CN104069091A - 氨苯砜在保护血脑屏障完整性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氨苯砜(化学名4，4’-二氨基二苯砜)在保护血脑屏障完整性中的应用。利用脂多糖致炎因素引起的血脑屏障损伤模型，发现氨苯砜通过下调NADPH氧化酶的活性和NADPH氧化酶2(NOX2)的水平，降低小鼠脑血管ROS水平，从而提高紧密连接蛋白表达，最终减轻LPS导致的血脑屏障渗漏。本发明说明了氨苯砜可以保护血脑屏障完整性。结构式：。

Description

氨苯砜在保护血脑屏障完整性中的应用

技术领域

本发明属于药物领域，涉及氨苯砜在保护血脑屏障完整性中的应用。

背景技术

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是由连续的脑血管内皮细胞组成的结构，功能为调控细胞和分子入脑，并阻止神经毒性物质由血入脑。紧密连接蛋白负责维持BBB的完整性。BBB功能失调是许多神经系统疾病发病过程中的早期和重要事件，因此保护BBB完整性在多种神经系统疾病的治疗中起重要作用。

许多体内和体外的刺激都会引起BBB损伤，如脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，在感染性脑损伤中引起BBB通透性增加，紧密连接蛋白水平下降。脂多糖致炎因素导致BBB渗漏的机制包括引起促炎细胞因子分泌，上调活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，导致氧化应激损伤。而ROS可由NADPH氧化酶(NOX)催化生成，抑制NADPH氧化酶的活性和表达可以减轻脂多糖致炎因素造成的BBB损伤。

氨苯砜目前被用于治疗麻风病和部分皮肤病。发明人前期研究已经发现服用氨苯砜的老年麻风病人脑内海马CA3区的神经元数量则显著多于未服用氨苯砜的病人(De-Hua Chui et al.Am J Pathol1994)，提示氨苯砜对于神经系统的保护作用。在脑缺血/再灌注模型中，氨苯砜能够减少脑氧化应激和炎症损伤，抑制神经细胞凋亡，并且可以缩小脑梗塞面积(Diaz-Ruiz et al.J Neurosci Res.2008)。研究发现：氨苯砜可通过抗氧化作用延长线虫寿命(Cho SC et al.PNAS2010)。上述研究表明氨苯砜在细胞和动物水平均可抑制ROS水平，并减轻氧化应激造成的损伤，具有较好的抗氧化应激作用，但是氨苯砜对血脑屏障完整性的影响尚无报道。

发明内容

利用炎症诱导的血脑屏障损伤模型，我们研究了氨苯砜在BBB中的抗氧化作用，及其对血脑屏障完整性的影响。

本发明公开了结构如通式I所示的化合物，在保护血脑屏障完整性中的应用。在给与脂多糖致炎因素刺激的C57/BL6小鼠中，氨苯砜能降低ROS水平，抑制NADPH氧化酶活性以及NOX2表达，同时提高紧密连接蛋白表达水平，减轻脂多糖致炎因素造成的BBB渗漏。

优选的，本发明的化合物对小鼠BBB保护作用的有效浓度为5-10mg/kg体重。

本发明提供的化合物可以和常规药物赋形剂或辅料形成药物组合物，可通过口服或者直肠途径给药。

本发明通过研究发现了氨苯砜的新用途-可以保护血脑屏障的完整性，对于此类疾病的防治，利用现有药物提出了新的有效的方法。

附图说明

图1为氨苯砜对脂多糖致炎因素引起的BBB渗漏的影响。A图为双光子成像结果，B图为对双光子成像结果的定量统计。

图2为不同浓度的氨苯砜对脂多糖致炎因素引起的小鼠脑血管紧密连接蛋白水平降低的改善作用。A图为蛋白电泳结果，B，C，D图为对蛋白电泳结果的定量统计。

图3为不同浓度的氨苯砜对脂多糖致炎因素引起的小鼠脑血管ROS升高的改善作用。

图4为不同浓度的氨苯砜对小鼠脑血管NADPH氧化酶活性和NOX2水平的影响。A图为NADPH氧化酶活性测定结果，B图为蛋白电泳结果，C图为对蛋白电泳结果的定量统计。

具体实施方式

以下将结合附图1-4，通过具体实施例对本发明进行描述。

实施例1、动物模型构建及处理。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激常引起血管神经炎症性改变，因此是国际常用的炎症模型，用于探究药物对血管神经变化的影响及相关药理机制。

选取3月龄的C57/BL6小鼠，饲养于北京大学医学部实验动物部，自由觅食和饮水，12/12h日照节律。将小鼠作如下分组：溶剂组(Control)；腹腔注射LPS组(LPS)；腹腔注射LPS+0.5mg/kg DDS组(LPS+0.5mg/kgDDS)；腹腔注射LPS+2mg/kg DDS组(LPS+2mg/kg DDS)；腹腔注射LPS+5mg/kg DDS组(LPS+5mg/kg DDS)；腹腔注射LPS+20mg/kg DDS组(LPS+20mg/kg DDS)，每组6只。不同浓度的DDS用4.5％的聚乙二醇/水溶液溶解，腹腔注射的体积为每只100ul。24小时后进行后续实验。

实施例2、氨苯砜对LPS引起的BBB渗漏的影响

小鼠接受5％水合氯醛麻醉后，在其颅骨枕叶皮层上方开颅窗，尾静脉注射带有荧光标记的MW40,000葡聚糖，利用双光子显微镜下查看BBB完整性。

实施结果：Control组小鼠BBB完整，血管周围脑实质不出现荧光标记的葡聚糖；LPS组小鼠BBB渗漏，血管中的大分子荧光物质穿过血管进入脑实质；而LPS+5mg/kg DDS组与LPS组相比BBB完整性显著提高。上述结果说明5mg/kg DDS给药能减轻LPS造成的BBB渗漏。双光子结果与相应血管周围荧光强度统计结果如图1中所示。

实施例3、氨苯砜对小鼠脑血管紧密连接蛋白水平的影响

提取小鼠脑微血管，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30min，离心取上清液，蛋白定量，进行蛋白质印迹分析，检测血管紧密连接蛋白ZO-1，Claudin-5和Occludin的水平。

实施结果：LPS组小鼠脑血管紧密连接蛋白水平与control组相比明显下降，而在0.5-5mg/kg内，随着氨苯砜浓度的增加，紧密连接蛋白水平逐渐增加，在20mg/kg时有所减少，但相对于LPS组仍有显著性差异。与control组相比##p＜0.01，###p＜0.001；与LPS组相比*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。结果如图2所示。

实施例4、氨苯砜对小鼠脑血管ROS水平的影响

提取小鼠脑微血管，加入终浓度为10μM的2’7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCFDA)作为探针，37℃孵育30分钟，冰上终止反应，利用多功能酶标仪，在激发波长λexc＝488nm，发射波长λem＝530nm检测荧光强度。

实施结果：LPS组ROS水平与control组相比明显升高，而在0.5-5mg/kg内，随着氨苯砜浓度的增加，ROS水平逐渐降低，在20mg/kg时有所上升，但相对于LPS组仍有显著性差异。与control组相比#p＜0.05；与LPS组相比*p＜0.05，**p＜0.01。结果如图3所示。

实施例5、氨苯砜对小鼠脑血管NADPH氧化酶活性的影响

提取小鼠脑微血管，1％Triton-X100冰上裂解30min，离心取上清，蛋白定量，加入终浓度为5μM光泽精与100μM的NADPH，利用光度计检测化学发光。

实施结果：LPS组NADPH氧化酶活性与control组相比明显升高，而在0.5-5mg/kg内，随着氨苯砜浓度的增加，ROS水平逐渐降低，在20mg/kg时有所上升，但相对于LPS组仍有显著性差异。与control组相比#p＜0.05；与LPS组相比*p＜0.05，**p＜0.01。结果如图4A所示。

实施例6、氨苯砜对小鼠脑血管NOX2水平的影响

提取小鼠脑微血管，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30min，离心取上清，蛋白定量，进行蛋白质印迹分析，检测脑微血管中NOX2的水平。

实施结果：LPS组NOX2水平与control组相比明显升高，而在0.5-5mg/kg内，随着氨苯砜浓度的增加，NOX2水平逐渐降低，但在20mg/kg时有所上升，相对于LPS组无显著性差异。与control组相比##p＜0.01；与LPS组相比*p＜0.05。结果如图4B，4C所示。

Claims (7)

1.氨苯砜在保护血脑屏障完整性中的应用，其结构为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：氨苯砜能够抑制脂多糖致炎因素引起的小鼠血脑屏障渗漏。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：氨苯砜能够上调脂多糖致炎因素造成的紧密连接蛋白水平下降。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：氨苯砜下调脂多糖致炎因素诱导的氧化应激水平。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：氨苯砜下调脂多糖致炎因素诱导的NADPH氧化酶活性和NOX2水平。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：氨苯砜在小鼠中的有效剂量为5-10mg/kg体重。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：氨苯砜可以和常规药物赋形剂或辅料形成药物组合物，可通过口服或者直肠途径给药。