CN117695198B - 一种低共熔溶剂耦合超声、加热制备铁皮石斛提取物的方法 - Google Patents
一种低共熔溶剂耦合超声、加热制备铁皮石斛提取物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种低共熔溶剂耦合超声、加热制备铁皮石斛提取物的方法。本发明通过将铁皮石斛粉末加入到特定成分的低共熔溶剂中，依次进行超声、加热、离心、浓缩、醇沉、分离，并经后处理分别得到铁皮石斛多糖提取液与铁皮石斛黄酮提取液。该方法显著提升了铁皮石斛中多糖与黄酮的提取率，极大地提高了铁皮石斛的原料利用率；且得到的铁皮石斛多糖与黄酮具有优异的稳定性、保湿性能与抗衰性能，十分适用于制备保湿和/或抗衰化妆品。
Description
技术领域
本发明属于化妆品制备技术领域。更具体地，涉及一种低共熔溶剂耦合超声、加热制备铁皮石斛提取物的方法。
背景技术
铁皮石斛，又名铁皮兰、黑节草，是兰科植物铁皮石斛的茎，圆柱形，高15～50 cm，粗4～8 mm，富含多糖、黄酮等活性成分。铁皮石斛中的多糖与黄酮具有优异的保湿、抗衰等活性，因此如何提高铁皮石斛中多糖与黄酮的提取率逐渐成为化妆品领域的研发热点。
目前，铁皮石斛中多糖与黄酮的提取方法主要有：1）热水浸提法：将铁皮石斛直接浸泡在热水中进行提取，但该方法提取率较低；2）酶解法：采用纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等对铁皮石斛进行酶解，但酶在提取过程中易变性失活，导致提取率较低；3）超声法：将铁皮石斛浸泡在水中进行超声提取，但该方法易引起其可溶性多糖的降解，导致提取率较低；4）低共熔溶剂（DES）提取法：将铁皮石斛与低共熔溶剂共加热，但低共熔溶剂中各组分之间存在大量的氢键网络结构、范德华力及其它静电作用，流动性较差，进而导致提取效果较差，提取率较低。可见，现有方法中铁皮石斛多糖与黄酮的提取效果仍不尽人意。
因此，亟需寻找一种能显著提升铁皮石斛中多糖与黄酮提取率的方法，对于保湿、抗衰化妆品领域的发展具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种制备铁皮石斛提取物的方法，通过低共熔溶剂耦合超声、加热的方法对铁皮石斛进行提取，以显著提升铁皮石斛中多糖与黄酮的提取率。
本发明的第一目的是提供一种铁皮石斛提取物的制备方法。
本发明的第二目的是提供上述方法制备得到的铁皮石斛提取物。
本发明的第三目的是提供上述铁皮石斛提取物在制备化妆品中的应用。
本发明的第四目的是提供一种化妆品。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种铁皮石斛提取物的制备方法，包括如下步骤：
S1. 将氢键受体、氢键供体A、氢键供体B按1～3：1～6：0.1～2的摩尔比混合后，加水，得到低共熔溶剂；
S2. 将铁皮石斛粉末加入到低共熔溶剂中，依次经超声、加热得到粗提取液；
S3. 将粗提取液依次进行离心、浓缩、醇沉，分离得到上清液与沉淀；
S4. 上清液经后处理得到铁皮石斛黄酮提取液，沉淀经后处理得到铁皮石斛多糖提取液；
其中，所述氢键受体为甜菜碱；所述氢键供体A为甘油、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇中的一种或几种；
且：
当所述氢键供体A为甘油时，所述氢键供体B为1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、柠檬酸中的一种或几种；
当所述氢键供体A为1,3-丁二醇时，所述氢键供体B为1,2-戊二醇、1,2-己二醇、柠檬酸中的一种或几种；
当所述氢键供体A为1,2-戊二醇时，所述氢键供体B为1,2-己二醇和/或柠檬酸；
当所述氢键供体A为1,2-己二醇时，所述氢键供体B为柠檬酸。
本发明对铁皮石斛的特性进行了针对性探究，按特定顺序结合了低共熔溶剂处理、超声、加热等工艺对其进行提取，并专门在低共熔溶剂中设置了两种不同的氢键供体，与特定的氢键受体相复配，显著提升了铁皮石斛中多糖与黄酮的提取率，极大地提高了铁皮石斛的原料利用率。且本发明方法提取得到的铁皮石斛多糖与黄酮具有优异的稳定性、保湿性能与抗衰性能，十分适用于制备保湿和/或抗衰化妆品。
优选地，S1所述氢键受体、氢键供体A、氢键供体B的摩尔比为1：3：1。
优选地，S1所述混合为在65～75 ℃下混合，最优选为70 ℃。
优选地，S1所述混合的终点为：体系呈澄清透明的粘稠状液体。
优选地，S1所述混合后，还进行冷却，如冷却至20～30 ℃。此时无晶体析出。
优选地，S1所述加水的终点为：低共熔溶剂的含水量为40wt %～80wt %；最优选为70 wt %。
优选地，S2所述铁皮石斛粉末的粒径为30～50目，最优选为40目。
优选地，S2所述铁皮石斛粉末还先进行预处理，如依次进行除杂、过滤、干燥。
进一步优选地，所述除杂为将铁皮石斛粉末加入到75 %（v/v）～85 %（v/v）乙醇中，于65～75 ℃下加热0.8～1.2 h；最优选为将铁皮石斛粉末加入到80 %（v/v）乙醇中，于70 ℃下加热1 h。该操作是为了脱色、脱脂。
更优选地，所述铁皮石斛粉末与乙醇的用量比为1 g：8～12 mL，最优选为1 g：10mL。
优选地，S2所述铁皮石斛粉末与低共熔溶剂的质量比为1：40～100，最优选为1：50。
优选地，S2所述超声的频率为30k～50k Hz，最优选为40k Hz。
优选地，S2所述超声的时间为40～50 min，最优选为45 min。
优选地，S2所述加热的温度为60～80 ℃，最优选为70 ℃。
优选地，S2所述加热的时间为40～50 min，最优选为45 min。
优选地，S3所述离心为在8000～12000 rpm下离心8～12 min，最优选为在10000rpm下离心10 min。
进一步优选地，所述离心后还进行过滤，弃滤渣。
优选地，S3所述浓缩的方法为旋蒸。
进一步优选地，所述旋蒸为在55～65 ℃下旋蒸20～50 min，最优选为在60 ℃下旋蒸40 min。该操作是为了去除水分。
优选地，S3所述醇沉为将浓缩液加入到无水乙醇中，于3～5 ℃下静置12～24 h，最优选为于4 ℃下静置18 h。
进一步优选地，所述浓缩液与无水乙醇的质量比为1：3.5～4.5，最优选为1：4。
优选地，S3所述分离为过滤。
优选地，S4所述上清液的后处理为：去除水分。
进一步优选地，所述去除水分的方法为旋蒸，如在55～65 ℃下旋蒸40～50 min，最优选为在60 ℃下旋蒸40 min。
优选地，S4所述沉淀的后处理为：依次进行洗涤、加水、去除乙醇。
进一步优选地，所述洗涤为用无水乙醇进行洗涤。
进一步优选地，所述沉淀与水的用量比为1 g：10～40 mL，最优选为1 g：20 mL。
进一步优选地，所述去除乙醇的方法为旋蒸，如在55～65 ℃下旋蒸20～40 min，最优选为在60 ℃下旋蒸30 min。
上述方法制备得到的铁皮石斛提取物具有优异的稳定性，且保湿性能与抗衰性能均较佳，适用于制备化妆品，因此，上述方法制备得到的铁皮石斛提取物、上述铁皮石斛提取物在制备化妆品中的应用，以及一种含有上述铁皮石斛提取物的化妆品，均应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明对铁皮石斛的特性进行了针对性探究，按特定顺序结合了低共熔溶剂处理、超声、加热等工艺对其进行提取，并专门在低共熔溶剂中设置了两种不同的氢键供体，与特定的氢键受体相复配，显著提升了铁皮石斛中多糖与黄酮的提取率，极大地提高了铁皮石斛的原料利用率。
2. 本发明方法提取得到的铁皮石斛多糖与黄酮具有优异的稳定性、保湿性能与抗衰性能，十分适用于制备保湿和/或抗衰化妆品。
3. 本发明的方法操作简单、成本低廉、高效绿色、环境友好。
附图说明
图1为体外保湿功效测试结果。
图2为抗衰功效测试结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 铁皮石斛提取物的制备
S1. 将甜菜碱、甘油、1,3-丁二醇按1：3：1的摩尔比置于烧杯中，在70 ℃下磁力搅拌至体系呈澄清透明的粘稠状液体，再冷却至25 ℃（此时无晶体析出），加水使体系含水量为70wt %，即为低共熔溶剂；
S2. 将粉碎至40目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到80 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为10 mL：1 g），置于70 ℃水浴锅中加热搅拌1 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为50：1）充分混合，在超声仪器中进行超声提取（在40k Hz下超声45 min）后，再在70 ℃下水浴加热提取45 min，得到粗提取液；
S3. 将粗提取液在10000 rpm下离心10 min后，过滤，弃滤渣，将滤液在60 ℃下旋蒸40 min以去除水分，再将旋蒸液加入到无水乙醇中（控制无水乙醇与旋蒸液的质量比为4：1），于4 ℃下静置18 h后，过滤得到上清液与沉淀；
S4. 将上清液在60 ℃下旋蒸40 min以去除水分，得到铁皮石斛黄酮提取液；将沉淀用无水乙醇洗涤后，再加入水中（控制水与沉淀的用量比为20 mL：1 g），通过在60 ℃的旋蒸仪中旋蒸30 min以去除乙醇，得到铁皮石斛多糖提取液。
实施例2 铁皮石斛提取物的制备
S1. 将甜菜碱、甘油、1,3-丁二醇按1：1：0.1的摩尔比置于烧杯中，在65 ℃下磁力搅拌至体系呈澄清透明的粘稠状液体，再冷却至20 ℃（此时无晶体析出），加水使体系含水量为80wt %，即为低共熔溶剂；
S2. 将粉碎至30目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到85 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为12 mL：1 g），置于75 ℃水浴锅中加热搅拌0.8 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为100：1）充分混合，在超声仪器中进行超声提取（在50k Hz下超声50 min）后，再在80 ℃下水浴加热提取40 min，得到粗提取液；
S3. 将粗提取液在12000 rpm下离心8 min后，过滤，弃滤渣，将滤液在55 ℃下旋蒸50 min以去除水分，再将旋蒸液加入到无水乙醇中（控制无水乙醇与旋蒸液的质量比为3.5：1），于5 ℃下静置12 h后，过滤得到上清液与沉淀；
S4. 将上清液在55 ℃下旋蒸50 min以去除水分，得到铁皮石斛黄酮提取液；将沉淀用无水乙醇洗涤后，再加入水中（控制水与沉淀的用量比为40 mL：1 g），通过在55 ℃的旋蒸仪中旋蒸40 min以去除乙醇，得到铁皮石斛多糖提取液。
实施例3 铁皮石斛提取物的制备
S1. 将甜菜碱、甘油、1,3-丁二醇按3：6：2的摩尔比置于烧杯中，在75 ℃下磁力搅拌至体系呈澄清透明的粘稠状液体，再冷却至30 ℃（此时无晶体析出），加水使体系含水量为40wt %，即为低共熔溶剂；
S2. 将粉碎至50目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到75 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为8 mL：1 g），置于65 ℃水浴锅中加热搅拌1.2 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为40：1）充分混合，在超声仪器中进行超声提取（在30k Hz下超声40 min）后，再在60 ℃下水浴加热提取50 min，得到粗提取液；
S3. 将粗提取液在8000 rpm下离心12 min后，过滤，弃滤渣，将滤液在65 ℃下旋蒸20 min以去除水分，再将旋蒸液加入到无水乙醇中（控制无水乙醇与旋蒸液的质量比为4.5：1），于3 ℃下静置24 h后，过滤得到上清液与沉淀；
S4. 将上清液在65 ℃下旋蒸40 min以去除水分，得到铁皮石斛黄酮提取液；将沉淀用无水乙醇洗涤后，再加入水中（控制水与沉淀的用量比为10 mL：1 g），通过在65 ℃的旋蒸仪中旋蒸20 min以去除乙醇，得到铁皮石斛多糖提取液。
实施例4 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将1,3-丁二醇替换为1,2-戊二醇。
实施例5 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将1,3-丁二醇替换为1,2-己二醇。
实施例6 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将1,3-丁二醇替换为柠檬酸。
实施例7 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将甘油替换为1,3-丁二醇，将1,3-丁二醇替换为1,2-戊二醇。即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：3：1的甜菜碱、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇。
实施例8 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将甘油替换为1,3-丁二醇，将1,3-丁二醇替换为1,2-己二醇。即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：3：1的甜菜碱、1,3-丁二醇、1,2-己二醇。
实施例9 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将甘油替换为1,3-丁二醇，将1,3-丁二醇替换为柠檬酸。即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：3：1的甜菜碱、1,3-丁二醇、柠檬酸。
实施例10 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将甘油替换为1,2-戊二醇，将1,3-丁二醇替换为1,2-己二醇。即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：3：1的甜菜碱、1,2-戊二醇、1,2-己二醇。
实施例11 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将甘油替换为1,2-戊二醇，将1,3-丁二醇替换为柠檬酸。即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：3：1的甜菜碱、1,2-戊二醇、柠檬酸。
实施例12 铁皮石斛提取物的制备
同实施例1，区别在于，将甘油替换为1,2-己二醇，将1,3-丁二醇替换为柠檬酸。即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：3：1的甜菜碱、1,2-己二醇、柠檬酸。
对比例1
同实施例1，区别在于，不添加甘油，即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：4的甜菜碱、1,3-丁二醇，且保持S2所用低共熔溶剂的总质量不变。
对比例2
同实施例1，区别在于，不添加1,3-丁二醇，即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：4的甜菜碱、甘油，且保持S2所用低共熔溶剂的总质量不变。
对比例3
同实施例1，区别在于，将甜菜碱替换为L-脯氨酸。
对比例4
同实施例1，区别在于，将甘油替换为乙二醇。
对比例5
同实施例1，区别在于，将1,3-丁二醇替换为山梨醇。
对比例6
同实施例1，区别在于，将甘油、1,3-丁二醇均替换为1,2-丙二醇，即低共熔溶剂的原料成分为摩尔比1：4的甜菜碱、1,2-丙二醇，且保持S2所用低共熔溶剂的总质量不变。
对比例7
同实施例1，区别在于，将S2超声替换为加热，即S2具体如下：
S2. 将粉碎至40目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到80 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为10 mL：1 g），置于70 ℃水浴锅中加热搅拌1 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为50：1）充分混合，在70 ℃下水浴加热提取90 min，得到粗提取液。
对比例8
同实施例1，区别在于，将S2加热替换为超声，即S2具体如下：
S2. 将粉碎至40目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到80 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为10 mL：1 g），置于70 ℃水浴锅中加热搅拌1 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为50：1）充分混合，在超声仪器中进行超声提取（在40k Hz下超声90 min），得到粗提取液。
对比例9
同实施例1，区别在于，S2的超声与加热同时进行，即S2具体如下：
S2. 将粉碎至40目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到80 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为10 mL：1 g），置于70 ℃水浴锅中加热搅拌1 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为50：1）充分混合，在超声仪器中，边超声边水浴加热45 min（加热温度70 ℃、超声频率40k Hz），得到粗提取液。
对比例10
同实施例1，区别在于，将低共熔溶剂替换为水，即S2具体如下：
S2. 将粉碎至40目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到80 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为10 mL：1 g），置于70 ℃水浴锅中加热搅拌1 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到水中（控制水与铁皮石斛粉末的质量比为50：1）充分混合，在超声仪器中进行超声提取（在40k Hz下超声45 min）后，再在70 ℃下水浴加热提取45 min，得到粗提取液。
对比例11
同实施例1，区别在于，S2先低共熔溶剂提取，再依次高压均质、酶解、加热（不进行超声），即S2具体如下：
S2. 将粉碎至40目的5 g铁皮石斛粉末进行干燥，再加入到80 %（v/v）乙醇中（控制乙醇与铁皮石斛粉末的用量比为10 mL：1 g），置于70 ℃水浴锅中加热搅拌1 h进行脱色、脱脂处理后，过滤，将滤渣烘干，加入到低共熔溶剂中（控制低共熔溶剂与铁皮石斛粉末的质量比为50：1）充分混合，于50 ℃下提取20 min，得到提取液；再于80 Mpa、50 ℃下进行高压均质处理20 min，重复高压均质五次，然后加入质量比1：3：2的胰蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶（总酶质量为提取液质量的5 %），在65 ℃下酶解2 h后，在70 ℃下水浴加热提取45 min，得到粗提取液。
测试例1 铁皮石斛提取物的稳定性测试
一、测试方法
将实施例1～12与对比例1～11所得铁皮石斛多糖提取液、铁皮石斛黄酮提取液分别于25 ℃的条件下静置1个月，并于第0、30天时观察提取液。
二、测试结果
结果如表1所示。
表1 稳定性测试结果
可见，实施例1～12所得铁皮石斛多糖提取液与铁皮石斛黄酮提取液在静置1个月后，仍能保持澄清透明，稳定性较佳；而对比例3、8～11所得铁皮石斛多糖提取液与对比例10所得铁皮石斛黄酮提取液在静置1个月后均出现不稳定的现象。表明正是本发明按特定顺序结合了低共熔溶剂处理、超声、加热等工艺对铁皮石斛进行提取，并为低共熔溶剂选择了特定的氢键受体，才使提取得到的铁皮石斛多糖与黄酮具有优异的稳定性。
测试例2 多糖、黄酮含量的测定
一、多糖含量的测定
（1）多糖标准曲线的绘制
取100 mg干燥的葡萄糖置于烧杯中，加蒸馏水定容至100 mL，混匀，得到浓度1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL的葡萄糖标准溶液置于试管中，并用蒸馏水补足1 mL，再加入2 mL的DNS试剂充分混匀，沸水浴5 min后，冷却至25 ℃，然后加入9 mL蒸馏水，于540 nm处检测溶液的吸光度值。以葡萄糖标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制多糖的标准曲线。
（2）总糖溶液的制备
将实施例1～12与对比例1～11所得铁皮石斛多糖提取液加水稀释至体积150 mL后，分别量取1 mL置于试管中，加入1 mL蒸馏水与2 mL的7 mol/L盐酸溶液充分混匀，沸水浴5 min后，冷却至25 ℃，加入0.05 mL酚酞指示液，再加入15wt % NaOH至溶液出现微红色后，将溶液转移至25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容摇匀，得到总糖溶液。
（3）还原糖溶液的制备
将实施例1～12与对比例1～11所得铁皮石斛多糖提取液加水稀释至体积150 mL后，分别量取5 mL置于10 mL容量瓶中，加入0.05 mL酚酞指示液，再加入15wt % NaOH至溶液出现微红色后，加蒸馏水定容摇匀，得到还原糖溶液。
（4）总糖与还原糖含量的测定
量取1 mL总糖溶液与1 mL还原糖溶液，分别置于试管中，加入1 mL蒸馏水与2 mL的DNS试剂充分混匀，沸水浴5 min后，冷却至25 ℃，然后加入蒸馏水定容至25 mL，于540nm处检测溶液的吸光度值。根据标准曲线分别确定实施例1～12与对比例1～11所得铁皮石斛多糖提取液中的总糖与还原糖含量。
（5）多糖含量的计算
根据公式“多糖含量（mg/mL）=总糖含量-还原糖含量”、“提取率（%）=（多糖含量×铁皮石斛多糖提取液体积）/铁皮石斛质量×100 %”（此处铁皮石斛质量为5 g）计算得到铁皮石斛中多糖的提取率。
二、黄酮含量的测定
（1）黄酮标准曲线的绘制
称取0.002 g芦丁溶解于3 mL的30 %（v/v）乙醇中，再加蒸馏水定容至10 mL，得到0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别取1.5、1.0、0.5、0.25、0.15 mL的芦丁标准溶液置于试管中，并用30 %（v/v）乙醇补足5 mL，加入0.3 mL的10wt % Al（NO3）3溶液混匀后静置5 min，再加入0.3 mL的5wt % NaNO2溶液混匀后静置5 min，加入3 mL的1 mol/L NaOH溶液，并用30%（v/v）乙醇定容至10 mL，摇匀后静置15 min，于510 nm处检测溶液的吸光度值。以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制黄酮的标准曲线。
（2）黄酮含量的测定
将实施例1～12与对比例1～11所得铁皮石斛黄酮提取液加水稀释至体积75 mL后，分别量取0.5 mL置于试管中，加入4.5 mL的30 %（v/v）乙醇摇匀，并加入0.3 mL的10wt% Al（NO3）3溶液混匀后静置5 min，再加入0.3 mL的5wt % NaNO2溶液混匀后静置5 min，加入3 mL的1 mol/L NaOH溶液，并用30 %（v/v）乙醇定容至10 mL，摇匀后静置15 min，于510nm处检测溶液的吸光度值。根据标准曲线确定实施例1～12与对比例1～11所得铁皮石斛黄酮提取液中的黄酮含量，并根据公式“提取率（%）=（黄酮含量×铁皮石斛黄酮提取液体积）/铁皮石斛质量×100 %”（此处铁皮石斛质量为5 g）计算得到铁皮石斛中黄酮的提取率。
三、含量测定结果
结果如表2所示。
表2 铁皮石斛多糖与黄酮含量的测定结果
可见，实施例1～12铁皮石斛多糖与黄酮的提取率显著高于对比例1～11，表明正是本发明按特定顺序结合了低共熔溶剂处理、超声、加热等工艺对铁皮石斛进行提取，并专门在低共熔溶剂中设置了两种不同的氢键供体，与特定的氢键受体相复配，才使得铁皮石斛中多糖与黄酮的提取率得到显著的提升，进而显著提高了铁皮石斛的原料利用率。
测试例3 铁皮石斛多糖提取液的安全性测试
参照2015化妆品安全技术规范中重复性开放型涂抹试验方法，对实施例1～12所得铁皮石斛多糖提取液进行斑贴实验，测试其刺激性，按如表3所示的标准观察受试区域的皮肤状况，统计得到的皮肤反应结果如表4所示。
表3 斑贴实验皮肤等级标准
表4 斑贴实验皮肤反应结果
可见，实施例1～12所得铁皮石斛多糖提取液在斑贴实验中均呈阴性反应，表明本发明的铁皮石斛多糖提取液安全性高，可直接作用于皮肤。
测试例4 铁皮石斛多糖提取液的保湿功效测试
一、体外保湿功效测试
（1）测试方法
首先取两份1 g实施例1所得铁皮石斛多糖提取液，分别加水配制得到1wt %和10wt %的铁皮石斛多糖提取液。取三个直径3 cm的称量瓶分别干燥至恒重（称重W1），再在三个称量瓶中分别加入0.5 g的0.2wt %透明质酸钠溶液、1wt %铁皮石斛多糖提取液、10wt%铁皮石斛多糖提取液（称重W2），然后将三个称量瓶分别置于平均温度（T）26.0 ℃、相对湿度（RH）10 %的干燥器中放置24 h，并于第2、4、6、24 h时分别称重W3。试验重复三次，结果取平均值。
（2）测试结果
根据“吸湿率H=（W3-W2）/（W2-W1）×100 %”计算吸湿率，结果如图1所示。
可见，1wt %的铁皮石斛多糖提取液在第4～24 h时的保湿性能与现有常用于保湿的成熟产品——0.2wt %透明质酸钠溶液相当，且在第6 h时的保湿率仍能保持在70 %以上；10wt %的铁皮石斛多糖提取液在第4～6 h时的保湿性能与现有常用于保湿的成熟产品——0.2wt %透明质酸钠溶液相当，在第6 h后的保湿性能甚至还优于0.2wt %透明质酸钠溶液。表明本发明得到的铁皮石斛多糖提取液具有长效、优异的保湿性能，十分适用于制备保湿化妆品。
二、角质层水分含量测试
（1）测试方法
首先取1 g实施例1所得铁皮石斛多糖提取液，加水配制得到10wt %的铁皮石斛多糖提取液。再选择皮肤健康、无化妆品过敏史的受试者32名（18～57岁，男14名，女18名），用纯水分别清洁左右手的前臂内侧后，擦干，于室内温度25 ℃、相对湿度为50 %～60 %的房间内静坐30 min后，划定前臂内侧面积3 cm×3 cm的区域作为受试区域。使用CorneometerCM825测量受试区域内皮肤角质层的水分含量（T0h）后，于左臂的受试区域涂抹10wt %的铁皮石斛多糖提取液（2.0±0.1 mg/cm2），作为样品组。并以涂抹等量纯水（不涂抹铁皮石斛多糖提取液）的右臂受试区域作为空白对照组。所有受试者于室内温度25 ℃、相对湿度为50 %～60 %的房间内静坐5 min、2 h后，再次使用Corneometer CM825测量受试区域内皮肤角质层的水分含量（T5min、T2h）。每次测量重复三次，结果取平均值。
（2）测试结果
结果如表5所示。
表5 角质层水分含量测试结果
其中，“/”代表无显著性差异。
可见，样品组受试区域在涂抹10wt %的铁皮石斛多糖提取液后，角质层的水分含量在5 min内即可得到显著的提升，且一直到2 h时仍能保持较高的水分含量水平（与涂抹前存在显著性差异），表明本发明得到的铁皮石斛多糖提取液具有即时、优异的保湿性能，十分适用于制备保湿化妆品。
测试例5 铁皮石斛多糖提取液的抗衰功效测试
一、溶液配制
（1）样品溶液：取五份1 g实施例1所得铁皮石斛多糖提取液，分别加水配制得到0.125wt %、0.25wt %、0.5wt %、1.25wt %和2.5wt %的铁皮石斛多糖提取液。
（2）Tricine缓冲液：浓度50 mmol/L，pH 7.5。
（3）胶原蛋白酶溶液：取0.005 g胶原蛋白酶，加入到Tricine缓冲液中配制得到0.8 U/mL的胶原蛋白酶溶液。
（4）FALGPA溶液：取0.0096 g FALGPA，加入到Tricine缓冲液中配制得到2 mmol/L的FALGPA溶液。
二、测试方法
A组：将40 μL不同质量浓度的样品溶液分别与100 μL Tricine缓冲液混匀后，再加入20 μL 0.8 U/mL的胶原蛋白酶溶液混匀，于25 ℃下恒温孵育15 min后，加入40 μL 2mmol/L的FALGPA溶液混匀，再于25 ℃下恒温孵育15 min后，在335 nm处测定溶液的吸光度值A。
B组：将40 μL不同质量浓度的样品溶液分别与100 μL Tricine缓冲液混匀后，再加入20 μL Tricine缓冲液混匀，于25 ℃下恒温孵育15 min后，加入40 μL Tricine缓冲液混匀，再于25 ℃下恒温孵育15 min后，在335 nm处测定溶液的吸光度值B。
C组：取140 μL Tricine缓冲液与20 μL 0.8 U/mL的胶原蛋白酶溶液混匀，于25℃下恒温孵育15 min后，加入40 μL 2 mmol/L的FALGPA溶液混匀，再于25 ℃下恒温孵育15min后，在335 nm处测定溶液的吸光度值C。
D组：取160 μL Tricine缓冲液于25 ℃下恒温孵育15 min后，加入40 μL Tricine缓冲液混匀，再于25 ℃下恒温孵育15 min后，在335 nm处测定溶液的吸光度值D。
试验重复三次，结果取平均值。
三、测试结果
根据“抑制率（%）=[（C-D）-（A-B）]/（C-D）×100 %”计算样品溶液的胶原蛋白酶抑制率（结果如图2所示），进而得到样品溶液的IC50值为1.27 %，表明本发明得到的铁皮石斛多糖提取液具有优异的抗衰性能，十分适用于制备抗衰化妆品。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种铁皮石斛提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 将氢键受体、氢键供体A、氢键供体B按1～3：1～6：0.1～2的摩尔比在65～75 ℃下混合至体系呈澄清透明的粘稠状液体后，加水至含水量为40wt %～80wt %，得到低共熔溶剂；
S2. 将铁皮石斛粉末加入到低共熔溶剂中，于30k～50k Hz下超声40～50 min后，再于60～80 ℃下加热40～50 min，得到粗提取液；所述铁皮石斛粉末与低共熔溶剂的质量比为1：40～100；
S3. 将粗提取液依次进行离心、浓缩后，将浓缩液加入到无水乙醇中，于3～5 ℃下静置12～24 h，分离得到上清液与沉淀；所述浓缩液与无水乙醇的质量比为1：3.5～4.5；
S4. 上清液去除水分后，得到铁皮石斛黄酮提取液；沉淀依次经洗涤、加水、去除乙醇后，得到铁皮石斛多糖提取液；
其中，所述氢键受体为甜菜碱；所述氢键供体A为甘油、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇中的一种或几种；
且：
当所述氢键供体A为甘油时，所述氢键供体B为1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、柠檬酸中的一种或几种；
当所述氢键供体A为1,3-丁二醇时，所述氢键供体B为1,2-戊二醇、1,2-己二醇、柠檬酸中的一种或几种；
当所述氢键供体A为1,2-戊二醇时，所述氢键供体B为1,2-己二醇和/或柠檬酸；
当所述氢键供体A为1,2-己二醇时，所述氢键供体B为柠檬酸；
S2所述铁皮石斛粉末还先进行预处理，具体为：将铁皮石斛粉末加入到75 %（v/v）～85%（v/v）乙醇中，于65～75 ℃下加热0.8～1.2 h后，过滤并干燥；所述铁皮石斛粉末与乙醇的用量比为1 g：8～12 mL。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1所述混合为在70 ℃下混合。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述铁皮石斛粉末与低共熔溶剂的质量比为1：50。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述超声的频率为40k Hz。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述超声的时间为45 min。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述加热的温度为70 ℃。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述加热的时间为45 min。
8.权利要求1～7任一所述方法制备得到的铁皮石斛提取物，其特征在于，所述铁皮石斛提取物为铁皮石斛黄酮提取液和/或铁皮石斛多糖提取液。
9.权利要求8所述铁皮石斛提取物在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述铁皮石斛提取物为铁皮石斛多糖提取液。
10.一种化妆品，其特征在于，含有权利要求8所述铁皮石斛提取物，所述铁皮石斛提取物为铁皮石斛多糖提取液。
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