DE69734677T2

DE69734677T2 - Verwendung von estrogen zur verhütung oder kontrolle von katarakt

Info

Publication number: DE69734677T2
Application number: DE69734677T
Authority: DE
Inventors: Gwenda Coral CHAMBERLAIN; William Johnston McAVOY; Maria Angela HALES
Original assignee: University of Sydney
Current assignee: University of Sydney
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2017-12-20
Also published as: WO1998026784A1; EP1003522A4; AUPO427196A0; US6258856B1; EP1003522A1; DE69734677D1; EP1003522B1; JP2001506638A; ATE309842T1

Description

TECHNISCHES FELD
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Prävention oder Kontrolle pathologischer Veränderungen, welche in Verbindung mit einer Katarakt-Bildung in einem Säugetierauge auftreten, durch Schützen der Linsenzellen vor kataraktogenen Effekten des transformierenden Wachstumsfaktors-β (TGFβ). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Prävention oder Kontrolle von TGFβ-induzierter Katarakt-Bildung in einem Säugetierauge durch Verabreichen eines Östrogens oder einer östrogenen Substanz dem Säugetier.
STAND DER TECHNIK
Katarakt ist eine Opazität der Linse, welche das Sehen behindert. Er ist eine der häufigsten Augenkrankheiten und geht, obwohl er jederzeit im Leben auftreten kann, häufig mit dem Älterwerden einher. In den USA beispielsweise leiden bis zu 45% der Leute in einem Alter zwischen 74 und 89 Jahren an Katarakt. Prädisponierende Faktoren schließen Alterungsprozess, Diabetes, UV/Sonnenlicht, Augenbehandlung und Mangelernähung ein. Katarakte werden meistens nach dem Ort der Linsenopazität klassifiziert: nuklear, kortikal, posterior (hinten) subkapsulär oder anterior (vorne) subkapsulär (Tripathi und Tripathi, 1983). Gegenwärtig ist die am häufigsten eingesetzte Behandlung für Katarakt die chirurgische Entfernung der Linsenzellen und die nachfolgende Implantation einer synthetischen Ersatzlinse innerhalb der verbleibenden Linsenkapsel.
Allerdings kann die Implantation von synthetischen Linsen die Sicht nur temporär wiederherstellen, weil verbleibende, mit der Linsenkapsel verbundene Zellen oftmals wachsen, um neue Opazitäten zu bilden. Die letztgenannte Gegebenheit ist eine Form des Katarakts, welche als Sekundärkatarakt und ebenfalls als hintere Kapseltrübung bekannt ist (Green und McDonnell, 1985; Kappelhof und Vrensen, 1992).
Die Erfinder haben kürzlich gezeigt, dass TGFβ kataraktogen ist. Die Erfinder haben ebenfalls gezeigt, dass die TGFβ-induzierten Veränderungen an Linsenzellen durch Verringern oder Inhibieren der Wirkung von TGFβ, wie beispielsweise durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer Inhibitoren von TGFβ, inhibiert oder verhindert werden können. Dies wurde in der PCT/AU94/00694 offenbart.
Eine frühere Arbeit der Erfinder hat gezeigt, dass TGFβ gewisse Veränderungen induziert, von denen bekannt ist, dass diese mit Katarakt, einschließlich vorderem und hinterem subkapsulärem Katarakt und Sekundärkatarakt, verbunden sind. Diese Veränderungen wurden in mit TGFβ kultivierten Rattenlinsenexplantaten gezeigt und schließen Akkumulation von extrazellulärer Matrix, Bildung von spindelförmigen Zellen, Zellrunzeln und Zelltot mit den Merkmalen von Apoptose ein (Liu et al.; 1994, Hales et al., 1994).
Weitere Anzeichen für eine Beteiligung von TGFβ bei der vorderen subkapsulären Kataraktbildung stammen aus Studien mit ganzen Rattenlinsen, welche zeigen, dass TGFβ vordere Opazitäten induziert, welche mit subkapsulären Plaques enthaltend molekulare Marker für Katarakt, α-glattes Muskelaktin sowie Kollagentyp I, zusammentreffen (Hales et al., 1995). Diese Proteine werden normalerweise nicht in Linsen gefunden, sind aber in gewissen Formen von menschlichem Katarakt anwesend. Von den anderen vorstehend diskutieren Veränderungen ist bekannt, dass diese mit gewissen Formen von menschlichem Katarakt verbunden sind. Ein weiterer Nachweis für die Beteiligung von TGFβ bei der Bildung von hinterem subkapsulärem Katarakt und kortikalem Katarakt stammt aus den in den Beispielen 1 und 3 beschriebenen Studien.
Geschlechtsabhängige und in Beziehung zu weiblichen Sexualhormonen stehende Unterschiede in der Empfänglichkeit gegenüber Kataraktbildung wurden in epidemiologischen Studien beobachtet. Während die Prävalenz und Schwere von Katarakt mit dem Alter sowohl bei Männern als auch bei Frauen ansteigt, tritt im späteren Leben von Frauen, während der Zeitspanne, wenn die Serumspiegel von Sexualhormonen bei den Frauen gering sind, ein merklicherer Anstieg als bei Männern auf (Klein et al., 1992). Ferner scheint Menarche in frühem Alter oder verspätete Menopause gegen gewisse Formen von Katarakt zu schützen (Klein, 1993). Solche Studien geben keinen Nachweis dafür, dass der beobachtete, mit dem Geschlecht (oder den Sexualhormonen) in Beziehung stehende Schutzeffekt auf Östrogen zurückzuführen ist. Des Weiteren haben Forscher über die Prävalenz und Schwere von nuklearen, kortikalen und hinteren subkapsulären Katarakten bei postmenopausalen Frauen mit Hormonersatztherapie, welche die Verabreichung von pharmazeutischen Produkten enthaltend 'Östrogen' mit oder ohne 'Progesteron' einschließt, sowie bei anderen Frauen ohne Hormonersatztherapie berichtet (Klein, 1993). Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen von Frauen wurde nur für den nuklearen Katarakt gefunden und es ist nicht klar, ob der beobachtete Effekt der Hormonersatztherapie auf Östrogen zurückzuführen war. Bis heute gibt es keinen Nachweis, dass Östrogen per se einen Schutzeffekt gegen durch TGFβ induzierte Katarakt formen aufweist, oder, dass in diesen Studien ein mit TGFβ verbundener Prozess beim Schützen von Individuen gegen Katarakt beteiligt war.
Einige Tierstudien lehren allerdings, dass Östrogen Katarakt oder kataraktartige Veränderungen in Linsen verursacht. Es wurde beobachtet, dass Progesterone und Östrogene in vitro zu einem Anstieg in der Ionenpermeabilität führen, was durch den Verlust an Klarheit in den kultivierten Linsen begleitet ist (Lambert, 1968). Es wurde ebenfalls berichtet, dass intramuskuläre Injektion von Östrogen in das Linsenepithel in Atrophie resultierende Veränderungen verursacht, was ein Faktor bei der Entwicklung von lentikulärer Opazität sein könnte (Bisaria, 1980).
Starka et al. (1976) haben berichtet, in den okulären Medien weiblicher und männlicher Ratten Östrogene detektiert zu haben, aber es ist nicht klar, welche Spiegel an wirksamen Hormon vorliegen.
Gemäß der veröffentlichten wissenschaftlichen Literatur ist der Effekt von Östrogen auf die biologische Aktivität von TGFβ variabel. Es ist bekannt, dass Östrogene die biologische Aktivität von TGFβ verstärken. Beispielsweise ist berichtet worden, dass 17-β-Östradiol die Freisetzung von aktivem TGFβ stimuliert, wenn zu Kulturen von Granulosazellen von Ratten zugefügt (Dorrington et al., 1993). Des Weiteren berichten Herman et al. (1994) einen verstärkenden Effekt von Östrogen auf die TGFβ-Aktivität durch Nachweis, dass Entfernen von Östrogen aus dem Medium von kultivierten menschlichen Brustkrebszellen deren Sensitivität gegenüber den wachstumsinhibierenden Effekten von TGFβ reduziert. Von Östrogenen ist ebenfalls bekannt, dass diese einen suppressiven Effekt auf die TGFβ-Aktivität oder keinen Effekt aufweisen. Beispielsweise wird die östrogeninduzierte Tumorgenese in der vorderen Hypophyse von Ratten durch einen Verlust an Sensitivität gegenüber TGFβ 1 begleitet (Pastorcic et al., 1995) und Östradiol blockiert die wachstumsinhibierenden Effekte von TGFβ in Hepatozyt-Kulturen nicht spezifisch, obwohl die Zellen andererseits auf Östradiol reagieren (Ni und Yager, 1994). Gleichermaßen ist in Studien über die Expression von TGFβ-mRNA und -Protein und nicht über die biologische TGFβ-Aktivität kein konsistenter Trend wahrnehmbar, d. h. Östrogen kann die TGFβ-Expression abhängig sowohl von dem involvierten Zelltyp als auch von der involvierten TGFβ-Isoform hoch regulieren, herunter regulieren oder keinen Effekt aufweisen.
Viele postmenopausale Frauen erhalten derzeit eine Östrogenersatztherapie in Verbindung mit Progesteron, sofern angemessen, aber diese ist nicht universal befürwortet oder erhältlich. Es wurde berichtet, dass 1994 lediglich 5 bis 10% der menopausalen Frauen in den USA diese Behandlung erhalten haben (Griffling und Allen, 1994).
Die TGFβ-Familie besteht aus einer Gruppe von verwandten Proteinen; TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 sind in Säugetieren gefundene Isoformen. Reifes TGFβ in seiner biologisch aktiven Form ist ein 25 kDa-Dimer, welches aus einem latenten Vorläufermolekül herausgeschnitten wird (Kingsley et al., 1994).
OFFENBARBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogens bei der Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Prävention oder Kontrolle von TGFβ-induziertem Katarakt oder kataraktartigen Störungen im Auge eines Säugetiersubjekts bereit.
Um TGFβ-induzierten Katarakt oder kataraktartige Störungen in dem Auge eines Säugetiersubjekts zu vermeiden oder zu kontrollieren, wird dem Subjekt eine wirksame Menge der pharmazeutischen Formulierung verabreicht. In einigen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Formulierung direkt in das oder nahe dem Auge des Subjekts verabreicht.
Vorzugsweise ist das Säugetiersubjekt ein Mensch, aber die vorliegende Erfindung ist ebenfalls zur Behandlung von TGFβ-induziertem Katarakt oder kataraktartigen Störungen anderer Tiere, wie beispielsweise von Pferden, Katzen, Hunden oder dergleichen, geeignet.
Obwohl die vorliegende Erfindung zur Prävention oder Behandlung von Katarakt in Menschen unabhängig von deren natürlichem Östrogenspiegel geeignet ist, ist die vorliegende Erfindung insbesondere geeignet zur Behandlung von Frauen mit einem geringem Östrogenspiegel, d. h. von peri- und postmenopausalen Frauen oder von aus anderen Gründen, wie beispielsweise Hypogonadismus, Ovariektomie oder primären Versagen der Ovarien, an Hypoöstrogenismus leidenden Frauen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine ophthalmologische Spülung oder viskoelastische Lösung zur Verwendung während einer Augenoperation bereit, enthaltend in einer Spüllösung oder viskoelastischen Lösung ein Östrogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogens bei der Herstellung einer Linse oder eines Linsenimplantats bereit, die/das mit einem aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogen beschichtet oder imprägniert ist/sind, zur Prävention oder Kontrolle der Sekundärkataraktbildung in Folge einer Linsenimplantation in dem Auge eines Säugetiersubjekts.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Linsenimplantat bereit, das mit einem Östrogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon beschichtet oder imprägniert ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogens bei der Herstellung einer ophthalmologischen Formulierung zur Prävention oder Kontrolle von TGFβ-induziertem Katarakt oder kataraktartigen Störungen bereit.
Östrogene sind Säugetiersexualhormone, welche während des Lebens sowohl in Männchen als auch in Weibchen vorkommen. Während deren Hauptrolle in der Fortpflanzungsbiologie der Weibchen liegt, beeinflussen diese unterschiedliche Gewebe, welche nicht Teil des Fortpflanzungssystems sind. Bei Menschen natürlich vorkommende Östrogene sind Östradiol (17-β-Östradiol), Östron und Östronsulfat, mit kleineren Mengen an konjugierten oder hydroxylierten Derivaten; Östradiol ist von diesen das biologisch am meisten aktive (Lobo, 1987).
Auf Basis deren therapeutischer oder biologischer Wirkung werden viele Substanzen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, als Östrogene klassifiziert (siehe Liste unter 'Estrogens' in 'Therapeutic Category and Biological Activity Index' des Merck-Index, 12. Auflage, Merck Research Laboratories, NJ, 1996, Seite THER-22). Gemäß dieser Liste können Östrogene Steroide (beispielsweise Östradiol, Ethinylöstradiol, Colpormon, konjugierte östrogene Hormone, Equilenin, Equilin, Östriol, Östron, Mestranol, Moxestrol, Mytatriendiol, Quinestradiol und Quinestrol) oder Nicht-Steroide (beispielsweise Diethylstilbestrol, Dienestrol, Benzestrol, Broparoestrol, Chlorotrianisen, Dimestrol, Fosfestrol, Hexestrol, Methallenestril, Methestrol) sein. Die aufgelisteten Substanzen üben deren biologischen Effekte) nicht notwendigerweise direkt aus; manche benötigen nach der Verabreichung eine metabolische Umsetzung zu einer aktiven Form. Beispielsweise wird oral verabreichtes Östronsulfat durch verschiedene Stoffwechselwege metabolisiert, was zu einem ansteigenden Serumspiegel des aktiveren Östradiols führt, wohingegen Mestranol nach der Verabreichung zu dem hochpotenten Ethinylöstradiol umgesetzt wird. Andere nicht-steroidale Östrogene schließen Indenestrol ein.
Viele weitere Substanzen sind als östrogen bekannt, d. h., diese interagieren mit zellulären Östrogenrezeptoren und imitieren die Effekte von Östrogenen. Von vielen Klassen solcher östrogener Substanzen wurde gezeigt, dass diese in deren östrogenen Effekten gewebsselektiv sind. Diverse Klassen von Molekülen fallen in diese Kategorie, beispielsweise: Chinole und kondensierte Chinole, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, wie beispielsweise 3,9-Dihydroxy-5H-benzofuro[3,2-c]chinolin-6-on sowie solche in der WO 96/ 19458 offenbarten; Phytoöstrogene, welche natürlich in Pflanzen, wie Futterpflanzen, Sojabohnen, Samen, Beeren und Nüssen vorkommen (Jordan et al., 1985) einschließlich Isoflavonen, wie Genistein und Genisteinglykoside, Equol, o-Desmethylangolensin, Biochanin A, Daidzein und Formononetin; Flavone, wie Phloretin, 4'-6-Dihydroxyflavon sowie Tricin und Coumestane, wie beispielsweise Coumestrol, 4'-O-Methylcoumestrol, Medicagol und Sativol, Lignane, wie beispielsweise Matairesinol, Enterodiol, Enterolakton, Guajasäure, Nordihydroguajasäure und Derivate hiervon, β-Sitosterol; Mykoöstrogene, wie Zeranol, Zearalenol und Zearalenon; Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten, wie beispielsweise Tamoxifen, Hydroxytamoxifen, Zindoxifen und deren Metabolite, Nafoxiden und Derivate, Clomiphen, Centchroman, Benzothiophene sowie verwandte Verbindungen, wie beispielsweise von Benzothiophen abgeleitetes LY 139478 (Eli Lilly), Raloxifen und Droloxifen, welche die Wirkung von Östrogenen in gewissen Arten von Zellen imitieren können, wohingegen diese dieser in anderen entgegenwirken (Raisz, 1996); sowie viele Phenole, welche eine strategisch angeordnete, nicht durch eine Alkylsubstitution in der ortho-Stellung beeinträchtigte Phenolhydroxylgruppe enthalten (siehe Jordan et al., 1985), einschließlich Octylphenyl, Nonylphenol, butyliertem Hydroxyanisol, Bisphenol A und Trihydroxy-8-phenylflavon. Es ist zu beachten, dass östrogene Substanzen in dieser allgemeinen Kategorie in der Literatur auch als 'Östrogene' bezeichnet werden (siehe beispielsweise Jordan et al, 1985). Wie schon vorstehend beschrieben, können (für 'Östrogene' wie von Merck definiert) östrogene Substanzen deren östrogene Effekte) direkt ausüben oder diese können nach Verabreichung eine metabolische Umsetzung in eine aktive Form benötigen. Beispielsweise umfasst die metabolische Aktivierung einiger Phytoöstrogene die Demethylierung zu Phenolen (Jordan et al., 1985).
Ferner kann eine Substanz einen östrogenen Effekt auf die nachfolgenden Arten ausüben. Diese kann den Effekt der endogenen Östrogene verstärken, d. h. von bereits in einem Empfänger vorliegenden Östrogenen (beispielsweise durch Erhöhen der Zahl der Östrogenrezeptoren), oder diese kann die biologischen Effekte) endogener Östrogene durch Fördern der Umsetzung zu einer potenteren Form oder durch Inhibieren deren Abbau verstärken.
Wie in dieser Beschreibung verwendet ist beabsichtigt, dass der Begriff Östrogen alle zuvor diskutierten Formen von Östrogenen und östrogenen Substanzen einschließt. Derivate, Metabolite und dergleichen von allen zuvor diskutierten Substanzen mit therapeutischer oder biologischer Wirkung auf Östrogen oder östrogene Derivate oder Metabolite der vorgenannten Substanzen werden ebenfalls von dem Begriff "Östrogen" umfasst.
Insbesondere ein aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren wirken, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewähltes Östrogen ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Eine Kombination von zwei oder mehr Östrogenen ist zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet. Daher umfasst der Begriff Östrogen wie er in dieser Beschreibung einschließlich der Patentansprüche verwendet wird, auch eine Kombination von zwei oder mehr Östrogenen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren wirken, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt Mikrobilder von Linsen von männlichen und weiblichen Wistar-Ratten. Die Linsen wurden mit 0,15 ng/l TGFβ2 kultiviert und nach 7 Tagen fotografiert. Die 1A zeigt eine typische Linse von einer männlichen Ratte, welche ausgeprägte vordere Opazitäten (Pfeil) entwickelte. Die 1B zeigt eine typische Linse von einer weiblichen Ratte. Etwas Aufflackern der Lichtquelle ist in dem oberen rechten Quadranten jeder Linse sichtbar. Maßstabsbalken 400 μm.
Die 2 zeigt Mikrobilder von ovariektomierten Ratten. Die Linsen wurden mit 0,15 ng/ml TGFβ2 kultiviert und nach 7 Tagen fotografiert. Die 2A zeigt eine Linse einer Ratte, die nur ein Vehikel erhalten hat. 2B zeigt eine Linse einer Ratte, welche einen Östrogenersatz erhalten hat. Die 2C zeigt eine Linse von einer Ratte, welche einen Progesteron-Ersatz erhalten hat. Maßstabsbalken 400 μm.
Die 3 zeigt Mikrofotografien von Linsen aus ovariektomierten Raten, welche ein Vehikel alleine (3A, 3C und 3E) oder einen Östrogenersatz (3B, 3D und 3F) erhalten haben. Die Linsen wurden mit 0,15 ng/ml an TGFβ2 kultiviert und am Ende einer 7-tägigen Kulturzeit fixiert. Serielle Schnitte wurden mit Haematoxylin und Eosin eingefärbt (3A und 3B) oder zur Lokalisation von α-glattem Muskelaktin (3C und 3D) sowie Typ I-Kollgen (3E und 3F) eingesetzt. Der Pfeil in der 3A zeigt spindelförmige Zellen in einem großen vorderen subkapsulären Plaque enthaltend viele verdichtete Kerne; die Sterne zeigen geschwollene Faserzellen um den Plaque herum an, in denen ebenfalls Vakuolen anwesend sind. Die Pfeilspitzen in der 3C und der 3E zeigen die an der Kapsel angelagerten Zellen, welche α-glattes Muskelaktin bzw. Typ I-Kollagen enthalten, an. ep, Epithelzellen; ca, Linsenkapsel; fc, Faserzellen. Maßstabsbalken 40 μm.
Die 4 zeigt Linsen von ovariektomierten Ratten, welche ein Vehikel alleine (4A und 4C) oder einen Östrogenersatz (4B und 4D) erhalten haben. Die Linsen wurden mit 0,15 ng/ml TGFβ2 kultiviert und am Ende einer 7-tägigen Kulturzeit fixiert. Serielle Schnitte wurden für Routinehistologie mit Haematoxylin und Eosin gefärbt (4A und 4D) oder für eine immunofluoreszente Lokalisation von Typ I-Kollagen eingesetzt (4C und 4D). Der Linsenäquator ist am Kopfende jedes Mikrobildes angeordnet. In den 4A und 4C zeigen die Pfeilspitzen nukleierte, entlang der Linsenkapsel zu dem hinteren Pol wandernde Zellen an. Maßstabsbalken 40 μm.
Die 5 zeigt Mikrofotografien von Rattenlinsen, welche intravitreale Injektionen von Vehikeln alleine (5A und 5C) oder TGFβ32 (5B und 5D) erhalten haben. Serielle Schnitte wurden für Routinehistologie mit Haematoxylin und Eosin gefärbt (5A und 5B) oder verblieben ungefärbt und wurden durch Phasenkontrastmikroskopie besichtigt (5C und 5D). Die Pfeilspitzen in den 5B und 5D zeigen nukleierte Zellen an, von denen die meisten unterschiedliche Grade an Schwellung anzeigen. ca, hintere Linsenkapsel. Maßstabsbalken 40 μm (5A und 5B); 25 μm (5C und 5D).
Die 6 zeigt Beispiele von zum Klassifizieren von TGFβ3-induzierten kataraktösen Veränderungen in Linsen eingesetzten Kategorien entsprechenden Linsen aus unreifen weiblichen Ratten. Grad 1: Die Linse zeigt bei der visuellen Überprüfung eine leichte Trübung, welche in dem Mikrobild nicht ersichtlich ist (A); Grad 2: Die Linse zeigt beträchtliche Körnigkeit (B) oder eine einzelne zentrale Opazität (C). Grad 3: Die Linse enthält zwei bis drei diskrete Opazitäten (D). Grad 4: Die Linse enthält mehr als drei diskrete Opazitäten. Etwas Aufflackern von der Lichtquelle ist insbesondere in dem unteren Teil jeder Linse sichtbar. Maßstabsbalken, 420 μm.
Die 7 zeigt den in vivo Effekt der Verabreichung von Tamoxifen oder Nafoxiden an unreife weibliche Ratten auf TGFβ-induzierten Katarakt. Drei Tage vor der Entfernung der Linsen wurden die Ratten mit der Testsubstanz oder alleine mit einem Vehikel (Kontrolle), injiziert, welche dann mit 0,4–0,75 ng/ml TGFβ2 für 5 Tage kultiviert wurden und mit Bezug auf die kataraktösen Veränderungen klassifiziert wurden. Grad 0, die Linse verbleibt transparent; Grade 1–4, zunehmende Schwere der kataraktösen Veränderungen, wie in Beispiel 5 definiert. Die Daten geben die vereinigten Ergebnisse von zwei Experimenten wieder. Die Sterne indizieren die Signifikanz der Zunahme in dem Größenverhältnis der Linsen des Grades 0–1 als Antwort auf die Behandlung: *p < 0,02; **p < 0.003, Fisher's Exakttest. CON, Kontrolle; TAMOX, Tamoxifen; NAFOX, Nafoxiden.
Die 8 zeigt den in vitro Effekt der Verabreichung von (A) Coumestrol oder Genistein und (B) α-Zearalenol oder Octylphenol auf aus unreifen weiblichen Ratten erhaltene Linsen. Die Linsen wurden vor der Ersetzung des Mediums (einschließlich der Testsubstanz) und der Zugabe von 0,4–0,75 ng/ml TGFβ2 für 1–2 Tage mit der Testsubstanz oder ohne Testsubstanz (Kontrolle) vorkultiviert. Nach weiteren 5 Tagen Kultur wurden die Linsen im Hinblick auf die kataraktösen Veränderungen klassifiziert. Grad 0, die Linse verbleibt transparent; Grade 1–4, zunehmende Schwere der kataraktösen Veränderungen, wie in Beispiel 5 definiert. Die Daten geben die vereinigten Ergebnisse von zwei Experimenten wieder. Die Sterne indizieren die Signifikanz der Zunahme in dem Größenverhältnis der Linsen des Grades 0–1 als Antwort auf die Behandlung: *p < 0,03; **p < 0.001, Fisher's Exakttest. CON, Kontrolle; COUM, Coumestrol; GEN, Genistein; α-ZEAR, α-Zearalenol; OCT-PHE, Octylphenol.
BESTE UND ANDERE FORMEN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Kommerziell erhältliche Östrogene oder östrogene Substanzen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, schließen 6-Hydroxychinolin, Coumestrol, Formononetin, Equol, Daidzein, Zearalenol, Nafoxiden, Octylphenol, Diethylstilbestrol, Genistein, Biochenin A, Phloretin und Tamoxifen ein. Östrogene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, welche als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon können gemäß den Verfahren der Literatur einfach hergestellt werden.
Östrogen kann gemäß der vorliegenden Erfindung durch Einführen in eine oder mehrere Augenkammern (beispielsweise die vordere Kammer) oder nahe dem Auge, durch eine Injektion an einer Stelle, von der das Östrogen leicht über das Kreislaufsystem zu dem Auge transportiert werden kann, oder durch orale Verabreichung oder Injektion in das Subjekt oder topische Anwendung, wie beispielsweise in einer Creme oder einem Nasenspray, verabreicht werden.
Östrogen kann auch in der Form von Hautpatches oder durch Implantation eines Depots von Östrogen zur langsamen Freisetzung verabreicht werden. Das Östrogen kann ebenfalls durch ein augenähnliches Membranpatch, welches direkt auf die Oberfläche des Auges aufgebracht wird, verabreicht werden. Verabreichungsrouten, wie von Lobo (1987) diskutiert, sind für die vorliegende Erfindung ebenfalls geeignet.
Die wirksame Menge an zum Gebrauch in der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung benötigtem Östrogen wird je nach dem eingesetzten Östrogen, der Darreichungsroute, der Stufe der Behandlungsbedingung und dem die Behandlung durchmachenden Wirt variieren und diese liegt letztlich im Ermessen des Arztes. Eine Dosis, welche in der Aussetzung der Linsenzellen einer Konzentration eines Östrogenbioäquivalents von ungefähr 10^–9 bis 10^–11 molar 17-β-Östradiol resultiert, ist geeignet.
Typischerweise wird das Östrogen als pharmazeutische oder ophthalmologische Formulierung dargeboten.
Die Behandlung mit Östrogen kann als Zusatz zu einer Augenoperation eingesetzt werden, um katarakt-verwandte Veränderungen, die als Ergebnis der chirurgischen Intervention beispielsweise in der der Behandlung einiger anderer Formen von Katarakt nachfolgenden, Bildung eines Sekundärkatarakts auftreten können, zu inhibieren. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls zur Behandlung von ansonsten unter einem größeren als normalen Risiko der Kataraktbildung stehenden oder erhöhten TGFβ-Spiegeln nahe der Linse ausgesetzten Individuen geeignet sein.
Pharmazeutische und ophthalmologische Formulierungen der vorliegenden Erfindung werden gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Formulierungstechniken hergestellt. Der Träger kann abhängig von der Form der für die Darreichung gewünschten Präparation jede Form aufweisen und die Formulierung kann optional andere therapeutische Bestandteile enthalten. Üblicherweise kann Östrogen in während einer Augenoperation eingesetzten herkömmlichen Spülungslösungen oder viskoelastischen Lösungen enthalten sein (Black, 1996). Mit Östrogen beschichtete oder imprägnierte Linsenimplantate können andere therapeutische Mittel enthalten und können gemäß herkömmlichen Techniken hergestellt werden.
BEISPIEL 1 (nicht von dem Schutzumfang der Patentansprüche umfasst)
In-Vivo-Effekt von Östrogen auf TGFβ-induzierten Katarakt.
VERFAHREN
17-β-Östradiol (1,3,5[10]-Östratrien-3, 17β-diol) und Progesteron (4-Pregnen-3,20-dion) wurden von Sigma (St Louis, MO) und humanes rekombinantes TGFβ2 von Genzyme (Cambridge, MA) erhalten. In einigen Experimenten stammten die Linsen von vor der Entfernung der Augen durch CO₂-Erstickung geopferten 6 bis 10 Monate alten erwachsenen männlichen und weiblichen Wistar-Ratten. Alternativ dazu wurden Ovariektomien wie von Murphy und Rogers (1981) beschrieben unter Anästhesie an 3 Monate alten weiblichen Wistar-Ratten durchgeführt. Nach Warten für 4 bis 5 Wochen, um die Beseitigung von verbliebenem Östrogen und Progesteron sicherzustellen, wurden den ovariektomierten Ratten täglich drei Injektionen von 0,5 μg 17-β-Östradiol oder von 5 mg Progesteron aufgelöst in Benzylalkohol-Erdnussöl (1:3, v/v) verabreicht. Kontrollratten erhielten alleine das Vehikel. Einen Tag später wurden die Ratten durch eine letale Dosis an Nembutal (Boehringer, NSW, Australien) geopfert, bevor die Augen entfernt wurden.
Linsenkulturen
Die Linsen wurden, wie von Hales et al. (1995) beschrieben, in einem Kulturmedium sorgfältig von umgebendem Okulargewebe freigelegt sowie mit TGFβ2, welches sofort zugefügt wurde, bei Endkonzentrationen von 0,025–4 ng/ml kultiviert. Rekombinantes humanes TGFβ2 wurde von Genzyme (Cambridge, MA, USA) erhalten. Serumfreies Medium 199 enthaltend Antibiotika und 0,1% Rinderserumalbumin wurde, wie bereits von Hales et al. (1995) beschrieben, als Kulturmedium eingesetzt. Die Kontrollen erhielten kein TGFβ. Das Kulturmedium wurde während der Kultivierungszeitspanne jeden zweiten Tag, ohne Zugabe von weiterem TGFβ, erneuert. Die Linsen wurden für 7 Tage kultiviert und die vordere Oberfläche wurde täglich fotografiert, um die Entwicklung der Opazitäten aufzuzeichnen. Am Ende der Kultivierungsperiode wurden die Linsen in Carnoy-Fixiermittel (Essigsäure/Ethanol, 1:3, v/v) fixiert und in Paraffin eingebettet.
Trübungsindex
TGFβ-induzierte Linsentrübung beginnt als diffuse Eintrübung auf der vorderen Oberfläche der Linse. Mit Fortschreiten der Antwort verdichten sich diese Regionen, um ausgeprägte Trübungen, welche eine reduzierte Fläche der Trübung zurücklassen, zu bilden. Bei geringen TGFβ-Konzentrationen werden nach 7 Tagen Kultur wenig ausgeprägte Opazitäten beobachtet und ein großer Anteil der Linsenoberfläche verbleibt trüb. Im Gegensatz dazu verdichten sich bei hohen Konzentrationen die meisten der anfänglich trüben Flächen, um viele ausgeprägte Opazitäten (wie in der 1A) zu bilden. Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde ein Verfahren zum Messen des Ausmaßes der Trübung entwickelt.
Mikrobilder von Linsen von 7-Tage-Kulturen wurden eingesetzt, um die Linsentrübung zu bestimmen. Jedes Mikrobild wurde mit einem 3CX-Röntgenstrahlscanner (XRS Corporation, CA, USA) unter Ein satz von Adobe Photoshop und XRS Omni Media Software gescannt. Unter Einsatz von NIH Image v 1.52 wurde dann eine Serie von Messungen durchgeführt. In einigen Mikrobildern machten es flackernde Reflexionen der Lichtquelle unmöglich, das Ausmaß der Trübung in gewissen Regionen (siehe beispielsweise 1B) zu bestimmen. Lediglich Mikrobilder, in denen die zugängliche Fläche größer als 75% der Gesamtfläche war, wurden eingesetzt. Die zugängliche Fläche (A) und die Gesamtfläche an Trübung (B) in dieser Fläche sowie die Gesamtanzahl an ausgeprägten Trübungen (C) wurden gemessen. Ein 'Trübungsindex' wurde dann wie folgt berechnet:
Histologie und Immunohistochemie
Serielle Schnitte von in Paraffin eingebetteten Linsen wurden, wie von Hales et al. (1995) beschrieben, für Routinehistologie oder für immunohistochemische Lokalisierung von α-glattem Muskelaktin oder Typ I-Kollagen prozessiert. Repräsentative Linsen von jeder Behandlungsgruppe wurden durch Routinehistologie (alle TGFβ2-Konzentrationen) und Immunolokalisation (0,15 ng/ml TGFβ2) untersucht.
ERGEBNISSE
Männlich-weiblich Unterschied in der Empfindlichkeit der Linsen für TGFβ
Linsen von männlichen Ratten entwickelten ausgeprägte vordere Opazitäten, wenn mit 0,15 ng/ml TGFβ2 kultiviert (1A). Im Ge gensatz dazu verblieben Linsen von weiblichen Ratten unter denselben Bedingungen transparent (1B), so wie es die Kontrolllinsen von ohne TGFβ kultivierten männlichen und weiblichen Ratten taten (nicht gezeigt). Allerdings entwickelten die Linsen von weiblichen Ratten bei einer höheren Konzentration an TGFβ2, 1 ng/ml, ebenfalls Trübungen (Tabelle 1). Für beide Geschlechter stieg die Reaktion mit der Konzentration an TGFβ signifikant an. TABELLE 1

* Dieser Wert ist signifikant geringer als der entsprechende Wert für Linsen von männlichen Ratten (p < 0,05 Studenten/Test).

Eine histologische Überprüfung der mit 0,15 ng/ml TGFβ2 kultivierten Linsen zeigte in den Linsen von Männchen ausgeprägte subkapsuläre Plaques enthaltend spindelförmige Zellen und extrazelluläre Matrix. Im Gegensatz dazu behielten die Linsen von Weibchen und der Kontrollen eine normale Linsenarchitektur mit einer Monoschicht aus auf der Fasermasse aufliegenden Epithelzellen. Die Immunolokalisation von α-glattem Muskelaktin und Typ I-Kollagen zeigte, dass für Männchen eine starke Reaktivität für diese beiden Katarakt-Marker in den durch Kultivierung mit 0,15 ng/ml TGFβ2 induzierten Plaques vorlag, wohingegen entsprechende Linsen von Weibchen keine Reaktivität für α-glattes Muskelaktin und lediglich in einigen wenigen Zellen des Epithels eine sehr schwache Reaktivität für Typ I-Kollagen zeigten. Diese Marker waren nicht in den Schnitten von bis zu 7 Tagen ohne TGFβ kultivierten Kontrolllinsen von Männchen oder Weibchen detektierbar.
Effekt des Hormonersatzes folgend der Ovariektomie auf die Linsenempfindlichkeit von TGFβ in vitro (nicht von dem Schutzbereich der Patentansprüche umfasst)
Die Linsen von ovariektomierten Ratten (ohne Hormonersatz) entwickelten Trübungen, wenn mit 0,15 ng/ml TGFβ kultiviert (Tabelle 2; 2A), einer Konzentration, von der gezeigt wurde, dass sie einen vernachlässigbaren Effekt auf Linsen von normalen weiblichen Ratten aufweist (Tabelle 1, 1B). Die Linsen von ovariektomierten Ratten, welche Östrogen erhielten, entwickelten allerdings unter diesen Bedingungen keine Opazitäten (Tabelle 2; 2B), wohingegen die Reaktion der Linsen von mit Progesteron behandelten Ratten ähnlich zu der der Linsen von vehikelbehandelten Ratten war (Tabelle 2; 2C). TABELLE 2

* Dieser Wert ist nicht signifikant verschieden von dem Wert für die Kontrollen (Vehikel alleine).

Histologisch stimmten die in ovariektomierten Ratten, die lediglich Vehikel enthielten, beobachteten Opazitäten mit subkapsulären Plaques oder Klumpen abnormer Zellen überein (3A). Die Reaktivität für die Katarakt-Marker, α-glattes Muskelaktin und Typ I-Kollagen, wurde vornehmlich innerhalb der subkapsulären Plaques beobachtet (3C und 3E). Im Unterschied dazu behielten die Linsen von östrogenbehandelten Ratten eine normale zelluläre Morphologie (3B) und keine Reaktivität für α-glattes Muskelaktin oder Typ I-Kollagen wurde detektiert (3D und F). In allen diesen Hinsichten waren Linsen aus Ratten, welche Progesteron-Ersatz erhielten, von Linsen aus Ratten, welche alleine Vehikel erhielten, nicht unterscheidbar.
Eine Vielzahl an subtileren histologischen Veränderungen wurde in Linsen von ovariektomierten Ratten beobachtet, die kein Östrogen erhielten. Üblicherweise wurde, im Allgemeinen in dem Bereich der Linse vor dem Äquator, ein an kortikalen Katarakt erinnerndes Anschwellen der kortikalen Faserzellen mit Hinweis auf Degeneration beobachtet (siehe z. B. 3A). Des Weiteren wurden nukleierte, entlang der hinteren Kapsel zu dem hinteren Pol wandernde Zellen beobachtet (siehe z. B. 4A); diese Zellen zeigten eine Reaktivität für Typ I-Kollagen (4C), aber nicht für α-glattes Muskelaktin. Keine dieser Veränderungen wurde in Linsen von östrogenbehandelten, ovariektomierten Ratten beobachtet, welche transpaxent blieben (4B und D). In den Linsen von normalen männlichen und weiblichen Ratten wurden TGFβ-Konzentrationen von mehr als 0,15 ng/ml benötigt, um so ausgeprägte, wie die in den 3A und 4A gezeigten Veränderungen zu induzieren. Daher schienen die Linsen von normalen Ratten jedes Geschlechts gegenüber den Effekten von TGFβ resistenter als solche von ovariektomierten Ratten, welche kein Östrogen erhielten.
Es wurde früher gezeigt, dass alle Säugetierisoformen von TGFβ kataraktöse Veränderungen in Linsenexplantaten und kultivierten Linsen induzieren, wobei TGFβ2 und TGFβ3 potenter als TGFβ1 sind (de longh et al., 1997). Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass das Eier stocköstrogen, 17-β-Östradiol, Rattenlinsen gegen TGFβ-induzierten Katarakt schützt, und, dass die Empfänglichkeit gegenüber durch TGFβ-induzierten kataraktösen Veränderungen geschlechtsabhängig ist. Das Kultivieren von Linsen aus ovariektomierten Weibchen mit TGFβ resultierte in einer merklichen Trübung der Linse. Östrogenersatz verhinderte diese Reaktion in vivo, aber ein Progesteron-Ersatz tat dies nicht (Tabelle 2; 2). Ferner wurde gefunden, dass die Linsen von männlichen Ratten empfänglicher für kataraktogene Effekte von TGFβ sind als solche von normalen Weibchen (Tabelle 1; 1) und die Linsen von normalen Ratten jeden Geschlechts schienen gegenüber den Effekten von TGFβ resistenter zu sein als solche von ovariektomierten Ratten (vgl. Tabellen 1 und 2). Die letztgenannten Ergebnisse sind ebenfalls mit einer Schutzrolle von Östrogen konsistent, weil die Zirkulation von Östrogen in männlichen Ratten vorliegt, obgleich in viel geringerem Spiegeln als in normalen Weibchen.
Durch TGFβ-induzierte Trübungen korrespondieren mit subkapsulären Plaques von anormalen Zellen einschließlich spindelförmigen Zellen, welche oft mit einem Verknittern der Linsenkapsel verbunden sind. Abnormale extrazelluläre Matrixablagerung tritt, hauptsächlich in den Plaques, ebenfalls auf. Alle diese Veränderungen sind typisch für vorderen und hinteren subkapsulären Katarakt und Sekundärkatarakt. Des Weiteren induziert TGFβ die Akkumulation von α-glattem Muskelaktin und Typ I-Kollagen sowohl in Explantaten als auch in kultivierten Linsen (Hales et al., 1994; Hales et al., 1995). Diese Proteine, welche im Allgemeinen nicht in Linsen gefunden werden, sind in humanem vorderen subkapsulären Katarakt und in Sekundärkatarakt anwesend.
Die vorliegende Studie zeigt, dass in Linsen von erwachsenen Ratten, wie beispielsweise frisch entwöhnten, TGFβ Trübungen mit morphologischen und molekularen Merkmalen von Katarakt induziert. In jedem Fall sind die mit Trübungen verbundenen Plaques morphologisch von humanem vorderen subkapsulären Frühstadium Katarakten nicht unterscheidbar (Worgul, 1982).
Die Opazitäten, welche sich in mit TGFβ kultivierten Rattenlinsen bilden, sind vordere subkapsuläxe Katarakte. Merkliche Ähnlichkeiten zwischen TGFβ-induziertem Katarakt und Sekundärkatarakt wurden bereits bemerkt (Liu et al., 1994; Hales et al., 1995). Ein Nachweis für hinteren subkapsulären Katarakt und kortikalen Katarakt typische subtile Veränderungen wird durch die vorliegende Studie bereitgestellt. Die vorliegende Studie weist nach, das TGFβ die Wanderung von abnormalen Zellen entlang der Linsenkapsel zu dem hinteren Pol induzieren kann (wie in der 4A). Von einer ähnlich abnormalen Wanderung von nukleierten Zellen entlang der hinteren Kapsel wird gedacht, die Basis für die humane hintere subkapsuläre Kataraktbildung zu sein (Eshagian, 1982). Einige Hinweise auf TGFβ-induzierte kataraktartige Veränderung wurden in der vorliegenden Studie ebenfalls in den kortikalen Fasern beobachtet (3A). Diese Studie von Ratten mit unterschiedlichen natürlichen oder induzierten Östrogenstatus weist nach, dass Östrogen gegen TGFβ-induzierten Katarakt schützt.
BEISPIEL 2 (nicht vom Schutzumfang der Patentansprüche umfasst)
Ovariektomiertes Rattenmodell: Effekt der Verabreichung von 17-β-Östradiol direkt auf die Linsen auf TGFβ-induzierten Katarakt.
VERFAHREN
Die Linsen von ovariektomierten Ratten wurden für zwei Tage mit oder ohne 10^–10 M 17-β-Östradiol vorkultiviert; phenolrotfreies essen tielles Minimalmedium (Sigma) enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin und Antibiotika wurde eingesetzt. Das Medium wurde dann ersetzt und TGFβ2 (0,15 ng/ml) wurden sofort zugefügt. Nach einer weiteren Kultivierung für 7 Tage wurde der Trübungsindex in derselben Weise wie zuvor für Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
ERGEBNISSE
Die östrogenbehandelten Linsen zeigten in Reaktion auf TGFβ eine geringfügige Trübung. Während an dem Zentrum einiger dieser Linsen innerhalb von 6 Tagen nach Zugabe von TGFβ ein kleiner Bereich an Verschleierung beobachtet wurde, wurde keine Tendenz beobachtet, mit der Zeit zu diskreten Opazitäten zu verdichten. Zahlreiche ausgeprägte Opazitäten entwickelten sich, wie in der Tabelle 3 gezeigt, in entsprechenden, parallel ohne Zugabe von Östrogen kultivierten Zellen.
TABELLE 3
Diese, die Verabreichung von Östrogen auf Linsen einschließende in-vitro Studie weist nach, dass Östrogen durch direktes Beeinflussen der Linsenzellen vor TGFβ-induzierten Katarakt schützt. Daher scheint es ebenfalls wahrscheinlich, dass Östrogen, wenn in vivo verabreicht (wie in Beispiel 1), durch direktes Zusteuern der Linsenzellen Schutz vor Katarakt verleiht, obwohl die Möglichkeit zusätzlicher indirekter Unterstützung nicht ausgeschlossen ist.
BEISPIEL 3
Induktion von Katarakt durch in-vivo Verabreichung von TGFβ.
VERFAHREN
Drei 9 Monate alte männliche Wistar-Ratten (ehemals gezüchtete Kolonie) wurden in dieser Studie eingesetzt. Jede Ratte wurde unter Einsatz von 5% Halothan in 70% NO₂/30% O₂ betäubt. Für die Dauer aller chirurgischen Verfahren wurde die Konzentration an Halothan dann auf 1,5% verringert. Die Ratte wurde dann mit deren linken Auge zuoberst unter einem präparierenden Mikroskop positioniert. Unter Einsatz einer feinen Nadel (Beckton Dickinson, USA; äußerer Durchmesser 360 μm) wurde in dem Bereich des Limbus eine kleine Punktion gemacht. Eine sehr feine, an eine 10 μl-Spritze (Hamilton) angeschlossene Nadel (Hamilton, USA; äußerer Durchmesser 200 μm) wurde sofort unter Einsatz eines modifizierten Mikromanipulators (Narashige, Japan) durch das Punktionsloch in den Glaskörper herabgelassen. 3 μl TGFβ2 (unter Einsatz einer von Genzyme gelieferten 20 ng/μl-Lösung) wurden dann langsam in den Glaskörper injiziert. Die Nadel wurde für 30 bis 60 Sekunden in Position belassen und dann langsam entnommen, um den Flüssigkeitsverlust aus dem Auge zu minimieren. Jede Injektionsprozedur wurde unter einem Präparationsmikroskop durchgeführt, um eine korrekte Positionierung der Nadel sicherzustellen und um jeden Flüssigkeitsverlust aus dem Auge zu überwachen. Nach der Injektion wurde jedes Tier in einem gewärmten Erholungsbehälter platziert. Sobald alle Ratten mit TGFβ inji ziert waren, wurde jede Ratte ein zweites Mal betäubt und dann dasselbe Protokoll verwendet, um das rechte Auge, um als Kontrolle zu dienen, mit 300 μl Vehikel alleine (30% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure) zu injizieren.
6, 12 oder 15 Wochen nach der Injektion wurden die Ratten durch CO₂-Erstickung geopfert und die Augen wurden entfernt und in Medium 199 enthaltende Kulturschalen platziert. Die Linsen wurden sorgfältig von umgebenden okularen Gewebe freigelegt und auf die Anwesenheit von Opazitäten untersucht, fotografiert, fixiert und für Routinehistologie und Immunolokalisation (wie in Beispiel 1 beschrieben) verarbeitet.
ERGEBNISSE
Alle Linsen aus TGFβ-injizierten Augen zeigten Hinweise auf Trübung und Veränderungen in der Zellarchitektur, wohingegen die Kontrolllinsen transparent blieben und eine normale Morphologie beibehielten. Keine der Linsen aus dieser Studie, welche eine Kontrolle oder TGFβ behandelt ist, zeigte während der Injektionsprozedur Hinweise auf Penetration der Nadel in die Linsenkapsel.
Nach in-vivo Behandlung mit TGFβ tendierten die Linsen dazu, ähnlich zu den mit TGFβ kultivierten Linsen (siehe Beispiel 1) mit subkapsulären Plaques von abnormalen Zellen verbundene Trübungen zu entwickeln. Allerdings schienen sich diese auf einen sich über eine gewisse Distanz zu den vorderen und hinteren Polen der Linse erstreckenden Bereich um den Linsenäquator herum zu beschränken. Diffusere Trübungen wurden in den meisten der Linsen beobachtet.
In den Kontrollen wurde eine normale Linsenmorphologie beobachtet. Beispielsweise waren die Faserzellen in dem hinteren Bereich regulär, parallel zu der Linsenkapsel ausgerichtet und keine Kerne waren anwesend (5A und 5C). In den Linsen, welche in vivo TGFβ ausgesetzt waren, waren die Faserzellen in dem Sinne atypisch, dass deren Kerne keinen Abbau durchmachten; nukleierte Zellen wurden gewöhnlich unterhalb der hinteren Linsenkapsel und ebenfalls in dem Linsenkortex beobachtet (5B und 5D). Diese nukleierten Faserzellen waren oft geschwollen und schienen in einigen Gebieten zu großen homogenen Bereichen zu degenerieren (5D). Veränderungen, wie die in den 5B und 5D gezeigten, sind für bei humanem subkapsulärem hinteren Katarakt und kortikalen Katarakt beobachtete Abnormalitäten typisch.
BEISPIEL 4
Ovariektomiertes Rattenmodell: Effekt der Verabreichung von Equilin, Coumestrol oder 6-Hydroxychinolin direkt auf die Linse (Equilin ist nicht vom Schutzumfang der Patentansprüche umfasst) auf TGFβ-induzierten Katarakt.
VERFAHREN
Weibliche Wistar-Ratten (12–14 Wochen alt) wurden wie in dem Beispiel 1 beschrieben ovariektomiert. Equilin wurde von Sigma, Coumestrol von Apin Chemicals (Abingdon, Oxon, UK) sowie 6-Hydroxychinolin von Aldrich (Milwaukee, WI, USA) erhalten. Fünf bis elf Wochen nach der Ovariektomie wurden die Linsen entfernt und in 5 ml Kulturmedium (phenolrotfreies essentielles Minimalmedium mit Antibiotika wie in Beispiel 2) platziert. Die Linsen wurden nach der Zugabe von Testsubstanzen (5 μl in Ethanol) für 2 Tage vorkultiviert, um die folgenden End konzentrationen zu ergeben: Equilin, 10^–9 M; Coumestrol, 10^–6 M und 6-Hydroxychinolin, 5 × 10^–7 M. Kontrollen erhielten lediglich 5 μl Ethanol. Das Medium wurde dann wie zuvor mit oder ohne Testsubstanz ersetzt und TGFβ2 (0,75 ng/ml) wurde zu den meisten Schalen hinzugegeben; einige wurden ohne Zugabe von TGFβ kultiviert, um als Kontrollen zu dienen. Alle zwei Tage während der Kultivierungszeit wurde das Medium ohne erneute Zugabe von TGFβ oder Testsubstanz erneuert. Die Linsen wurden täglich hinsichtlich Trübung überwacht und am Tag 7 fotografiert und die Mikrobilder wurden verwendet, um die Anzahl an diskreten Trübungen in jeder Linse zu bestimmen. Statistische Analysen wurden unter Einsatz von Statix-Software durchgeführt.
ERGEBNISSE
Die ohne Testsubstanz vorkultivierten Linsen entwickelten vor der Aussetzung gegenüber TGFβ extensive Bereiche von Trübung und viele diskrete Opazitäten erschienen am Ende der Kultivierungszeit. Die Testsubstanzen verringerten die Anzahl an unter diesen Bedingungen durch TGFβ induzierten Trübungen signifikant (Tabelle 5); verallgemeinert wurde in lediglich einer Linse (in der Equilin behandelten Gruppe) Trübung beobachtet. Die ohne Zugabe an TGFβ kultivierten Kontrolllinsen blieben nach der Vorkultivierung mit oder ohne Testsubstanz während der Kultivierungszeit transparent. Daher schützten unter diesen Bedingungen Equilin (ein steroidales Östrogen), Coumestrol (ein Phytoöstrogen) und 6-Hydroxychinolin (ein Chinolinderivat) alle die Linsen gegen kataraktogene Effekte von TGFβ.
TABELLE 5
BEISPIEL 5
Unreifes Rattenmodell: Effekt der in vivo Verabreichung von Tamoxifen und Nafoxiden auf TGFβ-induzierten Katarakt.
VERFAHREN
Unreife weibliche Wistar-Ratten (26–27 Tage alt) wurden für drei Tage subkutan mit Vehikel alleine (Benzylalkohol/Erdnussöl wie in Beispiel 1) oder mit Testsubstanz mit den nachfolgenden täglichen Dosen injiziert: Tamoxifen, 75 μg, Nafoxiden, 500 μg (beide von Sigma). An den folgenden Tagen wurden die Ratten geopfert und die Linsen wurden entfernt und mit TGFβ2 für 5 Tage kultiviert wie in Beispiel 4 beschrieben ausgenommen, dass lediglich 4 μl Kulturmedium eingesetzt wurde. Die Endkonzentration an TGFβ2 betrug 0,4 ng/ml (Expt 1) oder 0,75 ng/ml (Expt 2). An dem letzten Kulturtag wurden die Linsen fotografiert und gemäß der Schwere der Trübungsreaktion wie folgt klassifiziert: Grad 0, transparente Linse; Grad 1, ein kleiner zentraler Bereich an Trübung oder Verschleierung wurde durch direkte Beobachtung bemerkt, war aber zu schwach, um fotografisch aufgenommen zu werden; Grad 2, verallgemei nerte Trübung oder lediglich eine diskrete Opazität, Grad 3, zwei oder drei diskrete Opazitäten; Grad 4, mehr als drei diskrete Opazitäten. Beispiele von den Kategorien 1–4 entsprechenden Linsen sind in der 6 gezeigt. Es wurde eine statistische Analyse an vereinigten Daten unter Einsatz von GraphPad Prism Software ausgeführt, um zu bestimmen, ob das Verhältnis der Linsen ohne Trübung (Grad 0) für behandelte Ratten höher als für Kontrollratten war.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse des Klassifizierens der Reaktion der Linsen in jeder Behandlungsgruppe sind in der 7 gezeigt. Die meisten der mit TGFβ allein kultivierten Linsen entwickelten Regionen an Trübung und enthielten meist diskrete Opazitäten am Ende der Kulturzeit. Jede der Testsubstanzen verringerte, wie durch die Verschiebung in den Werten von rechts nach links in den Frequenzverteilungen angezeigt, den kataraktogenen Effekt von TGFβ. Alle Linsen waren nach Freilegung transparent und ein ergänzendes Experiment ergab, dass Linsen aus mit Tamoxifen und Nafoxiden bei denselben Dosen injizierten Ratten während der Kultivierung ohne TGFβ transparent blieben. Folglich schützen Tamoxifen und Nafoxiden (Östrogen Agonist/Antagonist) unter diesen Bedingungen die Linse gegen die kataraktogenen Effekte von TGFβ.
BEISPIEL 6
Unreifes Rattenmodell: Effekt der Verabreichung verschiedener östrogener Substanzen direkt zu der Linse auf TGFβ-induzierten Katarakt.
VERFAHREN
Coumestrol wurde von Apin Chemicals erhalten. Genistein, α-Zearalenol und Octylphenol wurden von Sigma erhalten. Die Linsen von normalen 26 – 27 Tage alten weiblichen Wistar-Ratten wurden in 4 ml Kulturmedium (wie in Beispiel 5) platziert und nach Zugabe der Testsubstanz (5 μl in Ethanol) bei den nachfolgenden Endkonzentrationen vorkultiviert: Genistein, 5 × 10^–6, Coumestrol, 10^–6 M (Expt 1); Genistein, 5 × 10^–6; Coumestrol, 10^–7 M (Expt 2) und α-Zearalenol, 10^–6 M; Octylphenol, 10^–7 M (Expte 3 & 4). Die Kontrollen erhielten lediglich 5 μl Ethanol. Die Vorkultivierungszeit betrug 1 Tag (Expte 1, 2 & 3) oder 2 Tage (Expt 4). Das Medium wurde dann wie zuvor mit oder ohne Testsubstanz ersetzt und TGFβ2 wurde zugefügt (0,75 ng/ml, Expte 1 & 2; 0,4 ng/ml, Expte 3 & 4). Repräsentative Linsen von jeder Behandlungsgruppe wurden auf diesem Weg ohne Zugabe an TGFβ verarbeitet, um die Effekte der Testsubstanzen alleine zu bestimmen. Das Medium wurde alle zwei Tage während der Kultivierungszeit ohne erneute Zugabe an TGFβ oder Testsubstanz erneuert. Die Linsen wurden für 5 Tage kultiviert und fotografiert und wie in Beispiel 5 klassifiziert. Eine statistische Analyse wurde mit vereinten Daten unter Einsatz von GraphPad Prism Software durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Verhältnis der kleine oder keine Trübungen (Grade 0–1) zeigenden Linsen für die behandelten Ratten höher war als für die Kontrollen.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse der Klassifizierung der Reaktion der Linsen in jeder Behandlungsgruppe sind in der 8 gezeigt. Alle der mit TGFβ alleine kultivierten Linsen entwickelten Trübungsbereiche und die meisten enthielten am Ende der Kultivierungszeit viele diskrete Trübungen. Jede der Testsubstanzen verringerte, wie durch die Verschiebung in den Werten von rechts nach links in den Frequenzverteilungen (8) indiziert, den kataraktogenen Effekt von TGFβ. Die ohne Zugabe an TGFβ kultivierten Kontrolllinsen verblieben nach der Kultivierung mit oder ohne Testsubstanz über die Kultivierungszeit transparent. Folglich schützen Coumestrol (ein Coumestan-Phytoöstrogen), Genistein (ein Isoflavon-Phytoöstrogen), α-Zearalenol (ein Mykoöstrogen) sowie Octylphenol (ein Alkylphenol) unter diesen Bedingungen alle die Linsen gegen den kataraktogenen Effekt von TGFβ.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Es sollte klar sein, dass die Verwendungen, Formulierungen und Linsenimplantate der vorliegenden Erfindung breite Verwendung in dem medizinischen und veterinärmedizinischen Gebiet finden werden.
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Claims

Verwendung eines aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogens bei der Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Prävention oder Kontrolle von TGFβ-induziertem Katarakt oder kataraktartigen Störungen eines Säugetiersubjekts.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Östrogen ein aus der aus Diethylstilbestrol, Dienestrol, Benzestrol, Broparoestrol, Chlorotrianisen, Dimestrol, Fosfestrol, Hexestrol, Methallenestril und Methestrol bestehenden Gruppe ausgewähltes nicht-steroidalen Östrogen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Östrogen ein Phytoöstrogen oder ein therapeutisch wirksames Derivat oder ein therapeutisch wirksamer Metabolit davon ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Phytoöstrogen aus Isoflavonen, Flavonen und Coumestanen ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung direkt in das Auge oder nahe am Auge des Subjekts angepasst ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Säugetiersubjekt ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der TGFβ-induzierte Katarakt anteriorer (vorderer) subkapsulärer Katarakt, posteriorer (hinterer) subkapsulärer Katarakt, kortikaler Katarakt oder Sekundärkatarakt ist.
Ophthalmologische Spülung oder viskoelastische Lösung zur Verwendung während einer Augenoperation umfassend ein aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten und therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewähltes Östrogen in einer Spülungslösung oder viskoelastischen Lösung.
Ophthalmologische Spülung oder viskoelastische Lösung nach Anspruch 8, wobei das Östrogen ein aus der aus Diethylstilbestrol, Dienestrol, Benzestrol, Broparoestrol, Chlorotrianisen, Dimestrol, Fosfestrol, Hexestrol, Methallenestril und Methestrol bestehenden Gruppe ausgewähltes nicht-steroidales Östrogen ist.
Ophthalmologische Spülung oder viskoelastische Lösung nach Anspruch 8, wobei das Östrogen ein Phytoöstrogen oder ein therapeu tisch wirksames Derivat oder ein therapeutisch wirksamer Metabolit davon ist.
Ophthalmologische Spülung oder viskoelastische Lösung nach Anspruch 10, wobei das Phytoöstrogen aus Isoflavonen, Flavonen und Coumestanen ausgewählt ist.
Verwendung eines aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogens bei der Herstellung einer Linse oder eines Linsenimplantats, die/das mit einem Östrogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon beschichtet oder imprägniert ist zur Prävention oder Kontrolle der Sekundärkataraktbildung im Auge eines Säugetiersubjekts in Folge einer Linsenimplantation.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Östrogen ein aus der aus Diethylstilbestrol, Dienestrol, Benzestrol, Broparoestrol, Chlorotrianisen, Dimestrol, Fosfestrol, Hexestrol, Methallenestril und Methestrol bestehenden Gruppe ausgewähltes nicht-steroidales Östrogen ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Östrogen ein Phytoöstrogen oder ein therapeutisch wirksames Derivat oder ein therapeutisch wirksamer Metabolit davon ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Phytoöstrogen aus Isoflavonen, Flavonen und Coumestanen ausgewählt ist.
Linsenimplantat, das mit einem aus der aus nicht-steroidalen Östrogenen, Chinolinen und kondensierten Chinolinen, die als Steroidrezeptor-Modulatoren fungieren, Phytoöstrogenen, Mykoöstrogenen und nicht-steroidalen Östrogenrezeptor-Agonisten/Antagonisten sowie therapeutisch wirksamen Derivaten und Metaboliten hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Östrogen beschichtet oder imprägniert ist.
Linsenimplantat nach Anspruch 16, wobei das Östrogen ein nicht-steroidales Östrogen ist, das aus der aus Diethylstilbestrol, Dienestrol, Benzestrol, Broparoestrol, Chlorotrianisen, Dimestrol, Fosfestrol, Hexestrol, Methallenestril und Methestrol bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Linsenimplantat nach Anspruch 16, wobei das Östrogen ein Phytoöstrogen oder ein therapeutisch wirksames Derivat oder ein therapeutisch wirksamer Metabolit davon ist.
Linsenimplantat nach Anspruch 18, wobei das Phytoöstrogen aus Isoflavonen, Flavonen und Coumestanen ausgewählt ist.