 불안정성 및 열화를 강조하는 것을 가능하게 한다.
실시예 5. 로즈마리로부터 로즈마린산을 추출하기 위한 3원 혼합물 베타인:락트산:물의 능력에 대한 공융발생의 영향
본 실시예에 제공된 결과는 공융 혼합물의 형성 후에 수득된 상승작용을 명확히 나타낸다(도 4). 특히, 1회 경로로 50℃에서 2시간 동안 마서레이션의 조건하에서 로즈마리로부터 추출된 로즈마린산의 회수율은 3원 공융 혼합물 베타인:락트산:물(2:3, ㏖; 25중량%의 물)의 경우에 최대이다. 본 실시예에서 베타인과 락트산의 몰비는 공융물이 실시예 1에서 형성된 것에 동일하다. 혼합물에 25%의 물을 첨가하는 것은, 혼합물의 점도를 상당히 감소시켜서 추출 방법을 용이하게 하면서, 상승작용의 원인인 초분자 복합체를 유지시키는 것을 가능하게 한다. 추가로, 물 및 물:베타인 및 물:락트산 2원 혼합물로의 대조군 추출은(동일한 조건하에서 베타인 또는 락트산의 동일한 중량 기준 농도로 수행), 로즈마리가 공융 혼합물의 존재하에 있을 때만 상승작용이 수득된다는 것을 나타낸다. 후자는 물 및 물:베타인 및 물:락트산 혼합물 각각에 비해서 대략 47배, 31배 및 2.5배의 로즈마린산의 극적인 추출 수율 개선을 제공한다.
실시예 6. 로즈마리로부터 로즈마린산을 추출하기 위한 3원 혼합물 베타인:글리세롤:물의 능력에 대한 공융발생의 영향
실시예 6은 50℃에서 2시간 동안 마서레이션하에서 로즈마리로부터 추출된 로즈마린산의 수율에 대한, 25중량%의 물을 갖는 베타인과 글리세롤(몰비 2:3)의 3원 공융 혼합물을 사용하여 수득된 상승작용을 나타낸다(도 5). 베타인과 글리세롤 간의 몰비는 공융물이 실시예 2에서 형성된 것에 동일하다. 혼합물에 25%의 물을 첨가하는 것은, 혼합물의 점도를 상당히 감소시켜서 추출 방법을 용이하게 하면서, 상승작용의 원인인 초분자 복합체를 유지시키는 것을 가능하게 한다. 추가로, 물 및 물:베타인 및 물:글리세롤 2원 혼합물로의 대조군 추출(동일한 조건하에서 베타인 또는 글리세롤의 동일한 중량 기준 농도로 수행)은, 로즈마리가 공융 혼합물의 존재하에 있을 때만 상승작용이 수득된다는 것을 나타낸다. 후자는 물에 비해서는 대략 22배, 물:베타인 그리고 물:글리세롤 혼합물에 비해서는 15배의 로즈마린산의 극적인 추출 수율 개선을 제공한다.
실시예 7. 추출 용매로서 베타인:락트산:물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 로즈마리 추출물의 화학적 프로파일 및 항산화 활성의 비교
도 6에 나타난 바와 같이, 공융 혼합물 베타인:락트산:물을 사용하여 수득된 로즈마리 추출물의 프로파일은 하이드로글리세린 추출물의 것보다 다이터펜(141 대 8㎍/㎖), 페놀 화합물(850 대 232㎍/m) 및 로즈마린산(340 대 3㎍/㎖)이 훨씬 더 풍부하다. 결론적으로, 관심 화합물, 특히 폴리페놀 항산화제가 풍부한 공융 추출물이 하이드로글리세린 추출물보다 상당히 더 큰 항산화 활성을 나타낸다(도 7). 이러한 활성은 항산화제 능력을 측정하기 위한 참고 시험(즉, 산화 라디칼 흡수 능력 또는 ORAC 방법)을 사용하여 측정하였다.
본 발명자들은 특히 해당 로즈마리의 공융 추출물(베타인:락트산:물) 중의 로즈마린산의 높은 농도의 존재를 주목한다. 이 분자는, 이것이 페놀 하이드록실들 간의 분자간 수소 결합의 확립을 촉진시킨다는 점에서 항산화제 활성과 관련된 최적의 분자 구조를 갖는 2개의 카테콜 코어(오르토-다이페놀)의 특정 구조적 특징을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 표 5에서 공융 추출물을 수득하는 이러한 방법의 산업적인-규모 개발이 가능하고, 추가로 실험실-규모 방법에서 관찰된 것에 대등한 결과를 수득함을 밝혔고, 이는 본 발명에서 청구된 방법의 재현성에서 중요한 기준이다.
추가로, 다양한 결과는 화장품 응용, 식품 응용(인간 및 동물), 약제학적 응용 또는 뉴트라슈티컬 응용을 위한 항산화제로서의 로즈마리의 공융 추출물의 가능성을 나타낸다.
실시예 8. 올리브 잎으로부터 올러유러핀을 추출하기 위한 3원 혼합물 베타인:글리세롤:물의 능력에 대한 공융발생의 영향
본 실시예에 제공된 결과는 25중량%의 물을 갖는 베타인과 글리세롤(몰비 2:3)의 공융 혼합물의 형성 후에 수득된 상승작용을 명확히 나타낸다(도 8). 베타인:글리세롤 몰비는 공융물이 실시예 2에서 형성된 것에 동일하다. 혼합물에 25%의 물을 첨가하는 것은, 혼합물의 점도를 상당히 감소시켜서 추출 방법을 용이하게 하면서, 상승작용의 원인인 초분자 복합체를 유지시키는 것을 가능하게 한다. 추가로, 물:베타인(65:35, 중량 기준) 및 물:글리세롤(60:40, 중량 기준) 2원 혼합물로의 대조군 추출은, 동일한 조건 및 중량 기준으로 동일한 농도에서 수행되더라도, 올리브 잎이 공융 혼합물의 존재하에 있을 때 만이 상승작용이 수득된다는 것을 나타낸다. 후자는 물:베타인 및 물:글리세롤 혼합물, 및 물 각각에 비해서 올러유러핀의 극적인 회수 개선(2.8 내지 9배)을 제공한다.
실시예 9. 추출 효율을 개선시키기 위한 3원 혼합물 베타인:글리콜:물의 능력에 대한 공융발생의 영향
다양한 글리콜을 사용하여 하기 추출 실험을 수행하였다. 본 실시예에서 용어 <<글리콜>>은 펜틸렌 글리콜, 프로판다이올(제메아(Zemea)(등록상표)) 및 프로필렌 글리콜에 관한 것이다. 하기 추출에서, 로즈마리 잎, 올리브 잎, 점상 권백 기근(aerial) 부분 및 틸란드시아 유스노이데스 기근 부분을 비롯한 몇몇 식물 종을 사용하였다.
실시예 10. 올리브 잎으로부터의 올러유러핀의 추출에 대한 임계미만 물과 공융 혼합물의 비교
공융발생에 의한 추출 방법을 최신 추출 기술, 예컨대 125℃로 과열되고, 30 내지 45bar의 압력을 적용함으로써 액체를 유지시킨 수성 상으로 이루어진 임계미만 물과 비교하였다. 도 9는, 베타인 및 락트산 또는 글리세롤(2:3, ㏖)로 구성되고 25중량%의 물을 갖는 3원 공융 혼합물이 임계미만 물보다 식물(예를 들어, 식물성) 매트릭스, 예컨대 올리브 잎으로부터 올러유러핀을 더 많이 산출한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 올러유러핀, 예컨대 대부분의 페놀 화합물이 열 민감성이므로, 열-산화된다는 점에서 흥미롭다. 추가로, 에코-추출 및 녹색 화학의 관점으로부터, 에너지를 절약하고, 환경 친화적인 공정을 실행하려는 목적으로 공정의 온도 및 압력 둘 모두를 낮추는 것이 이롭다.
실시예 11. 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 올리브 잎 추출물의 화학적 프로파일 및 생물학적 활성의 비교
도 10에 도시된 크로마토그래피 프로파일은 하이드로글리세린 추출물과 비교하여 공융 추출물(베타인:글리세롤:물)의 더 높은 식물(예를 들어, 식물성) 활성물질 농도를 나타낸다. 이러한 결과는 특히 올러유러핀에 대해서 특히 뚜렷하다. 실험실 규모에서, 물:글리세롤 혼합물 중에 베타인을 첨가하는 것은 실시예 2에 나타내어진 공융발생 현상으로 인해서 올러유러핀의 농도를 3배로 만든다(또는 4배로 만든다). 공융발생에 의한 추출 공정이 산업 규모(표 10에 나타내어진 바와 같음)로 전환되는 경우, 이러한 증가는 심지어는 5.4배에 달한다. 유사한 방식으로, 페놀 화합물의 총 함량은 물:글리세롤 혼합물(50:50; w:w)을 사용한 통상적인 액체 추출물보다 실험실 규모 및 산업 규모에서 각각 수득된 올리브 잎의 공융 추출물의 경우 2.6 및 3.4배 더 높다.
이러한 결과는, 0.01 내지 0.1% 범위의 농도의 올리브 잎의 공융 추출물의 인큐베이션 후에 인간 피부 섬유모세포 상에서의 콜라겐 합성(도 11a) 및 Hacat 세포 상에서의 광-보호(도 11b)의 극적인 증가를 설명하는 것으로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 0.1%의 공융 추출물의 수성 제형은 하이드로글리세린 추출물을 사용한 동일한 제형보다 콜라겐 합성에 대해서 18배 더 활성이다. 따라서 이러한 개선된 효능은 공융 추출물의 요구되는 농도를 낮추는 것을 가능하게 하는데, 이는 특정 수의 이점을 나타낸다. 구체적으로, 10배 더 낮게 농축된 공융 추출물의 제형(0.01%)이 사용되는 경우, 세포외 기질에서 콜라겐의 증가에 대한 이의 생물학적 효능은 10배 더 농축된 하이드로글리세린 추출물에 대등하고, 흔히 이것보다 훨씬 더 높다. 추가로, 도 11b에 도시된 예방적인 광-보호 - UVA 조사 전 추출물로의 세포의 처리 -와 관련하여,본 발명자들은 생물학적 활성에서 4.7배의 증가를 인지하며, 이것은 상당한 것이다.
이들 데이터는 광-보호제, UV 필터, 항-노화제 및 수화제(콜라겐은 물을 보유하는 특성을 갖고 또한 피부에 대한 장벽 성능을 수행함)로서의 공융 추출물의 가능성을 예증한다. 또한, 올러유러핀의 공지된 항산화 활성(Laguerre et al., Characterization of olive leaf phenolics by ESI-MS and evaluation of their antioxidant capacities by CAT assay, J. Am. Oil Chem. Soc. 2009, 86, 1215-1225)을 고려할 때, 도 10에 제공된 크로마토그래피 프로파일은 이들 개선된 추출물이 다양한 제형 중에서 항산화제로서 사용될 가능성을 시사한다.
실시예 12. 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 및 베타인:락트산: 물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 벚꽃 추출물의 화학적 프로파일 및 생물학적 활성의 비교
본 실시예에 제공된 결과는 식물(예를 들어, 식물성) 재료를 추출하기 위해서 본 발명에서 청구된 공융 용매를 사용하는 것이 물:글리세롤 유형의 통상적인 용매에 의해서 "달성 가능하지 않은" 추출물을 수득하는 것을 가능하게 함을 완벽하게 설명한다. 이것은 특히 공융 혼합물로의 추출과 하이드로글리세린 혼합물로의 추출 간의 도 12에 도시된 크로마토그래피 프로파일 및 표 11에 나타내어진 데이터에 적용된다. 추출물은 완전히 상이하다. 공융발생에 의한 추출은 이러한 경우에 (통상적인 추출물에 비해서) 다수의 새로운 화합물, 예컨대 질량 분석법에 의해서 식별된 클로로겐산 또는 쿠마르산, 루틴, 다이카페오일퀸산 또는 이소람네틴의 글루코사이드를 포함하는 신규 벚꽃 추출물 생성하는 것을 가능하게 한다. 정량적인 관점에서, 하이드로글리세린 추출물과 비교하여 공융 용매 베타인:글리세롤:물 및 베타인:락트산:물의 경우 폴리페놀의 함량의 극적인 증가(각각 4.3 및 13.7배 더 농축됨)가 측정되었다.
생물학적 활성과 관련하여, 공융 추출물은 광-보호, 제1형 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP-1) 저해, 항-염증 활성 및 콜라겐 합성에서 극적인 우수성을 다시 한번 나타낸다. 베타인:글리세롤:물 혼합물로부터 수득된 추출물에 대한 결과 만이 본 명세서에서 제공되지만, 베타인:락트산:물 혼합물에 대해서도 유사한 데이터가 측정되었다. 도 13a에 도시된 바와 같이, 공융 추출물은 하이드로글리세린 추출물보다 광-보호제로서 훨씬 더 활성이고; 이는 심지어는 후자 추출물이 모든 효능이 결여되어 있다는 것으로 해석될 수 있다. 광-노화에 관련된 제1형 세포외 기질 메탈로프로테이나제(MMP-1)의 저해(도 13b), 중요한 염증 경로를 표시하는 TNFα의 저해(도 13c), 및 또한 세포외 기질에서 가용성 콜라겐의 합성(도 13d)에 대해서 수득된 결과를 기초로 유사한 결론이 또한 도출될 수 있다.더욱이, UV-유도된 인간 피부 외식편 모델을 기초로, 벚꽃 공융 추출물은 피부 수화로 이어지는 피부 장벽 기능, 세포 접착 및 응집에 관여된 밀착 연접 단백질 ZO-1(폐쇄 소대(Zona occuldens)) 및 로리크린 합성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라(도 14a 및 도 14b) 또한 피부 세포가 UV 손상과 싸우기 위한 DJ-1/NRF2 경로를 모집할 필요가 없게 함으로써 항산화 활성을 가질 수 있다(도 14c 및 도 14d). 이러한 활성 각각에 대해서, 본 발명에 청구된 용매 및 추출 방법을 사용하여 상당히 의미 있는 정량적인 증가가 수득되었다.
이들 결과는 이들 추출물의 항-염증제, 수딩제, 항-노화제, 광-보호제 및 항산화제, UV 필터, 수화제 또는 항-광-노화제로서의 신규 응용에 대한 길을 연다.
실시예 13. 추출 용매로서 베타인:락트산:물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 쇠뜨기 추출물의 화학적 프로파일 및 생물학적 활성 및 물리-화학적 활성의 비교
벚꽃과 유사하게, 쇠뜨기의 실시예는 공융발생에 의한 추출이 신규 추출물을 수득하는 수단을 제공한다는 사실을 예증한다. 도 15는, 두 크로마토그래피 트레이스를 비교하는데, 이는 적어도 이들이 서로 상에 중첩되지 않는다는 것으로 해석될 수 있다.다른 차이점 중에서, 본 발명자들은 하이드로글리세린 추출물과 비교할 때 켐페롤 다이헥소사이드 람노사이드, 고시피트린, 프로토겐콰닌-4'-O-글루코사이드 및 파세올산이 공융 추출물(베타인:락트산:물) 중에 더 높은 농도로 존재한다는 것을 주목할 수 있다. 표 12는 또한 수득된 추출물의 페놀 함량의 차이를 예증한다.
그럼에도 불구하고 이만큼 차별화된 프로파일을 기초로 이러한 것 및 이러한 추출물 단독의 우수성에 대한 결론에 도달하는 것은 어렵다. 이러한 이유로 인해서, TNFα의 생산으로 이어지는 염증-전 캐스케이드에 대한 쇠뜨기로부터 추출된 자연 재료의 저해 활성에 대해서 생물학적 활성 시험을 수행하였다(도 16). 동일한 중량 기준 농도(0.01%)의 경우, 쇠뜨기의 공융 추출물이 단순한 물:글리세롤 혼합물로부터 유래된 것보다 더 활성인 것이 명백하다. 용량-반응이 또한 관찰되는데, 이는 추구하는 생물학적 효능 수준에 따라서 제형을 조정하기에 이롭다. 종합적으로, 농도가 10배 증가하면 활성은 5배 증가한다. 추출물들 간의 항산화 활성의 비교 분석을 또한 수행하였다. 도 17은 하이드로글리세린 추출물과 비교할 때 쇠뜨기의 공융 추출물의 경우 아조 개시제로부터 유래된 퍼옥시라디칼 감소의 효능이 1.6배 더 큼을 나타낸다.
따라서 쇠뜨기의 공융 추출물은 많은 수의 분야(원칙적으로는 약제학, 뉴트라슈티컬 및 화장품)에서 항-염증제 및 항산화제로서의 응용을 위해서 유망한 것으로 보인다. 화장품 분야와 관련하여, 이들 추출물은 수딩제(이의 항-TNFα 특성을 통해서)로서 그리고 항산화제 및 항-노화제(이의 자유 라디칼 감소 특성을 통해서)로서 사용될 수 있다.
실시예 14. 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 크리트뭄(락 삼피어) 추출물의 화학적 프로파일 및 생물학적 활성의 비교
먼저, 본 명세서에 제공된 크로마토그래피 프로파일 모두 중에서, 크리스멈의 프로파일이 공융발생에 의한 추출 접근법과 통상적인 용매, 예컨대 물과 글리세롤(50:50; w:w)을 사용한 것 사이에서 적어도 차별화된다. 페놀 화합물과 관련하여, 두 추출물은 하이드로글리세린 및 공융 추출물에 대해서 각각 195 및 181㎍/㎖의 농도로 전체적으로 동등하다(도 18). 표 13은 또한 수득된 총 페놀 화합물의 차이를 예증한다.
공융 추출물은 물과 글리세롤을 사용한 추출물보다 1-카페오일퀸산 및 5-쿠마로일퀸산은 더 적게 함유하지만, 다이카페오일퀸산 및 5-페룰로일퀸산은 더 많이 함유한다. 그러나, 다른 화합물, 예컨대 5-카페오일퀸산의 경우, 두 추출물은 실질적으로 유사한 농도를 나타낸다. 이러한 상이한 분자는 수(분자 당 하나 또는 2개의 환) 및 구조(페룰 대 쿠마르 대 카페)가 상이한 페놀 코어를 갖기 때문에, 명백하게 드러나지 않는 성질이더라도, 프로파일의 변화는 생물학적 및/또는 물리-화학적 활성에서 매우 큰 변화를 야기할 수 있다. 이것은 도 19에서 인지될 수 있는데, 여기서는 0.1%의 크리스멈의 공융 추출물의 수성 제형이 33%의 인간 표피 멜라닌세포(약간 착색됨) 상에서의 멜라닌 합성의 저해를 나타내지만, 하이드로글리세린 추출물은 모든 활성이 결여되어 있다.
이는 아르부틴 - 이것은 화장품에서 가장 널리 사용되는 자연 저-착색제임 -이 독성 화합물(하이드로퀴논)(참조군)을 방출한다는 것을 고려할 때 중요한 결과이다. 이것은 자연물질이고 아르부틴이 존재하지 않는 신규 미백제의 개발을 위한 바람직한 맥락이다. 이러한 의미에서, 본 실시예에 제공된 결과는 피부 미백에서의 응용을 위한 본 발명에 청구된 크리스멈의 공융 추출물의 가능성을 충분히 예증한다. 추가로, 공융 추출물 중에 존재하는 하이드록시산남산의 퀴닉 에스터의 카테콜 코어(카페, 페룰, 쿠마르)의 확립된 반응성으로 인해서,후자는 모두 화장품, 뉴트라슈티컬, 약제학 또는 식품 산업에서 항산화제로서의 응용을 나타낸다.
실시예 15. 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 플랜테인 추출물의 화학적 프로파일 및 생물학적 활성의 비교
실시예 15는 베타인:글리세롤:물 공융 혼합물을 사용한 추출이 하이드로글리세린 추출물의 것에 비해서 총 베르바스코사이드가 전체적으로 더 풍부한 크로마토그래피 프로파일을 생성한다는 사실을 예증한다(도 20).총 베르바스코사이드 농도는 물-글리세롤 혼합물에 베타인을 첨가함으로써 197로부터 397㎍/㎖(2배임)로 증가한다(표 14에 나타내어진 바와 같음). 이러한 예에서, 화합물 6 - 베르바스코사이드 -은 실시예 6 및 실시예 7에 제공된 로즈마린산과 같이 2개의 카테콜 코어를 함유하는 매우 강력한 항산화제이다(Laguerre et al., 2009).
보다 정확하게는, 그것은 다수의 생물학적 및/또는 물리-화학적 활성에 관여되는 카페산과 하이드록시티로솔의 헤테로사이드 에스터이다. 추가로, 극적인 방식에서, 추출 방법의 산업 규모로의 개작은 총 베르바스코사이드 함량을 3배 초과 증가시키고, 페놀 화합물의 함량을 거의 2배 증가시키는 것을 가능하게 한다. 또한,실험실 규모에서 수득된 플랜테인의 공융 추출물과 하이드로글리세린 추출물 간의 총 페놀 화합물의 비교는 공융 추출물에 유리하게 2.3배 차이를 나타낸다.
실시예 16 추출 용매로서 베타인:락트산:물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 샤프란 꽃 추출물의 화학적 프로파일의 비교
도 21에 도시된 크로마토그래피 프로파일은 켐페롤 글리코실-글리세릴 람노사이드의 존재 및 켐페롤-3-O-락틸 소포로사이드의 2개의 이성질체의 존재와 관련하여 주로 상이하다(표 15에 나타내어진 바와 같음).
샤프란 꽃의 이들 활성 구성성분은 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-직렬 질량 분광계(LC-ESI/MS)에 의해서 식별될 수 있었다. 이들은 하이드로글리세린 추출물로부터 수득된 프로파일에서는 거의 존재하지 않는데, 이는 멜라닌 합성의 저해 및 세포외 기질에서 메탈로프로테이나제의 방출(후자 경우에서는 더 온화한 방식임)에 대한 공융 추출물의 증가된 효능을 나타내는 도 22에 주어진 결과를 설명할 수 있다. 플라보노이드 분율이 이들 두 활성의 생물화학적 결정론에 관여되는 유일한 것이라고 추정한다면, 켐페롤 글리코실-글리세릴 람노사이드 및 켐페롤-3-O-락틸 소포로사이드의 이성질체 형태의 존재는 하이드로글리세린 유형의 통상적인 추출물에 비해서 증가된 생물학적 활성이 부여된 추출물을 수득하기 위해서 제일 중요하다. 이들 결과는 또한 샤프란 꽃의 공융 추출물의 저-착색제, 광-보호제 및 항-노화제로서의 가능성을 예증한다. 추가로, 이들이 (플라보노이드)로 구성된 분자의 화학적 본성임을 고려할 때, 이들 공융 추출물은 통상적인 추출물의 것보다 더 높은 자유 라디칼 안정화 활성 및 이에 따른 이의 항산화제로서의 용도에 대한 좋은 징조이다.
실시예 17. 추출 용매로서 베타인:글리세롤:물 및 베타인:락트산: 물 3원 혼합물 또는 하이드로글리세린 혼합물을 사용하여 수득된 제리코 장미 추출물의 화학적 프로파일의 비교
공융발생(그것이 베타인:글리세롤:물 또는 베타인:락트산:물이든 관계없음)에 의한 추출로부터 수득된 추출물은 크로마토그래피에 의해서 관찰되고, 물과 글리세린 추출로부터 유래된 것과 완전히 상이한 프로파일을 제공한다(도 23). 이들 데이터는 깊은 공융 용매, 예컨대 본 발명에 청구된 것을 사용함으로써 유도된 구별되는 특징을 보다 통상적인 방법을 사용한 것과 비교하여 예증한다. 이러한 예에서, 도 23에 도시된 공융 추출물은 탁시폴린(및 이의 메틸 에터), 프로토카테킨산 및 플라보놀리그난, 예컨대 실리빈 및 아이소실리빈을 훨씬 더 많이 함유한다(표 16에 나타내어진 바와 같음). 페놀 화합물의 전체 농도가 베타인:락트산:물 및 베타인:글리세롤:물 혼합물의 사용으로부터 유래된 추출물의 경우 물:글리세롤 혼합물을 사용한 것보다 각각 2배 및 3배 더 높다는 것을 주목하는 것이 흥미롭다.
생물 활성과 관련하여, 크로마토그래피 프로파일이 도 23에 도시된 공융 추출물(베타인:글리세롤:물)은 멜라닌 합성을 거의 36% 저해한 반면, 하이드로글리세린 추출물은 모든 활성이 걸여되어 있다(도 24). 이는, 이러한 프로파일을 고려할 때, 탁시폴린이 저-착색제로서 화장품에서 널리 사용되는 아르부틴만큼 실제로 효과적으로 세포 멜라닌생성을 저해한다고 공지된 것의 타당한 결론이다(An et al., Flavonoids, taxifolin and luteolin attenuate cellular melanogenesis despite increasing tyrosine protein levels,Phytother. Res. 2008, 22, 1200-1207). 이러한 관점에 대해서, 아르부틴은 그것이 하이드로퀴논을 방출하고, 이의 존재(특히 화장품에서 1ppm 초과)는 금지되기 때문에, 만족스럽지 않다는 것을 주목해야 한다. 따라서 아르부틴의 부재하에서의 이러한 유형의 활성은, 프로토카테킨산 및 탁시폴린이 효과적인 자유 라디칼 감소제이고, 각각은 산화성 스트레스를 제어하는 작용 기전이 상기에 설명된 카테콜 코어를 갖는다는 것을 고려할 때, 저-착색제뿐만 아니라 항산화제 및 항-노화제의 범위에서의 화장품 분야를 위한 제리코 장미의 공융 추출물의 더 큰 가능성을 예증한다. 결국, 실시예 17은 공융 용매가 부활초(resurrection plant)로부터의 생물-활성 또는 화학-활성 화합물의 추출에 완전히 적합하다는 사실을 예증한다.
Claims (23)
- 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 추출하기 위한 공융 추출 용매(eutectic extraction solvent)로서, 상기 용매는,
(a) 베타인(트라이메틸 글리신) 또는 베타인의 수화 형태;
(b) 폴리올 및 유기산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 수소 결합 주개(donor) 화합물; 및
(c) 물
을 포함하는 투명하고, 안정한 유체 혼합물이고;
베타인 또는 베타인의 수화 형태 대 상기 적어도 1종의 수소 결합 주개의 몰비는 1:1.5 내지 1:3이고, 상기 용매 내 물의 비율은 15 내지 30중량%이되;
단 상기 공융 추출 용매는 임의의 외인성 당(sugar) 및/또는 아민염 및/또는 음이온을 함유하지 않는, 공융 추출 용매. - 제1항에 있어서, 상기 폴리올은 글리세롤, 에리트리톨, 만니톨, 소르비톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리비톨, 알도니톨, 프로판다이올, 및 펜틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 공융 추출 용매.
- 제1항에 있어서, 상기 유기산은 락트산, 말산, 말레산, 피루브산, 푸마르산, 석신산, 시트르산, 아세트산, 아코니트산, 타트르산, 아스코르브산, 말론산, 옥살산, 글루쿠론산, 뉴라민산, 시알산, 시킴산, 피트산, 갈락투론산, 이두론산, 히알루론산, 하이드록시시트르산, 및 락톤 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 공융 추출 용매.
- 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터의 페놀산 및 에스터를 포함하는 페놀 화합물, 플라보노이드, 세코이리도이드, 스틸벤 또는 페놀 알코올, 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료, 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 착색제, 안료, 계면활성제 또는 사포닌을 포함하는 테르페노이드를 포함하는 자연 생물 화합물의 추출 방법으로서,
a. 교반하면서, 분쇄되거나 또는 분쇄되지 않은 생물 물질을 제1항에 정의된 용매 중에 침지시키는 단계; 이어서
b. 단계 a.에서 수득된 혼합물을 20 내지 60℃의 온도에서 마세레이션(maceration) 또는 퍼콜레이션(percolation) 또는 인퓨젼(infusion)시키는 단계; 이어서
c. b.에서 수득된 추출 생성물을 여과하여, 상기 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터 유래된 자연 생물 액체 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 추출 방법. - 제4항에 있어서, 상기 식물 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인(plantain), 샤프란 꽃, 크리스멈(chrismum), 제리코 장미, 로즈마리, 점상권백(Selaginella pulvinata), 틸란드시아 유스노이데스(Tillandsia usnoides) 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 추출 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질로부터 페놀산 및 에스터를 포함하는 페놀 화합물, 플라보노이드, 세코이리도이드, 스틸벤 또는 페놀 알코올, 항산화제, 카로테노이드, 알칼로이드, 지질, 페닐프로파노이드, 향미료, 맛 개질제, 향제, 살생물제, 항미생물제, 단백질, 효소, 착색제, 안료, 계면활성제, 또는 사포닌을 포함하는 테르페노이드를 포함하는 자연 생물 화합물을 추출하기 위한, 공융 추출 용매.
- 제6항에 있어서, 상기 식물 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리, 점상권백, 틸란드시아 유스노이데스 및 올리브 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 공융 추출 용매.
- 제4항에 따른 추출 방법에 의해서 수득된 식물 및/또는 동물 및/또는 원핵 생물 물질을 포함하는 자연 생물 액체 추출물.
- 제8항에 있어서, 제1항에 따른 공융 추출 용매를 더 포함하는, 자연 생물 액체 추출물.
- 제9항에 있어서, 상기 공융 추출 용매는 0.01 내지 50중량%의 양으로 존재하는, 자연 생물 액체 추출물.
- 제8항에 있어서, 식물 생물 물질은 벚꽃, 쇠뜨기, 플랜테인, 샤프란 꽃, 크리스멈, 제리코 장미, 로즈마리, 올리브 잎, 점상권백 및 틸란드시아 유스노이데스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 자연 생물 액체 추출물.
- 제8항에 있어서, 경구 또는 비경구로 투여되려는 의도이거나, 또는 국소, 직장, 코, 귀, 질 및/또는 눈 적용을 위한 의도인, 뉴트라슈티컬 조성물(nutraceutical composition), 인간 또는 동물용 식이 또는 식품, 영양 보충제, 향제, 또는 향미료, 약제학적 제형, 포도주 양조학적(oenological) 제형 또는 화장품 제형의 제조를 위한, 자연 생물 액체 추출물.
- 제8항에 있어서, 광-보호제, 항-광-노화제, 저-착색제(hypo-pigmenting agent), 미백제(bleaching agent), 항-노화제, 항산화제 및 항라디칼제, 산소 반응성 종 감소제, 발전된 당화(glycation) 최종-산물 감소제, 메탈로프로테이나제 저해제, 항-염증제, 피부 수딩제(skin soothing agent), 콜라겐 합성 활성화제, 수화제, 피부 장벽 기능 복원제 또는 세포 접착 및 응집 개선제에서 사용하기 위한, 자연 생물 액체 추출물.
- 제11항에 있어서, 광-보호제, 장벽 기능 보호제, 항산화제 또는 항-광노화제로서 사용하기 위한 벚꽃으로부터 유래된, 자연 생물 액체 추출물.
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