KR102098780B1 - 블랙쵸크베리 추출물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
블랙쵸크베리 추출물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 블랙쵸크베리 추출물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퀸산을 함유하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
빠른 의학기술의 발달로 인간의 수명이 연장되고, 고령화 사회로 접어들면서 퇴행성 뇌질환은 사회적 문제로 대두 되고 있다. 노령화 과정에서 발생하는 뇌 질환의 장애는 지속적으로 증가하며, 경제적, 사회적 부담을 증가시키고 있다. 이러한 이유로 뇌질환치료제의 약물개발은 매우 중요다. 퇴행성 뇌질환 중 대표적인 알츠하이머 병(Alzheimer disease, AD)과 치매는 진행성 기억 상실로 특징지어지는 신경 변성 질환이다. AD는 병인 학적으로 복잡하며 β-아밀로이드 펩타이드의 축적, β-아밀로이드의 축적, 과산화된 타우, 자유 라디칼 및 염증 반응과 같은 인자들로 인해 발생되는 것으로 알려져 있다. 최근 보고에 따르면 AD 환자의 신경 병리학적 변화는 전형적으로 뇌에서 β-아밀로이드 펩타이드 축적 후의 해마 퇴화가 주요 원인의 하나로 밝혀졌다.
β-아밀로이드는 알츠하이머 환자의 뇌에서 발견된 물질로 아밀로이드플라크의 주성분이 되는 펩타이드이며, 신경세포의 사멸을 유도하는 주요 인자이다. β-아밀로이드의 생성 경로가 다양하게 알려져 있으나, 그 중에서 다량의 과다염증반응 축적을 유발할 수 있다.
생체 내 염증반응은 자극원에 대한 생체 내 방어기전 중의 하나로 세포의 손상억제와 괴사상태의 세포를 제거함과 동시에 조직재생을 유도하는 데 그 목적이 있다. 하지만, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)와 같은 분자는 분자수준에서 만성 염증유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 및 유도성 산화질소(NO), 유도형 일산화질소화 효소(iNOS), 시클로옥시게나아제 2(COX-2) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)와 같은 염증성 인자의 과발현을 유도한다. 특히, 신경세포와 교세포로 이루어진 신경계에서 미세아교세포(microglia)가 염증반응에 관여하며, LPS와 같은 자극원 등으로부터 과잉반응을 초래하는 경우 상기의 인자를 과발현하여 신경세포의 사멸을 유도할 수 있다. 매해 50,000명 이상이 퇴행성 뇌질환에 대헤 새롭게 진단을 받고 있으나, 많은 연구에도 불구하고 병인의 기전에 대한 명확한 원인을 규명하지 못하였다[Arevalo et al., Mov. Disord. 1997, 12, 277-284].
현재 치료방법은 대증적 치료제를 이용하고 있고, 대표적으로는 도파민 (dopamine)의 전구체인 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA), 모노아민 옥시다제 억제제 그리고 도파민 수용체 길항제(아고니스트) 등이 있다. 그러나 이러한 방법들은 병의 진행을 지연시켜 줄 뿐 근원적인 치료가 되지 않으며, 장기간의 복용에 따른 부작용과 합병증을 동반한다. 이에, 부작용이 적고, 항염증 효과와 신경세포 사멸의 효과가 있는 신규한 뇌질환 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.퀸
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 수용성 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 퀸산을 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 간질, 인지장애, 치매, 신경세포 손상성 뇌질환, 퇴행성 뇌질환, 우울증, 불면증 및 불안증으로 구성된 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 뇌질환은 염증반응으로 인해 생성된 β-아밀로이드 축적으로 유발된 뇌질환일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경보호 및 항염증 효과를 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 블랙쵸크베리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 얻는 단계; 및 (2) 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물로부터 수용성 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 퀸산을 포함하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물은 미세아교세포(microglia) 내 발생하는 염증 반응을 완화시킬 수 있으며, 동시에 신경세포를 보호하여 β-아밀로이드의 축적에 의한 신경세포 사멸을 억제할 수 있으므로, 염증반응 또는/및 신경세포 사멸에 의해 유발되는 뇌질환, 특히, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 간질, 인지장애, 치매, 신경세포 손상성 뇌질환, 퇴행성 뇌질환, 우울증, 불면증 및 불안증 등을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물에 의한 신경보호작용 메카니즘을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2A는 본 발명에 따른 실시예 1이 BV2의 세포독성에 미치는 영향을 평가한 것으로서, BV2를 각각 실시예 1로 무처리, 0, 30, 100, 300, 1000 및 2000 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤 48시간 뒤에 세포독성을 평가한 결과이고, 도 2B는 LIVE/DEAD Cell Viability Assays kit로 염색한 세포를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1이 LPS 유도 일산화질소 생성 저해에 미치는 영향을 평가한 것으로서, BV2를 각각 실시예 1로 무처리, 0, 30, 100, 300 및 1000 ㎍/mL의 농도 및 LPS(500 ng/mL) 처리한 뒤, 일산화질소 생성 억제 효과를 평가하였다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1이 염증성 사이토카인 생성 저해에 미치는 영향을 평가한 것이다. (A) iNOS, (B) COX-2, (C) IL-1β 및 (D) TNF-α.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 1의 처리에 의한 알츠하이머병 마우스모델의 해마영역에서 염증 발현 억제 효과를 확인한 것이다. (A)는 H&E 염색을 통한 조직학적 변화 분석 결과이며, (B)는 염증지표 면역화학적 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 실시예 2의 세포독성 및 신경보호 효과를 확인한 것이다. 도 6A는 실시예 1 및 실시예 2 처리된 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 6B는 실시예 1의 세포독성을 평가한 결과이며, 도 6C는 실시예 2의 세포독성을 평가한 결과이다. 도 6D는 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸에 대한 실시예 1의 처리에 의한 신경세포보호 효과이며, 도 6E는 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸에 대한 실시예 2의 처리에 의한 신경세포보호 효과이다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 1의 지표성분을 LC/MS로 확인한 결과이다.
도 2A는 본 발명에 따른 실시예 1이 BV2의 세포독성에 미치는 영향을 평가한 것으로서, BV2를 각각 실시예 1로 무처리, 0, 30, 100, 300, 1000 및 2000 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤 48시간 뒤에 세포독성을 평가한 결과이고, 도 2B는 LIVE/DEAD Cell Viability Assays kit로 염색한 세포를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1이 LPS 유도 일산화질소 생성 저해에 미치는 영향을 평가한 것으로서, BV2를 각각 실시예 1로 무처리, 0, 30, 100, 300 및 1000 ㎍/mL의 농도 및 LPS(500 ng/mL) 처리한 뒤, 일산화질소 생성 억제 효과를 평가하였다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1이 염증성 사이토카인 생성 저해에 미치는 영향을 평가한 것이다. (A) iNOS, (B) COX-2, (C) IL-1β 및 (D) TNF-α.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 1의 처리에 의한 알츠하이머병 마우스모델의 해마영역에서 염증 발현 억제 효과를 확인한 것이다. (A)는 H&E 염색을 통한 조직학적 변화 분석 결과이며, (B)는 염증지표 면역화학적 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 실시예 2의 세포독성 및 신경보호 효과를 확인한 것이다. 도 6A는 실시예 1 및 실시예 2 처리된 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 6B는 실시예 1의 세포독성을 평가한 결과이며, 도 6C는 실시예 2의 세포독성을 평가한 결과이다. 도 6D는 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸에 대한 실시예 1의 처리에 의한 신경세포보호 효과이며, 도 6E는 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸에 대한 실시예 2의 처리에 의한 신경세포보호 효과이다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 1의 지표성분을 LC/MS로 확인한 결과이다.
생체 내 염증 반응은 자극원에 대한 생체 내 방어 기전중의 하나로서, 세포의 손상 억제와 괴사상태의 세포를 제거함과 동시에 조직재생을 유도하는데에 목적이 있다. 신경세포와 교세포로 이루어진 신경계에서 미세아교세포는 염증 반응에 관여하며, LPS와 같은 자극원 등으로부터 과잉반응을 초래하는 경우, 염증성 사이토카인, 산화질소(NO), 일산화질소화 효소(iNOS), 시클로옥시게나아제 2(COX-2) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 등과 같은 염증성 인자가 과발현 된다.
산화질소(NO)는 세포 내에서 nitric oxide synthase (NOS) 효소에 의해 생성된다. 특히 inducible NOS (iNOS)는 뇌에 존재하는 소교세포와 성상세포에서 작용하는 효소이다. 평소에는 매우 낮은 농도로 존재하다가 세포가 활성되는 경우에 발현되고, 결과적으로 뇌 NO 농도를 현저히 (약 100 배) 증가시킨다. 퇴행성 뇌질환 환자의 뇌에서는 이렇게 증가된 iNOS의 발현이 휴식상태로 되돌아가지 못하고 NO를 장기적, 지속적으로 생성한다. 그러므로 iNOS를 비롯한 염증성 인자를 제어하고, 신경세포를 보호하는 조성물은 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 발명자들은 블랙쵸크베리(Arobia melanocarpa) 열매의 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 항염증 효과와 신경세포 사멸 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 퀸산을 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 1]
본 발명에 의하면, 상기 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 간질, 인지장애, 치매, 신경세포 손상성 뇌질환, 퇴행성 뇌질환, 우울증, 불면증 및 불안증으로 구성된 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 염증반응으로 인해 생성된 β-아밀로이드 축적으로 유발된 뇌질환일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 조성물은 뇌신경보호 및 항염증 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 환자의 연령, 체중 및 상태와 투여경로를 비롯한 각종 요인에 따라 투여량은 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 블랙쵸크베리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 얻는 단계; 및 (2) 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물로부터 수용성 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물로부터 뇌질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 바람직한 유효성분을 수득하기 위하여 크로마토그래피법 또는/및 재결정법 등을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물의 바람직한 유효성분은 퀸산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물로부터 분리된 퀸산이 블랙초크베리 에탄올 추출물 또는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물보다 염증성 인자 발생을 저해하는 효과가 우수하며, 신경보호 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명에 의하면, 상기 (1) 단계는 블랙쵸크베리 열매를 70 내지 100 부피% 에탄올 수용액에 침지하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 100%에 침지하는 것일 수 있다. 상기 침지는 6시간 내지 48시간일 수 있다. 침지액은 여과하여 상등액만을 회수한다.
다음으로, 상기 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 얻는다. 바람직하게는 상기 회수된 에탄올 추출물을 농축한 다음 물에 현탁시키고, 분리하여 수용성 성분만을 분리하여 수득될 수 있다.
본 발명에 의하면, 뇌질환 예방 또는 치료에 특히 바람직한 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물의 유효성분은 퀸산일 수 있다. 본 발명은 뇌질환 예방 또는 치료에 특히 바람직한 유효성분을 수득하기 위해 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 정제는 크로마토그래피법 또는/및 재결정법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 생약성분으로부터 단일 성분을 분리하기 위한 방법이면 제한은 없다.
또한, 본 발명은 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물은 사용목적 및 사용방법에 따라 그 함량을 조절하여 포함할 수 있으며, 바람직하기로는 0.001 내지 10 중량%로 함유될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.
실시예
시약: 세포배양에 주요시약은 Gibco BRL(Carlsbad, CA, USA)사에서 구매하여 사용하였다. 면역항체반응을 위한 실험에서 쓰이는 항체는 iNOS, COX-2, TNF-α 이며, Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)사의 것을 사용하였다. 면역화학적염색 방법을 위해서 Vector Laboratories(Burlingame, CA, USA)사의 VECTASTAIN ABC Kit를 사용하였고, 이외의 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사에서 구매하여 사용하였다.
통계학적 분석
모든 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험 (n ≥ 3)의 평균 ± 표준 오차 (SE)로 표현하였다. 그룹간의 차이는 Student's t-test 와 one-way analysis of variance (ANOVA)를 사용하였다. Tukey's test(GraphPad Prism ver. 4.00 for Windows, La Jolla, CA, USA)는 다중 비교에 사용하였다. P-value < 0.05는 통계적으로 유의하다고 간주된다.
실시예 1.
건조된 블랙쵸크베리 열매 100 g을 분쇄하였다. 1000 mL의 무수 에탄올을 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 정치하였다. 24시간 후, 상등액만을 걸러내고 저온감압 장치를 사용하여 농축하였다. bath의 온도를 60℃로 유지하여 에탄올을 완전히 제거하였다. 조농축물은 증류수 50 ml에 용해시킨 뒤, 용해물을 -60 ℃에서 분말화하였다.
실시예 2.
실시예 1의 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)법으로 분리하여 지표성분인 퀸산을 단일 성분으로 수득하였다.
HPLC 분석은 광다이오드 어레이 검출기에 연결된 sunfire C18 ODS 4.6×150 mm 컬럼(Waters Corporation, USA)을 사용하여 수행하였다. 이동상은 아세토니트릴 0.1%(v/v)과 포름산 0.1%(v/v)을 함유하는 물을 유속 1 mL/min으로 사용하였다. LC/MS를 측정하여 지표성분인 퀸산(MW 192.7)을 확인하였으며, 이를 하기 도 7에 나타내었다. 실시예 1은 퀸산을 약 0.023 mg/mg 함유하는 것으로 나타났다.
시험예 1. 세포독성 테스트
본 발명에 따른 실시예 1이 BV2 세포에 미치는 세포독성을 평가하였다. 구체적으로, 한국세포주 은행으로부터 BV2 세포주를 구매하여 실험에 사용하였다. 배양세포는 10 % fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin-streptomycin(PS) 첨가한 DMEM에서 배양조건(37 ℃, 5% CO2)를 통해 세포수를 유지하였다. 세포 독성의 확인은 무처리군을 대조군으로, 실시예 1을 다양한 농도(30, 100, 300, 1000 및 2000 ㎍/mL)로 처리한 후 48시간 뒤 MTT 처리방법과 LIVE/DEAD Cell Viability Assays kit(ThermoFisher 사)를 활용하여 현미경으로 관찰하여 분석하였다.
도 2A는 BV2 세포를 각각 실시예 1로 무처리, 0, 30, 100, 300, 1000 및 2000 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤 48시간 뒤에 세포 독성을 평가한 것이다. 도 2B는 세포독성의 시험을 보다 정확히 판단하기 위하여 LIVE/DEAD Cell Viability Assays kit로 염색한 세포를 현미경으로 관찰한 결과이다. 세포의 생존시에만 녹색의 형광을 나타내고 있는 바, 본 발명의 실시예 1에 따른 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물은 세포 독성이 없음을 확인하였다.
시험예 2. NO 생성 저해효과 테스트
BV2 세포에서 본 발명에 따른 실시예 1의 처리가 LPS 유도 NO 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 구체적으로 BV2 세포(5×104 세포)을 준비하고, 실시예 1로 무처리, 0, 30, 100, 300 및 1000 ㎍/mL의 농도 및 LPS(500 ng/mL) 처리한 뒤, LPS 500 ng/mL를 48시간 처리하여 유도 NO 생성에 대해 griess 용액에 반응시켜 수치적 해석을 하였다. 반응은 시험이 종료된 세포의 상등액을 100 μL 씩 새로운 용기로 옮겨 동량의 Griess reagent를 처리 한 후 30분간 암소에서 반응시켰다. 수치적 해석은 520 nm에서 ELISA reader로 측정한 수치를 무처리군을 음성대조군으로 지정하고 LPS 처리군의 증가수치를 양성대조군화 하여 비교분석하였으며, sodium nitrate 표준곡선으로 생성량을 수치화하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 농도의존적으로 NO 생성이 저해된 것이 관찰되었다.
시험예 3. 염증성 사이토카인 생성 저해 평가
BV2 세포에서 본 발명에 따른 실시예 1의 처리가 염증성 사이토카인 생성 저해에 미치는 영향을 평가하기 위하여 mRNA 수준에서 변화를 분석하였다. 구체적으로, Total RNA는 TRI reagent 시약의 사용법을 따라 세포를 용해하여 분리하였다. 측정된 mRNA의 발현은 PCR 역전사 효소를 갖는 thermocycler를 사용하여 수행하였다. 간단히 하게, first-strand cDNA는 SuperScript II reverse transcriptase 제조사의 프로토콜을 따라 합성하였다. Real-time PCR와 thermocycler를 이용하여 cDNA를 증폭시켰다. Real-time PCR은 다음과 같은 조건으로 실행하였다 : Initial denaturation(10min, 95C), denaturation 40 cycle(30s, 95C), annealing(30s, 60C) 그리고 extension (30s, 72C). Primer sequence는 다음과 같다: iNOS(5-CAG GAG GAG AGA GAT CCG ATT-3 and 5-GCA TTA GCA TGG AAG CAA AGA-3); COX-2 (5-CTG GTC GGT TTG ATG CTA-3 and 5-CGA GTC GTT CTG CCA ATA-3); IL-1β (5-TAC CAG TTG GGG AAC TCT GC-3 and 5-TGG AAA AGC GGT TTG TCT TC-3); TNF-α (5-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC-3 and 5-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG-3); GAPDH (5-TGT CAT CAT ATC TGG CAG GTT-3 and 5-GGC CTT CCG TGT TCC TAC-3).
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 처리는 iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 생성을 효과적으로 저해하는 것이 관찰되었다.
시험예 4. in-vivo 테스트
본 발명에 따른 실시예 1의 in-vivo 효과를 확인하였다. ICR계 수컷 마우스(체중 20~30g)를 실험에 사용하였다. 마우스는 물과 사료(AIN 93G formula)를 자유롭게 식이 할 수 있도록 개별적으로 보관하였다. 모든 마우스는 통제된 환경(실내온도 24±2 ℃; 습도 40±2%; 명암 사이클 12 시간)에 보관하였다. 모든 실험과 동물 관리는 동국대학교의 지침(IACUC-2014-005)에 따라 수행하였다. 마우스(6 주령, n=30)을 세 그룹으로 무작위로 나누었다. 미처리 그룹(대조군)은 생리 식염수를 투여하였다. LPS 유발 뇌손상 군(LPS)은 250 g/kg의 LPS를 단일 복강 i.p) 주사를 받았다. 실험군은 식염수에 실시예 1(50 mg/kg/day)을 투여한 뒤, 1시간 이후 LPS를 투약하였다. 실시예 1은 7일 동안 매일 구강투여 하였다. 실시된 동물은 7일 후 희생한 뒤, 뇌를 해부하였다.
마우스의 LPS 유도 손상성 뇌의 해마영역을 조직화학적(Histochemistry) 분석 및 면역조직화학적(immunohistochemistry) 분석을 통해 염증인자의 변화를 분석하였다. 구체적으로, 마우스의 뇌를 차가운 PBS로 세척하고 2% 포르말린으로 고정하였다. 각 절반의 조각을 파라핀에 끼워 넣고 5μm 슬라이스로 연속 section을 만들었다. 조제된 부분은 자일렌으로 수세하고, 에탄올 농도별(70%, 80% 그리고 90%)로 수화시켰다. section은 헤마톡실린&에오신(H&E)와 크레실 바이올렛으로 염색을 하였다. 일부 section은 iNOS, COX-2, IL-1와 TNF- 4C primary antibody를 16시간 동안 배양하였다. 면역염색법은 VECTASTAIN ABC Kit 내 시험정보에 따라 수행하였다.
본 발명에 따른 실시예 1의 처리는 LPS로 유도한 염증 발현 동물모델의 해마영역에서 조직 손상을 억제한 결과를 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다. 도 5A는 해마영역(hippocampus)에서 LPS 유도에 의한 손상영역이 CA1(Cornu Ammonis 1)영역과 DG(the dentate gyrus)영역에서 나타난 것을 H&E 염색법으로 확인한 결과이며, 도 5B는 실시예 1의 처리에 의해 LPS로 유도된 염증 발현 동물모델의 해마영역에서 염증지표가 유의성 있게 감소된 것을 보여주는 결과이다.
시험예 5. 퀸산의 약리활성 평가
마우스 태아로부터 뇌를 적출하여 신경세포를 분리한 뒤, neurobasal medium과 1% L-glutamine,1% PS 그리고 B27를 첨가하여 배양하였다. 세포독성의 확인은 무처리군을 음성대조군으로, β-아밀로이드(aβ) (20uM)을 처리군을 양성대조군으로, 실험군은 실시예 1 및 실시예 2를 각각 β-아밀로이드 처리와 동시에 처리한 뒤 48시간 배양하고 MTT 처리방법과 LIVE/DEAD Cell Viability Assays kit(ThermoFisher 사)를 활용하여 현미경으로 관찰하여 분석하였다.
도 6A는 실시예 1 및 실시예 2 처리된 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과이다. 신경세포에 SDS를 처리한 경우 세포사멸이 나타나는 반면, 실시예 1 및 실시예 2를 함께 처리한 경우 세포사멸이 일어나지 않았다. 특히, 실시예 2의 처리는 더 많은 형광이 관찰되었으며, 신경세포 보호 효과가 뛰어난 것으로 확인되었다. 도 6B 및 6C는 각각 실시예 1 및 실시예 2 처리된 군의 세포독성을 그래프로 나타낸 것으로, 모두 세포독성이 없는 것으로 나타났다.
도 6D는 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸에 대한 실시예 1의 처리에 의한 신경세포보호 효과이며, 도 6E는 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸에 대한 실시예 2의 처리에 의한 신경세포보호 효과이다.
실시예 1은 100 μM 농도 수준에서 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸로부터 신경세포를 100% 보호하였으나, 실시예 2는 더 낮은 농도인 10 μM 농도 수준에서 β-아밀로이드 처리에 의한 세포사멸로부터 신경세포를 100% 보호하였다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1로 표시되는 퀸산을 유효성분으로 포함하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 파킨슨병은 염증반응으로 인해 생성된 β-아밀로이드 축적으로 인한 것인, 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 뇌신경보호 및 항염증 효과를 가지는 것인, 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - (1) 블랙쵸크베리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 얻는 단계; 및
(2) 상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물로부터 수용성 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법으로,
상기 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 퀸산을 유효성분으로 포함하는 것인 제조방법:
[화학식 1]
.
- 삭제
- 삭제
- 하기 화학식 1로 표시되는 퀸산을 유효성분으로 포함하는 블랙쵸크베리 에탄올 추출물의 수용성 분획물을 포함하는 파킨슨병 예방 또는 개선용 식품 조성물:
[화학식 1]
.
- 삭제
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