FI94428C - Pichia-sukuisten hiivojen transformointi - Google Patents

Description

x . 94428

Pichia-sukuisten hiivojen transformointi Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikkaan. Eräässä piirteessään tämä keksintö kohdistuu uusiin hiivakantoihin.

Eräässä toisessa piirteessään tämä keksintö kohdistuu menetelmiin hiivakantojen transformoimiseksi yhdistelmä-DNA-materiaalilla.

Toistaiseksi kaupallisessa toiminnassa erilaisten polypeptidien tuottamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla ollaan keskitytty isäntäorganismin suhteen Escherichia coli-bakteeriin. Kuitenkin joissakin tapauksissa E. coli voi osoittautua sopimattomaksi isännäksi. E. coli-bakteeri sisältää esimerkiksi lukuisia toksisia ja pyrogeenisia tekijöitä, jotka on poistettava niistä polypeptideistä, joita on tarkoitus käyttää farmaseuttisina tuotteina. Tässä puhdistuksessa saavutettu tehokkuus vaihtelee luonnollisestikin kyseessä olevan polypeptidin mukaan. Lisäksi E. coli-bakteerin proteolyyttiset aktiivisuudet voivat huomattavasti rajoittaa eräiden käyttökelpoisten tuotteiden saantoa. Nämä ja muut huomiot ovat lisänneet vaihtoehtoisiin isäntiin kohdistuvaa mielenkiintoa, erityisesti huomio on kohdistunut eukarioottis-ten organismien käyttöön polypeptidituotteiden tuottamiseksi.

Mikäli käytettävissä olisi menetelmiä polypeptidituotteiden tuottamiseksi eukarioottisissa järjestelmissä, esimerkiksi hiivoissa, niin huomattavia etuja voitaisiin saavuttaa prokarioottisten järjestelmien, kuten E. coli-bakteerin käyttöön verrattuna yhdis-telmä-DNA:n koodaamien polypeptidien tuottamiseksi. Hiivoja on käytetty vuosisatojen ajan suuressa mitassa toteutetuissa käymis-prosesseissa, kun taas E. coli-bakteerin käyttäminen suuren mitan käymisissä on suhteellisen uutta. Hiivoja voidaan yleisesti ottaen • · ' kasvattaa suurempiin solutiheyksiin kuin bakteereita, ja ne voidaan mukauttaa helpommin jatkuviin käymisprosesseihin. Hiivan, kuten Pichia pastoris-hiivan, kasvattaminen erittäin suuriin solu-tiheyksiin, eli suuruudeltaan yli 100 g/1 oleviin solutiheyksiin, onkin julkaistu US-patenttijulkaisussa 4 414 329. Hiivaisäntien • · 2 - 94428 muina etuina on muun muassa se, että organismin lukuisat kriittiset toiminnot, esimerkiksi oksidatiivinen fosforylaatio, tapahtuu organellien sisällä, joten ne eivät ole alttiina niille haitallisille vaikutuksille, joita organismissa muodostuvat, isännän villityypin soluille vieraat polypeptidit mahdollisesti aiheuttavat. Eukarioottisena organismina hiiva saattaa kyetä glyko-syloimaan ilmentyneet polypeptidituotteet, mikäli tällainen gly-kosylaatio on tärkeätä polypeptidituotteen bioaktiivisuudelle.

Samoin on mahdollista, että eukarioottisena organismina hiivassa esiintyy samanlaista kodonien suosimista kuin korkeammissakin organismeissa, jolloin taipumuksena on niiden ilmentyvien tuotteiden tehokkaampi muodostuminen, jotka tuotteet ovat peräisin nisäkkään geeneistä tai sellaisesta täydentävästä DNA:sta (cDNA), joka on saatu käänteisellä kopioinnilla esimerkiksi nisäkkään mRNA-molekyylistä.

Ominaisuuksiltaan huonosti tunnettujen hiivasukujen kehittämistä isäntä/vektorijärjestelmiksi vaikeuttaa huomattavasti transformaation olosuhteisiin ja sopiviin vektoreihin liittyvän tietouden puute. Lisäksi käytettävissä ei useinkaan ole auksotrofisia mutaatioita, joten transformanttien suora valikointi auksotrofi-sen täydentämisen avulla on mahdotonta. Jotta yhdistelmä-DNA-tekniikkaa voitaisiin käyttää mahdollisimman täydellisesti hyväksi, on kyettävä kehittämään uusia isäntä/vektorijärjestelmiä, ·· jotka helpottavat DNA:n manipuloimista, ja joiden avulla istutettujen DNA-ketjujen ilmentymistä voidaan optimoida siten, että toivottuja polypeptidituotteita voidaan tuottaa hallituissa olosuhteissa, saannon ollessa korkea.

Näin ollen tämän keksinnön tavoitteena on Pichia-sukuisten hii-·) vojen transformoiminen.

Tämän keksinnön toisena tavoitteena on Pichia-sukuinen isäntä, joka voidaan transformoida yhdistelmä-DNA-materiaalilla.

Tämän keksinnön nämä ja myöskin muut tavoitteet ovat ilmeisiä *--- tämän julkaisun sekä liitteenä olevien patenttivaatimusten perus teella.

3 - 94428 Tämän keksinnön tavoitteiden mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan menetelmä Pichia-sukuisten hiivasolujen transformoimi-seksi. Tämän keksinnön mukaisen transformointimenetelmän käytännön sovellutuksessa DNA-ketjuja voidaan istuttaa Pichia-sukui-siin isäntäsoluihin, jolloin Pichia-hiivaa voidaan käyttää isäntä järjestelmänä tuotettaessa polypeptidituotetta hiivassa.

Edelleen tämän keksinnön tavoitteiden mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan Pichia-sukuisten mikro-organismien uusia kantoja. Näitä uusia kantoja voidaan käyttää isäntinä, kun yhdistelmä-DNA-materiaalia halutaan istuttaa hiivoihin.

Edelleen tämän keksinnön erään muun suoritusmuodon mukaisesti näitä uusia, Pichia-sukuisten mikro-organismien kantoja käytetään menetelmässä toiminnallisten geenien sekä muiden toiminnallisten DNA-ketjujen, eristämiseksi Pichia-sukuisista hiiva-kannoista.

Piirustuksissa:

Kuva 1 on plasmidin pYA2 restriktiokartta.

Kuva 2 on plasmidin YEpl3 restriktiokartta.

Kuva 3 on plasmidin pYA4 restriktiokartta.

Kuva 4 on plasmidin pYJ30 restriktiokartta.

Kuva 5 on plasmidin pYJ32 restriktiokartta.

··: Kuva 6 on plasmidin pSA0H5 restriktiokartta.

Käytetyistä restriktioentsyymeistä käytetään tässä julkaisussa seuraavia lyhenteitä: > · · • · 4 - 94428

Lyhenne Restriktioentsyymi

B BamHI

B2 Bglll H3 Hindlll

Nr NruI

Ps PstI

EcoRI

R5 EcoRV

S Sali

Sm Smal

Sp Sphl

S3 Sau3AI

Xh XhoI

Sellainen restriktioentsyymin kohta, jota käytettiin DNA-ketjun muodostamiseen, mutta joka tuhoutui tämän muodosteen ligaatiossa, esitetään kuvissa suluissa.

Tämän keksinnön tavoitteiden mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan transformointimenetelmä yhdistelmä-DNA-materiaalin istuttamiseksi Pichia-sukuisiin isäntäsoluihin.

Edelleen tämän keksinnön tavoitteiden mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan uusia Pichia-sukuisia hiivakantoja, joita voidaan käyttää isäntinä, kun yhdistelmä-DNA-materiaalia halutaan istuttaa hiivoihin.

Edelleen tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan menetelmä toiminnallisten geenien ja muiden toiminnallisten DNA-ketjujen eristämiseksi Pichia-sukuisten hiivo-jen perimästä.

• I

Pichia pastoris-hiivan transformaatiojärjestelmän kehittäminen Pichia pastoris-hiivan transformointia ei ole kuvattu aikaisemmin. Kokeelliset toimenpiteet Pichia pastoris-hiivan transfor-moimiseksi esitetään yksityiskohtaisemmin jäljempänä (esimerkki • «

Il ; I II l Hill I I .J.JH i : I

5 - 94428 III). Transformaatiojärjestelmän kehittämiseksi Pichia pastoris-hiivaa varten auksotrofinen mutantti GS115 (NRRL Y-15851) eristettiin ja sen histidiinireitti todettiin puutteelliseksi, sillä tästä kannasta ei voitu todeta lainkaan histidinoli-dehydrogenaa-sin aktiivisuutta (katso esimerkissä II esitetty koemenetelmä).

Alan asiantuntijalle on selvää, että mutaatioiden esiintymistiheyttä voidaan lisätä lukuisilla tavoilla, kuten esimerkiksi siten, että eksponentiaalisen kasvun vaiheessa olevat solut alistetaan erilaisten mutageenisten aineiden, kuten N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinin, etyylimetaanisulf onaatin, ultraviolettisäteilyn, tai muiden vastaavien vaikutukselle. Sellaisten mutanttikantojen, joiden jokin tietty metaboliareitti on puutteellinen, eristäminen ja tunnistaminen voidaan toteuttaa siten, että määritetään se ravinne tai ne ravinteet, jo(i)ta tämä kanta tarvitsee kasvaakseen, kuten esimerkiksi esimerkissä I esitetään. Tämän jälkeen se erityinen geeni ja geenituote, joiden suhteen mutanttikanta on puutteellinen, voidaan määrittää tunnistamalla puuttuva entsyymiaktiivisuus, kuten esimerkiksi esimerkissä II esitetään.

Pichia-sukuisia hiivakantoja, ja erityisesti tämän keksinnön mukaisia Pichia-hiivan mutanttikantoja voidaan transformoida siten, että soluseinämät hajotetaan entsymaattisesti, jolloin saadaan sferoplasteja; tämän jälkeen nämä sferoplastit sekoitetaan trans-·*: formoivaan DNA:hän ja niitä inkuboidaan kalsiumionien ja polyety- leeniglykolin läsnäollessa, jonka jälkeen ne regeneroidaan selektiivisellä kasvatusalustalla. Tämä transformoiva DNA sisältää sen toiminnallisen geenin, joka puuttuu isäntäkannalta, joten ainoastaan transformoidut solut säilyvät hengissä käytetyllä selektiivisellä kasvatusalustalla.

. · • · ·

Pichia-hiivan sferoplastien valmistamiseksi solut saatetaan ensin kosketuksiin sulfhydryyliryhmiä pelkistävän aineen, kuten ditiotreitolin tai β-merkaptoetanolin, kanssa. Esimerkkinä spesifisestä, sulfhydryyliryhmiä pelkistävää ainetta sisältävästä liuoksesta mainittakoon esimerkeissä kuvattava, ditiotreitolia 6 - 94428 sisältävä SED-puskuri. Tämän jälkeen soluseinämien entsymaat-tinen hajottaminen voidaan suorittaa saattamalla transformoitava kanta kosketuksiin minkä tahansa lukuisan, alan asiantuntijalle tutun, soluseinämiä hajottavan reagenssin kanssa, kuten esimerkiksi entsyymien Zymolyase (Miles Laboratories), Glusulase (Endo Laboratories), ja muiden vastaavien kanssa. Vaikka tällöin lukuisia erilaisia lämpötiloja, kosketusaikoja ja entsyymien annostustasoja voidaankin käyttää, niin kuitenkin tavallisesti, esimerkiksi entsyymiä Zymolyase 60 000 (60 000 yksikköä/gramma) käytettäessä sferoplastien muodostamiseen tarvitaan noin 10-100 ^ug soluseinämiä hajoittavaa reagenssiä solususpension 10 millilit-raa kohden. Mieluiten käytetään noin 40-50 ^ug entsyymiä Zymolyase 60 000 solususpension 10 millilitraa kohden. Lämpötilaa pidetään tavallisesti noin 25°C:ssa tai sen yläpuolella, mutta kuitenkin suurin piirtein alle 35°C:een. Kosketusarka on tavallisesti vähintään noin 15 minuuttia, ja yleensä se on korkeintaan 60 minuuttia. Useat puskuroidut väliaineet ovat sopivia, mutta kuitenkin on olennaista, että sferoplasteiksi muutettavat solut on suspendoitu puskuriin, joka on iso-osmoottista solujen kanssa, kuten esimerkiksi SCE-puskuriin (sorbitoli/sitraatti/EDTA; katso valmistusohje esimerkeistä).

Sferoplastit voidaan transformoida saattamalla ne kosketuksiin yhdistelmä-DNA-materiaalin lähes minkälaisten määrien kanssa tahan-*: sa. Yleisesti ottaen transformoinnissa käytetään vähintään noin 0,01 yug transformoivaa DNA-materiaalia sferoplasteja sisältävän liuoksen 100 mikrolitraa kohden (tämän liuoksen sisältäessä 7 suurin piirtein 1-3 x 10 sferoplastia 100 mikrolitraa kohden). Mikäli käytettävissä on ainoastaan pieniä määriä yhdistelmä-DNA-materiaalia, niin sonikoidun E. coli-bakteerin DNA:11a voidaan \m täydentää käytettävissä olevaa DNA-määrää, jolloin transformaation esiintymistiheys kasvaa, koska tällöin kokeellisen manipuloinnin aikana yhdistelmä-DNA-materiaalin käsittelyssä syntyvät tappiot saadaan pienemmiksi.

Tämän jälkeen transformoituja sferoplasteja käsitellään soluseinämiä regeneroivissa (uudistavissa) olosuhteissa. Soluseinämiä

l· *tt-t ·κη ia 4 U

7 94428 uudistavat olosuhteet käsittävät transformoituja sferoplasteja sisältävän näytteen lisäämisen sulaan regenerointiagariin, jota pidetään noin 40-60°C:n lämpötilassa. Tyypillinen regenerointi-agar on osmoottisesti tasapainoitettu alusta, ja se käsittää:

sorbitolia noin 1 M

dekstroosia noin 0,1 M

hiivan typpialustaa noin 7 g/1

Bacto-agaria noin 3 %.

Sulassa regenerointiagarissa olevat transformoidut sferoplastit kaadetaan regenerointiagarin muodostelman pohjakerroksen päälle, jonka jälkeen niitä inkuboidaan noin 25-35°C:n lämpötilassa noin 3-10 vuorokautta.

Pichia pastoris-hiiva NEFL Y-15851 (GS115) on transformoitu lukuisilla plasmideilla. Monet näistä plasmideista ovat uusia, joten ne on tallennettu kantakokoelmaan Northern Fegional Fesearch Center, Peoria, Illinois, jotta nämä plasmidit olisivat yleisön käytettävissä. Nämä plasmidit ja niiden tunnusnumerot on esitetty alla olevassa taulukossa (nämä kaikki plasmidit on tallennettu E. coli-isännässä).

Plasmidi Keksijän käyttämä NFFL-tunnusnumero _ nimitys kannasta _ '* pYA2 LE392-pYA2 B-15874 pYJ30 LE392-pYJ30 B-15890 pYJ32 LE392-pYJ32 B-15891 pSA0H5 MC106l-pSA0H5 B-15862

Hiivan GS115 transformointiin käytettiin myös plasmidia pYA4, joka ;* on peräisin S. cerevisiae - E. coli-sukkulavektorista YEpl3 (saatavana kantakokoelmasta ATCC tunnusnumeron 37115 perusteella:

Katso kuva 2). Näin ollen plasmidi pYA4 on YEpl3 plus Pichia pastoris-hiivan kromosomaalisesta DNA:sta osittaisella pilkkomisella saatu 6,0 kiloemäsparin suuruinen Sau3A-kappale, joka käsittää « · · - 94428 8 plasmidin YEpl3 ainoaan BamHI-kohtaan ligatoidun HIS4-geenin (katso kuva 3).

Plasmidi pYA2 (katso kuva 1) sisältää plasmidin pBR325 DNA-ket-juja sekä S. cerevisiae-hiivan 9,3 kiloemäsparin suuruisen Pstl-kappaleen, joka sisältää S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenin. Yllättävästi todettiin, että plasmidin pYA2 sisältämä S. cerevisiae-hiivan HIS4-geeni toimi Pichia-hiivassa. Lisäksi yllättävä havainto oli, että plasmidi pYA2, joka transformoi S. cerevisiae-hiivan yhtenäistävästi alhaisella esiintymistiheydellä, transformoi Pichia-hiivan siten, että transformaation esiintymistiheys oli korkea, ja se säilyi kromosomien ulkopuolisena elementtinä hiivassa NRRL Y-15851 usean kasvaneen sukupolven ajan.

Kuvassa 4 esitetty plasmidi pYJ30 käsittää plasmidin pBR322 DNA-ketjuja, Pichia-hiivan kromosomaalisesta DNA:sta peräisin olevan, 2,7 kiloemäsparin suuruisen Bglll-kappaleen, joka sisältää Pichia-hiivan HIS4-geenin, sekä Pichia-hiivan kromosomaalisesta DNA:sta peräisin olevan, 164 emäsparin suuruisen Taql-kappaleen, jolla on autonomisen replikaatioketjun aktiivisuutta (PARSi) .

Tätäkin plasmidia on käytetty hiivan NRRL Y-15851 (GS115) trans-formointiin, ja tämä transformaatio tapahtuu suurella esiintymistiheydellä. Tätä plasmidia voidaan käyttää istutettaessa yhdiste lmä-DNA-ma te riaalia Pichia-sukuiseen isäntään. Esimerkiksi ;** plasmidi pSAOH5 (katso kuva 6) on saatu tästä plasmidista istuttamalla E. coli-bakteerin LacZ-geeni ja alkoholioksidaasin säätelevä alue plasmidin pYJ30 ainoaan R^-kohtaan. Alla olevassa esimerkissä IV esitetään, että plasmidi pSA0H5 kykenee saamaan aikaan Pichia pastoris-hiivassa polypeptidituotteen, jota ei luonnostaan esiinny tässä isäntäsolussa.

* • ·

• I

Kuvassa 5 esitetty plasmidi pYJ32 on samankaltainen kuin plasmidi pYJ30, paitsi että PARS2 saa aikaan autonomisen replikaation aktiivisuuden, joka PARS2 on Pichia-hiivan kromosomaalisesta DNA:sta peräisin oleva 385 emäsparin suuruinen TaqI-kappale.

Tämäkin plasmidi kykenee transformoimaan Pichia pastoris-hiivan • , NRRL Y-15851 siten, että transformaation esiintymistiheys on korkea.

9 . 94428

Pichia-sukuisten hiivakantojen transformaation avulla, kuten ohessa esitetään, yhdistelmä-DNA-materiaalia saadaan istutetuksi hiivaisäntään. Kuten jäljempänä seuraavissa esimerkeissä yksityiskohtaisemmin esitetään, Pichia-sukuisten transformoitujen hiivakantojen avulla voidaan esimerkiksi tuottaa polypeptidi-tuotteita hiivaisännässä.

Tämän keksinnön erään muun suoritusmuodon mukaisesti tässä keksinnössä saadaan aikaan menetelmä toiminnallisten geenien tai muiden toiminnallisten DNA-ketjujen eristämiseksi Pichia-sukuisista hii-vakannoista. Toiminnallisten geenien eristämiseksi tässä menetelmässä puutteellinen Pichia pastoris-hiivan kanta täydennetään Pichia-hiivan kromosomaalisesta DNA:sta peräisin olevilla kloonatuilla kappaleilla, selektiivisissä kasvatusolosuhteissa eloonjääneet, transformoituneet kannat valikoidaan, näiden selektiivisten kasvatusolosuhteiden käsittäessä vähimmäisalustan, josta puuttuu se geenituote, jota puutteellinen isäntäkanta tarvitsee kasvaakseen, Pichia-hiivan DNA-istutteet eristetään ja otetaan talteen niistä plasmideista, joita nämä valikoidut, transformoituneet kannat sisältävät. Esimerkiksi Pichia-hiivan LEU2-geeni voitaisiin eristää siten, että P. pastoris-hiivan leu2-mutantti transformoidaan Pichia-hiivan kromosomaalisen DNA:n kirjastolla, jonka jälkeen valikoidaan sellaiset transformoituneet kannat, jotka pysyvät hengissä, vaikkei kasvatusalustaa olekaan täyden-- netty leusiinilla. Samoin Pichia-hiivan ARG4-geeni voitaisiin Λ · i eristää siten, että P. pastoris-hiivan sopiva mutantti transformoidaan Pichia-hiivan kromosomaalisen DNA:n kirjastolla, jonka jälkeen menetellään edellä esitetysti, paitsi että selektiivir sestä alustasta puuttuisi histidiini- tai arginiinitäydennys, vastaavasti.

Alan asiantuntijalle on selvää, että myöskin muita toiminnallisia DNA-ketjuja voidaan eristää tämän keksinnön mukaista transformaa- tiojärjestelmää käyttämällä: Tällaisia ketjuja ovat mm.: 10 94428 autonomiset replikaatioketjut (ARS), sentromeeriset ketjut (CEN-ketjut), kromosomien päät (telomeerit), promoottorit ja säätelevät alueet, kopioinnin ja luennan päättäjät, sekä muut vastaavat.

Esimerkit

Esimerkeissä käytetyillä puskureilla ja liuoksilla on seuraavassa esitetty koostumus: 1 M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 millilitrassa vettä; pH asetetaan toivottuun arvoon lisäämällä väkevää (35 %) HCl:n vesiliuosta; liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan ennen pH-arvon lopullista säätämistä

TE-puskuri 1,0 mM EDTA

0,01 M (pH 7,4) Tris-puskurissa YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta 2 % Bacto-peptonia 2 % dekstroosia SD-alusta 6,75 g hiivan typpialustaa ilman aminohappoja (Difco) • t 2 % dekstroosia 1 litrassa vettä SED 1 M sorbitoli

25 mM EDTA 50 mM DTT

SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 g EDTA 50 ml vettä pH säädetään arvoon 5,8 HCl-liuoksella n , 94428

CaS 1 M sorbitoli 10 mM CaCl2 steriloidaan suodattamalla PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykoli-3350 10 mM CaCl2 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitoli 0,3 x YPD-alusta 10 mM CaCl2 Vähimmäisalusta 0,875 g KH2P0^ 0,125 g K2HP04 1,0 g (NH4)2S04 0,5 g MgS04-7H20 0,1 g NaCl 0,05 mg FeCl3*6H20 0,07 mg ZnS04*7H20 0,01 mg H3B03 0,01 mg CuS04*5H20

0,01 mg KI

0,1 g CaCl2-2H20 yhdessä litrassa steriiliä vettä “ Vähimmäisalusta Vähimmäisalusta, josta puuttuu "miinus" (NH4)2S04

Sitraattipuskuri 9,79 g natriumsitraattia 3,2 g sitruunahappoa laimennetaan 500 millilitraksi vedellä pH asetetaan arvoon 5,5 IN NaOH-liuoksella

Nystatiiniliuos 4,4 mg nystatiinia (5680 yksikköä/mg) 1 ml dimetyyliformamidia laimennetaan 10 millilitraksi vedellä « l2 - 94428 E-puskuri 50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

0,01 mM histidinoli 50 mM MgS04 1 mM DTT

Vitamiiniseos p-aminobentsoehappo 50 mg/100 ml p-hydroksibentsoehappo 50 riboflaviini 25 pantotenaatti 50 B12 1 foolihappo 50 pyridoksiini 50 biotiini 5 tiamiini 10 nikotiinihappo 50 inositoli 2000

Esimerkeissä käytetään lyhenteitä, joilla on seuraava merkitys: NTG N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiini DTT ditiotreitoli NAD nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi SDS natriumdodekyylisulfaatti ala alaniini arg arginiini · · asn asparagiini asp asparagiinihappo cys kysteiini glu glutaamihappo gin glutamiini gly glysiini his histidiini ile isoleusiini leu leusiini lys lysiini met metioniini phe fenyylialaniini pro proliini ser seriini 13 - 94428 thr treoniini trp tryptofaani tyr tyrosiini vai väliini.

Esimerkki I

Auksotrofisten mutanttien eristäminen A. Pichia-hiivan mutageneesi

Valikoidun hiivakannan, kuten esimerkiksi Pichia pastoris-hiivan NRRL Y-11430, viljelmää siirrostettiin 100 millilitraan YPD-alustaa ja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa ravistelijassa noin 12-20 tuntia. Noin 40 ml tuloksena olevasta viljelmästä sentrifu-goitiin suurin piirtein nopeudella 2000 g 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti kulloinkin 40 millilitralla steriiliä 0,1 M sitraattipuskuria (pH 5,5). Pestyt solut suspendoitiin uudestaan 36 ml steriiliä sitraattipuskuria, jonka jälkeen ne käsiteltiin 4 millilitralla NTG-liuosta, joka sisälsi 5 mg NTG:tä millilitraa kohden - joten lopullinen NTG-pitoisuus oli 500yug/ml. Solujen annettiin seisoa tässä NTG-liuoksessa noin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa niitä sekoittamatta.

Tämän jälkeen NTG poistettiin pesemällä solut kahdesti kulloinkin 40 millilitralla steriiliä ionitonta vettä. Solut suspendoitiin uudestaan riittävään määrään YPD-alustaa, ja solut sekä YPD-·*, alusta siirrettiin tämän jälkeen pulloon, jonka kokonaistilavuudeksi saatettiin 100 ml YPD-alustaa lisäämällä. Näitä mutageenil-lä käsiteltyjä soluja inkuboitiin sitten 30°C:n lämpötilassa ravistelijassa noin 48 tuntia.

Inkuboinnin jälkeen noin 40 ml hiivasoluja sisältävää liuosta sentrifugoitiin nopeudella 2000 g 5 minuutin ajan. Solukasauma pestiin kahdesti kulloinkin 40 millilitralla steriiliä ionitonta vettä, jonka jälkeen se suspendoitiin 40 millilitraan vähimmäis-alustaan "miinus", joka sisälsi hiilen lähteenä 1 % glukoosia ja 5 ^ug biotiinia, ja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa ravistelijassa 12-20 tuntia.

14 . 94428 B. Nystatiinin rikastaminen

Edellä mainitusta, glukoosilla kasvatetusta viljelmästä otettiin 5 ml, ja se siirrostettiin 10 millilitraan "rajoittavaa alustaa". Tällainen rajoittava alusta käsittää vähimmäisalustan komponentit, ja sen lisäksi hiilen lähteen (tavallisesti 1 % glukoosi), ja sitä on täydennetty aina tilanteen mukaan vitamiinilla tai aminohapoilla (esimerkiksi edellä mainitulla "vitamiiniseoksella”), mutta alustaa ei ole täydennetty sen metaboliitin suhteen, jota metaboliittia syntyy siinä biosynteesireitissä, josta puutteellisuutta pyritään toteamaan. Esimerkiksi mikäli tavoitteena on leusiiniauksotrofin löytäminen, niin alustaa ei ole täydennetty leusiinilla. Rajoittavassa alustassa olevaa siirrostetta inku-boitiin 30°C:n lämpötilassa ravistelupullossa, ja viljelmää seurattiin säännöllisin väliajoin Klett-Summerson-merkkisellä valosähköisellä kolorimetrillä, jossa oli 500-570 millimikronin vihreä suodatin. Inkubointia jatkettiin niin kauan, kunnes lukema asteikolla (joka on verrannollinen optiseen tiheyteen) oli kohonnut 20-30 % lähtölukeman suhteen.

Kun asteikon lukema oli kohonnut toivotulla tavalla, tätä liuosta käsiteltiin 1 millilitralla Nystatiini-liuosta siten, että Nystatiinin pitoisuus liuoksessa oli noin 25 yksikköä/ml. Nystatiinilla käsiteltyä liuosta inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 90 minuuttia sekoittamatta, jonka ajan kuluttua 40 ml tätä liuos-** ta sentrifugoitiin, ja solut pestiin kahdesti 40 millilitralla ionitonta vettä. Tämän jälkeen pestyt solut laimennettiin siten, että maljaa kohden saadaan noin 100-150 pesäkettä. Pesäkkeet maljättiin mutanttien kasvatusalustalle, joka koostui vähimmäisalus-tasta, hiilen lähteestä (tavallisesti 1 % glukoosi), 5 yug biotii-nia, ja joka oli täydennetty kaikkien niiden metaboliittien suhteen, jotka metaboliitit syntyivät siinä biosynteesireitissä, josta mutaation aiheuttamaa puutteellisuutta etsitään.

Mutanttien kasvatusalustalle maljatut pesäkkeet toistomaljättiin sellaiselle alustalle, jota ei oltu täydennetty metaboliittien suhteen. Alkuperäisiä maljoja ja toistomaljauksella saatuja 4 15 - 94428 maljoja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa vähintään 48 tuntia.

Ne pesäkkeet, jotka kasvoivat alkuperäisellä maljalla (mutanttien kasvatusalustalla) mutta jotka eivät kasvaneet toistomaljoilla, valikoitiin ominaisuuksien lisäselvitystä varten.

Valikoidut auksotrofiset mutantit siirrettiin metaboliatuotteiden keräytymämaljoille, ja niitä inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa vähintään 48 tuntia, jotta saataisiin selville se, missä biosyntee-sireiteissä esiintyy mutaation aiheuttamia puutteita.

Keräytymämaljat valmistettiin liuottamalla kunkin seuraavan, 5 erilaisen aminohapon L-isomeeria pitoisuudeksi 10 mg/ml: 1 2 3 4 5 6 gly asn cys met gin 7 his leu ile vai lys 8 phe tyr trp thr pro 9 glu ser ala asp arg Täten malja 1 sisältää kutakin aminohappoa glysiini, histidiini, fenyylialaniini ja glutaamihappo pitoisuutena 10 mg/ml; malja 2 sisältää kutakin aminohappoa asparagiini, leusiini, tyrosiini ja seriini pitoisuutena 10 mg/ml, ja niin edelleen. Kymmenes malja valmistettiin liuottamalla 1 g Casaminohappoja 1 litraan steriiliä vettä.

Kustakin aminohappojen keräytymästä 1-10 otettiin 250 mikrolitraa, ja levitettiin maljoille, jotka sisälsivät vähimmäisalustaa sekä 1 % glukoosia, ja maljojen annettiin kuivua yön yli.

Tietyssä mutantissa esiintyvä, mutaation aiheuttama puutteellisuus voidaan määrittää tarkastelemalla mutantin kasvukäyttäyty-mistä eri keräytymämaljoilla. Täten kanta GS115, joka on histi-diinireittinsä suhteen puutteellinen mutantti, kasvoi ainoastaan maljoilla 1, 7 ja 10 muttei muilla keräytymämaljoilla, joita ei oltu täydennetty histidiinillä. Samoin kanta GS190, joka on arginiinireittinsä suhteen puutteellinen mutantti, kasvoi ainoas-: taan keräytymämaljoilla 5, 9 ja 10, muttei kasvanut muilla keräytymämal joilla, joita ei oltu täydennetty arginiinilla.

16 - 94428

Esimerkki II

Pichia pastoris-hiivan niiden mutanttien tunnistaminen, jotka mutantit ovat puutteellisia histidinoli-dehydrogenaasin aktii-visuuden suhteen_ A. Maljakoe

Esimerkissä I kuvatusti valmistettujen, histidiiniä tarvitsevien mutanttien ensimmäinen seulonta toteutettiin, jotta ne mutantit, jotka ovat puutteellisia his4C-kohdan suhteen (eli joilta puuttuu histidinoli-dehydrogenaasin aktiivisuus), tunnistettaisiin, Histidiinin suhteen auksotrofisten mutanttien perusmalja valmistettiin vähimmäisalustaa käyttäen, johon vähimmäisalustaan lisättiin 1 % glukoosia, vitamiiniseosta (1 ml alustan litraa kohden) sekä 0,2 % Casaminohappoja. Tätä perusmaljaa inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa vähintään 48 tuntia, jonka jälkeen tästä perusmaljas-ta valmistettiin neljä toistomaljaa: (1) Vähimmäisalusta "miinus" + 5 ^ug biotiinia + 1 % glukoosia + 0,2 % histidinolia (2) vähimmäisalusta + 5 ^ug biotiinia + 1 % glukoosia + 0,0002 % histidinolia (3) vähimmäisalusta "miinus" + 5 yug biotiinia + 1 % glukoosia + 0,2 % histidiiniä (4) vähimmäisalusta + 5 ^,ug biotiinia + 1 % glukoosia + 0,002 % histidiiniä.

• w Φ .

Näitä neljää maljaa inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa vähintään 48 tuntia. Lisäanalysointia varten valikoitiin ne pesäkkeet, jotka kasvoivat maljoilla (3) ja (4), mutta jotka eivät kasvaneet maljoilla (1) tai (2).

B. Entsymaattinen analyysi

Histidinoli-dehydrogenaasi-entsyymikokeen ensimmäisessä vaiheessa kasvatettiin erään kannan 200 millilitran suuruista viljelmää YPD-alustassa ravistellen, 30°C:n lämpötilassa, kunnes ODgQQ saavutti arvon 1,0. Tämän jälkeen tätä viljelmää sentrifugoitiin nopeudella 2000 g 5 minuutin ajan, ja solut suspendoitiin uudes-taan 200 millilitraan SD-alustaa, ja niitä inkuboitiin ravistellen 17 94428 30°C:n lämpötilassa. 6-12 tunnin kuluttua solut otettiin talteen tästä viljelmästä sentrifugoimalla, ja solukasaumaa säilytettiin -20°C:n lämpötilassa.

Seuraavassa vaiheessa tästä viljelmästä valmistettiin solu- uute. Noin 1 gramma (märkäpaino) soluja pestiin kahdesti 10 mil- lilitralla kylmää vettä (4°C), ja suspendoitiin uudestaan 0,83 millilitraan kylmää E-puskuria. Solujen hajottamiseksi näyte johdettiin Aminco French-merkkisen painekammion läpi, joka kammio oli varustettu halkaisijaltaan 9,5 mm:n suuruisella männällä, ja 2

Aminco French-puristinta käytettiin 1400 kp/cm :n paineella. Painekammiota pidettiin jäissä käyttöhetkeen saakka, ja tämä puristamistoimenpide suoritettiin kylmässä huoneessa (4°C). Solujen hajoamisen seuraamiseksi 10 mikrolitran suuruinen näyte lisättiin 10 millilitraan vettä, ja sen ODg^-arvo määritettiin, ja sitä verrattiin täsmälleen samalla tavalla valmistettuun vertailu-näytteeseen, jota ei oltu puristettu painekammion läpi. Mikäli käsitellyn näytteen optinen tiheys oli enemmän kuin 50 % vertailu-näytteen optisesta tiheydestä, niin näyte johdettiin toistamiseen hajottamistoimenpiteeseen. Tämän jälkeen solu-uute sentrifugoi-tiin Beckman SW50.1-roottorissa nopeudella 35 000 rpm 4°C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan solujätteiden poistamiseksi. Superna-tantti poistettiin, sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen 4°C:n lämpöistä glyserolia ja säilytettiin -20°C:n lämpötilassa.

• ·

Kokonaisproteiinien pitoisuus uutteessa arvioitiin yhtiön Bio-Rad Laboratories proteiinien määritysmenetelmällä. Tässä menetelmässä Bio-Rad-värireagenssin tiiviste laimennettiin neljällä tilavuudella ionitonta vettä, ja suodatettiin Whatman 3MM-suoda-tinpaperin läpi. Tämän jälkeen valmistettiin tunnetuista pitoisuuksista kalibrointikäyrä lisäämällä 3, 10, 30 ja 100 ^ug naudan seerumin albumiinia (BSA) 100 mikrolitrassa E-puskuria, joka sisälsi 50 % glyserolia, sarjaan lasiputkia, jotka olivat kooltaan 13 x 100 mm, ja joista kukin sisälsi 2,5 ml värireagenssia. Näytteet sekoitettiin, ja niitä pidettiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, ja niiden optinen tiheys määritettiin aallonpituudella 595 nm. Uutteen analysoimiseksi 3, 10 ja 30 ^ul näytettä laimen- 1β 94428 nettiin 100 mikrolitran tilavuuteen liuoksella, joka sisälsi E-puskuria ja 50 % glyserolia, ja niiden proteiinipitoisuus määritettiin edellä esitetysti. Kunkin uutenäytteen proteiinipitoisuus interpoloitiin tämän jälkeen BSA:lla valmistetun kalibroin-tikäyrän avulla.

Histidinoli-dehydrogenaasi-entsyymin aktiivisuuden määrityskokees-sa viimeisenä vaiheena oli histidinoli-dehydrogenaasin aktiivisuuden mittaaminen uutteesta siten, että histidinolin läsnäollessa tapahtuva NAD-yhdisteen pelkistyminen määritettiin spektrofoto-metrisesti. Kunkin määritettävän uutteen tapauksessa valmistettiin jäähauteessa reaktioseos, joka sisälsi 3 ml vettä, 0,5 ml 0,5 M glysiiniä (pH 9,4), 0,5 ml 5 mM MnClj sekä 0,5 ml 0,1 M NAD.

Tästä seoksesta lisättiin 2,25 millilitran suuruinen määrä kahteen lasiputkeen, jotka olivat kooltaan 13 x 100 mm, ja jotka olivat jäissä. Kumpaankin putkeen lisättiin näyte, joka sisälsi 50-500 yug proteiinia, ja näitä putkia inkuboitiin 25°C:n lämpötilassa. Reaktio käynnistettiin 5 minuutin kuluttua lisäämällä yhteen putkeen 0,25 ml 0,15 M histidinolia ja toiseen putkeen 0,25 ml vettä. Kummankin reaktioputken optinen tiheys määritettiin aallonpituudella 340 nm hetkillä 0,0; 0,5; 1,0 ja 2,0 tuntia. Ver-tailunäytteinä käytettiin Pichia pastoris-hiivasta NRRL Y-11430 ja Saccharomyces cerevisiae-hiivasta 5799-4D (NRRL Y-15859) valmistettuja uutteita, jotka määritettiin rinnan varsinaisten ·· näytteiden kanssa. Kunkin ajanhetken OD^Q-nettoarve saatiin vähentämällä histidinolin kanssa inkuboidun näytteen arvosta se arvo, joka saatiin ilman histidinolia inkuboidulla näytteellä.

Pichia pastoris-hiivan villityypin kannalla NRRL Y-11430, joka ei tarvitse aminohappotäydennystä kasvaakseen, OD^Q-arvoksi saatiin ί. noin 0,25, 0,38 ja 0,75 hetkillä 0,5, 1,0 ja 2,0 tuntia, vastaa vasti, kun taas vertailuna toimineella his4C-mutantilla (S. cerevisiae NRRL Y-15859) OD34Q-arvoksi saatiin olennaisesti nolla kaikilla ajanhetkillä. Yksi tällainen Pichia pastoris-hiivan mutantti, josta käytetään lyhennettä GS115, ja joka on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center tunnus-: numerolla NRRL Y-15851, tuotti samoin OD34Q-arvoksi olennaisesti 94428 19 nolla kaikilla ajanhetkillä. S. cerevisiae-hiivan mutantti-genotyypeistä käytetyn nimeämistavan mukaisesti GS115-kantaa kutsutaan his4C-mutanttikannaksi.

Esimerkki III

Pichia pastoris-hiivan transformointimenetelmä A. Solujen kasvattaminen 1. Pichia pastoris-hiivan GS115 (NRRL Y-15851) pesäke siirrostet-tiin noin 10 millilitraan YPD-alustaa, ja tätä viljelmää ravistellaan 30°C:n lämpötilassa 12-20 tunnin ajan.

2. Noin 12-20 tunnin kuluttua solut laimennetaan siten, että 0D600 on no^-n ja soluja pidetään logaritmisen kasvun vaiheessa YPD-a.1 ustalla 30°C:n lämpötilassa noin 6-8 tuntia.

3. Noin 6-8 tunnin kuluttua 100 millilitraan YPD-alustaa siirros-tetaan 0,5 ml siemenviljelmää, jonka ODg^Q-arvo on noin 0,1 (tai vastaava määrä). Viljelmää ravistellaan 30°C:n lämpötilassa noin 12-20 tunnin ajan.

4. Solut otetaan talteen, kun 0D600 on noin 0,2-0,3 (noin 16-20 tunnin kuluttua), sentrifugoimalla viljelmää nopeudella 1500 g 5 minuuttia.

B. Sferoplastien valmistaminen 1. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla steriiliä vettä. (Kaikki vaiheiden 1-5 sentrifugoinnit toteutetaan nopeudella 1500 g, ja niiden kesto on 5 minuuttia.) 2. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla juuri valmistettua SED-liuosta.

3. Solut pestään kahdesti 10 millilitralla 1 M sorbitolia.

j 4. Solut suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan SCE-puskuria.

5. Soluihin lisätään 5-10 ^ul entsyymin Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories) liuosta, jonka pitoisuus on 4 mg/ml.

Soluja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa noin 30-60 minuuttia.

• 20 - 94428

Koska sferoplastien valmistaminen on kriittinen vaihe transfor-mointimenetelmässä, niin sferoplastien muodostumista tulisi seurata seuraavalla tavalla: 100 mikrolitran suuruinen tilavuus soluja lisätään 900 mikrolitraan 5 % SDS-liuosta ja 900 mikrolit-raan 1 M sorbitolia ennen Zymolyaasin lisäämistä tai välittömästi tämän entsyymin lisäämisen jälkeen, sekä myöskin eri hetkinä inku-bointijakson aikana. Inkubointi pysäytetään sillä hetkellä, kun solut hajoavat SDS-liuoksessa, mutta eivät hajoa sorbitolissa (tavallisesti inkuboinnin kestettyä 30-60 minuuttia).

6. Sferoplastit pestään kahdesti 10 millilitralla steriiliä 1 M sorbitolia siten, että niitä sentrifugoidaan nopeudella 1000 g 5-10 minuutin ajan. (Sentrifugoinnin kesto ja nopeus voivat vaihdella; sentrifugoinnin tulee olla riittävää kasauttamaan sferoplastit, mutta se ei saa olla niin voimakasta, että sferoplastit hajoavat voiman vaikutuksesta.) 7. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla steriiliä CaS-liuosta.

8. Solut suspendoidaan yhteensä 0,6 millilitraan CaS-liuosta.

C. Transformointi 1. DNA-näytteet (tilavuudeltaan korkeintaan 20 ^ul) lisätään kooltaan 12 x 75 mm suuruisiin steriileihin polypropyleeniput-kiin. (DNA:n tulisi olla vedessä tai TE-puskurissa; jotta pienillä • · · DNA-määrillä transformaatioiden esiintymistiheydet olisivat mahdollisimman suuret, on suositeltavaa, että kuhunkin näytteeseen lisätään noin 1 ^ul sonikoidun E. coli-bakteerin DNA:ta pitoisuutena 5 mg/ml.) 2. Kuhunkin DNA-näytteeseen lisätään 100 ,ul sferoplasteja, ja • * : näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 20 minuuttia.

t . .

3. Kuhunkin näytteeseen lisätään 1 ml PEG-liuosta, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 15 minuuttia.

4. Näytteitä sentrifugoidaan nopeudella 1000 g 5-10 minuuttia, ja PEG-liuos dekantoidaan.

il ; tSitJUB 111« 1 i i 21 . 94428 5. Näytteet suspendoidaan uudestaan 150 mikrolitraan SOS-liuosta, ja niitä inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa.

6. Näytteisiin lisätään 850 mikrolitraa steriiliä 1 M sorbitolia, ja näytteistä maljataan tietty määrä jäljempänä esitetyllä tavalla.

D. Sferoplastien regenerointi 1. Regeneroinnissa käytettävän agaralustan valmistusohje: a. Agar-Sorbitoli - 9 g Bacto-agaria, 54,6 g sorbitolia, 240 ml vettä, autoklavointi.

b. 10X glukoosi - 20 g dekstroosia, 100 ml vettä, autoklavointi.

c. 10X SC - 6,75 g hiivan typpialustaa ilman aminohappoja, 100 ml vettä, autoklavointi. (Mitä tahansa toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa lisätään pitoisuudeksi 200 ^ug/ml ennen auto-klavointia.) d. 30 ml 10X glukoosia ja 30 ml 10X SC-komponenttia lisätään sulaan agar-sorbitoliliuokseen siten, että kokonaistilavuudeksi saadaan 300 ml. 0,6 ml pitoisuudeltaan 0,2 mg/ml olevaa biotiini-liuosta, sekä mitä tahansa muuta toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa lisätään pitoisuudeksi 20 yug/ml. Sulaa regene-rointiagaria pidetään 55-60°C:n lämpötilassa.

2. Transformointinäytteiden maljaaminen

Maljaa kohden kaadetaan 10 ml pohjan agarkerroksena toimivaa rege-:· nerointiagaria vähintään 30 minuuttia ennen transformaationäyt-teiden valmistumista. Regenerointiagaria laitetaan 10 ml suuruisia määriä putkiin, joita pidetään 45-50°C:een lämpöisessä hauteessa sinä aikana, kun transformaationäytteet ovat SOS-liuok-sessa. Regenerointiagaria sisältäviin putkiin lisätään tietyn . . suuruisia määriä edellä kuvatuista transformaationäytteistä, : . ja putkien sisältö kaadetaan maljojen pohjalla olevien agarkerros-ten päälle. Tietyn suuruinen määrä kustakin näytteestä lisätään 10 millilitraan sulaa regenerointiagaria, jota pidetään 45-50°C:n lämpötilassa, ja kaadetaan kuhunkin maljaan, jotka sisältävät 10 ml kiinteätä, pohjan agarkerroksena toimivaa regenerointiagaria.

22 - 94428 3. Sferoplastipreparaatin laadun määrittäminen

Yhdestä näytteestä otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan 100-kertai-sesti lisäämällä se 990 mikrolitraan 1 M sorbitolia. Tästä 100-kertaisesta laimennoksesta otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan toistamiseen 100-kertaisesti lisäämällä se toiseen 990 mikrolit-ran suuruiseen määrään 1 M sorbitolia. Kummastakin laimennoksesta otetaan 100 ^ul, ja ne levitetään YPD-agaralustaa sisältäville maljoille sferoplasteiksi muuttumatta jääneiden kokonaisten solujen pitoisuuden määrittämiseksi preparaatissa. 100 ^ul kummastakin laimennoksesta lisätään 10 millilitraan regenerointiagaria, joka on täydennetty 40 ^ug/ml histidiinillä, regeneroituvien sferoplastien kokonaismäärän määrittämiseksi. Hyvinä arvoina 7 transformointikokeessa pidetään yhteensä 1-3 x 10 regeneroituvaa 3 sferoplastia/ml, ja noin 1 x 10 kokonaista solua/ml.

4. Maljoja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa 3-5 vuorokautta. Esimerkki IV

g-galaktosidaasin tuottaminen Pichia pastoris-hiivassa g-galaktosidaasin tuottaminen transformoidussa Pichia pastoris-hiivassa osoittaa, että Pichia-sukuisia hiivoja voidaan käyttää isäntä/vektorijärjestelmänä polypeptidituotteita tuotettaessa. Pichia pastoris-kanta GS115 (NRRL Y-15851) transformoitiin plas-midilla pSA0H5 (katso kuva 6), ja sitä kasvatettiin vähimmäis-alustalla, joka sisälsi 0,5 yug/ml biotiinia sekä 0,1 % glukoosia, 30°C:n lämpötilassa, kunnes solujen kasvu saavutti stationääri-vaiheen. Tämän jälkeen solut siirrettiin vähimmäisalustalle, joka sisälsi 0,5 ^,ug/ml biotiinia ja 0,5 % metanolia ja niitä kasvatettiin noin 3-5 sukupolven ajan 30°C:n lämpötilassa. Kun soluja oli täten alustavasti kasvatettu metanolilla, ne siirret-·, tiin uudelle vähimmäisalustalle, joka sisälsi 0,5 yug/ml biotiinia ja 0,2 % metanolia hiilen lähteenä. Soluja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa noin 80 tuntia, ja näytteitä otettiin tietyin väliajoin alkoholioksidaasin ja β-galaktosidaasin tasojen määrittämiseksi.

il · «Mi li Mi I > * M 1 23 9 4 4 2 8

Ensimmäisestä näytteestä, joka otettiin välittömästi sen jälkeen, kun solut oli siirretty kasvatusalustalle, analysoitiin yli 500 yksikköä alkoholioksidaasia ja yli 1100 yksikköä β-galaktosidaa-sia. Käytetyt koemenetelmät on esitetty yksityiskohtaisesti liitteessä.

Nämä tulokset osoittavat, että Pichia pastoris-hiivaa voidaan käyttää isäntä/vektorijärjestelmänä geenituotteiden tuottamiseksi hiivassa. Isännän transformoimiseksi käytetty plasmidi pSA0H5 on Pichia-hiivan plasmidi, joka koodaa β-galaktosidaasin tuotantoa metanolin läsnäoloon reagoivan säätelevän alueen hallitsemana.

Tässä demonstraatiossa käytetty transformoitu kanta on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, ja se on yleisön saatavilla tunnusnumeron NRRL Y-15853 perusteella.

Esimerkit esitettiin ainoastaan havainnollistamaan tätä keksintöä, eikä niitä tulisi pitää tämän keksinnön tavoitteita tai liitteenä olevia patenttivaatimuksia millään tavalla rajoittavina. Kohtuullisten variaatioiden ja muunnelmien, jotka eivät poikkea tämän keksinnön tavoitteista eikä hengestä, katsotaan kuuluvan haettavan patenttisuojan puitteisiin.

Liite

Alkoholioksidaasikoe

Alkoholioksidaasin aktiivisuus määritettiin metanolin kanssa tapahtuvalla reaktiolla seuraavalla menetelmällä (väri-peroksidaasi-menetelmä). Väri-puskuriseos valmistettiin sekoittamalla 0,1 ml o-dianisidiinin liuosta (1 paino-% o-dianisidiinia vedessä) 12 mil-lilitraan ilmastettua 0,1 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,5). Koeseos valmistettiin 2,5 millilitrasta väri-puskuriliuosta, • 50 mikrolitrasta metanolia, 10 mikrolitrasta peroksidaasiliuosta (1 mg piparjuuren peroksidaasia, Sigma, Tyyppi II) sekä 25 mikro-litrasta alkoholi-oksidaasin liuosta. Koeseosta seisotettiin 25°C:n lämpötilassa 4x1x1 senttimetrin kyvetissä, ja värin aiheuttamaa absorbanssin kasvamista seurattiin aallonpituudella 460 nm 2-4 minuutin ajan. Entsyymiaktiivisuus laskettiin kaa-; vasta: 24 . 94428

Aktiivisuus (mikromoolia/min/ml tai entsyymiyksiköitä/ml) = - x 11,5 min ' missä 11,5 on kalibrointikäyrän perusteella saatu tekijä, joka kalibrointikäyrä on valmistettu vetyperoksidin H202 tunnettu3a määriä käyttäen, ja ΔΑ on absorbanssin muutos kokeen aikana.

β-galaktosidaasikoe β-galaktosidaasi määritettiin seuraavasti: A. Tarvittavat liuokset: Z-puskuri Lopullinen pitoisuus

Na2HP04 · 7H20 16,1 g 0,06 M

NaH2P04 5,5 g 0,04 M

KC1 0,75 g 0,01 M

MgS04· 7H20 0,246 g 0,001 M

2-merkaptoetanoli 2,7 ml 0,05 M

täytetään litraksi; pH-arvon tulisi olla 7. O-nitrofenyyli-g-D-galaktosidi (ONPG) 400 mg ONPG-yhdistettä (Sigma N-1127) liuotetaan 100 millilitraan tislattua vettä, jolloin saadaan pitoisuudeltaan 4 mg/ml oleva ONPG-liuos.

* B. Koemenetelmä: 1. Viljelyalustalta (hiivasoluja siten, että OD^qq on 0,1-0,5) otetaan näyte, se sentrifugoidaan ja solukasauma pestään vedellä.

2. Solukasaumaan lisätään 1 ml Z-puskuria, 30 ^ul CHCl3:ia sekä 30 yul 0,1 % SDS-liuosta, sekoitetaan ja inkuboidaan 5 minuuttia ] 30°C:n lämpötilassa.

4 3. Reaktio käynnistetään lisäämällä seokseen 0,2 ml ONPG-liuosta (4 mg/ml), sekoitetaan.

4. Reaktio pysäytetään lisäämällä 0,5 ml 1 M Na2C03~liuosta sopivilla hetkillä (kun A42q on alle 1) .

. 5. Supernatantin absorbanssi luetaan aallonpituudella 420 nm.

<1 ail.i dii, i i i UI

25 - 94428 C. β-galaktosidaasiyksiköiden laskeminen: 1 ϋ = 1 nanomooli ortonitrofenolia (ONP), joka muodostuu minuutissa 30°C:n lämpötilassa, pH-arvossa 7.

ONP-yhdisteen 1 nanomoolin absorbanssi aallonpituudella 420 nm (A420) on 0,0045, kun valonsäteen kulkema matka on 1 cm; näin ollen absorbanssin arvo 1 aallonpituudella 420 nm vastaa 222 nanomoolia ONP-yhöistettä/ml, tai 378 nanomoolia ONP/1,7 ml, sillä analysoitavan supernatantin kokonaistilavuus on 1,7 ml.

Näin ollen yksikkömäärä lasketaan kaavasta 0 = x 378 t(min) « *♦

Claims (18)

26 - 94428

1. Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115).

2. Menetelmä Pichia pastoris -hiivakantaisännän, joka on puutteellinen histidiini-biosynteesireittinsä suhteen, transformoimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä: a) isäntänä toimiva hiivakanta saatetaan kosketuksiin sulf-hydryyliryhmiä pelkistävän aineen kanssa; b) vaiheessa a) tuotteena saadut solut saatetaan kosketuksiin soluseinämiä hajottavan reagenssin kanssa olosuhteissa, jotka sopivat sferoplastien muodostumiselle ja säilymiselle; c) vaiheessa b) kehitetyt sferoplastit saatetaan kosketuksiin yhdistelmä-DNA-materiaalin kanssa transformaatiolle soveltuvissa olosuhteissa; ja d) vaiheen c) tuotetta käsitellään soluseinämiä regeneroivissa olosuhteissa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sulfhydryyliryhmiä pelkistävä aine on ditiotreitoli.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluseinämiä hajottava reagenssi on entsyymi Zymo-lyase™.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-tä, että sferoplastien muodostumiseen soveltuvat olosuhteet käsittävät: i) 10-100 μg soluseinämiä hajottavaa reagenssia solususpen-sion 10 millilitraa kohden; joka solususpensio on valmistettu suspendoimalla eksponentiaalisesti kasvavia soluja sorbitoli-sitraatti-EDTA-puskuriin, pH 5,8 (SCE-puskuri); i. ii) seosta seisotetaan 25-35°C:n lämpötilassa; iii) 15-60 minuutin ajan.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 2-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntänä toimiva hiivakanta on puutteellinen histidiini-biosynteesireittinsä suhteen. I· I . . UtUJLltl 1 1 J 4U 27 94428

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että histidiini-biosynteesireitti on puutteellinen sen geenin suhteen, joka koodaa histidinoli-dehydrogenaasia.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntänä toimiva hiivakanta on Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115).

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut olosuhteet kosketuksiin saatettaessa käsittävät: i) 2-10 tilavuutta CaCl2-polyetyleeniglykoliliuosta sfero-plasteja sisältävän suspension tilavuutta kohden; ii) seisottamisen 20-30°C:n lämpötilassa; iii) 5-30 minuutin ajan.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluseinämien regeneroinnissa vallitsevat olosuhteet käsittävät : i) transformoitujen sferoplastien lisäämisen regenerointi- agarille, joka regenerointiagar käsittää: : noin 1 M sorbitolia • « noin 0,1 M dekstroosia noin 7 g/1 hiivan typpialustaa, sekä noin 3 % agaria; ii) seisottamisen 25-35°C:n lämpötilassa; iii) noin 3-10 vuorokautta. • l f

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu yhdistelmä-DNA-materiaali käsittää toiminnallisen geenin, joka täydentää puutteen histidiini-biosynteesirei-tissä, jonka suhteen isäntänä toimiva hiivakanta on puutteellinen. « f

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-materiaali käsittää histidinoli-dehydrogenaasia koodaavan geenin. 94428

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu yhdistelmä-DNA-materiaali on plasmidi pYA2 (NRRL B-15874).

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-materiaali on piirustusten kuvan 3 mukainen plasmidi pYA4.

15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-materiaali on plasmidi pYJ30 (NRRL B- 15890) .

16. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-materiaali on plasmidi pYJ32 (NRRL B- 15891) .

17. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen vaiheet, joissa: e) vaiheessa d) saatuja soluja kasvatetaan selektiivisissä kasvatusolosuhteissa. • ·

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen vaiheen, jossa: e) vaiheessa d) saatuja soluja kasvatetaan selektiivisissä kasvatusolosuhteissa; mainittujen selektiivisten kasvatusolosuhteiden käsittäessä solujen kasvattamisen hiivan vähimmäis-alustalla, johon ei ole lisätty histidiiniä. 29 - 94428