CN102380335B - 核壳型水凝胶胶体晶体微球及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核壳型水凝胶胶体晶体微球,其特征在于所述微球呈核壳结构,核为含有水凝胶的胶体晶体微球,壳为反蛋白石结构的水凝胶;所述核壳型水凝胶胶体晶体微球通过如下方法制备:以胶体晶体微球为模板,将水凝胶前体填充至胶体晶体微球纳米粒子之间的孔隙内,当水凝胶凝胶化之后剥离出微球,再利用溶剂从外向内逐步腐蚀微球内的胶体纳米粒子获得核壳型水凝胶胶体晶体微球。该微球可以应用于细胞培养及蛋白质、核酸、细胞等多元检测技术领域中。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种核壳型胶体晶体水凝胶的制备方法,该种微球可应用于生物分子的多元检测,如核酸,蛋白质还可应用于细胞培养及细胞的多元检测中。
背景技术
随着人类基因组计划的完成,人类进入了后基因组时代。后基因组时代的一个显著特点就是要研究大量的蛋白与核酸之间,蛋白质与蛋白质之间,蛋白质和药物之间的相互作用。除此之外,人们也逐渐将研究转入到了细胞领域,细胞是生物分子有机的组合体,研究细胞可以发现一些单纯生物分子研究所无法解释的科学问题,细胞毒性或者一些复杂的细胞生物学。然而这一系列复杂的问题光靠采用传统的实验方法几乎是不可能的,因此需要一种高通量的试验平台。高通量的实验平台则要求有高通量的分子载体,来标识不同的分子或细胞之间发生的不同相互作用,即所谓的编码过程。
以胶体晶体微球为载体的液相芯片技术在生物分析以及蛋白质、基因、药物筛选中得到了越来越多的运用。相对于其他形式的载体,胶体晶体微球具有显著的优势:第一,微球的比表面积大,能够增加有效反应表面积与体积之比,因此可以使表面的化学反应在更小的体积内进行;第二,采用微球作为载体可以利用一些其他辅助手段如搅拌、液体冲刷等实现一种介于固-液反应和液-液反应之间的反应体系,从而加快体系的反应速度;第三,微球依靠光子晶体固有的反射峰作为其编码方式,编码方式简单,稳定,并且便于解码。第四,随着微球表面功能化基团的改变,可以扩展微球的用途。例如将光子晶体和水凝胶结合起来作为载体进行编码成为高通量筛选以及组合化学等领域关注的热点。
在胶体晶体微球载体中扩展水凝胶后,可以赋予微球新的优势:第一,水凝胶的比表面积大,因此可以使表面的化学反应更容易进行;第二,可以控制水凝胶收缩和舒张来控制其体积,以扩展其用途;第三,以水凝胶为载体可以保持蛋白的活性,提高检测的稳定性;第四,随着水凝胶表面功能化基团的改变,可以扩展水凝胶的用途。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备核壳型胶体晶体水凝胶微球的方法,其制备简单,成本低廉,壳层厚度均匀且可控,可重复性好。
为了解决现有技术中的这些问题,本发明提供的技术方案是:
一种核壳型水凝胶胶体晶体微球,其特征在于所述微球呈核壳结构,核为含有水凝胶的胶体晶体微球,壳为反蛋白石结构的水凝胶;所述核壳型水凝胶胶体晶体微球通过如下方法制备:以胶体晶体微球为模板,将水凝胶前体填充至胶体晶体微球纳米粒子之间的孔隙内,当水凝胶凝胶化之后剥离出微球,再利用溶剂从外向内逐步腐蚀微球内的胶体纳米粒子获得核壳型水凝胶胶体晶体微球。
优选的,所述胶体纳米粒子选自二氧化硅胶体粒子、二氧化钛胶体粒子、聚苯乙烯类聚合物胶体粒子中的一种或两种以上的任意混合,所述胶体粒子的粒径范围在50nm-1000nm之间。
优选的,所述水凝胶选自天然型水凝胶或合成水凝胶;所述天然型水凝胶选自海藻酸钙、琼脂糖、胶原、壳聚糖的一种或两种以上的任意混合;所述合成水凝胶选自HEMA、PEG、丙烯酰胺、NIPAM的一种或两种以上的任意混合。
本发明的另一目的在于提供一种核壳型水凝胶胶体晶体微球的制备方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
(1)制备胶体晶体微球模板:单分散的胶体晶体纳米粒子加去离子水稀释,利用微流控装置使胶体溶液在连续相中被剪切成单分散的液滴,固化液滴模板,清洗,煅烧之后,即可获得胶体晶体微球;
(2)将胶体晶体微球进行亲水处理后,氮气吹干,将微球投入水凝胶聚合前体溶液中,当微球的颜色从白色变为透明时固化水凝胶,然后将水凝胶浸泡在去离子水中,根据微球内外不同的膨胀程度从水凝胶中剥离胶体晶体微球;
(3)将胶体晶体微球投至调配好的腐蚀剂中,部分除去胶体粒子模板;即获得核壳型水凝胶胶体晶体微球。
优选的,所述方法中使用的微流控装置选自协流式或汇聚式微流控装置,微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、PDMS的一种或两种以上的任意组合。
优选的,所述方法中使用的胶体溶液选自二氧化硅胶体粒子溶液、二氧化钛胶体粒子溶液、聚苯乙烯类聚合物胶体粒子溶液中的一种或两种以上的任意混合,胶体粒子的粒径控制在50nm-1000nm之间。
优选的,所述方法中步骤(3)中去除液滴模板的腐蚀剂选自氢氟酸、NaOH或焦硫酸钾、四氢呋喃溶液的一种。
本发明的又一目的在于提供一种核壳型水凝胶胶体晶体微球在细胞培养及蛋白质、核酸及细胞的多元检测方面的应用。
优选的,进行检测应用时,所述微球壳体的水凝胶结构与生物分子结合或反应,微球内核的胶体晶体的反射峰可用于生物分子编码。
优选的,进行检测应用时,所述微球的壳体水凝胶固定待测的蛋白或核酸分子或所述微球的壳体水凝胶粘附待测的细胞进行生长繁殖。
本发明利用胶体晶体微球为模板,将水凝胶填充至胶体晶体微球内纳米粒子孔隙之间,部分地去除模板后,即可形成核壳型的水凝胶胶体晶体微球,是一种能符合细胞培养,蛋白质,核酸,细胞多元检测以及药物筛选等载体要求的复合微球。本发明利用微流控技术制备液滴模板,经过固化、清洗后可得到单分散较好的胶体晶体微球。以微球为模板把水凝胶填充至整个胶体晶体微球内的纳米粒子孔隙之间,并且去除部分模板,即可形成符合细胞培养以及蛋白质、基因、细胞、药物筛选等载体要求的聚合物微球。
本发明进行制备核壳型水凝胶胶体晶体微球的方法包括采用胶体晶体微球为模板,将水凝胶前体填充至胶体晶体微球纳米粒子之间的孔隙内,待水凝胶凝胶化之后剥离出微球,再利用溶剂逐步腐蚀微球内的胶体纳米粒子,即可形成核壳型的水凝胶胶体晶体微球,该微球能符合细胞培养及蛋白质、核酸、细胞等多元检测的要求。所述方法包括以下步骤:
1)单分散的胶体晶体纳米粒子加去离子水稀释,利用微流控装置使胶体溶液在连续相中被剪切成单分散的液滴,固化液滴模板,清洗,煅烧之后,即可获得胶体晶体微球。
2)亲水处理胶体晶体微球后,氮气吹干,将微球投入水凝胶聚合前体溶液中。当微球从白色变为透明时固化水凝胶。接着将水凝胶浸泡在溶液中,根据微球内外不同的膨胀程度,将微球从水凝胶中剥离出来。
3)将胶体晶体微球投至一定浓度的腐蚀剂中,部分除去胶体粒子模板得到核壳型水凝胶胶体晶体微球。
核壳型水凝胶胶体晶体微球的外层就是单纯的反结构水凝胶,内核就是含有水凝胶的胶体晶体微球。该核壳型水凝胶胶体晶体微球具有生物学应用。制备的核壳型水凝胶胶体晶体微球,其壳层的厚度均匀、可控,并且与试剂的浓度及腐蚀时间有关。核壳型水凝胶胶体晶体微球可用于细胞培养及蛋白质、核酸及细胞的多元检测中。核壳型水凝胶胶体晶体微球外层的水凝胶结构可用来与生物分子结合或反应,内核的胶体晶体的反射峰可用于生物分子编码。核壳型水凝胶胶体晶体微球进行生物学应用时,待测的蛋白或核酸分子可固定在外层的水凝胶中,待测的细胞可粘附生长于水凝胶网格上。
相对于现有技术中的方案,本发明的优点是:
本发明核壳型水凝胶胶体晶体微球利用内核的光子晶体的反射峰位置作为编码,随着胶体粒子尺寸不同,反射峰的位置可以整个可见光区域,甚至可以是红外或紫外区域。本发明核壳型水凝胶胶体晶体微球壳层水凝胶的折射率较大时,可以形成双峰编码。一个是内核的光子晶体的反射峰,一个是壳层反结构水凝胶的反射峰,可以增加编码量。
本发明核壳型水凝胶胶体晶体微球壳层由水凝胶组成,水凝胶的比表面积比较大,满足适合高灵敏度载体的要求,能获得高的检测灵敏度。当壳层水凝胶为天然性水凝胶时,由于其良好的生物相容性,不仅可适用于生物分析,还可用于细胞培养及细胞多元检测等领域。由于光子晶体的反射结构,载体表面对荧光标记的荧光的吸收降低,所以能够提高荧光的强度和检测反应的灵敏度。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1为核壳型水凝胶胶体晶体微球制备方法流程图。其中1为胶体晶体微球模板;2为水凝胶填充后的胶体晶体微球;3为腐蚀后形成的核壳型水凝胶胶体晶体微球。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解,这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1核壳型海藻酸钙SiO2胶体晶体微球制备:
1.有序胶体晶体微球的制备:将单分散的SiO2纳米粒子加去离子水调节浓度至20%-30%;利用玻璃微流控装置使胶体溶液在流动相中剪切成单分散的液滴,将液滴模板置于烘箱60℃干燥固化,去除表面或内部的杂质后,置于马弗炉中800℃煅烧3h。
2.海藻酸钙水凝胶填充:首先将制备好的SiO2胶体晶体微球进行亲水处理,浸泡在体积比为70%和30%的浓硫酸和双氧水的混合液中12h以使微球表面羟基化。在以超纯水反复清洗并用氮气吹干后,胶体晶体微球即可被浸泡在浓度为1%-3%(w/v)海藻酸钠水凝胶聚合前体溶液中,至微球从白色变为彩色,吸出多余的海藻酸钠溶液,加入足量的2%(w/v)的CaCl2溶液,几分钟后,海藻酸钠溶液可凝胶化。然后将海藻酸钙水凝胶浸泡至去离子水中,由于微球内外不同的膨胀系数,在微球表面会形成缝隙,很容易就可以将微球从水凝胶中剥离出来。
3.部分模板去除:将完全剥离后的填充有海藻酸钙的SiO2微球浸泡至HF溶液中,HF溶液可从外向内均匀腐蚀SiO2粒子,根据腐蚀时间的不同,可形成不同厚度的核壳型海藻酸钙二氧化硅微球。
实施例2核壳型琼脂糖聚苯乙烯胶体晶体微球的制备:
1.有序胶体晶体微球的制备:将单分散的PS纳米粒子加去离子水调节浓度至20%-30%;利用玻璃微流控装置使胶体溶液在流动相中剪切成单分散的液滴,将液滴模板置于烘箱60℃干燥固化,去除表面或内部的杂质后,置于马弗炉中800℃煅烧3h。
2.琼脂糖水凝胶填充:首先将制备好的PS胶体晶体微球进行亲水处理,浸泡在体积比为70%和30%的浓硫酸和双氧水的混合液中12h以使微球表面羟基化。在以超纯水反复清洗并用氮气吹干后,PS微球即可被浸泡在浓度为1%-5%(w/v)琼脂糖水凝胶聚合前体溶液中并保持70℃以上的水浴,至微球从白色变为彩色,吸出多余的琼脂糖溶液,冷却至琼脂糖凝胶化。然后将琼脂糖水凝胶浸泡至去离子水溶液中,由于微球内外不同的膨胀系数,在微球表面会形成缝隙,可迅速将微球从水凝胶中剥离出来。
3.部分模板去除:将完全剥离后的填充有琼脂糖的PS微球浸泡至四氢呋喃溶液中,HF溶液可从外向内均匀腐蚀PS粒子,根据腐蚀时间的不同,可形成不同厚度的核壳型琼脂糖聚苯乙烯微球。
实施例3核壳型PEGDA的SiO2胶体晶体微球的制备:
1.有序胶体晶体微球的制备:类似实施例1。
2.PEGDA水凝胶的填充:首先将制备好的SiO2胶体晶体微球进行亲水处理,浸泡在体积比为70%和30%的浓硫酸和双氧水的混合液中12h以使微球表面羟基化。在以超纯水反复清洗并用氮气吹干后,胶体晶体微球即可被浸泡在一定浓度并掺有1%的光引发剂的PEGDA水凝胶聚合前体溶液中,至微球从白色变为彩色,吸出多余PEGDA溶液,待强紫外照射1-2min后,PEGDA溶液可凝胶化。然后将PEGDA水凝胶浸泡至去离子水溶液中,很方便将微球剥离出来。
3.部分模板去除:类似实施例1。
实施例4核壳型海藻酸钙二氧化硅微球用于细胞多元检测
1.核壳型海藻酸钙二氧化硅微球制备及灭菌:根据选取SiO2的不同尺寸,制备6种不同反射峰的核壳型海藻酸钙二氧化硅微球,并将其浸泡于75%酒精溶液中过夜,再用无菌的PBS(7.4)反复清洗,并浸泡在PBS中。
2.细胞接种:将6种无菌的核壳型海藻酸钙二氧化硅微球分别置于六孔板中,将6种已消化好的细胞分别接种至六孔板的六个孔中。将其置于细胞培养箱(37℃,5%CO2),培养24-48h。
3.细胞混合:经过培养之后,当观察到细胞已粘附生长于壳层海藻酸钙表面时,将6个孔中的细胞混合至一个新孔中。
4.加药:在新孔中加入药物,继续培养24h。
5.检测:将细胞进行染色,根据荧光强度的强弱,可判断细胞的存活率;根据反射光谱,可进行解码,最后可以同时得到药物对不同细胞的不同作用。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种核壳型水凝胶胶体晶体微球,其特征在于所述微球呈核壳结构,核为含有水凝胶的胶体晶体微球,壳为反蛋白石结构的水凝胶;所述核壳型水凝胶胶体晶体微球通过如下方法制备:以胶体晶体微球为模板,将水凝胶前体填充至胶体晶体微球纳米粒子之间的孔隙内,当水凝胶凝胶化之后剥离出微球,再利用溶剂从外向内逐步腐蚀微球内的胶体纳米粒子获得核壳型水凝胶胶体晶体微球;具体是将胶体晶体微球进行亲水处理后,氮气吹干,将微球投入水凝胶聚合前体溶液中,当微球的颜色从白色变为透明时固化水凝胶,然后将水凝胶浸泡在去离子水中,根据微球内外不同的膨胀程度从水凝胶中剥离胶体晶体微球;然后将胶体晶体微球投至调配好的腐蚀剂中,部分除去胶体粒子模板;即获得核壳型水凝胶胶体晶体微球;所述胶体纳米粒子选自二氧化硅胶体粒子、二氧化钛胶体粒子、聚苯乙烯类聚合物胶体粒子中的一种或两种以上的任意混合,所述胶体粒子的粒径范围在50nm-1000nm之间;所述胶体晶体微球模板通过以下方式制备:单分散的胶体晶体纳米粒子加去离子水稀释,利用微流控装置使胶体溶液在连续相中被剪切成单分散的液滴,固化液滴模板,清洗,煅烧之后,即可获得胶体晶体微球;所述水凝胶选自天然型水凝胶或合成水凝胶;所述天然型水凝胶选自海藻酸钙、琼脂糖、胶原、壳聚糖的一种或两种以上的任意混合;所述合成水凝胶选自HEMA、PEG、丙烯酰胺、NIPAM的一种或两种以上的任意混合。
2.一种权利要求1所述的核壳型水凝胶胶体晶体微球的制备方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
(1)制备胶体晶体微球模板:单分散的胶体晶体纳米粒子加去离子水稀释,利用微流控装置使胶体溶液在连续相中被剪切成单分散的液滴,固化液滴模板,清洗,煅烧之后,即可获得胶体晶体微球;
(2)将胶体晶体微球进行亲水处理后,氮气吹干,将微球投入水凝胶聚合前体溶液中,当微球的颜色从白色变为透明时固化水凝胶,然后将水凝胶浸泡在去离子水中,根据微球内外不同的膨胀程度从水凝胶中剥离胶体晶体微球;
(3)将胶体晶体微球投至调配好的腐蚀剂中,部分除去胶体粒子模板;即获得核壳型水凝胶胶体晶体微球。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述方法中使用的微流控 装置选自协流式或汇聚式微流控装置,微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、PDMS的一种或两种以上的任意组合。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述方法中使用的胶体溶液选自二氧化硅胶体粒子溶液、二氧化钛胶体粒子溶液、聚苯乙烯类聚合物胶体粒子溶液中的一种或两种以上的任意混合,胶体粒子的粒径控制在50nm-1000nm之间。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述方法中步骤(3)中去除液滴模板的腐蚀剂选自氢氟酸、NaOH或焦硫酸钾、四氢呋喃溶液的一种。
6.一种权利要求1所述的核壳型水凝胶胶体晶体微球在细胞培养及蛋白质、核酸及细胞的多元检测方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于进行检测应用时,所述微球壳体的水凝胶结构与生物分子结合或反应,微球内核的胶体晶体的反射峰可用于生物分子编码。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于进行检测应用时,所述微球的壳体水凝胶固定待测的蛋白或核酸分子或所述微球的壳体水凝胶粘附待测的细胞进行生长繁殖。
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