CN103175957A - 一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，包括以下步骤：角度无偏的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤；分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤；检测步骤；通过上述方法，本发明的检测方法具有灵敏度高，特异性好，操作简单、检测成本低廉等优点。

Description

一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法

技术领域

本发明涉及一种非标记可视化检测方法领域，特别是涉及一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法。

背景技术

随着现代分析技术的飞速发展，近年来生物分析的一个重要发展方向是开发低成本的实时在线检测方法。可视化检测无需高精的仪器而直接将化学物质的信息转化为视觉可观察的信号，是最为简单直观的检测方法之一。目前常用的可视化检测方法主要是基于染料、酶及纳米金等所引起的颜色变化来实现。在所有用于可视化检测的材料中，胶体晶体由于其独特的光学特性而受到了广泛关注，任何能够引起材料折射率或晶格常数变化的因素都能导致胶体晶体反射峰或颜色的变化。1998年Asher小组首次将胶体晶体与刺激响应性水凝胶相结合制备得到的智能胶体晶体凝胶，是目前最具潜力的一类可视化检测材料。许多胶体晶体凝胶可视化传感器（如pH，离子，温度，湿度及生物分子等）都被成功应用。经过十多年的长足发展，胶体晶体凝胶可视化传感器已取得了巨大的成就，然而，胶体晶体结构色及反射峰强烈的角度依赖性是目前其在可视化检测发展中的瓶颈之一。

为了解决胶体晶体观察视角的依赖性，围绕可用于可视化检测的角度无偏的胶体晶体展开了大量的研究工作。如Lee等制备了Fe3O4SiO2的短程有序的准无定形胶体晶体材料，并实现了其在可见波段区角度无偏的全彩调节。Watanabe课题组受自然界中许多生物的纳米结构启发，同样制备了一种角度无偏的具有短程有序结构的胶体晶体。虽然上述材料解决了胶体晶体的视角问题，但是这些材料都采用了牺牲有序性来获得其角度无偏性。在实际应用中，胶体晶体有序性的降低会导致反射峰的变宽以及颜色鲜亮度的下降，而这些都不利于可视化检测的开展。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是以胶体晶体为载体的非标记可视化检测的角度依赖性缺点，提供一种以角度无偏的胶体晶体凝胶为载体的非标记可视化检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，包括以下步骤：

首先，角度无偏的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤：

将胶体晶体微球加入水凝胶前聚体溶液中，加入引发剂，灌入模具，将胶体晶体微球铺成均匀的薄膜，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对水凝胶前聚体溶液进行固化，即得蛋白石结构的胶体晶体水凝胶薄膜，将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于HF酸溶液中去除胶体晶体微球模版，2h后取出用纯水洗涤后保存与纯水中；

其次，分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤：

通过化学键偶联方法将分子识别单元偶联在所述胶体晶体水凝胶薄膜上，制成分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体凝胶薄膜的反射光谱；

再次，检测步骤：

将得到的检测用的胶体晶体凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行特异性结合反应，反应完毕，洗涤后比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。

在本发明一个较佳实施例中，所述胶体晶体凝胶薄膜为载体，所述胶体晶体凝胶薄膜由光学各项同性的胶体晶体微球构成。

在本发明一个较佳实施例中，所述分子识别单元是抗原抗体、核酸适体、RNA适体或酶中的一种。

在本发明一个较佳实施例中，所述分子识别单元是抗原抗体、核酸适体、RNA适体或酶中的一种。

在本发明一个较佳实施例中，所述的胶体晶体微球以二氧化硅纳米或聚苯乙烯纳米粒子为材料制成。

在本发明一个较佳实施例中，所述的水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一种或多种。  

在本发明一个较佳实施例中，所述化学键偶联方法是氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应中的一种或多种组合。

在本发明一个较佳实施例中，所述的待测物质为离子、药物分子、毒品分子、添加剂、小分子、神经递质、激素、蛋白质、酶、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的一种。

本发明的有益效果是：本发明的方法以角度无偏的胶体晶体凝胶为载体来实现非标记可视化检测，该凝胶膜从各个方向观察颜色相同，不受操作人观察视角的限制，极大地减小了操作者的操作误差。

附图说明

图1是本发明以角度无偏的胶体晶体凝胶制备过程示意图

附图中各部件的标记如下：1、胶体晶体微球。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

请参阅图1，本发明实施例提供如下技术方案

在一个实施例中，提供一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，包括以下步骤：

首先，角度无偏的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤：

将胶体晶体微球1加入水凝胶前聚体溶液中，加入引发剂，灌入模具，将胶体晶体微球1铺成均匀的薄膜，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对水凝胶前聚体溶液进行固化，即得蛋白石结构的胶体晶体水凝胶薄膜，将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于HF酸溶液中去除胶体晶体微球1模版，2h后取出用纯水洗涤后保存与纯水中；

其次，分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤：

通过化学键偶联方法将分子识别单元偶联在所述胶体晶体水凝胶薄膜上，制成分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体凝胶薄膜的反射光谱；

再次，检测步骤：

将得到的检测用的胶体晶体凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行特异性结合反应，反应完毕，洗涤后比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。

优选的，所述胶体晶体凝胶薄膜为载体，所述胶体晶体凝胶薄膜由光学各项同性的胶体晶体微球1构成。

优选的，所述分子识别单元是抗原抗体、核酸适体、RNA适体或酶中的一种。

优选的，所述分子识别单元是抗原抗体、核酸适体、RNA适体或酶中的一种。

优选的，所述的胶体晶体微球1以二氧化硅纳米或聚苯乙烯纳米粒子为材料制成。

优选的，所述的水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一种或多种。  

优选的，所述化学键偶联方法是氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应中的一种或多种组合。

优选的，所述的待测物质为离子、药物分子、毒品分子、添加剂、小分子、神经递质、激素、蛋白质、酶、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的一种。

实施例1    角度无偏的胶体晶体凝胶检测环境水样中的重金属离子Hg2+

1 制备胶体晶体凝胶微球

将单分散的280 nm的二氧化硅纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为20%，超声分散后作为微流控中的水相。外相采用为含有表面活性剂的正十六烷。收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高微球的稳定性。

2 制备角度无偏的胶体晶体凝胶

角度无偏的胶体晶体凝胶以上述制备的胶体晶体微球1为模版，通过模版复制的方法来获得。将胶体晶体微球1加入含有光引发剂1173(0.1%，质量体积比)的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合溶液中(29:1，摩尔比)，充分浸泡后，灌入模具，经高压汞灯照射15min后得胶体晶体凝胶。将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于4%的HF溶液中2 h，获得反蛋白石结构的胶体晶体凝胶。

3 分子识别单元的修饰

将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在0.1 M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原膜后，加入两端带氨基修饰的汞离子的适体偶联制成适体修饰的胶体晶体凝胶，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体凝胶的反射光谱。

4 Hg2+检测

将制备得到的胶体晶体凝胶用三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲溶液洗涤后，在0.5 ml的Tris缓冲液中与待测水样混合，35℃反应1 h。反应完毕后，用Tris缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定环境水样中汞离子的含量。

实施例2 使用角度无偏的胶体晶体凝胶检测艾滋病病毒（HIV）

1 制备胶体晶体凝胶微球

将单分散的200 nm的二氧化硅纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为35%，超声分散后作为微流控中的水相。外相采用为含有表面活性剂的硅油。收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高微球的稳定性。

2 制备角度无偏的胶体晶体凝胶

角度无偏的胶体晶体凝胶以上述制备的胶体晶体微球1为模版，通过模版复制的方法来获得。将胶体晶体微球1加入含有光引发剂HMPP(0.1%，质量体积比)的15%的聚乙二醇双丙烯酸酯溶液中，充分浸泡后，灌入模具，经高压汞灯照射1 min后得胶体晶体凝胶。将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于4%的HF溶液中4 h，获得反蛋白石结构的胶体晶体凝胶。

3 分子识别单元的修饰

将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在0.1 M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原膜后，加入HIV抗体偶联制成抗体修饰的胶体晶体凝胶，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体凝胶的反射光谱。

4 HIV检测

将制备得到的胶体晶体凝胶用磷酸盐缓冲液洗涤后，在0.5 ml的磷酸盐缓冲液中与待测血样混合，35℃反应1 h。反应完毕后，用磷酸盐缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体凝胶的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定HIV的含量。

实施例3 使用角度无偏的胶体晶体凝胶检测尿素

1 制备胶体晶体凝胶微球

将单分散的180 nm的二氧化硅纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为30%，超声分散后作为微流控中的水相。外相采用为含有表面活性剂的正十六烷。收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高微球的稳定性。

2 制备角度无偏的胶体晶体凝胶

角度无偏的胶体晶体凝胶以上述制备的胶体晶体微球1为模版，通过模版复制的方法来获得。将胶体晶体微球1加入含有光引发剂HMPP(0.1%，质量体积比)的聚乙二醇双丙烯酸酯与丙烯酸的溶液中，充分浸泡后，灌入模具，经高压汞灯照射8 min后得胶体晶体凝胶。将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于2%的HF溶液中2 h，获得反蛋白石结构的胶体晶体凝胶。

3 分子识别单元的修饰

将第一步所制备的胶体晶体凝胶膜在0.1 M的NaOH（10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）溶液中还原1h后，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液洗涤，在MES缓冲液中加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化还原膜后，加入尿素酶偶联制成尿素酶修饰的胶体晶体凝胶，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体凝胶的反射光谱。

4 尿素的检测

将制备得到的胶体晶体凝胶用磷酸盐缓冲液洗涤后，在0.5 ml的磷酸盐缓冲液中与待测尿样混合，35℃反应0.5 h。反应完毕后，用磷酸盐缓冲液洗涤，根据反应前后胶体晶体凝胶的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定尿素的含量。

实施例4 使用角度无偏的胶体晶体凝胶检测环境温度

1 制备胶体晶体凝胶微球

将单分散的160 nm的聚苯乙烯纳米粒子进行离心纯化，调节纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的质量百分数为50%，超声分散后作为微流控中的水相。外相采用为含有表面活性剂的正十六烷。收集产生的液滴，待其加热固化后，放入马弗炉内进行800℃煅烧以提高微球的稳定性。

2 制备角度无偏的胶体晶体凝胶

角度无偏的胶体晶体凝胶以上述制备的胶体晶体微球1为模版，通过模版复制的方法来获得。将胶体晶体微球1加入含有热引发剂过硫酸铵及N,N,N',N'-四甲基乙二胺(0.1%，质量体积比)的N-异丙基丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合溶液中(29:1，摩尔比)，充分浸泡后，灌入模具，经室温聚合30 min后得胶体晶体凝胶。将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落。

4 温度的检测

将制备得到的胶体晶体凝胶置于待测温度的环境中，根据胶体晶体凝胶的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶的反射光谱，确定温度。

本发明通过单分散的胶体晶体微球的球形对称结构，该凝胶膜从各个方向观察颜色相同，不受操作人观察视角的限制，极大地减小了操作者的操作误差。效果。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

首先，角度无偏的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤：

将胶体晶体微球加入水凝胶前聚体溶液中，加入引发剂，灌入模具，将胶体晶体微球铺成均匀的薄膜，经紫外光照射聚合或烘箱内通过热固化法对水凝胶前聚体溶液进行固化，即得蛋白石结构的胶体晶体水凝胶薄膜，将所得到的胶体晶体水凝胶薄膜从模具上剥落，洗涤后置于HF酸溶液中去除胶体晶体微球模版，2h后取出用纯水洗涤后保存与纯水中；

其次，分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜的制备步骤：

通过化学键偶联方法将分子识别单元偶联在所述胶体晶体水凝胶薄膜上，制成分子识别单元修饰的胶体晶体凝胶薄膜，将制备好的薄膜用磷酸缓冲液洗涤之后，测定胶体晶体凝胶薄膜的反射光谱；

再次，检测步骤：

将得到的检测用的胶体晶体凝胶薄膜在缓冲溶液中与待测样品混合进行特异性结合反应，反应完毕，洗涤后比较反应前后胶体晶体水凝胶薄膜的颜色或通过测定胶体晶体水凝胶薄膜的反射光谱，确定待测物质的含量。

2.根据权利要求1所述的基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，所述胶体晶体凝胶薄膜为载体，所述胶体晶体凝胶薄膜由光学各项同性的胶体晶体微球构成。

3.根据权利要求1所述的基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，所述分子识别单元是抗原抗体、核酸适体、RNA适体或酶中的一种。

4.根据权利要求1所述的基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，所述的胶体晶体微球以二氧化硅纳米或聚苯乙烯纳米粒子为材料制成。

5.根据权利要求1所述的基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，所述的水凝胶前聚体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、醋酸丁酸纤维素、硅氧烷甲基丙烯酸酯、氟硅甲基丙烯酸酯、全氟醚、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，所述化学键偶联方法是氨基与氨基的反应、氨基与羧基的反应或羧基与羟基的反应中的一种或多种组合。

7.根据权利要求1所述的基于胶体晶体凝胶的角度无偏的可视化检测方法，其特征在于，所述的待测物质为离子、药物分子、毒品分子、添加剂、小分子、神经递质、激素、蛋白质、酶、抗原抗体、细胞因子、生长因子、肿瘤标志物或各种生物分子中的一种。

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