PL185124B1

PL185124B1 - Zastosowanie cytykoliny oraz jej kompozycja do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej

Info

Publication number: PL185124B1
Application number: PL96322061A
Authority: PL
Inventors: Sandage┴Bobby┴W.; Locke┴Kenneth┴W.
Original assignee: Interneuron Pharmaceuticals
Priority date: 1995-03-06
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 2003-02-28
Also published as: PL322061A1; ES2244968T3; CN1181015A; AU5304796A; JPH11511732A; NO974076L; PT813416E; CN1488353A; NO313538B1; EP0813416A1; NO974076D0; DE69634773D1; DE69634773T2; BR9607206A; EP0813416B1; MX9706808A; WO1996027380A1; ATE296103T1; CN1126546C; EP0813416A4

Abstract

1. Zastosowanie cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalnej soli do wytwarza- nia leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawalem mózgu w wyniku niedokrwienia. 15. Kompozycja terapeutyczna do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawalem mózgu w wyniku niedokrwienia, znamienna tym, ze zawiera skuteczna ilosc cytykoliny i drugiego terapeutycznie skutecznego srodka, którym jest aspiryna lub 10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-5,10-iminy maleinian (MK-801), lub ich farmaceutycznie opuszczalnych soli w farmaceutycznie akceptowalnym nosniku. PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatosowanie cytykoliny oraz jej kompozycja do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia. Wynalazek ma na celu ograniczenie objętości zawału, w szczególności

185 124 zawału mózgu (udaru) po incydencie niedokrwiennym. Ograniczenie objętości zawału, połączone ewentualnie z ułatwieniem odnowy uszkodzonej tkanki może z kolei zwiększać do maksimum potencjał powrotu do zdrowia po zmniejszeniu krytycznego przepływu krwi, do którego dochodzi niekiedy w wyniku udaru. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie cytykoliny (cytydyno-5'-difosfocholiny, czyli CDP-choliny, do zmniejszenia objętości udaru mózgu i zwiększenia szansy na całkowity powrót do zdrowia.

Życie i prawidłowa czynność mózgu, bardziej niż innych narządów organizmu ludzkiego, zależy od względnie stałego dopływu utlenionej krwi. Mózg, ważący 2% całkowitej masy ciała, otrzymuje 15% krwi wyrzucanej przez serce, i zużywa 20% tlenu zużywanego przez cały organizm. Ponadto, stały dopływ krwi jest niezbędny do zaopatrywania mózgu w glukozę, główny substrat energetyczny wykorzystywany przez mózg do wytwarzania fosforanów wysokoenergetycznych, np. ATP.

Niedokrwienie można zdefiniować jako zmniejszenie przepływu krwi przez tkankę. Niedokrwienie mózgu stanowi przerwanie lub zmniejszenie przepływu krwi w tętnicach unaczyniających mózg zwykle w wyniku zamknięcia tętnicy przez zakrzep lub inną substancję (zator). Zmniejszenie dopływu krwi do danego obszaru unaczynienia określamy jako niedokrwienie ogniskowe; zmniejszenie dopływu krwi do całego mózgu jako niedokrwienie uogólnione.

Tkanki mózgu, pozbawione krwi, i, w wyniku tego tlenu i glukozy, ulegają martwicy niedokrwiennej, czyli udarowi. Domniemane podłoże metaboliczne tego zwyrodnienia i śmierci komórki obejmuje: niedobór energii spowodowany wyczerpaniem zasobów ATP; kwasicę komórkową; uwalnianie glutaminianu; napływ jonów wapniowych; pobudzenie degradacji fosfolipidów błony komórkowej, w następstwie czego dochodzi do nagromadzenia wolnych kwasów tłuszczowych; i uwalnianie wolnych rodników.

Znajomość tego podłoża popchnęła badaczy pracujących nad pewnymi rodzajami niedokrwiennego uszkodzenia tkanki mózgowej, do zastosowania środków takich jak blokery kanałów wapniowych, antagoniści glutaminianu i glicyny, CDP-aminy, wymiatacze wolnych rodników/przeciwutleniacze, perfluorowęglany i środki trombolityczne do poprawy mózgowego przepływu krwi i/lub poprawy stanu neurologicznego pacjenta; wyniki zastosowania tych wszystkich środków były jednak różne. Niektóre środki rozszerzające naczynia krwionośne mogą poprawiać przepływ krwi i znajdować zastosowanie jako środki przeciwniedokrwienne. Dla żadnego z nich nie udowodniono jednak, żeby zmniejszał objętość zawału, szczególnie u chorych po udarze niedokrwiennym mózgu. Przeciwnie, mimo że donoszono o zmniejszaniu rozmiarów zawału przez niektóre blokery kanałów wapniowych, donoszono również o niezgodnościach w wynikach zastosowania tych leków i o działaniach niepożądanych wywoływanych przez te leki, jak np. zwolnienie czynności serca lub zmniejszenie ciśnienia perfuzji. Por. np. Kastę, M. i wsp., Stroke (1994) 25: 1348-1353.

Bardziej szczegółowo, zaobserwowano, że antagoniści glutaminianu w pewnych warunkach doświadczalnych powodują zmniejszenie rozmiarów zawału. Por. np. Olney, J.W. i wsp., Science (1991) 254:1515-1518. Jednakże większość, jeżeli nie wszystkie, z tych związków, powodują wakuolizację mózgu, a większość z nich ma fencyklidynopodobne działania niepożądane u zwierząt i u ludzi. Przyjmowanie fencyklidyny powoduje euforię, lęk, zmienność nastroju i długotrwałą psychozę.

Wymiatacze wolnych rodników/przeciwutleniacze stanowią heterogenną grupę związków. Ogólnie, wyniki zastosowania tych związków nie są zgodne pod względem ich wpływu na objętość udaru. Na przykład, stwierdzono, że inhibitory dysmutazy nadtlenkowej zmniejszają objętość udaru wyłącznie po wstrzyknięciu dokomorowym (do komór mózgu). Por. Kinouchi H i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 11158-11162. Inne związki, jak np. lubeluzol, wykazują skuteczność kliniczną, jednakże z bardzo wąskim marginesem bezpieczeństwa. Por. Diener H.C. i wsp., Stroke (1995) 26:30.

Jakkolwiek wykazano pewną skuteczność perfluorowęglanów w poprawie stanu neurologicznego chorych po udarze niedokrwiennym mózgu, związki te mają niezwykle długi

185 124 czas połowicznego półtrwania i muszą być podawane przez infuzję do mózgu i płynu mózgowo-rdzeniowego. Ponadto obserwowano przerost gonad po zastosowaniu tych związków.. Por. Beli RD i wsp., Stroke (1991) 22:80-83.

Środki trombolityczne, takie jak tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA), streptokinaza i urokinaza, wydawały się obiecujące w leczeniu niedokrwienia. Jednakże środki te mogą zwiększać krwawienie śródmózgowe, co w wyniku może zwiększać śmiertelność. Poi:, np. del Zoppo GJ i wsp., Seminars in Neurology (1991) 11(4):368-384; The Ancrod Study Investigators, Stroke (1994) 25:1755-1759; Hacke W. i wsp., Stroke (1995) 26: 167. Ponadto skuteczność tych środków jest prawdopodobnie ograniczona do leczenia w ciągu trzech pierwszych godzin udaru mózgu.

Cytykolina jednosodowa stanowi egzogenną postać cytydyno-5'-difosfocholin.y (CDP-choliny). Endogenna CDP-cholina stanowi kluczowy produkt pośredni w biosyntezie fosfatydylocholiny błonowej, która ma pierwszorzędowe znaczenie dla dynamicznej regulacji integralności błony komórkowej. Rola fosfolipidów w podtrzymaniu czynności neuronów ma kluczowe znaczenie wtedy, gdy niedokrwienie może wywołać rozpad tych błon.

Przeprowadzono szeroko zakrojone badania kliniczne cytykoliny. Wyniki tych badań wykazują poprawę w zakresie rozmaitych objawów klinicznych, takich jak ból głowy, zawroty głowy, zaburzenia koordynacji ruchowej i bezsenność. W badaniach tych wykazano również poprawę sprawności ruchowej i zmniejszenie trwałych następstw udaru. Jednakże próby te ograniczały się do zastosowania cytykoliny w fazie rehabilitacji chorych po udarze, tak więc leczenie stosowano w dość długi czas po domniemanym incydencie niedokrwiennym.

W badaniach tych wykazano jednak, że chorzy po udarze mózgu lub urazie głowy dobrze tolerowali cytykolinę w zakresie dawki od 250 mg dziennie do 100 mg dziennie, podawanej przez kilka tygodni.

Autorzy niniejszego wynalazku uważają, że w dotychczas przeprowadzonych badaniach nie wykazano jeszcze pełnego potencjalnego działania leczniczego cytykoliny, które może być związane ze stabilizacją błony komórkowej poprzez zwiększoną syntezę fosfolipidów w niedokrwionej tkance mózgowej, ponieważ badania te polegały na podawaniu cytykoliny w długi czas po początku niedokrwienia, typowo, tylko w czasie prób leczenia podejmowanych w okresie rehabilitacji chorego. Ponadto, w tych przeprowadzonych do tej pory badaniach leczenia nie podawano przez dostatecznie długi czas.

Udar jest ciężką, potencjalnie śmiertelną chorobą, dotykającą około 50 000 osób rocznie w Stanach Zjednoczonych. Lekarze muszą opierać się na działaniach zapobiegawczych i środkach nieswoistych, takich jak sterydy i mannitol, dla zmniejszenia obrzęku mózgu. Ponieważ 25-50% chorych po udarze pozostaje niepełnosprawnymi, istnieje potrzeba poprawy sposobów leczenia tych chorych.

Jakkolwiek dożylne podawanie środków trombolitycznych wydawało się obiecujące pod warunkiem zastosowania w ciągu pierwszych trzech godzin udaru, uważa się, że leczenie doustne, którego podawanie rozpoczęto by w ciągu 24-godzinnego „okna terapeutycznego” po udarze i które spowodowałoby istotną poprawę stanu neurologicznego badanego w trzy miesiące po udarze, stanowiłoby cenny nowy środek w walce z tą chorobą.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatosowanie cytykoliny oraz jej kompozycja do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia. Wynalazek pozwala na zmniejszanie objętości zawału, w szczególności udaru mózgu po incydencie niedokrwiennym, np. niedokrwieniu mózgu spowodowanym przez dowolne z grupy takich zaburzeń, jak udar niedokrwienny mózgu. Wynalazek obejmuje zastosowanie cytykoliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli do leczenia zaburzeń, do których należą, jednak nie są one do nich ograniczone, udar pochodzenia zatorowego lub udar krwotoczny, skurcz naczyń mózgowych, hipoglikemia, nagłe zatrzymanie krążenia, stan padaczkowy; do zaburzeń tych mogą również należeć schizofrenia, padaczka, choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego, choroba Alzheimera i pląsawica Huntingtona.

185 124

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia, zawierająca skuteczną ilość cytykoliny i drugiego terapeutycznie skutecznego środka, którym jest aspiryna lub 10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-5,10-iminy maleinian (MK-801), lub ich farmaceutycznie opuszczalnych soli w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku. Kompozycja według wynalazku zawiera od 100 mg do 1000 mg cytykoliny i od 10 mg do 500 mg drugiego środka terapeutycznego.

Aby ograniczyć lub zmniejszyć objętości udaru, podawanie skutecznej ilości cytykoliny musi nastąpić w krótkim czasie po incydencie niedokrwiennym, korzystnie, w ciągu 24 godzin od tego incydentu. Następnie podaje się cytykolinę w dalszym ciągu przez pewien czas, typowo, co najmniej przez tydzień (około 5-10 dni, jednak korzystnie przez co najmniej 7 dni), korzystniej, przez co najmniej kilka tygodni (np. 3-8 tygodni, korzystniej przez co najmniej > tygodni). Sposób dawkowania może być różny, w pewnych granicach. Typowo, można podawać około 100-2000 mg cytykoliny jeden lub więcej razy dziennie, korzystnie, jeden raz dziennie, w czasie trwania okresu leczenia. Korzystny sposób podawania jeden raz dziennie stanowi podawanie około 500-1000 mg cytykoliny, korzystniej, około 500 mg. Jednakże, również tę pojedynczą dawkę można podawać więcej niż jeden raz dziennie, np. dwa razy dziennie, jeżeli jest to wskazane.

Można spodziewać się, że cytykolina będzie wykazywać przewagę nad innymi środkami stosowanymi do zmniejszania objętości udaru po incydencie niedokrwiennym. Cytykolina, będąc środkiem endogennym, jest tym samym bezpieczna. Cytykolina wykazuje bardzo niską toksyczność i wyjątkowo duży indeks terapeutyczny. Potencjalne wielokierunkowe działanie cytykoliny może również okazać się korzystne. Jakkolwiek nieznany jest udział poszczególnych mechanizmów działania w zmniejszaniu rozmiarów udaru, uważa się, że cytykolina i produkty jej hydrolizy, cytydyna i cholina, odgrywają istotną rolę w wytwarzaniu fosfolipidów biorących udział w tworzeniu i naprawie błony komórkowej. Uważa się również, że związki te biorą udział w kluczowych czynnościach metabolicznych, takich jak wytwarzanie kwasów nukleinowych i białek, oraz w syntezie neuroprzekaźnika - acetylocholiny. Por. Ulus IH i wsp., Brain Research (1989) 484:217-227. Tak więc, w warunkach niedokrwienia cytykolina może (1) stabilizować błonę poprzez dostarczenie substratów do utrzymania błony (2) naprawiać uszkodzoną błonę komórkową przez dostarczenie ważnych substratów do wytwarzania błony i (3) przywracać czynność neuronu przez dostarczenie substratów wytwarzania acetylocholiny. Ponadto, inaczej niż inne proponowane środki terapeutyczne, cytykolina nie tylko zmniejsza pierwotny rozmiar udaru, lecz uczestniczy również w odnowie uszkodzonej tkanki.

Pierwszym celem niniejszego wynalazku jest zatem zapewnienie sposobów poprawy stanu chorych po przebytym udarze mózgu lub urazie głowy, przez podawanie cytykoliny chorym w bardzo krótkim czasie po rozpoczęciu niedokrwienia, korzystnie, w ciągu 24 godzin po incydencie niedokrwiennym. Korzystniej, pierwszą dawkę cytykoliny podaje się w ciągu około 12 godzin do 15 godzin po incydencie niedokrwiennym.

Innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie sposobów zmniejszenia objętości zawału u chorych z uszkodzeniem tkanki np. w wyniku udaru niedokrwiennego lub urazu głowy, lub w wyniku innych zaburzeń powodujących zmniejszenie przepływu krwi w danym narządzie lub tkance.

Te i inne cele niniejszego wynalazku są oczywiste dla specjalistów w świetle powyższej dyskusji i przedstawionego poniżej dodatkowo szczegółowego opisu korzystnych wykonań wynalazku.

Na fig. 1 przedstawiono wykresy objętości zawału w grupie zwierząt otrzymujących rozczynnik (grupa kontrolna), 100 mg/kg cytykoliny i 500 mg/kg cytykoliny. Podane wartości stanowią wartości średnie ± odchylenie standardowe (SD).

185 124

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatosowanie cytykoliny oraz jej kompozycja do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia. Cytykolinę lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól podaje się w jednej do czterech dawek dziennie, od około 100 do około 2000 mg na dawkę, przy czym podawanie rozpoczyna się w bardzo krótkim czasie po incydencie niedokrwiennym i kontynuuje przez okres co najmniej do jednego tygodnia (np. 7 dni), do kilku tygodni, korzystnie,

4-8 tygodni, korzystniej, 5-8 tygodni, najkorzystniej, przez około 6 tygodni.

Uważa się, że cytykolina ma co najmniej dwoisty mechanizm działania: ogranicza uszkodzenie tkanki mózgowej wywołane przez urazy, takie jak udar lub poważny uraz głowy i ułatwia odnowę uszkodzonej tkanki nerwowej.

Uważa się, że podawanie cytykoliny ogranicza rozmiary udaru, uszkodzenia tkanki, poprzez zapobieganie gromadzeniu się toksycznych wolnych kwasów tłuszczowych. Ponadto, sadzi się, że cytykolina po podaniu rozpada się na dwie składowe, cytydynę i cholinę, stanowiące substraty niezbędne do tworzenia się błon komórek nerwowych. Postuluje się ponadto, że dla normalizacji czynności mózgu uszkodzone przez udar komórki nerwowe muszą wytworzyć nowe elementy błony komórkowej. Jak to opisano poniżej, w przedklinicznych modelach zwierzęcych udaru udowodniono, że podawanie cytykoliny znacząco zmniejsza rozmiary udaru. Wynik ten potwierdzono na ludziach poprzez badania kliniczne szerzej opisane poniżej, w których u wybranej grupy chorych, którym wcześniej podano leczenie cytykoliną, wykonano badanie metodą rezonansu magnetycznego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest nowe i istotne zastosowanie cytykoliny zmniejszanie rozmiarów udaru powstałego w wyniku niedokrwienia mózgu. Jakkolwiek uważa się, że stabilizacja błon komórkowych jest korzystna w warunkach niedokrwienia, nie udowodniono definitywnie, że stabilizacja błony komórkowej prowadzi do zmniejszenia objętości udaru. Autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że podawanie cytykoliny przez zaledwie siedem (7) dni znacząco zmniejsza objętość udaru, prawdopodobnie poprzez wpływ na syntezę fosfatydylocholiny i tworzenie się błony komórkowej.

Ochronny wpływ cytykoliny na tkankę mózgową udowodniono, w jednym przypadku, na modelu krótkotrwałego niedokrwienia przedniej części mózgu u szczura, u którego dokonano zamknięcia szwem tętnicy mózgu środkowej (middle cerebral artery - MCA) . Podawanie 500 mg/kg cytykoliny istotnie zmniejszało średnią objętość udaru w porównaniu z grupą kontrolną.

Na ogół korzystne jest podawanie cytykoliny doustnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Korzystną sól stanowi sól jednosodowa cytykoliny, ponieważ postać ta jest łatwa do wytworzenia w dopuszczalnej farmaceutycznie czystej postaci.

Jak to wspomniano powyżej, leczenie według wynalazku rozpoczyna się korzystnie w ciągu co najmniej 24 godzin od wystąpienia udaru, korzystnie, w ciągu 12-15 godzin, a najkorzystniej rozpoczyna się je jak najwcześniej po incydencie niedokrwiennym. W szczególnym wykonaniu niniejszego wynalazku leczenie prowadzi się przez co najmniej około 7 dni, korzystnie, co najmniej do około 14 dni, najkorzystniej co najmniej do około 30 dni od rozpoczęcia leczenia.

Korzystną dawkę około 500 do około 1000 mg cytykoliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli można podawać jeden lub więcej razy dziennie, korzystnie, raz lub dwa razy dziennie.

Niniejszy wynalazek znajduje najkorzystniejsze zastosowanie u chorych po incydencie niedokrwiennym, który dokonał się w mózgu, typowo, po niedokrwieniu mózgu, urazie głowy lub tym podobnych. Należy jednak wyraźnie zaznaczyć, że podanie pierwszej dawki skutecznej ilości cytykoliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli powinno nastąpić jak najszybciej po incydencie niedokrwiennym, jednak nie później niż 24 godziny po jego wystąpieniu. Można stosować szeroki zakres dawek leku. Cytykolinę według wynalazku można podawać w dawkach od około 100 do około 1000 mg, od jednego do około czterech razy dziennie. Na przykład, jeżeli pożądane jest podawanie w jednej dawce dziennej, cytykolinę

185 124

Ί podaje się w dawce od około 100 do około 4000 mg dziennie, korzystnie od około 500 do około 2000 mg dziennie. W jednym z wykonań wynalazku dawka wynosi 1000 mg dziennie.

W zastosowaniu terapeutycznym, ilość podawanej cytykoliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli („składnika czynnego”) dla osiągnięcia działania terapeutycznego będzie różna, w zależności od drogi podawania i zaburzenia lub choroby stwierdzanego u danego chorego. Odpowiednia dawka składnika czynnego podawanego ogólnie u ssaka, u którego stwierdza się lub podejrzewa jedno z zaburzeń, opisanych w niniejszym zgłoszeniu, pozostaje w zakresie od 100 do 4000 mg dziennie, przy czym korzystna dawka wynosi 1000 mg dziennie, podawane w dwóch dawkach po 500 mg. Przy podawaniu 100 mg cytykoliny dziennie stężenie choliny w osoczu wynosi 1,5 mg/ml, co jest równe stężeniu uzyskiwanemu przy podawaniu 500 mg/kg cytykoliny szczurom, jak to dalej opisano w przykładach. Udowodniono jednak, że przy podawaniu 500 mg dziennie osiąga się większość korzystnych działań cytykoliny, minimalizując działania niepożądane, takie jak zawroty głowy, które niektórzy chorzy mogą odczuwać.

Do badania klinicznego włączono 259 chorych z udarem niedokrwiennym w ciągu 24 godzin od wystąpienia objawów. Chorych losowo przydzielano do grupy placebo lub jednej z grup otrzymujących cytykolinę; grupy te otrzymywały doustnie, odpowiednio, 500, 1000 i 2000 mg dziennie; leczenie podawano przez 6 tygodni i chorych obserwowano przez dalsze 6 tygodni. Pierwszorzędowym wskaźnikiem skuteczności była poprawa stanu neurologicznego w dwunastym tygodniu po udarze, oceniana w skali Barthela.

U chorych otrzymujących 500 lub 2000 mg cytykoliny dziennie stwierdzono istotnie większą (p < 0,05) poprawę w skali Barthela w dwunastym tygodniu w porównaniu z chorymi z grupy placebo. Wskaźniki skuteczności dla grupy otrzymującej 1000 mg dziennie nie osiągnęły znamienności statystycznej, jakkolwiek wynik ten można wytłumaczyć nierównowagą demograficzną i pomieszaniem zmiennych wśród chorych z tej grupy.

Ponadto, ogólny stan neurologiczny, oceniany w innej znanej skali, skali Rankina, uległ znaczącej poprawie (p < 0,04) po leczeniu cytykoliną w porównaniu z placebo. Skala Barthela jest stupunktową skalą oceny. Wynik 95 lub więcej punktów oznacza całkowity lub prawie całkowity powrót do zdrowia po udarze mózg. W sumie, 33% chorych z grupy placebo uzyskało wynik powyżej 95 punktów w dwunastym tygodniu po udarze w porównaniu z 53% chorych otrzymujących 500 mg dziennie cytykoliny (p <0,04).

W innej skali poprawy stanu zdrowia, skali udarowej NIH, 34% chorych otrzymujących cytykolinę i 16% chorych otrzymujących placebo osiągnęło pełną lub prawie pełną normalizację funkcji, co jest równoznaczne z otrzymaniem wyniku mniejszego lub równego 1 w dwunastym tygodniu po udarze (p < 0,04). Nie stwierdzono istotnych różnic w śmiertelności pomiędzy czterema grupami leczonymi. Wstępna analiza działań niepożądanych i wyników badań laboratoryjnych wykazała, że cytykoliną była dobrze tolerowana we wszystkich dawkach. Jedyną znamienną statystycznie różnicę pomiędzy chorymi otrzymującymi cytykolinę w porównaniu z chorymi otrzymującymi placebo stanowiło częstsze występowanie zawrotów głowy i przypadkowych urazów, np. upadków. Jednakże, grupa chorych otrzymujących 500 mg cytykoliny nie wykazywała różnic w porównaniu z grupą placebo w odniesieniu do tych parametrów.

Biorąc pod uwagę stopień skuteczności dawki dziennej 500 mg i brak istotnych różnic w działaniach niepożądanych pomiędzy grupąotrzymującątę dawkę a grupąplacebo, z powyższego badania wynika, że 500 mg dziennie wydaje się stanowić dawkę optymalną.

Jakkolwiek jest możliwe podawanie samego składnika czynnego, korzystne jest podawanie składnika czynnego w postaci preparatu farmaceutycznego.

Preparaty zawierające składnik czynny, nadające się do podawania doustnego, mogą być wytwarzane w postaci oddzielnych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki, tabletki lub pastylki do ssania; w postaci proszku lub granulatu do rozpuszczania; w postaci roztworu lub zawiesiny w wodzie lub w innym płynie; lub w postaci emulsji typu olej w wodzie lub typu woda w oleju. Składnik czynny można wytwarzać również w postaci glinki, powidełek lub pasty.

185 124

Preparaty składnika czynnego nadające się do podawania pozajelitowego mogą stanowić jałowe wodne preparaty składnika czynnego. Preparaty można wytwarzać w postaci pojedynczych dawek i można je wytwarzać dowolnymi sposobami znanymi ze stanu techniki farmaceutycznej.

Powyższe preparaty oprócz standardowych dobrze znanych zaróbek i/lub nośników farmaceutycznych mogą zawierać również inne substancje terapeutycznie czynne. Kompozycja według wynalazku zawiera skuteczną ilość ilość cytykoliny i skuteczną ilość drugiego terapeutycznie środka, którym jest aspiryna lub 10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-5,10-iminy maleinian (MK-801), lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku.

Talk więc zgodnie z wynalazkiem, po incydencie niedokrwiennym choremu podaje się jednocześnie pierwszą dawkę skutecznej ilości cytykoliny i drugiego środka terapeutycznego lub jego odpowiedniej farmaceutycznie dopuszczalnej soli, krótko po wystąpieniu incydentu niedokrwiennego, jednak, korzystnie, nie później niż po około 24 godzinach od jego wystąpienia. Po tej pierwszej dawce można nadal podawać jednocześnie jedną lub więcej kolejnych dawek skutecznych ilości samej cytykoliny, oraz jeszcze drugi środek terapeutyczny, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Pierwszą dawkę obu środków można podawać w ciągu około 12 do około 15 godzin po wystąpieniu incydentu niedokrwiennego. Termin „podawanie obu środków” oznacza podawanie cytykoliny i drugiego środka terapeutycznego, lub ich odpowiednich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, jednocześnie lub sekwencyjnie.

W terapii łączonej podaje się kolejne dawki, korzystnie, przez co najmniej około 30 dni. W szczególnych wykonaniach wynalazku, podawanie kolejnych dawek obu środków prowadzi się co najmniej przez około 4-8 tygodni, korzystnie, przez okres co najmniej około pół roku do około roku. Ponadto, pierwszą lub następne dawki obu środków podaje się jeden lub więcej razy dziennie przez z góry wyznaczony czas. Zakłada się, że terapia łączona jest najbardziej wskazana u chorych po urazie głowy lub udarze mózgu. Zgodnie z tym, terapia łączona obejmuje podawanie drugiego środka terapeutycznego. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem kompozycja do leczenia chorego po incydencie niedokrwiennym, zawierająca skuteczną ilość cytykoliny i drugi środek terapeutyczny, lub ich odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne sole w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. W takim preparacie skuteczna ilość składników czynnych może być zmienna w zależności od konkretnego zastosowania. Typowo, preparaty te będą zawierać od około 100mg do około 1000mg cytykoliny, i od około 10mg do około 500mg drugiego środka terapeutycznego.

Niniejszy wynalazek zilustrowano poniższymi przykładami jednak rozumie się, że zakres wynalazku nie jest ograniczony do konkretnych szczegółów przedstawionych w tych przykładach.

Przykłady

Przykład I. Próba na zwierzętach I

Ochronne działanie cytykoliny na tkankę mózgową udowodniono na modelu krótkotrwałego niedokrwienia mózgu u szczura, u którego zamknięto szwem tętnicę środkową mózgu (MCA). Podawanie 500mg/kg cytykoliny istotnie ograniczało średnią objętość udaru w porównaniu z grupą kontrolną. 30 samców szczurów szczepu Sprague-Dawleya, o masie ciała od 280 do 350 g, podzielono losowo na trzy grupy po 10 szczurów: 10 zwierząt otrzymywało następnie 500mg/kg cytykoliny, 10 zwierząt otrzymywało 100mg/kg cytykoliny, a 10 zwierząt kontrolnych otrzymywało sól fizjologiczną, stanowiącą rozczynnik cytykoliny.

Wszystkie zwierzęta znieczulono, podając dootrzewnowe 400 mg/kg wodzianu chloralu. Do lewej tętnicy udowej założono cewnik z polietylenu PE-50 w celu ciągłego monitorowania ciśnienia tętniczego krwi i pobierania próbek krwi do analizy gazometrycznej. Pomiarów dokonywano przed zabiegiem, godzinę po niedokrwieniu i dwie godziny po niedokrwieniu, przed reperfuzją. Temperaturę w odbycie w czasie zabiegu i zamknięcia MCA utrzymywano na poziomie 37°C za pomocą, lampy grzewczej kontrolowanej termostatycznie.

185 124

Dokonano przeznaczyniowego zamknięcia prawej MCA, jak to opisano uprzednio. Por. Minematsu K i wsp., Neurology (1992) 42:235-240; Zea Longa E i wsp., Stroke (1989) 20:84-91. Pokrótce, prawą tętnicę szyjną wspólną i prawą tętnicę szyjną zewnętrzną odsłonięto poprzez nacięcie w linii pośrodkowej szyi. Dystalny odcinek CCA i tętnicę szyjną zewnętrzną podwiązano szwem jedwabnym o grubości 3-0. Poprzez arteriektomię CCA wprowadzono do tętnicy szew nylonowy monofilamentowy 4-0 (o długości 40 mm), którego koniec zaokrąglono przez ogrzewanie nad płomieniem, i następnie powleczono silikonem (Bayer, Leverkusen, Niemcy); szew delikatnie wprowadzano dalej do tętnicy szyjnej wewnętrznej. Po umieszczeniu w odległości około 17 mm od miejsca podziału tętnicy szyjnej wspólnej koniec szwu zamyka jednostronnie bliższy koniec tętnicy mózgu przedniej, początek MCA i tętnicę łączącą tylną. Dla zapobieżenia krwawieniu CCA luźno podwiązano nieco dystalnie od miejsca arteriotomii szwem jedwabnym 3-0. Po 110 minutach niedokrwienia zwierzętom podano dootrzewnowo 500 mg/kg cytykoliny; 100 mg/kg cytykoliny lub 0,3 ml rozczynnika - soli fizjologicznej (grupa kontrolna). Następnie, to znaczy po całkowitym okresie niedokrwienia wynoszącym dwie (2) godziny, usunięto szew zamykający MCA i cewnik z tętnicy udowej, umożliwiając reperfuzję tkanki. Zwierzęta pozostawiono do pełnego wybudzenia ze znieczulenia, pozwalając im swobodnie jeść i pić. Takie podawanie cytykoliny powtarzano przez dalszych 6 dni.

W siódmym dniu leczenia zwierzęta ponownie znieczulono, podając dootrzewnowo 400 mg/kg wodzianu chloralu, a następnie odcięto im głowy. Szybko wydobyto mózgi, obejrzano je dla potwierdzenia, że nie doszło do krwawienia podpajęczynówkowego, po czym mózgi pokrojono w płaszczyźnie wieńcowej na sześć 2 mm skrawków. Skrawki mózgu inkubowano przez 30 minut w 2% roztworze chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazolowego (TTC) w temperaturze 37°C, i utrwalono przez immersję w 10%o zbuforowanym roztworze formaliny. TTC barwi prawidłową tkankę mózgową (z nienaruszoną błoną komórkową) na czerwono; tkankę niedokrwioną - na różowo, a tkankę martwiczą - na biało. Sześć skrawków mózgu od każdego zwierzęcia wybarwiono TTC i sfotografowano, stosując aparat fotograficzny typu Charge Couple (EDC-1000HR, Computer Camera, Electrim Corporation, Princeton, New Jersey), z zachowaniem obrazu w pamięci mikrokomputera.

Ponieważ wiadomo, że obrzęk mózgu wpływa na pomiar wielkości udaru, zastosowano program komputerowy obróbki obrazu (Bio Scan OPTIMAS, Edmonds, Washington) do obliczenia właściwej objętości udaru. Właściwą powierzchnię udaru obliczano stosując równanie: właściwa powierzchnia udaru = powierzchnia lewej półkuli minus (powierzchnia lewej półkuli minus powierzchnia udaru). Właściwą objętość udaru obliczano mnożąc właściwą powierzchnię udaru przez grubość skrawka.

Pięć spośród dziesięciu zwierząt w grupie kontrolnej zdechło w okresie między 24 a 48 godzinami po zamknięciu MCA. W grupie otrzymującej 100 mg/kg zdechło pięć z dziesięciu zwierząt; cztery między 24 a 48 godzinami i jedno w dniu 5. W grupie otrzymującej 500 mg/kg zdechło trzy z dziesięciu zwierząt; dwa między 24 a 48 godzinami i jedno w dniu 6.

Jak to przedstawiono na fig. 1, średnia objętość udaru w grupie kontrolnej wynosiła 243,5 ± 88,6 mm³ (średnia ± odchylenie standardowe); w grupie otrzymującej 100 mg/kg,

200,2 ± 19,9 mm3; w grupie otrzymującej 500 mg/kg, 125,5 ± 45,2 mm3. Różnica między średnimi wartościami objętości udaru była znacząca dla grupy kontrolnej w porównaniu z grupą otrzymującą 500 mg/kg (p < 0,01, test Scheffe'a). Jakkolwiek nie stwierdzono statystycznie znamiennej różnicy między grupą kontrolną a grupą otrzymującą 100 mg/kg, stwierdzono tendencje do mniejszej objętości udaru w grupie otrzymującej 100 mg/kg.

Przykład II. Próba na zwierzętach II - zachowanie

Samce szczurów z samoistnym nadciśnieniem tętniczym (SHR), o masie ciała około 250-300 g, poddano odwracalnemu zaniknięciu, o różnym czasie trwania, tętnicy mózgu środkowej (MCA) i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA). Pokrótce, po znieczuleniu zwierzęcia wodzianem chloralu (jednorazowe podanie dootrzewnowo 0,5 g/kg wodzianu chloralu w 1 ml soli fizjologicznej powoduje znieczulenie trwające co najmniej 2 godziny), drut ze stali

185 124 nierdzewnej o średnicy 0,005 cala (Smali Parts Inc., Miami, FL) umieszczono poniżej lewej MCA, do przodu od szczeliny nosowej, proksymalnie od miejsca podziału MCA i dystalnie od tętnic soczewkowato-prążkowych. Tętnicę następnie uniesiono i drut obrócono zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Następnie dokonano zamknięcia lewej CCA, stosując dwa atraumatyczne klipsy naczyniowe typu Heifetz, powodując w ten sposób zmniejszenie przepływu krwi w obszarze udaru (4 mm od miejsca zamknięcia MCA w kierunku grzbietowym) do wartości 4-8% wartości podstawowej sprzed niedokrwienia przez cały czas trwania niedokrwienia, co mierzono stosując Vasamedics Laser Flow Blood Perfusion Monitor. Po z góry ustalonym czasie zamknięcia CCA/MCA, wynoszącym 0-120 minut, spowodowano reperfuzję, usuwając najpierw klips naczyniowy z CCA, a następnie obracając drut przeciwnie do ruchu wskazówek zegara i usuwając go spod MCA.

Temperaturę mięśnia skroniowego utrzymywano na poziomie 36,5 ± 0,3°C, stosując lampę grzewczą i koc elektryczny. Ponieważ celem badania była analiza sprawności ruchowej, wyeliminowaliśmy uraz, jaki byłby wynikiem cewnikowania naczyń udowych; uraz ten mógłby również wpływać na zachowanie zwierzęcia. Tak więc nie badano zmian ciśnienia tętniczego krwi, pH, pO2 i pCO2 w czasie zabiegu. Temperaturę mózgu w czasie całego czasu trwania niedokrwienia i w pierwszych dwóch godzinach reperfuzji utrzymywano na poziomie

36,2 ± 0,4°C. CDP-cholinę podawano 15 minut po początku niedokrwienia w pojedynczej dawce 0,5 g/kg dootrzewnowo w 0,5-0,6 ml 0,9% NaCl i następnie codziennie w tej samej dawce przez 14 dni. Codziennie przygotowywano świeży roztwór CDP-choliny. Szczurom z grupy kontrolnej podawano zamiast roztworu CDP-choliny samą sól fizjologiczną.

Analizy morfometryczne przeprowadzono 14 dni po niedokrwieniu, po zakończeniu całego badania behawioralnego. Pozwoliło to na bezpośrednią korelację stanu behawioralnego i obrazu histologicznego u tych samych zwierząt. 14 dni po zamknięciu MCA/CCA niedokrwiony mózg charakteryzuje się przede wszystkim zanikiem tkanki korowej w miejscu udaru. Tak więc, uszkodzenie niedokrwienne można ocenić ilościowo jako różnicę pomiędzy objętością kory po stronie przeciwnej od udaru i po stronie udaru.

dni po niedokrwieniu szczury uśmiercono w znieczuleniu wodzianem chloralu. Mózgi schłodzono i podzielono na skrawki o grubości 2 mm. morfometryczne oznaczenie powierzchni kory po stronie udaru i po stronie przeciwnej w każdym skrawku przeprowadzono stosując komputerowy analizator obrazu Drexel University (DUMAS), skalibrowany dla uzyskania wyniku w milimetrach kwadratowych. Objętość (mm3) kory obliczano sumując pola kory w kolejnych skrawkach i mnożąc przez wielkość odstępu między skrawkami. Na koniec, obliczano objętość zaniku, odejmując objętość kory po stronie udaru od objętości kory po stronie przeciwnej u tego samego szczura. Badacz wykonujący analizę morfometryczna nie wiedział, do której grupy terapeutycznej należało dane zwierzę.

Badania behawioralne

Dla oceny stanu czynnościowego po niedokrwieniu stosowano następującą baterię testów, które w uprzednich badaniach uznano za odpowiednie i standardowe w tym modelu.

1. Koło

Stosowano koło do biegania dla szczurów, o średnicy 30,3 cm i szczeblach rozmieszczonych co 2 cm/ przy czym oba boki koła były zasłonięte kartonem, z pozostawieniem klapy z zaniknięciem, którą można otwierać i zamykać w celu umieszczenia i utrzymania zwierząt wewnątrz koła. Szczury umieszczano wewnątrz koła, które z kolei umieszczono w klatce, po czym filmowano bieg szczura. Obserwowano sto kroków przednią łapą kontralateralną(po przeciwnej stronie ciała) do półkuli mózgu, w której dokonał się udar, i jednocześnie notowano liczbę ześlizgnięć się tej łapy między szczeble koła. Prowadzono podobne obserwacje przedniej łapy ipsilateralnej (po tej samej stronie ciała, co uszkodzenie) i łap tylnych, notując liczbę ześlizgnięć (błędów) na liczbę kroków każdej kończyny. Następnie obliczono liczbę błędów, odejmując błędy ipsilateralne od błędów kontralateralnych. Każde zwierzę badano jeden raz dziennie w dniach 4,7 i 10 po zabiegu.

185 124

2. Zginanie kończyny

Szczury unoszono za ogon, tak aby uwidocznić dla obserwatora, na 10 sekund, powierzchnię brzuszną. Mierzono stoperem czas trwania asymetrycznego zgięcia kończyny. Zwierzęta badano jeden raz dziennie (dwie próby dziennie) w dniach 1-14 po zabiegu.

3. Test taśmowy

Ten test asymetrii i wycofywania się asymetrii został uprzednio opisany i szczegółowo scharakteryzowany przez Schallerta i Whishawa. Pokrótce, samoprzylepne naklejki Ayer/ego (kółka o średnicy 1 cm) umieszczano na przednich łapach szczura w dystalno-promieniowym obszarze nadgarstka. Ustalano czas potrzebny zwierzęciu do dotknięcia i usunięcia każdej z naklejek, i kolejność: kontralateralne w stosunku do ipsilateralnych, w której zwierzę zdejmowało naklejki; czas ten stosowano dla przybliżonej oceny asymetrii ipsilateralnej. Następnie umieszczano większe naklejki na mniej preferowanym nadgarstku i odpowiednio mniejsze naklejki na drugim nadgarstku, wygaszając odchylenie i jednocześnie oceniając je ilościowo w zależności od niezbędnych rozmiarów naklejek. Im większy stosunek powierzchni naklejki ipsilateralnej do kontralateralnej (wynoszący od 1:1 do 1/8:15/8), niezbędny do wygaszenia odchylenia, tym większa liczba punktów (od 1 do 7) w ocenie danego szczura, odzwierciedlająca większe uszkodzenie. Nie stosowano tresury wstępnej, jedynie otaczano szczury bardziej troskliwą opieką przez co najmniej 7 dni przed zabiegiem. Każde zwierzę badano w dniach 2-3 po zabiegu (jedna próba dziennie).

Przed i po zabiegu wszystkie zwierzęta trzymano w pojedynczych klatkach w izolowanym pomieszczeniu, zapewniającym jak najmniej stresujące środowisko. Prowadzono co najmniej 2 tygodnie adaptacji, w czasie którym zwierzętami zajmował się ten sam badacz, który przeprowadzał potem wszystkie testy behawioralne; adaptację prowadzono codziennie, co najmniej 10 minut dziennie na jedno zwierzę. Adaptację prowadzono dla zmniejszenia odpowiedzi stresowej na dotyk; adaptacja miała kluczowe znaczenie szczególnie dla właściwego przebiegu testu taśmowego. Badacz prowadzący badania behawioralne nie wiedział, do której grupy terapeutycznej należało dane zwierzę.

Skala Zbiorcza Zaburzeń Behawioralnych

Obliczono skalę zaburzeń behawioralnych, stanowiącą podsumowanie trzech pojedynczych testów z uwzględnieniem liczby błędów (ześlizgnięcia/kroki; koło), czas (zginanie kończyn) lub liczbę punktów (powierzchnia niezbędna do wygaszenia odchylenia; test taśmowy) w celu ilościowej oceny zaburzenia czynności behawioralnych.

Po pierwsze obliczono średnią liczbę punktów z wykonania przez poszczególne szczury każdego z testów. W każdym teście behawioralnym uśredniano dwie najniższe wartości i odejmowano od średniej z dwóch wartości najwyższych. Zakres ten dzielono następnie na pięć równych przedziałów, po czym punktowano od 0 do 4. Następnie oceniliśmy zbiorczą skalę z wszystkich trzech testów, przypisując każdemu testowi równą wartość. Następnie wszystkie szczury oceniono w punktach w trzech testach oddzielnie i podano całkowitą punktację, przy czym maksymalna liczba punktów (maksymalny deficyt) wynosił 3x4=12.

Korelacja między czasem trwania niedokrwienia, a objętością udaru i zaburzeniami behawioralnymi

Skalę zaburzeń behawioralnych i obliczoną, objętość zaniku (mm³) wykorzystano do ustalenia korelacji między czasem trwania niedokrwienia a liczbą punktów w skali zaburzeń behawioralnych lub objętością zaniku u zwierząt nieleczonych i u zwierząt otrzymujących CDP-cholinę.

Wartości w skali zbiorczej lub objętość zaniku wprowadzano do komputera i poddawano analizie programem komputerowym dopasowywania krzywych ALLFIT dla uzyskania krzywej obrazującej korelację między zaburzeniem behawioralnym/objętością zaniku a czasem trwania niedokrwienia w zakresie maksymalnego zaburzenia behawioralnego/maksymalnej objętości zaniku (BD„_ax/Vol_max), wywołanych przez długotrwałe niedokrwienie, w zakresie czasu niezbędnego do wywołania połowy w zakresie maksymalnego zaburzenia behawioralnego/maksymalnej objętości zaniku (bD₅₀/T₅₀), jak również kształtu i nachylenia

185 124 krzywej. Program komputerowy (ALLFIT), wykorzystany do przeprowadzenia tej analizy, stosuje funkcję logistyczną y=(a-d)/[1+(xXc)b]+d, w którym y stanowi liczbę punktów w skali zaburzeń behawioralnych, x stanowi czas trwania niedokrwienia, a stanowi odpowiedź przy x=0, d stanowi BDm_X-Vol_m._łx b stanowi czynnik nachylenia, określający stromość krzywej, a c stanowi BD₅₀ /T_5Q. Program ten opracowano w celu jednoczesnego dopasowywania rodziny sigmoidalnych krzywych obrazujących zależność dawki i odpowiedzi; program otrzymano z Laboratorium Biologii Teoretycznej i Fizycznej NIH.

Analiza statystyczna

Obliczono statystyczną różnicę BD₅₀/T₅₀ i BD XVol_iTax między obiema grupami, stosując logarytm średniej i logarytm błędu standardowego porównywanych wartości, otrzymanych z użyciem programu ALLFIT, i oceniono je testem t-Studenta.

Wyniki

1. Badania histologiczne - analiza objętości zaniku

Analizowano 18 i 23 szczury, odpowiednio, z grupy kontrolnej, otrzymującej sól fizjologiczną, i z grupy otrzymującej CDP-cholinę. CDP-cholina, podawana przez 14 dni, istotnie (p < 0,05) wydłużała czas trwania niedokrwienia przed reperfuzją potrzebny do wywołania połowy zaniku maksymalnego (T50) .

T50, obliczane przez program ALLFIT, dla zwierząt kontrolnych (nieleczonych) wynosił

38,3 ± 5,9 min, a dla zwierząt otrzymujących CDP-cholinę - 60,5 ± 4,3 min. CDP-cholina w tym modelu nie zmniejszała maksymalnej objętości udaru; Volma wynosiła 103,3 ± 13,6 mm³w porównaniu ze 101,6 ± 11,4 mm3 dla, odpowiednio, grupy kontrolnej i grupy otrzymującej CDP-cholinę. Powyższe wyniki sugerują, że CDP-cholina może pierwotnie zmniejszać uszkodzenie morfologiczne po względnie krótkotrwałym niedokrwieniu, które powoduje uszkodzenie submaksymalne. Wyniki te podkreślają również konieczność podawania cytykoliny krótko po wystąpieniu incydentu niedokrwiennego, tzn. jak najszybciej.

2. Analiza behawioralna

Analizowano 16 szczurów nieleczonych i 21 otrzymujących CDP-cholinę. Podawanie CDP-choliny istotnie wydłużało BD5₀ w podobny sposób, jak to stwierdzano w analizie histologicznej.

BD50J u szczurów z grupy kontrolnej wynosił 41,9 ± 4,6 minuty, natomiast u szczurów otrzymujących CDP-cholinę leczenie wydłużało BD50 około 30 minut do 72,9 ± 24,5 min. Leczenie CDP-choliną nie wywierało istotnego wpływu na BD ; wartości wynosiły, odpowiednio, 8,5 ± 0,7 i 10,1 ± 4,0 dla szczurów z grupy kontrolnej i szczurów otrzymujących CDP-cholinę.

Dane te wskazują, że długotrwałe leczenie CDP-choliną pozwala na uzyskanie znaczącej poprawy zarówno stanu histologicznego, jak i czynnościowego, wydłużając T50 i BD50 CDP-choliną nie wpływa jednak w tym, przypadku na Volma , BDm_ax. Wyniki te sugerują, że skuteczność CDP-choliny jest większa u zwierząt z submaksymialnym uszkodzeniem niedokrwiennym, które w tym modelu jest wywoływane przez niedokrwienie trwające 30-75 minut.

Podwójnie ślepa próba kliniczna kontrolowana placebo

Z przeglądu dwóch prób klinicznych i 17 innych badań, opisanych w piśmiennictwie, można wywnioskować, że cytykolina (w dawkach od 250 do 1000 mg dziennie) wydaje się być dobrze tolerowana przez chorych po udarze mózgu lub urazie głowy przy podawaniu cytykoliny przez okres od 5 dni do 8 tygodni. We wszystkich badaniach opisanych w piśmiennictwie (ponad 50 badań) cytykolina była dobrze tolerowana również w innych populacjach pacjentów. Działania niepożądane nie miały zwykle znaczenia klinicznego z wyjątkiem przypadków śmierci z powodu ciężkości niedokrwienia (co nie jest nieoczekiwane w tych badanych populacjach). Nie stwierdzano klinicznie istotnych zmian parametrów laboratoryjnych, czynności serca i ciśnienia tętniczego krwi ani elektrokardiogramu.

Celem niniejszego badania była ocena wpływu trzech dawek cytykoliny (500 mg, 1000 mg i 2000 mg) w porównaniu z placebo u chorych po ostrym udarze niedokrwiennym mózgu.

185 124

1. Schemat/sposób dawkowania

Chorym zrandomizowanym przed godziną 15⁰⁰ podawano dwie tabletki w momencie włączenia do badania i dwie tabletki przy następnym posiłku, w sumie cztery tabletki w dniu randomizacji. Pozostałym chorym podawano dwie tabletki (dawka poranna) w momencie włączenia do badania, a pozostałych dwóch tabletek dla Dnia I (dawka wieczorna) nie wykorzystywano. W pozostałym czasie trwania badania chorym podawano dwie tabletki rano i dwie tabletki wieczorem (por. poniższy Schemat Leczenia). Chorym, którzy nie byli w stanie przełknąć tabletki badanego leku w całości, lek można podawać przez sondę wprowadzoną przez nos do żołądka lub poprzez pokruszenie tabletek i domieszanie ich do jedzenia lub napojów.

Faza leczenia

Lek badany podawano dwa razy dziennie (dwie tabletki rano i dwie tabletki wieczorem) przez sześć tygodni).

Skuteczność poszczególnych dawek cytykoliny oceniano w skali Barthela. Do wtórnych wskaźników skuteczności, stosowanych w niniejszym badaniu, należą wynik w skali Barthela w tygodniu 12. (wynik co najmniej 61 uważa się za powodzenie leczenia), w zmodyfikowanej skali Rankina, w całościowej skali udarowej NIH, w części skali udarowej NIH dotyczącej czynności ruchowych, liczba dni do dnia wypisu ze szpitala, śmiertelność i wyniki innych testów neuropsychologicznych. Skala udarowa NIH i skala Barthela stanowią standardowe sposoby ilościowej oceny objawów udaru i sprawności w życiu codziennym.

Podwójnie ślepa, kontrolowana placebo próba kliniczna wykazała, że u chorych otrzymujących 500 mg cytykoliny dziennie ponadd^ukrotnie częściej nie stwierdzano deficytów neurologicznych lub stwierdzano tylko minimalne deficyty neurologiczne po 12 tygodniach po udarze w porównaniu z chorymi placebo, według wyniku w skali NIH, i 1,6 razy częściej nie stwierdzano deficytów neurologicznych lub stwierdzano tylko minimalne deficyty neurologiczne według wyniku w skali Barthela.

Badania techniką magnetycznego rezonansu jądrowego (MRI) zależnego od dyfuzji - DWI

Metoda DWI pozwala na wykrycie, w ciągu pierwszych minut po wystąpieniu niedokrwienia, obszarów uszkodzenia niedokrwiennego; na modelach zwierzęcych udowodniono użyteczność DWI w monitorowanym leczeniu neuroprotekcyjnym. Próby kontrolowane placebo sugerują, że cytykolina zmniejsza rozmiary udaru w modelu szczurzym krótkotrwałego zamknięcia tętnicy, jak to opisano powyżej.

Niniejsze badania obejmowały dwunastu chorych z podwójnie ślepej, kontrolowanej placebo próby klinicznej fazy III cytykoliny (500/1000/2000 mg dziennie doustnie przez 6 tygodni) w ostrym okresie udaru mózgu (obszar unaczynienia MCA, poniżej 24 godzin od wystąpienia objawów). Powyżej przedstawiono protokół i wyniki całości badania. W ostrej fazie udaru i po udarze wykonano badanie techniką MRI - wielowarstwowe echowe planarne DWI T₂-zależne. To znaczy, wykonano zdjęcia DWI na początku badania (czyli między 8 a 24 godziną po wystąpieniu objawów, tzn. po domniemanym czasie dokonania się udaru) i co najmniej jeszcze jeden raz w trakcie leczenia. Średni czas obserwacji wynosił 9,3 tygodni (4,1-26,3 tygodni; mediana 6,6 tygodni). Pomiaru objętości uszkodzenia dokonywało dwukrotnie po trzech badaczy, których nie informowano o stanie klinicznym chorego ani o tym, do której grupy terapeutycznej dany chory należy. Oznaczano następnie procentową zmianę objętości udaru między obrazem z początku udaru a drugim obrazem, po leczeniu. U trzech spośród czterech chorych otrzymujących placebo stwierdzono powiększenie uszkodzenia, natomiast u siedmiu z ośmiu chorych otrzymujących cytykolinę stwierdzono zmniejszenie objętości uszkodzenia (4/5 w grupie 500 mg; 3/3 w grupie 2000 mg). Test chi-kwadrat trendu w oparciu o dawkę wykazywał znamienność przy p=0,031. W teście dokładnym Fishera uzyskano wartość p=0,067. Wyniki te porównano z serią zdjęć chorych uprzednio leczonych w tym samym ośrodku (n=31), wykonywanych w ten sam sposób. Z 31 chorych u 22

185 124 stwierdzano zwiększenie objętości udaru, u 7 zmniejszenie objętości udaru, a u 2 objętość udaru nie uległa zmianie. Spośród 4 chorych otrzymujących placebo w niniejszym badaniu, u 3 doszło do zwiększenia objętości udaru, a u jednego do zmniejszenia, co stanowi dokładnie taką samą proporcję, jak w kontrolnej grupie chorych uprzednio leczonych w tym samym ośrodku. Spośród ośmiu chorych leczonych sposobem według wynalazku (5 otrzymujących 500 mg dziennie i 3 otrzymujących 2000 mg dwa razy dziennie), u siedmiu objętość udaru zmniejszyła się, a u jednego zwiększyła się.

Badano odsetek chorych, u których doszło do zmniejszenia objętości udaru przy leczeniu sposobem według wynalazku w stosunku do chorych uprzednio leczonych w tym samym ośrodku (tzn. 22/7 w stosunku do 1/7), z użyciem testu dokładnego Fishera; stwierdzono, że różnica na korzyść wynalazku była znamienna (p=0,0021). Tak więc, biorąc pod uwagę wyniki DWI, z niniejszych badań wynika, że uzyskano istotne zmniejszenie objętości udaru przy leczeniu niedokrwienia cytykoliną, pod warunkiem rozpoczęcia leczenia jak najwcześniej po incydencie niedokrwiennym i kontynuowania tego leczenia przez okres do kilku tygodni.

Terapia łączona

40-60 samców szczurów szczepu Sprague-Dawleya, o masie ciała 280-365 g, po posiłku znieczulono, podając dootrzewnowo wodzian chloralu (400 mg/kg masy ciała). Wodzian chloralu w dawce 100 mg/kg podawano periodycznie po pierwszym wstrzyknięciu celem utrzymania stanu znieczulenia w czasie zabiegu chirurgicznego. Stan znieczulenia utrzymywano tylko przez 90 minut zamknięcia tętnicy. Do żyły głównej dolnej celem podawania leku wprowadzano cewniki przez lewą żyłę udową. Monitorowano temperaturę ciała szczura i utrzymywano ją na poziomie 37°C w całym czasie znieczulenia.

Stosowano model zamknięcia MCA szwem wprowadzonym do światła naczynia; model ten opisano szczegółowo w piśmiennictwie. Por. Minematsu K i wsp., Neurology (1991) 42: 235-240. Pokrótce, do światła naczynia, w celu jego zamknięcia, przez podwiązaną CCA wprowadzano monofilamentowy szew nylonowy z czubkiem zaokrąglonym przez ogrzewanie nad płomieniem do tętnicy szyjnej wewnętrznej, a następnie delikatnie przesuwano do wnętrza czaszki, około 17 mm od miejsca podziału CCA. Szew jednostronnie zamyka proksymalny odcinek tętnicy mózgu przedniej, dystalny odcinek tętnicy szyjnej wewnętrznej i początek MCA i tętnicy łączącej tylnej.

Zwierzęta podzielono na cztery grupy: (i) otrzymujących antagonistę NMDA (ii) otrzymujących sól fizjologiczną i cytykolinę (iii) otrzymujących antagonistę NMDA i cytykolinę i (iv) grupę kontrolną otrzymującą sól fizjologiczną. U 10-15 szczurów prowadzono powolny wlew dożylny 0,5 mg/kg masy ciała MK-801 (antagonisty NMDA) w 1 ml/kg soli fizjologicznej przez 5 minut po zamknięciu MCA. W 8 i 20 godzinie po zamknięciu MCA podawano dootrzewnowe dawki podtrzymujące 0,5 mg/kg MK-801. W drugiej grupie 10-15 innych szczurów w tych samych punktach czasowych, co w grupie otrzymującej antagonistę NMDA, podawano identyczną objętość soli fizjologicznej, jednakże jednocześnie podawano dootrzewnowe 500 mg/kg cytykoliny w 5 minucie, 8 godzinie i 20 godzinie po zamknięciu MCA. W trzeciej grupie 10-15 innych szczurów powtarzano schemat leczenia antagonistą NMDA, z tą różnicą, że podawano również 500 mg/kg cytykoliny dootrzewnowo w 5 minucie, 8 godzinie i 20 godzinie po zamknięciu MCA. W czwartej, ostatniej grupie 10-15 innych szczurów podawano identyczne objętości soli fizjologicznej w tych samych punktach czasowych, co w grupie otrzymującej antagonistę NMDA.

Zwierzęta pozostawiono do pełnego wybudzenia ze znieczulenia, pozwalając im swobodnie jeść i pić. Po ewentualnej ocenie neurologicznej zwierzęta ponownie znieczulono, podając dootrzewnowo 300 mg/kg wodzianu chloralu, po czym natychmiast odcięto im głowy. Szybko wydobyto mózgi, obejrzano je dla potwierdzenia zamknięcia MCA szwem w świetle naczynia, podzielono w płaszczyźnie wieńcowej w odstępach co 2 mm, barwiono 2% roztworem chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazolowego (TTC) w temperaturze 37°C przez 30 minut, i utrwalono przez imersje w 10% zbuforowanym roztworze formaliny. Wykonano zdjęcia wybarwionych TTC przekrojów mózgu poszczególnych zwierząt w celu ilościowej

185 124 oceny rozmiarów udaru. Powiększone zdjęcia poddano ocenie przez badaczy, którym nie było wiadomo, do której grupy należało dane zwierzę. Powierzchnię nie zabarwiona przez TTC na czerwono uważa się za powierzchnię objętą udarem. Objętość udaru (mm³) obliczano z zastosowaniem integracji numerycznej powierzchni udaru wszystkich przekrojów TTC poszczególnych zwierząt i odstępów między tymi przekrojami. Przeprowadzono standardowe testy dla oceny znamienności różnic w monitorowanych zmiennych fizjologicznych oraz powierzchni i objętości udaru w poszczególnych grupach. Dwustronną wartość prawdopodobieństwa poniżej 0,05 uważa się za znamienną.

Stwierdzono, że w trzech grupach szczurów otrzymujących któryś z rodzajów leczenia nastąpiło statystycznie znamienne zmniejszenie objętości udaru w porównaniu z grupą kontrolną. I tak, stwierdzono, że o ile w dwóch grupach szczurów otrzymujących tylko antagonistę NMDA lub tylko cytykolinę doszło do zmniejszenia objętości udaru w porównaniu z grupą kontrolną, parametry w trzeciej grupie szczurów, otrzymujących połączenie antagonisty NMDA i cytykoliny są znacznie lepsze, niż we wszystkich pozostałych grupach. Można zatem wykazać nieoczekiwany trend w kierunku działania synergistycznego. Szczury z trzeciej grupy uzyskały również wyższą punktację w ocenie neurologicznej. Podobne korzyści stwierdza się przy łączeniu cytykoliny z innymi proponowanymi środkami terapeutycznymi, dobranymi z grupy opisanej powyżej, włączając w to, jednak bez ograniczenia do nich, tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA), streptokinazę i urokinazę. Po pierwszej dawce leczenia łączonego można podawać jedną lub więcej następnych dawek samej cytykoliny, co najmniej jedną dawkę samego środka terapeutycznego lub obu środków terapeutycznych, w zależności od konkretnego przypadku.

1. Cytykolina i aspiryna

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również jednoczesne podawanie cytykoliny i aspiryny w ramach terapii łączonej, w której cytykolinę i aspirynę podaje się jednocześnie lub sekwencyjnie krótko po wystąpieniu incydentu niedokrwiennego (w rzeczywistości stwierdzenie, że „incydent” stanowi udar niekrwotoczny - i, co za tym idzie, że udar może być pochodzenia niedokrwiennego, zatorowego lub innego, jest wystarczające do rozpoczęcia terapii łączonej). Podawać można różne ilości aspiryny i cytykoliny w zależności od zapotrzebowania danego pacjenta. Typowo jednakże podaje się od około 50 do około 500 mg (korzystnie, około 70 do 300 mg)aspiryny na dawkę, i około 100 mg do około 1000 mg (korzystnie, od około 300 do 700 mg) cytykoliny lub jej soli na dawkę. W korzystnym wykonaniu podaje się jeden lub dwa razy dziennie, krótko po wystąpieniu udaru, preparat zawierający około 70-90 mg aspiryny i około 400-600 mg cytykoliny lub jej soli w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Terapię łączoną można prowadzić przez co najmniej 30 dni, korzystnie, do kilku tygodni, najkorzystniej, przez kilka miesięcy. Najkorzystniej, leczenie utrzymuje się przez około pół roku do około roku w celu zmniejszenia do minimum uszkodzenia tkanki, optymalizacji zdrowienia pacjenta i zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia drugiego epizodu udarowego lub podobnego.

Zgodnie z powyższym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest terapia łączoną, polegającą na jednoczesnym podawaniu cytykoliny i co najmniej jeszcze jednego środka terapeutycznego krótko po wystąpieniu incydentu niedokrwiennego. Podawanie obu środków można prowadzić jednocześnie lub sekwencyjnie. Przy sekwencyjnym podawaniu obu środków korzystne jest, żeby rozpocząć podawanie cytykoliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli i co najmniej jeszcze jednego środka terapeutycznego w ciągu pierwszych 24 godzin po wystąpieniu incydentu niedokrwiennego.

Inne wykonania będą oczywiste dla specjalistów w świetle niniejszego szczegółowego opisu; wykonania te pozostają w zakresie niniejszego wynalazku. Na przykład, zamiast aspiryny można stosować dipirydamol itp. Tak więc, powyższych korzystnych wykonań nie należy uważać za ograniczenie wynalazku w jakimkolwiek stopniu.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalnej soli do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek ma postać do podawania doustnego.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek zawiera skuteczną ilość cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól w dawce od 100 mg do 4000 mg dziennie.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że lek zawiera skuteczną ilość cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól w dawce od 100 mg do 2000 mg dziennie.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że lek zawiera skuteczną ilość cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól w dawce od 100 mg do 1000 mg dziennie.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że lek zawiera skuteczną ilość cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól w dawce 500 mg dziennie.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 3, albo 5, znamienne tym, że lek zawiera skuteczną ilość cytykoliny lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól w dawce 2 x 500 mg dziennie.
8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek stosuje się w przypadku niedokrwienia u ludzi.
9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 8, znamienne tym, że lek stosuje się w przypadku niedokrwienia mózgu.
10. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 8, znamienne tym, że przypadki niedokrwienia obejmują niedokrwienie mózgu, uraz głowy lub udar.
11. Zastosowanie cytykoliny oraz drugiego terapeutycznie skutecznego środka, którym jest aspiryna lub 10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-5,10-iminy maleinian (MK-801), lub ich farmaceutycznie akceptowalnych soli, do wytworzenia leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek stosuje się w przypadku niedokrwienia u ludzi.
13. Zastosowanie według zastrz. 11 albo 12, znamienne tym, że stosuje się go w przypadku niedokrwienia mózgu.
14. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że przypadki niedokrwienia obejmują niedokrwienie mózgu, uraz głowy lub udar.
15. Kompozycja terapeutyczna do wytwarzania leku przeznaczonego do ochrony tkanki mózgowej przed zawałem mózgu w wyniku niedokrwienia, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość cytykoliny i drugiego terapeutycznie skutecznego środka, którym jest aspiryna lub 10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-5,10-iminy maleinian (MK-801), lub ich farmaceutycznie opuszczalnych soli w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku.
16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera od 100 mg do 1000 mg cytykoliny i od 10 mg do 500 mg drugiego środka terapeutycznego.