KR20160047318A

KR20160047318A - 다프손을 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20160047318A
Application number: KR1020140143603A
Authority: KR
Inventors: 고영준; 박상철; 조성천; 조홍석
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2016-05-02
Also published as: EP3011957B1; US20160113890A1; EP3011957A1

Abstract

다프손을 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물 및 그의 용도가 제공된다.

Description

다프손을 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition for stimulating neovascularization at a site in a subject comprising dapsone and use thereof}

다프손을 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

다프손 (dapsone)은 디아미노페닐술폰 (diaminodiphenylsulfone) 또는 DDS라고도 하며, IUPAC 명칭은 4-[(4-아미노벤젠)술포닐]아닐린이다. 다프손은 미코박테리움 레트래 (Mycobacterium leprae) 감염 (간질 (leprosy))의 치료를 위한 다중 약물 치료 (multidrug therapy: MDT)로서 라팜피신 및 클로파지민과 조합되어 가장 흔하게 사용되는 항박테리제이다. 또한, CD4 수가 200/mm 미만인 HIV 환자에서 뉴모시스티스 지로베치 (Pneumocystis jirovecii)에 의하여 야기되는 뉴모시스티스 폐렴 (Pneumocystis pneumonia)에 대한 예방을 위한 2차 치료 (second-line treatment)이다. 다프손은 말라리아의 치료에서 피리메타민과 조합되어 사용되고 있다. 다프손은 국부 및 경구 제제로서 구입할 수 있다.

이러한 알려진 다프손의 효능에도 불구하고, 조직에서 다프손이 혈관신생을 자극하는 효과에 대하여는 알려진 바 없다.

일 양상은 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 개체에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키는 방법을 제공한다.

다프손 (dapsone)은 디아미노페닐술폰 (diaminodiphenylsulfone) 또는 DDS라고도 하며, IUPAC 명칭은 4-[(4-아미노벤젠)술포닐]아닐린이다. 다프손은 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다.

(식 I)

상기 다프손은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 직접 합성하거나 또는 천연물 등으로부터 추출된 것일 수 있다. 상기 다프손은 수불용성의 특성을 보다 개선하기 위하여, 물과 혼합한 후 고압멸균 처리된 것일 수 있다. 상기 고압멸균 처리는 일반적으로 사용되는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 고압 멸균은 예를 들면, 121℃, 151 psi로 15 내지 20분간 수행하는 것일 수 있다. 다프손을 물과 혼합하여 고압멸균 처리를 한 경우, 다프손의 수불용성의 특성에도 불구하고, 필요한 농도로 용해시킬 수 있다. 또한, 마우스에 투여시 적절 범위의 유효 혈중 농도를 나타낼 수 있다. 또한, 고압멸균 처리에 의해서 다프손의 활성, 즉 박테리아에 대한 항생 효과가 보존될 수 있다. 상기 N-아세틸-다프손은 N-모노아세틸-다프손, 또는 N,N'-디아세틸-다프손일 수 있다. N-아세틸-다프손은 다프손의 세포 내에서의 대사체로서 상업적으로 가능하거나, 합성하여 얻을 수 있다. 상기 합성은 예를 들면, 다프손의 N-아세틸화에 의하여 수행될 수 있다.

용어 '약학적으로 허용가능한 염'이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 들 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.

그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합은 개체의 의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 활성성분으로서, 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 1 ug 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 1,000 mg, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다.

상기 혈관신생 (neovascularization)은 적혈구 관류 (perfusion)을 갖는 기능성 미세맥관 네트워크 (functional microvascular networks)의 형성일 수 있다. 상기 혈관신생은 모세관 버드 (capillary buds)의 둘출 (protrusion) 및 과성장 (outgrowth) 및 기존 혈관으로부터의 분지 (sprouts)에 의하여 특징지워지는 혈관신생 (angiogenesis) 및 중배엽 세포 전구체로부터 내피 세포 (endothelial cells)의 새로운 생성 (de novo formation)인 혈관생성 (vascularization)을 포함한다. 혈관신생을 자극하는 것에 의하여, 개체의 부위에서 혈관신생이 증가하거나 혈관신생의 감소가 방지될 수 있다. 상기 조성물에 의하여 자극된 혈관 신생은 혈관주변 지지세포 (perivascular support cells)의 유인 (recruitment), 관(vessels)의 비-누출 (non-leakiness) 및 잘 정의된 분지 (arborization) 중 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 개체는 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 가진 것일 수 있다. 상기 조성물은 개체의 부위에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 개체는 나이 연관 퇴행성 조직 (degenerative tissue)를 가진 개체, 예를 들면, 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 또는 90세 이상의 노인일 수 있다.

상기 혈관신생의 감소와 연관된 증상은 허혈증 (ischemia) 또는 허혈증을 야기하는 질병 또는 상태를 포함할 수 있다. 상기 허혈증은 세포 대사에 필요한 산소와 포도당의 부족을 초래하는, 조직에의 혈액 공급의 제한을 의미한다. 허혈증은 일반적으로 혈관 (blood vessels)의 문제에 의하여 야기되며, 조직에 그에 따른 손상 및 부전 (dysfunction)을 야기한다. 허혈증은 때때로 또한 혈관수축 (vasoconstriction), 혈전 (thrombosis), 또는 색전 (embolism)과 같은 막힘 (congestion)으로부터 야기되는 신체의 주어진 부분 (part)에서의 국부적 빈혈 (local anemia)을 의미할 수 있다. 상기 허혈증은 심장 허혈증 (cardiac ischemia), 장 허혈증 (bowel ischemia), 뇌 허혈증 (brain ischemia), 사지 허혈증 (limb ischemia), 눈 허혈증 (eye ischemia), 또는 피부 허혈증 (skin ischemia)을 포함할 수 있다. 상기 허혈증은 혈관 폐색 (occlusion), 및 외상 (trauma)에 의하여 야기될 수 있다. 상기 혈관 폐색은 예를 들면 혈전 (blood clots)에 의한 혈전증 (thromboembolism)과 순환혈류 중의 외래 물질, 예를 들면, 양수 색전증 (amniotic fluid embolism)과 같은 색전증 (embolism)을 포함한다. 극단적인 외상적 손상 (traumatic injury)은 압축 (compression), 전단 (shearing) 또는 열상 (laceration)으로부터 관(vessel)의 부분적 또는 전체적 폐색을 생성시킬 수 있다. 상기 피부 허혈증은 피부 경화 (scleroderma), 또는 상처 (wound)를 포함할 수 있다. 상기 상처는 욕창 (decubitus ulcers), 욕창 (pressure ulcers), 수술 절개(surgical incisions), 외상성 조직 손상 (traumatic tissue injuries),당뇨병성 궤양(diabetic ulcers), 화상 (burns), 피부 이식 (skin grafts), 또는 그 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 눈 허혈증은 망막중심정맥 폐색과 망막분지정맥 폐색을 포함하는 망막혈관 폐색 (retinal vascular occlusive disorders)일 수 있다. 또한, 상기 증상은 비당뇨병성 만성 신질환(Nondiabetic chronic kidney disease)을 포함한 만성 신질환 (chronic kidney disease), 뇌 경색 (cerebral infarction), 심근경색 (myocardiac infarction: MI), 협심증 (angina pectoris), 관상 심장 질환 (coronary heart disease), 당뇨성 합병증 (diabetic complications), 허혈성 사지 질환 (ischemic limb disease), 뇌 허혈증 (cerebral ischemia), 혈관 염증 증상 (conditions of vascular inflammation), 동맥경화 (arteriosclerosis), 무혈관성 괴사 (avascular necrosis), 탈모 (hair loss), 퇴행성 조직 (degenerative tissue), 또는 발기부전 (erectile dysfunction)일 수 있다.

상기 조성물은 개체의 부위에 국소적으로 투여하기 의한 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 개체의 부위는 피부, 눈, 폐, 혈관 내, 신장, 심장, 뇌, 두피, 퇴행성 조직, 또는 남성 성기일 수 있다.

상기 조성물은 제2 혈관신생 작용제 (second angiogenic agent)를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 혈관신생 작용제는 PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리트로포이에틴, bFGF, VEGF, 안지오포이에틴 (angiopoietin), 및 태반 성장인자 (PIGF)로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 개체에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에서, 달리 언급되지 않으면, 동일한 용어에 대하여 상기한 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물에서 설명한 바와 같다.

상기 조성물은, 약학적 또는 기능성 식품 조성물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 '예방'이란 조성물의 투여에 의해 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 용어 '치료'란 조성물의 투여에 의해 혈관신생의 감소와 연관된 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물에 있어서, 상기 혈관신생의 자극은 VEGF-A 및 VERGF-2 경로의 신호 전달을 증가시키는 것에 의하여 야기되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 VEGF-A 및 VERGF-2 경로의 신호 전달을 증가시키기 위한 것일 수 있다.

상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal), 상피에 적용, 안내, 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 혈관신생의 감소와 연관된 증상이 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 개체의 부위는 피부, 눈, 폐, 혈관 내, 신장, 심장, 뇌, 두피, 퇴행성 조직, 또는 남성 성기일 수 있다.

"다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합" 및 "혈관신생의 감소와 연관된 증상"에 대하여는 상기한 바와 같다. "다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합"은 상기한 조성물의 형태일 수 있다.

상기 개체는 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 갖고 있는 것일 수 있다. 상기 방법은 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합에 의한 혈관신생의 자극에 의하여, 발휘될 수 있다. 상기 혈관신생의 자극은 VEGF-A 및 VERGF-2 경로의 신호 전달을 증가시키는 것에 의하여 야기되는 것일 수 있다. 상기 방법은 VEGF-A 및 VERGF-2 경로의 신호 전달을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

상기 방법은 제2 혈관신생 작용제 (second angiogenic agent)를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 혈관신생 작용제는 PDGF, G-CSF, 재조합 인간 에리트로포이에틴, bFGF, VEGF, 안지오포이에틴 (angiopoietin), 및 태반 성장인자 (PIGF)로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 제2 혈관신생 작용제 투여는 상기 약물 투여 전, 동시, 또는 그 후에 투여하는 것일 수 있다.

상기 투여는 상기 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합은 일당 체중 kg 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 매일 2 개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 매일 2 개월 내지 1년, 2 개월 내지 10개월, 2 개월 내지 6개월, 또는 2개월 내지 4개월 동안 투여하는 것일 수 있다.

"다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 개체에 투여하는 단계"에 대하여는 상기한 바와 같다.

일 양상에 따른 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물에 의하면, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극하는데 사용할 수 있다.

다른 양상에 따른 개체에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 의하면, 개체에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 개체의 부위에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하는 방법에 따르면, 개체의 부위에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

다른 양상에 따른 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키는 방법에 의하면, 개체의 부위에서 혈관신생을 효율적으로 자극시킬 수 있다.

도 1은 마우스 폐의 기관 (trachea) 조직 절편에 대한 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 도 1에서 PECAM-1에 해당하는 부위인 Alexa594 형광 (파장 = 574nm)의 세기 (pixel)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 마우스 귀 피부 조직 절편에 대한 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 도 3에서 PECAM-1에 해당하는 부위인 Alexa594 형광 (파장 = 574nm)의 세기 (pixel)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 대조군 마우스 신장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실험군 마우스 신장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 대조군 마우스 췌장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 실험군 마우스 신장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 대조군 및 실험군 마우스의 Soleus 근육에서의 유전자 발현을 마이크로어레이를 사용하여 분석한 결과이다.
도 10은 인산화된 단백질에 특이적인 항체가 고정된 인산화-특이적 항체 어레이를 사용하여 대조군 및 실험군 마우스의 Soleus 근육에서 발현된 단백질 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 :

7개월 및 24개월령 C57BL/6 (이하 "B6"라고 함) (한국기초과학지원 연구원) (암컷, n=18, 수컷; n=12) 마우스를 성균과대학교 의과대학 실험동물실의 지침에 따라 유지하였다. 생쥐는 물과 사료에 자유롭게 접근하도록 하였다. 각 생쥐 그룹 (n=5)은 물 중 다프손 (태극제약) 0.0, 0.5, 및 2.0 mg/kg/day을 3개월 동안 마시도록 하였다.

3개월 후, 각 마우스 그룹으로부터 선택된 마우스로부터 양쪽 귀 피부 (ear skin), 기관 (trachea), 양쪽 망막 (retina), 양쪽 신장 및 췌장 (pancreas)을 각각 적출하였다. 상기 장기의 적출을 위하여 sodium phenobarbital (엔토발)을 100mg/kg 체중으로 복강 내 주사하여 마취한 후, 1% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde) 200ml를 심장에 관류시켜 생쥐 체내 혈액을 제거하였다. 상기 장기를 외과적 방법으로 적출한 후, 각 조직은 4% 파라포름알데히드에 24 시간 고정하여 10 um의 두께로 냉동절편을 만들었다. 적출하여 냉동절편한 시료에 대하여 항-PECAM-1 항체를 사용한 면역 형광 염색을 수행하였다. 면역 형광 염색을 위하여, 0.3% tripton이 포함한 인산완충용액 (phosphate buffered solution: PBS)(0.3% PBST)에 5% 당나귀 혈청을 첨가한 용액으로 1 시간 동안 시료를 차단 (blocking)하였다. 아메리안 햄스터에서 생산된 항-PECAM-1 항체를 상기 용액에 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 조직의 항원과 1차 반응을 시켰다. 시료를 0.3% PBS-T로 10분간 6번에 걸쳐 세척한 후, 항-아메리안 햄스터-Alexa594 항체를 0.3% PBS-T에 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 항-PECAM-1 항체와 2차 반응을 시켰다. 시료를 0.3% PBS-T로 10분간 6번에 걸쳐 세척한 후, 슬라이드 글라스에 부착시켜 염색된 시료에 대하여 Carl Zeiss LSM710 공촛점 현미경 (confocal microscopy) 하에서 이미지를 얻었다. 각 이미지는 약 100 내지 300 um 두께의 조직을 축으로 순차적 공촛점 촬영을 한 후, 촬영한 모든 이미지를 z 축 방향으로 투사한 투사 이미지 (projection image)이다. 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (platelet endothelial cell adhesion molecule: PECAM-1)는 또한 분화 클러스 31 (cluster of differentiation 31) (CD31)로도 불리는 것으로서, 혈소판, 단핵세포 (monocyte), 및 일부 타입의 T-세포의 표면에서 발견되고, 내피세포 세포간 정션 (endothelial cell intecellular junction)의 대부분을 구성한다. PECAM-1은 면역형광화학에서, 조직학적 조직 절편 (histological tissue sections) 중의 내피 세포의 존재를 증명하기 위하여 주로 사용된다. 측정된 형광밀도는 내피 세포 즉, 혈관의 밀도를 나타낸다. 또한, 신장 조직 절편 및 췌장 조직 절편에 대하여는 Fluorescein으로 표지된 lycopersicon esculentum (토마토) letcin (이하 "Fluorescein-lectin"이라 함)을 추적자 (tracer)로 사용하여, 혈관 기능성을 검증하였다. lectin은 혈관과 미세교세포의 표지자로서, 혈액이 관류하는 기능성을 가진 혈관을 검증할 수 있게 한다. Fluorescein-lectin 10 mg/kg을 조직 적출 전에 각 생쥐의 안와정맥동에 주입하였다. 주입 15분 후에, 1% 파라포름알데히드 200 ml를 심장에 관류시켜 생쥐 체내 혈액 제거하였다. 적출한 각 조직은 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정한 후, 10 um의 두께로 냉동절편을 만들었다. 혈소판 내피 세포 흡착분자의 형광 염색을 동시에 실시하여 실제 혈액이 관류하는 혈관과 혈액이 관류하지 않는 혈관을 구분하였다. 염색된 시료에 대하여 Carl Zeiss LSM710 공촛점 현미경 (confocal microscopy) 하에서 이미지를 얻었다.

도 1은 마우스 폐의 기관 (trachea) 조직 절편에 대한 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 1에서, 상단 좌측으로부터 우측으로 Y0, Y0.5, 및 Y2는 7개월령 C57BL/6 대하여 0.0 mg/kg/d, 0.5 mg/kg/d, 및 2.0 mg/kg/d의 다프손을 매일 3개월 동안 마시게 한 것 (최종 12개월령)이고, 하단 좌측으로부터 우측으로 OO, O0.5, 및 O2는 27개월령 C57BL/6 대하여 0.0 mg/kg/d, 0.5 mg/kg/d, 및 2.0 mg/kg/d의 다프손을 매일 3개월 동안 마시게 한 것이다 (최종 30개월령).

도 2는 도 1에서 PECAM-1에 해당하는 부위인 Alexa 형광 (파장 = 594nm)의 세기 (pixel)를 나타낸 그래프이다. 상기 형광의 세기를 혈관의 밀도와 상관된다. 형광 세기 (pixel 숫자) 측정은 Image J 프로그램 (http://image.nih.gov/ij/)을 사용하여 얻었다. 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 다프손을 먹이지 않은 젊은 마우스 대조군 (Y0)에 비하여 노화된 마우스 대조군 (O0)에서, 혈관 밀도가 유의하게 낮았다. 또한, 젊은 마우스 사이에서는 대조군 (Y0)과 실험군 (Y0.5 및 Y2) 사이에 혈관 밀도는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 노화된 마우스 사이에서는 대조군 (O0)과 실험군 (O0.5 및 O2) 사이에 혈관 밀도는 유의한 차이가 있었다. 특히, 노화된 마우스에 0.5 mg/kg/d, 및 2.0 mg/kg/d의 다프손을 매일 3개월 동안 마시게 한 경우, 다프손을 먹이지 않은 젊은 마우스 대조군 (Y0)과 유사 또는 높은 혈관 밀도를 나타내어, 혈관 밀도를 노화되기 이전의 수준으로 전환시켰다.

도 3은 마우스 귀 피부 조직 절편에 대한 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에서, 상단 좌측으로부터 우측으로 Y0, Y0.5, 및 Y2는 7개월령 C57BL/6 (젊은 마우스)대하여 0.0 mg/kg/d, 0.5 mg/kg/d, 및 2.0 mg/kg/d의 다프손을 매일 3개월 동안 마시게 한 것이고 (최종 10개월령), 하단 좌측으로부터 우측으로 O0, O0.5, 및 O2는 27개월령 C57BL/6 (노화된 마우스)대하여 0.0 mg/kg/d, 0.5 mg/kg/d, 및 2.0 mg/kg/d의 다프손을 매일 3개월 동안 마시게 한 것이다 (최종 30개월령).

도 4는 도 3에서 PECAM-1에 해당하는 부위인 Alexa594 형광 (파장 = 594nm)의 세기 (pixel)를 나타낸 그래프이다. 상기 형광의 세기를 혈관의 밀도와 상관된다. 형광 세기 (pixel 숫자) 측정은 Image J 프로그램을 사용하여 얻었다. 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 다프손을 먹이지 않은 젊은 마우스 대조군 (Y0)에 비하여 노화된 마우스 대조군 (O0)에서, 혈관 밀도가 유의하게 낮았다. 또한, 젊은 마우스 사이에서는 대조군 (Y0)과 실험군 (Y0.5 및 Y2) 사이에 혈관 밀도는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 노화된 마우스 사이에서는 O0.5를 제외한, 대조군 (O0)과 실험군 (O2) 사이에 혈관 밀도는 유의한 차이가 있었다. 특히, 노화된 마우스에 2.0 mg/kg/d의 다프손을 매일 3개월 동안 마시게 한 경우 (O2), 다프손을 먹이지 않은 젊은 마우스 대조군 (Y0)과 유사 또는 높은 혈관 밀도를 나타내어, 혈관 밀도를 노화되기 이전의 수준으로 전환시켰다.

도 5는 대조군 마우스 신장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5에서, 상단 첫 번째 행 (row)은 젊은 마우스 대조군 (Young control)이고, 상단으로부터 제2 내지 4행은 노화된 마우스 대조군 (Old control)이다. 도 5에서 제2행 및 제3행은 복수 시료에 대한 것이며, 제4항은 제3행의 점선 사각형안을 확대하여 자세하게 보여주는 도면이다. 도 5에서, 화살표는 기능성이 떨어진 혈관을 나타낸다. 즉, 도 5에서 적색 형광으로 면역형광 염색된 혈관은 구조적으로 존재하고 있지만 Fluorescein-lectin이 음성이어서 혈액이 흐르지 않는, 기능성이 떨어진 혈관을 나타낸다. 또한, 제3행의 점선 사각형은 제4행의 도면으로 확대된 부분을 나타낸다.

도 6은 실험군 마우스 신장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6에서, 마우스는 각각 다프손 2.0 mg/kg/d를 매일 3개월 동안 마시게 한 것이다. 도 6에서, 제1행 내지 제3행은 도 5의 제1행 내지 제3행에 해당한다. 도 5에서 제4행은 도 6에서는 대응되는 행이 없다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 노화된 마우스의 신장 조직은 젊은 대조군 마우스 신장 조직에 비하여, 혈관의 기능성이 떨어져 있다. 또한, 다프손 2.0 mg/kg/d를 마시게 함으로써 혈관 기능을 대조군 마우스에서 유사한 정도로 회복시킬 수 있었다.

도 7은 대조군 마우스 췌장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에서, 상단 첫 번째 행 (row)은 젊은 마우스 대조군 (Young control)이고, 상단으로부터 제2행 및 3행은 복수의 노화된 마우스 대조군 (Old control)이다.

도 8은 실험군 마우스 신장 조직 절편에 대한 Fluorescein-lectin 추적 및 면역형광화학 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 8에서, 마우스는 각각 다프손 2.0 mg/kg/d를 매일 3개월 동안 마시게 한 것이다. 도 7 및 도 8에서, 화살표는 기능성이 떨어진 혈관을 나타낸다. 적색형광으로 면역형광 염색된 혈관은 구조적으로 존재하고 있지만 Fluorescein-lectin이 음성이어서 혈액이 흐르지 않는, 기능성이 떨어진 혈관이다. 도 7 및 도 8에서 화살표는, 기능성이 없는 혈관으로 녹색 형광 음성인 혈관을 나타낸다.

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 노화된 마우스의 췌장 조직은 젊은 대조군 마우스 췌장 조직에 비하여, 혈관의 기능성이 떨어져 있다. 또한, 다프손 2.0 mg/kg/d를 마시게 함으로써 혈관 기능을 회복시킬 수 있었다.

도 9는 대조군 및 실험군 마우스의 soleus 근육에서의 유전자 발현을 마이크로어레이를 사용하여 분석한 결과이다. 도 9에 있어서, 세로 축은 VEGF 또는 Tie2 유전자의 발현량 (형광강도: 임의의 단위)을 나타내고, 가로 축은 마우스 개체를 나타낸다. 도 9에서, middle control은 15개월령 마우스를 사용한 것이고, SD0는 다프손을 나타낸다. 도 9에서, SD0는 다프손을 2.0mg/kg/d로 3개월 동안 마시게 한 것이고, control은 다프손을 먹이지 않은 것을 제외하고 동일하게 실험한 것이다. 마이크로어레이 분석은, Agilent's Mouse Oligo Microarray (44K, Agilent Technology)를 사용하였다. 5, 15 및 20개월 된 C57BL/6J 마우스에 2mg/kg/d의 다프손을 3개월 동안 복용시켰다. 다프손은 약물 특성상 물에 잘 녹지 않는 특성이 있기 때문에, 물과 혼합하여 고압멸균시킴으로써 녹여 사용하였다. 다프손을 3개월 복용한 8, 18 및 23개월의 마우스에 엔토발 (sodium pentobarbital, 100 mg/kg body weight)을 주사하여 마취시킨 후, 마이크로어레이 분석을 위한 soleus 근육을 적출하여 냉동 보관하였다. 해당 근육에서 리보핵산을 분리하여, 상기 마이크로어레이에 적용하여 확인하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 실험군에서 VEGF의 발현이 증가하였다.

도 10은 인산화된 단백질에 특이적인 항체가 고정된 인산화된 단백질 특이적 항체 어레이를 사용하여 대조군 및 실험군 마우스의 soleus 근육에서 발현된 단백질 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 10에 있어서, 세로 축은 대조군 대비 실험군에서 발현된 단백질량 (형광강도: 임의의 단위)을 나타내고, 가로 축은 인산화된 각 단백질을 나타낸 것으로서, 괄호안의 기재가 인산화된 아미노산 잔기 및 위치를 나타내다. 도 10에서, 실험군은 다프손을 2.0mg/kg/d로 3개월 동안 마시게 한 것이고, control은 다프손을 먹이지 않은 것을 제외하고 동일하게 실험한 것이다. 어레이 분석은, Phospho Explorer Antibody array (1312개 항체, FULL MOON Biosystems)를 사용하고, 여기에 마우스의 soleus 근육을 채취하고, 단백질을 분리하여, 상기 어레이에 적용한 후, 확인하였다. 도 10에서, p-VR1 및 p-VR2는 각각 인산화된 VEGFR1 및 VEGFR2를 나타낸다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 VEGF2의 T1175, T1059 및 T1054에서 인산화가 현저하게 증가하여, VEGF2가 활성화되어 그를 통한 신호 전달이 되는 것으로 여겨진다.

Claims

다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 개체는 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 가진 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 혈관신생의 감소와 연관된 증상은 허혈증 (ischemia) 또는 허혈증을 야기하는 질병인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 허혈증은 피부 허혈증, 또는 눈 허혈증인 것인 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 피부 허혈증은 피부 경화 (scleroderma), 또는 상처 (wound)이고, 상기 상처는 욕창 (decubitus ulcers), 욕창 (pressure ulcers), 수술 절개(surgical incisions), 외상성 조직 손상 (traumatic tissue injuries),당뇨병성 궤양(diabetic ulcers), 화상 (burns), 피부 이식 (skin grafts), 또는 그 조합을 포함하는 것, 상기 눈 허혈증은 망막혈관 폐색 (retinal vascular occlusive disorders)인 것인 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 증상은 비당뇨병성 만성 신 질환 (nondiabetic chronic kidney disease), 뇌 경색 (cerebral infarction), 심근경색 (myocardiac infarction: MI), 협심증 (angina pectoris), 관상 심장 질환 (coronary heart disease), 당뇨성 합병증 (diabetic complications), 허혈성 사지 질환 (ischemic limb disease), 뇌 허혈증 (cerebral ischemia), 혈관 염증 증상 (conditions of vascular inflammation), 동맥경화 (arteriosclerosis), 무혈관성 괴사 (avascular necrosis), 탈모 (hair loss), 또는 발기부전 (erectile dysfunction)인 것인 조성물.
다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 포함하는, 개체에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 혈관신생의 감소와 연관된 증상은 허혈증 (ischemia) 또는 허혈증을 야기하는 질병인 것인 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 허혈증은 피부 허혈증, 또는 눈 허혈증인 것인 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 피부 허혈증은 피부 경화 (scleroderma), 또는 상처 (wound)이고, 상기 상처는 욕창 (decubitus ulcers), 욕창 (pressure ulcers), 수술 절개(surgical incisions), 외상성 조직 손상 (traumatic tissue injuries),당뇨병성 궤양(diabetic ulcers), 화상 (burns), 피부 이식 (skin grafts), 또는 그 조합을 포함하는 것이고, 상기 눈 허혈증은 망막혈관 폐색 (retinal vascular occlusive disorders)인 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 증상은 비당뇨병성 만성 신 질환 (nondiabetic chronic kidney disease), 뇌 경색 (cerebral infarction), 심근경색 (myocardiac infarction: MI), 협심증 (angina pectoris), 관상 심장 질환 (coronary heart disease), 당뇨성 합병증 (diabetic complications), 허혈성 사지 질환 (ischemic limb disease), 뇌 허혈증 (cerebral ischemia), 혈관 염증 증상 (conditions of vascular inflammation), 동맥경화 (arteriosclerosis), 무혈관성 괴사 (avascular necrosis), 탈모 (hair loss), 또는 발기부전 (erectile dysfunction)인 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합은 체중 kg 당 0.1 mg 내지 1000mg을 투여하기 위한 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 약학 또는 기능성 식품인 조성물.
다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생의 감소와 연관된 증상을 예방 또는 치료하는 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 혈관신생의 감소와 연관된 증상은 허혈증 (ischemia) 또는 허혈증을 야기하는 질병인 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 허혈증은 피부 허혈증, 또는 눈 허혈증인 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 피부 허혈증은 피부 경화 (scleroderma), 또는 상처 (wound)이고, 상기 상처는 욕창 (decubitus ulcers), 욕창 (pressure ulcers), 수술 절개(surgical incisions), 외상성 조직 손상 (traumatic tissue injuries),당뇨병성 궤양(diabetic ulcers), 화상 (burns), 피부 이식 (skin grafts), 또는 그 조합을 포함하는 것이고, 상기 눈 허혈증은 망막혈관 폐색 (retinal vascular occlusive disorders)인 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 증상은 비당뇨병성 만성 신 질환 (nondiabetic chronic kidney disease), 뇌 경색 (cerebral infarction), 심근경색 (myocardiac infarction: MI), 협심증 (angina pectoris), 관상 심장 질환 (coronary heart disease), 당뇨성 합병증 (diabetic complications), 허혈성 사지 질환 (ischemic limb disease), 뇌 허혈증 (cerebral ischemia), 혈관 염증 증상 (conditions of vascular inflammation), 동맥경화 (arteriosclerosis), 무혈관성 괴사 (avascular necrosis), 탈모 (hair loss), 또는 발기부전 (erectile dysfunction)인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합은 국소 투여하는 것인 방법.
다프손 또는 N-아세틸-다프손, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 다형체, 또는 이들의 조합을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 부위에서 혈관신생을 자극시키는 방법.