DE60116478T2

DE60116478T2 - Verwendung von cdp-cholin zur prophylaxe der cerebralen ischämie

Info

Publication number: DE60116478T2
Application number: DE60116478T
Authority: DE
Inventors: Rafael Foguet; Jorge Ramentol; J. Isidro FERRER; Rafael Lozano; J. Julio SECADES; M. Manuel RAGA; M. Josep CASTELLO; A. Josω ORTIZ
Original assignee: Ferrer Internacional SA
Current assignee: Ferrer Internacional SA
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: KR100883279B1; US20050222077A1; NO20024399L; RU2255741C2; EP1265621A2; WO2001068064A3; CZ300616B6; IL151165A; PT1265621E; KR20030005225A; US6930096B2; PL358249A1; NO20024399D0; ES2169986B1; ES2169986A1; MXPA02008917A; IL151165A0; DE60116478D1; AU2001248346B2; US20030050284A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von CDP-Cholin zur prophylaktischen Behandlung cerebraler Ischämie.
Es gibt mehrere Faktoren, die am Auftreten und dem Ausmaß cerebraler ischämischer Erkrankungen infolge fokaler Ischämie beteiligt sind. Zu diesen Faktoren gehören eine mangelnde Energieversorgung sowie fehlende Homöostasie von Neurotransmittern und Kationen; die Induktion und gelegentliche Expression früher Gene genauso wie die Mobilisierung von Cytokinen, welche die Blut-Hirn-Schrankenfunktion verändern und an der Leukocyten-Infiltration teilnehmen; der rasche Zelltod in zentralen Infarktbereichen und der verzögerte Tod – häufig mit Apoptose in Zusammenhang gebracht – in peripheren und Penumbrabereichen; und die Induktion oder Expression trophischer Faktoren und ihrer Rezeptoren, die reparative plastische Phänomene und Angiogenese fördern.
Das Wissen um Mechanismen des Zelltods nach einem ischämischen Ereignis ist ein grundlegender Aspekt, da ihre Kontrolle den externen therapeutischen Eingriff ermöglicht. Die genetische Kontrolle des programmierten Zelltods ist in der Hauptsache anhand des Nematoden Caenorhabditis elegans untersucht und mit den Genen ced-3, ced-4 und ced-9 in Zusammenhang gebracht worden. Caspasen, eine Art cysteinabhängiger Säugerproteasen, entsprechen gewissen Gegenstücken des ced-3-Genprodukts und sind für die Apoptoseentwicklung äußerst wichtig. Caspasen sind an mehreren Zelltodmodellen differenziell beteiligt und wirken auf Substrate, die für das Zellüberleben wesentlich sind, indem sie zu ihrer Desintegration führen. Die Caspasen 1, 2, 3, 6 und 8 werden mit verschiedenen Erkrankungen des zentralen Nervensystems in Zusammenhang gebracht. T. E. Andreoli (Am. J. Med., 107, 488–506, 1999) und B. C. Albensi (Drug News Perspect. 12 (8), 453–457, 1999) hat das Phänomen der Apoptose und die Rolle von Caspasen sorgfältig zusammenfassend beschrieben.
Derzeit gibt es wenig Daten in der Literatur zur Expression von Caspasen nach einem Schaden, der durch eine transiente globale Ischämie oder fokale Ischämie induziert ist. Laufende Untersuchungen haben für die jeweilige Caspase eine variable Expression gezeigt, die von der verstrichenen Zeit und den Zelltypen abhängt. Die Anmelder haben festgestellt, dass Caspasen an dem ischämischen Vorfall – sowohl in menschlichem Gehirn als auch im Rattenmodell der fokalen Ischämie – beteiligt sind und dass die Expression von Caspasen nachweislich besonders im Penumbrabereich innerhalb der ersten Tage nach dem Infarkt besonders deutlich ausgeprägt ist.
CDP-Cholin (Cytidindiphosphatcholin, Citicolin) stellt eine entscheidende Vorstufe in der Synthese von Membranphosphatidylcholin dar. In experimentellen Modellen führt die exogene Verabreichung von CDP-Cholin zu einem verminderten Abbau der Zellmembranen, wobei es eine Zunahme der Phosphatidylcholinsynthese und eine Abnahme der Konzentrationen freier Fettsäuren induziert. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit CDP-Cholin in mehreren Tiermodellen der Ischämie oder Hypoxie von Nutzen war. X. A. Alvarez et al. (Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology: 21 (8), 535–540, 1999) untersuchten experimentell Antiapoptose-, Neuroprotektions- und Antiamnesieeffekte von CDP-Cholin. Der neuroprotektive Mechanismus von CDP-Cholin ist nicht vollständig bekannt. Derzeit glaubt man, dass dieser Effekt mit einer Verringerung freier Fettsäuren, der Produktion freier Radikale, der Stabilisierung von Nervenzellmembranen, der Abnahme glutamatinduzierter Toxizität und dem zunehmenden Überleben von Nervenzellen zu tun hat. Ob der nützliche Effekt von CDP-Cholin bei ischämischen Vorfällen mit der Verminderung des apoptotischen Zelltods im Penumbrabereich nach fokaler Ischämie zu tun hat, hat man noch nicht herausgefunden.
Überraschenderweise stellte man fest, dass die Verabreichung von CDP-Cholin vor einem cerebralen ischämischen Vorfall zu einem größeren Nutzeffekt hinsichtlich der Vermeidung schwerer Folgeerscheinungen führt als bei Verabreichung des CDP-Cholins nach dem Auftreten der Folgeerscheinungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von CDP-Cholin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung cerebraler Ischämie.
Mit prophylaktischer Behandlung ist gemeint, dass CDP-Cholin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon vor dem eventuellen Auftreten eines ischämischen Vorfalls verabreicht wird. Tritt ein ischämischer Vorfall auf, ist es bevorzugt, die Be handlung fortzusetzen. Der Behandlungsmodus kann dann an die Bedürfnisse des Patienten angepasst werden.
Unter einem anderen Blickwinkel betrifft die vorliegende Erfindung eine neuroprotektive Behandlung. Mit Neuroprotektion ist gemeint, dass man Hirngewebe vor Schaden, insbesondere vor cerebralem Infarkt, schützt.
Unter einem weiteren Blickwinkel betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von CDP-Cholin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, um das Ausmaß des Hirngewebeschadens gering zu halten.
Einer speziellen Ausführungsform zufolge betrifft die vorliegende Erfindung obige Verwendung, wobei der Hirngewebeschaden und insbesondere der cerebrale Infarkt mit cerebraler Ischämie in Zusammenhang steht.
Cerebale Ischämie beinhaltet cerebrale ischämische Ereignisse. Ein ischämisches Ereignis kann definiert werden als die verminderte Blutzufuhr zu einem Gewebe. Ursache cerebraler Ischämie kann eine Verminderung oder gar eine Unterbrechung der Blutzufuhr über eine Hirnarterie sein.
CDP-Cholin wirkt hemmend auf die Aktivierung der Caspase-Kette und vermindert die Apoptose von Nervenzellen im Penumbrabereich.
Unter einem weiteren Blickwinkel betrifft die vorliegende Erfindung daher die Verwendung von CDP-Cholin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Hemmung der Aktivierung der Caspase-Kette. Da dieser Effekt in vorbehandelten Lebewesen größer war, wird geschlussfolgert, dass CDP-Cholin eine prophylaktische neuroprotektive Wirkung bei cerebralen ischämischen Vorfällen besitzt. Kurzum, dass CDP-Cholin tatsächlich wirksamer ist, wenn es vor Ischämie verabreicht wird, ist ein Hinweis auf eine präventive Wirkung auf die Schwere ischämischer Komplikationen. Schließlich ist es ein Vorteil des prophylaktischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung, dass es wirksamer ist als eine konventionelle Behandlung a posteriori.
Die erfindungsgemäße Verwendung beinhaltet die prophylaktische Behandlung cerebraler Ischämie, wobei eine wirksame Menge CDP-Cholin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon einem Lebewesen, das dessen bedarf, verabreicht wird.
CDP-Cholin oder dessen pharmazeutisch verträgliche Salze oder Gemische davon können in pharmazeutisch verträglicher Form, z.B. bequemerweise im Gemisch mit pharmazeutischen Trägern und/oder Exzipienten einem Lebewesen, das dessen bedarf, gewöhnlicherweise menschlichen Patienten, in einer wirksamen Menge, vorzugsweise mit Tagesdosen im Bereich von 0,5 bis 4 g freies CDP-Cholin, bevorzugter 1 bis 2 g freies CDP-Cholin, sowohl oral als auch parenteral, je nach dem Zustand des Patienten, oder gegebenenfalls zusammen mit weiteren therapeutischen Mitteln sequenziell oder simultan verabreicht werden.
Zu pharmazeutisch verträglichen Salzen des CDP-Cholins gehören seine Basenadditionssalze, insbesondere Alkali- oder Erdalkalisalze, wie seine Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze, oder seine Säureadditionssalze mit einer anorganischen oder organischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Malonsäure, Weinsäure, Acrylsäure, Methacrylsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und Nikotinsäure.
CDP-Cholin oder dessen Salze können in wasserfreier oder solvatisierter, insbesondere hydratisierter, Form verwendet werden.
Die Verabreichung kann oral in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Cachets, Pastillen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Syrupen, Gelen und dergleichen; oder parenteral in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen und dergleichen zur intravenösen oder intramuskulären Injektion erfolgen.
Lebewesen, die einer erfindungsgemäßen Behandlung bedürfen, sind vor allem:

– Patienten mit einem hohen Risiko, ein akutes ischämisches Ereignis wie einen Gehirnschlag aufgrund mehrerer bekannter Risikofaktoren, z.B. einer Vorgeschichte früherer vorübergehender ischämischer Vorfälle, arterieller Hypertonie, Hypercholesterolämie, Rauchen, aurikulärem Fibrillieren und anderen embolischen Herzerkrankungen, zu erleiden. In diesem Fall sollten Patienten mit einer wirksamen Dosis von beispielsweise 1 bis 2 g/Tag über den oralen Weg behandelt werden, selbst dann, wenn sie einen hypothetischen Gehirnschlag erlitten haben.

Beispiele
In den folgenden Beispielen sind Formulierungen des aktiven Inhaltsstoffs, die für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, erläuternd angegeben.
BEISPIEL 1: 500 mg Tabletten
BEISPIEL 2: 25%ige Orallösung
BEISPIEL 3: Lösung zur intravenösen Injektion
BEISPIEL 4: Neuroprotektive Wirkung
Die Wirkung von CDP-Cholin auf den verzögerten Nervenzelltod (Apoptose) wurde in einem Modell der kortikalen cerebralen Ischämie an der Ratte in Anlehnung an das folgende experimentelle Protokoll untersucht:
1) – Tiere:
Man führte sämtliche cerebrale Infarkttests an männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 220 bis 270 g durch. Die Tiere hielt man in Temperatur- und Luftfeuchtigkeit-kontrollierten Räumen bei einem 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser.
2) – Modell der Okklusion der Mittelhirnarterie:
Man induzierte eine cerebrale Ischämie durch fortdauernden proximalen Verschluss der Mittelhirnarterie, wozu man Elektrokoagulation verwendete. Bei tiefer Anästhesie befestigte man den Rattenkopf und nahm einen Einschnitt zwischen dem linken Ohr und dem linken Auge vor. Dann öffnete man das Cranium, indem man den Temporalmuskel zerteilte. Man führte eine Craniotomie durch, wobei man einen 1–2 mm-Bohrer hinter der Schuppenbeinfissur verwendete. Man durchbohrte die Dura mater, um den Arm der Mittelhirnarterie freizulegen, den man dann dauerhaft koagulierte.
3) – Behandlungen:
Man unterteilte die Ratten per Zufall in drei Gruppen:

(a) Nach 30-minütiger Ischämie behandelte man die Tiere in dieser Gruppe mit CDP-Cholin (500 mg/kg) in 0,9%iger steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,1 ml), die man intraperitoneal verabreichte. Diese Gruppe ist in den 1 bis 5 als „Nach" gezeigt.
(b) Im Zeitraum von 24 Stunden vor Ischämie bis 30 Minuten nach Ischämie erhielten die Tiere in dieser Gruppe die gleiche Behandlung wie in Gruppe (a). Diese Gruppe ist in den 1 bis 5 als „Vor" gezeigt.
(c) Die Tiere in dieser Gruppe verwendete man als Kontrolle. Nach Ischämie behandelte man sie mit 0,9%iger physiologischer Kochsalzlösung (0,1 ml), die man intraperitoneal verabreichte. Diese Gruppe ist in den 1 bis 5 als „Kontrolle" gezeigt.

4) – Präparation von Proben für morphologische Untersuchungen.
Markierung fragmentierter DNA und Caspase-Immunhistochemie:
Vor der abschließenden Anästhesie mit Ethylether ließ man die Tiere sich unterschiedlich lange erholen (30 min und 1, 4, 8, 12, 24 und 48 Stunden). Dann perfundierte man die Gehirne sofort bei 4°C mit PBS, wobei man eine in das Herz (linke Kammer) eingeführte Kanüle verwendete, anschließend mit 4%igem Paraformaldehyd. Man entnahm die Hirne rasch und fixierte sie, indem man sie in die gleiche Fixierlösung bei 4°C 24 h eintauchte. Nach der Cryoprotektion mit 30%iger Saccharose fror man die Gehirne in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan ein und konservierte sie bei –70°C. Unter Verwendung eines Cryostats zerteilte man die Gehirne in Schnitte von 50 μm. Die Gehirnschnitte konservierte man bei –70°C, wobei man einen Cryoprotektor verwendete. Diese Schnitte verwendete man anschließend als Proben für die Immunhistochemie, Morphologie und in situ-Markierung apoptotischer Zellen. Man untersuchte die Infarktmorphologie an sequenziellen Schnitten, den Beginn und das Ende des Infarkts eingeschlossen, wobei man Hämatoxylin- und Eosin-Färbung und Nisslsfärbung (Cresylviolett) verwendete. Man markierte die apoptotischen Zellen mittels verschiedener Arten von in situ-Markierung fragmentierter DNA. Die Immunhistochemie der Caspase-Expression führte man durch, indem man das Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren mit Primärantikörpern durchführte, die für die Caspasen 1, 2, 3, 6 und 8 spezifisch waren und die man von Santa Cruz Biotechnology erhielt.
5) – Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse:
Was die Gruppen und Zeiten angeht, ähnelt die Präparation der Proben der zu Ziffer 4). Man enthauptete die Tiere, die tief anästhesiert waren, und entnahm die Gehirne in frischem Zustand. In jedem Fall wurden die folgenden Regionen dissektiert: a) graue Substanz des Infarktbereichs; b) weiße Substanz des Infarktbereichs; c) graue Substanz des Penumbrabereichs; und d) weiße Substanz des Penumbrabereichs. In jedem Fall erhielt man Proben aus der ipsilateralen und kontralateralen Seite. Man verwendete diese Proben anschließend für die Western Blot-Analyse der Anticaspase-Antikörper und Antikörper gegen verschiedene Caspase-Subsrate, um ihren möglichen Abbau nach der ischämischen Schädigung festzustellen.
6) – Ergebnisse:
Um die Auswirkung der Behandlung zu bewerten, bestimmte man 12 Stunden nach Infarktinduktion die Expression der Caspasen 1, 2, 3, 6 und 8 als Marker des Apoptosevorgangs. Die Ergebnisse sind in den 1, 2, 3, 4 bzw. 5 gezeigt. Die Anmelder haben festgestellt, dass es signifikante Unterschiede zwischen den behandelten Tieren und den Kontrolltieren hinsichtlich der Expression dieser Marker gibt. Von noch größerer Bedeutung ist, dass diese Unterschiede außerdem in den Tieren, die vor der Ischämie behandelt wurden, signifikanter sind als in den Tieren, die nach der Ischämie behandelt wurden. All diese Experimente belegen, dass CDP-Cholin, wenn es vor und nach Infarktinduktion verabreicht wird, Caspase-Spiegel signifikanter senkt als wenn es nur nach Infarktinduktion verabreicht wird.
7) – Figurenbeschreibung:
Die 1, 2, 3, 4 und 5 zeigen Balkendiagramme mit Mittelwerten der Bestimmung der Caspasen 1, 2, 3, 6 bzw. 8 in Immunfluoreszenzeinheiten. Das Konfidenz-Intervall beträgt 95% und die statistische Signifikanz in Bezug auf die Kontrollen beträgt *p < 0,05, **p < 0,025, ***p < 0,01.

Claims

Verwendung von CDP-Cholin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung cerebraler Ischämie, wobei CDP-Cholin oder das pharmazeutisch verträgliche Salz einem menschlichen Wesen mit einem hohen Risiko, ein akutes ischämisches Ereignis zu erleiden, vor dem eventuellen Auftreten eines ischämischen Vorfalls zu verabreichen ist, wobei das akute ischämische Ereignis Gehirnschlag ist und das hohe Risiko auf einen Risikofaktor zurückzuführen ist, der ausgewählt ist unter einer Vorgeschichte früherer vorübergehender ischämischer Vorfälle, arterieller Hypertonie, Hypercholesterolämie, Rauchen, aurikulärem Fibrillieren und anderen embolischen Herzerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei CDP-Cholin in täglichen Dosen zu verabreichen ist, die äquivalenten Mengen von freiem CDP-Cholin im Bereich von 1 g bis 2 g entsprechen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das pharmazeutisch verträgliche Salz von CDP-Cholin ein Alkali- oder Erdalkalisalz oder ein Salz mit einer anorganischen oder organischen Säure ist, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Malonsäure, Weinsäure, Acrylsäure, Methacrylsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und Nikotinsäure, in wasserfreier oder hydratisierter Form.