ES2217538T3 - Composiciones para mejorar los efectos citoprotectores de compuestos fenolicos policiclicos mediante la interaccion sinergica con antioxidantes. - Google Patents
Composiciones para mejorar los efectos citoprotectores de compuestos fenolicos policiclicos mediante la interaccion sinergica con antioxidantes.Info
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Abstract
Se proporciona un procedimiento para potenciar el efecto citoprotector de los compuestos fenólicos policíclicos en una población celular que implica las etapas de administrar una combinación de compuestos fenólicos policíclicos y antioxidantes para alcanzar un efecto potenciado, que es mayor que el uso de cualquiera de los compuestos administrados por separado en condiciones similares. Un ejemplo de un antioxidante utilizado en el procedimiento es el glutation y un ejemplo de compuesto fenólico policíclico es un compuesto estrogénico. El efecto citoprotector ocurre en una variedad de tipos celulares diferentes, incluyendo células neuronales y células del sistema vascular.
Description
Composiciones para mejorar los efectos
citoprotectores de compuestos fénólicos policíclicos mediante la
interacción sinérgica con antioxidantes.
Se necesitan tratamientos que protejan las
células de la muerte celular causada por episodios de enfermedad,
traumatismo, aislamiento y extracción de tejidos o células del
cuerpo o exposición a toxinas. Esta necesidad se extiende a los
tratamientos para evitar la pérdida de células nerviosas asociada a
los trastornos neurodegenerativos agudos o traumatismos:
tratamientos para reducir la lesión tisular resultante de isquemia
en los que la isquemia puede haberse producido como resultado de
apoplejía, cardiopatía o una intervención de trasplante, u otra
intervención que produzca una limitación del suministro de
nutrientes a los tejidos; y el tratamiento para modular la muerte
celular asociada a condiciones como la osteoporosis o la anemia. La
ausencia de un tratamiento citoprotector eficaz puede dar como
resultado la pérdida de vida o un deterioro general de la calidad de
vida incluida la incapacidad permanente con costes sanitarios altos
para los pacientes, sus familias y los profesionales sanitarios. Un
enfoque para reducir al mínimo los cambios patológicos ha sido
intentar neutralizar el estrés oxidativo asociado a una acumulación
de radicales libres en el espacio extracelular. Mooradian [J.
Steroid Biochem. Molec. Biol. 45 (1993) 509-511] ha
notificado que ciertos estrógenos tienen propiedades antioxidantes
importantes en los estudios bioquímicos in vitro pero este
efecto no se observa con todos los estrógenos. Debido a la variación
de las propiedades antioxidantes observadas por Mooradian en sus
estudios bioquímicos, este autor concluyó que las moléculas
esteroides debían tener ciertos determinantes antioxidantes que aún
se desconocían. En WO 95/13076 se describen observaciones similares
relativas a los esteroides con anillos A fenólicos usando análisis
bioquímicos para comprobar la actividad antioxidante. Los análisis
usados por Mooradian y en WO 95/13076 fueron análisis bioquímicos y,
como tales, no examinaron directamente los efectos de estas
moléculas sobre las células. Sin embargo, el documento US 5.554.601
(1996) ha descrito pruebas en cultivos celulares para determinar un
procedimiento para conferir neuroprotección a una población de
células usando compuestos estrógenos que se basa en efectos
protectores demostrados en las células.
El daño oxidativo se ha asociado a diversas
enfermedades neurodegenerativas que incluyen la enfermedad de
Alzheimer (AD) y el proceso de envejecimiento [Benzi et al.
Free Radic. Biol. Med. 19, (1995); 77-101 y U.S.
5.554.601 incorporados en la presente memoria como referencia]. La
muerte celular también ocurre después de un evento isquémico
producido en el cuerpo resultante de la carencia de nutrientes que
puede estar asociada a la falta de oxígeno producida por una
oclusión en una localización cerebrovascular o cardiovascular, o
puede estar asociada a un traumatismo o una enfermedad.
Se necesitan mejores procedimientos para la
protección de los hombres y mujeres de las consecuencias de la
muerte celular anormal en los tejidos corporales.
En una realización de la invención, se
proporciona un procedimiento que confiere citoprotección a una
población de células, que incluye proporcionar un compuesto fenólico
policíclico y un compuesto antioxidante, y administrar el compuesto
fenólico policíclico y el compuesto antioxidante a la población de
células a una dosis eficaz para conferir citoprotección de modo tal
que el efecto citoprotector combinado del compuesto fenólico
policíclico y el compuesto antioxidante sea mayor que el efecto
aditivo de cada compuesto administrado por separado en condiciones,
por lo demás, similares.
Otra realización de la invención es un
procedimiento para conferir citoprotección a una población de
células de una persona que incluye los pasos necesarios para
proporcionar una dosis terapéutica combinada que contenga un
antioxidante y un compuesto fenólico policíclico en una formulación
farmacéutica, administrar la formulación a una dosis eficaz a la
población de células de modo tal que el efecto citoprotector que
produce la combinación en la persona sea mayor que el efecto aditivo
de cada compuesto proporcionado por separado; y proteger las células
de la persona que de lo contrario, en ausencia de la formulación
farmacéutica, se deteriorarían y morirían.
En otras realizaciones de la invención, el efecto
combinado puede ser un aumento de la citoprotección de
100-10.000 veces, más particularmente un aumento de
100-5.000 veces, más particularmente un aumento de
1.000-5.000 veces, como resultado del efecto
combinado del compuesto policíclico y el antioxidante en comparación
con cada compuesto proporcionado por separado. En otras
realizaciones de la invención, el compuesto fenólico policíclico es
un compuesto estrógeno, más particularmente, un compuesto estrógeno
que tiene una actividad sexual insustancial ejemplificado por el
isómero \alpha del estradiol. En ciertas realizaciones de la
invención, el antioxidante se selecciona de un grupo constituido por
un tiol, un fenol, un agente trampa de espín, una amina aromática,
un carotenoide, un flavonoide, un selenio, un aminoesteroide y una
ubiquinona. En otra realización de la invención, la citoprotección
incluye neuroprotección.
La Figura 1 muestra el efecto del glutatión (GSH)
y el 17\beta-estradiol sobre células neuronales
(células SK-N-SH) tratadas con la
proteína neurotóxica \beta-amiloide (\betaAP)
siendo \betaAP un péptido de 10 aminoácidos (aminoácidos
25-35), al que en lo sucesivo se hace referencia
como "\betaAP 25-35". Se muestran los efectos
del 17\beta-estradiol (2 nM) y el GSH (3,25
\muM) sobre la toxicidad inducida por \betaAP
25-35 (20 \muM) en células
SK-N-SH (10^{6} células/ml)
cultivadas en diferentes medios de cultivo celular que carecen de
GSH en la receta de cultivo celular. Las células se sembraron en
placas a razón de 10^{6} células/ml y se expusieron al vehículo,
\betaAP 25-35, 17\beta-estradiol
y GSH o una combinación de estos como se ha indicado. Los controles
representan el valor medio para los grupos vehículo, GSH,
17\beta-estradiol y GSH \pm
17\beta-estradiol; luego se los agrupó una vez que
las pruebas estadísticas determinaron que no eran significativamente
diferentes entre. Se representan los valores medios \pm SEM para
4-5 pocillos/grupo. * p < 0,05 frente a los
controles determinado por ANOVA seguido de la prueba de Scheffe
post-hoc.
La Figura 2 muestra el efecto del GSH y el
17\beta-estradiol sobre el número de células vivas
SK-N-SH tratadas con el neurotóxico
\betaAP 25-35 en presencia o ausencia de una dosis
no protectora de 17\beta-estradiol (2 nM). Las
células se sembraron en placas a razón de 10^{6} células/ml. El
efecto de la variación de las concentraciones de GSH en presencia de
17\beta-estradiol (triángulos sólidos) se comparó
con células tratadas con GSH en ausencia de
17\beta-estradiol (triángulos huecos). Se
representan los valores medios \pm SEM para 6 pocillos por grupo.
El efecto del 17\beta-estradiol sobre la respuesta
al GSH fue muy significativo (F = 41,48; p < 0,001). Una
comparación de los valores de CE_{50} para las diferentes curvas
de dosis y respuesta usando la prueba de suma de los rangos de
Mann-Whitney mostró una p = 0,036, donde CE_{50}
para \betaAP 25-35 \pm
17\beta-estradiol (2 nM) fue 0,041 \pm 0,025 y
\betaAP 25-35 (20 \muM) fue 82,5 \pm 60,4.
La Figura 3 muestra el efecto de GSH y
17\beta-estradiol sobre el número de células vivas
SK-N-SH expuestas a \betaAP
25-35 (20 \muM) a varias concentraciones de
17\beta-estradiol en presencia de 3,25 \muM de
GSH (triángulos sólidos) en comparación con los efectos en células
tratadas con 17\beta-estradiol en ausencia de GSH
(triángulos huecos). Se representan los valores medios \pm SEM
para 4 pocillos por grupo. El efecto de GSH sobre la respuesta al
17\beta-estradiol fue muy significativo (F =
44,33; p < 0,001). Una comparación de los valores de CE_{50}
para las diferentes curvas de dosis y respuesta, usando la prueba de
suma de rangos de Mann-Whitney, mostró una p <
0,057 donde el CE_{50} para \betaAP 25-35 \pm
GSH (3,25 \muM) fue 0,33 \pm 0,031, y para \betaAP
25-35 (20 \muM) fue 126 \pm 87,8.
La Figura 4 muestra los efectos de la dosis de
17\beta-estradiol sobre el número medio de
neuronas corticales primarias de rata por campo fotográfico cuando
se expusieron a \betaAP 25-35 en presencia y en
ausencia de una dosis no protectora de GSH. Las células se sembraron
y se expusieron a los tratamientos según se indicó anteriormente a
las dosis observadas. Se representan los valores medios \pm SEM
para 4-7 pocillos por grupo. El efecto del GSH sobre
la respuesta al 17\beta-estradiol fue muy
significativo (F = 8,53; p < 0,005). Una comparación de los
valores de CE_{50} para las diferentes curvas de dosis y
respuesta, usando la prueba de suma de rangos de
Mann-Whitney, mostró una p < 0,057.
La Figura 5 muestra los efectos de estratrienos
en presencia y en ausencia de GSH sobre la neurotoxicidad inducida
por \betaAP (25-35) inducida en células HT22. Los
símbolos representan:
| con GSH (3,25 \mum) | sin GSH |
| -\circ- 17\beta-estradiol | -\bullet-17\beta-estradiol |
| -\Delta-\alpha-estradiol | -\blacktriangle- \alpha-estradiol |
| -\Box- E-3-ol | -\blacksquare- E-3-O |
La Figura 6 muestra los efectos del
17\beta-estradiol en presencia y en ausencia de
GSH sobre la neurotoxicidad inducida por \betaAP
1-40 en células HT22. \Box indica la presencia de
GSH y \blacksquare indica la ausencia de GSH. La línea representa
el valor del grupo de control (sin \betaAP 1-40).
Los datos se representan como media \pm SEM para cuatro pocillos
por grupo. * = p < 0,05 frente al grupo de \betaAP
1-40 solo; ** = p < 0,05 frente al grupo de
\betaAP 1-40 solo y el grupo de control (grupo sin
\betaAP 1-40).
Una realización preferida de la invención está
dirigida al novedoso descubrimiento de que el efecto citoprotector
de los compuestos fenólicos policíclicos aumenta considerablemente
si se lo administra al menos junto con un compuesto antioxidante
adicional.
Más específicamente, la presente invención
proporciona una formulación citoprotectora que se caracteriza por
comprender un compuesto fenólico policíclico y un compuesto
antioxidante para conferir citoprotección a una población de células
en casos de enfermedad degenerativa crónica, enfermedad aguda,
envejecimiento, traumatismo, osteoporosis, quemaduras, trasplante de
tejidos y cirugía que produzcan una pérdida del flujo de nutrientes
al tejido, en la que el compuesto fenólico policíclico (i) incluye
dos o más estructuras anulares de las cuales al menos una es un
anillo fenólico terminal, y (ii) tiene un tamaño menor de 1.000
dalton, y se selecciona entre compuestos anulares de ciclopentanofen
(A) antreno de dos, tres o cuatro anillos que tienen un grupo
hidroxilo en los carbonos 1, 2, 3 y/o 4 del anillo A.
La presente invención también proporciona el uso
de un compuesto fenólico policíclico asociado a un compuesto
antioxidante para la fabricación de un medicamento para conferir
citoprotección a una población de células en casos de enfermedad
degenerativa crónica, enfermedad aguda, envejecimiento, traumatismo,
osteoporosis, quemaduras, trasplante de tejidos y cirugía que
produzcan una pérdida del flujo de nutrientes al tejido, en la que
el compuesto fenólico policíclico (i) incluye dos o más estructuras
anulares de las cuales al menos una es un anillo fenólico terminal y
(ii) tiene un tamaño menor de 1.000 dalton, y se selecciona entre
compuestos anulares de ciclopentanofen (A) antreno de dos, tres o
cuatro anillos que tienen un grupo hidroxilo en los carbonos 1, 2, 3
y/o 4 del anillo A.
El término "citoprotección" se define aquí y
en las reivindicaciones como la protección de células contra la
muerte o el daño celular que, de lo contrario, ocurriría en ausencia
del agente protector, pudiendo la muerte celular o el daño celular
ser causada por cualquier daño mecánico, carencia de nutrientes
incluida la carencia de oxígeno, traumatismo, proceso patológico,
lesión debida a la exposición a productos químicos o temperaturas
extremas, envejecimiento u otras causas.
El término "compuesto estrógeno" según se lo
utiliza aquí y en las reivindicaciones se define como cualquiera de
las estructuras descritas en la Edición 11ª de "Steroids" de
Steraloids Inc., Wilton N.H., incorporada a la presente memoria como
referencia. En esta definición se incluyen los isómeros y
enantiómeros, entre ellos los estrógenos no esteroides formados por
modificación o sustitución de los compuestos de la referencia
Steroloid. Otros compuestos estrógenos incluidos en esta definición
son los derivados de estrógeno, los metabolitos de estrógenos y los
precursores de estrógeno, además de las moléculas capaces de unirse
a los receptores de estrógeno asociados a la célula, además de otras
moléculas cuando el resultado de la unión desencadene
específicamente un efecto estrógeno caracterizado. También están
incluidas las mezclas de más de un estrógeno, ejemplos de las cuales
se proporcionan en la Tabla 2 incluida más abajo. En la Figura 5 se
presentan ejemplos de estructuras
\alpha-estrógenas que tienen utilidad por sí solas
o en combinación con otros agentes.
Los términos "17-E2,
\beta-estradiol,
17\beta-estradiol,
\beta-17-E2,
17\beta-E2, E2, 17\betaE2, \betaE2" según
se los utiliza aquí y en las reivindicaciones se consideran
sinónimos. Del mismo modo, los términos
"\alpha17-E2,
\alpha-17-E2,
\alpha-estradiol,
17\alpha-estradiol, 17\alphaE2, \alphaE2"
según se los utiliza aquí y en las reivindicaciones se consideran
sinónimos y corresponden al isómero \alpha del
17\beta-estradiol.
La abreviatura
"E-3-ol" según se la utiliza
aquí y en las reivindicaciones representa el
estratrieno-3-ol.
El significado de los términos "compuesto
fenólico policíclico, compuestos policíclicos o fenoles
policíclicos" según se los utiliza aquí y en las reivindicaciones
se ejemplifica conforme a la descripción del documento de
US-A-5.859.001 (es decir, el
compuesto fenólico policíclico que (i) incluye dos o más estructuras
anulares de las cuales al menos una es un anillo fenólico terminal y
(ii) tiene un tamaño menor de 1.000 dalton), e incluye un compuesto
que tiene un anillo A fenólico según se define más abajo y puede
contener hasta 3 estructuras anulares más conforme al ejemplo
siguiente:
(a) Compuestos con anillo ciclopentanofen (A)
antreno de dos, tres o cuatro anillos y con un grupo hidroxilo en
los carbonos 1, 2, 3 y/o 4 del anillo A. Además, los grupos R
seleccionados entre sales de sodio, potasio y/o amonio pueden estar
unidos a las posiciones alfa o beta reemplazando el hidrógeno o
cualquier carbono disponible de la estructura. Ese tipo de
compuestos puede tener más sustituciones en el anillo A para
proteger un único grupo OH y formar además piridina, piriazina,
pirimidina, s-triazina, v-triazina o
as-triazina.
(b) El anillo A fenólico con las posibles
sustituciones adicionales antes enumeradas puede unirse, además, a
un anillo de seis carbonos con una o más de las siguientes
estructuras: benceno; ciclohexano; 1,2- pirano; 1,
4-pirano; 1, 2-pirona; 1,
4-pirona; 1, 2-dioxina; 1,
3-dioxina (forma dihidro); piridina; piridazina;
pirimidina; pirazina; piperazina; s-triazina;
a-triazina; v-triazina; 1, 2,
4-oxazina; 1, 3, 2-oxazina; 1, 3,
6-oxazina (pentoxaxol); 1, 2,
6-oxazina; p-isoxazina; 1, 2,
5-oxatiazina; 1, 2, 6-oxatiazina; 1,
4, 2-oxadiazina; 1, 3, 5,
2-oxadiazina; morfolina
(tetrahidro-p-isoxazina). Cualquiera
de las estructuras de seis anillos enumeradas arriba puede unirse a
cualquiera de las siguientes estructuras de 5 anillos: furano;
tiofeno (tiofurano), pirrol (azol); isopirrol (isoazol);
3-isopirrol (isoazol); pirazol (1,
2-diazol); 2-isoimidazol (1,
3-isodiazol); 1, 2, 3-triazol; 1, 2,
4-triazol; 1, 2-ditiol; 1, 2,
3-oxatiol; isoxazol (furo(a) monozol); oxazol
(furo(b) monazol); tiazol; isotiazol; 1, 2, 3- oxadioazol; 1,
2, 3, 4- oxatriazol; 1, 2, 3, 5-oxatriazol; 1, 2,
3-dioxazol; 1, 2, 4- dioxazol; 1, 3,
2-dioxaxol; 1, 3, 4-dioxazol; 1, 2,
5-oxatiazol; 1, 3-oxatiol;
ciclopentano.
(c) Cualquiera de los compuestos enumerados
arriba en los que el compuesto con anillo ciclopentanofen (a)
antreno se selecciona de un grupo que consiste en 1, 3, 5 (10), 6,
8-estrapentaen; 1, 3, 5 (10), 6, 8,
11-estrapentaen; 1, 3, 5 (10),
6-estratetraen, 1, 3, 5 (10) 7 -estratetraen; 1, 3,
5 (10) 8-estratetraen; 1, 3, 5 (10)
16-estratetraen; 1, 3, 5 (10)
15-estratetraen; 1, 3, 5 (10)- estratrien; 1, 3, 5
(10) 15-estratrien.
El término "antioxidante" según se lo define
aquí y en las reivindicaciones se refiere a cualquier molécula que
evite la oxidación de un sustrato particular por una segunda
molécula. En la invención se incluyen los siguientes ejemplos de
antioxidantes aunque no son limitantes:
Tioles incluidos el glutatión, la taurina, la
cisteína, la homocisteína y el ácido
\alpha-lipoico; fenoles, incluidos el probucol,
los salicilatos, el Trolox C, el 3,
4-dihidroxitolueno, el 3, 4- dihidroxicinámico, el
ácido nordihidroxicuaiaréctico, la 2',
4'-dihidroxiacetofenona, la 2',
5'-dihidroxiacetofenona, la 3',
4'-dihidroxiacetofenona, el propilgalato; agentes
trampa de espín incluidos el
dimetil-1-pirrolin-N-óxido;
la
N-terc-butil-\alpha-fenilnitrona;
aminas aromáticas incluidas la prometazina, la clorpromazina, la
etoxiquina, el alopurinol, el ácido úrico; caroteno idees, incluido
el \beta-caroteno, el
\alpha-caroteno, el
\gamma-caroteno, el licopeno, el caratol;
flavonoides incluidos la (\pm)-catequina, la
dihidroquercetina, la hesperetina, la texasina, la biochanina A, el
caempferol, la quercetina y el 6,
7-dihidroxi-4'-metoxi-isoflavanol;
aminoesteroides de selenio incluidos el mesilato de trilazad, la
metil prednisolona, el suleptanato; lazaroides; y ubiquinonas como
la coenzima Q2, la coenzima Q10. Esta lista no es limitante.
Hemos demostrado por primera vez que en el
ambiente extracelular un antioxidante proporciona mayor
citoprotección cuando se lo administra a una persona junto con un
compuesto policíclico que tiene un anillo A fenólico, como el
estrógeno, a dosis con relevancia fisiológica y farmacológica. El
mayor efecto de la combinación de los compuestos fenólicos
policíclicos y los antioxidantes, más particularmente los compuestos
estrógenos que tienen una actividad sexual insustancial en
combinación con antioxidantes tioles, más particularmente compuestos
estrógenos con actividad sexual insustancial y glutatión, promueve
una protección celular mayor que la observada con cualquier
compuesto por separado. La combinación de antioxidantes y compuestos
fenólicos policíclicos incluidos los estrógenos tiene utilidad para
la protección de las células del daño causado por cualquiera de los
diversos eventos que son conocidos como perjudiciales para la
célula, incluido el daño químico como el causado por los radicales
libres, los aminoácidos excitadores y la placa amiloide. Por
ejemplo, la combinación anterior es más eficaz para la
neuroprotección que el compuesto antioxidante o el compuesto
fenólico policíclico por separado y, por lo tanto, representa un
enfoque terapéutico novedoso para tratar la pérdida neuronal que se
produce en las personas en las enfermedades neurodegenerativas como
la enfermedad de Alzheimer. Además, el tratamiento combinado
descrito aquí se ha utilizado para tratar otros estados patológicos
que resultan del aumento de la muerte celular, incluida la isquemia,
el traumatismo y el envejecimiento.
Las observaciones anteriores son una ampliación
sorprendente e inesperada de observaciones previas realizadas por
los autores en las que identificaron la aplicación de compuestos
fenólicos policíclicos que tienen un anillo A fenólico para la
protección celular. Previamente, los autores han demostrado que los
compuestos fenólicos policíclicos pueden proteger contra: la
neurodegeneración (US-A-5.859.001),
la muerte celular asociada a la isquemia
(US-A-5.877.169), la osteoporosis
(US-A-5.554.601), y la muerte
celular que se produce en los tejidos durante la separación de
tejidos del cuerpo y el trasplante
(US-A-5.824.672).
Como se muestra en la Figura 1, el efecto
citoprotector del 17\beta-estradiol y el glutatión
sobre células neuronales humanas
(SK-N-SH) fue significativamente
mayor que el efecto citoprotector del
17\beta-estradiol y el glutatión por separado.
Este efecto se observó sistemáticamente cuando se incubaron las
células en diferentes medios. La Figura 2 ilustra también este
efecto; la protección celular máxima se observó antes y a
concentraciones menores de glutatión cuando se incluyó
17\beta-estradiol en el medio. Una observación
similar se hizo en las Figuras 3 y 4 cuando se agregó glutatión en
una cantidad constante con concentraciones crecientes de
17\beta-estradiol a células neuronales humanas y
también a neuronas corticales primarias de rata. También se observó
un marcado efecto sinérgico cuando se usó un estrógeno que tiene
actividad sexual insustancial (\alpha-estradiol)
(Figura 5). La Figura 5 ilustra también aumentos de los efectos
neuroprotectores de 100-600 veces para tres
compuestos estrógenos diferentes. Los autores han encontrado que los
estratrienos muestran un aumento del efecto citoprotector de
aproximadamente 1.000-5.000 veces cuando se los
administra con el antioxidante, glutatión. En las realizaciones de
la invención, el aumento observado con diferentes combinaciones de
agentes se encuentra dentro del intervalo de las 100 veces a las
10.000 veces. El efecto sinérgico del antioxidante y el compuesto
estrógeno también se observó en células que carecían de un receptor
de estrógeno. La Figura 6 muestra el efecto sinérgico del glutatión
con 17\beta-estradiol en células
HT-22.
Los procedimientos de determinación del efecto
citoprotector que se describen en estos ejemplos pueden aplicarse
fácilmente para identificar el grado de sinergia del efecto de otros
compuestos fenólicos policíclicos y antioxidantes, además de los
descritos en la presente memoria. Además de las células neuronales
pueden usarse otras células, de acuerdo con las determinaciones
descritas en la presente memoria, para demostrar el efecto
citoprotector de los compuestos fenólicos policíclicos con
antioxidantes. Estas determinaciones y aplicaciones se encuentran
dentro del alcance de la invención según se expresa aquí.
Aunque los ejemplos anteriores describen la
sinergia usando el glutatión como antioxidante, pueden usarse otros
antioxidantes para obtener el efecto sinérgico observado. La Tabla 1
proporciona un resumen de los efectos del
17\beta-estradiol junto con varios antioxidantes y
su combinación sobre las células neuronales.
Los solicitantes no tienen el deber ni la
obligación de explicar el mecanismo por el cual funciona la
invención. Sin embargo, sugieren el siguiente mecanismo para
explicar el efecto sinérgico observado. Es conocido en estado
anterior de la técnica que los compuestos estrógenos son moléculas
lipófílas. Dado el carácter lipófilo del estrógeno, este puede
insertarse en la membrana. Partiendo de la observación de que es
deseable la presencia de un grupo fenólico intacto para la
citoprotección, es posible que done el hidrógeno hidroxílico
evitando así la cascada de peroxidación lipídica en la membrana.
Además, la mayor potencia de los estrógenos podría ser el resultado
de su capacidad de donar desde varias posiciones del anillo A
(Jellnick y Bradlow, 1990). Como resultado de esta donación de
hidrógeno puede producirse una forma de estradiol oxidada
relativamente estable. Se propone aquí, por ejemplo, que una
glutatión peroxidasa podría regenerar la forma reducida del
estrógeno. Esta enzima depende del GSH como sustrato para volver a
donar el grupo hidrógeno al estrógeno y , por lo tanto, se produce
una sinergia entre la actividad de las dos moléculas.
La especificidad de la interacción de los
estrógenos con este sistema de glutatión está apoyada por dos líneas
de evidencias. Primero, no hay interacciones aparentes observadas
entre el estrógeno y los otros tioles probados, ácido lipoico o
taurina, o algún otro antioxidante, incluido el ácido ascórbico o el
\alpha-tocoferol. Debe observarse que mientras el
\alpha-tocoferol es un antioxidante potente por
derecho propio, se han presentado argumentos convincentes de que el
estrógeno es aún más potente. Segundo, la capacidad del glutatión
oxidado de funcionar en este sistema es un argumento de que el
estrógeno puede estar interactuando con el proceso de glutatión
peroxidasa/reductasa.
La presencia de estrógeno en las membranas
celulares es un reflejo de las cantidades de estrógeno introducidas
en la circulación sanguínea. Si el estrógeno está disponible puede
insertarse en la membrana celular o en cualquier célula disponible
sin especificidad, proporcionando así un efecto de protección
celular. Sin embargo, en la medida en que las cantidades de
estrógeno se vuelven limitantes, estos pueden localizarse
predominantemente en las membranas celulares que tienen receptores
de estrógeno.
Basándose en el mecanismo anterior, los
solicitantes afirman que la protección celular producida por el
efecto sinérgico de los compuestos fenólicos policíclicos y los
antioxidantes puede producirse para cualquiera de las células del
cuerpo y no se restringe a los ejemplos proporcionados aquí. Los
solicitantes han demostrado previamente el efecto de protección
celular de los compuestos fenólicos policíclicos solos en las
neuronas, las células neurogliales, (US 5.554.601), las células
endoteliales (US-A-5.877.169), las
células del músculo esquelético y los eritrocitos
(US-A-5.824.672). Además, los
osteoblastos, las células del músculo liso incluidas las células
musculares cardiacas, los fibroblastos y las células madre estarían
todas protegidas mediante el efecto sinérgico de los compuestos
fenólicos y los antioxidantes.
Hemos demostrado que el efecto sinérgico
observado no depende del receptor de estrógeno (ER) nuclear. Esta
observación puede llevar a nuevos procedimientos de diseño de
fármacos para tratar la pérdida celular anormal en seres
humanos.
El efecto sinérgico independiente de ER fue
confirmado por experimentos que usaban la línea celular neuronal
murina (HT-22) que carece de receptor funcional de
estrógeno (Figuras 5 y 6). Cuando estas células se expusieron al
neurotóxico \betaAP 25-35, se produjo
aproximadamente un 50-60% de muerte celular. El
tratamiento concurrente con cualquiera de los tres estratrienos,
\beta-estradiol,
\alpha-estradiol o
estratrien-3-ol, produjo una
neuroprotección dependiente de la dosis (Figura 5). La presencia de
^{3}H-estradiol con unión específica a extractos
nucleares y preparados de células completas se determinó mediante
las pruebas descritas por Miranda et al. [J. Neurobiol 31,
(1996), 77-78] y Nakao et al.
[Atherosclerosis 38 (1981) 75-80]. La unión del
estradiol a células HT-22 se comparó con la unión a
células MCF-7 portadoras del receptor ER. Las
células HT-22 no demostraron tener una unión
específica en ninguna determinación, observándose sólo 6 \pm 3,93
fmol uniones específicas por millón de células en comparación con 56
\pm 6,5 para la línea celular MCF-7 ER positiva en
los preparados de células completas y 0,05 fmol por millón de
células en comparación con 35,21 para las células
MCF-7 del sedimento nuclear bruto. La protección
conferida a estas células por dosis fisiológicas de estrógenos
confirma que la mayor parte de los efectos protectores de los
estrógenos es independiente de ER.
Debe observarse que mientras que
\beta-estradiol es una hormona sexual y se sabe
que actúa a través del receptor estrógeno, por lo general, se
considera que el \alpha-estradiol y el
estratrien-3-ol son biológicamente
inactivos según se describe en la técnica. Estos compuestos son
todos ejemplos de compuestos fenólicos policíclicos. La invención
comprende el uso de cualquier clase de compuesto fenólico
policíclico independientemente de su capacidad para unirse al
receptor de estrógeno.
Los autores han probado el estradiol conjugado
con albúmina de suero bovino (BSA) para determinar si el estradiol
podría proteger células HT-22 de la
\beta-AP (25-35) si se restringe
el estrógeno al ambiente extracelular. La inmovilización del
esteroide por conjugación con BSA
(17\beta-estradiol-6-(carboximetil)
oxime:BSA que contiene 17\beta-estradiol 20
\muM) anuló la capacidad del esteroide de proteger las células
HT22 de la toxicidad producida por \betaAP (25-35)
en presencia de GSH (Ejemplo 2a, Tabla 2). Esto es coherente con
observaciones similares realizadas con células
SK-N-SH. En conjunto estos datos
indican que es deseable la interacción libre de estratrienos con la
membrana celular o el espacio intracelular para que ejerzan sus
efectos neuroprotectores.
La dosis de GSH usada en estos estudios no tuvo
efecto sobre la toxicidad inducida por \beta-AP
(25-35) por sí misma en la medida en que
\beta-AP (25-35) causó un 54 \pm
4% y un 55 \pm 3% de disminución de la disponibilidad celular en
ausencia y en presencia de 3,25 pM GSH, respectivamente. Sin
embargo, una dosis de GSH de 325 \muM mostró una protección
significativa de la toxicidad producida por
\beta-AP en células de neuroblastoma
SK-N-SH (Figura 2). Además, la
exposición de células HT-22 a GSH 3,25 \muM solo,
17\beta-estradiol 200 nM solo o ambos combinados
no causó un aumento del número de células en ausencia de agresión
(Figura 6) lo cual indica que el aumento del número de células se
debe a la protección y no a un efecto mitógeno de los
compuestos.
Es posible utilizar un preparado farmacéutico que
incluya un compuesto fenólico policíclico y un antioxidante para
tratar personas que padecen un traumatismo, una enfermedad crónica
degenerativa o una enfermedad aguda como la inducida por un ataque
isquémico. Entre los ejemplos se incluyen la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la apoplejía, la isquemia, el
infarto de miocardio o la angioplastia, o el traumatismo cerebral o
de la médula espinal, la hipoglucemia, la anoxia, las quemaduras o
las cirugías que producen pérdida del flujo de nutrientes al
tejido.
Las realizaciones de la invención pueden
aplicarse, además, al proceso de trasplante de tejido, antes,
durante o después de la extracción o reperfusión celular, tisular o
de órganos, o durante el almacenaje de células, tejidos u órganos y
se aplica a cualquier tipo de células del cuerpo. A continuación se
presentan ejemplos que no tienen la intención de ser limitantes sino
una ilustración eficaz del novedoso efecto biológico de la
invención.
Se eligió glutatión como antioxidante y
17\beta-estradiol como compuesto policíclico. La
prueba usó las células de neuroblastoma humano
SK-N-SH. Se trataron las células con
toxinas que se sabe que producen la muerte celular, encontradas en
la placa amiloide \beta-AP (1-40)
y \beta-AP (25-35). Los números
que siguen a "AP" corresponden al tamaño y el tipo del
fragmento proteico identificado por el número de residuos
aminoácidos.
Materiales:\beta-AP
(25-35) liofilizado (1 mg) (Bachem, Torrance,
California, EE.UU.) se disolvió inicialmente en 200 \mul de ddH2O
y con el agregado de 800 \mul de PBS se observó una agregación
rápida. Se disolvió inicialmente 17\beta-estradiol
(17\beta-estradiol, Steraloids, Wilton, New
Hampshire, EE.UU.) en etanol absoluto (Fisher Scientific Inc.,
Orlando, Florida, EE.UU.) a razón de 10 mg/ml y se diluyó en el
medio de cultivo celular para obtener las concentraciones adecuadas.
Se disolvió inicialmente acetato de
\alpha-tocoferol en 200 \mul de etanol absoluto
y se diluyó en el medio de cultivo celular hasta las concentraciones
adecuadas. Se disolvieron inicialmente ácido lipoico (ácido
tiótico), taurina (ácido 2-aminoetanoico) y ácido
ascórbico en medio de cultivo celular y se usó a la concentración
indicada. A no ser que se indique lo contrario, los materiales se
obtuvieron de Sigma Chemical Corp.
Cultivo celular de neuroblastoma
SK-N-SH:Se obtuvieron células de
neuroblastoma SK-N-SH de American
Type Collection (Rockville, MD). Los cultivos celulares se dejaron
proliferar hasta que confluyeron en un medio
RPMI-1640 (Fisher Scientific, Inc.) suplementado con
un 10% de suero fetal bovino (FBS) tratado con carbón/dextrano
(Hyclone®, Logan, Utah, EE.UU.), 100 U/ml de penicilina G y 100
mg/ml de estreptomicina (Sigma Chemical Corp.) en monocapas en
matraz Corning de 150 cm^{2} (Fisher Scientific, Inc.), a una
temperatura de 37ºC y con un 5% de CO_{2} y un 95% de aire. Se
cambió el medio tres veces a la semana. Se observaron las células
con un microscopio de contraste de fase (Nikon
Diaphot-300).
(a) Las células
SK-N-SH usadas en los siguientes
experimentos estaban en los pases 4 a 12. El medio de cultivo se
decantó inicialmente y se enjuagaron las células con EDTA al 0,02%
durante 30 minutos a 37ºC. Luego se contaron las células en un
hemacitómetro Neubauer (Fisher Scientific) y se volvieron a
suspender en un medio adecuado. Se iniciaron los estudios sembrando
1 x 10^{6} células por pocillo en 24 placas, permitiendo la unión
en medio normal, y luego decantando ese medio y reemplazándolo con
el tratamiento adecuado después de 4 horas. Se cultivaron las
células en DMEM o RPMI-1640 sin GSH (reducido),
suplementado con FBS al 10% y anticuerpos con etanol absoluto como
un control del vehículo o suplementado con el agregado de \betaAP
25-35 (20 \muM),
17\beta-estradiol (0,002 - 200 nM), GSH
(0,0325-325 \muM), acetato de
\alpha-tocoferol (50 \muM), ácido ascórbico (100
\muM), ácido lipoico (10 \muM), taurina (5 mM) o una combinación
como se indicó. Se eligió la concentración de 20 \muM de \betaAP
porque es cercana a LD_{50} para este péptido, como han demostrado
los autores (Green et al., 1996). La elección de las
concentraciones de antioxidante se realizó a partir de las
evaluaciones preliminares de dosis y respuesta usadas para
identificar la concentración a la cual no se obtiene
neuroprotección.
La viabilidad de células
SK-N-SH se determinó usando el
procedimiento de exclusión con azul de tripano (Black and Berenbaum,
1964; Tennant, 1964). Tras 72 horas de incubación, se decantó el
medio de tratamiento y se separaron las células por incubación con
0,2 ml de EDTA al 0,02% durante 30 minutos a 37ºC. Se suspendieron
las células por pipeteado repetido. Se incubaron alícuotas de 100
\mul de cada suspensión de células con alícuotas de 100 \mul de
colorante azul de tripano al 0,4% durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Se contaron todas las suspensiones en un hemacitómetro en
el transcurso de los 10 minutos posteriores a la adición del
colorante azul de tripano. Se hicieron dos recuentos independientes
de células vivas y muertas para cada alícuota.
Estadística: Se determinaron los efectos
significativos del tratamiento sobre la viabilidad celular usando un
ANOVA seguido por la prueba de Scheffe
post-hoc, con una significación establecida
en p < 0,05. Para las evaluaciones de dosis y respuesta, se
calcularon valores de CE_{50} asignando al azar recuentos de
células a las dosis indicadas para generar 3-5
líneas por tratamiento y determinar el valor promedio para esas
líneas. Se usó el análisis no paramétrico de la suma de rangos de
Mann-Whitney sobre los valores de CE_{50} porque
las varianzas de la desviación típica no fueron equivalentes. Se
calcularon las comparaciones para las relaciones entre dosis y
respuesta usando un ANOVA bilateral para determinar la significación
de la presencia o ausencia de GSH o
17-\beta-estradiol.
(b) Se volvieron a cultivar células
SK-N-SH humanas en placas de 96
pocillos en un medio RPMI sin glutatión. Cuatro horas más tarde, un
grupo de placas de células se trataron simultáneamente con la
proteína \beta-amiloide \beta-AP
25-35: (20 \muM) y una serie de concentraciones de
glutatión que variaron entre 0-325 \muM. Se trató
un segundo grupo de placas de células simultáneamente con A\beta
25-35: (20 \muM), una serie de concentraciones de
glutatión que variaron entre 0-325 \muM y una
concentración de dosis única de 17\beta-estradiol
(2 nM). Después de 72 horas de incubación, se determinaron las
células vivas por exclusión con Trypan Blue. Como se muestra en la
Figura 2, en ausencia de 17\beta-estradiol, el
glutatión tenía una DE_{50} de 32,5 \muM y mostró poco efecto
neuroprotector a 3,25 \muM. Por el contrario, en la presencia de
17\beta-estradiol, se comprobó que la DE_{50}
era 0,325 \muM y que proporcionaba 1.000 veces más neuroprotección
que el glutatión solo.
(c) Utilizando la determinación antes descrita,
se trataron células SK-N-SH con
A\beta 25-35 (20 \muM), una dosis única de
glutatión (3,25 \muM) y concentraciones variables de
17\beta-estradiol en el intervalo de
0-200 nM. Después de 72 horas de incubación, se
tiñeron las células con Trypan Blue. Se observó neuroprotección a
concentraciones de 200 nM de 17\beta-estradiol en
ausencia de glutatión con un DE_{50} de 100 nM. En presencia de
glutatión y 17\beta-estradiol, la DE_{50} fue
0,02 nM. Por lo tanto, la potencia neuroprotectora del
17\beta-estradiol alcanza las 5.000 veces en
presencia de glutatión en comparación con la ausencia de glutatión
(Figura 3).
La neuroprotección proporcionada por el
17\beta-estradiol solo fue 628 veces menor que en
presencia de GSH. Después del tratamiento de las células con
\betaAP (1-40), una dosis de 200 nM de
17\beta-estradiol proporcionó una protección del
99,9% en presencia de GSH y 35,6% en ausencia de GSH (Figuras 1).
Los estrógenos \alpha-17-E2 y
E-3-ol se comportaron ambos de forma
similar con un DE_{50} de 6 nM y 14 nM, respectivamente, en
presencia de GSH y un DE_{50} de 1.014 nM y 3.683 nM,
respectivamente, en ausencia de GSH.
(a) Efecto del
17\beta-estradiol y el conjugado
17\beta-estradiol-6-(carboxi-metil)oxima:
BSA sobre la toxicidad inducida por \betaAP 25-35
en células HT-22.
Se iniciaron los experimentos sembrando las
células en una placa Nunc®de 24 pocillos y se dejó que las células
se adhirieran durante 4 horas antes del tratamiento. Se expusieron
las células a \betaAP 25-35 20 \muM en presencia
de la dosis indicada de 17\beta-estradiol o
17\beta-estradiol - BSA en medio RPMI que contenía
GSH 3,25 \muM. Después de 48 horas se suspendieron las células y
se determinó la viabilidad usando el debido procedimiento de
exclusión por Trypan Blue [Tennant J.R. (1964) Transplantation 2
(1964) 685-694]. Se prepararon los esteroides y
\betaAP como se describió anteriormente [Green et al,
Neuroscience Lett. 218 (1996) 165-168]. Se
analizaron los datos con Análisis de Varianza unilateral y se usó un
análisis de Scheffe post-hoc para las
comparaciones entre los grupos previstas. Se presentaron los datos
como media \pm SEM para 4 pocillos por grupo. * = p < 0,05
frente a \betaAP (20 \muM) grupo.
| Tratamiento | Número de células vivas (x 10^{3} células) \pm SEM | |
| Control (Sin \betaAP) | 427 \pm 11 * | |
| \betaAP (20 \muM) | 189 \pm 11 | |
| \betaAP + \beta17-E2 0,2 \muM | 324 \pm 14 * | |
| \betaAP + \beta17-E2:BSA 20 \muM | 216 \pm 17 |
(b) Efectos de los estratrienos en presencia y
ausencia de glutatión sobre la neurotoxicidad inducida por \betaAP
25-35 en células HT-22.
Se iniciaron los experimentos sembrando células
en placas Nunc® de 24 pocillos: se dejó que las células se
adhiereran durante 4 horas antes del tratamiento. Se expusieron las
células a 20 \muM de \betaAP en presencia de la dosis indicada
de \beta17-estradiol \betaAP o
\alpha17-E2 o
E-3-ol (0-20.000 nM)
ya sea en medio RPMI que contiene 3,25 \muM GSH o medio RPMI sin
GSH. Después de 48 horas se suspendieron las células y se determinó
la viabilidad usando el procedimiento de exclusión con colorante
Trypan Blue (Tennant, 1964). Se prepararon los esteroides y
\betaAP como se describió anteriormente (Green et al.,
1996). Se analizaron los valores de DE_{50} con Análisis de
Varianza bilateral. Se determinaron las diferencias entre efectos
con un análisis post-hoc de Scheffe
considerando significativa una p < 0,05. El efecto del glutatión
es significativo con una p < 0,001. Se normalizaron los datos al
grupo de control sin \betaAP como una protección del 100% y el
grupo con \betaAP solo como una protección del 0%. En la Figura 3
se presenta la media \pm SEM para 3-5 pocillos por
grupo.
(c) Efectos del
17\beta-estradiol en presencia y en ausencia de
glutatión sobre la neurotoxicidad inducida por \betaAP
(1-40) en células HT-22.
Se llevaron a cabo experimentos según se
describió en el Ejemplo 2(b) con la excepción de que
\betaAP (1-40) se dejó incubar durante 4 días
antes de diluir con 20 \muM en el medio de cultivo. El
envejecimiento de \betaAP es necesario para agregar el péptido,
para que tenga así el efecto tóxico sobre las células [Pike et
al. J. Neurosci, 13 (1993) 1676-1687]. Se
presentaron los datos como media \pm SEM para 3-4
pocillos por grupo. Se analizaron los datos por análisis de varianza
unilateral y se consideró significativa una p < 0,05 (Figura
5).
Como muestran las Figuras 5 y 6 los resultados
demuestran el efecto neuroprotector del GSH con
\beta-estradiol sobre las células HT22 después del
tratamiento con uno de dos tipos de la neurotoxina
\beta-AP. Se observó un efecto sinérgico entre los
estrógenos neuroprotectores y la protección conferida por
antioxidante intracelular GSH. El
17\beta-estradiol, el potente estrógeno natural,
protegió las células HT-22 de la muerte celular
inducida por el fragmento amiloide neurotóxico, el fragmento
\beta-AP (25-35) con un ED_{30}
de 5 nM y neuroprotección significativa con esteroide 2 nM y GSH
3,25 pM (Figura 5).
Para asegurar que el efecto sinérgico observado
en los Ejemplos 1 y 2 no se debió al origen o la tumorigenicidad de
las células, llevamos a cabo experimentos similares en neuronas
corticales primarias de rata. Cultivo de neuronas corticales
primarias de rata: Se prepararon los cultivos de neuronas
primarias siguiendo el procedimiento usado por Chandler et
al. [Alcoholism: Clinical and Experimental Research, 17 (1993)
54-60].
Los tratamientos se agregaron directamente a los
cultivos primarios el día 10 de cultivo, manteniendo un volumen
agregado constante independientemente del tratamiento de la
siguiente forma: Controles: etanol absoluto y PBS;
muestras: \betaAP 25-35 (10 \muM),
17\beta-estradiol (0,02 mM - 2 \muM), GSH (3,25
\muM) o combinaciones según se indicaron. Una vez agregados los
tratamientos, se incubaron los cultivos primarios durante otras 24
horas y se determinó la viabilidad usando el equipo LIVE/DEAD® de
viabilidad/citotoxicidad (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células vivas se
distinguen por la presencia de actividad de la esterasa intracelular
que escinde el colorante calceina AM, produciendo una fluorescencia
verde brillante cuando se excita. El homodímero etidio entra en las
células que tienen la membrana dañada y produce una fluorescencia
roja al unirse a los ácidos nucleicos. Ambos colorantes se excitan a
485 nM, y se observaron las placas de cultivo con microscopio de
fluorescencia (Nikon Diaphot-300). Se fotografiaron
tres campos al azar y se determinó el número de células vivas por
campo contando el número de células coloreadas de verde brillante.
Nuevamente se evaluó la capacidad del estradiol en presencia y en
ausencia de GSH (3,25 \mum) (Fig. x). El agregado de \betaAP
25-35 (10 \muM) a neuronas corticales primarias
dio como resultado una reducción del número medio de células viables
por campo del 39% en ausencia de GSH y del 40% en presencia de GSH
(Figura 4). Cuando se evaluaron dosis crecientes de
17\beta-estradiol con \betaAP
25-35, la dosis de 200 \muM de
17\beta-estradiol fue la menor dosis que se
resultó protectora, lo cual está totalmente de acuerdo con nuestros
estudios en la línea celular SK-N-SH
(Figuras 1-3). Con el agregado de GSH (3,25 \muM)
al 17\beta-estradiol, todas las dosis de
17\beta-estradiol de 2 \muM o mayores fueron
neuroprotectoras (Fig. 4). La evaluación de los valores de CE_{50}
demuestra cambios similares de la potencia, desde 68,1 \pm 79
\muM en ausencia de GSH, a 4,3 \pm 5,9 \muM en presencia de
GSH. Asimismo, la evaluación del efecto de GSH sobre el efecto
neuroprotector del 17\beta-estradiol en neuronas
corticales primarias de rata usando un ANOVA bilateral demostró un
efecto significativo (F: 8,53; p < 0,005).
Claims (10)
1. Una formulación citoprotectora
caracterizada porque comprende un compuesto fenólico
policíclico y un compuesto antioxidante para conferir citoprotección
a una población de células en casos de enfermedad degenerativa
crónica, enfermedad aguda, envejecimiento, traumatismo,
osteoporosis, quemaduras, trasplante de tejidos y cirugía que
produzcan una pérdida del flujo de nutrientes al tejido, en la que
el compuesto fenólico policíclico (i) incluye dos o más estructuras
anulares de las cuales al menos una es un anillo fenólico terminal,
y (ii) tiene un tamaño menor de 1.000 dalton, y se selecciona entre
compuestos anulares de ciclopentanofeno (A) antreno de dos, tres o
cuatro anillos que tienen un grupo hidroxilo en los carbonos 1, 2, 3
y/o 4 del anillo A.
2. Una formulación de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el compuesto fenólico policíclico es un
compuesto estrógeno, que preferiblemente tiene una actividad sexual
insustancial.
3. Una formulación como la reivindicada en la
reivindicación 2, en la que el compuesto estrógeno es un
estratrieno.
4. Una formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que el antioxidante se elige entre
un tiol, un fenol, un agente trampa de espín, una amina aromática,
un carotenoide, un flavonoide, un aminoesteroide de selenio y una
ubiquinona.
5. Una formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antioxidante es el
glutatión.
6. Una formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en la que hay un efecto sinérgico
observado sobre la citoprotección, atribuible a la asociación entre
el compuesto fenólico policíclico y el compuesto antioxidante.
7. Una formulación de acuerdo con la
reivindicación 6, en la que el efecto sinérgico es del orden de las
100-10.000 veces.
8. Una formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la que la citoprotección se confiere
en los casos de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson,
isquemia o apoplejía.
9. Una formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en la que la población de células es de
células neuronales, células cardiovasculares, células
cerebrovasculares o células corporales que han estado expuestas a un
suceso isquémico.
10. El uso de un compuesto fenólico policíclico
en asociación con un compuesto antioxidante para la fabricación de
un medicamento para conferir citoprotección a una población de
células en casos de enfermedad degenerativa crónica, enfermedad
aguda, envejecimiento, traumatismo, osteoporosis, quemaduras,
trasplante de tejidos y cirugía que produzcan una pérdida del flujo
de nutrientes al tejido, en el que el compuesto fenólico policíclico
(i) incluye dos o más estructuras anulares de las cuales al menos
una es un anillo fenólico terminal, y (ii) tiene un tamaño menor de
1.000 dalton, y se selecciona entre compuestos anulares de
ciclopentanofeno (A) antreno de dos, tres o cuatro anillos que
tienen un grupo hidroxilo en los carbonos 1, 2, 3 y/o 4 del anillo
A.
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