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Hintergrund
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Es
besteht ein Bedarf nach Behandlungen, die Zellen vor einem Tod beschützen, der
sich aus Krankheitsepisoden, Trauma, Isolierung und Entfernung von
Geweben oder Zellen aus dem Körper
oder aus der Exposition gegenüber
Toxinen ergibt. Dieser Bedarf erstreckt sich auf Behandlungen für einen
Nervenzellverlust, der mit chronischen oder akuten neurodegenerativen
Störungen
oder Verletzungen in Verbindung steht: Behandlungen zur Minimierung
einer Gewebsschädigung,
die sich aus einer Ischämie
ergibt, wobei die Ischämie als
Folge eines Schlaganfalls, einer Herzkrankheit, eines Transplantationsereignisses
oder eines anderen Ereignisses auftreten kann, die ein Abschneiden
der Nährstoffzufuhr
zu den Geweben zur Folge hat; und eine Behandlung zur Modulierung
eines Zelltodes, der mit Zuständen,
wie beispielsweise Osteoporose oder Anämie in Verbindung steht. Das
Fehlen einer effektiven cytoprotektiven Therapie kann entweder den
Verlust des Lebens oder eine allgemeine Abnahme der Lebensqualität einschließlich einer
dauerhaften Behinderung mit hohen Pflegekosten für Patienten, deren Familien
und den Gesundheitsversorgern zur Folge haben. Ein Ansatz zur Minimierung
pathologischer Veränderungen
war ein Versuch, den oxidativen Stress, der mit einer Akkumulation
freier Radikale im extrazellulären
Raum in Verbindung steht, zu neutralisieren. Mooradian, J. Steroid
Biochem. Molec. Biol. 45 (1993) 509 bis 511, haben berichtet, dass
bestimmte Östrogene
signifikante antioxidative Eigenschaften in biochemischen in vitro
Assays aufweisen, jedoch ist diese Wirkung nicht bei allen Östrogenen
ersichtlich. Wegen der Variation antioxidativer Eigenschaften, die
von Mooradian in seinen biochemischen Assays bemerkt wurde, schloss
er, dass Steroid-Moleküle bestimmte
antioxidative Determinanten aufweisen müssen, die bis jetzt unbekannt
sind. Ähnliche
Beobachtungen, die Steroide mit phenolischen A-Ringen betreffen,
wurden in der WO 95/13 076 berichtet, in der biochemische Assays
verwendet wurden, die eine antioxidative Wirksamkeit zeigten. Die
von Mooradian und von WO 95/13 076 verwendeten Assays waren biochemische
Assays und überprüften als
solches die Wirkungen dieser Moleküle auf Zellen nicht direkt.
US 5,554,601 (1996) beschrieb
jedoch zellbasierte Assays zur Bestimmung eines Verfahrens unter
Verwendung von Östrogenverbindungen, die
eine Neuroprotektion auf eine Zellpopulation übertrugen, auf Grundlage demonstrierter
zellproliferativer Wirkungen.
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Eine
oxidative Schädigung
wurde mit einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der
Alzheimer Krankheit (Alzheimer's
Disease = AD) und dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht (Benzi et
al., Free Radic. Biol. Med. 19 (1995), 77 bis 101, und
US 5,554,601 , hierin durch Bezugnahme
mit aufgenommen). Der Zelltod tritt auch als Folge eines ischämischen
Ereignisses im Körper
auf, das sich aus einer Nahrungsverknappung ergibt, die mit einer/einem
sich aus einem Verschluss an einem cerebrovaskulären oder cardiovaskulären Ort
ergebenden Sauerstoff-Verknappung bzw. -Mangel ergibt oder mit einer
Verletzung oder einer Krankheit in Verbindung stehen kann.
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Es
besteht ein Bedarf nach verbesserten Verfahren, sowohl Männer als
auch Frauen vor den Folgen eines abnormalen Zelltodes im Körper zu
beschützen.
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Zusammenfassung
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, durch das auf eine
Population von Zellen ein Zellschutz übertragen wird, das die Bereitstellung
einer polycyclischen Phenol-Verbindung und einer antioxidativen
Verbindung bzw. Antioxidansmittel-Verbindung und das Verabreichen
der polycyclischen Phenol-Verbindung und der antioxidativen Verbindung
an die Population von Zellen in einer wirksamen Dosis einschließt, um einen
Zellschutz zu verleihen, so dass die kombinierte cytoprotektive
Wirkung der polycyclischen phenolischen Verbindung und der antioxidativen
Verbindung größer ist
als der zusätzliche
bzw. additive Effekt jeder Verbindung, die getrennt unter in anderer
Weise ähnlichen
Bedingungen verabreicht wird.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren, um einer Population von Zellen
in einem Subjekt einen Zellschutz zu verleihen, einschließlich der
Schritte, eine therapeutische Kombinationsdosis zu verabreichen,
die ein Antioxidans und eine polycyclische phenolische Verbindung
in einer pharmazeutischen Formulierung enthält; die Formulierung in einer
wirksamen Dosis an die Population von Zellen derart zu verabreichen,
dass die cytoprotektive Wirkung der Kombination im Subjekt größer als
der zusätzliche
Effekt jeder getrennt bereitgestellten Verbindung ist; und ein Schützen der
Zellen im Subjekt, die sich ansonsten verschlechtern und in Abwesenheit
der pharmazeutischen Formulierung absterben würden.
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In
weiteren Ausführungsformen
der Erfindung kann die kombinierte Wirkung eine 100- bis 10.000-fache
Steigerung, insbesondere eine 100- bis 5.000-fache Steigerung, insbesondere
eine 1.000- bis 5.000-fache Steigerung des Zellschutzes sein, die
sich aus der kombinierten Wirkung der polycyclischen Verbindung
und des Antioxidans bzw. Antioxidationsmittels im Vergleich mit
jeder Verbindung getrennt ergibt. In weiteren Ausführungsformen
der Erfindung ist die polycyclische Phenolverbindung eine Östrogenverbindung,
insbesondere eine Östrogenverbindung
mit einer unbeträchtlichen
Geschlechts-Wirksamkeit, beispielhaft gezeigt durch das α-Isomer von Östradiol.
In bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung ist das Antioxidans aus der Gruppe ausgewählt, die
aus einem Thiol-, einem Phenol-, einem Spin-Einfangmittel, einem
aromatischen Amin, einem Carotinoid, einem Flavonoid, einem Selen,
einem Aminosteroid und einem Ubichinon besteht.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung schließt
der Zellschutz eine Neuroprotektion ein.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt die Wirkung von
Glutathion (GSH) und 17β-Östradiol
auf Nervenzellen (SK-N-SH-Zellen), behandelt
mit neurotoxischem β-Amyloid-Protein
(βAP), wobei βAP ein Peptid
aus 10 Aminosäuren
(Aminosäuren
25 bis 35) ist, das nachstehend als „βAP 25–35" bezeichnet wird. Die Wirkungen von
17β-Östradiol
(2 nM) und GSH (3,25 μM)
auf die durch βAP
25–35
(20 μM)
induzierte Toxizität
auf SK-N-SH-Zellen (106 Zellen/ml) in unterschiedlichen
Zellkulturmedien, denen GSH in der Zellkultur-Rezeptur fehlte, ist
dargestellt. Die Zellen wurden zu 106 Zellen/ml
ausplattiert und wurden gegenüber
Träger, βAP 25–35, 17β-Östradiol,
GSH oder einer Kombination wie angezeigt ausgesetzt. Kontrollen
repräsentieren
den Durchschnittswert für
den Träger,
GSH, 17β-Östradiol
und die GSH + 17β-Östradiolgruppen
und wurden zusammengepoolt, nachdem festgestellt wurde, dass diese
voneinander nicht statistisch signifikant verschieden waren. Abgebildet
sind die Durchschnittswerte ±SEM
(Standard Error of Mean = Standardabweichung des Mittel wertes) für 4–5 Wells/Gruppe.
*p < 0,05 gegen
Kontrollen, bestimmt durch ANOVA, gefolgt von Scheffe's post-hoc-Test.
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2 zeigt die Wirkung von
GSH und 17β-Östradiol
auf die Anzahl lebender SK-N-SH-Zellen,
die mit neurotoxischem βAP
25–35
in Gegenwart oder in Abwesenheit einer nicht-protektiven Dosis von 17β-Östradiol (2
nM) behandelt wurden. Die Zellen wurden zu 106 Zellen/ml
ausplattiert. Die Auswirkung variierender Konzentrationen von GSH
in Gegenwart von 17β-Estradiol
(ausgefüllte
Dreiecke) wurde mit den Zellen verglichen, die mit GSH in Abwesenheit
von 17β-Östradiol
(nicht ausgefüllte
Dreiecke) behandelt wurden. Dargestellt sind Durchschnittswerte ±SEM für 6 Wells/Gruppe.
Die Wirkung von 17β-Östradiol auf die Reaktion gegenüber GSH
war hoch signifikant (F = 41,48; p < 0,001). Ein Vergleich der EC50-Werte für die unterschiedlichen Dosiswirkungskurven
unter Verwendung des Mann-Whitney Rangsummentests zeigte ein p =
0,036, wobei der EC50 für βAP 25–35 + 17β-Östradiol (2 nM) 0,041 ± 0,025
betrug und für βAP 25–35 (20 μM) 82,560,4
betrug.
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3 zeigt die Wirkung von
GSH und 17β-Östradiol
auf die Anzahl lebender SK-N-SH-Zellen,
die eine Herausforderung mit βAP
25–35
(20 μM)
in variierenden Konzentrationen von 17β-Östradiol in Gegenwart von 3,25 μM GSH (ausgefüllte Dreiecke)
unterworfen wurden, im Vergleich mit den Wirkungen in Zellen, die
mit 17β-Östradiol
in Abwesenheit von GSH (offene Dreiecke) behandelt wurden. Dargestellt
sind die Durchschnittswerte ±SEM
für 4 Wells/Gruppe.
Die Wirkung von GSH auf die Reaktion gegenüber 17β-Östradiol
war hoch signifikant (F = 44,33; p < 0,001). Ein Vergleich der EC50-Werte für die unterschiedlichen Dosiswirkungskurven
unter Verwendung des Mann-Whitney Rangsummentests zeigte ein p < 0,057, wobei der
EC50 für βAP 25–35 + GSH
(3,25 μM)
0,330,031 und für βAP 25–35 (20 μM) 12687,8
betrug.
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4 zeigt die Wirkungen einer
Dosis 17β-Östradiol
auf die durchschnittliche Anzahl primärer Cortexneurone der Ratte
pro fotografischem Feld, wenn sie einer βAP 25–35 Herausforderung in Gegenwart
und Abwesenheit einer nicht-protektiven Dosis GSH unterworfen wurden.
Die Zellen wurden wie früher
angezeigt bei den erwähnten
Dosen ausplattiert und gegenüber
den Behandlungen exponiert. Dargestellt sind Durchschnittswerte ±SEM für 4 bis
7 Wells/Gruppe. Die Wirkung von GSH auf die Reaktion gegenüber 17β- Östradiol war hoch signifikant
(F = 8,53; p < 0,005).
Ein Vergleich der EC50-Werte für die unterschiedlichen
Dosiswirkungskurven unter Verwendung des Mann-Whitney Rangsummentests
zeigte einen p < 0,057.
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5 zeigt die Wirkungen von
Estratrienen in Gegenwart und Abwesenheit von GSH auf die durch βAP (25–35) in
HT22-Zellen induzierte Neurotoxizität. Die Symbole repräsentieren
folgendes:
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6 zeigt die Wirkungen von
17β-Östradiol
in Gegenwart und Abwesenheit von GSH auf die durch βAP 1–40 in HT22-Zellen
induzierte Neurotoxizität. ☐ zeigt
das Vorhandensein von GSH an und
zeigt
das Fehlen von GSH an. Die Linie repräsentiert den Wert der Kontrollgruppe
(kein βAP
1–40).
Die Daten werden als Durchschnitt ±SEM für 4 Wells/Gruppe präsentiert.
*= p < 0,05 gegen
die Gruppe mit βAP
1–40 alleine,
**= p < 0,05 gegen
sowohl die Gruppe mit βAP
1–40 alleine
als auch die Kontrollgruppe (kein βAP 1–40).
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Ausführliche
Beschreibung
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft die neue Erkenntnis, dass die cytoprotektive Wirkung
polycyclischer Phenol-Verbindungen wesentlich verbessert wird, wenn
sie mit zumindest einer zusätzlichen
antioxidativen Verbindung verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt insbesondere eine cytoprotektive bzw.
Zellschutz-Formulierung
bereit, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine polycyclische Phenol-Verbindung und eine
Antioxidans bzw. antioxidative Verbindung umfasst, um einer Population
von Zellen im Falle einer chronischen degenerativen Erkrankung,
akuten Erkrankung, Alterung, Verletzung, Osteoporose, Verbrennungen,
Gewebstransplantation und ei nem chirurgischen Eingriff, die einen
Verlust an Nährströmung zu
diesem Gewebe zur Folge hat, Zellschutz zu verleihen, wobei die
polycyclische Phenol-Verbindung (i) zwei oder mehr Ringstrukturen
einschließt,
von denen zumindest eine ein terminaler Phenolring ist und (ii)
eine Größe von weniger
als 1.000 Dalton aufweisen, ausgewählt aus 2, 3 oder 4 Ring-Cyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindungen
mit einer Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffatomen 1, 2, 3 und/oder
4 des A-Ringes.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung einer polycyclischen
Phenolverbindung in Verbindung mit einer antioxidativen Verbindung
zur Herstellung eines Medikamentes zum Verleihen eines Zellschutzes
für eine
Population von Zellen in den Fällen
einer chronisch degenerativen Erkrankung, einer akuten Erkrankung,
des Alterns, einer Verletzung, der Osteoporose, von Verbrennungen,
Gewebstransplantation und eines chirurgischen Eingriffes bereit,
die einen Verlust an Nährströmung zu
diesem Gewebe zur Folge haben, wobei die polycyclische Phenol-Verbindung
(i) zwei oder mehr Ringstrukturen einschließt, von denen zumindest eine
ein terminaler Phenolring ist und (ii) eine Größe von weniger als 1.000 Dalton
aufweisen, ausgewählt aus
2, 3 oder 4-Ringcyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindungen
mit einer Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffatomen 1, 2, 3 und/oder
4 des A-Ringes.
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Der
Begriff „Zellschutz" ist hierin und in
den Ansprüchen
als Schutz von Zellen gegen Zelltod oder eine Zellschädigung definiert,
die in anderer Weise in Abwesenheit eines protektiven Mittels auftreten
würden,
wobei der Zelltod oder die Zellschädigung verursacht sein kann
durch irgendeine mechanische Schädigung,
Nahrungsmittelentzug, einschließlich
Sauerstoffmangel, Verletzung, Krankheitsprozesse, Schädigung aufgrund der
Exposition gegenüber
Chemikalien oder extreme Temperaturen, Alterung oder eine andere
Ursache.
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Der
Begriff „Östrogen-
bzw. Estrogen-Verbindung",
wie hierin und in den Ansprüchen
verwendet, ist als irgendeine der Strukturen, wie in der 11. Ausgabe
von „Steroids" von Steraloids Inc.,
Wilton N. H., beschrieben, definiert und hierin durch Bezugnahme
mit aufgenommen. Eingeschlossen in diese Definition sind Isomere
oder Enantiomere, die nicht steroidale Östrogene einschließen, gebildet
durch Modifikation oder Substitution der Verbindungen in der Literaturstelle
von Steroloid. Weitere Östrogenverbindungen,
die in diese Definition mit eingeschlossen sind, sind Östrogenderivate, Östrogenmetabolite
und Östrogenprecursoren
ebenso wie solche Moleküle,
die zur Bindung eines zellassoziierten Östrogenrezeptors in der Lage
sind, ebenso wie andere Moleküle,
wobei das Ergebnis der Bindung spezifisch einen charakterisierten Östrogen-Effekt
auslöst. Ebenfalls
eingeschlossen sind Gemische aus mehr als einem Östrogen, wobei Beispiele für solche
Gemische in Tabelle 2, unten, dargestellt sind. Beispiele für α-Östrogenstrukturen
mit Anwendbarkeit entweder alleine oder in Kombination mit anderen
Mitteln sind in 5 dargestellt.
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Die
Begriffe „17-E2, β-Östradiol,
17β-Östradiol, β-17-E2, E2,
17βE2, βE2", wie hierin und
in den Ansprüchen
verwendet, sollen synonym sein. In ähnlicher Weise sollen die Begriffe „α17-E2, α-17-E2, α-Östradiol,
17-α-Östradiol,
17αE2, α-E2", wie hierin und
in den Ansprüchen
verwendet, synonym sein und entsprechen dem α-Isomer von 17β-Östradiol.
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Die
Abkürzung „E-3-ol", wie hierin und
in den Ansprüchen
verwendet, repräsentiert
Estratrien-3-ol.
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Die
Bedeutung der Begriffe „polycyclische
phenolische Verbindung, polycyclische Verbindungen oder polycyclische
Phenole", wie hierin
und in den Ansprüchen
verwendet, werden gemäß der Offenbarung
von US-A-5,859,001 beispielhaft gezeigt (d. h. die polycylische
Phenol-Verbindung (i), die zwei oder mehr Ringstrukturen einschließt, von
denen zumindest eine ein terminaler Phenol-Ring ist und (ii) eine
Größe von weniger
als 1.000 Dalton aufweisen) und schließt jede Verbindung mit einem
phenolischen A-Ring, wie unten definiert, ein und kann bis zu drei
zusätzliche
Ringstrukturen enthalten, die durch folgendes beispielhaft dargestellt
sind:
- a) Cyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindungen
mit 2, 3, oder 4 Ringen und einer Hydroxylgruppe an den Kohlenstoffatomen
1, 2, 3 und/oder 4 des A-Ringes. Zusätzlich können R-Gruppen, ausgewählt aus Natrium-,
Kalium- und/oder Ammoniumsalzen an die α- oder β-Positionen gebunden werden,
um Wasserstoff an jedem verfügbaren
Kohlenstoffatom in der Struktur zu ersetzen. Solche Verbindungen
können
weiter am A-Ring substituiert sein, um eine einzige OH-Gruppe zu
erhalten und können
weiterhin ein Pyridin, Pyriazin, Pyrimidin, s-Triazin, v-Triazin
oder as-Triazin bilden.
- b) Der Phenol-A-Ring mit möglichen
zusätzlichen
Substitutionen, die oben aufgelistet sind, kann weiter an einen
C6-Ring mit einer oder mehreren der folgenden
Strukturen gebunden sein – Benzol,
Cyclohexan, 1,2-Pyran; 1,4-Pyran, 1,2-Pyron, 1,4-Pyron; 1,2-Dioxin, 1,3-Dioxin
(Dihydroform); Pyridin; Pyridazin; Pyrimidin; Pyrazin; Piperazin;
s-Triazin; as-Triazin,
v-Triazin, 1,2,4-Oxazin; 1,3,2-Oxazin; 1,3,6-Oxazin (Pentoxazol);
1,2,6-Oxazin; p-Isoxazin; 1,2,5-Oxathiazin; 1,2,6-Oxathiazin; 1,4-2-Oxadiazin,
1,3,5,2-Oxadiazin; Morpholin
(Tetrahydro-p-isoxazin). Irgendeine 6-Ring-Struktur, wie oben aufgelistet,
kann an irgendeine der folgenden 5-Ring-Strukturen gebunden sein:
Furan; Thiophen (Thiofuran); Pyrrol (Azol); Isopyrrol (Isoazol); 3-Isopyrrol
(Isoazol); Pyrazol (1,2-Diazol);
2-Isoimidazol (1,3-Isodiazol); 1,2,3-Triazol; 1,2,4-Triazol; 1,2-Diothiol;
1,2,3,Oxathiol, Isoxazol (Furo(a)monozol); Oxazol (Furo(b)monazol);
Thiazol; Isothiazol; 1,2,3-Oxadiazol; 1,2,3,4-Oxatriazol; 1,2,3,5-Oxatriazol;
1,2,3-Dioxazol; 1,2,4-Dioxazol; 1,3,2-Dioxazol; 1,3,4-Dioxazol;
1,2,5-Oxathiazol; 1,3-Oxathiol, Cyclopentan.
- c) Irgendeine der oben aufgelisteten Verbindungen, bei denen
die Cyclopentanophen-(A)-anthrenringverbindung
aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus 1,3,5 (10), 6,8-Estrapentaen;
1,3,5(10), 6,8,11-Estrapentaen; 1,3,5(10), 6-Estratetraen-1,3,5(10),
7-Estratetraen;
1,3,5(10)8-Estratetraen; 1,3,5(10)16-Estratetraen; 1,3,5(10)15-Estratetraen;
1,3,5(10)-Estratrien; 1,3,5(10)15-Estratrien, besteht.
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Der
Begriff „ Antioxidans", wie hierin und
in den Ansprüchen
definiert, betrifft jedes Molekül,
das eine Oxidation eines speziellen Substrates durch ein zweites
Molekül
verhindert. Obwohl nicht einschränkend,
sind Beispiele für
Antioxidantien, die in die Erfindung mit eingeschlossen sind, die
folgenden:
Thiole, einschließlich Glutathion, Taurin, Cystein,
Homocystein und α-Liponsäure; Phenole,
einschließlich
Probucol, Salicylate, Trolox C, 3,4-Dihydroxytoluol, 3,4-Dihydroxyzinnaminsäure, Nordihydroxyquaiarectinsäure, 2'',4'-Dihydroxyacetophenon,
2',5'-Dihydroxyacetophenon,
3',4'-Dihydroxyacetophenon,
Propylgallat; Spin-Einfangmittel,
einschließlich
Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid, N-tert-Butyl-α-phenylnitron, aromatische Amine, einschließlich Promethazin,
Chlorpromazin, Ethoxyquin, Allopurinol, Harnsäure; Carotinoide, einschließlich β-Carotin, α-Carotin, γ-Carotin,
Lycopen, Caratol; Flavonoide, einschließlich (+)-Catechin, Dihydroquercetin, Hesperetin,
Texasin, Biochanin A, Kaempherol, Quercetin und 6,7-Dihydroxy-4'-methoxy-isoflavanol;
Selen-Aminosteroide,
einschließlich
Trilazad-Mesylat, Methylprednisolon, Suleptanat, Lazaroide, und
Ubichinone, beispielsweise Coenzym Q2, Coenzym Q10. Diese Liste
ist nicht einschränkend.
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Polycyclische Verbindungen
mit einem terminalen phenolischen A-Ring in Kombination mit Antioxidantien
zur Verbesserung der cytoprotektiven Wirksamkeit in einer synergistischen
Weise
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Wir
haben zum ersten Mal gezeigt, dass ein Antioxidans im extrazellulären Milieu
einen verbesserten Zellschutz bereitstellt, wenn es einem Subjekt
zusammen mit einer polycyclischen Verbindung mit einem phenolischen
A-Ring, beispielsweise Östrogen,
in physiologisch und pharmakologisch relevanten Dosen verabreicht
wird. Die verbesserte Wirkung der Kombination von polycyclischen
phenolischen Verbindungen und Antioxidantien, insbesondere Verbindungen
mit einer unbeträchtlichen
Geschlechts-Aktivität
in Verbindung mit den Antioxidantien der Thiole, insbesondere Östrogenverbindungen
mit einer unbeträchtlichen
Geschlechts-Aktivität
und Glutathion, fördern
den Zellschutz über
denjenigen hinaus, der bei irgendeiner Einzelverbindung zu beobachten
ist. Die Kombination antioxidativer und polycyclischer phenolischer
Verbindungen einschließlich
von Östrogenen
weist einen Nutzen beim Schutz von Zellen vor einer Schädigung auf,
die sich aus irgendeinem von mehreren Ereignissen ergibt, von denen
bekannt ist, dass sie für
die Zelle von Nachteil sind, einschließlich einer chemischen Schädigung,
wie sie beispielsweise durch freie Radikale, exzitatorische Aminosäuren und
Amyloid-Plaque verursacht wird. Beispielsweise ist die obige Kombination
für die
Neuroprotektion wirksamer als entweder die antioxidative oder polycyclische
phenolische Verbindung alleine und präsentiert deswegen einen neuen
therapeutischen Ansatz zur Behandlung eines Neuronverlustes in menschlichen
Subjekten, der bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie beispielsweise
der Alzheimer Krankheit, auftritt. Zusätzlich weist die hier offenbarte
Kombinationstherapie eine Nützlichkeit
bei der Behandlung weiterer Krankheitsbedingungen auf, die sich
aus einem gesteigerten Zelltod ergeben, einschließlich Ischämie, Verletzung
und Altern.
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Die
obigen Beobachtungen sind eine überraschende
und unerwartete Erweiterung früherer
Beobachtungen, die von uns vorgenommen wurden, bei denen wir die
Anwendung poly cyclischer phenolischer Verbindungen mit einem phenolischen
A-Ring zum Zellschutz erkannten. Wir zeigten kürzlich, dass polycyclische phenolische
Verbindungen einen Schutz gegen: eine Neurodegeneration (US-A-5,859,001);
einen Zelltod, der mit einer Ischämie in Verbindung steht (US-A-5,877,169);
Osteoporose (US-A-5,554,601); und einen Zelltod in Geweben während der
Gewebsentfernung vom Körper
und der Transplantation (US-A-5,824,672)
verleihen können.
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Wie
in 1 dargestellt ist,
war die cytoprotektive Wirkung von 17β-Östradiol und Glutathion auf
humane Nervenzellen (SK-N-SH) signifikant größer als die cytoprotektive
Wirkung von 17β-Östradiol
und Glutathion individuell bzw. einzeln. Diese Wirkung wurde beständig beobachtet,
wenn die Zellen in unterschiedlichen Medien inkubiert wurden. 2 zeigt weiter diesen Effekt,
wobei der maximale Zellschutz früher
und bei niedrigeren Konzentrationen an Glutathion zu beobachten
war, wenn 17β-Östradiol
im Medium mit enthalten war. Eine ähnliche Beobachtung wurde in
den 3 und 4 gemacht, wenn Glutathion
in einer konstanten Menge in zunehmenden Konzentrationen von 17β-Östradiol
in humanen Nervenzellen und auch primären Cortexneuronen von Ratten
zugesetzt wurde. Ein markanter synergistischer Effekt wurde ebenfalls
beobachtet, wenn ein Östrogen
mit einer unbeträchtlichen
Geschlechts-Aktivität
verwendet wurde (α-Östradiol)
(5). 5 zeigt weiterhin Zunahmen der neuroprotektiven
Wirkung um das 100- bis 600-fache für drei unterschiedliche Östrogenverbindungen.
Wir haben herausgefunden, dass Estratriene eine ungefähr 1.000-
bis 5.000-fache Steigerung ihrer cytoprotektiven Wirkung erfahren,
wenn sie mit dem Antioxidans Glutathion verabreicht werden. In Ausführungsformen
der Erfindung fällt
die bei unterschiedlichen Kombinationen von Mitteln beobachtete
Steigerung in den Bereich von 100-fach bis 10.000-fach. Die synergistische
Wirkung eines Antioxidans und seiner Östrogenverbindung wurde weiterhin
in Zellen beobachtet, denen ein Östrogenrezeptor
fehlt. 6 zeigt die synergistische
Wirkung von Glutathion mit 17β-Östradiol in HT22-Zellen.
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Die
in diesen Beispielen beschriebenen Verfahren zum Untersuchen einer
cytoprotektiven Wirkung kann einfach auf das Identifizieren des
Umfanges einer synergistischen Wirkung zwischen zusätzlichen
polycyclischen phenolischen Verbindungen und Antioxidantien angewendet
werden, über
die hierin offenbarten hinaus. Weiterhin können andere Zellen als Nervenzellen
gemäß der hier
beschriebenen Assays verwendet werden, um die cytoprotek tive Wirkung
polycyclischer phenolischer Verbindungen mit Antioxidantien zu demonstrieren.
Diese Assays und Anwendungen liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung,
wie er hierin verkörpert ist.
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Obwohl
die obigen Beispiele eine Synergie unter Verwendung von Glutathion
als Antioxidans beschreiben, können
andere Antioxidantien verwendet werden, um den beobachteten synergistischen
Effekt zu erzielen. Tabelle 1 stellt eine Zusammenfassung der Wirkungen
von 17β-Östradiol
zusammen mit einer Vielzahl von Antioxidantien und deren Kombination,
auf Nervenzellen bereit.
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Die
Anmelder unterliegen keiner Verpflichtung, den Mechanismus zu erklären, durch
den die Erfindung funktioniert. Jedoch wird der nachfolgende Mechanismus
vorgeschlagen, um die beobachtete synergistische Wirkung zu erklären. Es
ist im Stand der Technik bekannt, dass Östrogenverbindungen lipophile
Moleküle
sind. Unter Vorgabe des lipophilen Charakters von Östrogen
kann Östrogen
in die Membran eingefügt
werden. Aufgrund der Beobachtung, dass eine intakte phenolische
Gruppe für
den Zellschutz wünschenswert
ist, kann der Hydroxyl-Wasserstoff gespendet werden, um die Kaskade
der Membran-Lipid-Peroxidation
zu vermeiden. Zusätzlich
kann sich die gesteigerte Wirkstärke
von Östrogenen
aus ihrer Fähigkeit
ergeben, aus mehreren Positionen am A-Ring zu spenden (Jellnick
und Bradlow, 1990). Eine relativ stabile oxidierte Form von Östradiol kann
sich aus dessen Wasserstoff Ionen-Donation ergeben. Es wird hierin
vorgeschlagen, dass beispielsweise eine Glutathionperoxidase die
reduzierte Form von Östrogen
regenerieren kann. Dieses Enzym beruht auf GSH als sein Substrat
zur Donation der Wasserstoff-Gruppe zurück an Östrogen und hatte dadurch eine
Synergie zwischen der Aktivität
der beiden Moleküle
zur Folge.
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Die
Spezifität
der Interaktion von Östrogenen
für dieses
Glutathionsystem wird durch zwei Beweislinien gestützt. Zunächst bestehen
keine offensichtlichen Interaktionen, die zwischen Östrogen
und anderen getesteten Thiolen, Liponsäure oder Taurin oder irgendwelchen
anderen Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure oder α-Tocopherol,
bemerkt wurden. Es sollte erwähnt
werden, dass, während α-Tocopherol
an sich ein starkes Antioxidans ist, argumentiert wurde, dass das Östrogen
noch stärker
ist. Zweitens spricht die Fähigkeit von
oxidiertem Glutathion, das in diesem System funktioniert, dafür, dass Östrogen mit
dem Glutathionperoxidoxidase/Reduktaseprozess interagieren kann.
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Das
Vorhandensein von Östrogen
in Zellmembranen ist eine Wiederspiegelung der Östrogenmengen, die in den Blutstrom
eingebracht wurden. Wenn Östrogen
verfügbar
ist, kann es sich in die Zellmembranen jeder verfügbaren Zelle
ohne Spezifität
einfügen,
wodurch eine zellprotektive Wirkung bereitgestellt wird. Jedoch,
wenn die Östrogenmengen
beschränkt
werden, können
sich die Östrogene
in erster Linie in den Membranen von Zellen befinden, die Östrogenrezeptoren
tragen.
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Auf
Basis des obigen Mechanismus machen die Anmelder geltend, dass der
sich aus dem synergistischen Effekt polycyclischer phenolischer
Verbindungen und Antioxidantien ergebende Zellschutz für jede der Zellen
des Körpers
eintreten kann und nicht auf die hierin angegebenen Beispiele beschränkt ist.
Die Anmelder haben kürzlich
die zellprotektive Wirkung polycyclischer phenolischer Verbindungen
alleine auf Nervenzellen, Gliazellen (
US
5,554,601 ), Endothelzellen (US-A-5,877,169), Skelettmuskelzellen
und Erythrocyten (US-A-5,824,672) demonstriert. Außerdem sollten
Osteoblasten, glatte Muskelzellen, einschließlich Herzmuskelzellen, Fibroblasten
und Stammzellen durch die synergistische Wirkung polycyclischer
phenolischer Verbindungen und Antioxidantien geschützt werden.
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Die synergistische Wirkung
ist Rezeptor-unabhängig
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Wir
haben gezeigt, dass die beobachtete synergistische Wirkung nicht
vom Kernöstrogenrezeptor (ER)
abhängt.
Diese Beobachtung kann zu neuen Verfahren zur Entwicklung von Arzneistoffen
zur Behandlung abnormaler Zell-Verluste in Menschen führen.
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Die
ER-unabhängige
synergistische Wirkung wurde durch Experimente unter Verwendung
der murinen Nervenzelllinie (HT22) bestätigt, der ein funktioneller Östrogenrezeptor
fehlt (5 und 6). Wenn diese Zellen gegenüber dem
neurotoxischen βAP
25–35
exponiert wurden, wurden ungefähr
50 bis 60% der Zellen abgetötet.
Eine gleichzeitige Behandlung mit jedem von drei Estratrienen, β-Östradiol, α-Östradiol
oder Estratrien-3-ol, hatte eine dosisabhängige Neuroprotektion zur Folge
(5). Das Vorliegen einer
spezifischen 3H-Östradiolbindung sowohl an Kernextrakte
als auch Ganzzellzubereitungen wurde durch Assays bestimmt, die
von Miranda et al., J. Neurobiol 31 (1996), 77 bis 87, und von Nakao et
al., Arteriosclerosis 38 (1981), 75 bis 80, beschrieben wurden.
Die Bindung von Östradiol
an HT22 Zellen wurde mit der Bindung an MCF-7-Zellen, die den ER-Rezeptor
tragen, verglichen. HT22-Zellen zeigten keine spezifische Bindung
in jedem Assay mit nur 63,93 fmol spezifischer Bindung pro Million
Zellen im Vergleich zu 566,5 für
die ER positive MCF-7-Zelllinie in der Gesamtzellzubereitung und
0,05 fmol pro Million Zellen im Vergleich zu 35,21 für die MCF-7-Zelle im
rohen bzw. unbehandelten Kern-Pellet. Der durch physiologische Dosen
von Östrogenen
auf diese Zellen übertragene
Schutz bestätigt,
dass ein Hauptanteil der protektiven Wirkungen der Östrogene
vom ER unabhängig
ist.
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Es
sollte erwähnt
werden, dass, während β-Östradiol
ein Geschlechtshormon ist und von diesem bekannt ist, dass es über den Östrogenrezeptor
wirkt, α-Östradiol
und Estratrien-3-ol
im Allgemeinen gemäß dem Stand
der Technik als biologisch inaktiv angenommen werden. Diese Verbindungen
sind alle Beispiele für
polycyclische phenolische Verbindungen. Die Erfindung umfasst die
Verwendung jeder Klasse polycyclischer phenolischer Verbindungen,
unabhängig
von ihrer Fähigkeit,
an den Östrogenrezeptor
zu binden.
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Wir
testeten Östradiol,
gebunden an Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin = BSA), um
zu bestimmen, ob Östradiol
HT22-Zellen vor βAP
(25–35)
schützen
könnte,
wenn Östrogen
auf die extrazelluläre Umgebung
beschränkt
wurde. Eine Immobilisierung des Steroids durch BSA-Konjugation (17β-Östradiol-6-(carboxymethyl)oxim:
BSA, das 20 μM
17β-Östradiol
enthielt) beseitigte die Fähigkeit
des Steroids, HT22-Zellen vor einer βAP (25–35) Toxizität in Gegenwart
von GSH zu schützen
(Beispiel 2a, Tabelle 2). Dies stimmt mit ähnlichen Beobachtungen mit
SK-N-SH-Zellen überein.
Kollektiv legen diese Daten die Erwünschtheit einer freien Interaktion
der Estratriene mit der Zellmembran oder dem intrazellulären Raum
nahe, um ihre neuroprotektiven Wirkungen hervorzurufen.
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Die
in diesen Studien verwendete Dosis von GSH wies keine Wirkung auf βAP (25–35) induzierte
Toxizität
per se auf, insofern als βAP
(25–35)
eine 54 ± 4%
und eine 553% Abnahme der Zelllebensfähigkeit in An- und Abwesenheit
von 3,25 pM GSH jeweils verursachte. Jedoch zeigte eine GSH-Dosis
von 325 μM
einen signifikanten Schutz vor einer βAP-Toxizität in SK-N-SH-Neuroblastomzellen
(2). Weiterhin verursachte eine
Exposition von HT22-Zellen gegenüber
3,25 μM
GSH alleine, 200 nM 17β-Östradiol
alleine oder beides in Kombination keine Zunahme der Zellzahl in
Abwesenheit eines Insultes (6),
was darauf hinweist, dass die Zunahme der Zellzahl auf einen Schutz
und nicht auf eine mitogene Wirkung der Verbindungen zurückzuführen ist.
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Anwendungen
des beobachteten synergistischen Effektes zwischen polycyclischen
phenolischen Verbindungen und Antioxidantien
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Eine
pharmazeutische Zubereitung, die eine polycyclische phenolische
Verbindung und ein Antioxidans einschließt, kann zur Behandlung von
Subjekten verwendet werden, die unter einer Verletzung, chronischen
degenerativen Erkrankungen oder einer akuten Krankheit, beispielsweise
einem ischämischen
Anfall, induziert wurden. Beispiele schließen die Alzheimer'sche Krankheit, die
Parkinson'sche Krankheit,
einen Schlaganfall, eine Ischämie,
eine Herzattacke oder eine Angioplastie ein, oder eine Verletzung
des Gehirns oder des Rückenmarks,
eine Hypoglykämie,
Anoxie, Verbrennungen oder chirurgische Eingriffe, die den Verlust
der Nährstoffzufuhr
zu den Geweben zur Folge haben.
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Ausführungsformen
der Erfindung können
weiterhin auf das Verfahren der Gewebstransplantation vor, während oder
nach der Entfernung oder Reperfusion von Zellen, Geweben oder Organen
oder während
der Aufbewahrung der Zellen, von Gewebe oder von Organen angewendet
werden und ist auf jede der Zellen im Körper anwendbar. Die folgenden
Beispiele werden nicht zur Einschränkung, sondern zur Veranschaulichung der
neuen biologischen Wirkung der Erfindung präsentiert.
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Beispiel 1
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Die synergistische
Wirkung eines Antioxidans mit einer polycyclischen phenolischen
Verbindung unter Verwendung von SK-N-SH-Nervenzellen des Menschen
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Glutathion
wurde als Antioxidans ausgewählt
und 17β-Östradiol
wurde als polycyclische Verbindung ausgewählt. Der Assay verwendete die
humanen Neuroblastomzellen SK-N-SH.
Die Zellen wurden mit Toxinen behandelt, von denen bekannt ist,
dass sie den Zelltod verursachen, zu finden in Amyloidplaque-βAP (1–40) und βAP (25–35). Die
Zahlen im Anschluss an „AP" entsprechen der
Größe und dem
Typ des Proteinfragmentes, das durch die Aminosäureresteanzahl identifiziert
wird.
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Materialien:
Lyophilisiertes βAP
25–35
(1 mg) (Bachem, Torrance, CA) wurden zu Beginn in 200 μl ddH2O gelöst
und unter Zusatz von 800 μl
PBS war eine schnelle Aggregation zu beobachten. 17β-Östradiol (17β-Östradiol,
Steraloids, Wilton, NH) wurden zu Beginn zu 10 mg/ml in absolutem
Ethanol gelöst
(Fisher Scientific Inc., Orlando, FL) und in Zellkulturmedien verdünnt, um
die notwendigen Konzentrationen zu erzielen. α-Tocopherolacetat wurde zu Beginn in
200 μl absolutem
Ethanol gelöst
und in Zellkulturmedien bis zu den geeigneten Konzentrationen verdünnt. Liponsäure (Thiotinsäure), Taurin
(2-Aminoethansäure)
und Ascorbinsäure
wurden zu Beginn in Zellkulturmedien gelöst und in den angegebenen Konzentrationen
verwendet. Soweit nichts anderes angemerkt ist, wurden die Materialien
von Sigma Chemical Corp. bezogen.
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SK-N-SH-Neuroblastomzellkultur:
SK-N-SH-Neuroblastomzellen wurden von der American Type Tissue Collection
(Rockville, MD) bezogen. Die Zellkulturen wurden bis zur Konfluenz
in RPMI-1640 Medium (Fisher Scientific, Inc.), ergänzt mit
10% Kohle/Dextran-behandeltem fötalem
Rinderserum (FBS), (Hyclone®, Logan, UT), 100 U/ml
Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin (Sigma Chemical Corp.) in
Monolayers in 150 cm2 Kolben von Corning
(Fisher Scientific, Inc.) bei 37°C
unter 5% CO2, 95% Luft gezüchtet. Die
Medien wurden dreimal wöchentlich
ausgetauscht. Die Zellen wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop
(Nikon Diaphot-300) beobachtet.
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(a)
SK-N-SH-Zellen, die in den nachfolgenden Experimenten verwendet
wurden, befanden sich in den Umläufen
4 bis 12. Die Wachstumsmedien wurden zu Beginn dekantiert und die
Zellen wurden mit 0,02% EDTA für
30 min bei 37°C
gespült.
Die Zellen wurden dann auf einen Neubauer Hämocytometer (Fisher Scientific)
gezählt
und in geeigneten Medien resuspendiert. Die Studien wurden durch
Ausplattieren von 1 × 106 Zellen pro Well in 24 Well Platten begonnen,
wodurch die Anlagerung in regulären
Medien ermöglicht
wurde und darauf durch Dekantieren des Mediums und Ersetzen mit
der geeigneten Behandlung nach 4 h. Zellen wurden in DMEM oder RPMI-1640
ohne GSH (reduziert) kultiviert, mit 10% FBS und Antibiotika ergänzt, mit absolutem
Ethanol als Trägerkontrolle,
oder durch Zusatz von βAP
25–35
(20 μM),
17β-Östradiol
(0,002 bis 200 nM), GSH (0,0325 bis 325 μM), α-Tocopherolacetat (50 μM), Ascorbinsäure (100 μM), Liponsäure (10 μM), Taurin
(5 mM) oder einer Kombination, wie angezeigt, ergänzt. Die
20 μM Konzentration
von βAP
wurde ausgewählt,
weil wir gezeigt haben, dass sie dem LD50 für die ses
Peptid nahe liegt (Green et al., 1996). Die Auswahl von Konzentrationen
für das
Antioxidans wurden auf Grundlage vorläufiger Dosis-Wirkungsauswertungen
vorgenommen, die dazu verwendet wurden, die Konzentration zu bestimmen,
bei der eine Neuroprotektion nicht erzielt wurde.
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Die
SK-N-SH-Zelllebensfähigkeit
wurde unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens (Black and Berenbaum,
1964; Tennant, 1964) bestimmt. Nach 72 h Inkubation wurden die Behandlungsmedien dekantiert
und die Zellen wurden durch Inkubieren mit 0,2 ml 0,02% EDTA für 30 min
bei 37°C
abgehoben. Die Zellen wurden durch wiederholtes Pipettieren suspendiert.
100 μl Teilmengen
aus jeder Zellsuspension wurden mit 100 μl Teilmengen 0,4% Trypanblau-Färbung für 5 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Suspensionen wurden auf einem
Neubauer Hämocytometer
innerhalb von 10 min nach Zusatz von Trypanblau-Färbungen gezählt. Zwei
unabhängige
Zählungen
lebender und toter Zellen wurde für jede Teilmenge durchgeführt. Tabelle
1
Tabelle 1. Wirkungen von 17β-Östradiol
(17β-Östradiol),
einer Vielzahl von Antioxidantien und deren Kombination auf die βAP 25–35 induzierte
Toxizität
auf die Anzahl lebender SK-N-SH-Zellen. Die Zahlen zeigen die Zahlen
lebender Zellen an
- x
- p < 0,05 gegen βAP behandelte Kontrollen
- TRT
- Behandlung mit dem
angezeigten Antioxidans
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Statistik:
Die signifikanten Behandlungseffekte auf die Lebensfähigkeit
der Zellen wurden unter Verwendung von ANOVA, gefolgt von Scheffe's post-hoc-Test,
bestimmt, mit einer Signifikanz, die bei p < 0,05 bestimmt wurde. Für Dosiswirkungsauswertungen
wurden die EC50-Werte durch zufallsbedingtes
Zuordnen der Zellzahlen zu den angezeigten Dosen berechnet, um 3
bis 5 Linien pro Behandlung zu erzeugen und durch Bestimmung des
Mittelwertes für
diese Linien. Die nicht parametrische Mann-Whitney Rangsummenanalyse wurde
für die
EC50-Werte verwendet, weil die Varianzen
für die
Standardabweichung nicht äquivalent
waren. Vergleiche zwischen Dosiswirkungsbeziehungen wurden unter
Verwendung des zweiseitigen ANOVA berechnet, um die Signifikanz
von GSH oder der 17β-Östradiol-An- bzw. -Abwesenheit
zu bestimmen.
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(b)
Humane SK-N-SH wurden in 96 Well Platten in einem RPMI-Medium, dem
Glutathion fehlte, rückkultiviert.
4 h später
wurde eine Gruppe von Zellplatten simultan mit dem neurotoxischen β-Amyloidprotein βAP 25–35 behandelt:
(20 μM)
und eine Reihe von Konzentrationen von Glutathion im Bereich von
0 bis 325 μM. Eine
zweite Gruppe von Zellplatten wurde gleichzeitig mit Aβ 25–35: (20 μM), einer
Reihe von Glutathionkonzentrationen im Bereich von 0 bis 325 μM und einer
Einzeldosiskonzentration von 17β-Östradiol (2 nM) behandelt.
Nach 72 h Inkubation wurden die lebenden Zellen mit Trypanblau-Ausschluss
bestimmt. Wie in 2 dargestellt,
wies in Abwesenheit von 17β-Östradiol Glutathion einen ED50 von 32,5 μM auf und zeigte eine nur geringe
neuropro tektive Wirkung bei 3,25 μM.
Im Gegensatz hierzu zeigte das Vorhandensein von 17β-Östradiol einen ED50 von
0,325 μM,
der eine 1.000-fach höhere
Neuroprotektivität
als mit Glutathion alleine bereitstellte.
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(c)
Unter Verwendung des oben beschriebenen Assays wurden SK-N-SH-Zellen
mit Aβ 25–35 (20 μM), einer
einzigen Konzentration Glutathion (3,25 μM) und variablen Konzentrationen
von 17β-Östradiol
im Bereich von 0 bis 200 nM behandelt. Nach 72 h Inkubation wurden
die Zellen mit Trypanblau gefärbt.
Eine Neuroprotektion wurde in Konzentrationen von 200 nM β-Östradiol
in Abwesenheit von Glutathion mit einem ED50 von
100 nM beobachtet. In Gegenwart von Glutathion und β-Östradiol
war die ED50 0,02 nM. Somit erreicht die neuroprotektive
Wirkstärke
von 17β-Östradiol
in Gegenwart von Glutathion den 5.000-fachen Wert im Vergleich zur
Abwesenheit von Glutathion (3).
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Die
alleine durch 17β-Östradiol
bereitgestellte Neuroprotektion war 628-fach weniger als in Gegenwart von
GSH. Im Anschluss an eine βAP
(1–40)
Behandlung von Zellen, ergab eine 200 nM 17β-Östradioldosis 99,9% bzw. 35,6%
Schutz in Gegenwart und Abwesenheit von GSH (1). α-17-E2
und E-3-ol-östrogene verhielten
sich beide ähnlich
mit einer ED50 von 6 nM bzw. 14 nM in Gegenwart
von GSH und einer ED50 von 1.014 nM und
3.683 nM in Abwesenheit von GSH.
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Beispiel 2
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Die
synergistische neuroprotektive Wirkung eines Antioxidans mit einer
polycyclischen phenolischen Verbindung auf murine Nervenzellen,
denen funktionelle Östrogenrezeptoren
fehlen (HT22) unter Verwendung eines in vitro Assays.
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(a) Wirkungen von 17β-Östradiol
und 17β-Östradiol-6-(carboxymethyl)oxim:
BSA-Konjugat an βAP 25–35 induzierte
Toxizität
an HT22-Zellen
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Die
Experimente wurden durch Ausplattieren von Zellen in Nunc 24 Well
Platten begonnen und man ließ die
Zellen für
4 h vor der Behandlung anhaften. Die Zellen wurden gegenüber 20 μM βAP 25–35 in Gegenwart
der angezeigten Dosis von 17β-Östradiol
oder 17β-Östradiol-BSA
in RPMI-Medium exponiert, das 3,25 μM GSH enthielt. Nach 48 h wurden
die Zellen suspendiert und die Lebensfähigkeit unter Verwendung der
Trypanblau- Ausschlussmethode
bestimmt (Tennant J. R. (1964), Transplantation 2 (1964), 685 bis
694. Steroide und βAP
wurden, wie vorher beschrieben, zubereitet (Green et al., Neuroscience
Lett. 218 (1996), 165 bis 168). Die Daten wurden durch einseitige
Varianzanalyse untersucht und eine Scheffe's post-hoc-Analyse wurde für einen
geplanten Vergleich zwischen den Gruppen verwendet. Die Daten sind
als Durchschnittswert ± Standardabweichung
des Durchschnittswertes für
4 Wells pro Gruppe angegeben. *= p < 0,05 gegen die βAP (20 μM) Gruppe.
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Tabelle
2
Tabelle 2. Wirkungen von 17β-Östradiol
und 17β-Östradiol-6-(carboxymethyl)oxim:
BSA-Konjugat auf
eine βAP
(25–35)
induzierte Toxizität
auf HT22-Zellen
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(b) Wirkungen von Estratrienen
in Gegenwart und Abwesenheit von Glutathion auf die durch βAP 25–35 in HT22-Zellen
induzierte Neurotoxizität.
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Die
Experimente wurden durch Ausplattieren von Zellen in Nunc®24
Well Platten begonnen. Man ließ die
Zellen für
4 h vor der Behandlung anhaften. Die Zellen wurden gegenüber 20 μM βAP in Gegenwart
der angezeigten Dosis von 17β-Östradiol
oder α17-E2
oder E-3-ol (0 bis 20.000 nM) entweder in RPMI-Medium, das 3,25 μM GSH enthielt
oder RPMI-Medium, ohne GSH enthielt, exponiert. Nach 48 h wurden
die Zellen suspendiert und die Lebensfähigkeit unter Verwendung des
Trypanblaufarbstoff-Ausschlussverfahrens bestimmt (Tennant (1964).
Steroide und βAP
wurden, wie vorher beschrieben, hergestellt (Greene et al. (1996)).
Die ED50-Werte wurden durch zweiseitige
Varianzanalyse untersucht. Die Unterschiede zwischen den Effekten wurde
durch eine Scheffe's
post-hoc-Analyse
mit einem p < 0,05,
der als signifikant betrachtet wurde, bestimmt. Die Glutathionwirkung
ist mit einem p < 0,001
signifikant. Die Daten wurden mit der βAP freien Kontrollgruppe als
100% Schutz vereinheitlicht bzw. normiert und mit der βAP alleine
Gruppe als 0% Schutz. Der Durchschnitt ± Standardabweichung d. M.
für 3 bis
5 Well pro Gruppe ist in 3 dargestellt.
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(c) Wirkungen von 17β-Östradiol
in Gegenwart und Abwesenheit von Glutathion auf die durch βAP (1–40) in HT22-Zellen
induzierte Neurotoxizität.
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Die
Experimente wurden, wie in Beispiel 2 (b) beschrieben, durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass βAP (1–40) 4 Tage
vor Verdünnung
zu 20 μM
in den Kulturmedien inkubieren gelassen wurde. Die Alterung von βAP ist notwendig,
um das Peptid zu aggregieren, um die toxische Wirkung auf die Zellen
zu erbringen (Pike et al., J. Neurosci. 13 (1993), 1676 bis 1687).
Die Daten wurden als Durchschnitt ± Standardabweichung für 3 bis
4 Wells pro Gruppe präsentiert.
Die Daten wurden durch einseitige Varianzanalyse analysiert und
ein p < 0,05 wurde
als signifikant betrachtet (5).
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Die
in 5 und 6 dargestellten Ergebnisse zeigen die
neuroprotektive Wirkung mit beiden GSH mit β-Östradiol auf HT22-Zellen im
Anschluss an eine Behandlung mit einem von zwei Typen des Neurotoxins βAP. Eine
synergistische Interaktion zwischen neuroprotektiven Östrogenen
und dem durch das intrazelluläre Antioxidans
GSH verliehenen Schutz wurde beobachtet. 17β-Östradiol, das wirkstarke natürlich vorkommende Östrogen,
schützte
HT22-Zellen vor einem durch das neurotoxische Amyloidfragment βAP (25–35) induzierten Zelltod
mit einer ED30 von 5 nM und erbrachte eine
signifikante Neuroprotektion mit 2 nM des Steroids und 3,25 pM GSH
(5).
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Beispiel 3
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Die neuroprotektive Wirkung
der Östrogenverbindungen
mit einem Antioxidans auf primäre
kortikale Nervenzellen der Ratte
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Um
sicherzustellen, dass der in den Beispielen 1 und 2 beobachtete
synergistische Effekt nicht auf die Zellherkunft oder Tumorigenität zurückzuführen war,
führten
wir ähnliche
Experimente in kortikalen primären Rattenneuronen
durch.
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Primäre kortikale
Ratten-Kultur: Primäre
Nervenzellkulturen wurden gemäß des von
Chandler et al. verwendeten Verfahrens hergestellt: Alcoholism:
Clinical and Experimental Research 17 (1993), 54 bis 60.
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Die
Behandlungen wurden direkt am Kulturtag 10 auf primäre Kulturen
angewendet, unter Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens, das
ohne Rücksicht
auf die folgende Behandlung zugesetzt wurde: Kontrollen: Absoluter
Ethanol und PBS, Proben: βAP
25–35
(10 μM),
17β-Östradiol
(0,02 nM–2 μM), GSH (3,25 μM) oder Kombinationen,
wie angezeigt. Wenn einmal die Behandlungen zugesetzt wurden, wurden
die primären
Kulturen für
zusätzliche
24 h inkubiert und die Lebensfähigkeit
unter Verwendung des LIVE/DEAD® Lebensfähigkeits-/Cytotoxizitäts-Kits
(Molecular Probes, Eugene, OR) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Lebende Zellen werden durch das Vorhandensein einer intrazellulären Esteraseaktivität unterschieden,
die den Calcein-AM- Farbstoff
spaltet, wodurch eine hellgrüne
Fluoreszenz nach Anregung erzeugt wird. Das Ethidiumhomodimer dringt
in die Zellen mit geschädigten
Membranen ein und erzeugt nach der Bindung an Nucleinsäuren eine
rote Fluoreszenz. Beide Farbstoffe werden bei 485 nm angeregt und
Kulturplatten wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Nikon Diophot-300)
betrachtet. Drei zufällig
ausgewählte
Felder wurden fotografiert und die durchschnittliche Zahl lebender
Zellen pro Feld wurde durch Zählen
der Anzahl hellgrüner
Zellen bestimmt. Erneut wurde die Fähigkeit von Östradiol
in Gegenwart und in Abwesenheit von GSH (3,25 μM) ausgewertet (x).
Der Zusatz von βAP
25–35
(10 μM)
zu primären
kortikalen Neuronen hatte eine 39 bis 40%ige Reduktion der durchschnittlichen
Zahl lebensfähiger
Zellen pro Feld in An- und Abwesenheit von GSH jeweils zur Folge
(4). Wenn zunehmende
Dosen von 17β-Östradiol
mit βAP
25–35
ausgewertet wurden, war die 200 μM
Dosis von 17β-Östradiol
die am niedrigsten als protektiv gefundene Dosis, was voll mit unseren
SK-N-SH-Zelllinienstudien übereinstimmt
(1 bis 3). Mit Zusatz von GSH (3,25 μM) zu 17β-Östradiol
waren alle Dosen von 17β-Östradiol
von 2 μM
oder höher
protektiv (4). Eine
Auswertung der EC50-Werte zeigt ähnliche
Veränderungen
der Wirkstärke
von 68,1 ± 79 μM in Abwesenheit
von GSH bis 4,3 ± 5,9 μM in Anwesenheit
von GSH. Desgleichen zeigte die Auswertung der Wirkung von GSH auf
die neuroprotektive Wirkung von 17β-Östradiol in primären Rattenkulturen
unter Verwendung eines zweiseitigen ANOVA einen signifikanten Effekt
(F: 8,53; p < 0,005).
