DE60218840T2 - Nicht legierende Core-Shell-Nanopartikel - Google Patents

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Description

  • Gegenstand der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Kern/Schale-Nanopartikel, Materialien auf Basis von Kern/Schale-Nanopartikeln, Kits, die diese Kern/Schale-Nanopartikel enthalten, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Kern/Schale-Nanopartikel zur Detektion von Zielmolekülen, einschließlich von Nukleinsäuren, Peptiden und Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung DNA-modifizierte Kern/Schale-Nanopartikel und ihre Verwendung zur Detektion von Zielmolekülen, wie Nukleinsäuren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • 1996 wurde über ein Verfahren zur Verwendung von Biomolekülen, wie DNA, berichtet und über ihre Eigenschaften zur molekularen Erkennung, um den Aufbau von nanopartikulären Bausteinen, die mit komplementären Elementen zur Erkennung modifiziert sind, zu funktionellen Materialien zu steuern1. Diese Materialien fanden breite Anwendung bei der Entwicklung von hochempfindlichen und selektiven Diagnoseverfahren für DNA2. Dieses Materialsyntheseverfahren wurde auf einen breiten Bereich von Biomolekülen, einschließlich Peptiden und Proteinen3, und auf eine bescheidene Sammlung von Nanopartikeln, einschließlich Gold und Halbleiter-Quantenpunkte4-9 ausgedehnt. In jedem Fall müssen, wenn eine neue Nanopartikelzusammensetzung entwickelt wird, neue Verfahren zur Modifizierung entwickelt werden, um die Biomoleküle auf der Oberfläche der gewünschten Partikel zu immobilisieren. Dieser Ansatz fand intensive Anwendung, jedoch mit beschränktem Erfolg. Die Verfahren zur Modifizierung von Gold-Nanopartikeln wurden jetzt optimiert und für einen breiten Bereich von Partikelgrößen und Oberflächenzusammensetzungen, einschließlich Kügelchen und Stäbchen, verallgemeinert1,2,4,10. Gold-Partikel lassen sich besonders leicht modifizieren, da sie häufig mit einer schwach bindenden Schicht geladener Liganden (z.B. Citrate) stabilisiert sind, die durch Moleküle mit chemischen Funktionalitäten, die sich stärker (z.B. Thiole, Amine und Disulfide) an die Oberfläche binden als diese Liganden, ersetzt werden können. Die CdSe und CdS Quantenpunkte erwiesen sich als schwieriger zu modifizieren, da sie eine Schicht eines oberflächenaktiven Mittels besitzen, die sehr fest an ihre Oberflächen gebunden und folglich schwer zu ersetzen ist5. Bislang wurden keine erfolgreichen Wege zur Erzeugung von stabilen Oligonukleotide-Konjugaten mit Silber-Nanopartikeln entwickelt, hauptsächlich deshalb, weil sie unter den Bedingungen, bei der DNA-Hybridisierung bewirkt wird, zur chemischen Zersetzung neigen. Ein größerer Fortschritt wäre es, ein Verfahren zu entwerfen, mit dem Partikel mit den physikalischen Eigenschaften einer gewählten Nanopartikel-Zusammensetzung, jedoch mit der Oberflächenchemie von Gold, konstruiert werden können. Hierin wird ein Niedertemperaturverfahren zur Erzeugung von Kern/Schale-Partikeln bereitgestellt, die unter Verwendung der bewährten Herstellungsverfahren reiner Gold-Partikel-Oligonukleotid-Konjugate2d aus einem Silberkern und einer nicht-legierenden Gold-Schale bestehen, die leicht mit Oligonukleotiden funktionalisiert werden kann. Darüber hinaus kann die neue Nanopartikel-Zusammensetzung verwendet werden, um ein colorimetrisches Detektionssystem zugänglich zu machen, das sich vom reinen Gold-System unterscheidet2a,2d.
  • Die Abscheidung diskreter Gold-Partikel auf TiO2 ist in Colloids and Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects, 131, Nr. 1-3, 1998, Seiten 271-280, offenbart. Mikrokristalline Gold-Partikel bildeten sich auf der Oberfläche der TiO2-Kern-Partikel, aber es bildete sich eigentlich keine Schale auf den TiO2-Kernen.
  • Radiation Physics and Chemistry, 54, Nr. 5, 1999, Seiten 463-473, betrifft die radiolytische Erzeugung von zweilagigen Pt/Au/Pt-Kern-Schale-Clustern, indem Gold- und Platinkolloide kurz vor der Bestrahlung des Gemisches mit hohen und geringen Bestrahlungsdosen gemischt wurden.
  • WO 01/06257 A betrifft Metall-Nanoschalen für biosensorische Anwendungen mit nicht-leitenden Kernen.
  • WO 98/04740 A offenbart Gold-Nanopartikel mit daran gebundenen Oligonukleotiden und ihre Verwendung zur Detektion der Anwesenheit einer Nukleinsäure.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Komposit-Kern/Schale-Nanopartikel, Zusammensetzungen und Kits, die diese Kern/Schale-Nanopartikel enthalten, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Komposit-Kern/Schale-Nanopartikel, insbesondere Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel, zur Detektion von Zielmolekülen wie Nukleinsäuren, Proteinen und dergleichen. Diese Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel wurden durch Reduktion von HAuCl4 mit NaBH4 in Gegenwart von Ag-Nanopartikel-„Templaten" hergestellt und durch UV-VIS-Spektroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedispersive Röntgenmikroanalyse (EDX) charakterisiert. Signifikanterweise legieren diese Partikel nicht, wodurch sich Strukturen mit den optischen Eigenschaften von Silber und der Oberflächenchemie und der hohen Stabilität von Au ergeben. Experimentelle und theoretische Daten erhärten die Strukturcharakterisierung dieser neuen Materialien als Silber-Kerne (~12 nm im Durchmesser), beschichtet mit einer annähernd einatomigen Monoschicht aus Gold (~3Å). Die Kern/Schale-Nanopartikel können weiterhin mit Alkanthiololigonukleotiden modifiziert werden, wobei sich Strukturen bilden, die eine reversible Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden durchlaufen, um so ausgedehnte Nanopartikel-Netzwerkstrukturen zu bilden. Beim Tüpfeln von aliquoten Mengen einer Lösung, die Oligonukleotid-modifizierte Nanopartikel ohne und mit DNA-Ziel enthält, auf eine Umkehrphasen-Aluminiumplatte kann ein deutlicher colorimetrischer Übergang von gelb nach dunkelbraun mit dem bloßem Auge beobachtet werden. Die optischen Eigenschaften der dispergierten und aggregierten Kern/Schale-Partikel bilden einen neuen colorimetrischen Kanal für die Detektion von DNA auf der Grundlage von Nanopartikeln.
  • Dementsprechend ist es ein Ziel der Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Herstellung von Kern/Schale-Nanopartikel mit den optischen, und vielen der physikalischen, Eigenschaften von Silber, jedoch der Stabilität von Gold bereitzustellen. Die Oberflächen dieser Nanopartikel kann mit einer Vielzahl von Einheiten modifiziert werden, wie beispielsweise mit natürlichen und synthetischen Polymeren, mit Molekülen, die zur selektiven Molekülerkennung fähig sind, einschließlich, jedoch nicht darauf limitiert, der Nukleotide, Nukleoside, Poly- oder Oligonukleotide, Proteine, Peptide, Kohlehydrate, Zucker und Haptene, wodurch die Nanopartikel mit nutzbaren Eigenschaften zur Bioerkennung ausgestattet werden.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines allgemeinen Verfahrens zur Herstellung von Kern/Schale-Partikeln mit physikalischen Eigenschaften nach Maß durch die Wahl des Kerns, z.B. Fe3O4, CdS, CdSe, Ag-Au-Legierung, Co, Cu, oder Pt, jedoch der Oberflächenchemie und Stabilität von nativen und Oligonukleotid-modifizierten, reinen Gold-Partikeln.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Verfahren zur Detektion von Molekülen bereitzustellen, die zur selektiven Molekülerkennung in der Lage sind, umfassend die Verwendung von Kern/Schale-Nanopartikelsonden. Diese Verfahren umfassen das In-Kontakt-Bringen der Kern/Schale-Nanopartikelsonden mit einem oder mit einer Mehrzahl von Zielmolekülen unter Bedingungen, die die selektive Molekülerkennung ermöglichen, und die Detektion einer optischen Änderung. Die physikalischen Eigenschaften von bestimmten Kern/Schale-Nanopartikelsonden kann vielfältige zusätzliche Schritte in diesen Verfahren ermöglichen, wie beispielsweise Induzierung ihrer Migration durch Anlegen elektrischer oder magnetischer Felder.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Nanomaterialien auf der Basis von Kern/Schale-Nanopartikeln der Erfindung bereitzustellen.
  • Diese und weitere Ziele der Erfindung werden im Lichte der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
  • 1 stellt dar (A) eine TEM-Aufnahme von Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln; (B) EDX-Spektren von Silber-Kern-Nanopartikeln (gepunktete Linie) und von Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln (durchgezogene Linie), wobei L und M Elektronenübergänge in die L- und M-Schale der Atome aus höheren Zuständen kennzeichnen; (C) UV-VIS-Spektren eines Silber-Kerns (gepunktete Linie) und einer Ag/Gold-Kern/Schale (durchgezogene Linie), wobei das Nebenbild das berechnete Extinktionsspektrum der Silber-Nanopartikel (gepunktete Linie) und der Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel (durchgezogene Linie) zeigt; (D) die thermische Denaturierungskurve der Aggregate, die aus hybridisierten Oligonukleotid-modifizierten Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln in einer Pufferlösung (0,3 M NaCl und 10 mM Phosphat-Puffer, pH = 7) gebildet wurden. Das Nebenbild zeigt die UV-VIS-Spektren von dispergierten Oligonukleotid-modifizierten Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln (durchgezogene Linie) und aggregierten Oligonukleotid-modifizierten Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln (gepunktete Linie), die über Hybridisierung gebildet wurden. Die Basensequenzen sind in 2A angegeben.
  • 2 stellt (A) Mercaptoalkyl-Oligonukleotid-modifizierte Ag/Gold-Kern/Schale-Partikel und Polynukleotid-Ziele dar. CS: Kern/Schale; Alkyl: Propyl (links) und Hexyl (rechts); DNA-Spottest unter Verwendung von: (B) 12,4 nm Ag/Gold-Nanopartikelsonden und (C) 13 nm Gold-Nanopartikelsonden: (I) ohne Ziel, (II) mit Ziel bei Raumtemperatur, (III) mit Ziel bei 58°C, einer Temperatur oberhalb der Tm (53°C) der hybridisierten DNA.
  • 3 stellt die relativen Stabilitäten von Ag, einer Ag/Au-Legierung und eines Ag/Au-Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugats bei verschiedenen Salzkonzentrationen dar.
  • 4 stellt die UV-VIS-Spektren eines Pt-Kerns (gepunktete Linie) und von Pt/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln (durchgezogene Linie) dar.
  • 5 stellt die UV-VIS-Spektren des Gold-Wachstums auf der Oberfläche von Fe3O4-Nanopartikeln bei 0, 0,3 nm, 0,6 nm und 0,9 nm Dicke dar.
  • 6 stellt den Kern/Schale-Ansatz zur Herstellung magnetischer Gold-Nanopartikel dar.
  • 7 stellt das Verhalten von Fe3O4/Gold-Kern/Schale-Partikeln als superparamagnetische Partikel in Gegenwart eines angelegten magnetischen Feldes dar. In Gegenwart eines magnetischen Feldes erscheint eine Lösung, die die magnetischen Gold-Nanopartikel enthält, rot. Wenn eine magnetische Kraft über einen Zeitraum von 2 h angewendet wird, wird die Lösung farblos und die Nanopartikel migrieren zur magnetischen Kraft.
  • 8: (A) und (B) magnetische Eigenschaften DNA-funktionalisierter Magneto-Gold-Nanopartikel; (C) TEM-Bild DNA-funktionalisierter Magneto-Gold-Nanopartikel (mittlerer Durchmesser = 18 nm, Dicke der Schale = 2 nm, (Kern-Durchmesser = 14 nm)); (D) Schmelzkurve für Magno-Gold-Nanopartikelsonden verbunden mit Ziel-DNA, Sonde a = 3'HS-A20-CTC CCT AAT AAT-5', Sonde b = 3'TTA TAA CTA TTC CTA-A20-SH5', Ziel a'b' = 5'-GAG GGA TTA TTG TTA...AAT ATT GAT AAG GAT-3'.
  • 9 stellt das TEM-Bild von Co-Nanopartikeln dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Kern/Schale-Nanopartikel bereit, die einen Nanopartikel-Kern und eine Gold-Schale umfassen. Das Kernmaterial kann jedes dem Fachmann bekannte Nanopartikel umfassen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Metall, Halbleiter und magnetische Nanopartikel. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kernmaterial Metall oder magnetische Nanopartikel, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Ag, Pt, Fe, Co, Ni, FePt, FeAu, Fe3O4, Co3O4 und CdSe (oder CdS). Verfahren zur Herstellung derartiger Nanopartikel sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe beispielsweise, z.B. Schmid, G. (Hrsg.), Clusters and Colloids (VCH, Weinheim, 1994); Hayat, M.A. (Hrsg.), Colloidal Gold: Principals, Methods, and Applications (Academic Press, San Diego, 1991); Massart, R., IEEE Transactions On Magnetics, 17, 1247 (1981); Ahmadi, T.S. et al., Science, 272, 1924 (1996); Henglein, A. et al., J. Phys. Chem., 99, 14129 (1995); Curtis A.C., et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27, 1530 (1988).
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung nicht-legierender Gold-Kern/Schale-Nanopartikel und Produkte, die daraus hergestellt sind, bereit. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst Bereitstellen eines inneren Nanopartikel-Kerns, gleichzeitiges Behandeln des Kerns mit einer ein Goldsalz umfassenden Lösung und einer ein Reduktionsmittel umfassenden Lösung und Isolieren der Kern/Schale-Nanopartikel. Das Verfahren stellt erstmalig eine nicht-legierende Gold-Schale bereit, die einen Nanopartikel-Kern umgibt. Diese nicht-legierenden Gold-Kern/Schale-Nanopartikel zeigen überraschende hervorragende spektroskopische Eigenschaften, die in herkömmlichen Gold-Kern/Schale-Nanopartikel nicht gefunden werden, und können mit Molekülen wie Nukleinsäuren und Rezeptoren funktionalisiert werden zur Erzeugung von Nanopartikel-Konjugaten, die sich zum Targeting und zur Detektion von Ziel-Analyten wie Nukleinsäuren, Antigenen, Proteinen, Kohlenhydraten und anderen Substanzen verwenden lassen.
  • Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Verfahren bei jeder Temperatur durchgeführt werden, die sich zur Herstellung einer nicht-legierenden, den Kern umgebenden Gold-Schale eignet. Im Allgemeinen hängt die Temperatur von der Wahl des Reaktionslösungsmittels ab, das bei der Erzeugung der Gold-Schale verwendet wird. Geeignete, jedoch nicht limitierende Beispiele des Reaktionslösungsmittels schließen Wasser, Ethanol, Methanol, Trinatriumcitratlösung, Ölsäure, Trioctylphosphinoxid und Trioctylphosphin ein. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist die Trinatriumcitratlösung (0,3 mM) bevorzugt.
  • Bei der praktischen Durchführung der Erfindung liegt die Temperatur im Allgemeinen im Bereich von etwa 0°C bis etwa 45°C in Wasser oder wässrigen Reaktionslösungen. Bei organischen Lösemitteln liegt die Temperatur im Allgemeinen im Bereich von etwa 130°C bis etwa 180°C, wenn Ölsäure und Trioctylphosphinoxid verwendet werden.
  • Das Gold-Salz kann jedes geeignete Gold-Salz umfassen, einschließlich, jedoch nicht daruf beschränkt, HAuCl4, NaAuCl4, KAuCl4 oder KAu(CN)2. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist HAuCl4 das bevorzugte Gold-Salz.
  • Das Reduktionsmittel kann jedes geeignete Reduktionsmittel umfassen, das in der Lage ist, die Wertigkeit des Golds, das die Gold-Salzlösung umfasst, zu reduzieren, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, NaBH4, Ascorbinsäure, NH2OH und N2H4. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist NaBH4 das bevorzugte Reduktionsmittel.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate bereit, die einen Nanopartikel-Kern, eine Gold-Schale, die das Nanopartikel umgibt, und ein Oligonukleotid umfassen, das an die Goldoberfläche des Kern/Schale-Nanopartikels gebunden ist. Zum Anbringen der Oligonukleotide an die Gold-Oberfläche kann jedes geeignetes Verfahren verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Anbringen der Oligonukleotide an eine Gold-Oberfläche basiert auf einem Alterungsprozess, wie er in den U.S. Patentanmeldungen mit den Nummern 09/344,667, eingereicht am 25. Juni 1999; 09/603,830, eingereicht am 26. Juni 2000; 09/760,500, eingereicht am 12. Januar 2001; 09/820,279, eingereicht am 28. März 2001; 09/927,777, eingereicht am 10. August 2001, und in den internationalen Anmeldungen mit den Nummern PCT/US97/12783, eingereicht am 21. Juli 1997; PCT/US00/17507, eingereicht am 26. Juni 2000; PCT/US01/01190, eingereicht am 12. Januar 2001, und PCT/US01/10071, eingereicht am 28. März 2001, beschrieben ist. Der Alterungsprozess stellt Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate mit unerwarteter verbesserter Stabilität und Selektivität bereit. Das Verfahren umfasst Bereitstellen von Oligonukleotiden mit einer vorzugsweise kovalent daran gebundenen Einheit, die eine funktionelle Gruppe umfasst, die an die Nanopartikel binden können. Die Einheiten und funktionellen Gruppen sind jene, die eine Bindung (z.B. durch Chemisorption oder kovalente Bindung) der Oligonukleotide an die Nanopartikel ermöglichen. Zum Beispiel können Oligonukleotide mit einem Alkanthiol, einem Alkandisulfid oder einem zyklischen Disfulfid, die kovalent an ihre 5'- oder 3'-Enden gebunden sind, zur Bindung der Oligonukleotide an eine Vielzahl von Nanopartikeln, einschließlich Gold-Nanopartikeln, verwendet werden.
  • Die Oligonukleotide werden in Wasser mit den Nanopartikeln in Kontakt gebracht für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um zumindest einigen der Oligonukleotide die Anbindung an die Nanopartikel mittels der funktionellen Gruppen zu ermöglichen. Diese Zeitspannen können empirisch ermittelt werden. Zum Beispiel wurde gefunden, dass eine Zeitspanne von etwa 12-24 Stunden gute Ergebnisse ergibt. Andere geeignete Bedingungen zur Bindung der Oligonukleotide können auch empirisch bestimmt werden. Zum Beispiel ergibt eine Konzentration von etwa 10-20 nM an Nanopartikeln und eine Inkubation bei Raumtemperatur gute Ergebnisse.
  • Als nächstes wird mindestens ein Salz in das Wasser gegeben, um eine Salzlösung zu bilden. Das Salz kann jedes geeignete wasserlösliche Salz sein. Beispielsweise kann das Salz Natriumchlorid, Lithiumchlorid, Kaliumchlorid, Cäsiumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat, Lithiumnitrat, Cäsiumnitrat, Natriumacetat, Lithiumacetat, Cäsiumacetat, Ammoniumacetat, eine Kombination von zwei oder mehreren dieser Salze oder eines dieser Salze in einem Phosphatpuffer sein. Vorzugsweise wird das Salz als konzentrierte Lösung zugegeben, es kann aber auch als Feststoff zugegeben werden. Das Salz kann dem Wasser vollständig auf einmal oder das Salz kann schrittweise über die Zeit zugegeben werden. Bei „schrittweise über die Zeit" ist gemeint, dass das Salz in mindestens zwei Portionen in Intervallen, die zeitlich auseinander liegen, zugegeben wird. Geeignete Zeitintervalle können empirisch ermittelt werden.
  • Die Ionenstärke der Salzlösung muss ausreichend sein, um mindestens teilweise die elektrostatische Abstoßung der Oligonukleotide voneinander und entweder die elektrostatische Anziehung der negativ geladenen Oligonukleotide zu den positiv geladenen Nanopartikeln oder die elektrostatische Abstoßung der negativ geladenen Oligonukleotide von den negativ geladenen Nanopartikeln zu überwinden. Es wurde gefunden, dass die schrittweise Reduzierung der elektrostatischen Anziehung und Abstoßung durch die schrittweise Salzzugabe über die Zeit die höchste Oberflächendichte der Oligonukleotide auf den Nanopartikeln ergibt. Geeignete Ionenstärken können für jedes Salz oder Salzkombination empirisch ermittelt werden. Es wurde gefunden, dass eine Endkonzentration von Natriumchlorid von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M in Phosphatpuffer, vorzugsweise mit einer über die Zeit schrittweisen Erhöhung der Natriumchloridkonzentration, gute Ergebnisse liefert.
  • Nach der Salzzugabe werden die Oligonukleotide und die Nanopartikel in der Salzlösung über einen weiteren Zeitraum, der ausreichend ist, um die Anbindung ausreichend weiterer Oligonukleotide an die Nanopartikel zu ermöglichen, inkubiert, um die stabilen Nanopartikel-Oligonukleotide-Konjugate zu bilden. Wie nachstehend detailliert beschrieben werden wird, wurde gefunden, dass eine erhöhte Oberflächendichte der Oligonukleotide auf den Nanopartikeln die Konjugate stabilisiert. Die Zeit dieser Inkubation kann empirisch bestimmt werden. Es wurde gefunden, dass eine Gesamtinkubationszeit von etwa 24-48, vorzugsweise 40 Stunden, gute Ergebnisse liefert (das ist die Gesamtzeit der Inkubation; wie oben erwähnt, kann die Salzkonzentration schrittweise über diese Gesamtzeit erhöht werden). Diese zweite Inkubationsperiode in der Salzlösung wird hier als der „Alterungs"-Schritt bezeichnet. Andere geeignete Bedingungen für diesen „Alterungs"-Schritt können ebenfalls empirisch bestimmt werden. Beispielsweise ergibt eine Inkubation bei Raumtemperatur und pH 7,0 gute Ergebnisse.
  • Es wurde gefunden, dass die Konjugate, die unter Verwendung des „Alterungs"-Schrittes hergestellt werden, beträchtlich stabiler sind als jene, die ohne den „Alterungs"-Schritt hergestellt werden. Wie oben erwähnt, ist diese erhöhte Stabilität auf die erhöhte Oligonukleotiddichte auf den Oberflächen der Nanopartikel zurückzuführen, die über den „Alterungs"-Schritt erzielt wird. Die Oberflächendichte, die durch den „Alterungs"-Schritt erreicht wird, hängt von der Größe und der Art der Nanopartikel und der Länge, der Sequenz und der Konzentration der Oligonukleotide ab. Eine Oberflächendichte, die adäquat ist, um die Nanopartikel stabil zu machen, und die Bedingungen, die notwendig sind, um diese für eine gewünschte Kombination aus Nanopartikeln und Oligonukleotiden zu erhalten, können empirisch ermittelt werden. Im Allgemeinen ist eine Oberflächendichte von mindestens 10 picomol/cm2 ausreichend, um stabile Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate zur Verfügung zu stellen. Vorzugsweise beträgt die Oberflächendichte mindestens 15 picomol/cm2. Da die Fähigkeit der Oligonukleotide dieser Konjugate zur Hybridisierung mit Nukleinsäuren und Oligonukleotid-Zielen herabgesetzt werden kann, wenn die Oberflächendichte zu groß ist, beträgt die Oberflächendichte vorzugsweise nicht mehr als etwa 35-40 picomol/cm2.
  • Wie hier verwendet bedeutet „stabil", dass über einen Zeitraum von mindestens sechs Monaten nach Herstellung der Konjugate eine Mehrheit der Oligonukleotide an die Nanopartikel gebunden bleibt und die Oligonukleotide mit Nukleinsäure und Oligonukleotid-Zielen unter Standardbedingungen, wie man sie in den Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren und Verfahren zur Nanofabrikation antrifft, hybridisieren können.
  • In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Detektion von Ziel-Analyten, wie Nukleinsäuren, bereit, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate der gegenwärtigen Erfindung mit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen, die die Hybridisierung zwischen mindestens einem Teil der an das Nanopartikel gebundenen Oligonukleotide und mindestens einem Teil der Ziel-Nukleinsäuresequenz ermöglicht. Weiterhin können Proteinrezeptoren und andere spezifische Teile eines Bindungspaars mit Oligonukleotiden funktionalisiert und auf den Oligonukleotid-modifizierten Nanopartikeln immobilisiert werden, um so eine neue Klasse von Hybridpartikeln (Nanopartikel-Rezeptor-Konjugaten) zu bilden, die die hohe Stabilität der Oligonukleotid-modifizierten Partikel, jedoch mit molekularen Erkennungseigenschaften, die durch den Proteinrezeptor und nicht durch die DNA vorgegeben sind, aufweisen. Alternativ kann man ein Protein, das mehrere Rezeptorbindungsstellen aufweist, mit Rezeptor-modifizierten Oligonukleotiden funktionalisieren, so dass der Proteinrezeptorkomplex anstelle der anorganischen Nanopartikel in den oben diskutierten Original-Nanomaterialbauteilschema als einer der Bausteine verwendet werden kann. Die Verwendung dieser neuen Nanopartikel-Rezeptor-Konjugate in der Methodik zur Detektion von Analyten wurde auf vielfältige Art und Weise beurteilt, einschließlich der Identifizierung von Zielen und dem Screenen von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Geeignete Hybridisierungsbedingungen zur Detektion von Nukleinsäuren und Herstellverfahren von Nanopartikel-Rezeptor-Konjugaten sind in den US-Anmeldungen Nrn. 09/344,667, eingereicht am 25. Juni 1999; 09/603,830, eingereicht am 26. Juni 2000; 09/760,500, eingereicht am 12. Jan. 2001; 09/820,279, eingereicht am 28. März 2001; 09/927,777, eingereicht am 10. Aug. 2001, und in den internationalen Anmeldungen mit den Nummern PCT/US97/12783, eingereicht am 21. Juli 1997; PCT/US00/17507, eingereicht am 26. Juni 2000; PCT/US01/01190, eingereicht am 12. Jan. 2001; PCT/US01/10071, eingereicht am 28. März 2001, beschrieben, deren Offenbarungen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme enthalten sind. Sobald ein Kern/Schale-Nanopartikel-Konjugat der Erfindung an ein Zielmolekül gebunden wird, kann eine Änderung der optischen Charakteristik der Kern/Schale-Nanopartikel-Konjugate leicht detektiert werden. In einer anderen Ausführungsform wird der Detektionsschritt in Gegenwart eines angelegten Magnetfeldes durchgeführt, das die Hybridisierung oder die Bindung des Nanopartikel-Konjugats mit dem Zielmolekül, wie einer Nukleinsäure, weiter verstärkt.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Nanofabrikation auf Grundlage der erfindungsgemäßen Kern/Schale-Nanopartikel-Konjugate bereit. Nanostrukturen und Verfahren zur Herstellung der Materialien aus Nanopartikeln wurden in den US-Anmeldungen Nr. 09/344,667, eingereicht am 25. Juni 1999; Nr. 09/603,830, eingereicht am 26. Juni 2000; 09/760,500, eingereicht am 12. Jan. 2001; 09/820,279, eingereicht am 28. März 2001; 09/927,777, eingereicht am 10. Aug. 2001, und in den internationalen Anmeldungen mit den Nummern PCT/US97/12783, eingereicht am 21. Juli 1997; PCT/US00/17507, eingereicht am 26. Juni 2000; PCT/US01/01190, eingereicht am 12. Januar 2001, und PCT/US01/10071, eingereicht am 28. März 2001, beschrieben. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen mindestens eines Typus eines verbindenden Oligonukleotids mit einer ausgewählten Sequenz, wobei die Sequenz eines jeden Typus eines verbindenden Oligonukleotids mindestens zwei Teile aufweist. Weiterhin umfasst das Verfahren das Bereitstellen eines oder mehrerer Typen von Kern/Schale-Nanopartikeln mit daran gebundenen Oligonukleotiden, wobei die Oligonukleotide eines jeden Nanopartikel-Typus eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Teil der Sequenz des verbindenden Oligonukleotids ist. Die verbindenden Oligonukleotide und die Nanopartikel werden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die effektiv sind, eine Hybridisierung der Oligonukleotide auf den Nanopartikeln zu den verbindenden Oligonukleotiden zu ermöglichen, so dass die gewünschten Nanomaterialien oder Nanostrukturen gebildet werden.
  • Die Erfindung stellt ein weiteres Verfahren zur Nanofabrikation bereit. Dieses Verfahren umfasst das Bereitstellen von mindestens zwei Typen der erfindungsgemäßen Kern/Schale-Nanopartikel mit daran gebundenen Oligonukleotiden. Die Oligonukleotide auf dem ersten Nanopartikel-Typus besitzen eine Sequenz, die komplementär zu jener der Oligonukleotide auf dem zweiten Typus der Nanopartikel ist. Die Oligonukleotide auf dem zweiten Nanopartikel-Typus besitzen eine Sequenz, die komplementär zu jener der Oligonukleotide auf dem ersten Typus der Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate ist. Die ersten und zweiten Nanopartikel-Typen werden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die effektiv ist, eine Hybridisierung der Oligonukleotide auf den Nanopartikeln untereinander zu ermöglichen, so dass die gewünschten Nanomaterialien oder Nanostrukturen gebildet werden.
  • Weiterhin stellt die Erfindung Nanomaterialien oder Nanostrukturen bereit, die aus Kern/Schale-Nanopartikel mit daran gebundenen Oligonukleotiden zusammengesetzt sind, wobei die Nanopartikel über Oligonukleotidverbindungselemente zusammengehalten werden.
  • Beispiel 1: Synthese von Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel hergestellt über eine Zwei-Schritt-Synthese
  • Dieses Beispiel illustriert das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Ag/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel. Im Teil A werden Verfahren zur Herstellung von Silberkernen beschrieben. Im Teil B wird ein Verfahren zur Herstellung von Ag/Gold- Kern/Schale-Nanopartikeln bereitgestellt. Silber-Nanopartikel sind gesuchte Zusammensetzungen für Bausteine für die Materialsynthese und für biologische Label aus zwei wichtigen Gründen: (1) Silberpartikel zeigen eine Oberflächenplasmonbande zwischen ~390 und 420 nm in Abhängigkeit von der Partikelgröße11; dies ist ein Spektralbereich, der sich von jenem des Goldes (520-580 nm) unterscheidet. (2) Der Extinktionskoeffizient der Oberflächenplasmonbande für ein Silberpartikel ist ungefähr vier Mal so groß wie der für ein Goldpartikel der gleichen Größe12. Deshalb würden mit DNA funktionalisierte Silberpartikel nicht nur eine Möglichkeit zum Maßschneidern der optischen Eigenschaften von DNA/Nanopartikel-Verbundstrukturen bieten, sondern auch Wege zu neuen Diagnosesystemen bereiten, die auf der Lage und der Intensität der Oberflächenplasmonbande beruhen (z.B. colorimetrische Systeme auf Grundlage der Absorption oder Streuung, oder SPR- und SERS-Detektionssysteme).
  • Experimentell wurde gefunden, dass Silber- Nanopartikel durch Alkylthiol-modifizierte Oligonukleotide nicht wirksam passiviert werden können, wenn die etablierten Verfahren zur Modifizierung von Gold-Partikeln herangezogen werden. In der Tat aggregieren durch derartige Verfahren hergestellte Silberpartikel-DNA-Konjugate irreversibel, wenn sie in einer Lösung mit einer Salzkonzentration, die zur DNA-Hybridisierung erforderlich ist (0,05 M NaCl oder höher), erwärmt werden. Hier wurde ein Kern/Schale-Ansatz angewendet, um dieses Problem zu lösen. Bei diesem Ansatz ließ man eine dünne Goldschale auf einem Silber-Nanopartikel aufwachsen, wodurch ein Partikel mit einer äußeren Goldoberfläche gebildet wurde, die sich leicht mit Alkylthiol-Oligonukleotiden modifizieren lässt. Dieser Ansatz ließ sich zur Herstellung anderer Partikel, wie Cu und Pt, verallgemeinern, um so durch die Auswahl des Kerns eine Reihe von Kern/Schale-Partikeln mit maßgeschneiderten physikalischen Eigenschaften zu erzeugen, jedoch mit der Oberflächenchemie und Stabilität der ursprünglichen und Oligonukleotid-modifizierten, reinen Goldpartikel.
  • A. Herstellung der Silber-Nanopartikelkerne
  • Die Silber-Nanopartikel waren durch Reduktion von Silbernitrat mit Natriumborhydrid in einer Trinatriumcitrat-Lösung synthetisch hergestellte Silber-Nanokristalle. Zwei Verfahren zur Synthese der Silbernanokristalle sind nachstehend beschrieben und die entstandenen Kern-Nanokristalle wurden verglichen.
  • Verfahren Nr. 1: AgNO3 (2,2 mg) und Natriumcitrat-dihydrat (8,2 mg) wurden in einem 250 ml Kolben in 99 ml extrem extrem reinen (nanopure) Wasser gelöst. Der Kolben wurde 15 min in ein Eisbad gestellt, während unter Ar gerührt wurde. Dann wurde 1 ml Natriumborhydrid-Lösung (0,14 M) in die Lösung gespritzt. Nachdem eine Stunde gerührt wurde, wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt. Die Silber-Nanopartikel (Durchmesser ~12 nm) wurden erhalten. Diese Silber-Nanopartikel konnten ohne weitere Reinigung direkt zum Aufwachsen der Goldschale verwendet werden.
  • Verfahren Nr. 2: AgNO3 (2,2 mg) und Natriumcitrat-dihydrat (8,2 mg) wurden in einem 250 ml Kolben in 98 ml extrem reinen (nanopure) Wasser gelöst. Der Kolben wurde 15 min in ein Eisbad gestellt, während unter Ar-Atmosphäre gerührt wurde. Dann wurde 1 ml Natriumborhydrid-Lösung (0,14 M) in die Lösung gespritzt. Nachdem eine Stunde gerührt wurde, wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt. Die Silber-Nanopartikel (Durchmesser ~12 nm) wurden erhalten. Bis(p-sulfonatophenyl)-phenylphosphin (BSPP, 17 mg) wurde in die Silber-Nanopartikel-Lösung gegeben und über Nacht gerührt. Anschließend wurden die Silber-Nanopartikel mittels Gradientenzentrifugation zwischen 12 kUpM ~20 kUpM gereinigt und abgetrennt. Die entstandenen Silber-Nanopartikel enthaltenden aliquoten Mengen des Niederschlags wurden vereinigt und in extrem reinem (nanopure) Wasser dispergiert.
  • Vergleichsergebnisse: Die Silberpartikel, die mittels des Verfahrens Nr. 2 hergestellt wurden, besitzen eine bessere Größenverteilung im Vergleich mit jenen, die mittels des Verfahrens Nr. 1 hergestellt wurden (σ = 18% für Verfahren Nr. 2; σ = 30% für Verfahren Nr. 1). Nachfolgende Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass die Silberpartikel jedes der beiden Verfahren gut als Kern zur Erzeugung von Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel dienen.
  • B. Herstellung der Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • Dieser Schritt beschreibt das Aufwachsen der Goldschale auf der Oberfläche der oben beschriebenen Silberkerne. Passend zu den Silber-Nanopartikeln ließ man Goldschalen durch Reduktion von HAuCl4 mit dem Reduktionsmittel NaBH4 auf die Silberkernoberflächen aufwachsen. Das reduzierte Gold besitzt eine Affinität zu der Silberoberfläche, teilweise, aufgrund des geringen chemischen Oberflächenpotenzials der Silber-Nanopartikel und der annähernd verschwindenden Gitterunterschiede zwischen den beiden Stoffen. Zwei Verfahren zum Aufwachsen von Goldschalen auf den Silberkern-Nanokristallen sind unten beschrieben und die erhaltenen Kern/Schale-Nanopartikel wurden miteinander verglichen. Die Silberkern-Partikel wurden mit dem oben beschriebenen Verfahren Nr. 1 hergestellt.
  • Verfahren Nr. 1: Goldschalen (etwa eine Monolage dick) ließ man auf die Oberfläche der Silber-Nanopartikel (0,25 nmol Silberpartikel in 100 ml einer 0,3 mM wässrigen Natriumcitratlösung) aufwachsen, indem man gleichzeitig HAuCl4- (2 mM) und NaBH4-(6 mM) Lösungen (in extrem reinem (nanopure) Wasser) mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 50 μl ~600 μl/min bei 0°C zu der Silber-Nanopartikelsuspension zutropfte. Das gleichzeitige Zutropfen des verdünnten Goldvorläufers verhindert die Bildung von Goldcluster-Nukleationsstellen, indem die Konzentration dieser Gold-bildenden Reagenzien bei etwa 2 μM gehalten wird. Nachdem genügend HAuCl4 und NaBH4 zu den Nanopartikeln hinzugegeben war, um eine Gold-Monolage auf den Partikeln zu erzeugen (siehe Gleichung 1 zur Berechnung der Schalendicke), wurde die Zugabe gestoppt.
  • Gleichung 1
    • Vkern = 4/3·π·R3, VKern/Schale = 4/3·π·(R + a)3,wobei a die Dicke der Schale ist (0,3 nm für 1 Au-Monolage); VSchale = VKern/Schale – VKern, NSchale = dSchale·VSchale/FWSchale,wobei VSchale das Volumen der Schale ist, NSchale die Menge der Schale in Mol ist, dSchale die Dichte der Schalenmaterialien (bei Gold, d = 19,3 g/ml) ist; FWSchale das Formelgewicht der Schalenmaterialien (bei Gold, FW = 196,97 amu) ist.
  • Gold wurde mit einem 5%igen Überschuss zugegeben, berechnet unter der Annahme von 12 nm Kügelchen: 0,8 mg HAuCl4·3H2O und 3,7 mg NaBH4. Nachdem ein 5%iger Überschuss erreicht war, wurde die Zugabe der Lösungen gestoppt (Anhalten der Schalenbildung) und 30 μmol Bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphin (BSPP) wurde zugegeben.
  • Dann wurden die Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel durch Zentrifugieren gereinigt und in extrem reinem (nanopure) Wasser dispergiert (Durchmesser 12,4 nm, (σ = 18%)), wobei sich eine 96%ige Ausbeute und ein Silber-zu-Gold-Verhältnis von etwa 5,5:1 ergab.
  • Verfahren Nr. 2: Goldschalen (etwa eine Monolage dick) ließ man auf die Oberfläche der Silber-Nanopartikel (0,25 nmol Silberpartikel in 100 ml einer 0,3 mM einer wässrigen Natriumcitratlösung) aufwachsen, indem man sie gleichzeitig mit HAuCl4 (2 mM) und NaBH4 (6 mM) durch Zutropfen mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 50 μ1~600 μl/min bei Raumtemperatur behandelte. Das gleichzeitige Zutropfen des verdünnten Goldvorläufers verhindert die Bildung von Goldcluster-Nukleationsstellen, indem die Konzentration dieser Gold-bildenden Reagenzien bei etwa 2 μM gehalten wird. Nachdem genügend HAuCl4 und NaBH4 zu den Nanopartikel hinzugegeben wurde, um eine Gold-Monolage auf den Partikeln zu erzeugen (5%iger Überschuss, berechnet unter der Annahme von 12 nm Kügelchen: 0,8 mg HAuCl4·3H2O und 3,7 mg NaBH4), wurde die Zugabe gestoppt und 30 μmol BSPP wurde zugegeben. Dann wurden die Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel durch Zentrifugieren gereinigt und in extrem reinem (nanopure) Wasser dispergiert, wobei sich eine etwa 90%ige Ausbeute in Gewichtsprozent, eine mittlere Partikelgröße von etwa 12,5 nm und ein Silber-zu-Gold-Verhältnis von etwa 6,3:1 ergab.
  • Vergleichsergebnisse: Es wurde gefunden, dass die Kern/Schale-Nanopartikel, die via des Verfahrens Nr. 1 (Synthese bei 0°C) hergestellt wurden, eine bessere Stabilität in 0,5 M NaCl-Lösung aufwiesen, verglichen mit den Kern/Schale-Nanopartikeln, die mittels des Verfahrens Nr. 2 (Synthese bei Raumtemperatur) hergestellt wurden. Dieses Ergebnis kann, teilweise, auf die langsamere Geschwindigkeit des Schalenwachstums bei 0°C als die Wachstumsgeschwindigkeit bei Raumtemperatur zurückgeführt werden.
  • (C) Diskussion
  • Silber-Nanopartikel wurden gemäß den Verfahren aus der Literatur13 hergestellt. Dann wurden die Partikel mit BSPP (0,3 mM) passiviert, mittels Gradientenzentrifugation gereinigt (Sammeln der Primärfraktion; ~12 nm Durchmesser) und in extrem reinem (nanopure) Wasser dispergiert. Auf der Oberfläche der Silber-Nanopartikel (0,25 nmol Silber-Partikel in 100 ml einer wässrigen 0,3 M Natriumcitratlösung) ließ man Goldschalen, etwa eine Monolage dick, aufwachsen, indem man sie gleichzeitig mit HAuCl4 und Natriumborhydrid durch Zutropfen bei 0°C behandelte. Das reduzierte Gold besitzt eine Affinität zu der Silberoberfläche, teilweise, aufgrund des annähernd verschwindenden Gitterunterschieds14. Das gleichzeitige Zutropfen des verdünnten Goldvorläufers bei 0°C verhindert die Bildung von Goldcluster-Nukleationsstellen, indem die Konzentration dieser Gold-bildenden Reagenzien bei etwa 2 μM gehalten wird. Nachdem genügend HAuCl4 und NaBH4 zugegeben worden war, um eine Gold-Monolage auf den Partikeln zu erzeugen (5%iger Überschuss, berechnet unter der Annahme von 12 nm Kügelchen: 0,8 mg HAuCl4·3H2O und 3,7 mg NaBH4), wurde die Reaktion angehalten und 30 mM BSPP (0,3 ml) wurde zugegeben. Dann wurden die Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel durch Zentrifugieren gereinigt und in extrem reinem (nanopure) Wasser dispergiert (Partikel mit Durchmesser 12,4 nm, (σ = 18%)). 1A zeigt eine TEM-Aufnahme eines Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikels, die unter Verwendung eines Hitachi 8100 Elektronenmikroskops erhalten wurde. Eine typische TEM-Probe wurde präpariert, indem man einen Tropfen der Nanopartikellösung auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Kupfergitter auftrug. Die überschüssige Lösung wurde mit einem Filterpapier aufgesaugt und im Vakuum getrocknet. Das Silber:Gold-Verhältnis in diesen Kern/Schale-Partikeln wurde durch energiedispersive Röntgenmikroanalyse (EDX) der Partikel (1B) zu 5,2:1 bestimmt. 1B stellt ein EDX-Spektrum von Silber-Kern-Partikeln (gepunktete Linie) und von Silber/Gold-Kern/Schale-Partikeln (durchgezogene Linie) dar. L und M kennzeichnen jeweils Elektronenübergänge in die L- und M-Schale der Atome von höheren Zuständen. Die EDX-Analyse wurde auf einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FEREM) Hitachi 4500 durchgeführt. Die REM-Proben wurden hergestellt, indem ein Tropfen der Nanopartikellösung auf eine Siliziumscheibe aufgetragen wurde. Das Silber:Gold-Verhältnis entspricht einer Dicke der Goldschale von 3,1 +/– 0,6 Å, was mit ungefähr einer Monolage der Goldatome korreliert.
  • Signifikanterweise ist das Extinktionsspektrum der Kern/Schale-Partikel dem von Citrat-stabilisierten, reinen Silber-Partikeln sehr ähnlich. Die Oberflächenplasmonbande des Silbers verbleibt bei der selben Wellenlänge ist jedoch um etwa 10% gedämpft, und die Goldplasmonbande wird als leichte Wölbung bei 500 nm beobachtet. Diese spektralen Merkmale stellen einen starken Beweis für das Wachstum einer Goldschale dar. Man beachte, dass, unter Verwendung von anderen Verfahren, andere Gold-beschichtete Silber-Nanopartikel hergestellt haben15. Jedoch haben diese Verfahren zu Silber/Gold-Legierungen15a geführt; die Extinktionsspektren derartiger Partikel zeigen eine charakteristische Rotverschiebung und eine Verbreiterung der Plasmonresonanz. Wenn man darüber hinaus absichtlich eine Lösung von legierten Silber/Gold-Partikeln herstellt, lassen sich diese leicht von Kern/Schale-Partikeln mit vergleichbaren Silber/Gold-Verhältnissen unterscheiden (siehe unterstützende Information). Tatsächlich behalten die Kern/Schale-Silber/Gold-Nanopartikel, die nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die optischen Eigenschaften des Kerns, ohne dass eine Rotverschiebung der Silberplasmonbande beobachtet wird (1C). Unter Verwendung der Mie-Theorie wurde ein Extinktionsspektrum eines Partikels berechnet, das aus einem 11,8 nm Silberkern und einer monolagigen Goldschale bestand11. Das berechnete Spektrum war beinahe deckungsgleich mit dem experimentell gemessenen Spektrum der Partikel (1C, Nebenbild). 1C stellt die UV-VIS-Spektren des Silber-Kerns (gepunktete Linie) und der Silber/Gold-Kern/Schale (durchgezogene Linie) dar, wobei das Nebenbild die berechneten Extinktionsspektren der Silberpartikel (gepunktete Linie) und der Silber/Gold-Kern/Schale-Partikel (durchgezogene Linie) zeigt. Die UV-VIS-Spektren wurden unter Verwendung eines HP 8453 Diodenarray-Spektralphotometers erhalten.
  • Beispiel 2: Herstellung von Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten als Sonden zur Detektion von Ziel-Nukleinsäure. Zwei Verfahren wurden angewendet und die entstandenen Sonden wurden dann hinsichtlich der Stabilität verglichen. Die zur Herstellung der Konjugate verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind in 2A dargestellt. Diese Sequenzen wurden unter Anwendung von Standard-Phosphoamiditchemie gemäß der Literatur synthetisiert (James J. Storhoff, Robert Elghanian, Robert C. Mucic, Chad A. Mirkin und Robert L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 1959).
  • (a) Herstellung von Kern/Schale-Nanopartikel-Konjugaten
  • Verfahren Nr. 1: Nanopartikelsonden mit geeigneten Sonden-Oligonukleotiden wurden hergestellt, indem man 10 ml eines wässrigen Kern/Schale-Nanopartikelkolloids (vom Verfahren Nr. 1) mit 8~10 OD (in etwa 500 μl) Alkanthiol-oligonukleotid (die Oligonukleotidkonzentration am Ende beträgt etwa 2 μM) derivatisierte. Nach dem Stehenlassen über Nacht (etwa 15 h) wurde die Lösung in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) eingebracht, wobei 100 mM konzentrierter Phosphatpuffer verwendet wurde, und Salz (von einer 2 M, wässrigen NaCl-Lösung) wurde nach 0,5 h auf 0,05 M NaCl zugegeben, stehen lassen für etwa 8 h, dann weitere NaCl-Zugabe auf 0,1 M und nach weiterem Stehenlassen für etwa 8 h weitere NaCl-Zugabe auf etwa 0,3 M und Stehenlassen für abschließende ~8 h. Um überschüssige DNA zu entfernen, wurden die Kolloide 30 min bei 18.000 UpM zentrifugiert unter Verwendung von 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen. Nach dem Entfernen des Überstands wurde der ölige Niederschlag mit einem Volumen, das dem verworfenen Überstand entsprach, an 0,3 M NaCl, 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen, zentrifugiert, und in 0,3 M NaCl, 10 mM Phosphatpuffer (pH 7), 0,01 % Azidlösung dispergiert. Die endgültigen Kolloide wurden gekühlt und für die weitere Verwendung gelagert.
  • Verfahren Nr. 2: Nanopartikelsonden mit geeigneten Sonden-Oligonukleotiden wurden hergestellt, indem man 10 ml eines wässrigen Kolloids mit 8~10 OD Alkanthiol-Oligonukleotid (die Oligonukleotidkonzentration am Ende beträgt etwa 2 μM) derivatisierte. Nach dem Stehenlassen über Nacht (~15 h) wurde die Lösung in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) eingebracht, wobei 100 mM konzentrierter Phosphatstammpuffer verwendet wurde, und Salz wurde auf 0,1 M NaCl zugegeben, stehen lassen für etwa 20 h, und weitere NaCl-Zugabe auf 0,3 M nach weiteren ~8 h. Das Gemisch ließ man etwa 4 bis 8 Stunden stehen. Um überschüssige DNA zu entfernen, wurden die Kolloide 30 min bei 18.000 UpM zentrifugiert unter Verwendung von 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen. Nach dem Entfernen des Überstands wurde der ölige Niederschlag mit 0,3 M NaCl, 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 7) mit demselben Volumen wie der verworfene Überstand gewaschen, zentrifugiert, und in 0,3 M NaCl, 10 mM Phosphatpuffer (pH 7), 0,01 % Azidlösung dispergiert. Die endgültigen Kolloide wurden gekühlt und für die weitere Verwendung gelagert.
  • (b) Beurteilung der Stabilität der Kern/Schale-Nanopartikel-Oligionukleotid-Konjugate
  • Die Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate, die mit den beiden oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wurden unter Verwendung des Salzbehandlungsverfahrens, wie es in jedem der beiden obigen Verfahren beschrieben ist, verglichen.
  • Im Verfahren 1 wurde die Salzkonzentration von 0,05 M NaCl auf 0,1 M NaCl und dann auf 0,3 M NaCl erhöht. Im Verfahren 2 wurde die Salzkonzentration in zwei Schritten gesteigert: direkt auf 0,1 M NaCl und dann auf 0,3 M NaCl. Verfahren 1 ergibt Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate einer höheren Qualität im Vergleich zu jenen, die mittels Verfahren 2 hergestellt wurden. Beim Verfahren 2 entsprechen etwa 15% der Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate nicht der erforderlichen Qualität. Die Qualität der Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate wird mittels UV-VIS-Spektroskopie beurteilt. Konjugate einer akzeptablen Qualität zeigen ein UV-VIS-Spektrum mit einem Oberflächenplasmon-Absorptionspeak, der sein Zentrum bei 400 nm aufweist, während Konjugate schlechter (ungeeigneter) Qualität einen Absorptionspeak aufweisen, der signifikant gedämpft ist und eine Rotverschiebung zu 450-550 nm besitzt.
  • (c) Diskussion
  • Die Oberflächenmodifikation dieser Kern/Schale-Nanopartikel mit 3'- und 5' Alkanthiol-gekappten Oligonukleotiden wurde bewerkstelligt, indem ein Verfahren verwendet wurde, das identisch zu dem ist, das für 13 nm Goldpartikel verwendet wurde2d. Signifikanterweise zeigen die Oligonukleotid-modifizierten Partikel die Stabilität der reinen Gold-Nanopartikel und können unbegrenzt in einer 1M NaCl-Lösung suspendiert werden. Dies stellt einen signifikanten Vorteil gegenüber den Oligonukleotid-modifizierten legierten Silber/Gold-Partikeln dar, die unter vergleichbaren Lösungsbedingungen irreversibel aggregieren und nicht die Stabilität der Oligonukleotid-modifizierten Kern/Schale-Partikel der vorliegenden Erfindung aufweisen.
  • Darüber hinaus unterziehen sich die Kern/Schale-Partikel einer Hybridisierung mit komplementär verbindenden Oligonukleotiden, um aggregierte Strukturen mit einer damit einhergehenden Dunkelfärbung der Lösung zu bilden; allerdings ist mit dem bloßen Auge keine deutliche Farbänderung zu beobachten (2). Wie die Oligonukleotid-modifizierten reinen Goldnanopartikel können die Nanopartikel, die diese aggregierten Silber/Gold-Kern/Schale-Aggregatsstrukturen umfassen, zerlegt werden, indem man die Aggregate über die „Schmelztemperatur" (TM) der Duplexlinker (1D) erhitzt. Die UV-VIS-Spektroskopie zeigt eine Rotverschiebung und eine Dämpfung der Plasmonresonanz der Kern/Schale-Partikel bei einem DNA-induzierten Aufbau (1D, Nebenbild). 1D stellt die thermische Denaturierungs(„Schmelz-")-Kurve der Aggregate dar, die von hybridisierten Oligonukleotid-modifizierten Silber/Gold-Kern/Schale-Partikel in Pufferlösung (0,3 M NaCl und 10 mM Phosphatpuffer, pH = 7) erhalten wurde. Die Oligonukleotidsequenzen werden in 2A dargestellt. Das Nebenbild in 1D zeigt die UV-VIS-Spetren von dispergierten Oligonukleotid-modifizierten Silber/Gold-Kern/Schale-Partikeln (durchgezogene Linie) und aggregierten (gepunktete Linie) Oligonukleotid-modifizierten Silber/Gold-Kern/Schale-Partikeln, die durch Hybridisierung gebildet wurden. Die UV-VIS-Spektren des Silbers und der Silber/Gold-Kern/Schale-Partikel (1C und Nebenbild von 1D) wurden unter Verwendung eines HP 8453 Diodenarray-Spektralphotometers erhalten. Das thermische Denaturierungsexperiment (1D) wurde unter Verwendung eines HP 8453 Diodenarray-Spektralphotometers, das mit einer HP 89090a Peltier-Temperatursteuerung ausgestattet war, durchgeführt. Die UV-VIS-Signatur der Silber/Gold-Kern/Schale-Sonde/Ziel-Oligonukleotid-Aggregate wurde in Zeitabständen von 1 min aufgezeichnet, während die Temperatur von 25°C auf 70°C mit einer Haltezeit von 1 min/Grad gesteigert wurde.
  • Das Partikelzusammenlagerungsverfahren, induziert durch die komplementäre DNA, kann auch auf einer C18-Umkehrphasen-Aluminiumoxid-TLC-Platte verfolgt werden, das den Vergleich mit dem reinen Goldsystem ermöglicht. Die in 2B und 2C dargestellten Tupfentestergebnisse wurden folgendermaßen erhalten: Eine Lösung des geeigneten Oligonukleotid-Ziels (24 pmol, 3 μl) wurde in ein dünnwandiges 600 μl PCR-Röhrchen gegeben, das 200 μl von jedem der Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate enthielt. Nach einer Standzeit von 30 min bei Raumtemperatur wurde die Lösung in eine Heizvorrichtung mit Temperatursteuerung überführt. Nachdem die Solltemperatur erreicht war (überprüft mit einem Ethanolthermometer, 0,5°C Inkremente), wurde das Gemisch 5 min equilibriert, wobei 2,5 μl der aliquoten Menge der Silber/Gold-Sonde/Ziel-Oligonukleotidlösung mit einer Pipette auf die Umkehrphasen-Aluminiumoxidplatte überführt und getrocknet wurde.
  • Wie in 2 dargestellt, wird mit den Kern/Schale-Partikeln nach der Partikelzusammenlagerung in Gegenwart des komplementären Ziels ein deutlicher Farbumschlag von gelb nach dunkelbraun beobachtet, 2B-I und 2B-II. Man beachte, dass sich ein gelber Fleck auf dem Umkehrphasen-Aluminiumoxidträger bildet, wenn die Temperatur der Lösung oberhalb von Tm des DNA-Duplexlinkers liegt, 2B-III. Wenn man die Eigenschaften dieser neuen Silber/Gold-Kern/Schale-Sonden mit jenen vergleicht, die sich von reinen Gold-Nanopartikeln ableiten (mit identischen Oligonukleotidsequenzen), 2C, erkennt man, dass die Kern/Schale-Partikel eine Route zu einer zweiten colorimetrischen Veränderung eröffnen, die sich vom Goldsystem unterscheidet, die letztendlich verwendet werden kann, um zwei verschiedene Oligonukleotid-Ziele in einer Probe zu überwachen. Derartige Fähigkeiten können sich sowohl bei Forschungs-basierenden als auch bei klinisch-genomischen Assays, wo mehrfarbige Formate erforderlich sind, als wichtig erweisen16.
  • Beispiel 3: Vergleich von Silber, Silber/Gold-Kern/Schale- und Silber/Gold-Legierung Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate
  • In diesem Beispiel wurden die Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel, die wie in Beispiel 1 (Verfahren Nr. 1) hergestellt wurden, mit Gold-Nanopartikeln2 und Silber/Gold-Legierung-Nanopartikeln, die nach Literaturverfahren hergestellt wurden, verglichen. Siehe Link, S.; Wang Z. L.; El-Sayed, M.A., J. Phys. Chem. B. 1999, 103, 3529. Gemäß dem Literaturverfahren wurden 0,8 mg HAuCl4·3H2O und 1,8 mg AgNO3 in 95 ml extrem reinem (nanopure) Wasser gelöst. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und 5 ml 1%iges Natriumcitrat wurde zu der Lösung hinzugefügt. Nachdem weitere 30 min unter Rückfluss erhitzt wurde, ließ man die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Das UV-VIS-Spektrum der Legierungspartikel zeigt eine Oberflächenplasmonbande bei 428 nm mit einer Halbwertsbreite (FWHM) von 90 nm (0,62 eV). Im Gegensatz dazu zeigt das UV-VIS-Spektrum der Silber/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel mit einem vergleichbaren Silber/Gold-Verhältnis eine Oberflächenplasmonbande bei 400 nm mit einer FWHM von 58 nm (0,45 eV).
  • Die Oberflächenmodifikation dieser Kern/Schale- und Legierung-Nanopartikel mit 3'- und 5'-Alkanthiol-gekappten Oligonukleotiden wurde bewerkstelligt, indem ein Verfahren angewendet wurde, das identisch zu dem war, das bei 13 nm Gold-Partikeln angewendet wurde. Siehe Storhoff J.J.; Elghanian, R.; Mucic, R.C.; Mirkin, C.A.; Letsinger, R.L., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1959. Signifikanterweise zeigen die Oligonukleotid-modifizierten Kern/Schale-Nanopartikel die Stabilität der reinen Gold-Nanopartikel und können unbeschränkt in 1M NaCl-Lösungen suspendiert werden, 3. Im Gegensatz dazu aggregieren die Oligonukleotid-modifizierten Silber-Gold-Legierungspartikel irreversibel, wenn sie auf eine Salzkonzentration von 0,1 M gebracht werden, 3.
  • Ein anderer Weg, um die Stabilität der Partikel/DNA-Konjugate zu beurteilen, verwendet einen DNA-Schmelztest. Das Kern/Schale-Nanopartikel/DNA-Konjugat kann mit Ziel-DNA in einem Salzkonzentrationsbereich von 0,1 bis 1,0 M reversibel hybridisieren und die entstandenen Nanopartikelaggregate können weg"schmelzen", wenn sie über die Schmelztemperatur erhitzt werden. Dieser Hybridisierungs-/Dehybridisierungsvorgang ist für Kern/Schale-Partikel vollständig reversibel. Die Kern/Schale-Partikel/DNA-Konjugate zeigen nach 100 Zyklen keinerlei Zersetzung, was in einem scharfen Gegensatz zu den Silber/Gold-Legierungspartikel/DNA-Konjugaten steht, die irreversibel aggregieren, sogar bei niedrigen Salzkonzentrationen (0,05 M NaCl), die erforderlich sind, um die Hybridisierung zu bewirken.
  • Beispiel 4: Herstellung von Pt/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Pt/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln durch das erfindungsgemäße Verfahren. Im Teil A wurden Pt-Kern-Nanopartikel durch Wasserstoffreduktion von K2PtCl4 in einer Reaktion über Nacht hergestellt. Im Teil B ließ man Gold-Schalen auf die Pt-Kerne aufwachsen.
  • (a) Herstellung der Pt-Kern-Nanopartikel
  • In einem 500 ml Dreihalskolben wurden K2PtCl4 (8,3 mg) und Natriumpolyacrylat (20 mg) in 200 ml extrem reinem (nanopure) Wasser gelöst. H2 wurde über Nacht in die Reaktionslösung unter Rühren eingeleitet. Dies führte zu Pt-Nanopartikeln, die gereinigt und isoliert wurden, was Nanopartikel mit etwa 12 nm Durchmesser ergab.
  • (b) Herstellung der Pt/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • 100 ml der 12 nm Pt-Nanopartikel-Lösung (0,25 nmol, hergestellt nach dem obigen Verfahren) wurden in einen 250 ml Dreihalskolben gegeben. Zu der Nanopartikellösung wurden gleichzeitig HAuCl4 und NaBH4 bei 0°C zugetropft. Das gleichzeitige Zutropfen des verdünnten Goldvorläufers verhindert die Bildung von Goldclusternukleationsstellen, indem die Konzentration dieser Gold-bildenden Reagenzien bei etwa 2 μM gehalten wird. Nachdem genügend HAuCl4 und NaBH4 zu den Nanopartikeln hinzugegeben wurde, um eine Gold-Monolage auf den Pt-Nanopartikeln zu erzeugen (5%iger Überschuss, berechnet unter der Annahme von 12 nm Kügelchen; 1,6 mg HAuCl4·3H2O und 4 mg NaBH4) wurde die Zugabe dieser Reagenzien zur Reaktion gestoppt. LTV-VIS-Spektren des Pt-Kerns und des Pt/Gold-Kern/Schale-Nanopartikels sind in 4 gezeigt.
  • Beispiel 5: Herstellung von magnetischen Fe3O4/Gold-Kern/Schale-Nanopartikeln
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von magnetischen Gold-Nanopartikeln durch das erfindungsgemäße Verfahren. Im Teil A wurden magnetische Fe3O4-Kern-Nanoprtikel hergestellt. Im Teil B ließ man Gold-Schalen auf die magnetischen Kerne aufwachsen. Anstelle von Fe3O4 könnten andere magnetische Kerne, wie Co, Fe, Ni, FePt und FeAu verwendet werden. 6 stellt den Kern/Schale-Ansatz zur Herstellung magnetischer Gold-Nanopartikel dar.
  • (a) Herstellung der Fe3O4-Kern-Nanopartikel
  • In einer typischen Synthese wurden die Fe3O4-Nanopartikel wie folgt hergestellt. Zunächst wurden 0,86 g FeCl2·4H2O und 2,35 g FeCl3·6H2O in 50 ml extrem reinem (nanopure) Wasser unter einer inerten Ar(g)-Atmosphäre gelöst. Die Lösung wurde unter heftigem Rühren auf 80°C erhitzt. Eine Lösung von 100 mg reiner Decansäure in 5 ml Aceton wurde zu der Fe-Lösung hinzugegeben, gefolgt von 5 ml 28 gewichts%igem NH3/H2O. Der Suspension wurde weitere reine Decansäure in 5 × 0,2g Mengen über 5 min hinzugefügt. Die Reaktion wurde über 30 min bei 80°C unter Rühren durchgeführt, um eine stabile Suspension auf Wasserbasis zu erzeugen. Nach der Bildung der Suspension wurde die Reaktion langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die gebildeten Fe3O4-Nanopartikel (5,0 nmol) wurden weiterhin über Nacht mit sodium thiorectic acid (vermutlich Natriumthioctansäure) (0,1 mmol) Lösung behandelt, um einen Oberflächenaustausch an der Partikeloberfläche zu ermöglichen. Schwefelionen ersetzen Sauerstoff auf der Oberfläche der Fe3O4-Nanopartikel und stellen so die Wachstumsstellen für die Goldschale bereit. Dieses Ligandenaustauschverfahren ist auch für die Herstellung von magnetischen Co3O4-Kernen erforderlich.
  • (b) Herstellung der Fe3O4/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • Das Verfahren für das Aufwachsen der Goldschale ähnelt dem der in Beispiel 1 beschriebenen Kern/Schale-Silber/Gold-Herstellung. Das UV-VIS-Spektrum des Fe3O4/Gold Schalenwachstums ist in 5 dargestellt. In einem angelegten Magnetfeld verhalten sich die Fe3O4/Gold-Kern/Schale-Partikel als superparamagnetische Partikel (7). Die magnetischen Eigenschaften der DNA-funktionalisierten Magneto-Gold-Nanopartikel sind in 8(A) und (B) dargestellt. 8(C) zeigt ein REM-Bild von DNA-funktionalisierten Magneto-Gold-Nanopartikeln (mittlerer Durchmesser = 18 nm, Dicke der Schale = 2 nm (Kerndurchmesser = 14 nm)) und (D) zeigt eine Schmelzkurve für Magneto-Gold-Nanopartikelsonden, die mit Ziel-DNA verbunden sind, Sonde a = 3'HS-A20-CTC CCT AAT AAT-5', Sonde b = 3'TTA TAA CTA TTC CTA-A20-SH5', Ziel a'b' = 5'-GAG GGA TTA TTG TTA...AAT ATT GAT AAG GAT-3'.
  • Beispiel 6: Herstellung der magnetischen Co/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von magnetischen Gold-Nanopartikeln durch das erfindungsgemäße Verfahren. Im Teil A wurden magnetische Co-Kern-Nanopartikel hergestellt. Im Teil B ließ man Gold-Schalen auf die magnetischen Co-Kerne aufwachsen.
  • (a) Herstellung der Co-Nanopartikelkerne
  • O-Dichlorbenzol (15,9 g), Trioctylphosphinoxid (0,1 g) und 0,2 ml Oleinsäure wurden in einem 50 ml Dreihalskolben vorgelegt und auf 180°C erhitzt. Eine Lösung von Co2(CO)8 (0,65 g in 3 ml o-Dichlorbenzol) wurde hinzugefügt, indem man es in die erhitzte Lösung injizierte. Nach dieser Zugabe wurde die Reaktionstemperatur eine Stunde bei 180°C gehalten. Dann wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Co-Nanopartikel von etwa 12 nm im Durchmesser wurden in einer 95%igen Ausbeute hergestellt. 9 zeigt das REM-Bild der Co-Nanopartikel.
  • (b) Herstellung der Co/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • Das folgende ist ein typisches Beschichtungsverfahren für Co/Gold-Kern/Schale Nanopartikel.
  • Nachdem Co-Nanopartikel (0,01 μmol) in o-Dichlorbenzol (12 g) in einem 50 ml Dreihalskolben gelöst waren, wurde Trioctylphosphinoxid (0,1 g) zu der Co-Lösung hinzugegeben. Die Lösung wurde auf 180°C erhitzt, wobei dann die Gold-Schale Stammlösungen 1 und 2 (siehe unten) gleichzeitig zu der heißen Reaktionslösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 μl-500 μl/min zugetropft wurden. Nachdem eine ausreichende Menge der Stammlösungen 1 und 2 hinzugegeben waren (etwa 5% Überschuss), wurde die Reaktionslösung für weitere 30 min auf 180°C gehalten. Anschließend wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt, um sie zu stoppen.
  • Die Gold-Schale-Stammlösungen wurde wie folgt hergestellt: Stammlösung 1, HAuCl4·3H2O (0,1 g) und n-Hexadecyltrimethylammoniumbromid (0,1 g) wurden in o-Dichlorbenzol (10 g) gelöst; Stammlösung 2, 1,1-Hexadecandiol (0,12 g) wurde in o-Dichlorbenzol (10 g) gelöst.
  • Beispiel 7: Herstellung der CdS, CdSe/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Gold-beschichteten Halbleiter-Quantenpunkten durch das erfindungsgemäße Verfahren. Im Teil A wurden CdSe- (oder CdS-)Halbleiterkern-Nanopartikel hergestellt. Im Teil B ließ man Gold-Schalen auf die SdS- und SdSe-Halbleiterkerne aufwachsen.
  • (a) Herstellung der CdSe (oder CdS)-Nanopartikelkerne
  • Extrem reines (nanopure) Wasser (100 ml), Natriumcitrat (100 mg) und Cadmiumperchlorat (25 mg) wurden in einem 250 ml-Dreihalskolben vorgelegt und der pH der Lösung wurde auf etwa 9,0 eingestellt. Nach dem Einleiten von Ar über 30 min wurde die Lösung auf 100°C erhitzt. Eine Lösung (4 ml, 0,02 M) 1,3-Dimethyl-2-selenharnstoff (oder 1,3-Dimethyl-2-thioharnstoff) wurde in die heiße Lösung injiziert. Nach 2 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die CdSe (oder CdS)-Nanopartikel wurden durch Centricon-Filtration von der Lösung abgetrennt und in extrem reinem (nanopure) Wasser redispergiert.
  • (b) Herstellung der CdSe (oder CdS)/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel
  • Das folgende ist ein typisches Beschichtungsverfahren für CdSe (oder CdS)/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel.
  • Nachdem CdSe (oder CdS)-Nanopartikel (~4 nm im Durchmesser, 10 nmol) in extrem reinem (nanopure) Wasser (100 ml) in einem 250 ml Dreihalskolben gelöst waren, wurde Natriumcitrat (0,2 g) zu der Nanopartikellösung hinzugegeben. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, wobei dann die Gold-Schale-Stammlösungen 1 und 2 (siehe unten) gleichzeitig zu der Reaktionslösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 μl-200 μl/min zugetropft wurden. Nachdem eine ausreichende Menge der Stammlösungen 1 und 2 hinzugegeben war (etwa 5% Überschuss), wurde die Reaktionslösung für weitere 30 min auf 0°C gehalten. Anschließend wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur erwärmt. Abgetrennt von der Lösung durch Centricon-Filtration wurden CdSe (oder CdS)/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel erhalten.
  • Die Gold-Schale-Stammlösungen wurde wie folgt hergestellt: Stammlösung 1, HAuCl4·3H2O (4,1 mg) wurde in extrem reinem (nanopure) Wasser (5 ml) gelöst; Stammlösung 2, NaBH4 (7,4 mg) wurde bei 0°C in extrem reinem (nanopure) Wasser (5 ml) gelöst und bei 0°C zur Verwendung aufbewahrt.
  • Literaturhinweise
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Claims (23)

  1. Kern/Schale-Nanopartikel umfassend: (a) einen inneren Metall-enthaltenden Kern, welcher eine Oberflächenplasmonresonanzbande aufweist; und (b) eine äußere nicht-legierende Goldschale, welche den Kern direkt umgibt, wobei die Goldschale eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 2 Monolagen aufweist, und wobei der Kern des Kern/Schale-Nanopartikels keine Rotverschiebung und keine Verbreiterung der Oberflächenplasmonresonanzbande relativ zur Oberflächenplasmonresonanzbande eines Kerns, umgeben von einer legierten Goldschale, aufweist.
  2. Kern/Schale-Nanopartikel, wobei der Kern ein magnetischer Kern oder ein Halbleiterkern ist.
  3. Kern/Schale-Nanopartikel gemäß Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend Oligonukleotide, welche an der Goldschale anhaften, und somit ein Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugat bilden.
  4. Kern/Schale-Nanopartikel gemäß Anspruch 3, wobei die Oligonukleotide eine Sequenz komplementär zu einem Teil einer Sequenz einer Zielnukleinsäure aufweisen.
  5. Kern/Schale-Nanopartikel gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der innere Metall-enthaltende Nanopartikelkern ausgewählt ist aus Silber, Pt, Fe, Co und Ni; FePt oder FeAu; einem Metalloxid; Fe3O4 oder Co3O4; CdSe oder CdS; und einem Halbleiter.
  6. Kern/Schale-Nanopartikel gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Goldschale eine Dicke von etwa 1 Monolage aufweist.
  7. Nanostruktur, umfassend Kern/Schale-Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
  8. Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Oberflächenplasmon-Absorptionsmaximum bei 500 bis 530 mm liegt.
  9. Verfahren zur Herstellung von Kern/Schale-Nanopartikeln gemäß den Ansprüchen 3 bis 7, wobei die Oligonukleotide in einem schrittweisen Vergütungsprozess an die Nanopartikel angelagert werden, umfassend (i) In-Kontakt-Bringen der Oligonukleotide mit den Nanopartikeln in einer ersten wässrigen Lösung für eine Zeitspanne, die ausreicht, um einige der Oligonukleotide an die Nanopartikel binden; (ii) Zufügen von mindestens einem Salz zu der wässrigen Lösung, um eine zweite wässrige Lösung zu erzeugen; und (iii) In-Kontakt-Bringen der Oligonukleotide und Nanopartikel in der zweiten wässrigen Lösung für eine weitere Zeitspanne, um weiteren Oligonukleotiden das Anbinden an die Nanopartikel zu erlauben.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Oligonukleotide eine Einheit enthalten, umfassend eine funktionelle Gruppe, welche an ein Nanopartikel binden kann.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das gesamte Salz in einem einzigen Zugabeschritt das Wasser zugefügt wird.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das gesamte Salz allmählich mit der Zeit zugefügt wird.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Salz ausgewählt ist aus Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumacetat, Ammoniumacetat, einer Kombination von zwei oder mehr dieser Salze, einem dieser Salze in einem Phosphatpuffer und einer Kombination von zwei oder mehr dieser Salze in einem Phosphatpuffer.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate hergestellt werden, die die Oligonukleotide auf der Oberfläche der Nanopartikel mit einer Oberflächendichte aufweisen, die ausgewählt ist aus mindestens 10 Picomol/cm2; mindestens 15 Picomol/cm2; und von 15 Picomol/cm2 bis 40 Picomol/cm2.
  15. Verfahren zur Herstellung von Kern/Schale-Nanopartikeln gemäß den Ansprüchen 1-2, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von inneren Metall-enthaltenden Nanopartikelkernen; (b) Behandeln der inneren Metall-enthaltenden Nanopartikelkerne gleichzeitig mit einer Lösung umfassend ein Goldsalz und einer Lösung umfassend ein Reduktionsmittel bei 0°C, um eine nicht-legierende Goldschale, welche die Nanopartikelkerne umgibt, herzustellen; und (c) Isolieren der Kern/Schale-Nanopartikel.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Goldsalz HAuCl4, NaAuC14, KAuC14 oder KAu(CN)2 umfasst.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei das Reduktionsmittel NaBH4 oder Ascorbinsäure umfasst.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 15 bis 17, wobei das Goldsalz und das Reduktionsmittel in einem Verhältnis im Bereich von 1:2 bis 1:20 vorhanden sind.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die gleichzeitige Zugabe der Lösung umfassend ein Goldsalz und der Lösung umfassend ein Reduktionsmittel zu einer Lösung, welche Metall-enthaltende Nanopartikelkerne enthält, in einer solchen Weise stattfindet, dass die Konzentration des Goldsalzes bei etwa 2 μM gehalten wird.
  20. Verfahren zum Nachweis von an eine Oberfläche gebundener Nukleinsäure, umfassend: (a) In Kontakt bringen der Oberfläche mit einer Lösung umfassend Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate gemäß Anspruch 3, wobei das In-Kontakt-Bringen unter Bedingungen stattfindet, die eine effektive Hybridisierung der Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate mit der gebundenen Nukleinsäure zulassen; (b) Einbringen des Nanopartikel-Konjugats in ein externes Magnetfeld, um eine beschleunigte Bewegung des Nanopartikel-Konjugats zur Oberfläche zu erreichen, um die Wechselwirkung zwischen dem Nanopartikel-Konjugat und der Nukleinsäure zu fördern; (c) Entfernen aller Nanopartikel-Konjugate von der Oberfläche, welche nicht mit der Nukleinsäure hybridisiert sind; und (d) Beobachten einer nachweisbaren Änderung, hervorgebracht durch die Hybridisierung der Nukleinsäure mit den Nanopartikel-Konjugaten.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugat Fe3O4/Gold-Kern/Schale-Nanopartikel umfasst.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 20 oder 21, wobei Schritt (c) ausgeführt wird durch Spülen der Oberfläche mit einer Waschlösung oder Umkehren des Magnetfelds.
  23. Verfahren des Nachweises eines Ziel-Analyten, der an die Oberfläche gebunden ist, umfassend: (a) Bereitstellen einer Oberfläche, welche einen gebundenen Zielanalyten beinhaltet; (b) In Kontakt bringen der Oberfläche mit einer Lösung umfassend das Kern/Schale-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugat gemäß Anspruch 3, wobei die Oligonukleotide zusätzlich mit einem Rezeptor funktionalisiert sind und wobei der Rezeptor spezifisch an den Analyten bindet, wobei das In-Kontakt-Bringen unter Bedingungen stattfindet, die eine effektive Bindung der Nanopartikel-Konjugate mit dem gebundenen Ziel-Analyten zulassen; (c) Einbringen des Nanopartikel-Konjugats in ein externes Magnetfeld, um eine beschleunigte Bewegung des Nanopartikel-Konjugats zur Oberfläche zu erreichen, um die Bindungswechselwirkung zwischen dem Nanopartikel-Konjugat und dem Ziel-Analyten zu fördern; (d) Entfernen aller Nanopartikel-Konjugate von der Oberfläche, welche nicht an den Ziel-Analyten gebunden sind; und (e) Beobachten einer nachweisbaren Änderung, hervorgebracht durch die Bindungswechselwirkung des Ziel-Analyten mit den Nanopartikel-Konjugaten.
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