DE60107942T2

DE60107942T2 - Verwendung von chrysanthon-naturstoffen, die eine antiangiogene wirkung haben

Info

Publication number: DE60107942T2
Application number: DE60107942T
Authority: DE
Inventors: Sergio Penco
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2021-03-13
Also published as: CZ20022761A3; CA2401267A1; JP2004500395A; HUP0302472A2; ITRM20000128A1; WO2001068071A3; IT1317000B1; ATE285230T1; AU2001244537A1; US20030149068A1; PT1274408E; ES2234827T3; EP1274408B1; MXPA02008952A; SK11882002A3; DE60107942D1; US6887883B2; EP1274408A2; KR20020081420A; PL356931A1

Description

Die hierin beschriebene Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen natürlichen Ursprungs für die Behandlung von Erkrankungen, die mit abnormaler Angiogenese verbunden sind.
Angiogenese beim Erwachsenen ist normalerweise unauffällig, repräsentiert aber eine normale Funktion, beispielsweise beim Abheilen von Wunden oder in der Rekonstruktion des Endometriums während des weiblichen Reproduktionszyklus.
Die angiogene Antwort wird physiologisch stimuliert, wenn die vaskulären Funktionen vermindert werden und die Gewebeperfusion inadequat ist. Mehr allgemein kann beansprucht werden, daß bei physiologischen Zuständen Angiogenese ein positives Feedback als Antwort auf die inadäquate Perfusion ausmacht oder zu einer reduzierten Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen führt, wie es z.B. bei der Okklusion einer Arterie, in Situationen von Gewebemassenwachstum (beispielsweise die Neovaskularisierung, die die Bildung von Muskelgewebe begleitet) und beim Fall einer erhöhten Arbeitsbelastung im Zusammenhang mit einem erhöhten Sauerstoff- und Nährstoffbedarf auftritt.
Während des Verlaufes einer lokalen Ischämie aufgrund einer teilweisen oder vollständigen Verstopfung einer Arterie ist die Entwicklung von kollateralen Gefäßen notwendig, um die Perfusion aufrechtzuerhalten.
Der normale Prozeß von Angiogenese wird durch das Gleichgewicht zwischen proangiogenen Molekülen wie Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Plazentawachstumfsfaktor, vaskulärer Endothelialwachstumsfaktor (VEGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF), Angiogenin, Interleukin-8 und Hepatozyten-Wachstumsfaktor und negative Angiogenese-Regulatoren wie Thrombospondin-1, Angiostatin, alpha-Interferon, Prolactin-16-Kd-Fragment, Inhibitoren von Metalloproteinasen (MMPS), Plättchenfaktor 4 und Genistein moduliert.
Es ist gutbekannt, daß das Wachstum eines Primärtumors durch die gute Vaskularisierung des Tumorgewebes favorisiert wird. Eine adäquate Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen fördert ein schnelles Wachstum des Tumors selbst.
Es wurde bewiesen, daß das Ausmaß der Angiogenese ein extrem negativer Faktor bei der Prognose von Neoplasmen sein kann (van Hinsbergh V.W., Collen A., Koolwijk P.; Ann. Oncol., 10 Suppl., 4:60–3, 1999; Buolamwini J.K.; Curr. Opin. Chem. Biol. 3(4):500–9, Aug. 1999).
Es ist ebenfalls auf dem neoplastischen Gebiet bekannt, daß eine fundamentelle Stufe in der Biologie der Tumorzelle die Akquisition der metastasierenden Fähigkeit ist.
Die Tumorzellen, die metastasieren, sind in der Lage, die Anhaftung an umgebende Strukturen zu verlieren, in Blut- und lymphatische Gefäße einzudringen und andere Gewebe bei einem Abstand zu bevölkern, wo sie die eigene Reproduktion fortsetzen.
Die Metastasenbildung ist ebenfalls ein kritischer Ablauf in der klinischen Historie der Krankheit und ist die Hauptursache für den Tod durch den Krebs. Sie ist eng verbunden mit dem Vorhandensein von vaskulärem Gewebe an der Tumorsteller oder benachbarten Flächen und wird hierdurch erleichtert.
Die Migration von Tumorzellen entlang den umgebenden Strukturen ermöglicht, daß die Zellen die intratumoralen Blutgefäße erreichen, wobei sie entweder vorher existieren oder durch Neoangiogenese gebildet werden, und somit den Blutstrom erreichen (Ray J.M., Stetler-Stevenson W.G.; Eur. Respir. J., 7(11):2062–72, 1994; Stetler-Stevnson W.G., Liotta L.A., Kleiner D.E. Jr.; FASEB J., 7(15):1434–41, Dez. 1993).
Das Vorhandensein der Kommunikation zwischen lymphatischen und Blutgefäßen im vaskulären Gebiet des Tumor ermöglich, daß die neoplastischen Zellen in beiden vaskulären Systemen sich bewegen.
Kürzliche Studien haben eine direkte Beziehung zwischen Angiogenese und arthritischer Erkrankung gezeigt (Koch A.E., Arthritis and Rheumatism 41:951–962, 1998). Insbesondere wurde demonstriert, daß die Neovaskularisierung der artikulären Knorpel eine deutliche Rolle bei der Pannusbildung und bei der Progression von Arthritis spielt. Ein normaler Knorpel besitzt keine Blutgefäße, während das Synovialfluid von arthritischen Patienten einen Angiogenese-stimulierenden Faktor enthält, der durch Endothelialzellen (EASF) erzeugt wird.
Das Vorhandensein dieses Faktors ist mit der Vaskularisierung und dem Abbau des Knorpels verbunden.
Andere Erkrankungen sind ebenfalls mit abnormaler Angiogenese verbunden.
Es wurde festgestellt, daß bei diabetischer Retinopathie [Histol. Histopathol. Okt. 1999; 14(4):1287–94], Psoriasis [Br. J. Dermatol., Dez. 1999; 141(6):1504–60], chronischer Entzündung und Atheriosklerose [Planta Med. Dez. 1998; 64(8):686–95] Neovaskularisierung der beeinflußten Gewebe ein erleichternder Faktor darstellt.
Die Kontrolle der Neovaskularisierung ist daher eines der Grundelemente für die Kontrolle und Heilung dieser Erkrankungen.
Verbindungen natürlichen Ursprungs mit antiangiogene Aktivität, die für die menschliche Therapie nützlich sind, sind bereits bekannt.
Zum Beispiel präsentiert Fumagillin, eine Verbindung, extrahiert von dem Pilz Aspergillus fumigatus, eine wesentliche antiangiogene Fähigkeit. Sein synthetisches Derivat, TNP-470 ist in der klinischen Versuchsstufe für die Behandlung von Tumoren (Griffith E.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95(26), 15163–8).
Combrestatin, ein aktiver Bestandteil, extrahiert von der Rinde einer afrikanischen Weide, ist ein starker Inhibitor der Neovaskularisierung und agiert direkt und selektiv auf das Endothelium von Blutgefäßen, die gerade gebildet sind (Cancer Research, 1997, 57, 1829). Diese Verbindung wurde kürzlich in die klinischen Versuche der Phase I und später in Versuche der Phase II als Inhibitor der Angiogenese eingeführt.
Die Curcumine, die phenolische Verbindungen sind, isoliert von dem Arzneimittel Curcuma longa, inhibieren die Angiogenese durch direktes Wirken auf Endothelialmorphogenese durch Modulation der Aktivität einer Anzahl von Proteasen (Cell Growth Diff. 1998, 9(4), 305–12).
Die Zimtaldehyde, Verbindungen, die von der Rinde der Cinnamomum cassia Blume isoliert sind, zeigen eine wesentliche antiangiogene Eigenschaft, die größer ist als die von anderen natürlich auftretenden Verbindungen wie Genistein mit ähnlicher Aktivität (Bioorganic and Medeicinal Chemistry Letters, 1997, 7(19), 2473–6).
Trotz des Fortschrittes der letzten Jahre wird dieser Sektor der pharmakologischen Forschung von vielen Experten auf dem Gebiet der Medizin als einer der vielversprechensten Sektoren für die Ermittlung von neuen Arzneimitteln für die Behandlung von Erkrankungen angesehen, die durch abnormale Angiogenese charakterisiert sind, und insbesondere Tumoren.
Für diese Erkrankungen gibt es tatsächlich ein starkes Bedürfnis für neue Verbindungen, die in der Lage sind, die abnormalen angiogenen Mechanismen, die für solche Erkrankungen verantwortlich sind, zu blockieren oder diese zu behindern, wodurch ermöglich wird, daß für diese Heilungen gefunden werden.
Wie bereits erwähnt, umfassen solche Erkrankungen arthritische Erkrankungen, Tumoren, diabetische Retinopathie, Psoriasis, chronische Entzündung und Atheriosklerose.
Es wurde festgestellt, daß ein natürlich auftretendes Produkt vom Pilzursprung, Chrysanthon A, ein Metabolit, isoliert von Nasini et al. vom Pilz Ascochyta chrysanthemi [Phytochemistry 29, 923 (1989)], bakteristatische und Antipilzaktivität aufweist. Weitere Studien bei diesem Pilzstamm haben die Isolierung von zwei weiteren Verbindungen ermöglicht, die mit Chrysanthon A in Beziehung stehen und mehr spezifisch Chrysanthon B und Chrysanthon C, isoliert von Nasini et al. [Phytochemistry Bd. 29, Nr. 8, S. 2499–2502 (1990)].
Es wurde nun gefunden, das Chrysanthon A, Chrysanthon B und Chrysanthon C eine antiangiogene Aktivität aufweisen und daher nützliche Mittel für die Behandlung von Erkrankungen sind, die durch abnormale Angiogenese charakterisiert sind.
Die Verbindungen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung sind: Chrysanthon A mit der Formel (I):
beschrieben in Phytochemistry 29, 923 (1989);
Chrysanthon B mit der Formel (II):
beschrieben in Phytochemistry Bd. 29, Nr. 8, S. 2499–2502 (1990);
und Chrysanthon C mit der Formel (III):
beschrieben in Phytochemistry Bd. 29, Nr. 8, S. 2499–2502 (1990).
Die Verbindungen gemäß dieser Erfindung weisen antiangiogene Aktivität auf und können daher nützliche Mittel für die Behandlung von Erkrankungen sein, charakterisiert durch abnormale Angiogenese.
Ein Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Herstellung eines Medikamentes mit antiangiogener Aktivität.
Ein anderes Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Behandlung von Erkrankungen vom Tumortyp.
Ein anderes Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Vorbeugung und Verminderung von Tumormetastasen.
Ein anderes Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Behandlung von arthritischen Erkrankungen.
Ein anderes Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Behandlung von diabetischer Retinopathie.
Ein weiteres Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Behandlung von Psoriasis.
Ein anderes Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Behandlung von chronischen Entzündungserkrankungen.
Ein anderes Ziel der hierin beschriebenen Erfindung ist die Verwendung von Chrysanthon A oder Chrysanthon B oder Chrysanthon C für die Behandlung von Atheriosklerose.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung können erhalten werden, wie in Phytochemistry 29, 923 (1989) und Phytochemistry Bd. 19, Nr. 8, S. 2499-2502 (1990) beschrieben ist.
Nachfolgend wird eine Anzahl von experimentellen Daten angegeben, die die Erfindung erläutern.
Beispiel 1
Aktivitätsversuche bezüglich Chrysanthon A
Die pharmakologische Aktivität dieser Verbindung wurde mit Hilfe der Vorhersagen der biologischen Tests ausgewertet, die in vitro den hauptangiogenen Mechanismus reproduzieren. Diese Tests werden allgemein zur Auswertung der pro- oder antiangiogenen Aktivität der untersuchten Verbindungen angewandt.
Toxizitätstests
Die Auswertung der intrinsischen Toxizität von Chrysanthon A erfolgte durch Vergleich mit Suramin unter Verwendung des Sulphorhodamin B (SRB)-Cytotoxizitätstest, der unten beschrieben ist.
Mikrovaskuläre Rinderendothelialzellen (BMEC) wurden bei einer Dichte von 3000 Zellen/Well auf 96-Well-Mikrotiterplatten in normalem Kulturmedium (200 μl/Well) gesät. Am nächsten Tag wurden die Studienverbindungen zu den Wells in skalaren Konzentrationen gegeben. Am dritten Tag nach dem Säen wurde das Medium entfernt und drei Waschungen mit PBS wurden durchgeführt. Am Ende der Waschungen wurden 200 μl Kulturmedium zu jedem Well gegeben und die Platten in einem Inkubator bei 37°C, 5 % CO₂ für die nächsten 48 Stunden gegeben. Am Ende dieser Inkubationsperiode wurde das Medium entfernt und die Zellen kalt eine Stunde mit einer Lösung aus 15 % Trichloressigsäure (TCA) behandelt. Die Wells wurden dreimal mit destilliertem H₂O durch Eintauchen der Platte und durch Entfernen durch Umkippen gewaschen.
200 μl/Well 0,4 % SRB in 1 % Essigsäure wurden zu den Platten gegeben und 30 Minuten inkubiert. Die Wells wurden dreimal mit 1%iger Essigsäure gewaschen und schließlich wurden 200 μl/Well Tris 10 mM zugegeben.
Die Färbung der Wells wurde durch spektrophotometrisches Ablesen bei einer Wellenlänge von 540 nm quantifiziert. Der Vergleich der Werte, erhalten in den Wells, die die Studienverbindung und die Kontrollen enthielt, ermöglichte die Bestimmung von IC₅₀ und IC₀ der Verbindung gemäß dieser Erfindung, definiert als Konzentration, die 50 % cytotoxische Aktivität (IC₅₀) bzw. der maximalen nicht-cytotoxischen Konzentration (IC₀) entspricht.
Die erhaltenen Ergebnisse, die in der Tabelle 1 gezeigt sind, zeigen, daß Chrysanthon A einen IC₅₀ von 1,5 μM auf BMEC aufweist.
Chemotaxis-Test
Dieser Test ist der erste Screening-Assay für Verbindungen mit potentieller Angiogenese inhibierender oder erleichternder Aktivität (Glaser B.M. et al., Nature, 1980; 288:483–4).
Chrysanthon A, eine der Verbindungen, auf die sich die Erfindung bezieht, wurde einem Chemotaxis-Test unter Verwendung der Boyden-Kammer unterworfen (Werner F., Goodwin R.H. und Leonard E. J., Journal of Immunology Methods, 1980; 33:239–247).
Die Realisierung dieses in vitro-Assays führt zur Entwicklung von Techniken für die Isolierung und Kultur von Rinderendothelialzellen von sowohl dem Aorta (BAEC)- als auch dem Adrenal-Mark (BMEC) sowie zur Identifizierung von geeigneten Referenzverbindungen. Einer der Vorteile für die Verwendung der Boyden-Kammer für den Chemotaxis-Test ist die Möglichkeit des Erhalts quantitativer Daten. Die Boyden-Kammer besteht aus einem oberen und einem unteren Well, getrennt durch ein Polycarbonat-Filter mit Poren von 8 μm. Eine Lösung, umfassend den chemischen Lockstoff, wird in dem unteren Well angeordnet, während die Zellen in den oberen Well eingefügt werden. Nach einer Periode der Inkubation werden die Zellen, die entlang dem Filter als Antwort auf den chemotaktischen Stimulus migriert sind, auf der Unterfläche der Membran gezählt.
Bei dem Chemotaxis-Test war der ausgewählte chemische Lockstoff Rinderserum (1 % in DMEM-Kulturmedium). Die BMEC-Endothelialzellen wurden in DMEM mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) resuspendiert und bei diesem Test 4 Stunden analysiert. Die Chemotaxis wurde durch direkte Zellzählung unter dem optischen Mikroskop quantifiziert. Die Migrationsprozentsätze, präsentiert in der Chemotaxistabelle, ausgedrückt als "% Migration" wurden entsprechend der Formel berechnet: (T–C/C) × 100worin T = mittlere Anzahl (n°) von Zellen, die in die Testprobe migrieren und C = mittlere Anzahl von Zellen, die in die Kontrolle migrieren.
Eine Kontrolle, bestehend aus Zellen, die nicht mit der Studienverbindung behandelt sind und die in Richtung zum Serum migrieren, war bei jedem Chemotaxisexperiment enthalten.
Die mittlere Anzahl von migrierenden Zellen betrifft die Ablesungen von 5 mikroskopischen Feldern/Well in 4 unabhängigen Chemotaxis-Wells pro Probe.
Normalerweise wird Suramin als Referenzverbindung bei dem Chemotaxis-Test verwendet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angezeigt und zeigen, daß bei den zwei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von 0,4 μM Chrysanthon A, entsprechend IC₀ die Inhibition der BMEC-Migration 44 % ± 0,7 bzw. 52 % ± 2,8 war.
Tabelle 1
Beispiel 2
Aktivitätstest bezüglich Chrysanthon C
Toxizitätstest
Dieser Test wurde unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse, die in Tabelle 2 angegeben sind, zeigen, daß Chrysanthon C einen IC₅₀ von 35 μM auf BMEC hat.
Chemotaxis-Test
Dieser Test wurde unter Anwendung der Vorgehensweise gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse, die in Tabelle 2 angegeben sind, zeigen, daß unter Verwendung von 10 μM Chrysanthon C, entsprechend seinem IC₀, die Inhibition der BMEC-Migration 54 % ± 7,6 war.
Tabelle 2
Beispiel 3
Cytotoxizitäts-Test auf menschliche Tumorlinien mit Chrysanthon A
Dieses Experiment wurde unter Verwendung der Toxizitäts-Testsvorgehensweise gemäß Beispiel 1 durchgeführt.
Die folgenden 4 menschlichen Tumorlinien wurden untersucht: MCF-7; Mes-Sa; LoVo und LoVo-Dx.
Die erhaltenen Ergebnisse, die in Tabelle 3 repräsentiert sind, zeigen, daß Chrysanthon A eine direkte cytotoxische Wirkung auf die untersuchten Tumorlinien aufweist.
Tabelle 3

Claims

Verwendung von Chrysanthon A mit der Formel (I):
zur Herstellung eines Medikamentes mit antiangiogener Aktivität.
Verwendung von Chrysanthon B mit der Formel (II):
zur Herstellung eines Medikamentes mit antiangiogener Aktivität.
Verwendung von Chrysanthon C mit der Formel (III):
zur Herstellung eines Medikamentes mit antiangiogener Aktivität.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 für die Behandlung von Tumortyp-Erkrankungen.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 zur Vorbeugung und Behandlung von Tumormetastasen.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 für die Behandlung von arthritischen Erkrankungen.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 für die Behandlung von diabetischer Retinopathie.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 für die Behandlung von Psoriasis.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 für die Behandlung von chronischen Entzündungserkrankungen.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 für die Behandlung von Atheriosklerose.