DE602004006633T2 - Verwendung von dapson als neuroprotektor bei zerebralinfarkt - Google Patents

Description

• HINTERGRUND
• Zur pharmakologischen Behandlung des Hirnschlages wurden in der Vergangenheit einige Arzneimittel mit geringer klinischer Wirksamkeit verwendet; von diesen kann auch Citicolin erwähnt werden. In einer neueren Studie, die 2002 veröffentlicht wurde (Davalos A., Castillo J., Alvarez-Sabin J., Secades JJ., Mercadal J., Lopez S., Cobo E., Warach S., Sherman D., Clark WM., Lozano R., Orales Citicoline bei akutem ischämischen Schlag: eine individuelle Patientendaten-Poolanalyse von klinischen Versuchen. Stroke 33(12): 2850-2857, 2002), wurde demonstriert, dass dieses Medikament eine Verbesserung von durchschnittlich 25% erzeugte, drei Monate nach seiner Verabreichung an Patienten mit Hirnschlag, während die Patienten, die ein Placebo erhielten, sich durchnittlich um 20% besserten. Aus diesen Ergebnissen kann abgeleitet werden, dass diese pharmakologische Behandlung nicht in der Lage ist, den mit dem Hirnschlag verbundenen Hirnschaden mehr als 20-30% im Durchschnitt zu vermindern.
• Anderseits hat man bei der Erforschung und Entwicklung von neuen Medikamenten zur Verhinderung der Folgen von Hirnschlag enttäuschende Ergebnisse erhalten. 2001 beispielsweise genehmigte die Food and Drug Administration der Vereinigten Staaaten von Amerika die Anwendung von 5 Medikamenten gegen Herzerkankungen und kein Medikament gegen Hirnschlag. Das führt dazu, dass es keine selektive Medikamentenbehandlung für diese schwere Krankheit gibt.
• Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, die Anwendung von Dapson als erste wirksame Behandlung gegen Behinderung verursachende Folgen, die mit einem einem Hirnschlag für diese Patienten verbunden sind, zu demonstrieren.
• Dapson ist ein aktuell verwendetes Medikament zur Chemotherapiebehandlung von Lepra und zur Prophylaxe gegen Pneumonie durch Pneumocystis carinii. In Anbetracht dessen, dass Lepra eine seltene Krankheit ist, war die therapeutische Anwendung von Dapson bisher eingeschränkt.
• Akuter Hirnschlag steht an dritter Stelle als Todesursache und ist der Hauptgrund für Behinderung bei der Weltbevölkerung. Angesichts der ernsthaften Konsequenzen, die ein Hirnschlag für die Gesellschaft in Hinblick auf Rehabilitation und Ausgaben für medizinische Versorgung zur Folge hat, wurde eine neues therapeutischel Mittel gesucht, das effizienter als das aktuelle ist, wobei Dapson als eine neue neuroprotektive Verbindung synthetisiert wurde.
• Die vorliegende Erfindung hat zum Gegenstand, ein Produkt zur therapeutischen Anwendung bei der Behandlung von akutem Hirnschlag zu entwickeln. Diese Krankheit ist weit verbreitet innerhalb der Weltbevölkerung, mit einer Häufigkeit von 500 000 bis 750 000 pro Jahr betroffenen Menschen allein in den Vereinigten Staaten von Amerika, so dass entschieden wurde, nach anderen therapeutischen Alternativen, die wirksamer als die aktuell angewendeten sind, zu suchen.
• Bei der Suche nach einem neuen therapeutischen Mittel, das wirksamer als das allgemein bekannte ist, zur pharmakologischen Behandlung von Hirnschlag wurde Dapson als Verbindung mit der nachfolgenden Formel synthetisiert:

  
• Das Medikament Dapson wurde in Mexico seit den achtziger Jahren nicht mehr hergestellt und sein Ausgagngsmaterial wird ebenfalls nicht hergestellt.
• Aus diesen Gründen demonstriert die vorliegende Arbeit durch ein experimentelles Modell und mit Hilfe einer klinisch kontrollierten Versuchstudie bei Patienten mit akutem Hirnschlag, dass Dapson wirksam ist, um die widrigen Folgen der Krankheit zu verhindern, wenn es in den ersten zwölf Stunden nach dem ischämischen Ereignis verabreicht wird.
• Die pharmakologischen Tests wurden durchgeführt, indem das experimentelle Modell eines akuten Hirnschlags für permanente Zerstörung der mittleren Gehirnarterie bei Ratten angewendet wurde, wobei ein Nahtfaden durch die innere Kopfschlagader (Karotis interna) des Tieres eingeführt wurde (Beispiel 1). Das Medikament wurde auch Patienten mit einem akuten Hirnschlag verabreicht, die die Notdienste des Nationalen Instituts der Neurologie und Neurochirugie "Manuel Velasco Suarez", in Mexico-Stadt versorgten (Beispiel 2).
• Die Ergebnisse der Experimente mit Ratten demonstrieren, dass Dapson (I) bei einer Dosis von 9,325 mg/kg eine Wirksamkeit von 93% aufwies, während bei einer Dosis von 12,5 mg/kg sich eine 91%ige Wirksamkeit ergab, um das Volumen eines Hirnschadens zu reduzieren, der durch den in den Ratten herbeigeführten Schlaganfall in dem experimentellen Schlaganfall-Modell erzeugt wurde.
• Die Ergebnisse der Wirksamkeit bei Patienten demonstrieren, dass Dapson bis zu Dosis von 200 mg in der Lage war, die neurologischen Symptome von Patienten zu 67% im Durchschnitt zu verbessern.
• Die wirksame Dosis für Dapson ist 0,013 mMol/kg. Es zeigten sich keine Nebeneffekte für die verwendet Dosis. Insbesondere wurden die folgenden Techniken verwendet:
• Synthese von Dapson
• Dapson kann über verschiedene Wege synthetisiert werden, aber die folgende Synthese wird als ein Beispiel dargelegt: Die Synthese wurde in zwei Schritten durchgeführt:
• 1. 60 g Acetanelid werden in einen Erlenmeyerkolben eingebracht und werden langsam erhitzt bis all das feste Material geschmolzen war. Die resultierende visköse Flüssigkeit wurde unter Verwendung eines Eisbades gekühlt, wobei ein festes Material am Boden des Kolbens zurückblieb. 165 ml Chlorschwefelsäure wurden hinzugefügt, ohne dabei das Eis zu entfernen. Später wurde der Kolben aus dem Eis entfernt, vorsichtig bewegt und eine Reaktion wurde 10 Minuten lang durchgeführt, nach deren Ablauf das Reaktionsgemisch wieder erhitzt wurde bis zur gesamten Solubilisierung des restlichen Acetanelids, wobei man es wieder 10 weitere Minuten lang reagieren ließ. Das Produkt wurde gekühlt und vorsichtig in einen Behälter mit Eis und Wasser gegossen, das Präzipitat wurde filtiert und mit kalten Wasser gewaschen. Das Präzipitat wurde gesammelt, in Chloroform aufgelöst und dreimal mit Wasser extrahiert, wobei die Chloroform-Phase gesammelt wurde, welche in ein Eisbad gestellt wurde, wobei das gereinigte Thionylchlorid präzipitiert wurde (angegebener Schmelzpunkt des Zwischenproduktes: 149° C).
• 2. 123,6 ml von wasserfreiem Nitrobenzol wurden in einen Reaktionsbehälter gegeben, 89,2 g Aluminiumchlorid wurden hinzugefügt und langsam erwärmt; zu der warmen Mischung wurden 41,3 g Thionylchlorid hinzugefügt, wobei das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 140-145° C erwärmt wurde, und langsam 13 g Acetanilid hinzugefügt wurde, wobei die Reaktionstemperatur zwei Stunde lang beibehalten wurde. Am Ende dieses Zeitraums wurde das Rohreaktionsmaterial in 104 ml mit Salzsäure angesäuertes Wasser gegossen, wobei ein dunkel gefärbtes Produkt präzipitierte wurde, welches mit verdünnter Essigsäure rekristallisiert wurde. Nach der Rekristallisation und Filtration wurde das feste Material 30 Minuten lang mit Salzsäure 5N refluxiert, später wurde das Reaktionsgemisch neutralisiert, wobei weiße Kristalle (Roh-DDS) präzipitiert wurden, die mit Ethanol rekristallisiert wurde.
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• CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER SYNTHETISIERTEN VERBINDUNG
• Um die Echtheit der synthetisierten Verbindungen zu ermitteln, wurde ihr Schmelzpunkt gemessen, wobei sich 151-153° C für das Reaktionszwischenprodukt Thionyichlorid und 172-175° C für DDS ergab.
• Die für diese Verbindungen berichteten Schmelzpunkte sind 149° C, 175- 176°C für das Zwischenprodukt bzw. das DDS.
• Bevorzugter Modus, die Erfindung durchzuführen
• Beispiel 1.-Bewertung eines neuroprotektiven Effekts von Dapson bei dem akuten Hirnschlag, der durch Verschluß der mittleren Gehirnarterie der Ratte induziert wurde.
• Dapson wurde als Neuroprotektor in dem Hirnschlag-Modell, das durch Verschluß der mittleren Gehirnarterie erzeugt wurde, bewertet. Das Medikament wurde in einem geeigneten Träger suspendiert.
• 3 Gruppen von 5 Tieren wurden mit folgendem behandelt: isotonische Kochsalzlösung (SSI, Kontrollgruppe), Dapson (12,5 mg/kg) und Dapson (9,375 mg/kg), das auf intraperitonealem Weg injiziert wurde, 30 Minuten nach dem Verschluß der mittleren Gehirnarterie, wie nachfolgend beschrieben wird.
• Die permanente selektive Gehirn-Ischämie wurde in den Tieren durch Einführen eines Nahtfadens intraluminal durch die Karotisarterie erzeugt. Alle Tiere erhielten ununterbrochen eine Anästhesie während des chirurischen Eingriffs mit 1,5%igem Halothan durch eine Gesichtsmaske. Die Tiere wurden in dorsale Dekubitusposition gebracht, fixiert und in dem vorderen Halsbereich rasiert, um einen Einschnitt in der Mittelinie von dem Sternum zu dem Bereich des Sternohyoideus-Muskels an seinen Seitenrand hin durchzuführen, wobei in dieser Seite der mittlere Rande des Sternocleidomastoideus und die oberflächliche Halsarterien-Aponeurose in ihrem tiefen Blatt identifiziert wurde, die durchtrennt wurde, um dem üblichen Karotis-Schlag und den kaudalen Muskelbauch des Digastrikus exponiert zu lassen. Eine Schnittsektion der allgemein Karotis wurde bis zum Hypoglossus-Loop durchgeführt. Die Karotis-Gabelung wurde identifiziert, die äußere Karotis und ihre Okzipital- und Thyroid-Zweige, die beiden letzteren wurden mit einem Monfilament von 8-0 ebenso wie mit Elektrokoagulation für ihre spätere Trennung vereinigt. Die innere Karotis wurde in einer Länge von etwa 5 mm präpariert und zu diesem Zeitpunkt wurde die Pterygopalatina-Arterie identifiziert. Ein Mikrochip wurde eingesetzt oder sie wurde mit eine Monofilament 6-0 verbunden. Sobald der Fluß durch diesen Arterienzufluß gestoppt war, wurde ein Monofilament, Nylon 3-0, in die innere Karotisarterie durch den Stummel der äußeren Karotisarterie in einer Länge von 17 mm wie von der Gabelung eingeführt. Die Wunde wurde geschlossen und das Tier wurde, um sich zu erholen, mit Wasser und Futter nach Belieben in Ruhe belassen. In allen Fällen wurde eine Ischämie durch makroskopischische Beobachtung und für die Position des Fadens überprüft.
• Bewertung des neuroprotektiven Effekts von Dapson bei Ratten.
• Während der 96 Stunden nach dem ischämischen Eingriff wurden die Tiere neurologisch bewertet alle 24 Stunden durch Anwenden einer Funktionsskala. Diese Skala legt Raten von 0-5 fest entsprechend der Ernsthaftigheit der Anzeichen, die die Tiere zeigen: 0 = ohne neurologische Veränderung; 1 = Schwierigkeiten beim Ausstrecken der vorderen Extremitäten; 2 = kreisförmige Bewegung nach rechts; 3 = nach rechts Fallen; 4 = Tier geht nicht spontan und weist ein herabgesetztes Bewußtsein auf; 5 = Tod.
• Bestimmung des Volumens von geschädigtem Gewebe
• Nach 96 Stunden Beobachtung wurden die Tiere mit einer Überdosis von Natrium-Pentobarbital auf intraperitonealem Weg getötet und ihre Gehirne wurden durch Kraniektomie herausgeholt. Nach der Entnahme wurden die Gehirne mit wasserfreiem Alkohol zwei Wochen lang fixiert. Die übliche histologische Prozedur wurde durchgeführt, ebenso wie Schnitte von 10 μm, wobei jede 200 μm ein Schnitt gespeichert wurde. Letztere wurde mit der Hämatoxylin-Eosin-Technik gefärbt. Alle Schnitte wurde durch einen Phatologen untersucht, der nicht über die Behandlungsgruppe unterricht war, um makro- und mikroskopisch die ischämischen Zonen zu bestimmen.
• Der Bereich jedes Gewebeabschnitts wurde mittels Verwendens eines digitalen Analysesystems und eines photographischen Vergrößerers bestimmt. In allen Fällen wurde eine Vergrößerung von 1:10 durchgeführt. Jeder Abschnitt wurde nach drei Determinierungen bewertet; A) gesamter Bereich einschließlich Ventrikulus B) Ventrikulärer Bereich C) Ischämischer Bereich entsprechend der Beurteilung des Pathologen. Zur Bestimmung des Schädigungsvolumens wurde die folgende Formel verwendet:

  
• Wobei P die Summe der Bereiche (in mm²) ist. 0,2 mm ist die festgelegte Länge zwischen jedem Schnitt und die Division durch 10 ist aufgrund der Vergrößerung jeden Schnitts für eine Volumenmessung erforderlich. Bei Anwenden der Formel werden drei unterschiedliche Volumen erhalten: Gesamt, ventrikulär und ischämisch. Das ventrikuläre Volumen wird von dem gesamten Volumen subtrahiert, um das Gehirnparenchym zu erhalten. Letzeres wird als Bezugsgröße verwendet, um den Schädigungsprozentanteil zu erhalten, wobei das ischämische Volumen verwendet wird.
• Beispiel 2. Bewertung des neuroprotektiven Effekts von Dapson bei Patienten mit akutem Hirnschlag.
• Die Studie beurteilt den neuroprotektiven Effekt von Dapson bei Patienten, die, nachdem sie einen akuten Hirnschlag mit Thromboembolie erlitten haben, von dem Nothilfedienst des National Institute of Neurologie and Neurosurgery "Manuel Valesco Suarez" aufgenommen wurden. Dapson wurde in einer einzigen Dosis von 200mg in Suspension oral verabreicht. Die Suspension wird bei 4° C gekühlt bis zu einem Monat stabil gehalten.
• Dapson wurde verdeckt an 15 Patienten verabreicht, während weiteren 15 Patienten eine antazid Suspension als Placebo-Medikation verabreicht wurde. Patienten wurden nach dem Zufallsprinzip einer der Behandlungsgruppen zugeordnet, wobei Zufallsnummern verwendet wurden, die durch einen Taschenrechner erzeugt wurden. Beide Medikationen wurden während der ersten zwölf Stunden nach dem Hirnschlag verabreicht. Als Ergebnis dieser Vorgehensweisen waren die klinischen Tests randomisiert, doppeltblind und Placebo-kontrolliert.
• Die Bewertung der klinischen Anzeichen und Symptome wurden durch einen Fachneurologen verdeckt durchgeführt nach einer NIH-Skala, welche die Intensität der durch den Hirnschlag verursachten Schädigungen quantifiziert. Diese Skala wurde zu dem Zeitpunkt angewendet, wenn der Patient in die Studie aufgenommen wurde (Tag Null) und 2, 6 und 30 Tage nach dem Hirnschlag. Der Schlaganfall wird als gemäßigt schwerwiegend oder schwerwiegend angesehen, wenn der NIH mit einen Wert höher als sieben eingestuft wird.
• Dosismengen von Dapson wurden in dem Bereich von 1 bis 12,5 mg/kg verwendet, oral im Falle von Patienten oder intraperitoneal im Falle der Ratten.
• Für die neurologische Gradeinteilung und den Prozentsatz des geschädigten Volumens bei Ratten wurde die statistische Signifikanz mit dem Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von dem U-Test von Mann-Whitney ermittelt.
• Die NIH-Skala-Ergebnisse in den zwei Gruppen von Patienten wurden statistisch mit einer Analyse einer Varianz-Analyse (ANOVA) ausgewertet, wobei als Ko-Variable die NIH-Skala am Aufnahmetag (Tag Null), ebenso wie das Geschlecht, Alter, Blutdruck und andere wichtige klinische Variablen für die Zustand des Patienten verwendet wurden.
• Werte von ≤ 0,01 und 0,05 wurden aufgenommen, um den Grenzwert der statistischen Signifikanz zu bestimmen.
• Die Ergebnisse der neurologischen Bewertung bei Ratten sind in 1 gezeigt, in der die Stufen des neurologischen Tests als Funktion der Zeit beobachtet werden können, nachdem Erzeugen des Schlaganfalls bei den Ratten. Die Ergebnisse werden als der Mittelwert von 4 unabhängigen Experimenten dargestellt, D=Dapson (9,375 und 12,5 bezieht sich auf die Dosis in mg/kg.ip), *p < 0.05 (Kruskal-Wallis-Test gefolgt von Mann-Withney-Test).
• Die Daten der neurologischen Tests bei Ratten zeigten, dass die Tiere, die mit Dapson behandelt wurden bei zwei angewendeten Dosen, sich besser von der ischämischen Schädigung erholten, signifikant im Vergleich zu der Kontrollgruppe.
• Die Ergebnisse des Schadensvolumens sind in 2 dargestellt, wobei sie den Prozentanteil einer ischämischen Schädigung zeigen, 96 Stunden nach Erzeugen des Schlaganfall bei Ratten. Die Ergebnisse werden als der Mittelwert +/- Standardfehler aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. D = Dapson (9,375 und 12,5 bezieht sich auf die Dosis in mg/kg.ip), *p < 0.05 (Kruskal-Wallis-Test gefolgt von Mann-Withney-Test).
• Die erhaltenen Daten zeigen, dass Dapson zu 93% bei der Dosis von 9,375 mg/kg bzw. zu 90% bei der Dosis von 12,5 mg/kg im Vergleich mit der Kontrollgruppe schützt.
• Die Ergebnisse bei Patienten mit akutem thromboembolischem Hirnschlag sind in 3 gezeigt, welche die Stufen der neurologischen Skala (NIH) als Funktion der Zeit (in Tagen) nach Verabreichung von Dapson oder dem Placebo darstellt. Die Ergebnisse sind als Durchschnittswert von 15 Patienten pro Gruppe +/-Standardfehler dargestellt. D = Dapson, *p ( < 0,05, **p < 0,01, (Analyse des Varianz-Tests, mit Ko-Variablen).
• Die Ergebnisse von Patienten, die mit 200 mg Dapson oral behandelt wurden, zeigen eine signifikante klinische Besserung. Diese Besserung lag im Durchschnitt bei 67%.
• Die Bewertung des neuroprotektiven Effekts von Dapson der vorliegenden Erfindung kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:
  Eine signifikante Reduktion der Stärke der neurologischen Symptome bei Ratten von 50% wurde beobachtet im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Reduktion von 93% und 90% des Schädigungsvolumen derselben Tiere wurde ebenfalls beobachtet.
• Betrachtet man die Studie bei Patienten, lag die klinische Besserung im Durchschnitt bei 67%.
• Diese Ergebnisse zeigen, dass Dapson wirksamer ist als die augenblicklich vorhandenen Medikamente auf dem Markt zur Behandlung von akutem Hirnschlag. Dies ist so bei einer bevorzugten Dosis von Dapson im Bereich von 1 bis 12,5 mg/kg, das während der ersten 12 Stunden des akuten Hirnschlags verabreicht wird, obgleich Dapson auch in wiederholten Dosen verabreicht werden kann.

Claims (4)

1. Verwendung von Dapson zum Bereitstellen eines Medikamentes für die Behandlung von akutem Schlaganfall.
2. Verwendung von Dapson nach Anspruch 1, wobei das Medikament für die orale Verabreichnung ist.
3. Verwendung von Dapson nach Anspruch 2, wobei das Medikament für die orale Verabreichnung eine Suspension ist.
4. Verwendung von Dapson nach Anspruch 3, wobei die Suspension 200 mg Dapson enthält.