CN101780098A - 迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方及其在治疗帕金森病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方及其在治疗帕金森病中的应用。该复合制剂的药物配方为迷迭香酸与杨梅黄酮的摩尔浓度配比为10∶1。该药物用于神经保护，10-9mol/L迷迭香酸与10-10mol/L杨梅黄酮配比使用时，减轻神经毒素6-羟基多巴胺诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降；减轻神经毒素6-羟基多巴胺诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，具有抗氧化应激作用。该药物能够保护MES23.5多巴胺能细胞免受神经毒素6-OHDA的损伤，安全无毒，副作用小，对于开发成为一种新型的抗帕金森病天然新药具有重要的应用前景和价值。
Description
技术领域：
本发明涉及一种迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方及其在治疗帕金森病中的应用，尤其是涉及迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂药物配方及其在治疗帕金森病中对多巴胺能神经元起神经保护作用的应用。属医药技术领域。
背景技术：
神经退行性疾病是困扰现代社会中老年人群的重大脑疾病，帕金森病(PD)以发病率仅次于居首位的老年痴呆病排列第二。无论是从社会学角度还是从市场经济角度，PD已经成为影响我国乃至世界人口健康水平和生活质量，阻碍经济持续发展的重大社会问题。PD主要病理变化为黑质多巴胺能神经元丢失，多巴胺递质含量减少。虽然PD的可能致病因素很多，但确切机制还不清楚。更为严重的是，至今尚无成熟有效的药物或方法能阻止或逆转PD病情的发展。目前PD的治疗仍以药物治疗为主。左旋多巴——作为治疗PD的经典药物，长期应用后大部分患者会出现多动症、疗效波动和开关现象，其用药副作用不仅严重影响病人的生活，而且难以纠治。因此人们一直致力于从分子、细胞和整体水平上，多层次、多角度研究PD的发病机理，以寻求有效的预防和治疗的药物及方法。开发新型的能够防治PD及具有神经保护作用的药物尤其是天然提取物将对保护人类健康具有重要的现实社会意义和应用经济价值。
迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)是一种水溶性的含多酚羟基的酸，其化学名称为[R(E)]α-[[3-(3，4-二羟基苯基)-l-氧代-2-丙烯基]氧基]-3，4-二羟基苯丙酸。1958年首次从迷迭香植物中分离提取而得名。迷迭香酸为天然抗氧化剂，有抗氧化、抗炎、免疫抑制等多种活性。杨梅黄酮(Myricetin)是一种脂溶性的黄酮类植物提取物，其化学名称为3，5，7-三羟基-2-(3，4，5-三羟基苯基)-4H-1-苯并呋喃-4-酮，具有抗炎、抗肿瘤、抗突变、预防龋齿、抗氧化性、消除体内自由基等多种药理活性，已广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品等领域，并可作为添加剂用作治疗、预防关节炎和其它各种炎症。目前迷迭香酸已有多项相关专利用于抑制血糖水平升高，预防、控制或治疗糖尿病或肥胖症；制备治疗或预防冠心病、心绞痛、脑损伤；治疗或预防急慢性肾功能衰竭；升高白细胞及血小板等等；杨梅黄酮已有保健酒的相关专利。
迷迭香酸和杨梅黄酮的化学结构明确，结构式分别为：
迷迭香酸 杨梅黄酮
本发明人从事迷迭香酸和杨梅黄酮的综合开发利用研究，长期研究和大量试验结果表明，作为结构明确的天然植物提取物，迷迭香酸和杨梅黄酮来源丰富，配比使用毒性低，副作用小，足以其作为药物开发的新靶点。其在PD中是否具有防治作用未见报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服目前传统的抗PD药物都有一些不良反应，严重地限制了其应用和推广的缺点，旨在提供一种迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂的药物配方及其在治疗帕金森病中的应用。本发明人通过长期研究和大量试验发现，迷迭香酸与杨梅黄酮复合制剂具有明显的神经保护作用，其发挥作用的浓度无任何毒副作用，故在治疗PD和神经保护方面有良好的应用前景。同时，迷迭香酸与杨梅黄酮复合制剂作为结构明确的天然植物提取物，来源丰富，毒性低，具有良好的神经保护及抗氧化应激作用，有着巨大的新药开发价值。
为了实现上述发明目的，本发明的迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂的药物配方是：迷迭香酸与杨梅黄酮的摩尔浓度配比为10∶1。迷迭香酸和杨梅黄酮均为天然植物提取物。迷迭香酸可以从迷迭香植物如紫苏中提取获得。
本发明的迷迭香酸-杨梅黄酮药物在治疗帕金森病中的应用，其特征在于该复合制剂用于神经保护，其机制与抗氧化应激有关：
1、10-9mol/L迷迭香酸与10-10 mol/L杨梅黄酮配比使用时，可以明显减轻神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降；
2、10-9mol/L迷迭香酸与10-10mol/L杨梅黄酮配比使用时，可以明显减轻神经毒素6-OHDA诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，具有抗氧化应激作用。
本发明的迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂药物配方在体外实验中证实迷迭香酸-杨梅黄酮配比使用能够保护MES23.5多巴胺能细胞免受神经毒素6-OHDA的损伤，其保护作用与抗氧化应激有关。通过迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂药物在体外的细胞毒性实验证实其发挥保护作用的浓度不具有毒性。本发明对于开发成为一种新型的国家I类抗PD天然新药具有重要的应用前景和价值。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方在MES23.5多巴胺能细胞上发挥神经保护作用实验
一、实验材料
(一)细胞
MES23.5多巴胺能细胞由美国休斯敦贝勒医学院乐卫东教授惠赠。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
(二)药品及试剂
迷迭香酸由青岛大学医学院生物学教研室李荣贵教授提供(李荣贵，中国专利CN1796362，紫苏迷迭香酸的生产工艺)，以Dulbecco′s modification of Eagle′s medium/F12(Dulbecco改良的Eagle培养基/F12，DMEM/F12)培养液(Gibco公司)溶解后以10-3mol/L储存。实验时稀释为所需浓度10-9mol/L。杨梅黄酮为Sigma公司产品，以二甲亚砜(DMSO)溶解后以10-3mol/L储存，实验时用DMEM/F12培养液稀释为所需浓度10-10mol/L。DMSO，2，7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(H2DCF-DA)，6-OHDA，罗丹明123，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)为Sigma公司产品。
(三)仪器
酶标仪：R-T-2100C，深圳雷杜公司。超净工作台：苏州净化设备工程有限公司。CO2培养箱：美国热电公司。倒置生物光学显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司。流式细胞仪：美国BD Biosciences公司。
二、实验方法
1、MTT测定细胞存活率：取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。贴壁后加入迷迭香酸(10-9mol/L)和杨梅黄酮(10-10mol/L)预孵育12h后，与6-OHDA(100μmol/L)共培养24h；之后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃培养箱中培养4h；弃上清后每孔加入DMSO 200μl，自动酶标读数仪比色(主波长573nm，次波长630nm)，测定其吸光度值，并计算各组MES23.5多巴胺能细胞的存活率。细胞存活率＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
2、细胞线粒体跨膜电位的检测：细胞按上述处理后加入荧光染料罗丹明123(终浓度为5μmol/L)37℃避光负载30min；用N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液(20mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，pH＝7.4)洗3次后再用1ml缓冲液重悬；以激发波长488nm，发射波长523nm测定，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞罗丹明123的荧光强度。
3、细胞内活性氧物质(ROS)检测：细胞按上述处理后加入荧光染料H2DCF-DA(终浓度为5μmol/L)37℃避光负载30min；用HEPES缓冲液洗3次后再用1ml缓冲液重悬；以激发波长488nm，发射波长523nm测定，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞H2DCF-DA的荧光强度。
4、统计学处理：实验结果采用SPSS软件进行处理，均数的比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行比较，继以Student-Newman-Keuls进行两两均数间的比较。
三、实验结果
(一)迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方对神经毒素6-OHDA处理的MES23.5多巴胺能细胞具有神经保护作用
从表1可以看出，MTT法显示当只加入6-OHDA时，细胞的存活率明显下降，而用迷迭香酸(10-9mol/L)和杨梅黄酮(10-10mol/L)预孵育后，细胞的存活率均有上升，与6-OHDA单独作用组相比有统计学意义，表明迷迭香酸和杨梅黄酮在体外配比使用可以对神经毒素损伤的MES23.5多巴胺能细胞有明显的保护作用。
表1 迷迭香酸-杨梅黄酮配比使用减轻神经毒素6-OHDA诱导的细胞存活率的下降
＊P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with 6-OHDA
(二)迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂的抗氧化应激作用
1.细胞线粒体跨膜电位(ΔψM)的检测
6-OHDA处理细胞后，细胞内线粒体跨膜电位出现明显的下降，10-9mol/L迷迭香酸与10-10mol/L杨梅黄酮配比使用可以明显恢复线粒体跨膜电位，与6-OHDA单独作用组相比有统计学意义(表2)。
2.细胞内活性氧物质(ROS)的检测
6-OHDA处理细胞后，细胞内活性氧物质的明显增加，10-9mol/L迷迭香酸与10-10mol/L杨梅黄酮配比使用可以明显降低细胞内活性氧物质水平，与6-OHDA单独作用组相比有统计学意义(表2)。
表2 迷迭香酸-杨梅黄酮配比使用对细胞线粒体跨膜电位和ROS的影响
＊P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with 6-OHDA
实施例2：迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂药物配方的体外毒性实验
一、实验材料
(一)药品和试剂
MTT，DMSO。
(二)仪器
酶标仪：R-T-2100C，深圳雷杜公司。
二、实验方法
取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞融合度达到70-80％后换用无血清培养基及药物处理，加入迷迭香酸(10-9mol/L)与杨梅黄酮(10-10mol/L)，孵育MES23.5多巴胺能细胞24h后，阴性对照组只用无血清培养基替换，每个浓度设6个复孔；培养结束前4h，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃培养箱中培养4h；弃上清后每孔加入DMSO 200μl，自动酶标读数仪比色(主波长573nm，次波长630nm)，测定其吸光度值，并计算各组MES23.5细胞的存活率。细胞存活率＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
三、实验结果
结果显示迷迭香酸(10-9mol/L)和杨梅黄酮(10-10mol/L)配比使用处理细胞24h后，细胞存活率(0.987±0.102)与对照组(1.000±0.000)相比没有统计学意义。表明实验所用浓度的迷迭香酸-杨梅黄酮复合制剂没有表现出细胞毒性作用。
通过以上实验表明，迷迭香酸-杨梅黄酮配比使用(摩尔浓度配比为10∶1)能对MES23.5多巴胺能细胞发挥神经保护作用。该药物配方可以明显减轻神经毒素6-OHDA诱导的MES23.5细胞存活率的下降；明显减轻细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，无细胞毒性，副作用小，具有神经保护及抗氧化应激的作用。
Claims (3)
1.一种迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方，其特征在于迷迭香酸与杨梅黄酮的摩尔浓度配比为10∶1。
2.根据权利要求1所述的迷迭香酸-杨梅黄酮药物配方，其特征在于所述的迷迭香酸和杨梅黄酮均为天然植物提取物，其中迷迭香酸从迷迭香植物紫苏中提取获得。
3.一种迷迭香酸-杨梅黄酮药物在治疗帕金森病中的应用，其特征在于该复合制剂用于神经保护，10-9mol/L迷迭香酸与10-10mol/L杨梅黄酮配比使用时，减轻神经毒素6-羟基多巴胺诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降；减轻神经毒素6-羟基多巴胺诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，具有抗氧化应激作用。
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