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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung
aus Coenzym Q10 (oder Ubichinon Q10 oder Chinon Q10,
CoQ10) oder Ubichinol zum Herstellen eines
Medikaments für
die Verhütung,
die Behandlung und/oder die Linderung von degenerativen Pathologien
des Auges mit einer familienerblichen, entzündlichen, dysmetabolischen, senilen
altersbezogenen Natur, wobei sich der degenerative Prozess aus apoptotischen
Phänomenen,
d. h. dem programmierter Zelltod (PZT) ableitet.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart auch die topische Verabreichung
einer Coenzym Q10- oder einer Ubichinonzusammensetzung.
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Hintergrund der Erfindung
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Apoptose
oder der programmierte Zelltod (PZT) ist in eine Vielzahl degenerativer
Pathologien einschließlich
der Pathologien des hinteren Teils des Auges und der perioptischen
Fläche
involviert. Unter diesen Krankheiten gibt es familienerbliche, entzündliche,
dysmetabolische und altersbezogene makulare und retinale Degenerationen,
z. B.: das Glaukom, die altersbezogene makulare Degeneration, die
Retinitis pigmentosa, verschiedene familienerbliche Makulopathien
wie die Stargardt-Erkrankung, die vitelliformen makularen Zysten
und die Konusdystrophie, die diabetische Retinopathie (exudativ
oder proliferierend), die durch Bluthochdruck bedingte Retinopathie,
die ischämische
Optikopathie, die senile Trübung
der Linsen, das Katarakt, das Ablösen der Retina (Netzhaut),
die Uveitis, das Retinoblastom, die Neuritis und die optischen Neuropathien
von toxischem, entzündlichem
und degenerativem Ursprung. In all diesen Pathologien ist die Degeneration
durch den Zelltod durch Apoptose bedingt.
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Das
Glaukom kann als ein paradigmatisches Beispiel solch einer Gruppe
von Pathologien genommen werden, in denen apoptotische Vorgänge eine wichtige
Rolle für
sowohl die involvierten pathogenetischen Mechanismen wie auch für die Ausbreitung der
Krankheit spielen. Das Glaukom ist eine optische Neuropathie, die
einen Verlust an Ganglionzellen mit einem fortschreitenden Verlust
des Sichtfeldes und der visuellen Funktion und einem anschließenden Abbau
des optischen Nervenkopfes bestimmt. Der hohe intraokulare Druck
(Innendruck des Auges) ist ein Risikofaktor für die Entwicklung der Krankheit
und es ist bekannt, dass die Verringerung des intraokularen Drucks
den optischen Nerv vor weiteren Schäden schützt.
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In
Patienten, die vom Glaukom betroffen sind, ist der Verlauf der Erkrankung üblicher
Weise langsam und unregelmäßig mit
einer deutlichen Variabilität
zwischen Individuen. Obwohl es nicht so scheint, dass es eine direkte
Korrelation zwischen dem Tod der Ganglionzellen und dem Verlauf
der Mängel
im Sichtfeld gibt, wird angenommen, dass der Zellverlust dem Beginn
der Sichtfeldveränderungen
vorausgeht. Der fortschreitende Verlust der Sichtfunktion war mit
verschiedenen Risikofaktoren wie dem hohen intraokularen Druck oder
dem Vorhandensein einer lokalen oder systemischen Deregulation des
Blutflusses assoziiert. Da experimentelle und klinische Tests gezeigt
haben, dass okularer Bluthochdruck ein ursächlicher Faktor für das Fortschreiten
der glaukomatösen
optischen Neuropathie ist, ist die universell anerkannte Behandlung
zur Zeit im Wesentlichen auf die Verringerung des intraokularen
Drucks beschränkt,
z. B. durch Medikamente mit einer diuretischen Wirkung, β-Blocker-
Medikamente und andere.
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Die
Beobachtungen betreffen nicht nur Menschen, sondern auch Säugetiere
im Allgemeinen und insbesondere Haustiere.
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Kürzlich haben
in vitro- und in vivo- Studien an Tiermodellen die Möglichkeit
vorgeschlagen, dass ein Patient, der von einem Glaukom betroffen
ist, von einer neuroprotektiven Behandlung profitieren könnte, die
auf die Verlangsamung der Progression des Todes von Ganglionzellen
gerichtet ist (Nickells R. W. Apoptosis of retinal ganglion cells
in glaucoma: an update of the molecular pathways involved in cell death.
Surv. Ophtalmol. 1999; 43: S151 – 161). Zudem ist es bekannt,
dass der größte Teil
der retinalen Ganglionzellen in Glaukomen durch Apoptose stirbt (Kerrigan
L. A., Zack D. J., Quickley H. A., et al. TUNEL-positive ganglion
cells in human primary open-angle glaucoma. Arch. Ophtalmol. 1997;
115: 1031 – 1035),
und dass die Hypoxie nach der Ischämie eine der sicheren Ursachen
des zellulären
Todes ist (Gross R. L., Hensley S. H., Gao F., Wu F. M., Retinal
ganglion cell dysfunction induced by hypoxia and glutamate: potential
neuroprotective effects of beta-blockers. Surv. Ophtalmol. 1999,
43 Erg.: S162 – 70).
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Obwohl
das Glaukom hierin als ein paradigmatisches Beispiel verwendet wurde,
haben alle oben genannten degenerativen Pathologien zwei gemeinsame
Merkmale, sie beschädigen
den hinteren Teil des Auges (d. h. die Retina und/oder den optischen
Nerv) und sie durchlaufen verschiedene Arten von apoptotischen Vorgängen in
diesen Geweben, wobei die aptoptotischen Vorgänge durch sehr unterschiedliche
Phänomene
wie: Ischämie,
Hypoxie/Anoxie, Mangel an trophischen Faktoren, das Vorhandensein
freier Radikale ausgelöst
werden.
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Unter
Berücksichtigung
der gemeinsamen Merkmale, die die oben genannten Pathologien gemeinsam
haben, gibt es einen Bedarf an der Bereitstellung von Mitteln für die Behandlung,
Linderung oder Verhütung
von allen oben genannten apoptotischen Vorgängen, womit auf eine neuroprotektive Aktivität in dem
hinteren Teil des Auges gezielt wird.
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Die
PCT WO 01/37851 in dem Namen des gleichen Anmelders wie der vorliegenden
Erfindung offenbart die Verwendung von Coenzym Q10 bei
der Verhütung
des PZD, der sich aus chirurgischen Behandlungen zur Hornhautfotobrechung
(vorderer Teil des Auges) mittels eines Excimer-(Kaltlicht)- Lasers und
dem Aussetzen an ultraviolette Strahlen ableitet.
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Die
oben genannte Patentanmeldung lehrt, wie man die Apoptose der Hornhautzellen
(vorderer Teil des Auges), die durch die Generierung freier Radikale
ausgelöst
wird, die durch elektromagnetische Strahlungen hergestellt werden,
bekämpft.
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Coenzym
Q10 oder Ubichinon ist ein Coenzym, das
in der Zelle auf der mitochondrialen inneren Membran vorhanden ist,
wo seine Funktion in Verbindung mit einer Reihe von Faktoren in
der Elektronentransportkette, die in der Produktion von Energie
in der Form von Adenosintriphosphat (ATP) kulminiert, entscheidend
ist. Zudem ist das Coenzym Q10 ein aktiver
Radikalfänger
und sein Vorhandensein, das genau mit dieser Aktivität assoziiert
ist, wurde auch auf der Ebene der Plasmamembran nachgewiesen. Man muss
darauf hinweisen, dass die tatsächlichen
Therapien von z. B. Glaukomen im Wesentlichen auf die Verringerung
des intraokularen Drucks beschränkt sind
und eine neuroprotektive Aktivität
nicht vorsehen. Stattdessen gibt es bis heute keinerlei Wissen, dass
die Aktivität
von Coenzym Q10 als ein Molekül betrifft,
das anti-apoptotische Eigenschaften in pathologischen Zuständen haben
könnte,
bei denen der apoptotische Vorgang auch unabhängig von der Erhöhung an
freien Radikalen zustande kommen kann. Dies ist insbesondere der
Fall bei einer durch Ischämie,
Hypoxie/Anoxie, Mangel an tropischen Faktoren bedingten Apoptose.
Es gibt nämlich
keinerlei Hinweise auf die Tatsache, dass Coenzym Q10 auch
in einer zu seiner gut bekannten antioxidativen Wirkung verschiedenen
Weise fungieren kann. Es gibt daher die Notwendigkeit an einer neuroprotektiven
Therapie für
die degenerativen Erkrankungen des hinteren Teils des Auges, die
auf die Unterbrechung, Verlangsamung oder Verhinderung des programmierten
Zelltodes unabhängig
von den Mechanismen, die durch PZT ausgelöst werden, gerichtet ist.
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Diese
Notwendigkeit ergibt sich aus der Beobachtung, dass bei den Pathologien
des Auges, wie den familienerblichen, entzündlichen, dysmetabolischen
und altersbedingten makularen und retinalen Degenerationen, der
degenerative Prozess bedingt durch eine Apoptose nicht einheitlich
ausgelöst
wird, sondern durch eine Mischung von apoptotischen Phänomenen
ausgelöst
wird, die durch unterschiedliche Stimuli ausgelöst werden, wie ein Überschuss freier
Radikale, Ischämie,
Hypoxie/Anoxie, ein Mangel an trophischen Faktoren. In all den genannten Pathologien
ist der größte Teil
der apoptotischen Vorgänge
nicht auf das Vorhandensein freier Radikale zurückzuführen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung von zwei verschiedenen
unerwarteten Vorgängen.
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Der
erste ist, dass sich das Coenzym Q10 in unerwarteter
Weise in der Retina anhäuft,
auch dann wenn es topisch auf den vorderen Teil des Auges verabreicht
wird. Der zweite und wichtigere ist, dass das Coenzym Q10 seine
anti-apoptotischen Wirkungen auch auf apoptotische Vorgänge überträgt, die
nicht durch die Bildung freier Radikaler ausgelöst werden.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Verhütung, Behandlung und/oder Linderung
apoptotischer Vorgänge
in degenerativen Pathologien des hinteren Teils des Auges zur Verfügung, und zwar
unabhängig
von den Mechanismen, die diese Vorgänge verursachen (somit auch
apoptotische Vorgänge,
die nicht durch einen Überschuss
an freien Radikalen ausgelöst
werden). Bedingt durch die Verschiedenheit der unterschiedlichen
Stoffwechselwege, die eine apoptotische Reaktion der Zelle verstärken können und
bedingt durch die Tatsache, dass das Coenzym Q10 als
ein Fänger
freier Radikaler wohl bekannt ist, war die anti-apoptotische Wirkung des
Moleküls
gemäß der Erfindung
vollkommen unerwartet.
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In
der vorliegenden Anmeldung wird die überraschende Fähigkeit
des Coenzyms Q10 zur Verhütung von
apoptotischen Phänomenen,
die durch drei apoptotische Stimuli ausgelöst werden, von denen bekannt
ist, dass sie nicht durch die Bildung freier Radikale und durch
UVC ausgelöst
werden, gezeigt. Diese Stimuli, die unabhängig von der Bildung freier
Radikaler sind, sind:
- 1) Antimycin A, das als
ein Modell für
die durch Hypoxie ausgelöste
Apoptose verwendet wird;
- 2) C2-Ceramid, das ein zelldurchlässiges Analogon
von Ceramid (ein natürlicher,
lipidischer, apoptotischer Botenstoff, der von freien Radikalen
unabhängig
ist) ist; und
- 3) Der Entzug von Überlebensfaktoren
durch Serumentzug, bei dem man davon ausgeht, dass freie Radikale
die primäre
apoptotische Bedrohung nicht auslösen.
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Die
Beispiele der vorliegenden Erfindung zeigen, dass die oben genannten
Stimuli apoptotische Vorgänge
auslösen,
die nicht den Überschuss freier
Radikaler involvieren, und dass Coenzym Q10 auch
eine anti-apoptotische Wirkung in diesen apoptotischen Vorgängen aufweist.
Das in der vorliegenden Erfindung gezeigte, das die allgemeine anti-apoptotische
Wirkung von Coenzym Q10 betrifft, ist mit der
einen neuen das erste Mal offenbarten Lehre in Verbindung zu bringen,
gemäß der Coenzym
Q10 sich in den Netzhäuten und in dem optischen Nerv
von Augen anhäuft,
die mit einer Zubereitung zur topischen Verwendung behandelt werden.
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Somit
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Coenzym
Q10 oder Ubichinon als ein aktives Prinzip
für das
Herstellen eines Medikaments zur Verhütung, Behandlung und/oder Linderung
apoptotischer Vorgänge,
die in degenerativen Pathologien des hinteren Teils des Auges vorkommen;
wobei die Verabreichung davon topisch ist.
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Die
durch die vorliegende Erfindung verhüteten, behandelten oder gelinderten
apoptotischen Vorgänge
sind alle apoptotische Vorgänge,
die okulare degenerative Pathologien auslösen, genauer gesagt, die den
hinteren Teil des Auges betreffen. Die Bedeutung des „hinteren
Teils des Auges" gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Retina (Netzhaut) und der optische Nerv.
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Insbesondere
liegt die Verwendung des Coenzyms Q10 oder
eines funktionell äquivalenten
Derivates davon gemäß der vorliegenden
Erfindung in der Herstellung von Medikamenten zur Verwendung in
topischen Behandlungen, um die apoptotischen Vorgänge zu verhüten, zu
lindern oder zu behandeln, die durch Ischämie, Hypoxie/Anoxie, einen
Mangel an trophischen Faktoren, einen Überschuss an freien Radikalen
induziert werden, der/die in dem hinteren Teil des Auges zustande
kommen. Insbesondere die degenerativen Pathologien des Auges, bei
denen apoptotische Vorgänge
direkt in den degenerativen Prozess involviert sind. Genauer gesagt,
die degenerativen Pathologien gemäß der vorliegenden Erfindung
sind neurodegenerative Pathologien.
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Genauer
gesagt liegt der Nutzen von Coenzym Q10 oder
eines funktionell äquivalenten
Derivats davon gemäß der vorliegenden
Erfindung in der Herstellung eines Medikaments für die topische Behandlung der
apoptotischen Vorgänge
der Pathologien der Retina und des optischen Nervens wie bei familienerblichen,
entzündlichen,
dysmetabolischen und altersbedingten makularen und retinalen Degenerationen.
Beispiele von solchen Pathologien gemäß der Erfindung sind: das Glaukom,
die altersbedingte makulare Degeneration, die Retinitis pigmentosa,
verschiedene familienerbliche Makulopathien wie die Stargardt-Erkrankung,
die vitelliformen makularen Zysten und die Konusdystrophie, die
diabetische Retinopathie (exudativ oder proliferierend), die durch Bluthochdruck
bedingte Retinopathie, die ischämische
Optikopathie, die senile Trübung
der Linsen, das Katarakt, das Ablösen der Retina, die Uveitis, das
Retinoblastom, die Neuritis und die optischen Neuropathien aus toxischer,
entzündlicher
und degenerativer Ursache, wobei der pathogenetische Mechanismus
davon auch einen Überschuss
an programmiertem Zelltod (PZT) umfasst, bei dem freie Radikale
nicht involviert sind. Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann das Coenzym Q10 oder Ubichinol für die oben
genannten Behandlungen verwendet werden oder für die Herstellung der oben
genannten Medikamente zur Verwendung im Menschen oder im Tier verwendet
werden. Unter den Tieren sind domestizierte Tiere wie Haustiere
bevorzugt.
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Die
oben genannte Verwendung von Coenzym Q10 oder
eines funktionell äquivalenten
Derivats davon kann durch topische oder systemische Verabreichung
durchgeführt
werden.
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Das
Coenzym Q10 oder Ubichinol kann topisch
in einem Medikament in der Form einer Augensalbe verabreicht werden.
Die Formulierungen einer geeigneten Augensalbe, die Coenzym Q10 umfasst, werden in der PCT WO 01/37851
beschrieben.
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Coenzym
Q10 oder Ubichinol kann topisch durch all
die Wege, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden. Gemäß der Erfindung
können die
oben beschriebenen aktiven Verbindungen ein Mal oder mehrere Male
am Tag verabreicht werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1)
stellt eine Balkengrafik dar, die die Anzahl lebender Zellen 24
Stunden nach der Behandlung mit UVC oder Antimycin A im Vergleich
zu der nicht behandelten Kontrolle zeigt.
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2)
stellt eine Balkengrafik dar, die die schützende Wirkung von Coenzym
Q10 gegenüber der Apoptose zeigt, die
durch UVC und Antimycin A induziert wird, 24 Stunden nach der Behandlung,
die als die Anzahl der gesamten apoptotischen Vorgänge ausgedrückt wird.
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3)
stellt eine Grafik dar, die die Wirkung von Coenzym Q10 auf
die Malondialdehydmengen nach der Behandlung mit UVC oder Antimycin
A zeigt.
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4)
stellt eine Grafik dar, die die Wirkung von Coenzym Q10 auf
die Adenosintriphosphat (ATP)- Mengen nach der Behandlung mit UVC
und Antimycin A zeigt.
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5)
stellt eine Grafik dar, die die Einfangkinetiken von Coenzym Q10 durch die Choroidea (Aderhaut)/Retina
nach Behandlungen mit einer Augensalbenformulierung an weißen Neuseeland-Kaninchen
im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle zeigt.
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6)
stellt eine Grafik dar, die das Einfangen von Coenzym Q10 durch
die Choroidea/Retina von weißen
Neuseeland-Kaninchen zeigt, die mit einer Augensalbenformulierung
behandelt wurden, im Vergleich zu der nicht behandelten Kontrolle.
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7) Nachweis der DNA-Fragmentierung in
apoptotischen Nuklei durch die Endmarkierung des Klenow Fragments
(FragEL, Oncogene Research Products) der DNA. RCE-Zellen wurden
mit Antimycin A (A) stimuliert; mit Coenzym Q10 vor
der Stimulierung mit Antimycin A behandelt (B); Serumentzug (C);
mit Coenzym Q10 vor dem Serumentzug behandelt
(D).
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8) Überleben
von RCE, ausgedrückt
als die Zahl lebender Zellen/Platte, was durch MTT-Analyse 24 Stunden
nach UVC-Bestrahlung, Verabreichung von 200 μM Antimycin A oder 20 μM Ceramid bestimmt
wird, wobei vorher mit 10 μM
Coenzym Q10 (8A) oder
10 μM Vitamin
C (8B) oder auch nicht behandelt wird. Die Zellen
wurden anfänglich mit
3 × 105 Zellen/Platte ausplattiert. Jeder Punkt
ist das Mittel ± SE
von 5 Experimenten für
die 8A und 3 Experimenten für die 8B.
*p ≤ 0,005 im
Vergleich zu mit Coenzym Q10 oder Vitamin
C unbehandelten Zellen.
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9) Videomikroskopie des Zeitverlaufs von
RCE-Zellen 24 Stunden nach UVC-Bestrahlung (linker
Abschnitt); Stimulation mit 200 μM
Antimycin A (mittlere Abschnitte); oder Stimulation mit 20 μM Ceramid
(rechte Abschnitte), wobei eine Behandlung mit 10 μM Coenzym
Q10 vorausging oder auch nicht. (A) Unbehandelte
RCE-Zellen; (B) UVC-bestrahlt; (C)
mit Coenzym Q10 vor der UVC-Bestrahlung
behandelt; (D) mit Antimycin A stimuliert (AA); (E) mit Coenzym
Q10 vor der Stimulierung mit Antimycin A behandelt;
(F) mit Ceramid stimuliert; (G) mit Coenzym Q10 vor
der Stimulierung mit Ceramid behandelt. Apoptotische RCE-Zellen
erscheinen weiß,
geschrumpft und vom Substrat losgelöst. Deren Anzahl ist nach der
Behandlung mit Coenzym Q10 wesentlich verringert
(untere Abschnitte).
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10) Verringerung der kumulativen apoptotischen
Vorgänge
durch Behandlung mit Coenzym Q10 in RCE-Zellen.
Die apoptotischen Vorgänge
wurden durch die Videomikroskopie des Zeitverlaufs während der
24 Stunden nach apoptotischen Stimuli, wie sie zuvor beschrieben
wurden, bewertet. In Bezug auf die unbehandelten Zellen erhöhte die UVC-Bestrahlung,
Antimycin A und Ceramid deutlich die Anzahl der kumulierenden apoptotischen
Vorgänge
in RCE-Zellen, was wesentlich durch die Behandlung mit dem Coenzym
Q10 reduziert war.
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Jeder
Punkt ist das Mittel ± SE
von 3 Experimenten. *p ≤ 0,005
im Vergleich zu nicht mit Coenzym Q10 behandelten
Zellen. **p ≤ 0,05
im Vergleich zu nicht mit Coenzym Q10 behandelten
Zellen.
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11) Quantifizierung der Malonaldehyd (MDA)-
Mengen und der SOD-Aktivität
in RCE-Zellen 24 Stunden nach apoptotischer Simulierung mit UVC bei
254 nm (15 mJ/cm2), mit Antimycin A (200 μM), mit Ceramid
(20 μM)
oder durch Serumentzug, mit oder ohne vorherige 2 stündige Behandlung
mit jeweils 10 μM
Coenzym Q10 (links) oder Vitamin C (rechts).
RCE-Zellen waren: 1) nicht stimuliert; 2) mit Coenzym Q10 oder
Vitamin C- behandelt; 3) UVC-bestrahlt; 4) mit Coenzym Q10 oder Vitamin C behandelt und mit UVC bestrahlt;
5) mit Antimycin A stimuliert; 6) mit Coenzym Q10 oder
Vitamin C behandelt und mit Antimycin A stimuliert; 7) mit Ceramid
stimuliert; 8) mit Coenzym Q10 oder Vitamin
C behandelt und mit Ceramid stimuliert; 9) mit Seriumentzug; 10)
mit Coenzym Q10 oder Vitamin C behandelt
und mit Serumentzug. Jeder Punkt war das Mittel ± SE von 5 Experimenten, *p ≤ 0,001 im
Vergleich zu nicht mit Coenzym Q10 oder
Vitamin C behandelten Zellen.
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12)
Untersuchung der zellulären ATP-Mengen
in RCE-Zellen 24 Stunden nach der Anwendung apoptotischer Stimuli.
Die Zubereitung der Zelllysate wird in Materialien und Methoden
beschrieben. Die Behandlung mit Coenzym Q10 verringerte wesentlich
den zellulären
ATP-Verlust. Jeder Punkt ist das Mittel ± SE von 3 Experimenten. *p ≤ 0,005 im Vergleich
zu nicht mit Coenzym Q10 behandelten Zellen.
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13) Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials
durch den Doppelfluoreszenz JC-1-Assay. Duale Emissionsbilder (525
und 590 nm) zeigen das Signal der monomeren (grün) und der J-Aggregat- (rot)
JC-1-Fluoreszenz in RCE-Zellen. (a) Unbehandelte RCE-Zellen zeigen
rot gefärbte
Mitochondrien (großes
negatives Membranpotential). Die Mitochondrien der RCE-Zellen, die
24 Stunden nach apoptotischem Stimulus untersucht wurden mit (b)
UVC-Bestrahlung; (d) mit 200 μM
Antimycin A, oder (f) mit 20 μM
Ceramid schienen einheitlich grün gefärbt zu sein
(niedrigeres Membranpotential). Die Behandlung mit Coenzym Q10 schützte
wesentlich gegen den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials
wie es durch das erneute Erscheinen rot gefärbter Mitochondrien in RCE-Zellen
zu erkennen war; (c) mit Coenzym Q10 vor
der UVC-Bestrahlung behandelt; (e) mit Coenzym Q10 vor
der Verabreichung von Antimycin A behandelt; (g) mit Coenzym Q10 vor der Verabreichung von Ceramid.
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14)
Westernblot-Analyse der cytosolischen Extrakte aus RCE-Zellen mit
1 μg/ml
Anti-Cytochrom C – mAb.
Bahnen: 1) unbehandelte Kontrolle; 2) UVC-Bestrahlung; 3) Coenzym
Q10 Behandlung und UVC-Bestrahlung; 4) 200 μM Antimycin
A; 5) Coenzym Q10 Behandlung und 200 μM Antimycin
A; 6) 20 μM
Ceramid; 7) Coenzym Q10 Behandlung und 20 μM Ceramid.
Die Banddichte des cytoplasmatischen Cytochroms C (Pfeil) erhöhte sich
nach der apoptotischen Behandlung von RCE-Zellen (Bahnen 2, 4, 6) im
Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen (Bahn 1). Die Anwendung
von Coenzym Q10 vor den apoptotischen Stimuli
verringerte signifikant die Banddichte (Bahnen 3, 5, 7).
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15)
Caspase 9- Aktivität.
Bahnen: 1) unbehandelte Kontrolle; 2) UVC-Bestrahlung; 3) Coenzym
Q10 Behandlung und UVC-Bestrahlung; 4) 200 μM Antimycin
A; 5) Coenzym Q10 Behandlung und 200 μM Antimycin
A; 6) 20 μM
Ceramid; 7) Coenzym Q10 Behandlung und 20 μM Ceramid.
Die Aktivität
der Caspase 9 erhöhte
sich um das 6 – 8- fache nach der apoptotischen
Behandlung der RCE-Zellen (Bahnen 2, 4, 6). Die Anwendung von Coenzym
Q10 verringerte deutlich die Caspase 9-
Aktivierung in allen Fällen (Bahnen
3, 5, 7).
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16)
Nukleosomale Leiterbildung. Bahnen: 1) unbehandelte Kontrolle; 2)
UVC-Bestrahlung; 3)
Coenzym Q10 Behandlung und UVC-Bestrahlung; 4)
200 μM Antimycin
A; 5) Coenzym Q10 Behandlung und 200 μM Antimycin
A; 6) 20 μM
Ceramid; 7) Coenzym Q10 Behandlung und 20 μM Ceramid.
Die durch alle drei apoptotischen Stimuli induzierte Fragmentierung
der DNA (Bahnen 2, 4, 6) war größtenteils
verringert, wenn eine Behandlung mit Coenzym Q10 der
Verabreichung eines apoptotischen Stimulus vorausging (Bahnen 3,
5, 7). M) Molekulare DNA-Gewichtsmarken λ/Hind III.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Coenzym Q10- oder Ubichinol-
Zusammensetzung zum Herstellen eines Medikaments zur topische Verabreichung
auf das Auge verwendet werden. Das Medikament, das das Coenzym Q10 oder ein funktionell äquivalentes Derivat davon umfasst,
liegt vorzugsweise in einer Form von Augentropfen vor und kann die
opthalmologische Lösung
sein, wie sie in der PCT WO 01/37851 beschrieben wird. Die ophtalmologische
Lösung
kann lokal durch oberflächliches Aufträufeln verabreicht
werden.
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Die
Zusammensetzung umfasst: 0,01 bis zu 2,0 Gewichtsprozent Coenzym
Q10 oder ein funktionell äquivalentes
Derivat davon; 0,005 bis zu 0,1 Gewichtsprozent Tocopherol; und
ein Gemisch umfassend ein modifiziertes Rizinusöl und ein Block Copolymer aus
hydrophilem Ethylenoxid und einem lipophilen Propylenoxid mit einem überwiegenden
Anteil von Polyoxyethylen, einem mittleren Molekulargewicht zwischen
10.000 und 13.000 Dalton und einem Hydrophilie-Lypophilie-Gleichgewicht
(HLB)-Wert von mehr als 15, in einer Menge, die ausreicht, um die
Komponenten in einer wässrigen
Lösung
löslich zu
machen, üblicher
Weise zwischen 10 und 15 Gewichtsprozent.
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Die
Mischung aus diesen zwei Tensiden (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen)
und einem modifizierten Rizinusöl
(Polyethylenglycolglyceryltriricinoleat) produziert die vollständige mizellare
Solubilisierung der Komponenten der pharmazeutischen Form.
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Ein
spezielles Beispiel des oben genannten Blockcopolymers ist ein kommerzielles
Produkt, das Lutrol F127 genannt wird.
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Die
Konzentrationen an Coenzym Q10 oder Ubichinol,
die zur Formulierung ophtalmologischer Lösungen verwendet werden können, liegen
zwischen 0,01 und 2,0 Gewichtsprozent, mehr bevorzugt zwischen 0,1
und 1,0 Gewichtsprozent, wobei die ideale Konzentration als „Anti-hornhautmittel" bei 0,2 Gewichtsprozent
liegt. Die Tocopherolkonzentrationen in diesen Zubereitungen liegen
im Allgemeinen zwischen 0,005 und 0,1 Gewichtsprozent, mehr bevorzugt
zwischen 0,01 und 0,5 Gewichtsprozent.
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In
einer mehr bevorzugten Weise umfasst eine bevorzugte Zusammensetzung:
Coenzym Q10 oder Ubichinol mit ungefähr 0,2 Gewichtsprozent;
Tocopherol mit 0,02 bis zu 0,04 Gewichtsprozent und das Gemisch
umfasst Polyethylenglycolglyceryltriricinoleat und ein Ethylenoxid-/Propylenoxid-Blockpolymer
mit einem Anteil von ungefähr
70 % Polyethylenoxid, einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von ungefähr
12.000 Dalton und einem HLB-Wert von 22.
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Der
Inhaltsstoff, der notwendigerweise zu den Formulierungen hinzu gegeben
werden muss, ist ein Produkt, das die Lösung veranlasst, den richtigen osmolaren
Werten zu haben. Die Lösung,
die nur das aktive Prinzip enthält,
resultiert tatsächlich
in hypotonischer anstatt Tränenflüssigkeit.
Andere Inhaltsstoffe, die hinzu gegeben werden können, sind pH-korrigierende
Mittel (die Salze umfassen, die einen Puffer in der Lösung bilden),
Produkte mit antiseptischen Eigenschaften, komplexierende Mittel
und Konservierungsmittel, antioxidative Mittel und synergistische Mittel.
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Im
Wege eines Beispiels werden einige Ausführungsformen der Formulierung
aufgelistet:
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Formulierung 1
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- Konzentration der Inhaltsstoffe in Gewichtsprozent
- Coenzym Q10 oder Ubichinol 0,20
- Tocopherol 0,04
- Copolymer 10,00
- modifiziertes Rizinusöl
5,00
- NaCl 0,45
- Benzalkoniumchlorid 0,01
- doppelt destilliertes Wasser q. s. bis 100,00
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Formulierung 2
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- Konzentration der Inhaltsstoffe in Gewichtsprozent
- Coenzym Q10 oder Ubichinol 0,10
- Tocopherol 0,02
- Copolymer 15,00
- Mannitol 2,50
- Benzalkoniumchlorid 0,01
- doppelt destilliertes Wasser q. s. bis 100,00
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Formulierung 3
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- Konzentration der Inhaltsstoffe in Gewichtsprozent
- Coenzym Q10 oder Ubichinol 0,20
- Copolymer 10,00
- NaCl 4,50
- Benzalkoniumchlorid 0,01
- Phosphat-gepufferte Sorensenlösung mit pH 7,4 bis auf 100,00
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Die
topische Verabreichung auf das Auge kann auch mit einer Augenpaste
durchgeführt
werden.
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Das
Coenzym Q10 oder Ubichinol gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auch in Kombination mit anderen geeigneten aktiven
Prinzipien, die auf dem Gebiet als für die Behandlung oder Linderung oder
Verhütung
der oben genannten optischen Erkrankungen bekannt sind, verabreicht
werden.
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EXPERIMENTELLE
ERGEBNISSE UND BEISPIELE
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In
den vorliegenden Beispielen werden Antimycin A, C2-Ceramid
und Serumentzug verwendet, um die anti-apoptotische Wirkung von
Coenzym Q10 in anti-apoptotischen Vorgängen zu
zeigen, die nicht mit einem Überschuss
an freien Radikalen assoziiert sind. Die Wahl der Substanzen ist
durch deren Wirkungsmechanismus bedingt.
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1)
Antimycin A ist ein organisches Gift, das die zelluläre Atmung
blockiert, und dadurch die zelluläre Fähigkeit zur Herstellung von
Energie, und das durch das Binden des Komplexes III der mitochondrialen
Atmungskette. Als eine Folge davon kann das Mitochondrion, auch
wenn in der Zelle Sauerstoff verfügbar ist, diesen nicht erfolgreich
verwenden und unterbricht daher die Bildung von ATP durch oxidative
Phosphorylierungen. Dieses Phänomen
zeigt sich als chemische (oder auch als histotoxische) Hypoxie, d.
h., die Unmöglichkeit
zur Nutzung von Sauerstoff bedingt durch eine Vergiftung der Atmungskette;
diese Hypoxie ist mit anderen Arten von Hypoxie (Hypoxie, Anämie und
Ischämie)
assoziiert, die durch ein Mangel an tatsächlich verwendetem Sauerstoff
in der zellulären
Umgebung bedingt sind.
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Die
durch Antimycin A induzierte chemische Hypoxie wurde hier als ein
experimentelles Modell eines zellulären Schadens analog zu einem
ischämischen
Schaden, wie er oben gezeigt wird, verwendet, der sehr häufig in
der spontanen Pathologie retinaler Zellen vorkommt und unabhängig von
der Bildung freier Radikaler ist.
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2)
Die durch Ceramid induzierte Apoptose ist hauptsächlich eine Folge von dessen
Fähigkeit
zum Kollabieren des mitochondrialen Δψ entweder durch die direkte
Hemmung des mitochondrialen Komplexes III der Atmungskette oder
durch die Bildung von großen
Transmembrankanälen
zur Erhöhung
der mitochondrialen Durchlässigkeit.
3) Der Entzug von überlebenswichtigen
Faktoren, der in kultivierten Zellen durch Serumentzug erreicht wird,
kann Zellen durch unterschiedliche Mechanismen wie die Induktion
der MAP-Kinase,
der Ceramidfreisetzung, der COX-2-Aktivierung, deren gemeinsame
Wirkung durch den von Mitochondrion abhängigen apoptotischen Stoffwechselweg
ausgelöst
wird, zur Apoptose führen.
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Die
Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Reaktion auf Antimycin
A, C2-Ceramid
und Serumentzug (11) wurde auch in einigen experimentellen Modellen
berichtet. Jedoch ist es, da die ROS ein entscheidender Vermittler
der Apoptose sind, nicht leicht zu etablieren, ob die Erhöhung an
ROS nach der Anwendung apoptotischer Stimuli eine Ursache oder eine
Auswirkung der Durchführung
der Apoptose ist. Dieser Punkt ist entscheidend, um auszuschließen, dass
Antimycin A, C2-Ceramid und Serumentzug
direkt die Bildung freier Radikaler induzieren könnten, dies wurde eine entscheidende
Voraussetzung. Dies wurde durch die frühe Quantifizierung der Mengen
an freien Radikalen in RCE direkt nach der Anwendung der apoptotischen
Stimuli, das bedeutet vor dem Beginn der Durchführung der Apoptose, festgestellt.
Die Erhöhung
der MDA- und SOD-Aktivität,
die in der zweiten Stunde nach der UVC-Bestrahlung, nicht aber nach
der Behandlung mit Antimycin A oder C2-Ceramid
oder Serumentzug beobachtet wird, bestätigte, dass die drei letzteren apoptotischen
Stimuli keine freien Radikale generieren.
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Im
Wege eines Vergleichs und immer in den gleichen Zellkulturen wurden
die Ultravioletten als ein Modell des apoptotischen Angriffs, der
auch durch den Überschuss
an freien Radikalen bedingt ist, verwendet.
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Die
schützende
Wirkung von Coenzym Q10 gegenüber der
Apoptose in Kaninchenkeratozyten (Hornhautepithelzellen aus Kaninchen,
die mit SV40 transformiert wurden, die auch als RCE bezeichnet werden)
wurde experimentell in Kulturen nachgewiesen, die mit Antimycin
A, Ceramid, Serumentzug und Aussetzen an UVC bei 254 nm induziert
wurden. Die Apoptose wurde mittels früher und später Marker wie der Analyse
des Redoxstatus des Zytoplasmas (Malondialdehydassay), der Mengen
an Adenosintriphosphat (ATP, der Caspase 9 Aktivität, der Zytochrom
C – Freisetzung
aus Mitochondrien und dem DNA-Fragmentierungsassay) untersucht.
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Die
Verteilung von Coenzym Q10 auf der Choroidea-
und Retinaebene in Kaninchen wurde auch verifiziert. Zu diesem Zweck
erhielten weiße Neuseeland-Kaninchen
ein Einträufeln
(ungefähr 100 μl) der Augensalbe,
die in der PCT WO 01/37851 beschrieben wird, in dem Namen des gleichen
Anmelders wie der vorliegenden Patentanmeldung, und das jede Minute
für 15
Minuten und wurden direkt danach geopfert. Die Augen wurden in physiologischer Lösung gewaschen
und die Retina wurde zusammen mit der Choroidea daraus entfernt.
Das Gewebe wurde dann homogenisiert und durch HPLC quantifiziert. Die
Ergebnisse von all diesen durchgeführten Experimenten, die die überraschenden
anti-apoptotischen Wirkungen von Coenzym Q10 zeigen,
werden in den folgenden Beispielen gezeigt.
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BEISPIELE
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Beispiel 1. Schützende Wirkung
von Coenzym Q10 gegen die hystotoxische
Hypoxiewirkung.
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RCE-Zellen
wurden in dreißig
Platten am Tag vor der Verabreichung des apoptotischen Stimulus mit
einer Dichte von 2 × 105/Petrischale mit einem Durchmesser von 100
mm ausplattiert. Am Tag danach wurden zwei Serien von 10 Platten
mit jeweils 200 μM
Antimycin A und UVC bei 254 nm 15 J/m2 behandelt,
wohingegen die dritte Serie unbehandelt blieb. Nach 24 Stunden wurden
die lebenden Zellen mit dem Trypan-blau-Verfahren gezählt und als Prozentanteil der
Kontrolle in der Grafik gezeigt (1).
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Die
RCE-Zellen wurden am Tag vor der Verabreichung des apoptotischen
Stimulus bei der Dichte von 2 × 106/Petrischale mit einem Durchmesser von 100
mm plattiert. Am Tag danach wurden Antimycin A in der Konzentration
von 200 μM
in Kombination mit 10 μM
Coenzym Q10 in 0,04 % Lutrol F127® oder nur
0,04 % Lutrol F127® zu einer Platte hinzu
gegeben. Von nun an bezieht sich „mit Coenzym Q10 behandelt" auf Coenzym Q10 in 0,04 % Lutrol F127® als Trägermittel,
wohingegen bei der Kontrolle immer gemeint ist, dass sie nur mit
0,04 % Lutrol F127® behandelt ist. Eine andere
Platte wurde mit UVC bei 254 nm 15 J/m2 allein
oder in Kombination mit 10 μM
Coenzym Q10 behandelt. Die Zellen wurden
mittels einer Videomikroskopie des Zeitverlaufs aufgezeichnet und
die kumulativen apoptotischen Vorgänge, die nach 24 Stunden aufgezeichnet
wurden, werden in der Grafik gegen die Zeit gezeigt (2).
Die gezeigten Werte stellen den Durchschnitt von 5 Experimenten
dar.
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Beispiel 2. Indirekte
Untersuchung der Produktion freier Radikaler nach der Behandlung
mit Antimycin A und mit UVC bei 254 nm durch Messung der Mengen an
Malondialdehyd und der Effizienz von Coenzym Q10 bei
der Verhinderung dieser Produktion.
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Das
Malondialdehyd ist ein Produkt der Lipidperoxidation, das nach dem
Aussetzen von polyungesättigten
Fettsäuren
an freie Radikale zustande kommt. Die Produktion von Malondialdehyd
wird dann routinemäßig als
Index der Produktion der Radikale selbst durch Behandlungen mit
elektromagnetischen Strahlungen oder oxidierenden Substanzen angenommen.
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Als
Antioxidanz verringert Coenzym Q10 die Malondialdehydproduktion
durch das Aufzeigen einer Wirkung, die die Bildung freier Radikaler
hemmt.
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Um
den Malondialdehydassay durchzuführen,
wurden RCE-Zellen mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Platte
in 20 Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm ausplattiert
und über
Nacht in 5 % CO2 Atmosphäre bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden
die Platten für
2 Stunden mit Coenzym Q10 (10 Platten) vorinkubiert
oder unbehandelt gelassen (10 Platten), mit 8 ml physiologischer
Salzlösung
gewaschen, die mit sterilem Phosphat (PBS) gepuffert war, unter
Zugabe von Ca++ und Mg++.
Die Platten wurden einer Behandlung mit Antimycin A (200 μM) oder ultravioletter
Strahlung bei 254 nm (15 J cm2) ausgesetzt,
wie es in 3 gezeigt wird. PBS wurde durch
frisches Medium mit und ohne Coenzym Q10 ersetzt
und die Platten wurden für
weitere 2 Stunden inkubiert. Nach dem Durchführen des Assays wurden die
Zellen mit Trypsin gemäß den üblichen
Prozeduren abgelöst
und mittels einer Globuli-Zählkammer gezählt. Die
Zellen der verschiedenen Proben wurden dann durch die Zugabe von
Trichloressigsäure (TCA)
lysiert und für
20 Minuten bei 12.000 Upm zentrifugiert, um die Proteine zu fällen.
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Zu
300 μl des Überstandes
von jeder Probe wurden 300 μl
1 % Thiobarbituronsäure
(TBA) hinzu gegeben. Die Mischungen wurden bei 95 °C für 30 Minuten
inkubiert, für
20 Minuten bei 12.000 Upm zentrifugiert und die optische Absorption
des Überstandes,
die aus der spektrofotometrischen Analyse bei 532 nm resultiert,
wurde untersucht.
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Die
beobachteten Werte wurden mit einer üblichen Kalibrierungskurve
verglichen und auf die Anzahl der Zellen normalisiert. In 3 wird
die schützende
Wirkung von Coenzym Q10 nach der Behandlung
mit Antimycin A oder UVC-Bestrahlung gezeigt.
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Der
Assay zeigte dann durch den direkten Vergleich mit anderen Mitteln
des Standes der Technik die abschwächende Wirkung, die durch Coenzym Q10 auf die peroxidative Menge an Fettsäuren bedingt durch
freie Radikale ausgeübt
wird, sowie indirekt die schützende
Wirkung gegenüber
den freien Radikalen selbst, die durch die UVC-Behandlung hergestellt werden. 3 zeigt
auch, dass die Peroxidationsmenge der Fettsäuren in dem Fall der Behandlung mit
Antimycin A ähnlich
wie die der unbehandelten Kontrolle ist und dieses bestätigt die
Fähigkeit
von Coenzym Q10 gegen Apoptose unabhängig von
der Eigenschaft als freier Radikalfänger zu schützen, wie es in 2 betont
wird.
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Beispiel 3. Auswertung
der Mengen an Adenosintriphosphat (ATP) nach Behandlung mit Antimycin
A und UVC bei 254 nm.
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Die
ATP-Mengen korrelieren eng mit dem Muster des Zelltodes, der nach
biochemischer Beschädigung
zustande kommt. Zum Beispiel ist eine Menge an ATP von weniger als
20 % des normalen Wertes für
eine Nekrose verantwortlich, wohingegen höhere Mengen immer noch das
Zustandekommen einer Apoptose ermöglichen, da diese ein notarischer Prozess
ist, der Energie benötigt.
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Während es
bestätigt
wurde, dass die ATP-Mengen nach der Behandlung mit Bestrahlungen
drastisch verringert sind, resultierte es gemäß der vorliegenden Erfindung,
dass Coenzym Q10 in der Lage war, solch
eine Verringerung zu verhindern.
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Um
den ATP-Assay durchzuführen,
wurden RCE-Zellen mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Platte in
10 Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm ausplattiert und über Nacht
in einer Atmosphäre
von 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die
Platten für
2 Stunden mit Coenzym Q10 bei 10 μM oder nur
mit dem Trägermittel
allein vorinkubiert. Das Medium wurde dann mit 8 ml steriler PBS
unter Zusatz von Ca++ und Mg++ ersetzt
und die Platten wurden mit Antimycin A (200 μM) oder UVC bei 254 nm (15 J/cm2) behandelt, wie es in 4 gezeigt
wird. Anschließend
wurde das PBS mit frischem Medium mit und ohne Coenzym Q10 ersetzt und die Platten wurden für weitere
2 Stunden inkubiert. Nach der Durchführung des Assays wurden die
Zellen mit Trypsin gemäß üblichen
Prozeduren abgelöst
und mittels einer Globuli-Zählkammer
gezählt.
Die Zellen wurden dann in destilliertem H2O
in der Konzentration von 6 × 104 Zellen/I resuspendiert, sofort für 5 Minuten
gekocht und bei –20 °C zur anschließenden Analyse
eingefroren.
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Die
Quantifizierung des ATPs in den Extrakten wurde durch den „ATP Detennination
Kit" (Molecular
Probes, USA) durchgeführt,
der auf der Luciferase der Feuerfliege basiert, und das gemäß den Instruktionen
des Lieferanten. Um eine Fluoreszenz nachzuweisen, wurde eine Analysenvorrichtung
für Flüssigkeitszintillation
(Camberra Packard, USA) verwendet, die zur Biolumineszenzanalyse
voreingestellt war.
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Dieser
Assay zeigt quantitativ die schützende
Wirkung von Coenzym Q10, die der Verringerung der
ATP-Menge entgegensteht, die durch Antimycin A und durch UVC-Bestrahlungen zustande
kommt.
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Beispiel 4. Lokalisierung
von Coenzym Q10 auf der Ebene der Choroidea
und der Retina von weißen Neuseeland-Kaninchen,
die topisch behandelt wurden.
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Behandlung von Kaninchen
und Isolierung von Choroidea und Retina
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Die
Tiere wurden mit einer intramuskulären Injektion von Zoletil (0,25
ml pro Kilogramm) und einer mit Rompun (0,15 ml pro Kilogramm) sediert
und mit einer Gasmischung aus Sauerstoff, Stickstoffmonoxid und
Isofluoran betäubt
und durch das Einträufeln
von 100 μl
(2 Tropfen) der Augensalbe pro Minute behandelt, die in der PCT
WO 01/37851 beschrieben wird, in dem Namen des gleichen Anmelders, oder
nur mit Trägermittel
behandelt.
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Die
Tiere wurden dann durch eine intrakardiale Injektion mit Tanax 82
(3 ml) geopfert. Die Augen wurden dann ausgeschnitten, mit einer
physiologischen Lösung
gewaschen, um Blut zu vermeiden, und von Muskeln und optischem Nerv
gereinigt. Die Hornhaut wurde dann mit einer Hornhautschere entfernt,
die kristallinen Anteile wurden eliminiert, wohingegen die Choroidea
und Retina zusammen mit der Sclera (Augenhaut) und Glaskörpersäften bei –80 °C zur Bestimmung
der Antioxidanzien konserviert wurden.
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Extraktion
und chromatographische Bestimmung der Antioxidanzien
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Die
Probe wurde mit einem Turrax in 1 ml doppelt destilliertem Wasser
homogenisiert und die lipidlöslichen
Antioxidanzien (Coenzym Q10, Retinol, α-Tocopherol, β-Karotin)
wurden durch Verwendung von 2 ml Extraktionsmischung (95 % Ethanol
und 5 % Isopropanol) plus 5 ml Hexan extrahiert; die Mischung wurde
für zwei
Minuten gerührt.
Diese Prozedur löste
die gesamte Oxidation des Coenzyms Q10 aus,
das möglicher
Weise in einer reduzierten Form vorliegt. Die Probe wurde dann bei
Raumtemperatur bei 3640 g für
10 Min. zentrifugiert, der Überstand wurde
zurück
gewonnen, zur Trockene verdampft und in Ethanol resuspendiert.
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Die
Antioxidationsmittel wurden durch Umkehrphasen- HPLC unter Verwendung
einer KROMASIL 100 Å – C18 250 × 4,6
mm Säule
mit einer Vorsäule
aus dem gleichen Material durch einen konvexen Gradienten (Phase
A: 90 % Methanol und 10 % Wasser; Phase B: 50 % Methanol, 25 % Isopropanol und
25 % Hexan; Elutionsgeschwindigkeit: 1,5 ml/Min.) abgetrennt. Das
oxidierte Coenzym Q10 wurde mittels eines
Multidiodenspektrophotometers bei Wellenlängen von 275 nm nachgewiesen.
Die quantitative Bestimmung wurde durch die Bezugnahme auf Standardkurven
durchgeführt.
Die Ergebnisse, die die Aufnahmekinetiken von Coenzym Q10 zeigen, das
durch Choroidea-/Retinazellen aufgenommen wird, sowie die Gegenwart
von Coenzym Q10 in diesen Geweben, werden
jeweils in den 5 und 6 gezeigt.
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Analoge
Daten, die die anti-apoptotische Wirkung von Coenzym Q10 zeigen,
wurden mit Mausfibroblasten (RAT-1) und mit menschlichen retinalen Zellen
(menschliches retinales, pigmentiertes Epithel, das auch als RPE
bezeichnet wird) erhalten.
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Bei
den erhaltenen Ergebnissen zur Hemmung des apoptotischen Phänomens bedingt
durch Hypoxie durch Coenzym Q10 beansprucht
die vorliegende Erfindung die Verwendung von Coenzym Q10 (oder
Ubichinon Q10 oder Coenzym Q10)
zur Herstellung eines Medikaments zur Verhütung, Behandlung und/oder Linderung
der degenerativen okkularen Pathologien, die sich aus apoptotischen
Phänomenen ableiten,
d. h., aus dem programmierten Zelltod (PZT) ableiten, und unter
Ausschluss der apoptotischen Phänomene,
die durch einen Überschuss
an freien Radikalen bedingt sind.
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Die
topische Verabreichung wird durch die Verwendung der Augensalbe
durchgeführt,
die in der PCT WO 01/37851 in dem Namen des gleichen Anmelders beschrieben
wird.
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Beispiel 5. Schützende Wirkung
von Coenzym Q10 gegenüber einer UVC-Bestrahlung, Antimycin
A, C2-Ceramid und der durch Serumentzug induzierten Apoptose.
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Eine
Zelllinie aus Keratozyten der Kaninchenhornhaut (RCE, „rabbit
corneal keratocytes") wurde
in Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM),
HAM's Nährstoffmischung
F 12 1 : 1 aufbewahrt, ergänzt
mit 15 % fötalem
Rinderserum (FRS), 2 mM Glutamin, 5 μg/ml Insulin, 10 ng/ml EGF und
50 Ul/ml Penicillin in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO2 bei
37 C°. Die
Zellen wurden mit 3 × 105/Platte plattiert. Vier schädigende
Mittel wurden in Dosen angewendet, von denen experimentell etabliert
wurde, dass sie Apoptose induzieren: UVC-Bestrahlung (254 nm) bei
15 mJ/cm2, das Blockierungsmittel der Atmungskette
Antimycin A in einer Konzentration von 200 μM, das apoptotisch signalisierende
Lipid C2-Ceramid (ein synthetisches zelldurchlässiges Analogon der
endogenen Ceramide) in einer Konzentration von 20 μM und die
FRS-Beschränkung auf
0,5 %. Die Behandlungen mit 10 μM
Coenzym Q10, aufgelöst in 0,04 % Lutrol F107, das
als Trägermittel
verwendet wurde, um die zelluläre
Aufnahme dieses hydrophoben Moleküls sicher zu stellen, oder
mit 10 μM
Vitamin C (Ascorbinsäure)
wurden 2 Stunden vor der Anwendung der apoptotischen Stimuli begonnen.
Nur mit Trägermittel
allein behandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Die antiapoptotischen
Wirkungen von Coenzym Q10 oder des Vitamins
C gegen die Bestrahlung mit UVC, gegen Antimycin A, gegen C2-Ceramid und gegen den Serumentzug wurden durch
Lichtmikroskopie und Ultramikroskopie ausgewertet. Die Identifizierung
apoptotischer Zellen mit fragmentierter DNA wurde durch die Endmarkierung mit
dem Klenow-FragEL® durchgeführt. In
diesem Assay werden apoptotische Zellen leicht durch das Vorhandensein
einer dunkelbraunen Färbung
im Gegensatz zu lebensfähigen
Zellen erkannt, die stattdessen grün oder sogar ungefärbt erscheinen.
Eine signifikante Anzahl (30 % – 60
%) von RCE-Zellen, die 24 Stunden nach der UVC-Bestrahlung, Verabreichung
von Antimycin A oder C2-Ceramid und Serumentzug
untersucht wurden, enthielten braungefärbte fragmentierte DNA. RCE-Zellen,
die mit 10 μM
Coenzym Q10 2 Stunden vor der Anwendung
apoptotischen Stimuli behandelt wurden, färbten grün. Die Behandlung mit 10 μM Vitamin
C verhinderte die Apoptose nur als Reaktion auf die UVC-Bestrahlung. Dies
zeigte, dass die Behandlung mit Coenzym Q10 die
Apoptose durch einen Mechanismus verhinderte, der unabhängig von
seiner Eigenschaft als freier Radikalfänger ist. Der Mangel an schützender
Wirkung durch Vitamin C unterstützt
diesen Beweis stark. Die mit Antimycin A und dem Serumentzug entweder
in der Abwesenheit (Abschnitte links) oder in der Anwesenheit (Abschnitte
rechts) von Coenzym Q10 erhaltenen Ergebnisse
werden in 7 gezeigt. In weiteren Experimenten
war der Serumentzug als apoptotischer Stimulus und die Vorbehandlung
mit Vitamin C nicht mit umfasst.
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Die
Anzahl lebender Zellen nach den oben beschriebenen Behandlungen
und durch den MTT-Assay analysiert, wurden dann ausgewertet (8). Wie in 8A gezeigt
wird, verringerte die UVC-Bestrahlung, Antimycin A und C2-Ceramid die Anzahl der lebenden Zellen
jeweils um 82 %, 56 % und 61 %. In allen Fällen schützte die Behandlung mit 10 μM Coenzym
Q10 die RCE-Zellen, was in eine Anzahl von
lebenden Zellen resultierte, die jeweils nur um 49 %, 29 % und 24
% verringert waren. Im Gegensatz dazu (8B) schützte die
Behandlung mit Vitamin C, das als reiner freier Radikalfänger verwendet
wurde, RCE-Zellen vor der Apoptose nur als Reaktion auf UVC-Bestrahlung
wirksam. 9 zeigt die Aspekte der Videomikroskopie
des Zeitverlaufs der RCE-Keratozyten, die für 24 Stunden in Abwesenheit jeglicher
Behandlung (oberer Abschnitt) oder nach entweder UVC-Bestrahlung
(links) oder Behandlung mit Antimycin A (Mitte) oder mit C2-Ceramid
(rechts) jeweils mit oder ohne einer zweistündigen Vorbehandlung mit Coenzym
Q10 kultiviert wurden. Nach allen drei Behandlungen
durchliefen eine große
Anzahl von RCE-Zellen eine Apoptose, aber die Behandlung mit Coenzym
Q10 verringerte diese Anzahl dramatisch,
was die Wirksamkeit von Coenzym Q10 bei
der Verhinderung der Apoptose gegen jeglichen apoptotischen Stimulus
zeigt. Korrespondierende quantitative Daten werden in 10 berichtet. In Bezug auf unbehandelte
oder mit Coenzym Q10 behandelte Kontrollen
erhöhte
sich die Anzahl kumulativer apoptotischer Vorgänge bei der Bewertung der Videomikroskopie
des Zeitverlaufs deutlich nach der Anwendung aller drei apototischer
Stimuli, aber in einem wesentlich geringeren Ausmaß, wenn
die Zellen mit Coenzym Q10 für 2 Stunden
vor der Induktion der Apoptose behandelt worden waren.
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Beispiel 6. Die UVC-Bestrahlung,
nicht aber Antimycin A, C2-Ceramid und Serumentzug
erhöht
freie Radikale.
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Die
Wirkungen der UVC-Bestrahlung, von Antimycin A, von C2-Ceramid
und des Serumentzugs auf die Generierung freier Radiale 2 Stunden
nach der Anwendung der Stimuli wurde unter Verwendung der Malonaldehydmenge
und der SOD-Aktivität
als indirekte Parameter analysiert. Die Zellen wurden mit Coenzym
Q10 oder Vitamin C, wie in Beispiel 4 beschrieben,
vorbehandelt oder auch nicht. Wie in 11 gezeigt
wird, wurden wesentliche Erhöhungen
der MDA-Menge (oberer Abschnitt) und der SOD-Aktivität (unterer Abschnitt) in Bezug
auf unbehandelte Zellen nur als Reaktion auf die UVC-Bestrahlung
erhalten (jeweils 1,5 pg/Zelle bis 16,5 pg/Zelle und 6,5 U/mg Protein
bis 19,5 U/mg Protein). Die Vorbehandlung mit Coenzym Q10 oder
Vitamin C verringerte diese Erhöhung.
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Beispiel 7. Coenzym Q10 verringerte die ATP-Mengen als Reaktion
auf apoptotische Stimuli, die nicht mit freien Radikalen assoziiert
sind
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Die
Durchführung
des apoptotischen Todesprogrammes setzt den massiven Verbrauch von
ATP voraus und dem entsprechend wird sie von einer dramatischen
Verringerung der zellulären
ATP-Mengen begleitet. Die Zellen wurden wie in Beispiel 5 behandelt.
Wie es in 12 gezeigt wird, verringerte
die UVC-Bestrahlung, Antimycin A und C2-Ceramid die ATP-Mengen
in RCE-Zellen um jeweils 65 %, 76 % und 81 % im Vergleich zu unbehandelten
Kontrollen. Die Verabreichung von Coenzym Q10 schützte RCE-Zellen
signifikant gegen die Verringerung der ATP-Mengen. Tatsächlich waren
in behandelten RCE-Zellen die Mengen an ATP um 28 % in UVC-bestrahlten
Zellen, um 41 % in mit Antimycin A behandelten Zellen und um 51
% in mit C2-Ceramid behandelten Zellen im
Vergleich zu mit nur Coenzym Q10 behandelten
Kontrollen verringert.
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Beispiel 8. Coenzym Q10 wirkte dem mitochondrialen Δψ-Kollaps
der Freisetzung von Cytochrom C, der Caspase 9- Aktivierung und
der DNA-Fragmentierung entgegen, die durch apoptotische Stimuli
ausgelöst
werden die nicht mit freien Radikalen assoziiert sind.
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Die
Zellen wurden wie in Beispiel 5 behandelt.
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Nachweis der Änderung
des mitochondrialen Transmembranpotentials (Δψ).
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Die Änderung
des mitochondrialen Transmembranpotentials (Δψ), die während der Apoptose zustande
kommt, wurde durch einen auf Fluoreszenz basierenden Assay in RCE-Zellen
nachgewiesen. Die Zellen wurden auf Deckelschalen für 15 Min.
bei 37 °C
in DMEM-Medium, das die lipophile kationische Sonde 5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1'3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyaniniodid
(JC-1, 5 mg/ml) (JC-1, Molecular Probes Inc. Eugene, OR, USA) enthält, inkubiert.
Dieser Farbstoff hat eine einzigartige Eigenschaft: bei hyperpolarisierten
Membranpotentialen (bis –140
mV) bildet er ein rot fluoreszierendes J-Aggregat, wohingegen er
bei depolarisierten Membranpotentialen (bis –100 mV) in der grün fluoreszierenden
monomeren Form verbleibt. Vor dem Nachweis wurden die Zellen in
PBS gewaschen und in eine offene Ojektträgerfliessbeladungskammer platziert,
die auf die Plattform eines konfokalen BioRad MRC 1024 ES Mikroskops
(BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) aufgesetzt war, das
mit einer Krypton-/-Argon-Laserquelle
ausgestattet war. Die Fluoreszenz wurde durch die Verwendung der
Wellenlängen
488 und 568 nm beobachtet und die ausgestoßene Fluoreszenz wurde mit
einem Nikon Plan Apo X 60 Ölimmersionsobjektiv
gesammelt. Wie es in 13 gezeigt wird,
bestimmte die UVC-Bestrahlung sowie die Behandlungen mit Antimycin
A oder C2-Ceramid den Δψ-Kollaps, tatsächlich wurde
eine Verschiebung in der Membranladung als das Verschwinden der
fluoreszierenden rotorange gefärbten
Mitochondrien und eine Erhöhung
in fluoreszierenden grün
gefärbten Mitochondrien
beobachtet. Westernblot-Analyse des cytoplasmatischen Cytochroms
C.
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Die
RCE-Zellen wurden 24 Stunden nach den apoptotischen Stimuli untersucht.
Cytosolische Fraktionen wurden wie in Ruties et al. 1999, J. Biol. Chem.
274, 24799 – 24807
beschrieben, hergestellt. Proteine in den cytosolischen Extrakten
wurden durch das BCA-Protein-Assay-Reagenz (PIERCE, Rockford, IL,
USA) quantifiziert. Die Proteine (25 μg/Bahn) wurden durch SDS-Polyacrylamidgel
(12,5 %) elektrophoretisch behandelt und auf Nitrozellulosemembran
(Schleicher & Schuell,
Keene, NH) unter Verwendung eines Transblotters (BioRad Laboratories
Inc., Hercules, CA, USA) elektrogeblottet. Die nicht spezifischen
Signale wurden mit Blockierungspuffer (5 Gew./Vol. fettfreies Instantmilchpulver
in PBS) blockiert und über
Nacht bei 4 °C
mit 1 μg/ml Anti-Cytochrom
C monoklonalem Antikörper
inkubiert (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
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Die
Membran wurde gewaschen und anschließend mit Ziege – anti-Maus
IgG, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (Sigma-Aldrich,
Mailand, Italien), inkubiert. Der Nachweis wurde unter Verwendung
einer kommerziellen Lumineszenzprozedur (ECL, Amersham Pharmacia
Biotech Europe, Freiburg, Germany) durchgeführt. Wie es in 14 24
Stunden nach der Induktion der Apoptose gezeigt wird, zeigten die
RCE-Zellen eine Erhöhung
in cytoplasmatischem Cytochrom C, wenn diese mit unbehandelten RCE-Zellen verglichen
wurden. Wenn den Behandlungen die Verabreichung von QoC10 vorausging,
blieb das Cytochrom C in der gleichen Menge wie bei nicht-induzierte
Zellen. Analyse der Caspase 9 Aktivität.
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Die
Caspase 9 Aktivität
wurde durch den Caspase 9 kolorimetrischen Protease Assay (BioSource
Europe, S.A., Nivelles, Belgien) bestimmt. Cytosolische Extrakte,
die durch das Lysieren von Zellen mit Zelllysepuffer hergestellt
wurden, der in dem Kit bereit gestellt wurde, wurden mit dem kolorimetrischen
Substrat LEHD (Leu-Glu-His-Asp), das mit dem Chromophor p-Nitroanilid
(pNA) konjugiert war, in 50 μl
2X Reaktionspuffer, der 10 mM DTT enthält, inkubiert. Nach einer 2-stündigen Inkubation
bei 37 °C
wurde die OD der Proben bei 405 nm in dem BioRad-ELISA-Auslesegerät gemessen. 15 zeigt
eine 6- bis 8- fache Verstärkung
der Caspase 9 Aktivität
in RCE-Zellen 24 Stunden nach der Verabreichung von apoptotischen
Stimuli. Wenn der Stimulierung eine Verabreichung von Coenzym Q10 vorausging, dann blieb die Caspase 9 Aktivität deutlich
niedriger, nicht aber bei der gleichen Menge wie bei nicht stimulierten
Zellen.
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Der
Kollaps des mitochondrialen Membranpotentials (Δψ), cytoplasmatisches Cytochrom
C und die Aktivierung der Caspase 9 sind Teil des intrinsischen
(Mitonchondrion abhängigen)
apoptotischen Stoffwechselweges, der durch Öffnung des PTP ausgelöst wird.
Die Vorbehandlung mit Coenzym Q10 verhinderte
größtenteils
alle diese Vorgänge.
Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass das Coenzym Q10 unabhängig von
seiner Eigenschaft als Radikalfänger die
Durchführung
der Apoptose durch die direkte Aufrechterhaltung des PTP in der
geschlossnen Konformation verhinderte.
-
Analyse
der DNA (nucleosomale Leiterbildung) Die apoptotische internucleosomale DNA-Fragmentierung
wurde durch den klassischen Nachweis ausgewertet, der elektrophoretisch
die getrennte Leiter fragmentierter DNA nachweist. Die genomische
DNA wurde aus RCE-Zellen extrahiert wie es durch Blankenberg et
al., 1997, Blood 89, 3778 – 3786
beschrieben wird. Die Fragmente wurden durch Gelelektrophorese in
0,8 % Agarose aufgetrennt, die Ethidiumbromid (0,2 μg/ml), enthält, durch
UV sichtbar gemacht und photographiert. Die Vorbehandlung mit Coenzym
Q10 verhinderte auch die internucleosomale
DNA-Fragmentierung (16), die durch alle apoptotischen
Stimuli ausgelöst
wird, was zeigte, dass die Blockierung des intrinsischen apoptotischen Stoffwechselweges
mit Coenzym Q10 ausreicht, um die „Zündung" der gesamten apoptotischen
Maschinerie zu verhindern, die durch apoptotische Stimuli ausgelöst wird.