DE60037139T4

DE60037139T4 - Polyhydroxylierte aromatischen verbindungen für die behandlung von amyloidosis und alpha-synuclein fibril krankheiten

Info

Publication number: DE60037139T4
Application number: DE60037139T
Authority: DE
Inventors: Gerardo M. Seattle CASTILLO; Paula Y. Bothell CHOI; Alan D. Lynnwood SNOW
Original assignee: ProteoTech Inc
Current assignee: ProteoTech Inc
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2009-11-19
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: JP2009001589A; US20110065657A1; ATE378043T1; EP1244435B9; WO2001049281A2; DK1244435T3; US20070191330A1; CA2686468C; JP5366473B2; DK1244435T5; US20010047032A1; CA2392709C; DE60037139D1; JP4370072B2; EP1244435A2; DE60037139T2; WO2001049281A3; US20040152760A1; EP1244435B1; ES2295078T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von bestimmten polyhydroxylierten aromatischen Verbindungen und Zusammensetzungen, welche diese enthalten, für die Behandlung einer Amyloidose, insbesondere für Morbus Alzheimer.
Beschreibung des Standes der Technik
Amyloid und Amyloidose
Amyloid ist eine allgemeine Bezeichnung, die sich auf eine Gruppe von unterschiedlichen, jedoch typischen extrazellulären Proteinablagerungen bezieht, die alle gemeinsame morphologische Eigenschaften, Färbungseigenschaften und Röntgenbeugungsspektren aufweisen. Ungeachtet der Natur des abgelagerten Amyloidproteins weisen alle Amyloide die folgenden Eigenschaften auf: 1) Sie zeigen auf der Lichtmikroskopebene ein amorphes Erscheinungsbild, das bei Verwendung von Hämatoxylin und Eosinfarben eosinophil erscheint, 2) sie färben sich mit Kongorot und zeigen bei Ansicht unter polarisiertem Licht eine rot/grüne Doppelbrechung (Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 355–364, 1962), 3) sie enthalten eine Sekundärstruktur, die überwiegend Faltblatt-Charakter aufweist und 4) sie bestehen hinsichtlich der Feinstruktur aus nicht verzweigten Fibrillen mit unbestimmter Länge und mit einem Durchmesser von 7–10 nm.
Amyloidosen werden heutzutage nach dem spezifischen abgelagerten Amyloidprotein klassifiziert. Die Amyloide umfassen, sind aber nicht beschränkt das Amyloid, das mit Morbus Alzheimer, Down-Syndrom und erblicher cerebraler Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ verbunden ist (wobei das spezifische Amyloid als Amyloidprotein Beta oder Aβ bezeichnet wird), das mit einer chronischen Entzündung, verschiedenen Formen von Malignomen und familiärem Mittelmeerfieber verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als AA-Amyloid oder als Entzündungs-assoziiertes Amyloid bezeichnet wird), das mit einem multiplen Myelom und anderen B-Zell-Dyskrasien verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als AL-Amyloid bezeichnet wird), das mit dem Typ II-Diabetes verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Amylin oder Inselamyloid bezeichnet wird), das mit den Prionenerkrankungen einschließlich der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, dem Gerstmann-Straussler-Syndrom, Kuru und Scrapie verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als PrP-Amyloid bezeichnet wird), das mit einer Langzeithämodialyse und einem Carpaltunnelsyndrom verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Beta₂-Mikroglobulin-Amyloid bezeichnet wird), das mit einer senilen Herzamyloidose und mit einer familiären Amyloid-Polyneuropathie verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Präalbumin oder Transthyretin-Amyloid bezeichnet wird) und das mit endokrinen Tumoren, wie etwa einem medullären Karzinom der Schilddrüse verbundene Amyloid (wobei das spezifische Amyloid als Varianten von Procalcitonin beschrieben wird).
Obwohl Amyloidablagerungen bei klinischen Erkrankungen gemeinsame physikalische Eigenschaften im Hinblick auf das Vorhandensein einer Beta-Faltblatt-Konformation teilen, ist nun klar, dass viele unterschiedliche chemische Typen existieren und in der Zukunft wahrscheinlich weitere Typen beschrieben werden. Gegenwärtig wird angenommen, dass es mehrere gemeinsame pathogene Mechanismen gibt, die im Allgemeinen bei einer Amyloidiose zusammenwirken können. In vielen Fällen kann ein zirkulierendes Vorläuferprotein aus einer Überproduktion entweder von intakten oder anomalen Molekülen (beispielsweise bei Plasmazell-Dyskrasien), aus einer verringerten Degradation oder Exkretion (bei einigen sekundären Amyloid-Syndromen Serum-Amyloid A und bei einer Langzeithämodialyse Beta₂-Mikroglobulin) oder aus genetischen Anomalien, die mit Proteinvarianten verbunden sind (beispielsweise familiäre Amyloid-Polyneuropathie), resultieren. Bei vielen Typen der Amyloidose tritt die Proteolyse eines größeren Proteinvorläufermoleküls auf, welche die Produktion von Fragmenten mit geringerem Molekulargewicht ergibt, die polymerisieren und als Gewebeablagerungen eine Beta-Faltblatt-Konformation annehmen, normalerweise an einer extrazellulären Stelle. Die genauen Mechanismen, die beteiligt sind und die abnormen Ursachen, die zu Veränderungen im proteolytischen Processing und/oder der translationalen Modifikation führen, sind bei den meisten Amyloiden nicht bekannt.
Systemische Amyloide, welche das mit einer chronischen Entzündung, mit verschiedenen Formen von Malignomen und familiärem Mittelmeerfieber verbundene Amyloid (d. h. das AA-Amyloid oder Entzündungs-assoziierte Amyloidose) (Benson und Cohen, Arth. Rheum. 22: 36–42, 1979; Kamei et al., Acta Path. Jpn. 32: 123–133, 1982; McAdam et al., Lancet 2: 572–573, 1975; Metaxas, Kidney Int. 20: 676–685, 1981) und das mit einem multiplen Myelom und anderen B-Zell-Dyskrasien verbundene Amyloid (d. h. AL-Amyloid) umfassen (Harada et al., J. Histochem. Cytochem. 19: 1–15, 1971), betreffen beispielsweise bekanntermaßen eine Amyloidablagerung in verschiedenen unterschiedlichen Organen und Geweben, die im Allgemeinen außerhalb des zentralen Nervensystems liegen. Eine Amyloidablagerung bei diesen Erkrankungen kann beispielsweise in der Leber, im Herz, in der Milz, im Magen-Darm-Trakt, in der Niere, der Haut und/oder den Lungen auftreten (Johnson et al., N. Engl. J. Med. 321: 513–518, 1989). Für die meisten dieser Amyloidosen gibt es keine ersichtliche Heilung oder wirksame Behandlung, und die Konsequenzen der Amyloidablagerung können für den Patienten schädlich sein. Beispielsweise kann eine Amyloidablagerung in der Niere zu einem Nierenversagen führen, während eine Amyloidablagerung im Herz zu einem Herzversagen führen kann. Bei diesen Patienten führt eine Amyloidansammlung in systemischen Organen schließlich innerhalb von 3–5 Jahren zum Tod. Andere Amyloidosen können ein einzelnes Organ oder ein Gewebe betreffen, wie dies beispielsweise bei den Aβ-Amyloidablagerungen beobachtet wird, die in den Gehirnen von Patienten mit Morbus Alzheimer und Down-Syndrom zu finden sind; bei den PrP-Amyloidablagerungen, die in den Gehirnen von Patienten mit der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, dem Gerstmann-Straussler-Syndrom und Kuru zu finden sind, bei den Ablagerungen von Inselamyloid (Amylin), die bei 90% der Patienten mit Typ II-Diabetes in den Langerhans-Inseln im Pankreas zu finden sind (Johnson et al., N. Engl. J. Med. 321: 513–518, 1989; Lab. Invest. 66: 522 535, 1992), bei den Beta₂-Mikroglobulin-Amyloidablagerungen im Medialnerv, die zum Carpaltunnelsyndrom führen, wie bei Patienten beobachtet wird, die eine Langzeithämodialyse durchlaufen (Geyjo et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 129: 701–706, 1985; Kidney Int. 30: 385–390, 1986), bei dem Präalbumin/Transthyretin-Amyloid, das in Herzen von Patienten mit einem senilem Herzamyloid beobachtet wird und bei dem Präalbumin/Transthyretin-Amyloid, das in den peripheren Nerven von Patienten mit einer familiären Amyloid-Polyneuropathie beobachtet wird (Skinner und Cohen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 99: 1326–1332, 1981; Saraiva et al., J. Lab. Clin. Med. 102: 590–603, 1983; J. Clin. Invest. 74: 104–119, 1984; Tawara et al., J. Lab. Clin. Med. 98: 811–822, 1989).
Morbus Alzheimer und die alternde Bevölkerung
Morbus Alzheimer ist bei den älteren Menschen die Hauptursache von Demenz, wobei 5–10% der Bevölkerung im Alter von mehr als 65 Jahren betroffen sind (A Guide to Understanding Alzheimer's Disease and Related Disorders, Jorm, Editor, New York University Press, New York, 1987). Bei Morbus Alzheimer degenerieren die Teile des Gehirns, die für kognitive Prozesse wie etwa Gedächtnis, Aufmerksamkeit, Sprache und logisches Denken erforderlich sind, was die Opfer vieler Eigenschaften beraubt, die uns menschlich machen, einschließlich der Unabhängigkeit. Bei manchen erblichen Formen von Morbus Alzheimer findet der Ausbruch im mittleren Lebensalter statt, aber normalerweise treten die Symptome ab Mitte 60 aufwärts auf. Morbus Alzheimer betrifft heute 4–5 Millionen Amerikaner, wobei etwas mehr als die Hälfte dieser Menschen eine Betreuung zuhause erhalten, während sich die anderen in vielen unterschiedlichen Einrichtungen der medizinischen Versorgung befinden. Die Verbreitung von Morbus Alzheimer und anderen Demenzen verdoppelt sich ab dem Alter von 65 alle fünf Jahre, und gegenwärtige Studien deuten darauf hin, dass nahezu 50% aller Menschen im Alter von 85 und älter Symptome von Morbus Alzheimer aufweisen (1999 Progress Report an Alzheimer's Disease, National Institute an Aging/National institute of Health). 13% (33 Millionen Menschen) der gesamten Bevölkerung der Vereinigten Staaten sind im Alter von 65 oder älter, und dieser Prozentsatz wird bis zum Jahr 2025 auf 20% ansteigen (1999 Progress Report an Alzheimer's Disease).
Morbus Alzheimer ist für eine Gesellschaft auch eine schwere ökonomische Belastung. Eine neuere Untersuchung schätzte, dass die Kosten für die Betreuung eines Patienten mit Morbus Alzheimer mit schweren kognitiven Beeinträchtigungen zuhause oder in einem Pflegeheim mehr als 47000 $ jährlich betragen (A Guide to Understanding Alzheimer's Disease and Related Disorders). Bei einer Erkrankung, die sich 2 bis 20 Jahre hinziehen kann, sind die Gesamtkosten der Alzheimer-Erkrankung für die Familien und für die Gesellschaft erschütternd. Die jährlichen ökonomischen Kosten von Morbus Alzheimer in den Vereinigten Staaten bezüglich der Ausgaben für Gesundheitspflege und dem Verlust von Gehältern sowohl der Patienten als auch ihren Betreuern wird auf 80 bis 100 Milliarden $ geschätzt (1999 Progress Report an Alzheimer's Disease).
Tacrinhydrochlorid („Cognex”), das erste für Morbus Alzheimer von der FDA zugelassene Arzneimittel, ist ein Acetylcholinesteraseinhibitor (Cutler und Sramek, N. Engl. J. Med. 328: 808–810, 1993). Jedoch zeigte dieses Arzneimittel beim Bewirken einer kognitiven Verbesserung bei Patienten mit Morbus Alzheimer einen eingeschränkten Erfolg und wies anfänglich schwere Nebenwirkungen wie etwa eine Lebertoxizität auf. Das zweite, vor kürzerer Zeit von der FDA zugelassene Arzneimittel Donepezil („Aricept”), das ebenso ein Acetylcholinesteraseinhibitor ist, ist wirksamer als Tacrin, zeigt eine leichte kognitive Verbesserung bei Patienten mit Morbus Alzheimer (Barner und Gray, Ann. Pharmacotherapy 32: 70–77, 1998; Rogers und Friedhoff, Eur. Neuropsych. 8: 67–75, 1998), es wird jedoch nicht angenommen, dass es ein Mittel zur Heilung ist. Deshalb ist klar, dass ein Bedarf an wirksameren Behandlungen für Patienten mit Morbus Alzheimer besteht.
Das Amyloid als therapeutisches Ziel bei Morbus Alzheimer
Morbus Alzheimer ist gekennzeichnet durch die Ablagerung und Anreicherung eines Peptids mit 39 bis 43 Aminosäuren, welches als Beta-Amyloidprotein, Aβ oder β/A4 bezeichnet wird (Glenner und Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 885–890, 1984; Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245–4249, 1985; Husby et al., Bull. WHO 71: 105–108, 1993). Aβ stammt durch Proteasespaltung von größeren Vorläuferproteinen, die Beta-Amyloid-Vorläuferproteine (oder βPP) bezeichnet werden, von welchen es mehrere alternativ gesplicte Varianten gibt. Die häufigsten Formen der βPPs umfassen Proteine, die aus 695, 751 und 770 Aminosäuren bestehen (Tanzi et al., Nature 331: 528–530, 1988; Kitaguchi et al., Nature 331: 530–532, 1988; Ponte et al., Nature 331: 525–527, 1988).
Das kleine Aβ-Peptid ist ein Hauptbestandteil, der die Amyloidablagerungen von „Plaques” in den Gehirnen von Patienten mit Morbus Alzheimer ausmacht. Außerdem ist Morbus Alzheimer gekennzeichnet durch das Vorliegen von zahlreichen neurofibrillären „Knäueln”, die aus gepaarten helikalen Filamenten bestehen, die sich im neuronalen Cytoplasma auf anormale Weise anreichern (Grundke-Iqbal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4913–4917, 1986; Kosik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4044–4048, 1986; Lee et al., Science 251: 675–678, 1991). Das pathologische Kennzeichen von Morbus Alzheimer ist deshalb das Vorliegen von „Plaques” und „Knäueln”, wobei das Amyloid im zentralen Kern der Plaques abgelagert wird. Der andere Haupttyp einer Läsion, der bei Morbus Alzheimer im Gehirn zu finden ist, ist die Anreicherung des Amyloids in den Wänden der Blutgefäße, sowohl innerhalb des Hirnparenchyms als auch in den Wänden von Hirnhautgefäßen, die außerhalb des Gehirns liegen. Die an den Wänden der Blutgefäße lokalisierten Amyloidablagerungen werden als zerebro-vaskuläres Amyloid oder kongophile Angiopathie bezeichnet (Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45: 79–90, 1986; Pardridge et al., J. Neurochem. 49: 1394–1401, 1987).
Über viele Jahre hat es eine laufende wissenschaftliche Debatte bezüglich der Bedeutung des „Amyloids” bei Morbus Alzheimer gegeben, und darüber, ob die für diese Erkrankung charakteristischen „Plaques” und „Knäuel” eine Ursache oder lediglich eine Folge der Erkrankung sind. Innerhalb der letzten paar Jahre haben Untersuchungen nun gezeigt, dass das Amyloid in der Tat ein ursächlicher Faktor für Morbus Alzheimer ist und nicht lediglich als ein unbeteiligter Zuschauer betrachtet werden sollte. In Zellkultur wurde gezeigt, dass das Aβ-Protein bei Morbus Alzheimer innerhalb eines kurzen Zeitraums eine Degeneration von Nervenzellen verursacht (Pike et al., Br. Res. 563: 311–314, 1991; J. Neurochem. 64: 253–265, 1995). Untersuchungen deuten darauf hin, dass es die fibrilläre Struktur ist (die aus einer vorherrschenden Beta-Faltblatt-Sekundärstruktur besteht), die für alle Amyloide charakteristisch ist, die welche für die neurotoxischen Wirkungen verantwortlich ist. Es wurde auch gefunden, dass Aβ in Slice-Kulturen des Hippocampus neurotoxisch ist (Harrigan et al., Neurobiol. Aging 16: 779–789, 1995) und bei transgenen Mäusen den Tod von Nervenzellen induziert (Games et al., Nature 373: 523–527, 1995; Hsiao et al., Science 274: 99–102, 1996). Die Injektion des Aβ von Morbus Alzheimer in ein Rattenhirn verursacht auch eine Beeinträchtigung des Gedächtnisses und eine neuronale Dysfunktion (Flood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3363–3366, 1991; Br. Res. 663: 271–276, 1994).
Der überzeugendste Beweis, dass das Aβ-Amyloid direkt an der Pathogenese von Morbus Alzheimer beteiligt ist, stammt wahrscheinlich von genetischen Untersuchungen. Es wurde gefunden, dass sich die Produktion von Aβ aus Mutationen des Gens ergeben kann, das für den Vorläufer, das Beta-Amyloid-Vorläuferprotein codiert (Van Broeckhoven et al., Sciene 248: 1120–1122, 1990; Murrell et al., Science 254: 97–99, 1991; Haass et al., Nature Med. 1: 1291–1296, 1995). Die Identifizierung von Mutationen im Gen des Beta-Amyloid-Vorläuferproteins, das einen frühen Ausbruch von familiärem Morbus Alzheimer verursacht, ist das stärkste Argument dafür, dass das Amyloid für den pathogenetischen Prozess, der dieser Erkrankung zugrunde liegt, wesentlich ist. Nun sind vier bekannte, die Erkrankung verursachende Mutationen gefunden worden, welche die Bedeutung von Aβ bei der Verursachung von familiärem Morbus Alzheimer zeigen (Übersicht in Hardy, Nature Genet. 1: 233–234, 1992). Alle diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Bereitstellung eines Arzneimittels zur Verringerung, Beseitigung oder Vorbeugung der Bildung, Ablagerung, Anreicherung und/oder Persistenz von fibrillärem Aβ in den Gehirnen von humanen Patienten als eine wirksame Therapie dienen wird.
Das Auffinden und die Identifizierung von neuen Verbindungen oder Mitteln als mögliche therapeutische Mittel wird verzweifelt angestrebt, um der Ablagerung, Anreicherung und/oder Persistenz, die beim Morbus Alzheimer und anderen Amyloidosen auftritt, Einhalt zu gebieten.
Morbus Parkinson und die α-Synuclein-Fibrillenbildung
Morbus Parkinson ist eine neurodegenerative Erkrankung, die pathologisch durch das Vorliegen von intrazytoplasmatischen Lewy-Korpuskeln gekennzeichnet ist (Lewy im Handbuch der Neurologie, M. Lewandowski, Ed., Springer, Berlin, S. 920–933, 1912; Pollanen et al., J. Neuropath. Exp. Neurol. 52: 183–191, 1993), deren Hauptbestandteile Filamente aus α-Synuclein sind (Spillantini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6469–6473, 1998; Arai et al., Neurosc. Lett. 259: 83–86, 1999), einem Protein mit 140 Aminosäuren (Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11282–11286, 1993). Es wurden zwei dominante Mutationen im α-Synuclein beschrieben, die einen frühen Ausbruch des familiären Morbus Parkinson verursachen, was darauf hindeutet, dass die Lewy-Korpuskel bei Morbus Parkinson mechanistisch zur Degeneration der Neuronen beitragen (Polymeropoulos et al., Science 276: 2045–2047, 1997; Kruger et al., Nature Genet. 18: 106–108, 1998). Kürzlich haben in vitro-Untersuchungen gezeigt, dass rekombinantes α-Synuclein in der Tat Fibrillen bilden kann, die Lewy-Korpuskeln ähneln (Conway et al., Nature Med. 4: 1318–1320, 1998; Hashimoto et al., Brain Res. 799: 301–306, 1998; Nahri et al., J. Biol. Chem. 274: 9843–9836, 1999). Am wichtigsten ist, dass beide Mutationen in dem mit Morbus Parkinson verbundenen α-Synuclein diesen Aggregationsprozess beschleunigen, was darauf hindeutet, dass solche in vitro-Untersuchungen für die Pathogenese von Morbus Parkinson von Bedeutung sein können. Die α-Synuclein-Aggregation und die Fibrillenbildung erfüllen die Kriterien eines Polymerisationsprozesses, der von einer Keimbildung abhängig ist (Wood et al., J. Biol. Chem. 274: 19509–19512, 1999). In dieser Hinsicht ähnelt die Bildung von α-Synucleinfibrillen der Bildung der Fibrillen des Beta-Amyloidproteins (Aβ) von Morbus Alzheimer. Das rekombinante α-Synucleinprotein und ein nicht amyloider Bestandteil (bekannt als NAC-P), welcher ein Peptidfragment von α-Synuclein mit 35 Aminosäuren ist, besitzen beide die Fähigkeit, bei einer Inkubation bei 37°C Fibrillen zu bilden und sind mit Amyloidfarben wie etwa Kongorot (zeigen bei Ansicht unter polarisiertem Licht eine rot/grüne Doppelbrechung) und Thioflavin S (zeigen eine positive Fluoreszenz) positiv (Hashimoto et al., Brain Res. 799: 301–306, 1998; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11282–11286, 1993).
Die α-Synucleinfibrillen von Morbus Parkinson bestehen ebenso wie die Aβ-Fibrillen von Morbus Alzheimer aus einer vorherrschenden Beta-Faltblatt-Struktur. Wir glauben deshalb, dass man erwarten kann, dass Verbindungen, von welchen gefunden wurde, dass sie die Bildung von Aβ-Amyloidfibrillen bei Morbus Alzheimer hemmen, auch bei der Hemmung der Bildung von α-Synucleinfibrillen wirksam sind. Diese Verbindungen würden deshalb neben der Wirksamkeit als Therapeutikum für Morbus Alzheimer auch als Therapeutika für Morbus Parkinson dienen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit für die Behandlung einer Amyloidose bei einem Säuger, der daran leidet, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer isolierten reinen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Verbindungen mit der Formel A und der Formel B:
an den Säuger,
wobei R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy und C_1-6-Alkylthio (wobei jeweils die Alkylgruppe wahlweise mit 1–5 Halogenatomen substituiert ist) und einer Halo-Gruppe,
X ausgewählt ist aus Wasserstoff und der Gruppe bestehend aus C_1-22-Alkyl, wahlweise mit 1–5 Einheiten substituiert, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Amino,
und der Gruppe von Verbindungen bestehend aus 1,2,4-Benzentriol, Carbidopa, Desoxyepinephrin, Dioxethedrin, Dopa, Dopamin, Droxidopa,
und deren pharmazeutisch annehmbare Salze.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses ersten Aspekts wird nur eine solche Verbindung verabreicht, der Säuger ist ein Mensch und die Amyloidose ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Morbus Alzheimer, Down- Syndrom, erblicher cerebraler Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ, Amyloidose einer chronischer Entzündung, der Amyloidose von Malignomen, bei familiärer paroxysmaler Peritonitis (familiäres Mittelmeerfieber), multiplem Myelom, B-Zell-Dyskrasien, Typ II-Diabetes, den Prionenerkrankungen, der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, dem Gerstmann-Straussler-Syndrom, Kuru, Scrapie, der Amyloidose, die mit einer Langzeithämodialyse einhergeht, der Amyloidose, die mit einem Carpaltunnelsyndrom einhergeht, senile Herzamyloidose, familiäre Amyloid-Polyneuropathie und der Amyloidose, die mit endokrinen Tumoren einhergeht, und ist insbesondere Morbus Alzheimer.
In einer Ausführungsform wird ein Arzneimittelprodukt für die Behandlung der Amyloidose bei einem Säuger, der davon betroffen ist, in einem Behälter bereitgestellt, der gekennzeichnet ist oder der mit einer Beschreibung versehen ist, worin angegeben wird, dass das Arzneimittelprodukt für die Behandlung der Amyloidose vorgesehen ist, wobei der Behälter eine oder mehrere Dosierungseinheiten enthält, wobei jede mindestens eine pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanz und als Wirkstoff eine isolierte reine Verbindung umfasst, ausgewählt aus denjenigen, die bei dem Verfahren des ersten Aspekts dieser Erfindung verwendet werden.
Bevorzugt enthält das Arzneimittelprodukt nur eine solche Verbindung, der Säuger ist ein Mensch und die Amyloidose ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Morbus Alzheimer, Down-Syndrom, erblicher cerebraler Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ, der Amyloidose einer chronischen Entzündung, der Amyloidose von Malignomen, familiärer paroxysmaler Peritonitis (familiäres Mittelmeerfieber), einem multiplem Myelom, B-Zell-Dyskrasien, Typ II-Diabetes, Prionenerkrankungen, der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, des Gerstmann-Straussler-Syndroms, Kuru, Scrapie, der Amyloidose, die mit einer Langzeithämodialyse einhergeht, der Amyloidose, die mit einem Carpaltunnelsyndrom einhergeht, der senilen Herzamyloidose, der familiären Amyloid-Polyneuropathie und der Amyloidose, die mit endokrinen Tumoren einhergeht, und ist insbesondere Morbus Alzheimer.
Die Verbindungen können auch in einem Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, die charakterisiert ist durch eine α-Synucleinfibrillenbildung, bei einem Säuger, der davon betroffen ist.
In einer Ausführungsform wird nur eine solche Verbindung verabreicht, der Säuger ist ein Mensch und die Erkrankung ist eine Erkrankung mit Lewy-Korpuskeln oder Morbus Parkinson, insbesondere Morbus Parkinson.
In einem anderen Aspekt wird ein Arzneimittelprodukt für die Behandlung einer Erkrankung bereitgestellt, die durch eine α-Synucleinfibrillenbildung gekennzeichnet ist, in einem Säuger, der davon betroffen ist, umfassend einen Behälter, der gekennzeichnet ist oder der mit einer Beschreibung versehen ist, worin angegeben wird, dass das Arzneimittelprodukt für die Behandlung einer Erkrankung vorgesehen ist, die durch eine α-Synucleinfibrillenbildung gekennzeichnet ist, wobei der Container eine oder mehrere Dosierungseinheiten enthält, die jeweils mindestens eine pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanz und als Wirkstoff eine isolierte reine Verbindung umfassen, ausgewählt aus denjenigen, die beim Verfahren des dritten Aspekts dieser Erfindung verwendet werden.
Bevorzugt enthält das Arzneimittelprodukt nur eine solche Verbindung, der Säuger ist ein Mensch und die Erkrankung ist eine Erkrankung mit Lewy-Korpuskeln oder Morbus Parkinson, insbesondere Morbus Parkinson.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen
„Alkyl” bedeutet eine lineare Kohlenwasserstoffgruppe mit einem bis zur angegebenen Zahl an Kohlenstoffatomen, oder eine verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit drei bis zur angegebenen Zahl an Wasserstoffen. „Alkyl” wird in dieser Anmeldung eine breitere Bedeutung gegeben, als dies konventionell in der organischen Chemie der Fall ist, und es umfasst sowohl gesättigte Gruppen (diejenigen, die konventionell als Alkylgruppen bekannt sind), einfach ungesättigte Gruppen (beispielweise diejenigen, die konventionell als Alkenyl- und Alkinylgruppen bekannt sind) und mehrfach ungesättigte Gruppen, mit der Ausnahme, dass diese Begriffe keine Gruppen mit aromatischen Komponenten umfassen, da der Begriff „aromatisch” in konventioneller Art verwendet wird. Beispielhafte C_1-6-Alkylgruppen umfassen Methyl, Ethyl, Isopropyl, Cyclopropyl, tert-Butyl, Cyclopropylmethyl und Hexyl.
Eine „aromatische” Gruppe ist eine cyclische (monocyclische, kondensierte bicyclische oder verbundene bicyclische) Gruppe mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen im Ring, und wobei der Ring ausreichend ungesättigt ist, dass die Gruppe im konventionellen Sinn dieses Begriffs „aromatisch” ist. Beispielhafte aromatische Gruppen umfassen Phenyl, Naphthyl und Biphenyl. Eine „heteroaromatische” Gruppe ist eine „aromatische” Gruppe wie eben definiert, worin 1 bis 4 Kohlenstoffatome des Rings durch O, S, oder NR ersetzt wurden (wobei R Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl ist). Beispielhafte heteroaromatische Gruppen umfassen Pyrrolyl, Furanyl, Thiophenyl, Benzofuranyl, Indolyl und dergleichen. Solche aromatischen und heteroaromatischen Gruppen können wahlweise mit 1 oder mehreren, insbesondere 1 bis 3 nicht störenden Substituenten substituiert sein.
Eine „isolierte reine Verbindung” ist eine Verbindung in isolierter gereinigter Form, wie dies konventionell bei Wirkstoffen in der pharmazeutischen Industrie der Fall ist, und schließt die Verbindung insbesondere dann aus, wenn sie als ein Bestandteil in einem Gemisch zu finden ist, wie etwa in einer Pflanze oder einem Teil davon, oder einem Extrakt oder einem Aufguss aus einer solchen Pflanze oder einem solchen Teil, selbst wenn solche Gemische teilweise gereinigt werden, um die Anzahl der darin vorliegenden Bestandteile zu begrenzen. Jedoch ist die Behandlung mit einer „isolierten reinen Verbindung” nicht auf die Behandlung mit der Verbindung alleine beschränkt, sondern umfasst auch eine Behandlung mit der Verbindung, wenn sie in einer pharmazeutischen Zusammensetzung in der Art vorliegt, die in der pharmazeutischen Praxis üblich ist, d. h. dass sie eine oder mehrere pharmazeutische Trägersubstanzen enthält, jedoch ist eine Behandlung mit der Verbindung insbesondere dann ausgeschlossen, wenn die Verbindung als ein Bestandteil in einem Gemisch zu finden ist, wie etwa in einer Pflanze oder einem Teil davon, oder einem Extrakt oder Auszug einer solchen Pflanze oder einem Teil davon, selbst wenn solche Gemische teilweise gereinigt sind, um die Anzahl der darin vorhandenen Bestandteile zu begrenzen.
„Säuger” bzw. „Säugetier” umfasst Menschen und nicht menschliche Säugetiere, wie etwa Haustiere (Katzen, Hunde und dergleichen) und Nutztiere (Rinder, Pferde, Schafe, Ziegen, Schweine und dergleichen).
Geeignete nicht störende Substituenten umfassen Halogen und C_1-6-Alkyl und C_1-6-Alkoxy, jeweils wahlweise mit bis zu 5 Halogenatomen substituiert.
„Pharmazeutisch annehmbarer Trägerstoff” bedeutet einen Trägerstoff, der bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung brauchbar ist, der im Allgemeinen sicher, nicht toxisch und erwünscht ist, und umfasst Trägerstoffe, die ebenso für eine veterinärmedizinische Verwendung wie für eine humane pharmazeutische Verwendung annehmbar sind. Solche Trägerstoffe können fest, flüssig, halbfest oder im Fall einer Aerosolzusammensetzung gasförmig sein.
„Pharmazeutisch annehmbare Salze” bedeutet Salze, die pharmazeutisch annehmbar sind und die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften besitzen. Solche Salze umfassen Salze, die gebildet werden können, wenn in den Verbindungen vorhandene saure Protonen mit anorganischen oder organischen Basen reagieren können. Geeignete anorganische Salze umfassen diejenigen, die mit den Alkalimetallen, z. B. Natrium und Kalium, Magnesium, Calcium und Aluminium gebildet werden. Geeignete organische Salze umfassen diejenigen, die mit organischen Basen wie etwa den Armbasen, z. B. Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Tromethamin, N-Methylglucamin und dergleichen gebildet werden. Solche Salze umfassen auch Säure-Additionssalze, die mit anorganischen Säuren (z. B. Salzsäure und Bromwasserstoffsäure) und mit anorganischen Säuren (z. B. Essigsäure, Zitronensäure, Maleinsäure und den Alkan- und Arensulfonsäuren wie etwa Methansulfonsäure und Benzolsulfonsäure) gebildet werden. Wenn zwei saure Gruppen vorliegen, kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz ein Mono-Säure-Mono-Salz oder ein Di-Salz sein, und ebenso können einige oder alle solche Gruppen ein Salz bilden, wenn mehr als zwei saure Gruppen vorliegen.
Eine „Schutzgruppe” hat die Bedeutung, die normalerweise in der organischen Synthese damit verbunden ist, d. h. eine Gruppe, die selektiv eine oder mehrere reaktive Stellen in einer multifunktionalen Verbindung blockiert, so dass eine chemische Reaktion selektiv an einer anderen ungeschützten reaktiven Stelle durchgeführt werden kann, und so, dass die Gruppe nach Beendigung der selektiven Reaktion leicht entfernt werden kann.
Eine „therapeutisch wirksame Menge” bedeutet die Menge, die bei Verabreichung an ein Tier bzw. einen Menschen für die Behandlung einer Erkrankung für eine wirksame Behandlung der Erkrankung ausreichend ist.
„Behandeln” oder „Behandlung” der Erkrankung umfasst die Vorbeugung des Auftretens der Erkrankung bei einem Säuger, der für die Erkrankung anfällig ist, jedoch die Erkrankung noch nicht durchläuft oder der noch keine Symptome der Erkrankung zeigt (prophylaktische Behandlung), die Hemmung der Erkrankung (Verlangsamung oder Stoppen der Entwicklung bzw. des Entstehens), die Bereitstellung einer Erleichterung der Symptome oder Nebenwirkungen der Erkrankung (einschließlich einer palliativen Behandlung) und die Linderung der Erkrankung (Bewirken der Rückentwicklung der Erkrankung). „Behandlung” einer Amyloidose umfasst eines oder mehrere der Folgenden: Vorbeugung, Hemmung, Reduzierung, Abbau, Störung und Zerlegen von Amyloidfibrillen und Amyloidproteinablagerungen wie etwa von Aβ und den anderen Amyloiden, die im „Hintergrund der Erfindung” beschrieben werden. „Behandeln” einer Erkrankung mit α-Synucleinfibrillen umfasst eines oder mehrere der Folgenden: Vorbeugung, Hemmung, Reduzierung, Abbau, Störung und Zerlegen der α-Synucleinfibrillen und der mit α-Synuclein verbundenen Proteinablagerungen, wie etwa diejenigen bei einer Erkankung mit Lewy-Korpuskeln und bei Morbus Parkinson.
Die Verbindungen, die in den Zusammensetzungen zu finden sind und in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, können eines oder mehrere chirale Zentren besitzen, und können deshalb als einzelne Stereoisomere oder als Gemische von Stereoisomeren erzeugt werden, abhängig davon, ob einzelne Stereoisomere oder Gemische von Stereoisomeren der Ausgangsmaterialien verwendet werden. Solange nichts anderes angegeben ist, soll die Beschreibung oder Nennung einer Verbindung oder einer Gruppe von Verbindungen sowohl die einzelnen Stereoisomere als auch die Gemische (racemisch oder sonstige) der Stereoisomere umfassen. Verfahren zur Bestimmung der Stereochemie und der Trennung von Stereoisomeren sind einem Fachmann allgemein bekannt [siehe Diskussion in Kapitel 4 von March J: Advanced Organic Chemistry, 4. Auflage, John Wiley and Sons, New York, NY, 1992].
Derzeit bevorzugte Verbindungen
Während die breiteste Definition der Erfindung in der Zusammenfassung der Erfindung dargelegt wird, sind bestimmte Verbindungen dieser Erfindung derzeit besonders bevorzugt.
Derzeit bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung sind Verbindungen, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy und C_1-6-Alkylthio (wobei jeweils die Alkylgruppe wahlweise mit 1 bis 5 Halogenatomen substituiert ist) und einer Halo-Gruppe,
X ausgewählt ist aus Wasserstoff und der Gruppe bestehend aus C_1-22 Alkyl, jeweils wahlweise mit 1 bis 5 Gruppen substituiert, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Amino, Nitro, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylthio und C_1-6-Alkylcarbonyl,
und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon.
Bevorzugte Verbindungen umfassen die Verbindungen mit der Formel A und der Formel B.
Oben wurde eine Reihe von unterschiedlichen (Präferenzen angegeben, und das Befolgen einer beliebigen dieser Präferenzen ergibt eine erfindungsgemäße Verbindung oder die erfindungsgemäße Zusammensetzung oder ein erfindungsgemäßes Verfahren, das gegenwärtig mehr bevorzugt ist als eine Verbindung, bei der diese bestimmte Präferenz nicht befolgt wird. Jedoch sind diese Präferenzen im Allgemeinen unabhängig und additiv, und das Befolgen von mehr als einer dieser Präferenzen kann eine derzeit mehr bevorzugte Verbindung ergeben, als wenn weniger dieser Präferenzen befolgt werden.
Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung umfassen 1,2,4-Benzentriol, 5-Hydroxydopamin.
Pharmakologie und Nutzen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bewirken eine Hemmung oder Vorbeugung der Bildung von Amyloidfibrillen, eine Hemmung oder Vorbeugung des Wachstums von Amyloidfibrillen und/oder bewirken einen Abbau, eine Störung und/oder Zerlegung von bereits gebildeten Amyloidfibrillen und Amyloidproteinablagerungen. Ihre Aktivität kann in vitro durch Verfahren gemessen werden, wie beispielsweise die in den Beispielen 1–4 und Assay 1 unten beschriebenen Verfahren, während ihre Aktivität in vivo gegenüber Amyloidosen in Tiermodellen, wie beispielsweise denjenigen für Morbus Alzheimer gemessen werden kann, und beim Menschen durch ein Verfahren, wie beispielsweise das in Assay 2 unten erläuterte Verfahren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bewirken auch eine Hemmung oder Vorbeugung der Bildung von α-Synucleinfibrillen, eine Hemmung oder Vorbeugung des Wachstums von α-Synucleinfibrillen und/oder einen Abbau, eine Störung und/oder eine Zerlegung von bereits gebildeten α-Synucleinfibrillen und mit α-Synuclein verbundenen Proteinablagerungen. Ihre Aktivität kann in vitro durch Verfahren gemessen werden, die ähnlich sind wie die in den Beispielen 1–4 unten erörterten Verfahren.
Der therapeutische Index einer Verbindung kann beispielsweise bestimmt werden durch Vergleichen der Dosis, welche in einem geeigneten in vivo-Modell in einer geeigneten Tierspezies wie etwa der Maus eine wirksame Aktivität gegen Fibrillen (gegen Amyloid oder gegen α-Synuclein) ergibt, mit der Dosis, die bei der Versuchstierspezies einen signifikanten Gewichtsverlust (oder andere beobachtbare Nebenwirkungen) ergibt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung
Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in reiner, isolierter Form in therapeutisch wirksamen Mengen durch eine beliebige im Fachgebiet bekannte Art und Weise verabreicht, entweder einzeln oder in Kombination mit mindestens einer anderen erfindungsgemäßen Verbindung und/oder mindestens einem anderen konventionellen therapeutischen Mittel für die zu behandelnde Erkrankung. Eine therapeutisch wirksame Menge kann in Abhängigkeit von der Erkrankung, der Stärke, dem Alter und der relativen Gesundheit des zu behandelnden Tieres bzw. Menschen, der Wirksamkeit der Verbindung(en) und anderen Faktoren stark variieren. Als Mittel gegen Fibrillen können therapeutisch wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen im Bereich von 1–1000 mg/kg Körpergewicht liegen, beispielsweise 10–100 mg/kg. Ein Durchschnittsfachmann kann ohne unangemessenes Experimentieren unter Berücksichtigung des Fachwissens und dieser Offenbarung eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung für die Behandlung einer Amyloidose bestimmen.
Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als pharmazeutische Zusammensetzungen durch einen der folgenden Wege verabreicht: oral, topisch, systemisch (z. B. transdermal, intranasal oder durch Zäpfchen) oder parenteral (z. B. intramuskulär, subkutan oder durch eine intravenöse Injektion). Zusammensetzungen können die Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, halbfesten Substanzen, Pulvern, Formulierungen mit einer verzögerten Freisetzung, Lösungen, Suspensionen, Elixieren, Aerosoln oder beliebige andere geeignete Gestaltungen aufweisen, und umfassen mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung in Kombination mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff. Geeignete Trägerstoffe sind Durchschnittsfachleuten allgemein bekannt und diese und die Verfahren zur Formulierung der Zusammensetzungen sind in solchen Standardreferenzen wie etwa Alfonso AR: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985 zu finden. Geeignete flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen, umfassen Wasser, wässrige Salzlösung, wässrige Dextroselösung und Glykole.
Insbesondere kann die Verbindung bzw. können die Verbindungen – bevorzugt wird in jeder bestimmten Dosierungsform nur eine solche Verbindung verabreicht – oral verabreicht werden, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Lutschtabletten, wässrige oder ölige Suspension, dispergierbare Pulver oder Granulate, Emulsionen, harte oder weiche Kapseln oder Sirup oder Elixiere. Zusammensetzungen, die für eine orale Verwendung vorgesehen sind, können nach einer beliebigen im Fachgebiet bekannten Methode für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt werden, und solche Zusammensetzungen können eine oder mehrere Mittel enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Süßstoffen, Geschmacksstoffen, Farbstoffen und Konservierungsmitteln, um pharmazeutisch elegante und schmackhafte Präparationen bereitzustellen.
Tabletten enthalten die Verbindung als Beimischung zu nicht toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanzen, welche für die Herstellung von Tabletten geeignet sind. Diese Trägerstoffe können beispielsweise inerte Verdünnungsmittel wie etwa Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Lactose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat; Granulierungsmittel und Aufschlussmittel, beispielsweise Maisstärke oder Alginsäure; Bindemittel, beispielsweise Maisstärke, Gelatine oder Akazin und Gleitmittel, beispielsweise Magnesiumstearat oder Stearinsäure oder Talk sein. Die Tabletten können unbeschichtet sein oder sie können durch bekannte Verfahren zur Verzögerung des Aufschlusses und der Absorption im Magen-Darm-Trakt beschichtet werden und hierbei für einen längeren Zeitraum eine anhaltende Wirkung bereitstellen. Beispielsweise kann ein Material zur zeitlichen Verzögerung wie etwa Glycerolmonostearat oder Glyceroldistearat verwendet werden. Formulierungen für eine orale Verwendung können auch als Hartgelatinekapseln bereitgestellt werden, worin die Verbindung in einem inerten festen Verdünnungsmittel, beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin gemischt wird, oder sie können als Weichgelatinekapseln bereitgestellt werden, worin der Wirkstoff mit Wasser oder einem Ölmedium gemischt wird, beispielsweise mit Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl.
Wässrige Suspensionen enthalten die Verbindung als Beimischung mit Trägerstoffen, die für die Herstellung von wässrigen Suspensionen geeignet sind. Solche Trägerstoffe sind Suspensionsmittel, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Traganthgummi und Akaziengummi; Dispersionsmittel oder Benetzungsmittel können natürlich vorkommende Phosphatide sein, beispielsweise Lecithin, oder Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit Fettsäuren, beispielsweise Polyoxyethylenstearat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Kondensations produkte von Ethylenoxid mit Partialestern, die von Fettsäuren wie etwa Hexitol abgeleitet sind, wie etwa Polyoxyethylensorbitolmonooleat, oder Kondensationsprodukten von Ethylenoxid mit Partialestern von Fettsäuren und Hexitolanhydriden, beispielsweise Polyethylensorbitanmonooleat. Die wässrigen Lösungen können auch ein oder mehrere Konservierungsmittel, beispielsweise Ethyl oder N-Propyl p-hydroxybenzoat, ein oder mehrere Farbstoffe, ein oder mehrere Geschmacksstoffe oder ein oder mehrere Süßstoffe, wie etwa Saccharose oder Saccharin enthalten.
Ölige Suspensionen können formuliert werden durch Suspendieren der Verbindung in einem Pflanzenöl, beispielsweise Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnussöl, oder in einem Mineralöl wie etwa flüssigem Paraffin. Die öligen Suspensionen können ein Verdickungsmittel enthalten, beispielsweise Bienenwachs, hartes Paraffin oder Cetylalkohol. Es können Süßstoffe, wie etwa die unten genannten, und Geschmacksstoffe zugegeben werden, um eine schmackhafte orale Präparation bereitzustellen. Diese Zusammensetzungen können durch die Zugabe eines Antioxidationsmittels wie etwa Ascorbinsäure konserviert werden. Dispergierbare Pulver und Granulate, die für die Herstellung einer wässrigen Suspension durch Zugabe von Wasser geeignet sind, stellen den Wirkstoff in Beimischung mit einem Dispersionsmittel oder Benetzungsmittel, einem Suspensionsmittel und einem oder mehreren Konservierungsmitteln bereit. Geeignete Dispersionsmittel oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel sind durch die bereits oben beschriebenen Mittel beispielhaft erläutert. Ebenso können weitere Trägersubstanzen, z. B. Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Mittel vorliegen.
Die Verbindungen können auch in Form von Öl-in-Wasser-Emulsionen vorliegen. Die ölige Phase kann ein Pflanzenöl, beispielsweise Olivenöl oder Erdnussöle, oder ein Mineralöl sein, beispielsweise flüssiges Paraffin oder Gemischen aus diesen. Geeignete Emulgatoren können natürlich vorkommende Gummis, beispielsweise Akaziengummi oder Traganthgummi, natürlich vorkommende Phosphatide, beispielsweise Sojabohnen, Lecithin und vorkommende Phosphatide, beispielsweise Sojabohnen, Lecithin und Ester oder Partialester sein, die von Fettsäuren und Hexitolanhydriden stammen, beispielsweise Sorbitanmonooleat, und Kondensationsprodukte der Partialester mit Ethylenoxid, beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Die Emulsion kann auch Süßstoffe und Geschmacksstoffe enthalten. Sirup und Elixiere können mit Süßstoffen formuliert werden, beispielsweise mit Glycerol, Sorbitol oder Saccharose. Solche Formulierungen können auch ein Demulcens, ein Konservierungsmittel und Geschmacksmittel oder Farbstoffe enthalten.
Die Verbindung kann auch durch eine Injektion oder eine Infusion verabreicht werden, entweder subkutan oder intravenös oder intramuskulär oder intrasternal oder intranasal oder durch Infusionsverfahren in Form einer sterilen injizierbaren oder ölartigen Suspension. Die Verbindung kann in Form von sterilen injizierbaren wässrigen oder ölartigen Suspensionen vorliegen. Diese Suspensionen können gemäß des Wissens im Fachgebiet unter Verwendung von geeigneten Dispersions- oder Benetzungsmitteln und Suspensionsmitteln formuliert werden, die oben beschrieben wurden. Die sterile injizierbare Präparation kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen, parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den annehmbaren Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und eine isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden sterile, gehärtete Öle traditionell als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Für diesen Zweck können konventionell beliebige, mild gehärtete Öle verwendet werden, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride. Außerdem können Fettsäuren wie etwa Ölsäure bei der Präparation von Injektionsmitteln Verwendung finden.
Die Dosierungsverordnungen können so angepasst werden, dass eine optimale therapeutische Reaktion erreicht wird. Beispielsweise können täglich mehrere aufgeteilte Dosierungen verabreicht werden, oder die Dosierung kann proportional verringert werden, so wie es durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt ist.
Es ist besonders vorteilhaft, die Verbindungen in einer Dosierungseinheitsform zu formulieren, um die Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu erleichtern. Eine Dosierungseinheitsform wie hierin verwendet bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für die zu behandelnden Patienten geeignet sind, wobei jede eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung und mindestens eine pharmazeutische Trägersubstanz enthält. Ein Arzneimittelprodukt enthält eine Dosierungseinheitsform in einem Behälter, der markiert ist oder dem eine Beschreibung beiliegt, welche das angestrebte Behandlungsverfahren angibt, wie etwa die Behandlung einer Amyloiderkrankung wie etwa Morbus Alzheimer, oder einer Erkrankung, die mit einer α-Synucleinfibrillenbildung in Verbindung steht, wie etwa Morbus Parkinson. Eine „therapeutisch wirksame Dosierung” hemmt bevorzugt die Amyloidose oder eine mit der α-Synucleinfibrillenbildung verbundene Erkrankung bei einem Patienten um mindestens 20, mehr bevorzugt um mindestens 40%, noch mehr bevorzugt um mindestens 60%, und noch mehr bevorzugt um mindestens 80% bezogen auf nicht behandelte Patienten.
Herstellung der Verbindungen dieser Erfindung
Viele der in den Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung verwendeten Verbindungen sind im Fachgebiet bekannt. Sie können in solchen Referenzen wie dem Merck-Index, 12. Auflage, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, 1996 (worin normalerweise ein Verweis auf die Synthese oder auf die Isolierung bereitgestellt wird) kurz beschrieben sein, und sie können in chemischen Katalogen zu finden sein, wie etwa den Katalogen von kommerziellen Lieferanten wie etwa Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Bachem (Torrance, CA), Sigma (St. Louis, MO).
Für diejenigen Verbindungen, die neu sind, sind die bei der Herstellung dieser Verbindungen verwendeten Ausgangsmaterialien und Reagenzien im Allgemeinen von kommerziellen Lieferanten wie etwa Aldrich Chemical Company, Bachem und Sigma erhältlich, oder sie können durch Verfahren hergestellt werden, die einem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt sind, unter Befolgung von Prozessen, die in solchen Referenzen wie Fieser und Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Bd. 1–17, John Wiley and Sons, New York, NY, 1991; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Bd. 1–5 und Ergänzungen, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, Bd. 1–40, John Wiley and Sons, New York, NY, 1991; March J: Advanced Organic Chemistry, 4. Auflage, John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; und Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989 beschrieben werden, und die Synthesen der neuen Verbindungen sind für einen Durchschnittsfachmann unter Bezugnahme auf bekannte Analoga (wie etwa die kommerziell erhältlichen Analoga, auf die oben Bezug genommen wird) der neuen Verbindungen naheliegend. Viele solche Herstellungen werden die Verwendung von Schutzgruppen beinhalten, insbesondere für den Schutz der Hydroxygruppen, welche einen wesentlichen Teil der Verbindungen darstellen, und das Wissen um solche Schutzgruppen und die Verwendung solcher Schutzgruppen liegt innerhalb des Wissens eines Durchschnittsfachmanns.
Die Ausgangsmaterialien, Zwischenprodukte und Verbindungen dieser Erfindung können unter Verwendung konventioneller Techniken, einschließlich Filtration, Destillation, Kristallisation, Chromatographie und dergleichen isoliert und gereinigt werden. Sie können unter Verwendung von konventionellen Verfahren, einschließlich physikalischer Konstanten und Spektraldaten charakterisiert werden.
Beispiele
Die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1. Abbau/Störung der Aβ-1-42-Fibrillen von Morbus Alzheimer durch polyhydroxylierte aromatische Verbindungen
In dieser Untersuchung wurden unterschiedliche Arten kommerziell erhältlicher Verbindungen, die aus verschiedenen Strukturen mit polyhydroxylierten Aromaten bestehen, bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, einen Abbau/eine Störung von bereits gebildeten Amyloidfibrillen mit Aβ 1-42 von Morbus Alzheimer zu bewirken. Diese Art von Aktivität wäre für alle möglichen Arzneimittel gegen Amyoide von Bedeutung, welche bei Patienten verwendet werden können, die bereits eine deutliche Amyloidablagerung in Organen und/oder Geweben aufweisen. Beispielsweise weisen Patienten mit Morbus Alzheimer im mittleren bis späten Krankheitsstadium zahlreiche Aβ-haltige Amyloidablagerungen in ihren Gehirnen auf, sowohl als Teil von neuritischen Plaques, als auch cerebrovaskuläre Amyloidablagerungen. Eine Verbindung, die einen Abbau/eine Störung der bereits existierenden Amyloidablagerungen bewirken kann, wäre für eine Verwendung bei diesen Patienten, die sich in späteren Stadien des Erkrankungsprozesses befinden, von Vorteil.
Für die erste Untersuchung wurde 1 mg Aβ 1-42 (Bachem Inc., Torrance, CA, USA) in 1,0 ml zweifach destilliertem Wasser gelöst (1 mg/ml Lösung). 25 μM Aβ 1-42 wurden dann über Nacht (~18 h) bei 37°C inkubiert, in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 μg/ml der folgenden Verbindungen: 1) EDTA (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), 2) Myricetin (Acros, Somerville, New Jersey, USA), 3) Exifon (Acros) 4) Pyrogallol (Sigma), 5) Tannin (Agros), 6) Pyrocatechol (Acros), 7) Quercetin (Sigma), 8) Ellagsäure (Acros), 9) 1,2,4-Benzentriol (Acros), 10) 5-Hydroxydopamin (Acros), 11) Gallamidhydrate (Acros), 12) Gallussäure (Sigma), 13) Ethylgallat (Acros), 14) Chinasäure (Acros), 15) Propylgallat (Sigma) und 16) Phloroglucid (Acros), jeweils in Gegenwart von 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl (pH 7,0) mit 0,02% Natriumazid. In dieser Untersuchung betrug das Gewichtsverhältnis von Aβ 1-42: Verbindung 1:1.
Für die zweite Untersuchung wurde 1 mg Aβ 1-42 (Bachem) in 1,0 ml zweifach destilliertem Wasser gelöst (1 mg/ml Lösung). 25 μM Aβ 1-42 wurden dann über Nacht (~18 h) bei 37°C inkubiert, in Abwesenheit oder Gegenwart von 50 μg/ml der folgenden Verbindungen: 1) Gallussäure, 2) Ethylgallat, 3) Chinasäure, 4) Gallamidtrihydrat, 5) Ellagsäure, 6) Propylgallat und 7) Pyrogallol, jeweils in Gegenwart von 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl (pH 7,0) mit 0,02% Natriumazid. In dieser Untersuchung betrug das Gewichtsverhältnis von Aβ 1-42: Verbindung 2:1.
Für die Identifizierung von möglichen therapeutischen Verbindungen, die einen Abbau/eine Störung der Aβ-1-42-Amyloidfibrillen von Morbus Alzheimer bewirken können, wurde ein zuvor beschriebenes Verfahren zur Messung der Bildung von Amyloidfibrillen unter Verwendung der Thioflavin T-Fluorometrie (H Naiki et al., Lab. Invest. 65: 104–110, 1991; H Levine III, Protein Sci. 2: 404–410, 1993; H Levine III, Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2: 1–6, 1995; H Naiki and K. Nakakuki, Lab. Invest. 74: 374–383, 1996) verwendet. Es ist bekannt, dass Thioflavin T an fibrilläre Amyloidproteine bindet, und eine Zunahme der Fluoreszenz korreliert mit einer Zunahme der Amyloidfibrillenbildung, wohin gegen eine Abnahme der Fluoreszenz mit einer Abnahme der Amyloidfibrillen aufgrund eines Abbaus und/oder einer Störung korreliert. Wenn das Alzheimer-Aβ-Protein (1-42) in eine Lösung, wie etwa destilliertes Wasser, gegeben wird, neigt es zur spontanen Bildung von Amyloidfibrillen. Unter Verwendung dieses empfindlichen Assays wurde zuvor gezeigt, dass alle Abnahmen oder Zunahmen der Fluoreszenz mit einer Abnahme oder Zunahme der Menge der Amyloidfibrillen korreliert (siehe die oben zitierten Dokumente), was eine Identifizierung und Quantifizierung des Ausmaßes von möglichen Inhibitoren und/oder Verstärkern der Alzheimer-Aβ-1-42-Amyloidfibrillen ermöglicht.
Um die Wirkungen jeder Verbindung auf einen möglichen Abbau/eine mögliche Störung von bereits gebildeten Aβ-1-42-Fibrillen zu bewerten, wurden für fluorometrische Messungen 50 μl Aβ 1-42 mit oder ohne Testverbindungen (oben beschrieben) zu 1,2 ml 100 μM Thioflavin T (Sigma) in 50 mM NaH₂PO₄ (pH 6,0) zugegeben. Die Untersuchungen zeigten, dass steigende Konzentration an Aβ in Gegenwart von 100 μM Thioflavin T einen proportionalen Anstieg der Fluoreszenz ergaben, was das Vorhandensein von beliebigen unangemessenen inneren Filtereffekten in diesen Untersuchungen ausschloss. Die Fluoreszenzemission bei 482 nm wurde auf einem Turner-Instrument Modell 450-Fluorometer bei einer Anregungswellenlänge von 450 nm gemessen. Für jede Bestimmung wurde das Fluorometer kalibriert durch Einstellen auf Null in Gegenwart des Thioflavin T-Reagenz alleine, und durch Einstellen von 50 ng/ml Riboflavin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) im Thioflavin T-Reagenz auf 1800 Fluoreszenzeinheiten. Alle Fluoreszenzbestimmungen basierten auf diesen Referenzen, und jede Fluoreszenz, die von einer beliebigen der Verbindungen in Gegenwart des Thioflavin T-Reagenz abgegeben wurde, wurde immer von allen relevanten Messungen subtrahiert.
Die Vergleiche des Amyloidproteins in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindungen basierten bei allen Untersuchungen zur Fibrillogenese unter Verwendung der Thioflavin T-Fluorometrie, wie hierin offenbart, auf einem gepaarten Student t-Test, wobei die Daten als Mittelwert der dreifachen Messungen ± Standardabweichung gezeigt sind.

Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, bewirkten die polyhydroxylierten aromatischen Verbindungen einen Abbau/eine Störung der Aβ-1-42-Aymloidfibrillen, bestimmt durch die Hemmung der Thioflavin T-Fluoreszenz. Alle Ergebnisse waren auf dem Niveau p < 0,005 signifikant, mit Ausnahme des Ergebnisses für Chinasäure im Verhältnis 2:1 (Sternchen in Tabelle 1), das nicht signifikant war. Tabelle 1: Abbau/Störung der Alzheimer-1-42-Fibrillen, dargestellt durch die Hemmung der Thioflavin T-Fluoreszenz

	Fluoreszenzhemmung, %, bei den angegebenen Verhältnissen von Aβ 1-42: Verbindung
Name der Verbindung	1:1	2:1
Myricetin	94 ± 0,9
Exifon	93 ± 1,4
Pyrogallol	89 ± 6,7	72 ± 3,8
Tannin	77 ± 1,3
Pyrocatechol	77 ± 2,6
Quercetin	76 ± 0,6
Ellagsäure	74 ± 1,4	62 ± 3,9
1,2,4-Benzentriol	71 ± 3,3
5-Hydroxydopamin	70 ± 1,1
Gallamidtrihydrat	65 ± 12,3	60 ± 2,2
Gallussäure	57 ± 1,9	44 ± 1,7
Ethylgallat	49 ± 0,8	30 ± 3,7
Chinasäure	31 ± 9,0	0,5 ± 3,9*
Phloroglucid	30 ± 0,6
Propylgallat	29 ± 2,8	38 ± 4,8

EDTA, ein bekannter Chelatbildner, bewirkte keinen signifikanten Abbau/Störung der Aβ-1-42-Amyloidfibrillen, was darauf hindeutete, dass die inhibitorischen Wirkungen, die bei den polyhydroxylierten aromatischen Verbindungen beobachtet wurden, nicht ihrer Fähigkeit zur Komplexierung von Metallen zuzuschreiben war.
Beispiel 2: Dosisabhängiger Abbau/Störung der Aβ-1-40-Fibrillen von Morbus Alzheimer durch Tannin und Gallussäure
In dieser Untersuchung wurden die möglichen dosisabhängigen Wirkungen von Tannin und Gallussäure auf den Abbau/die Störung von bereits gebildetem Aβ 1-40 bewertet. In diesem Experiment wurde 1 mg Aβ 1-40 (Bachem Inc., Torrance, CA, USA, Lot # T-20824) in 1,0 ml zweifach destilliertem Wasser gelöst (1 mg/ml Lösung) und für 4 Tage bei 37°C zur spontanen Induktion der Fibrillenbildung inkubiert. 25 μM zuvor fibrilliertes Aβ 1-40 wurde dann über Nacht (~18 h) bei 37°C in Abwesenheit oder Anwesenheit von steigenden Mengen (25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml und 100 μg/ml) Tannin oder Gallussäure inkubiert (jeweils in Gegenwart von 150 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, pH 7,0 mit 0,02% Natriumazid). Die Gewichtsverhältnisse von Aβ: Verbindung betrugen somit 4:1, 2:1, 4:3 bzw. 1.1. Für Fluorometriemessungen wie in Beispiel 1 oben beschrieben wurden dann 50 μl-Aliquots zu 1,2 ml 100 μM Thioflavin T (Sigma) in 50 mM NaH₂PO₄ (pH 6,0) zugegeben.

Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, bewirkten sowohl Tannin als auch Gallussäure einen dosisabhängigen Abbau/Störung von Aβ-1-40-Amyloidfibrillen, wie durch eine dosisabhängige Hemmung der Thioflavin T-Fluoreszenz gezeigt wird. Alle Ergebnisse waren auf dem Niveau von p < 0,005 signifikant, mit Ausnahme des Ergebnisses für Gallussäure im Verhältnis 4:1 (Sternchen in Tabelle 2), das auf dem Niveau von p < 0,05 signifikant war. Tabelle 2: Dosisabhängiger Auseinanderbau/Störung der Alzheimer-1-40-Fibrillen, dargestellt durch Thioflavin T-Fluoreszenzhemmung

	Fluoreszenzhemmung, %, bei den angegebenen w/w Verhältnisssen von Aβ 1-40: Verbindung
Name der Verbindung	4:1	2:1	4:3	1:1
Tannin	31 ± 4,8	42 ± 2,8	49 ± 3,7	53 ± 4,2
Gallussäure	14 ± 8,2*	22 ± 3,3	34 ± 3,6	45 ± 4,1

Beispiel 3: Zerlegung von Aβ-1-40-Fibrillen von Morbus Alzheimer durch polyhydroxylierte aromatische Verbindungen
In dieser Untersuchung wurde ein spektrophotometrischer Aβ-Assay mit Kongorot (Klunk et al., Anal. Biochem. 266: 66–76, 1999) modifiziert, um die Wirksamkeit von polyhydroxylierten aromatischen Verbindungen auf die Zerlegung von bereits gebildeten Aβ-1-40-Amyloidfibrillen zu bestimmen. Für diesen Assay wurde 1 mg Aβ 1-40 (Bachem) für 4 Tage bei 37°C in destilliertem Wasser inkubiert, um spontan Amyloidfibrillen zu erzeugen. 25 μM fibrilliertes Aβ 1-40 wurde dann dreifach mit verschiedenen Testverbindungen in einem Gewichtsverhältnis Aβ: Verbindung von 2:1 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) (100 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,0 mit 0,02% Natriumazid) für 3 Tage bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden dann 50 μl 360 μM Kongorot (Sigma) in destilliertem Wasser zu 250 μl von jedem Inkubationsgemisch zugegeben, was ein finales Molverhältnis von Aβ:Kongorot von 1:3 ergab. Nach 10 min wurde die Extinktion bei 405 nm (Referenzwellenlänge zur Einberechnung der Extinktion von Kongorot alleine bei 450 nm) und 540 nm (Probenextinktion, wobei „Probe” Aβ alleine, die Testverbindung alleine oder Aβ plus Testverbindung bezeichnet, jeweils in Gegenwart von Kongorot) unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts von Biorad, Modell 550 (Biorad, Hercules, CA, USA) bestimmt. Die Extinktion bei der Wellenlänge 405 nm wurde durch das ELISA-Plattenlesegerät automatisch von der Extinktion bei der Wellenlänge 540 nm subtrahiert (der Unterschied wird als Δ Extinktion bezeichnet) (siehe Klunk et al., oben zitiert). Deshalb war die Δ-Extinktionsmessung bei 540 nm proportional zur Menge des in der Lösung belassenen aggregierten Aβ (Klunk et al.).
Bei allen Experimenten, bei welchen die Testverbindungen einbezogen wurden, wurde die Δ-Extinktionsmessung bei 540 nm der Testverbindung alleine (ohne Aβ) immer von der entsprechenden Δ-Extinktionsmessung bei 540 nm der Testverbindung in Gegenwart von Aβ subtrahiert. Unter Verwendung dieser Modifikation des Verfahrens von Klunk et al. ergab die Verwendung einer größeren Endkonzentration an Kongorot, d. h. 60 μM anstelle von 14 μM, in Gegenwart von fibrillärem Aβ eine Gesamtextinktion bei 540 nm, welche immer unterhalb von 1,0 Extinktionseinheiten (AU, „Absorbance Unit”) und gut innerhalb des linearen Extinktionsbereichs lag.
Zur Bestimmung ihrer Wirksamkeit auf die Zerlegung von bereits gebildeten Aβ-1-40-Amyloidfibrillen wurden die folgenden Verbindungen mit polyhydroxylierten Aromaten unter Verwendung des oben beschriebenen spektrophotometrischen Kongorot-Aβ-Assays untersucht: 1) Gallussäure, 2) Ethylgallat, 3) Chinasäure, 4) Gallamidtrihydrat, 5) Ellagsäure, 6) Propylgallat und 7) Pyrogallol.

Die polyhydroxylierten aromatischen Verbindungen zeigten unterschiedliche Wirkungen hinsichtlich einer Zerlegung von bereits aggregierten Aβ-1-40-Amyloidfibrillen, wie unter Verwendung des oben beschriebenen spektrophotometrischen Kongorot-Assays bestimmt wurde. Die Ergebnisse waren auf dem Niveau von p < 0,005 signifikant, mit Ausnahme von Propylgallat (Sternchen in Tabelle 3) auf dem Niveau von p < 0,05 und Chinasäure (zwei Sternchen), welches nicht signifikant war. Tabelle 3: Zerlegung von Alzheimer-1-40-Fibrillen, dargestellt durch Kongorot-Spektrophotometrie

Name der Verbindung	Abnahme der Extinktion, %
Gallussäure	52 ± 0,4
Ethylgallat	28 ± 5,0
Chinasäure	0 + 5,0**
Gallamidtrihydrat	31 ± 1,9
Ellagsäure	54 ± 2,8
Propylgallat	17 ± 7,3*
Pyrogallol	63 ± 3,4

Beispiel 4: Dosisabhängige Zerlegung von Aβ-1-40-Fibrillen von Morbus Alzheimer durch Tannin und Gallussäure
In dieser Untersuchung wurden die möglichen dosisabhängigen Wirkungen von Tannin und Gallussäure auf die Zerlegung von fibrilliertem Aβ 1-40 bewertet. In diesem Experiment wurde der modifizierte spektrophotometrische Kongorot-Aβ-Assay (Klunk et al., Anal. Biochem. 266: 66–76, 1999) verwendet, der oben (d. h. in Beispiel 4) beschrieben wird. Jedoch wurden in diesem speziellen Experiment steigende Mengen von Tannin oder Gallussäure (d. h. 25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml und 100 μg/ml) nach einer Inkubation über Nacht (~18 h) bei 37°C in Gegenwart von 25 μM Aβ 1-40 (Bachem) untersucht.

Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, bewirkten sowohl Tannin als auch Gallussäure eine dosisabhängige Zerlegung der Aβ-1-40-Amyloidfibrillen, wie durch die Abnahmen der Thioflavin-T-Fluoreszenz bestimmt wurde. Alle Ergebnisse waren auf dem Niveau p < 0,001 signifikant, mit Ausnahme des Ergebnisses für Gallussäure im Verhältnis 4:1 (Sternchen in Tabelle 4), das auf dem Niveau von p < 0,05 signifikant war. Tabelle 4: Dosisabhänige Zerlegung von Alzheimer-1-40-Fibrillen, gezeigt durch Kongorot-Spektrophotometrie

	Abnahme der Extinktion, %, bei den angegebenen w/w Verhältnissen von Aβ 1-42: Verbindung
Name der Verbindung	4:1	2:1	4:3	1:1
Tannin	42 ± 5,2	48 ± 6,8	59 ± 6,4	61 ± 11,1
Gallussäure	17 ± 9,5*	22 ± 4,0	30 ± 6,0	32 ± 4,8

Beispiel 5: Abbau/Störung von Inselamyloidfibrillen (Amylin) durch polyhydroxylierte aromatische Verbindungen
90% der Patienten mit Typ II-Diabetes weisen die Ablagerung und Anreicherung von Amyloidfibrillen in den Langerhans-Inseln im Pankreas auf (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8628–8632, 1987). Das betreffende Amyloidprotein besteht aus einem Protein mit 37 Aminosäuren, das als Inselamyloidpolypeptid oder Amylin bekannt ist. Es wird angenommen, dass das Inselamyloid zur Zerstörung der β-Zellen des Pankreas beiträgt, und somit schließlich dazu führt, dass viele Patienten insulinabhängig werden (d. h. Typ I-Diabetes). Insulin besitzt die Fähigkeit, sofort deutliche Amyloidfibrillen zu bilden, wenn es in Lösung gegeben wird. Die nächste Untersuchung wurde deshalb durchgeführt, um zu bestimmen, ob einige der spezifischen Verbindungen mit polyhydroxylierten Aromaten, die einen Abbau/eine Störung der Aβ-Fibrillen bewirken, auch einen Abbau/eine Störung der Inselamyloidfibrillen bewirken.
Für diese Untersuchung wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren der Thioflavin-T-Fluorometrie verwendet. Kurz gesagt, 25 μM humanes Amylin (Bachem) wurden über Nacht (~18 h) bei 37°C alleine oder in Gegenwart von 100 μg/ml der folgenden Verbindungen inkubiert: 1) Exifon, 2) Myricetin und 3) Tannin, jeweils in Gegenwart von 150 μM Tris HCl, 10 μM NaCl, pH 7,0 mit 0,02% Natriumazid, mit einem Gewichtsverhältnis von Amylin: Verbindung von 1:1.
Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Thioflavin-T-Fluorometriemessungen wurden auch 5 μl-Aliquots von Amylin alleine, Amylin plus Myricetin, Amylin plus Exifon und Amylin plus Tannin entnommen, über Nacht auf Gelatine-beschichteten Plättchen luftgetrocknet und wie zuvor beschrieben mit Kongorot gefärbt (Castillo et al., Diabetes 47: 612–620, 1998).
Wie in Tabelle 5 gezeigt wird, waren die polyhydroxylierten aromatischen Verbindungen, die bei der Bewirkung eines Abbaus/einer Störung der Aβ-1-42-Amyloidfibrillen wirksam waren, auch bei der Bewirkung eines Abbaus/einer Störung der Inselamyloidfibrillen wirksam. Alle Ergebnisse waren auf dem Niveau von p < 0,005 signifikant. Tabelle 5: Zerlegung/Störung der Amylinfibrillen, gezeigt durch die Hemmung der Thioflavin-T-Fluoreszenz

Name der Verbindung Fluoreszenzhemmung, %

Myricetin 97,4 ± 0,3

Exifon 99,1 ± 0,5

Tanninsäure 83,8 ± 1,4
Die Färbeexperimente mit Kongorot bestätigten den Abbau/die Störung von Amylinfibrillen durch polyhydroxylierte aromatische Verbindungen, die zunächst durch Thioflavin-T-Fluorometrieuntersuchungen wie oben beschrieben gezeigt wurde. Die Kongorot-Färbung von Amylin alleine zeigte eine positive Färbung (d. h. klassische Rot/Grün-Doppelbrechung bei Ansicht unter polarisiertem Licht, und Hinweis auf Amyloid) (Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 355–364, 1962). Im Vergleich dazu ergab eine Inkubation über Nacht mit Exifon, Myricetin oder Tannin eine deutliche Abnahme der Kongorot-Färbung, was auf einen Abbau/eine Störung der Amylinfibrillen hindeutet.
Es können in vitro- und in vivo-Assays verwendet werden, um die Verbindungen hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bei der Behandlung von Morbus Alzheimer zu untersuchen, wie etwa diejenigen, die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 659 418 beschrieben werden.
Stammlösungen der Peptide (1 mM) wurden in pyrogenfreiem sterilem Wasser frisch hergestellt und in definierten Kulturmedien auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt. Hippocampuskulturen von Ratten (10–14 Tage in vitro) wurden für 4 Tage mit Peptiden oder Vehikel behandelt. Die Lebensfähigkeit der kortikalen Rattenkulturen wurde visuell durch Phasenkontrastmikroskopie bewertet und durch Messung der Lactatdehydrogenase (LDH), die in das Kulturmedium freigesetzt wird, quantifiziert.
Assay 1
Primäre Ratten-Hippocampusneuronen wurden in vitro mit Standardzellkulturtechiken kultiviert. Zu den kultivierten Zellen wird das Amyloid β(Aβ)-Peptid mit einer normalen toxischen Konzentration von 25–50 μM zugegeben. Nach einer 4-tägigen Behandlung wird die Lebensfähigkeit durch Messung der Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH) in das Kulturmedium bewertet. Die Lactatdehydrogenase (LDH) wird in Aliquots von 20 μl konditioniertem, definiertem DMEM unter Verwendung eines kinetischen LDH-Standardassays bei 340 nm (Sigma Katalog-Nr. #228-20) in einem 96-Well-Format gemessen. Die Assays wurden bei 37°C in einem PC-gesteuerten EL340 Microplate Biokinetics-Plattenlesegerät (Bio-Tek Instruments) gemessen, unter Verwendung der Delta Soft II-Software (Version 3.30B, BioMetallics, Inc.) für die Analyse der Daten. Qualitätskontrollstandards mit normalen und erhöhten Mengen an Serum-LDH (beispielsweise Sigma-Enzymkontrollen 2N und 2E) wurden mit jedem Assay durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Unit LDH/I ausgedrückt, wobei 1 Unit als die Enzymmenge definiert ist, welche unter den Assaybedingungen die Bildung von 1 μM Nicotinamidadenindinucleotid pro min katalysiert. Für die Protektionsstudien wird eine Verbindung mit der Formel 1 vor und/oder gleichzeitig mit der Amyloid-β-Behandlung zu den Kulturen zugegeben.
Die Aktivität der Verbindungen wird durch eine Abnahme der in das Medium freigesetzten LDH (ein neurotoxischer Indikator) im Vergleich mit der Kontrolle veranschaulicht.
Assay 2
Fünf bis fünfzig Frauen wurden für eine klinische Studie ausgewählt. Die Frauen waren in der Postmenopause, d. h. die Menstruation hat vor 6 bis 12 Monaten vor Beginn der Studie aufgehört, bei ihnen wurde ein frühes Stadium von Morbus Alzheimer (AD, „Alzheimer's Disease”) diagnostiziert, es wurde erwartet, dass sie innerhalb des Studienzeitraums eine Verschlimmerung der Symptome aufweisen, jedoch weisen sie im Übrigen eine gute allgemeine Gesundheit auf. Die Studie hat eine Placebo-Kontrollgruppe, d. h. die Frauen werden in zwei Gruppen unterteilt, wobei eine davon die erfindungsgemäße Verbindung und die andere ein Placebo erhält. Der Status der Patienten hinsichtlich Gedächtnis, Wahrnehmung, logischem Denken und anderen Symptomen, die mit AD verbunden sind, wird festgestellt. Die Frauen in der Testgruppe erhielten täglich durch den oralen Weg eine therapeutische Dosis der Verbindung. Sie führten diese Therapie für 6 bis 36 Monate weiter durch. In beiden Gruppen wurden genaue Aufzeichnungen hinsichtlich des Status der Symptome geführt, und am Ende der Studie wurden diese Ergebnisse verglichen. Es wurden sowohl die Ergebnisse zwischen den Mitgliedern jeder Gruppe verglichen, und ebenso wurden die Ergebnisse jedes Patienten mit den Symptomen verglichen, die vor Studienbeginn bei jedem Patienten festgestellt wurden. Die Aktivität der Verbindung wird durch eine Abschwächung der typischen kognitiven Verschlechterung und/oder der Verhaltensstörungen, die mit AD verbunden sind, veranschaulicht.
Die Nützlichkeit der Verbindungen wird durch eine Aktivität in mindestens einem der obigen Assays gezeigt.
Obwohl diese Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungen und Beispielen beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann im Hinblick auf diese Offenbarung offensichtlich, dass Äquivalente der speziell offenbarten Materialien und Verfahren bei dieser Erfindung ebenso anwendbar sind, und dass solche Äquivalente von den folgenden Ansprüchen umfasst werden sollen.

Claims

Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers, das an Amyloidose leidet, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer isolierten reinen Verbindung, ausgewählt aus den Verbindungen Formel A und Formel B:
worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy und C_1-6-Alkylthio (bei denen jede der Alkylgruppen gegebenenfalls mit 1 bis 5 Halogenatomen substituiert ist); und einer Halo-Gruppe; X ausgewählt ist aus Wasserstoff und der Gruppe bestehend aus C_1-22-Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit 1 bis 5 Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy und Amino, und der Gruppe von Verbindungen bestehend aus Pyrocatechol, 5-Hydroxydopamin, 1,2,4-Benzentriol, Carbidopa, Desoxyepinephrin, Dioxethedrin, Dopa, Dopamin, Droxidopa, und deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Verbindung nach Formel A oder Formel B oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-Hydroxydopamin und dessen pharmazeutisch annehmbaren Salzen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Amyloidose ausgewählt ist aus der Gruppe von Krankheiten bestehend aus Morbus Alzheimer, Down-Syndrom, hereditärer zerebraler Hämorrhagie mit Amyloidose vom Dutch-Typ, Amyloidose bei chronischen Entzündungen, Amyloidose bei Krebs und familiärem Mittelmeerfieber, Amyloidose bei multiplem Myelom und B-Zell-Dyskrasie, Amyloidose bei Diabetes Typ 2, Amyloidose bei Prionenerkrankungen, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Sträussler-Syndrom, Kuru, Scrapie, Amyloidose, die mit Langzeithämodialyse assoziiert ist, Amyloidose, die mit dem Karpaltunnelsyndrom assoziiert ist, senile Herzamyloidose, familiäre Amyloid-Polyneuropathie und Amyloidose, die mit endokrinen Tumoren assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 3, bei der die Amyloidose Morbus Alzheimer ist.