DE69534734T2

DE69534734T2 - Verwendung von astaxanthin zur verzögerung und verbesserung der augenschädigung

Info

Publication number: DE69534734T2
Application number: DE69534734T
Authority: DE
Inventors: O. Mark Northbrook TSO; Tim-Tak Skokie LAM
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 1994-10-27
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2015-10-17
Also published as: CA2203836A1; DE69534734D1; CA2203836C; EP0786990A1; EP0786990B1; WO1996013255A1; US5527533A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Verzögerung und Milderung von Augenerkrankungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung eines Augeninsults, der von einer Erkrankung oder Verletzung herrührt, wie etwa altersbedingter Makuladegeneration, durch Licht hervorgerufener Verletzung bzw. photischer Verletzung, Photorezeptorzellen- oder Ganglienzellenschädigung, traumatischer Verletzung, ischämischen insultbedingten Erkrankungen und entzündlichen Erkrankungen. Dies kann erzielt werden, indem einer Person entweder oral, topisch oder parenteral eine therapeutisch wirksame Menge Astaxanthin verabreicht wird, um die durch die Erkrankung oder Verletzung verursachte Schädigung zu mildern oder das Fortschreiten einer degenerativen Erkrankung zu verzögern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele Erkrankungen und Verletzungen des zentralen Nervensystems sind zur Zeit nicht behandelbar. Diese Erkrankungen und Verletzungen sind unbehandelbar, weil das zentrale Nervensystem im Gegensatz zu vielen peripheren Organen, die ganz oder teilweise entfernt oder transplantiert werden können, ein sehr begrenztes Regenerationsvermögen hat und nicht vollständig exzidiert werden kann, ohne zum Tod zu führen. Das Auge ist eine Erweiterung des Gehirns und deshalb ein Teil des zentralen Nervensystems. Im Fall einer Augenverletzung oder -erkrankung, d. h. einer Netzhautverletzung oder -erkrankung, bleiben die Erkrankungen also häufig ohne Behandlung, und das Auge kann nicht transplantiert werden. Augenerkrankungen und -verletzungen, die zur Zeit unbehandelbar sind, umfassen photische Netzhautverletzung, durch Ischämie induzierte retinale Augenverletzung, altersbedingte Makuladegeneration und andere Augenerkrankungen und -verletzungen, die durch freie Radikalenspezies induziert sind.
Man hat die Hypothese aufgestellt, dass eine Hauptursache für diese unbehandelbaren Erkrankungen und Verletzungen des zentralen Nervensystems die Erzeugung und Anwesenheit von Singulett-Sauerstoff und anderen freien Radikalenspezies ist. Singulett-Sauerstoff und freie Radikalenspezies können durch eine Kombination von Licht und Sauerstoff oder während der Reperfusion nach einem ischämischen Insult erzeugt werden.
Das Auge ist Dauerbelastung durch Licht ausgesetzt, da der Hauptzweck des Auges die Lichtwahrnehmung ist. Deshalb resultieren einige unbehandelbare Erkrankungen und Verletzungen des Auges aus der Dauerbelastung des Auges durch Licht, gekoppelt mit der hoch sauerstoffgesättigten Umgebung im Auge.
Der Vorgang der Lichtwahrnehmung wird in den Photorezeptorzellen initiiert. Die Photorezeptorzellen sind ein Bestandteil der äußeren neuronalen Schicht der Retina bzw. Netzhaut, die eine Komponente des zentralen Nervensystems ist. Die Photorezeptorzellen sind im Zentrum des Auges sicher untergebracht und werden von der Sklera strukturell geschützt, werden von der stark vaskularisierten Uvea ernährt und von der Blut-Netzhaut-Schranke des Netzhautpigmentepithels geschützt.
Die Hauptfunktion der Photorezeptorzellen ist es, Licht in ein physiochemisches Signal (Transformation) umzuwandeln und dieses Signal zu den anderen Neuronen zu senden (Transmission). Während der Transformations- und Transmissionsvorgänge werden die Stoffwechselaktivitäten dieser Neuronen dramatisch verändert. Obwohl die Photorezeptorzellen im Inneren des Auges sicher geschützt sind, sind diese Zellen für Licht ohne weiteres zugänglich, da ihre Hauptfunktion das Detektieren von Licht ist. Übermäßige Lichtenergie, welche die Netzhaut erreicht, kann diese Neuronen entweder direkt oder indirekt schädigen, indem das Stoffwechselsystem dieser Zellen überschwemmt wird.
Die Kombination von Dauer- und/oder Überbelastung durch Licht und die relativ hohe Konzentration von Sauerstoff im Auge erzeugt Singulett-Sauerstoff und andere freie Radikalenspezies. Singulett-Sauerstoff und freie Radikalenspezies können auch durch enzymatische Prozesse erzeugt werden, die von Lichtbelastung unabhängig sind. Die freien Radikalenspezies und der Singulett-Sauerstoff sind reaktionsfähige Entitäten, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren oxidieren können. Die Netzhaut enthält die höchste Konzentration an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von allen Geweben im menschlichen Körper, und die Peroxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Zellmembranen der Netzhaut durch Hydroxylradikale (OH^–) oder Superoxidxadikale (O₂ ^–) kann zusätzliche freie Radikalenspezies fördern. Diese freien Radikalenspezies können zu einer funktionellen Beeinträchtigung der Zellmembranen führen und eine vorübergehende oder permanente Schädigung des Netzhautgewebes verursachen. Man hat die Theorie aufgestellt, dass die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff und freien Radikalenspezies deshalb der Pathogenese von lichtinduzierter Retinopathie und postischämischer Rückflußverletzung zugrunde liegt (d. h. der Erzeugung von freien Radikalen während der Reperfusion nach einem ischämischen Insult). Außerdem kann auch ein unzulängliches Entfernen dieser Spezies zu verschiedenen Erkrankungen des Auges und des zentralen Nervensystems beitragen.
Eine Reihe von natürlichen Mechanismen schützt die Photorezeptorzellen vor Verletzung durch Licht. Beispielsweise filtern die Elemente des Auges, welche die Cornea, das Kammerwasser, die Linse und den Glaskörper umfassen, den größten Teil des Lichts im Ultraviolettbereich. Nach einer Kataraktextraktion oder einem anderen chirurgischen Eingriff sind jedoch einige von diesen Schutzschranken entfernt oder beeinträchtigt, so dass die Photorezeptorzellen für eine Schädigung durch Strahlungsenergie anfälliger sind. Die Photorezeptorzellen besitzen auch andere Formen von Schutz vor photischer Verletzung, beispielsweise die Anwesenheit Antioxidantien-Verbindungen, um den durch Licht erzeugten freien Radikalenspezies entgegenzuwirken. Wie nachstehend gezeigt ist, tragen Antioxidantien, die Singulett-Sauerstoff, Hydrogenperoxid, Superoxid und Radikalenspezies löschen und/oder einfangen, dazu bei, eine Verletzung der Photorezeptorzellen zu minimieren. Außerdem hat das menschliche Auge eine außerordentlich große Anzahl von Photorezeptorzellen, so dass nur die Zerstörung einer erheblichen Anzahl von Photorezeptorzellen die Sehfunktion nachteilig beeinflusst.
Obwohl mehrere Schutzmechanismen im Auge vorhanden sind, ist in den Vereinigten Staaten altersbedingte Photorezeptordegeneration eine Hauptursache für Erblindung. Klinisch steht die Photorezeptordegeneration, wie man sie bei altersbedingter Makuladegeneration antrifft, ursächlich mit übermäßiger Belastung durch blaues Licht im Zusammenhang. Die Ursachen von altersbedingter Makuladegeneration, die durch einen Verlust von Photorezeptorneuronen gekennzeichnet ist, was in verringertem Sehvermögen resultiert, werden untersucht. Epidemiologische Studien zeigen auf, dass altersbedingte Photorezeptordegeneration oder altersbedingte Makuladegeneration durch mehrere Faktoren verursacht wird, die das Alter, das Geschlecht, die Familiengeschichte, die Farbe der Iris, Nähxstoffmangel, immunologische Störungen, Herz-Kreislauf- und Atemwegserkrankungen und bereits existierende Augenerkrankungen umfassen. Fortschreitendes Alter ist der bedeutendste Faktor. Kürzlich ist gezeigt worden, dass älter werdende Augen eine verringerte Menge an Carotinoiden haben. Klinische und Laboruntersuchungen zeigen auf, dass photische Verletzung aufgrund der kumulativen Wirkung von wiederholtem leichtem photischem Insult, was zu einem allmählichen Verlust von Phatorezeptorzellen führt, eine Ursache von altersbedingter Makuladegeneration ist.
Altersbedingte Makuladegeneration ist eine irreversible zum Erblinden führende Erkrankung der Netzhaut. Im Gegensatz zum Katarakt, bei dem das Sehvermögen durch Ersetzen der erkrankten Linse wiederhergestellt werden kann, kann altersbedingte Makuladegeneration nicht behandelt werden, indem die erkrankte Netzhaut ersetzt wird, da die Netzhaut eine Komponente des zentralen Nervensystems ist. Da es keine Behandlung für diese Erkrankung gibt, sobald die Photorezeptoren zerstört sind, ist die Verhinderung die einzige Möglichkeit, altersbedingter Makuladegeneration zu begegnen. Zur Zeit besteht die Verhinderung von altersbedingter Makuladegeneration darin, eine durch Licht und Sauerstoff induzierte (d. h. durch freie Radikale induzierte) Schädigung der Netzhaut zu begrenzen oder zu verhindern, da die Netzhaut das einzige Organ ist, das kontinuierlich hohen Lichtpegeln in einer stark sauerstoffgesättigten Umgebung ausgesetzt ist.
Zusätzlich zu photischer Verletzung können eine Augenverletzung und -erkrankung von Singulett-Sauerstoff und freien Radikalenspezies herrühren, die während der Reperfusion nach einem ischämischen Insult erzeugt werden. Ein ischämischer Insult der Netzhautganglienzellen und Neuronen der inneren Schichten der Netzhaut verursacht einen Verlust des Sehvermögens. Verlust des Sehvermögens geht mit diabetischer Retinopathie, Netzhautarterienverschluss, Netzhautvenenverschluss und Glaukom einher, von denen jedes ein ischämischer Insult für das Auge ist, d. h. dem Auge Sauerstoff und Nährstoffe entzieht.
Dir Schädigung der Netzhautganglienzellen wird auf Ischämie und anschließende Reperfusion zurückgeführt, während der freie Radikale erzeugt werden. Während der Reperfusion resultiert die Reoxygenierung von Gewebe nach einem ischämischen Insult in einer relativ hohen Konzentration an Sauerstoff, der durch das betroffene Gewebe strömt, was zur Bildung von freien Radikalen beiträgt. Ichämischer Insult und Reperfusion, begleitet von der Erzeugung von freien Radikalen, ist ferner ein Hauptelement, das zu einer Schädigung des zentralen Nervensystems, wie etwa einer durch einen Schlaganfall verursachten Schädigung, beiträgt.
Die Pathogenese von photischer Verletzung, altersbedingter Makuladegeneration, Schädigung durch Ischämie/Reperfusion, traumatischer Verletzung und Entzündungen des Auges und des zentralen Nervensystems wird auf Singulett-Sauerstoff und die Erzeugung von freien Radikalen und anschließende durch freie Radikale ausgelöste Reaktionen zurückgeführt. Forscher haben deshalb die Rolle von Antioxidantien bei der Verhinderung oder Milderung dieser Erkrankungen und Verletzungen des zentralen Nervensystems im Allgemeinen und des Auges im Besonderen untersucht.
Es wurde beispielsweise Ascorbat als ein Mittel zur Behandlung von photischer Netzhautverletzung untersucht. Ascorbat ist ein Reduktionsmittel, das in der Netzhaut in einer hohen Konzentration anwesend ist. Untersuchungen haben aufgezeigt, dass Ascorbat in der Netzhaut als ein Antioxidans wirksam sein kann und durch freie Radikalenspezies, die während übermäßiger Lichtbelastung erzeugt werden, oxidiert wird.
Die Verabreichung von Ascorbat hat den Verlust von Rhodopsin nach photischer Belastung verringert, wodurch nahegelegt wurde, dass Ascorbat Schutz vor photischer Netzhautverletzung bietet. Eine Verringerung von Rhodopsinspiegeln ist ein Indikator für eine photische Augenverletzung. Die Schutzwirkung von Ascorbat ist dosisabhängig, und Ascorbat war wirksam, wenn es vor der Lichtbelastung verabreicht wurde. Morphometrische Untersuchungen der Photorezeptorkerne, die nach Lichtbelastung in der Netzhaut zurückblieben, zeigten, dass Ratten, die Ascorbatsupplemente erhalten hatten, eine erheblich geringere Netzhautschädigung hatten. Morphologisch zeigten Ratten mit Ascorbatsupplementen auch eine bessere Erhaltung des Netzhautpigmentepithels.
Die vorstehenden Studien führten zu der Hypothese, dass Ascorbat eine photische Netzhautverletzung aufgrund seiner Antioxidans-Eigenschaften abschwächt, die seinen Redoxeigenschaften zugeschrieben werden. Ascorbat ist ein Radikalenfänger von Superoxidradikalen und Hydroxyradikalen und löscht ferner Singulett-Sauerstoff und verringert Hydrogenperoxid, die sämtlich bei photischer Netzhautverletzung gebildet werden. Diese Hypothese erklärt die Anwesenheit von hohen Spiegeln von natürlich vorkommendem Ascorbat in einer normalen Netzhaut.
Deshalb können Antioxidantien, welche die Bildung von freien Radikalen inhibieren oder Singulett-Sauerstoff löschen und freie Radikalenspezies einfangen, die Lipidperoxidation verringern und eine photische Verletzung und ischämische/Reperfusionsverletzung im zentralen Nervensystem und insbesondere in der Netzhaut mildern. Antioxidantien wurden ursprünglich untersucht, da sie bekannte Bestandteile von Humangewebe sind. Es wurden jedoch auch Antioxidantien untersucht, die nicht natürlich in Humangewebe vorkommen. Dabei sind zusätzlich zu Ascorbat Antioxidantien wie etwa 2,6-Di tert-butylphenol, γ-Oryzanol, α-Tocopherol, Mannitol, reduziertes Glutathion und verschiedene Carotinoide hinsichtlich der Fähigkeit untersucht worden, Singulett-Sauerstoff zu löschen und freie Radikalenspezies einzufangen. Diese und andere Antioxidantien sind wirksame Löschmittel und Fänger von Singulett-Sauerstoff und freien Radikalen. Dabei sind die Carotinoide als eine Klasse von Verbindungen sehr wirksame Singulett-Sauerstoff-Löschmittel und Fänger von freien Radikalen. Die einzelnen Carotinoide unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Singulett-Sauerstoff zu löschen und freie Radikalenspezies einzufangen.
Die Carotinoide sind natürlich vorkommende Verbindungen, die Antioxidans-Eigenschaften haben. Die Carotinoide sind gewöhnliche Verbindungen, die aus Pflanzen oder Tieren erzeugt werden und stark zu der Färbung von Pflanzen und Tieren beitragen. Eine Reihe von Tieren, einschließlich Säugern, sind unfähig, Carotinoide de novo zu synthetisieren und sind deshalb von der Ernährung abhängig, um den Carotinoidbedarf zu decken. Säuger haben ferner eine begrenzte Fähigkeit, Carotinoide zu modifizieren. Ein Säuger kann β-Carotin in Vitamin A umwandeln, die meisten anderen Carotinoide werden jedoch unveränderter Form in Säugergewebe abgelagert.
Was Menschen angeht, so finden sich in Humanserum ungefähr zehn Carotinoide. Die Hauptcarotinoide in Humanserum sind β-Carotin, α-Carotin, Cryptoxanthin, Lycopen und Lutein. Geringe Mengen Zeaxanthin, Phytofluen und Phytoen finden sich in menschlichen Organen. Von den zehn Carotinoiden, die sich in Humanserum finden, werden jedoch nur zwei, Zeaxanthin und Lutein, in der menschlichen Netzhaut gefunden. Zeaxanthin ist das vorherrschende Carotinoid in der Makula und ist in den Zapfenzellen im Zentrum der Netzhaut, d. h. in der Makula, konzentriert. Lutein befindet sich in der peripheren Netzhaut in den Stäbchenzellen. Deshalb assimiliert das Auge bevorzugt Zeaxanthin gegenüber Lutein in der Makula und konzentriert ferner selektiv Zeaxanthin, das ein wirksamerer Singulett-Sauerstoff-Fänger als Lutein ist, im Zentrum des Auges. Man hat die Theorie aufgestellt, dass Zeaxanthin und Lutein aufgrund ihrer Fähigkeit Singulett-Sauerstoff zu löschen und freie Radikale einzufangen, in der Netzhaut konzentriert sind und dadurch eine photische Schädigung der Netzhaut begrenzen oder verhindern.
Deshalb finden sich nur zwei von den ungefähr zehn Carotinoiden, die in Humanserum anwesend sind, in der Netzhaut. β-Carotin und Lycopen, die zwei am reichlichsten vorhandenen Carotinoide in Humanserum, sind entweder in der Netzhaut nicht oder nur in geringfügigen Mengen nachgewiesen worden. Die Netzhaut ist für β-Carotin relativ unzugänglich, da β-Carotin nicht imstande ist, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke des Netzhautpigmentepithels wirksam zu durchbrechen. Wie nachstehend im Einzelnen erläutert wird, hat man gefunden, dass geringe Mengen β-Carotin die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke durchbrechen.
Es ist ferner bekannt, dass ein anderes Carotinoid, Canthaxanthin, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke durchbrechen und die Netzhaut erreichen kann. Canthaxanthin ist wie alle Carotinoide ein Pigment und kann die Haut verfärben. Canthaxanthin ergibt eine Hautfarbe, die einer Sonnenbräune nahekommt, und wird deshalb vom Menschen dazu verwendet, eine künstliche Sonnenbräune zu erzeugen. Ein unerwünschter Nebeneffekt bei Personen, die Canthaxanthin in hohen Dosen für eine längere Zeit zu sich nahmen, war jedoch die Bildung von kristallinen Canthaxanthinablagerungen in den inneren Schichten der Netzhaut. Deshalb gestattet die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke des Netzhautpigmentepithels nur bestimmten Carotinoiden, in die Netzhaut einzutreten. Die Carotinoide, die nicht Zeaxanthin und Lutein sind und die in die Netzhaut eintreten, verursachen nachteilige Wirkungen wie etwa die Bildung von kristallinen Ablagerungen durch Canthaxanthin, die möglicherweise mehrere Jahre brauchen, um sich aufzulösen. Canthaxanthin in der Netzhaut verursachte ferner eine verringerte Dunkeladaptation.
Forscher haben ohne Erfolg nach einem Antioxidans gesucht, um den nachteiligen Wirkungen von Singulett-Sauerstoff und freien Radikalenspezies im zentralen Nervensystem im Allgemeinen und im Auge im Besonderen entgegenzuwirken. Die Forscher haben die Antioxidans-Fähigkeiten von mehreren Verbindungen einschließlich verschiedener Carotinoide untersucht. Obwohl die Carotinoide starke Antioxidantien sind, ist es den Forschern nicht gelungen, unter den 600 natürlich vorkommenden Carotinoiden spezielle Carotinoide zu finden, die Singulett-Sauerstoff wirksam löschen und freie Radikalenspezies wirksam einfangen, die imstande sind, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, die nicht die nachteiligen Wirkungen von Canthaxanthin nach dem Durchbrechen der Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zeigen und die eine Augenerkrankung oder -verletzung mildern und/oder das Fortschreiten einer degenerativen Erkrankung des Auges verzögern.
Verschiedene Veröffentlichungen betreffen Augenerkrankungen und -verletzungen wie etwa altersbedingte Makuladegeneration, Ursachen der Schädigung, die von den Erkrankungen oder Verletzungen herrührt, und Versuche, solche Erkrankungen und Verletzungen zu verhindern oder zu behandeln. Die Veröffentlichungen, die verschiedene Antioxidantien, einschließlich der Carotinoide und anderer Antioxidantien wie etwa α-Tocophexol, diskutieren, umfassen:

M.O.M. Tso, "Experiments on Visual Cells by Nature and Man: In Search of Treatment for Photoreceptor Degeneration", Investigative Ophthalmology and Visual Science, 30(12), S. 2421–2454 (Dezember 1989);
W. Schalch, "Carotenoids in the Retina – A Review of Their Possible Role in Preventing or Limiting Damage Caused by Light and Oxygen", Free Radicals and Aging, I. Emerit et al. (ed.), Birkhauser Verlag, S. 280–298 (1992);
M.O.M. Tso, "Pathogenetic Factors of Aging Macular Degeneration", Ophthalmology, 92(5), S. 628–635 (1985);
M. Mathews-Roth, "Recent Progress in the Medical Applications of Carotenoids", Pure and Appl. Chem., 63(1), S. 147–156 (1991);
W. Miki, "Biological Functions and Activities of Animal Carotenoids", Pure and Appl. Chem., 63(1), S. 141–146 (1991),
M. Mathews-Roth, "Carotenoids and Cancer Prevention – Experimental and Epidemiological Studies", Pure and Appl. Chem., 57(5), S. 717–722 (1985);
M. Mathews-Roth, "Porphyrin Photosensitization and Carotenoid Protection in Mice; In Vitro and In Vivo Studies", Photochemistry and Photobiology, 40(1), S. 63–67 (1984);
P. DiMascio et al., "Carotenoids, Tocopherols and Thiols as Biological Singlet Molecular Oxygen Quenchers", Biochemical Society Transactions, 18, S. 1054–1056 (1990);
T. Hiramitsu et al., "Preventative Effect of Antioxidants on Lipid Peroxidation in the Retina", Ophthalmic Res., 23, S. 196–203 (1991);
K. Kirschfeld, "Carotenoid Pigments: Their Possible Role in Protecting Against Photooxidation in Eyes and Photoreceptor Cells", Proc. R. Soc. Lond., B216, S. 71–85 (1982);
D. Yu et al., "Amelioration of Retinal Photic Injury by Beta-Carotene", ARVO Abstracts Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 28 (Suppl.), S. 7 (1987);
M. Kurashige et al., "Inhibition of Oxidative Injury of Biological Membranes by Astaxanthin", Physiol. Chem. Phys. and Med. NMR, 22, S. 27–38 (1990); und Ni.I. Krinsky et al., "Interaction of Oxygen and Oxy-radicals With Carotenodis",
T. Natl. Cancer Inst., 69(1), S. 205–210 (1982).

Im Allgemeinen stützen die obengenannten Veröffentlichungen die Hypothese, dass Singulett-Sauerstoff und freie Radikalenspezies zu einer Verletzung und Erkrankung des zentralen Nervensystems und insbesondere des Auges erheblich beitragen. Es ist beispielsweise berichtet worden, dass der Verzehr eines Antioxidans wie etwa Ascorbinsäure (Vitamin C), α-Tocopherol (Vitamin E) oder β-Carotin das Vorkommen von altersbedingter Makuladegeneration verringern kann.
Die obengenannten Veröffentlichen zeigten ferner, dass mehrere Carotinoide einschließlich Astaxanthin im Vergleich mit β-Carotin, Ascorbinsäure and anderen umfangreich verwendeteten Antioxidantien starke Antioxidantien sind. Die Veröffentlichungen berichten ferner, dass (1) nur bestimmte Carotinoide die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke selektiv durchbrechen und dass (2) bestimmte Carotinoide, die nicht Zeaxanthin und Lutein sind und welche die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke durchbrechen, nachteilige Wirkungen hervorrufen.
Im Allgemeinen lehren die obengenannten Veröffentlichungen, dass Astaxanthin ein wirksameres Antioxidans ist als Carotinoide wie etwa Zeaxanthin, Lutein, Tunaxanthin, Canthaxanthin und β-Carotin und als α-Tocopherol. Beispielsweise zeigten die in vitro und in vivo Untersuchungen, die in der Veröffentlichung von Kurashige et al. in Bezug auf Astaxanthin beschrieben sind, dass die mittlere wirksame Konzentration von Astaxanthin, die eine Lipidperoxidation inhibiert, 500mal niedriger als die von α-Tocopherol war. Gleichermaßen beschreibt die Veröffentlichung von Miki, dass Astaxanthin in vitro eine starke Löschwirkung gegenüber Singulett-Sauerstoff und eine starke Radikalenfangwirkung gegenüber freien Radikalenspezies zeigt.
Forscher haben die Theorie aufgestellt, dass in der Pathogenese von degenerativen Erkrankungen wie etwa der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der altersbedingten Makuladegeneration, der ischämischen/Reperfusions-Schädigung und der traumatischen Verletzung des Gehirns, des Rückenmarks und der Netzhaut sowie bei entzündlichen Prozessen des Körpers und insbesondere des Auges durch freie Radikale vermittelte Reaktionen beteiligt sind. Diese Theorie ist von Forschern vorgebracht worden, welche die Wirksamkeit von verschiedenen Antioxidantien bei der Milderung dieser Erkrankungen untersuchten. Beispielsweise wird Methylprednisolon, das in hohen Dosen ein starker Lipidperoxidationsinhibitor ist, klinisch zur Verwendung im Fall einer traumatischen Verletzung des Rückenmarks empfohlen.
Bis heute sind die Bemühungen bei den Untersuchungen darauf ausgerichtet, Erkrankungen und Verletzungen zu verhindern, da die resultierende durch freie Radikale induzierte Schädigung nicht wirksam behandelbar ist. Deshalb besteht ein Bedarf für ein Verfahren nicht nur zum Verhindern oder Verzögern, sondern auch zum Mildern von degenerativen und traumatischen Erkrankungen und Verletzungen des Auges.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Astaxanthin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Person, die an einer Netzhautschädigung oder Netzhauterkrankung leidet, um das Sehvermögen der Person zu verbessern, wobei Astaxanthin in die Netzhaut so verabreicht wird, dass Astaxanthin die Blut-Hirn-Schranke durchbricht. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Astaxanthin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Person, die an einer degenerativen Netzhauterkrankung leidet, um das Fortschreiten der Erkrankung zu verzögern.
Diese und weitere neue Merkmale und Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden genauen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Figuren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Balkendiagramm, das die Dicke der ONL (outer nuclear layer = äußeren Körnerschicht) der Netzhaut in Mikrometern (μm) nach lichtinduzierter Rezeptordegeneration zeigt und die Netzhaut von Kontrolltieren mit der Netzhaut von Tieren vergleicht, die mit Astaxanthin behandelt wurden, das parenteral sowohl für die Netzhaut insgesamt (Mittelwert) als auch für jeden von den vier Quadranten der Netzhaut verabreicht wurde;
2 ist ein Balkendiagramm, das die Dicke der inneren Netzhautschicht (inner retinal layer = IRL) in Mikrometern zeigt, wobei die Netzhaut von Kontrolltieren mit der Netzhaut von Tieren nach einem ischämischen Insult verglichen wird, die mit Astaxanthin behandelt wurden;
3 ist ein Diagramm des Rhodopsinspiegels über der Zeit nach einer photischen Verletzung, wobei die Netzhaut von Tieren, die mit Astaxanthin oral behandelt wurden, mit der Netzhaut von Kontrolltieren verglichen wird; und
4 ist ein Diagramm der ONL-Dicke über der Zeit nach einer photischen Verletzung, wobei die Netzhaut von Tieren, die mit Astaxanthin oral behandelt wurden, mit der Netzhaut von Kontrolltieren vergleichen wird.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bestimmte Erkrankungen und Verletzungen der Augen sind zur Zeit unbehandelbar. Neuronale Degeneration des zentralen Nervensystems oder des Auges kann von photischer Verletzung, ischämischem oder intraokularem druckbedingtem Insult, beispielsweise einer Okklusion oder einem Schlaganfall, oder von einem Trauma, beispielsweise einem Trauma des Rückenmarks herrühren. Die Schädigung kann auch von einer Verletzung der Photorezeptorzellen, der Ganglienzellen in der Netzhaut des Auges oder von Neuronen der inneren Netzhautschichten des Auges oder von altersbedingter Makuladegeneration herrühren.
Man hat die Theorie aufgestellt, dass die Schädigung aufgrund solcher Erkrankungen und Verletzungen auf das vermehrte Erzeugen oder verringerte Entfernen von Singulett-Sauerstoff und freien Radikalenspezies zurückgeführt werden kann. Da bekannt ist, dass Antioxidantien Singulett-Sauerstoff löschen und freie Radikalenspezies einfangen, und da bekannt ist, dass im Menschen Antioxidantien existieren, haben deshalb Forscher nach wirksamen Antioxidantien gesucht, um freie Radikale einzufangen und dadurch die durch freie Radikale induzierte Schädigung zu verringern, die an dem zentralen Nervensystem und insbesondere dem Auge durch eine Erkrankung und Verletzung verursacht wird.
Es sind zahlreiche Antioxidantien untersucht worden, wie beispielsweise Ascorbinsäure, α-Tocopherol und β-Carotin. Einige Forscher haben den Fokus auf die Carotinoide gerichtet, beispielsweise β-Carotin, da über 600 Carotinoide bekannt sind, natürlich vorkommen (und deshalb reichlich vorhanden sind) und starke Antioxidantien sind. Ferner finden sich in Bezug auf die Augen zwei Carotinoide, Zeaxanthin und Lutein, die starke Antioxidantien sind, in den Photorezeptorzellen der Netzhaut. Obwohl Humanplasma ungefähr zehn Carotinoide aufweist, sind nur diese beiden Carotinoide imstande, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke wirksam zu durchbrechen und sich in der Makula des Auges anzureichen. β-Carotin, das am reichlichsten vorhandene Humanplasma-Carotinoid, hat eine sehr begrenzte Fähigkeit, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen.
Die Fähigkeit eines Carotinoids, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, ist wichtig, da Carotinoide vom menschlichen Körper nicht synthetisiert werden. Die einzige Carotinoidquelle für den Menschen ist die Aufnahme über die Ernährung. Ferner hat der Mensch eine sehr begrenzte Fähigkeit, Carotinoide zu modifizieren. Deshalb sammeln sich Carotinoide in verschiedenen Organen in der aufgenommenen Form an. Wenn also ein bestimmtes Carotinoid nicht imstande ist, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, kann sich das Carotinoid nicht in der Netzhaut ansammeln und als ein Antioxidans wirken.
Ferner zeigen Carotinoide, die keine normalen Bestandteile von Humanplasma sind, jedoch die Fähigkeit haben, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, nachteilige Wirkungen auf die Netzhaut. Canthaxanthin, das absichtlich aufgenommen wird, um künstliche Sonnenbräune zu ergeben, sammelt sich in der Netzhaut in Form von Kristallen an und beeinträchtigt vorübergehend die Dunkeladaptation des Auges. Außerdem hat β-Carotin eine begrenzte Fähigkeit, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen.
Obwohl die Carotinoide als starke Antioxidantien bekannt und reichlich vorhanden sind, werden deshalb die Carotinoide nicht für die Behandlung einer Schädigung des zentralen Nervensystems oder einer Augenschädigung verwendet, die durch eine Erkrankung oder Verletzung verursacht ist. Die bis heute untersuchten Carotinoide konnten entweder die Blut-Netzhaut-Schranke nicht wirksam durchbrechen (beispielsweise β-Carotin) oder hatten eine nachteilige Wirkung auf das Auge (beispielsweise Canthaxanthin).
Gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung wird Astaxanthin, das eine natürlich vorkommende Verbindung und ein potentes Antioxidans ist, dafür eingesetzt, eine Zellschädigung bei einer Person, die an einer degenerativen, entzündlichen oder traumatischen Erkrankung oder Verletzung des Auges leidet, zu mildern und zu verzögern. Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung verhindert, verzögert und/oder mildert die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge Astaxanthin an eine Person eine durch freie Radikale induzierte Schädigung, die von einer Erkrankung oder Verletzung wie etwa einem Trauma herrührt. Beispielsweise kann eine Netzhautschädigung entweder von einer photischen Verletzung, einer neurodegenexativen Erkrankung oder einem ischämischen Insult, gefolgt von Reperfusion, herrühren. Was eine Schädigung aufgrund einer photischen Verletzung angeht, so verringert Astaxanthin den Verlust von Photorezeptoxzellen. Was eine Schädigung aufgrund eines ischämischen Insults angeht, so mildert Astaxanthin den Verlust vor Ganglienzellen und der inneren Schichten des neuronalen Retinanetzwerks.
Im Allgemeinen sind die Carotinoide Terpenoidverbindungen, die in der Natur weit verbreitet sind und selektiv Licht absorbieren. Ungefähr 600 Carotinoide sind von verschiedenen pflanzlichen und tierischen Quellen isoliert und identifiziert worden. Tiere können Carotinoide nicht de novo synthetisieren, sondern sind von pflanzlichen Quellen abhängig. Deshalb sind Tiere hinsichtlich Carotinoiden von der Aufnahme über die Ernährung abhängig. Tiere können Carotinoide jedoch modifizieren. Die Fähigkeit, Carotinoide zu modifizieren, ist beim Menschen sehr begrenzt.
Carotinoide werden in zwei Hauptgruppen unterteilt: (1) die Carotine, die Kohlenwasserstoffe sind, und (2) die Xanthophylle, die Sauerstoff zusätzlich zu Kohlenstoff und Wasserstoff aufweisen. Die Xanthophylle können als Oxidationsprodukte der Carotine betrachtet werden und werden durch Einbau von Sauerstoff in Carotine und anschließende Neuordnungen hergestellt. Das üblichste Carotinoid ist das Carotin, β-Carotin. Im Folgenden ist die chemische Struktur von verschiedenen Carotinoiden gezeigt:
β-Carotin
Zeaxantin
Leutein
Aslaxaninin
Die chemischen Strukturen der fünf oben angegebenen Carotinoide zeigen, dass geringfügige Änderungen der chemischen Struktur die Eigenschaften des Carotinoids stark beeinflussen, wie etwa die Fähigkeit des Carotinoids, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, und die Fähigkeit des Carotinoids, als ein Antioxidans zu wirken. Beispielsweise ist β-Carotin das in Humanplasma am reichlichsten vorhandene Carotinoid, findet sich aber typischerweise nicht in der Netzhaut. Kleine Mengen β-Carotin finden sich in der Netzhaut, wenn β-Carotin in hohen Dosen intraperitoneal oder oral verabreicht wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass β-Carotin große Schwierigkeiten hat, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen. Dagegen sind Zeaxanthin und Lutein, die beide hinsichtlich der Struktur β-Carotin sehr ähnlich sind, in der Netzhaut konzentriert vorhanden, obwohl Zeaxanthin und Lutein in Humanplasma nur in geringfügigen Mengen vorhanden sind.
Was die Fähigkeit angeht, als ein Antioxidans zu wirken, so unterscheiden sich die Carotinoide stark hinsichtlich der Fähigkeit, Singulett-Sauerstoff zu löschen und freie Radikale einzufangen. Die vorstehend genannte Veröffentlichung von DiMascio berichtete über die folgende Fähigkeit von Carotinoiden, Singulett-Sauerstoff zu löschen:
Astaxanthin > Canthaxanthin > β-Carotin > Zeaxanthin > Lutein >> α-Tocopherol.
Die vorstehend genannte Veröffentlichung von Miki berichtete über die folgende Fähigkeit von Carotinoiden, freie Radikalenspezies einzufangen:
Astaxanthin > Zeaxanthin > Canthaxanthin > Lutein > β-Carotin > α-Tocopherol.
Deshalb beeinflussen geringfügige strukturelle Unterschiede die Fähigkeit eines Carotinoids, als ein Antioxidans im Allgemeinen zu wirken und insbesondere als ein Singulett-Sauerstoff-Löschmittel oder Fänger von freien Radikalen zu wirken.
Canthaxanthin, das ein starkes Antioxidans ist und eine Zeaxanthin und Lutein ähnliche Struktur hat, hat die Fähigkeit, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen. Canthaxanthin sammelt sich jedoch in der Netzhaut an und bildet Kristalle. Astaxanthin hat auch eine Canthaxanthin, Zeaxanthin und Lutein ähnliche Struktur. Astaxanthin ist ferner ein stärkeres Antioxidans als Canthaxanthin, Zeaxanthin und Lutein. Überraschenderweise hat man gefunden, dass Astaxanthin, das in Humanplasma nicht vorhanden ist, die Fähigkeit hat, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen (im Gegensatz zu β-Carotin), jedoch keine Kristalle in der Netzhaut bildet und das Auge anderweitig nicht nachteilig beeinflusst (im Gegensatz zu Canthaxanthin).
Astaxanthin oder 3,3'-Dihydroxy-β,β-carotin-4,4'-dion ist eine reichlich vorhandene und natürlich vorkommende Verbindung. Astaxanthin ist das Hauptpigment von Krustentieren und ist das am weitesten verbreitete Xanthophyll im Tierreich.
Astaxanthin ist ein lipidlösliches Pigment, das hauptsächlich zur Pigmentierung von Zuchtfischen wie Lachs verwendet wird, der Astaxanthin aufnehmen muss, um für den Verbraucher akzeptable, rosafarbene Lachsmuskeln zu erhalten. Astaxanthin ist ferner ein Antioxidans, das um ungefähr das 100- bis 1000fache wirksamer als α-Tocopherol ist.
Die Hauptquelle für Astaxanthin sind Schalen von Krustentieren wie Krill. Astaxanthin ist auch synthetisch erhältlich. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung kann entweder das natürlich vorkommende oder das synthetische Astaxanthin verwendet werden.
Dabei ist Astaxanthin zur Zeit in drei Formen erhältlich: (1) als natürliches Astaxanthin, das aus Krill extrahiert wird, erhältlich von Itano Refrigerated Food Co., Tokushima, Japan; (2) als synthetisches Astaxanthin, erhältlich von Itano Refrigerated Food Co.; und (3) als Astaxanthin, das aus der Hefe Phaffia Rhodozyma extrahiert wird, erhältlich von Universal Food Co., Milwaukee, Wisconsin. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung würde jedoch Astaxanthin in jeder erhältlichen Form verwendet werden. Bei den nachstehenden Experimenten wurde aus Krill extrahiertes Astaxanthin in dem Zustand, wie es erhalten wurde, verwendet. Das synthetische Astaxanthin wurde vor der Verwendung zunächst mit Sojaöl vermischt. Das Astaxanthin auf Hefebasis wurde mit Aceton extrahiert, um den Astaxanthingehalt zu steigern. Der Astaxanthin-reiche Extrakt wurde dann vor der Verwendung mit Sojaöl vermischt.
Wie bereits erwähnt, schützt das Netzhautpigmentepithel die Netzhaut, indem es eine Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke bildet. Die Schranke schließt Plamabestandteile aus, die für die Netzhaut potentiell schädlich sind. Wie ebenfalls bereits erwähnt, gestattet die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke nur Lutein und Zeaxanthin, in die Netzhaut einzutreten, und schließt andere in Humanserum vorhandene Carotinoide aus, einschließlich β-Carotin, welches das in Humanserum am reichlichsten vorhandene Carotinoid ist. Deshalb wurde ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob Astaxanthin, das keine Komponente von Humanplasma ist, die Fähigkeit hat, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen.
Um zu bestimmen, ob Astaxanthin die Fähigkeit hat, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen und sich in der Netzhaut eines Säugers anzureichern, wurde eine Astaxanthinlösung präpariert, indem 0,15 g AST-5000 (eingetragenes Warenzeichen), ein Astaxanthin, das aus Krill extrahiert wird und von Itano Refrigenated Food Co. erhältlich ist, in 1,0 mL einer 1,0 Gew.-% wässrigen Lösung von TWEEN-80 (Polyoxyethylensorbitan-monooleat, erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis Mo.) suspendiert wurde. Die resultierende Astaxanthinlösung (1,5 mL) wurde in sechs (6) Ratten intraperitoneal injiziert. Nach Tötung der Ratten wurde die Netzhaut auf die Anwesenheit von Astaxanthin untersucht. Nach sechs aufeinanderfolgenden intraperitonealen Injektionen von Astaxanthin in Abständen von zwölf Stunden und in einer Dosis von ungefähr 37,5 mg/kg Körpergewicht ergab sich sechs Stunden nach der letzten Injektion eine mittlere Konzentration von Astaxanthin in der Netzhaut von ungefähr 0,17 μg/mg feuchtem Gewebe.
Astaxanthin ist kein natürlich vorkommender Bestandteil der Netzhaut. Deshalb zeigt die Anwesenheit einer so bedeutenden Menge Astaxanthin in der Netzhaut die Fähigkeit von Astaxanthin, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke in die Netzhaut ohne weiteres zu durchbrechen.
Die Fähigkeit von Astaxanthin, eine durch photische Verletzung verursachte Augenschädigung zu mildern, wurde wie folgt demonstriert:
Eine lichtinduzierte Photorezeptordegeneration wurde gemäß dem Protokoll durchgeführt, über das in Z. Li et al., Current Eye Res., 10, S. 133–44 (1991), berichtet wird. Kurz gesagt, 35 bis 40 Tage alte männliche Lewis-Albinoratten (Harlan, Indianapolis, IN) erhielten normale Ernährung und wurden 14 Tage lang einem Zwölfstundenzyklus von Licht (gleichmäßige Beleuchtungsstärke von 53,8 Lux) und Dunkelheit ausgesetzt. Vier Ratten wurden dann vier intraperitoneale Injektionen einer Suspension aus 0,15 g AST-5000 (Astaxanthin) in 1,0 mL wässrigem 1,0 % TWEEN-80 (eingetragenes Warenzeichen) verabreicht. Die Dosis jeder Injektion war 37,5 mg Astaxanthin/kg Körpergewicht pro Injektion. Die Injektionen wurden in Abständen von 12 h verabreicht, beginnend 24 h vor Lichtbelastung. Drei Kontrollratten wurden 1,0 mL einer wässrigen 1,0 % TWEEN-80-Lösung injiziert. Alle sieben Ratten wurden einen Tag nach totaler Dunkeladaptation für 24 h 180 bis 200 ft-candle (1800 bis 2000 Lux) grüngefiltertem Fluoreszenzlicht (490 bis 580 nm) (Plexiglass (eingetragenes Warenzeichen) Nr. 2092, Polycast technology, Stamford, CT) ausgesetzt. Alle sieben Ratten wurden für eine zweitägige Erholungsdauer im Dunkeln gehalten, dann mit einer Überdosis Pentobarbital euthanasiert. Beide Augen jeder Ratte wurden für histopathologische und morphometrische Studien enukleiert.
Die enukleierten Augen jeder Ratte wurden in einer 0,1 M phosphatgepufferten 4 % Formaldehyd- und 1 % Glutaraldehydlösung (Gewichtsprozent) fixiert. Das vordere Segment jedes Auges wurde entfernt, und das hintere Segment wurde in den oberen (S), nasalen (N), unteren (I) und temporalen (T) Quadranten unterteilt. Gewebeproben von jedem Quadranten wurden dann mit Osmiumtetroxid behandelt (d. h. mit Osmiumsäure behandelt), in einer abgestuften Serie von Alkoholen dehydriert und in ein Epoxidharz eingebettet. Morphologische und morphometrische Studien wurden an 1 μm Schnitten durchgeführt, die mit Mallorys Azur-II-Methylenblau angefärbt waren.
Eine quantitative Bestimmung der Photorezeptorzellendegeneration wurde durchgeführt, indem die Dicke der äußeren Körnerschicht (ONL) der Netzhaut durch einen maskierten Beobachter gemessen wurde, wie dies in J. Michon et al., Invest Ophthalmol. Vis. Sci., 32, S. 280–84 (1991), beschrieben ist. Die Messungen wurden mit einem Bildverarbeitungssystem durchgeführt, wobei die angefärbten Netzhautschnitte auf eine digitalisierte Unterlage projiziert wurden, die mit einem Mikrocomputer gekoppelt war. Die Messungen wurden von dem hinteren Augenpol zu der Ora serrata an beiden Schnitten durchgeführt.
Die Balkendiagramme von 1 fassen die Ergebnisse des Tests der photischen Verletzung zusammen. Wie aus 1 ersichtlich ist, war für jeden Quadranten und für die Netzhaut insgesamt die ONL-Dicke der Netzhaut bei Ratten größer, welche die Astaxanthininjektion erhalten hatten. Das Astaxanthin schützte also die Photorezeptoren in jedem von den vier Augenquandranten sowie im ganzen Auge. Beispielsweise war die ONL für das ganze Auge von Ratten, die das Astaxanthin erhalten hatten, ungefähr 42 μm dick. Die ONL des ganzen Auges der Kontrollratten war ungefähr 32 μm dick. Zum Vergleich: Bei Nichtvorliegen einer photischen Verletzung ist die ONL eines normalen Auges ungefähr 45 μm dick. 1 zeigt deshalb, dass die Verabreichung von Astaxanthin Photorezeptorzellen einen erheblichen Schutz vor photischer Verletzung bietet.
Die Fähigkeit von Astaxanthin, eine Verletzung von Neuronen nach einem ischämischen Netzhautinsult und anschließender Reperfusion zu mildern, wurde wie folgt demonstriert: Zwei 45 bis 50 Tage alten männlichen Lewis-Albinoratten (Harlan, Indianapolis, IN) wurden drei intraperitoneale Injektionen einer Suspsension von 0,15 g AST-5000 (Astaxanthin) in 1,0 mL 1 % wässrigem TWEEN-80 verabreicht (d. h. eine Dosis von 37,5 mg/kg/Injektion). Zwei anderen Albinoratten wurden 1,0 mL Lösung aus 1,0 % wässrigem TWEEN-80 als Kontrolle injiziert. Die Injektionen wurden in Abständen von 12 h verabreicht, beginnend 24 h von dem ischämischen Netzhautinsult. Zwei weitere Ratten dienten als unbehandelte Kontrollen.
Vier Ratten wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Chloralhydrat (400 mg/kg) anästhetisiert. Dann wurde durch Erhöhen des intraokulären Drucks (IOP) durch eine Infusionskanüle zu der vorderen Augenkammer ein bilateraler ischämischen Insult induziert. Der IOP wurde für 60 min auf 110 mmHg gehalten. Dann wurden die Kanülen entfernt, und die Reperfusion der Okulargefäßen wurde durch Augenfundusuntersuchung festgestellt. Alle vier Ratten wurden sieben Tage nach den Reperfusion mit einer Überdosis Pentobarbital euthanisiert. Beide Augen jeder Ratte wurde enukleiert und in einer Lösung aus 0,1 M Phosphatpuffer und 1 % Glutaraldehyd und 4 % Formaldehyd (Gewichtsprozent) fixiert.
Nach dem Entfernen des vorderen Segments jedes Auges wurde das hintere Segment jedes fixierten enuklierten Auges in den oberen (S), temporalen (T), unteren (I) und nasalen (N) Quadranten unterteilt. Jedem Quadranten wurde eine Probe in Form eines Streifens entnommen, dieser wunde verarbeitet und in Epoxidharz eingebettet. Morphologische und morphometrische Auswertungen wurden an 1 μm Schnitten durchgeführt, die mit Methylenblau angefärbt waren. Der Grad des ischämischen Insults wurde ausgewertet, indem die mittlere Dicke (IRT) zwischen der inneren Grenzmembran (ILM) zu der Grenzfläche der äußenen retikulären Schicht (outer plexiform layer = OPL) und der äußeren Körnerschicht (ONL) gemessen wurde. Die Messungen wurden an dem projizierten Bild der angefärbten Netzhautschnitte mittels Bildverarbeitung durchgeführt.
Die Messergebnisse von sämtlichen Quadranten der Netzhaut wurden gemittelt, um einen Mittelwert für die IRT je Auge zu erhalten.
Das Balkendiagramm von 2 fasst die Ergebnisse des Tests des ischämischen Insults zusammen. Aus 2 ist ersichtlich, dass sieben Tage nach dem ischämischen Netzhautinsult die mittlere IRT der Netzhaut der Ratten, die mit Astaxanthin behandelt worden waren, größer war als die IRT von Kontrollratten.
Die IRT bei Ratten, die mit Astaxanthin behandelt worden waren, war ungefähr 70 μm. Die IRT bei den Kontrollratten war ungefähr 62 μm. Zum Vergleich: Die normale IRT bei einer Ratte, die keinem ischämischen Netzhautinsult ausgesetzt worden war, war 120 μm. Die mit Astaxanthin behandelten Ratten, deren IRT ungefähr 10 μm dicker war als die der unbehandelten Ratten, zeigte, dass Astaxanthin einen statistisch signifikanten Schutz der Ganglienzellen und anderer neuronaler Elemente der inneren Netzhaut vor ischämischem Insult bot.
Zusätzlich zu den Tests unter Verwendung von durch die Extraktion aus Krill erhaltenem Astaxanthin wurden auch Tests unter Verwendung von Astaxanthin durchgeführt, das aus Phaffia Rhodozyma extrahiert wurde. Das Astaxanthin wurde unter Anwendung einer Modifikation des von E.A. Johnson et al., App. Environ. Microbiol., 35, S. 1155–59 (1978), beschriebenen Verfahrens extrahiert. 100 g getrocknetes Phaffia Rhodozyma Pulver (Universal Food Co., Milwaukee, WL) wurden mit 200 mL Wasser, das 70 mg butyliextes Hydroxytoluol (BHT) enthielt, vermischt und vermahlen. Der Brei wurde durch Hinzufügen von 2 L Aceton, das 0,7 g BHT enthielt, extrahiert. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt, dann für 10 min mit 3,110 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde von dem Festmaterial getrennt, dann mit einem Rotationsverdampfer verdampft. Der Rückstand wurde dann wiederum mit 1 L Aceton unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie bei der ersten Extraktion extrahiert. Der Rückstand der Acetonextraktionen wurde dann in 100 mL Aceton, das 35 mg BHT enthielt, gelöst. Die resultierende Suspension wurde luftgetrocknet und bei –20 °C bis zur Verwendung gelagert. Der Astaxanthingehalt des Extrakts war ungefähr 10 Gew.-% (ermittelt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie).
Eine photische Verletzung wurde in 35 bis 40 Tage alten männlichen Lewis-Albinoratten (Harlan, Indianapolis, IN) induziert, die normale Ernährung erhielten. Die Ratten wurden 14 Tage lang einem Zwölfstundenzyklus von Licht (gleichmäßige Beleuchtungsstärke von 53,8 Lux) und Dunkelheit ausgesetzt. Die Tiere erhielten dann eine tägliche orale Zufuhr von entweder: (1) dem extrahierten Astaxanthin in 1,0 mL Sojaöl in einer Dosis von 80 mg Astaxanthin/kg/Tag oder (2) 1,0 mL Sojaöl als Kontrolle, beginnend neun Tage vor der Lichtbelastung, für 11 Tage weitergeführt. Eine Gruppe von 18 Ratten erhielt das extrahierte Astaxanthin, und eine zweite Gruppe von anderen 18 Ratten erhielt die Sojaölkontrolle. Alle 36 Ratten wurden nach einem Tag totaler Dunkeladaptation für 24 h 180 bis 200 ft-candle (1800 bis 2000 Lux) grüngefiltertem Fluereszenzlicht (490 bis 580 nm) (Plexiglass Nr. 2092, Polycast technology, Stamford, CT) ausgesetzt. Alle 36 Ratten wurden für eine Erholungsdauer von sechs Stunden, sechs Tagen oder dreizehn Tagen im Dunkeln gehalten, dann mit einer Überdosis Pentobarbital euthanisiert. Ein Auge jeder Ratte wurde für histopathologische und merphometrische Studien enukleiert. Das zweite Auge jeder Ratte wurde zur biochemischen Auswertung von Rhodopsinspiegeln verwendet.
Deshalb wurde ein enukleiertes Auge jeder Ratte in 0,1 M phosphatgepufferter 4 % Formaldehyd- und 1 % Glutaraldehydlösung (Gewichtsprozent) fixiert. Das vordere Segment jedes Auges wurde entfernt, und das hintere Segment wurde in den oberen (S), nasalen (N), unteren (I) und temporalen (T) Quadranten unterteilt. Gewebeproben von jedem Quadranten wurden dann mit Osmiumtetroxid behandelt, in abgestuften Serien von Alkoholen dehydriert und in ein Epoxidharz eingebettet. Morphologische und morphometrische Studien wurden an 1 μm Schnitten durchgeführt, die mit Mallorys Azur-II-Methylenblau angefärbt waren.
Eine quantitative Bestimmung der Verletzung von Photorezeptorzellen wurde durchgeführt, indem die Dicke der äußeren Körnerschicht (ONL) der Netzhaut durch einen maskierten Beobachter gemessen wurde, wie dies in der Veröffentlichung von Michon et al. beschrieben ist. Die Messungen wurden mit einem Bildverarbeitungssystem durchgeführt, wobei angefärbte Netzhautschnitte auf eine digitalisierte Unterlage projiziert wurden, die mit einem Mikrocomputer gekoppelt war. Die Messungen wurden von dem hinteren Augenpol zu der Ora serrata an zwei Schnitten pro Quadsrant durchgeführt.
Das zweite enukleierte Auge jeder Ratte wurde dazu verwendet, die Netzhaut-Rhodopsinspiegel gemäß dem in Z. Li et al., Current Eye Res., 10, S. 133–44 (1991), veröffentlichten Verfahren zu schätzen. Rhodopsin ist ein lichtempfindliches Protein, das in den Stäbchen der Netzhaut im Auge vorgefunden wird. Eine Verringerung des Rhodopsinpigmentspiegels zeigt eine photische Verletzung des Auges an. Eine Netzhaut, die keiner photischer Verletzung ausgesetzt worden ist, hat einen Rhodopsinspiegel von ungefähr 2 bis ungefähr 2,25 nmol pro Auge.
3 fasst die Ergebnis dieses Tests einer photischen Verletzung zusammen. Die Diagramme in 3 zeigen, dass der Rhodopsinspiegel in der Netzhaut von Kontrollratten für sechs Tage nach der photischen Verletzung weiter sinkt, dann steigt der Rhodopsinspiegel. Der Rhodopsinspiegel von Kontrollratten ist 6 h nach der photischen Verletzung ungefähr 0,75 nmol, sinkt dann 6 Tage nach der photischen Verletzung auf ungefähr 0,5 nmol, verbessert sich dann dreizehn Tage nach der photischen Verletzung auf ungefähr 0,8 bis 0,85 nmol.
Dagegen hatten mit Astaxanthin behandelte Ratten 6 h nach der photischen Verletzung einen Rhodopsinspiegel von ungefähr 1,15 bis 1,2 nmol. Außerdem sank der Rhdopsinspiegel über die nächsten 6 Tage nicht, sondern stieg auf ungefähr 1,25 nmol an und blieb dann bis zum Tag dreizehn nach der photischen Verletzung im wesentlichen konstant.
Deshalb schützte Astaxanthin die Photorezeptorzellen nicht nur vor photischer Verletzung (d. h. höherer Rhodopsinspiegel 6 h nach der photischen Verletzung), sondern milderte auch die Auswirkungen der photischen Verletzung, da die Rhodopsinspiegel für einen Zeitraum von 6 Tagen nach der photischen Verletzung nicht sanken, sondern stiegen.
Ein ähnlicher Test wurde durchgeführt, wobei β-Carotin in Ratten injiziert und der Rhodopsinspiegel in der Netzhaut der euthanisierten Ratten bestimmt wurde. Die Ratten erhielten vier intraperitoneale Injektionen von β-Carotin in einer Dosis von 35 kg/mg. Es wurde auch eine Kontrollgruppe von Ratten verwendet. Nach Belastung mit grüngefiltertem kontinuierlichem Fluoreszenzlicht mit einer Intensität von 220 bis 250 footcandles für 24 h wurde der Rhodopsinspiegel als Anzeichen von photischer Verletzung gemessen. Die mit β-Carotin behandelten Ratten hatten sechs Stunden, sechs Tage bzw. dreizehn Tage nach der photischen Verletzung Rhodopsinspiegel von 1,18, 0,20 bzw. 0,55 nm. Die Ergebnisse zeigen, dass Astaxanthin wirksamer ist als β-Carotin. Man hat die Hypothese aufgestellt, sich hier aber nicht darauf gestützt, dass diese Vergleichsergebnisse zwischen Astaxanthin und β-Carotin auf die Antioxidans-Eigenschaften von Astaxanthin und die Fähigkeit von Astaxanthin zurückzuführen sind, die Blut-Netzhaut-Schranke zu durchbrechen.
Die Tests unter Verwendung von β-Carotin zeigen, dass 6 h nach einer Verletzung durch Licht ein erheblicher Verlust von Photorezeptorkernen sowohl bei den Kontrollratten als auch bei den behandelten Ratten vorlag. Sechs bis vierzehn Tage nach der Lichtbelastung gab es einen Unterschied zwischen den Kontrolltieren und den behandelten Tieren, wobei die behandelten Tiere weniger beeinträchtigt waren. Die behandelten Ratten zeigten eine bessere Erhaltung der Photorezeptorkerne und des Netzhautpigmentepithels in sämtlichen Quadranten. β-Carotin milderte also eine photische Verletzung in der Rattennetzhaut. β-Carotin hat jedoch Schwierigkeiten, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen. Astaxanthin durchbricht die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke leichter als β-Carotin und zeigt keine Tendenz, in der Netzhaut Kristalle zu bilden.
4 fasst ebenfalls die Ergebnisse des oben beschriebenen Tests einer photischen Verletzung zusammen. 4 weist Diagramme der mittleren Dicke der ONL über einen Zeitraum von dreizehn Tagen nach der photischen Verletzung auf. Bei Ratten, die Astaxanthin erhalten hatten, war die photische Schädigung im Vergleich mit Kontrollratten gemildert. Die Ratten, die Astaxanthin erhalten hatten, zeigten 6 Tage nach der photischen Verletzung keine so starke Verringerung der ONL und zeigten dreizehn Tage nach der photischen Verletzung eine um ungefähr 5 μm stärkere ONL. Die in den 3 und 4 dargestellten Tests zeigen ferner, dass Astaxanthin oxal sowie intraperitoneal verabreicht werden kann, um eine Augenschädigung zu mildern.
Die in den 1 bis 4 dargestellten Ergebnisse der in vivo Tests zeigen die Fähigkeit von Astaxanthin, Neuronen und neuronale Elemente der inneren und äußeren Netzhaut vor einer Photorezeptorzellendegeneration in der Netzhaut und vor ischämischer und intraokularer druckbedingter Verletzung von Neuronen der inneren Schichten der Netzhaut zu schützen. Die Tests haben gezeigt, dass Astaxanthin Neuronen und andere Zelltypen schützen oder retten kann und dass Astaxanthin ein wirksames Therapeutikum ist, um Photorezeptordegeneration und ischämische Schädigung von Neuronen der Netzhaut zu mildern. Außerdem hat Astaxanthin eine Schutzwirkung auf das zentrale Nervensystem im Allgemeinen, insbesondere in Bezug auf eine Schädigung des Gehirns und des Rückenmarks, verursacht durch freie Radikale.
Die vorstehenden Tests zeigen, dass die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge Astaxanthin an eine Person eine Schädigung des Auges, die von einer Erkrankung oder Verletzung herrührt, verhindert, verzögert und/oder mildert. Das Astaxanthin wird der Person in Dosen von ungefähr 5 bis ungefähr 500 mg Astaxanthin pro kg Körpergewicht verabreicht. Bevorzugt ist die Astaxanthindosis ungefähr 10 bis ungefähr 200 mg Astaxanthin pro kg Körpergewicht, und um den vollen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erreichen, ist die Astaxanthindosis ungefähr 25 bis ungefähr 150 mg Astaxanthin/kg Körpergewicht. Die optimale Astaxanthindosis kann von einem Fachmann nach Berücksichtigung von Faktoren wie etwa der zu behandelnden Erkrankung oder Verletzung, des Schweregrads der Schädigung und des Verabreichungswegs (d. h. oral, topisch oder parenteral) bestimmt werden. Die Astaxanthindosen können täglich oder gemäß einem Regime verabreicht werden, das von einem Fachmann festgelegt wird, wobei die Länge der Behandlung von dem Schweregrad und der Natur der Verletzung abhängt.
Das Astaxanthin kann einer Person parenteral, oral oder topisch verabreicht werden. Bei oraler Verabreichung kann das Astaxanthin beispielsweise in Form eines flüssigen Präparats, einer Tablette oder einer Nahrungsmittelkomponente sein. Bei topischer Anwendung kann das Astaxanthin beispielsweise in Form einer Augentropfenzusammensetzung zur direkten Applikation auf die Augen sein.
Die Verabreichung von Astaxanthin an eine Person, die an einer Augenverletzung oder -erkrankung leidet, wie etwa an einer durch freie Radikale induzierten Verletzung, ist dem Sehvermögen der Person zuträglich, indem weitere Photorezeptorzellen vor einer zerstörenden Schädigung gerettet werden. Die durch freie Radikale induzierte Schädigung kann auf eine lichtinduzierte Verletzung oder auf eine Verletzung, die von einem ischämischen Insult und anschließender Reperfusion herrührt, oder auf neurodegenerative Erkrankungen zurückgeführt werden. Die Verabreichung von Astaxanthin trägt auch dazu bei, zusätzlich zu einer Milderung einer photischen Verletzung eine photische Verletzung zu verhindern und zu verzögern.
Die Verabreichung von Astaxanthin mildert eine Schädigung von Photorezeptorzellen, die lichtinduziert ist, und mildert eine Schädigung von Ganglienzellen, die durch einen ischämischen Insult und anschließende Reperfusion induziert ist. Die Verabreichung von Astaxanthin verzögert ferner das Fortschreiten von degenerativen Augenerkrankungen und ist dem Sehvermögen von Personen zuträglich, die an einer degenerativen Augenerkrankung wie etwa altersbedingter Makuladegeneration leiden.
Die Verabreichung von Astaxanthin ist nützlich bei der Behandlung von ischämischen Netzhauterkrankungen wie etwa diabetischer Retinopathie, zystoidem Makulaödem, zentralem Netzhautarterienverschluss, zentralem Netzhautvenenverschluss und Glaukom. Außerdem ist die Verabreichung von Astaxanthin nützlich bei der Behandlung von entzündlichen Erkrankungen des Auges wie etwa Retinitis, Uveitis, Iritis, Keratitis und Skleritis, bei denen freie Radikale in großen Mengen erzeugt werden. Diese ischämischen Netzhauterkrankungen und entzündlichen Erkrankungen des Auges sind durch freie Radikale bedingt. Deshalb machen die Antioxidans-Eigenschaften von Astaxanthin, gekoppelt mit der Fähigkeit von Astaxanthin, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, das Nichtvorliegen von Toxizität von Astaxanthin und das Nichtvorliegen von mit Astaxanthin verbundenen nachteiligen Nebenwirkungen Astaxanthin zu einer nützlichen Verbindung zum Behandeln oder Verhindern von solchen durch freie Radikale bedingten Erkrankungen.
Forscher haben lange nach wirksamen Antioxidantien geforscht, die eine neuronale Schädigung mildern können. Ein geeignetes Antioxidans muss die Fähigkeit haben, die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke zu durchbrechen, und muss eine geringe Toxizität haben. Von den verschiedenen bis heute geprüften Antioxidantien konnte das Antioxidans entweder die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke nicht wirksam durchbrechen (beispielsweise β-Carotin) oder ist toxisch oder zeigte nachteilige Nebenwirkungen (beispielsweise Canthaxanthin). Astaxanthin ist ein natürliches, nichttoxisches Produkt, und hat sich bis heute, selbst nach Verabreichung großer Astaxanthindosen über längere Zeiträume, nicht als toxisch erwiesen oder nachteilige Nebenwirkungen gezeigt. Beispielsweise hat Astaxanthin nicht die nachteiligen Nebenwirkungen von strukturell eng verwandtem Canthaxanthin und β-Carotin in Bezug auf die Bildung von Kristallen in der Netzhaut oder einer abnehmenden Dunkeladaptation gezeigt.
Da keine wirksame und nichttoxische Verbindung zum Erhalten von Neuronen gegenüber verschiedenen Verletzungs- oder Erkrankungstypen gefunden worden ist, gibt es keine etablierte medizinische Behandlung von Erkrankungen wie etwa altersbedingter Makuladegeneration. Die einzige wirksame Therapie ist die Verabreichung von β-Carotin und Ascorbinsäure. β-Carotin kann jedoch die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke nicht wirksam durchbrechen. Ascorbinsäure ist in der Netzhaut natürlich vorhanden. Überraschenderweise ist Astaxanthin ein starkes Antioxidans und kann die Blut-Netzhaut-Hirn-Schranke wirksam durchbrechen, so dass es bei der Behandlung von altersbedinger Makuladegeneration eingesetzt werden kann.

Claims

Verwendung von Astaxanthin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Person, die an einer Netzhautschädigung oder Netzhauterkrankung leidet, um das Sehvermögen der Person zu verbessern, wobei Astaxanthin der Netzhaut so verabreicht wird, dass Astaxanthin die Blut-Hirn-Schranke durchbricht.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei das Astaxanthin parenteral verabreicht wird.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei das Astaxanthin oral verabreicht wird.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei das Astaxanthin topisch direkt in das Auge verabreicht wird.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei das Astaxanthin in der Menge von ungefähr 5 bis ungefähr 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei das Astaxanthin in der Menge von ungefähr 10 bis ungefähr 200 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei das Astaxanthin in der Menge von ungefähr 25 bis ungefähr 150 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei die Netzhaut-schädigung eine durch freie Radikale induzierte Netzhautschädigung aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei die Netzhaut-schädigung eine lichtinduzierte Netzhautschädigung aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei die Netzhaut-schädigung eine Fotorezeptorzellen-Netzhautschädigung oder eine Schädigung von Neuronen der inneren Netzhautschichten aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei die Netzhaut-schädigung eine Ganglienzellen-Netzhautschädigung aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1, wobei die Netzhaut-schädigung alterbedingte Makuladegeneration aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1 zur Behandlung einer Person, wobei die Verwendung aufweist: einer Person wird eine therapeutisch wirksame Menge an Astaxanthin verabreicht, um Neuronen in einer Netzhaut der Person vor durch freie Radikale induzierter Verletzung der Netzhaut zu schützen.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1 zur Behandlung einer Person, die an neuronaler Schädigung einer Netzhaut leidet, um den Zustand der Netzhaut zu verbessern.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 14, wobei die neuronale Schädigung eine Verletzung der Netzhaut durch Licht, ein ischämisches Trauma der Netzhaut oder ein intraokulares druckbedingtes Trauma der Netzhaut aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 14, wobei die neuronale Schädigung ein ischämisches Trauma der Netzhaut oder ein intraokulares druckbedingtes Trauma der Netzhaut aufweist.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1 zur Behandlung einer Person, die an altersbedingter Makuladegeneration leidet, um den Prozess von altersbedingter Makuladegeneration zu verzögern.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1 zur Behandlung einer Person, die an einer ischämischen oder intraokularen druckbedingten Netzhaut-erkrankung einer Netzhaut leidet, um den Zustand der Netzhaut zu verbessern und eine weitere Schädigung der Netzhaut zu verhindern.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 18, wobei die ischämische Netzhauterkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: diabetischer Retinopathie, zystoidem Makulaödem, zentralem retinalem Arterienverschluss, zentralem retinalem Venenverschluss und Glaukom.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 1 zur Behandlung einer Person, die an einer entzündlichen Erkrankung einer Netzhaut leidet, um den Zustand der Netzhaut zu verbessern und eine weitere Schädigung der Netzhaut zu verhindern.
Verwendung von Astaxanthin nach Anspruch 20, wobei die entzündliche Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Retinitis, Uveitis, Iritis, Keratitis und Skleritis.
Verwendung von Astaxanthin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Person, die an einer degenerativen Netzhauterkrankung leidet, um das Fortschreiten der Erkrankung zu verzögern.