DE60217324T2

DE60217324T2 - Pharmazeutische zusammensetzung für die hormonersatztherapie

Info

Publication number: DE60217324T2
Application number: DE60217324T
Authority: DE
Inventors: Franz Christian New York HOLINKA; Jan Herman COELINGH BENNINK; Johannes Evert BUNSCHOTEN
Original assignee: Pantarhei Bioscience BV
Current assignee: Pantarhei Bioscience BV
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2022-05-18
Also published as: CA2447178C; WO2002094276A1; EP1390040B1; ATE350041T1; CA2447178A1; US20040198671A1; DK1390040T3; EP1390040A1; US8048869B2; ES2278924T3; CY1106457T1; DE60217324D1; PT1390040E

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Östrogenverbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln für die Hormonersatztherapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren der Hormonersatztherapie, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Östrogenkomponente an eine behandlungsbedürftige Person umfasst.
Hintergrund der Erfindung
Bei der Hormonersatztherapie (HRT), die gelegentlich als Östrogen-Ersatztherapie bezeichnet wird, werden Östrogene verabreicht, um Symptome, die sich aufgrund von Östrogenmangel oder Hypoöstrogenismus ergeben, zu verhindern oder zu behandeln. Hypoöstrogenismus kann bei weiblichen und männlichen Subjekten auftreten und kann zu Störungen und Krankheiten, wie Osteoporose (Verlust an Knochenmasse), Arteriosklerose, klimakterischen Symptomen, wie Hitzewallungen, Schweißausbrüchen, urogenitaler Atrophie, Stimmungsstörungen, Schlaflosigkeit und Herzklopfen, führen. Ein Östrogenmangel wurde auch in Verbindung mit kognitiven Störungen und der Alzheimer-Krankheit gebracht.
Hypoöstrogenismus und insbesondere chronischer Hypoöstrogenismus wird häufig bei Frauen in der (Peri)-menopause und Postmenopause beobachtet. Dieser Zustand kann jedoch auch auf Hypogonadismus oder Kastration sowie auf primäre Ovarialinsuffizienz, Behandlung beispielsweise von Brustkrebs mit Aromatase-Inhibitoren und eine Behandlung mit Homologen des Gonadotropin-Freisetzungshormons, von gutartigen gynäkologischen Krankheiten, wie Endometriose, Adenomyose, Uterusfibroide (Leiomyome), Dysmenorrhoe, Menorrhagie und Metrorrhagie, ergeben.
Endogene und exogene Östrogene erfüllen im weiblichen Organismus wichtige Funktionen im Zentralnervensystem und im Stoffwechsel: normale Östrogenspiegel liefern einen entscheidenden Beitrag für das Wohlbefinden der Frau. Trotz der weitverbreiteten Anwendung von Östrogenen bei HRT-Verfahren gibt es immer noch einige ungelöste Probleme. Bekannte Östrogene, insbesondere biogene Östrogene (d. h. Östrogene, die natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommen), werden sehr rasch aus dem Blutkreislauf beseitigt. Beispielsweise beträgt beim hauptsächlichen humanen biogenen Östrogen 17β-Östradiol die Halbwertszeit etwa 1 Stunde. Infolgedessen besteht zwischen getrennten Verabreichungsereignissen eine Tendenz zu erheblichen Schwankungen der Blutserumspiegel derartiger biogener Östrogene. So ist kurz nach der Verabreichung die Serumkonzentration üblicherweise um ein mehrfaches höher als die optimale Konzentration. Wenn ferner das nächste Verabreichungsereignis hinausgeschoben wird, nehmen die Serumkonzentrationen rasch auf ein Maß ab, bei dem das Östrogen nicht mehr physiologisch aktiv ist.
Das wichtigste, synthetisch veränderte, östrogene Steroid ist 17α-Ethinylöstradiol (EE). Dieses Östrogen wird in überwiegendem Maße bei der oralen hormonellen Empfängnisverhütung eingesetzt. Neben EE wird Mestranol in einigen Fällen eingesetzt; Mestranol ist eine "Arzneistoffvorstufe", die im Organismus zu EE metabolisiert wird. Die Leber stellt das Zielorgan für Östrogene dar. Die Sekretionsaktivität, die durch Östrogene in der menschlichen Leber beeinflusst wird, umfasst eine erhöhte Synthese der Transportproteine CBG, SHBG, TBG, von mehreren Faktoren, die für die Physiologie der Blutgerinnung von Bedeutung sind, und von Lipoproteinen. Die stark hepatische Östrogenizität von Ethinylöstradiol und Diethylstilböstrol (DES), insbesondere deren Einfluss auf Hämostase-Faktoren, kann eine Erklärung dafür sein, warum diese synthetischen Östrogene mit einem erhöhten Risiko in bezug auf Thromboembolismus verbunden sind. Zu weiteren unerwünschten Nebenwirkungen, über die in bezug auf die Verwendung von synthetischen Östrogenen berichtet worden ist, gehören Flüssigkeitsretention, Übelkeit, Blähungen, Cholelithiasis, Kopfschmerzen, Schmerzen in der Brust und ein erhöhtes Brustkrebsrisiko bei längerer Anwendung. Die vorerwähnten Mängel sind von erheblicher klinischer Bedeutung, wenn allgemein bekannte biogene oder synthetische Östrogene eingesetzt werden. Infolgedessen besteht ein immer noch unbefriedigtes Bedürfnis nach Östrogenen, die diese Mängel nicht zeigen und die in geeigneter Weise bei HRT-Verfahren eingesetzt werden können, um in wirksamer Weise die endogene Ovarialsekretion von Östradiol zu ersetzen, d. h. Symptome von Hypoöstrogenismus zu behandeln oder zu verhindern.
Bei einer HRT bedient man sich einer kontinuierlichen Verabreichung wirksamer Mengen eines Östrogens über längere Zeiträume hinweg. Die Verabreichung von Östrogenen ist jedoch mit einer endometrialen Proliferation bei Frauen in Zusammenhang gebracht worden und man ist sich heutzutage weitgehend darüber einig, dass eine Östrogentherapie "ohne Gegenmaßnahmen" das Risiko von endometrialem Krebs erheblich steigert (Cushing et al., Obstet. Gynecol., Bd. 91 (1998), S. 35-39; Tavani et al., Drugs Aging, Bd. 14 (1999), S. 347-357). Es gibt auch Anzeichen für eine signifikante Zunahme von Brustkrebs bei Langzeitanwendung (10-15 Jahre) einer Östrogentherapie (Tavani et al., Drugs Aging, Bd. 14 (1999), S. 347-357; Pike et al., Steroids, Bd. 65 (2000), S. 659-664).
Um den negativen Einflüssen einer Östrogentherapie ohne Gegenmaßnahmen entgegenzuwirken, wird heutzutage üblicherweise eine begleitende Behandlung mit Progestogen durchgeführt. Man nimmt an, dass eine regelmäßige Verabreichung von Progestogen die kontinuierliche Östrogenstimulation des Endometriums durch eine antiproliferative Wirkung hemmt und offensichtlich das Auftreten von endometrialen Karzinomen bei Frauen in der Postmenopause, die eine Östrogen-Ersatztherapie erhalten, verringert (Beral et al., J. Epidemiol. Biostat., Bd. 4 (1999), S. 191-210). Eine derartige begleitende Behandlung, im allgemeinen unter Verwendung von synthetischen Progestogenen, erfolgt entweder in Form von kontinuierlichen kombinierten Schemata zusammen mit Östrogen oder sequenziell, typischerweise jedes Monat für etwa 14 Tage, nach einer kontinuierlichen Östrogenbehandlung. Sequenzielle Behandlungsschemata sind mit unerwünschten Vaginalblutungen in Reaktion auf den periodischen Entzug von Progestogen verbunden, während eine kontinuierliche kombinierte Therapie häufig zu unvorhersagbaren Durchbruchblutungen führt. Eine inakzeptable Blutung dieses Typs ist der häufigste Grund für ein Absetzen der Hormonersatztherapie.
Zu weiteren nachteiligen Wirkungen von begleitenden Progestogenen gehören Ödeme, abdominale Krämpfe, Spannungsgefühle in der Brust und Stimmungssymptome (Hahn, Am. J. Obstet. Gynecol., Bd. 161, S. 1854-1858). Einige synthetische Progestogene beeinflussen in ungünstiger Weise die Lipidmuster und führen somit zu einer Beseitigung oder Abschwächung von östrogeninduzierten Kardioschutzwirkungen (Sitruk-Ware, Steroids, Bd. 65 (2000), S. 651-658).
Um die Notwendigkeit einer begleitenden Verabreichung von Progestogenen zu vermeiden, hat man versucht, Moleküle mit selektiven östrogenen Eigenschaften zu synthetisieren, um angestrebte Wirkungen in bestimmten Zielgeweben, wie Knochen, Leber, Gehirn und Gewebe, die eine Herzschutzfunktion vermitteln, zu erzielen, während eine minimale Beeinflussung von anderen Geweben, wie Endometrium und Brust, hervorgerufen wird. Diese Bemühungen beruhten auf der gewonnenen Erkenntnis, dass die Wechselwirkung von Östrogenen mit Proteinen, die die Östrogen-Reaktivität regulieren, d. h. Östrogen-Rezeptoren, in verschiedenen Zielgeweben unterschiedlich sein kann. Östrogene Verbindungen, die in selektiver Weise Östrogen-Rezeptoren in verschiedenen Zielgeweben modulieren und von denen daher zu erwarten ist, dass sie selektive Östrogen-agonistische/antagonistische Wirkungen ausüben, sind als selektive Modulatoren von Östrogenrezeptoren (SERMs) bekannt (Katzenellenbogen et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., Bd. 74 (2000), S. 279-285; Burger, Horm. Res. Suppl. 3 (2000), S. 25-29).
Von einem optimalen SERM wird erwartet, dass er differenzierte zelluläre Funktionen beeinflusst, ohne eine Proliferation herbeizuführen, da eine verstärkte Proliferation mit einem erhöhten Krebsrisiko verbunden ist. Bezüglich des Endometriums wurde gezeigt, dass eine übermäßige Proliferation (Hyperplasie) eine Vorstufe von endometrialem Krebs darstellt. Ferner entfällt bei einem optimalen SERM die Notwendigkeit einer begleitenden Progestogen-Behandlung, so dass auch deren Nebenwirkungen entfallen. Ein Beispiel für einen synthetischen SERM, der im Handel erhältlich ist, ist Raloxifen, ein Benzothiophen-Antiöstrogen (Clemett et al., Drugs, Bd. 60 (2000), S. 379-411). Ein Nachteil von bekannten synthetischen SERMs besteht darin, dass diese Moleküle im menschlichen Körper natürlicherweise nicht vorkommen und sie eine geringe Ähnlichkeit mit Östrogen-Rezeptor-Agonisten haben, die im menschlichen Körper auftreten, z. B. mit Östrogenen, wie Östron, Östradiol und Östriol.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung bestimmter östrogener Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren der Hormonersatztherapie bereitzustellen, wobei eine Östrogenkomponente verabreicht wird, die nicht die Mängel aufweist, die bei bekannten biogenen oder synthetischen Östrogenen beobachtet werden, wobei diese Östrogenkomponente SERM-artige Eigenschaften aufweist, so dass eine gemeinsame Verabreichung von Progestogen vermieden werden kann. Ferner strebt das vorliegende Verfahren die Verwendung einer Östrogenkomponente an, die biogen ist oder die eine starke Ähnlichkeit mit einer biogenen östrogenen Substanz zeigt.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass sich diese Ziele erreichen lassen, indem man östrogene Substanzen der folgenden Formel verwendet
wobei in der Formel R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen bedeuten; jeder der Reste R₅, R₆ und R₇ eine Hydroxylgruppe bedeutet; und nicht mehr als drei der Reste R₁, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoffatome bedeuten.
Diese Östrogene unterscheiden sich von den üblicherweise bei der Östrogenersatztherapie eingesetzten Östrogenen, d. h. Ethinylöstradiol, Östradiol und dessen Estern, wie das Acetat, Valerat oder Benzoat, Mestranol, den konjugierten Equinöstrogenen und Östronsulfat.
Ein bekannter Vertreter dieser Gruppe von östrogenen Substanzen ist 1,3,5(10)-Östratrien-3,15α,16α,17β-tetrol, auch unter den Bezeichnungen Estetrol, Östetrol und 15α-Hydroxyöstriol bekannt. Östetrol ist ein Östrogen, das bei der humanen Schwangerschaft durch die fötale Leber erzeugt wird. Die Konzentrationen an unkonjugiertem Östetrol im mütterlichen Plasma erreicht ein Maximum von etwa 1,2 ng/ml bei Endtermin der Schwangerschaft und sind im fötalen Plasma etwa 12-fach höher als im maternellen Plasma (Tulchinsky et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., Bd. 40 (1975), S. 560-567).
Obgleich sich die Erfinder nicht auf eine Theorie festlegen wollen, wird angenommen, dass die Östrogenkomponente in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Weise mit den Östrogen-Rezeptoren im humanen Endometrium in Wechselwirkung tritt, die sich klar von der Wechselwirkung unterscheidet, die bei Östrogenen, die üblicherweise bei der Hormonersatztherapie eingesetzt werden, beobachtet werden. Wie nachstehend erläutert, kann diese Erscheinung sehr wohl mit einer selektiven Wechselwirkung mit den ERα- und ERβ-Östrogen-Rezeptoren verbunden sein, die für die vorliegenden östrogenen Substanzen beobachtet worden ist. Es wird angenommen, dass Östetrol auf ähnliche Weise wie ein SERM wirkt, indem es in selektive Wechselwirkung mit den Östrogen-Rezeptoren tritt, um östrogene Wirkungen zu erreichen, während die klassischen wachstumsfördernden Wirkungen der vorerwähnten, üblicherweise eingesetzten Östrogene auf ein Minimum beschränkt werden. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe zeigen beispielsweise im Vergleich zu Östradiol und Ethinylöstradiol eine begrenzte proliferative Wirkung auf das Endometrium. Somit besteht im Gegensatz zur Situation bei diesen anderen Östrogenen keine Notwendigkeit zur Behandlung mit einem begleitenden Progestogen (oder Antiprogestogen), insbesondere dann nicht, wenn die vorliegenden östrogenen Substanzen in mäßigen Dosen verabreicht werden. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Östrogenkomponenten ohne ergänzendes Progestogen oder Antiprogestogen sorgt für die volle günstige Wirkung der Östrogenersatztherapie, ohne dass damit die Nachteile der letztgenannten Hormone verbunden sind.
Im Jahre 1970 veröffentlichten Fishman et al. ("Fate of 15α-Hydroxyestriol-³H in Adult Man", J. Clin. Endocrinol. Metab., Bd. 31 (1970), S. 436-438) die Ergebnisse einer Studie, bei der mit Lithium markiertes 15α-Hydroxyöstriol (Östetrol) intravenös zwei erwachsenen Frauen verabreicht wurde. Es wurde festgestellt, dass das Östretol rasch und vollständig im Urin als Glucosidurinat ausgeschieden wurde und dass praktisch kein Stoffwechsel mit Ausnahme einer Konjugation stattfand.
Im Zeitraum zwischen den Jahren 1975 und 1985 untersuchten mehrere Forschungsgruppen die Eigenschaften von Östetrol und berichteten über dessen östrogene Wirkungsstärke und uterotrophe Aktivität. Die wichtigsten Veröffentlichungen, die in diesem Zeitraum erschienen, sind nachstehend aufgeführt:

• Levine et al., "Uterine vascular effects of estetrol in nonpregnant ewes", Am. J. Obstet. Gynecol., Bd. 148 (73) (1984), S. 735-738. "Bei intravenöser Verabreichung an nicht-trächtige Mutterschafe ist Östetrol 15- bis 30-fach weniger wirksam als Östriol und 17β-Östradiol in bezug auf die Uterus-Vasodilatation".
• Jozan et al., "Different effects of oestradiol, oestriol, oestetrol and of oestrone on human breast cancer cells (MCF-7) in long term tissue culture", Acta Endocrinologica, Bd. 98 (1981), S. 73-80: "Die agonistische Wirkungsstärke von Östetrol bei der in vitro-Zellproliferation beträgt etw 2 % der für 17β-Östradiol festgestellten Wirkung."
• Holinka et al., "Comparison of effects of estetrol and tamoxifen with those of estriol and estradiol on the immature rat uterus", Biol. Reprod., Bd. 22 (1980), S. 913-926: "Subkutan verabreichtes Östetrol zeigt eine sehr schwache uterotrophe Wirkung und ist erheblich weniger wirksam als 17β-Östradiol und Östriol".
• Holinka et al., "In vivo effects of estetrol on the immature rat uterus", Biol. Reprod., Bd. 20 (1979), S. 242-246: "Subkutan verabreichtes Östetrol weist eine sehr schwache uterotrophe Aktivität auf und ist erheblich weniger wirksam als 17β-Östradiol und Östriol".
• Tseng et al., "Heterogeniety of saturable estradiol binding sites in nuclei of human endometrium. Estetrol studies", J. Steroid Biochem., Bd. 9 (1978), S. 1145-1148: "Die relative Bindung von Östetrol an Östrogen-Rezeptoren im humanen Endometrium beträgt 1,5 % der Bindung von 17β-Östradiol".
• Martucci et al., "Direction of estradiol metabolism as a control of its hormonal action-uterotrophic activity of estradiol metabolites", Endocrin., Bd. 101 (1977), S. 1709-1715: "Eine kontinuierliche Verabreichung von Östetrol aus einem subkutanen Depot zeigt eine sehr schwache uterotrophe Aktivität und ist erheblich weniger wirksam als 17β-Östradiol und Östriol".
• Tseng et al., "Competition of estetrol and ethynylestradiol with estradiol for nuclear binding in human endometrium", J. Steroid Biochem., Bd. 7 (1976), S. 817-822: "Die relative Bindungskonstante der Östetrol-Bindung an den Östrogen-Rezeptor im humanen Endometrium beträgt 6,25 %, verglichen mit 17β-Östradiol (100 %)".
• Martucci et al., "Uterine estrogen receptor bindung of catecholestrogens and of estetrol (1,3,5(10)-estratriene-3,15alpha,16alpha,17beta-tetrol)", Steroids, Bd. 27 (1976), S. 325-333: "Die relative Bindungsaffinität von Östetrol an den Rattenuterus-Zytosol-Östrogen-Rezeptor beträgt 0,5 % des Werts von 17β-Östradiol (100%).

Ferner beträgt die relative Bindungsaffinität von Östetrol an den Rattenuterus-Nucleus-Östrogen-Rezeptor 0,3 % des Werts von 17β-Östradiol (100%)".
Ein gemeinsamer Aspekt sämtlicher vorstehender Veröffentlichungen besteht darin, dass die Autoren die östrogene Wirkungsstärke von Östetrol untersucht haben. Ohne Ausnahme kommen sie zu dem Schluss, dass Östetrol ein schwaches Östrogen darstellt. In einigen der zitierten Artikel wurde festgestellt, dass die östrogene Wirkungsstärke von Östetrol geringer als die eines anderen biogenen Östrogens, nämlich 17β-Östradiol ist, das als relativ schwaches Östrogen gilt (z. B. verglichen mit Ethinylöstradiol). Unter Berücksichtigung dieser Befunde ist es nicht überraschend, dass das Interesse an Östetrol seit den frühen 80-er Jahren abgenommen hat und dass seitdem keine Veröffentlichungen mehr über die Eigenschaften von Östetrol erschienen sind.
US-5 468 736 (Hodgen) beschreibt ein Verfahren der Hormonersatztherapie unter Verabreichung von Östrogen zusammen mit einer Menge an Antiprogestin (Antiprogestogen), die die östrogeninduzierte endometriale Proliferation bei Frauen hemmt. In Beispiel 3 wird die kombinierte Verwendung von Östetrol und Lilopriston erwähnt. Die Beispiele liefern keine Hinweise über die Art und die Häufigkeit der Verabreichung oder bezüglich des eingesetzten Dosierungsniveaus. Ein Nachteil, der mit der Verwendung von Antiprogestinen (oder Antiprogestogenen), wie Lilopriston, verbunden ist, besteht in der Gefahr, dass eine abnormale endometriale Morphologie, d. h. eine zystische Hyperplasie, induziert wird, wie es bei Frauen beobachtet worden ist, die einer Antiprogestogen-Behandlung gegen Endometriose unterzogen worden sind (Murphy et al., Fertil. Steril., Bd. 95 (1995), S. 761-766).
US-5 340 586 (Pike et al.) betrifft Zusammensetzungen und Verfahren, die zur Behandlung von Frauen nach einer Oophorektomie wirksam sind, wobei eine wirksame Menge einer östrogenen Zusammensetzung und einer androgenen Zusammensetzung über einen bestimmten Zeitraum hinweg bereitgestellt werden. In diesem US-Patent wird angegeben, dass zu natürlichen und synthetischen östrogenen Zusammensetzungen, die verwendet werden können, natürliche Östrogenhormone und verwandte Produkte gehören, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Östradiol, Östradiolbenzoat, Östradiolcypionat, Östradiolvalerat, Östron, Diethylstilböstrol, Piperazinöstronsulfat, Ethinylöstradiol, Mestranol, Polyöstradiolphosphat, Östriol, Östriolhämisuccinat, Chinestrol, Östropipat, Pinestrol und Östronkaliumsulfat, und dass ferner equine Östrogene, wie Equilelinin, Equilelininsulfat und Östetrol, verwendet werden können. Mit Ausnahme der erschöpfenden Aufzählung von bekannten Östrogenen findet sich in diesem US-Patent kein Hinweis auf Östetrol (das irrtümlicherweise als Equinöstrogen bezeichnet wird).
Die gleiche erschöpfende Liste von Östrogenen findet sich in den folgenden Patenten:

• US-4 762 717 (Crowley): Ein kontrazeptives Verfahren umfasst die sequenzielle Verabreichung von (1) einer Kombination aus Luteinisierungshormon freisetzendem Hormon (LHRH) und Östrogen und (2) einer Kombination von LHRH und Östrogen und Progestogen.
• US 5 130 137 (Crowley): Ein Verfahren zur Behandlung einer gutartigen Ovarialsekretionsstörung, das die sequenzielle Verabreichung von (1) einer Kombination von Luteinisierungshormon freisetzendem Hormon (LHRH) und Östrogen und (2) einer Kombination von LHRH und Östrogen und Progestogen umfasst.
• US-5 211 952 (Spicer et al.): Ein kontrazeptives Verfahren, umfassend die Verabreichung einer Gonadotropinhormon freisetzenden Hormon (GnRH)-Zusammensetzung in einer Menge, die eine Hemmung der Ovulation bewirkt, und die Verabreichung von Östrogen und Progestogen, um die Serumspiegel oberhalb eines definierten Minimalwerts zu halten.
• US-5 340 584 (Spicer et al.): Ein Verfahren zur Empfängnisverhütung oder zur Behandlung gutartiger gynäkologischer Störungen, umfassend die Verabreichung einer GnRH-Zusammensetzung für einen ersten Zeitraum in einer Menge, die eine Unterdrückung der ovarialen Östrogen- und Progesteron-Erzeugung bewirkt, die gleichzeitige Verabreichung einer östrogenen Zusammensetzung in einer Menge, die eine Verhinderung der Symptome von Östrogenmangel bewirkt, und die gleichzeitige Verabreichung eines Progestogens in einer Menge, die eine Aufrechterhaltung des Serumspiegels dieses Progestogens auf einem Wert bewirkt, der zur Verminderung der endometrialen Zellproliferation wirksam ist.
• US-5 340 585 (Pike et al.): Ein Verfahren zur Behandlung gutartiger gynäkologischer Störungen bei einer Patientin, bei der das Risiko einer endometrialen Stimulation durch östrogene Zusammensetzungen auf ein Minimum beschränkt ist oder fehlt, umfassend das Verabreichen einer GnRH-Zusammensetzung in einer Menge, die eine Unterdrückung der Erzeugung von ovarialem Östrogen und Progesteron bewirkt, und das Verabreichen einer östrogenen Zusammensetzung in einer Menge, die eine Verhinderung der Symptome von Östrogenmangel bewirkt.
• WO-00/73416 (Yifang et al.): Ein Verfahren zur Regulierung der Fertilität eines Wirts, umfassend das Kontaktieren von Ovarialzellen des Wirts mit einer sicheren und wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein antisense-Oligonucleotid umfasst, das komplementär zur Nucleotidsequenz des Rezeptors des follikelstimulierenden Hormons (FSH) ist. Die Möglichkeit einer kombinierten Verabreichung eines derartigen antisense-Oligonucleotids mit einem östrogenen Steroid wird in dieser Anmeldung erwähnt.

Die Vorteile der vorliegenden Erfindung lassen sich ohne die gleichzeitige Verabreichung von Antiprogestogenen, LHRH-Zusammensetzungen, GnRH-Zusammensetzungen und/oder antisense-Oligonucleotiden, die komplementär zur Nucleotidsequenz des Rezeptors des follikelstimulierenden Hormons (FSH) ist, wie sie in den vorerwähnten Patenten vorgeschlagen werden, erreichen. Ferner kann die vorliegende Erfindung in geeigneter Weise auf Individuen angewandt werden, bei denen eine Oophorektomie vorgenommen worden ist oder bei denen das Risiko einer endometrialen Stimulation durch östrogene Zusammensetzungen nicht auf ein Minimum beschränkt ist oder fehlt. Ferner ist beim vorliegenden Verfahren nicht die Verwendung einer Zubereitung mit langsamer Wirkstofffreisetzung erforderlich, wie dies von den meisten vorerwähnten US-Patenten verlangt wird.
Im Hinblick auf die geringe östrogene Wirkungsstärke der erfindungsgemäß verwendeten östetrolartigen Substanzen ist es überraschend, dass diese Substanzen in wirksamer Weise in einem Hormonersatzverfahren verwendet werden können. Obgleich die Erfinder sich nicht auf eine Theorie festlegen lassen wollen, wird angenommen, dass die unerwartete Wirksamkeit von enteral oder parenteral verabreichten, östetrolartigen Substanzen sich aus der Kombination von unvorhergesehenen günstigen pharmakokinetischen (ADME) und pharmakodynamischen Eigenschaften dieser Substanzen ergibt.
Bezüglich der pharmakokinetischen Eigenschaften der vorliegenden östrogenen Substanzen haben die Erfinder festgestellt, dass deren in vivo-Halbwertszeit erheblich länger als die von anderen biogenen Östrogenen ist. So haben zwar Östetrol und östetrolartige Substanzen eine relativ geringe östrogene Wirkungsstärke, können aber in HRT-Verfahren in wirksamer Weise eingesetzt werden, da ihre geringe Wirkungsstärke durch eine relativ hohe Stoffwechselstabilität, die sich durch eine lange Halbwertszeit zeigt, ausgeglichen wird.
Eine vorteilhafte Eigenschaft der vorliegenden östrogenen Substanzen liegt in der Tatsache, dass Sexualhormon bindendes Globulin (SHBG) kaum diese östrogenen Substanzen bindet, was bedeutet, dass im Gegensatz zu den meisten bekannten Östrogenen die Serumspiegel für die biologische Aktivität repräsentativ und unabhängig von den SHBG-Spiegeln sind.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der vorliegenden östrogenen Substanzen ergibt sich aus ihrer relativen Unempfindlichkeit gegenüber Wechselwirkungen mit anderen Arzneistoffen (Arzneistoff-Arzneistoff-Wechselwirkungen). Es ist bekannt, dass bestimmte Arzneistoffe die Wirksamkeit von Östrogenen, wie Ethinylöstradiol, verringern können, und dass andere Arzneistoffe deren Aktivität erhöhen können, was zu möglichen verstärkten Nebenwirkungen führt. Gleichermaßen können Östrogene den Stoffwechsel anderer Arzneistoffe stören. Im allgemeinen ist der Einfluss von anderen Arzneistoffen auf Östrogene auf eine Störung der Resorption, des Stoffwechsels oder der Ausscheidung dieser Östrogene zurückzuführen, während der Einfluss von Östrogenen auf andere Arzneistoffe auf konkurrierende Vorgänge im Stoffwechsel zurückzuführen ist.
Die klinisch wichtigste Gruppe von Östrogen-Arzneistoff-Wechselwirkungen tritt mit Arzneistoffen auf, die hepatische, mikrosomale Enyzme induzieren, welche die Östrogen-Plasmaspiegel unter eine therapeutische Konzentration senken können (z. B. antikonvulsive Mittel; Phenytoin, Primidon, Barbiturate, Carbamazepin, Ethosuximid und Methosuximid; antituberkulose Arzneistoffe, wie Rifampin; antifungale Arzneistoffe, wie Griseofulvin). Die vorliegenden östrogenen Substanzen sind von der Herauf- und Herunterregulierung von mikrosomalen Leberenzymen (z. B. P450s) weniger stark abhängig und auch weniger empfindlich gegenüber einer Konkurrenz mit anderen P450-Substraten. Gleichermaßen stören sie nicht in signifikantem Umfang den Stoffwechsel von anderen Arzneistoffen.
Die Konjugate der meisten Östrogene, wie sie in der Leber gebildet werden, werden in die Galle ausgeschieden und können durch Darmbakterien im Kolon unter Freisetzung des aktiven Hormons aufgebrochen werden, das dann reabsorbiert werden kann (enterohepatischer Kreislauf). Es gibt klinische Berichte, die die Ansicht stützen, dass die enterohepatische Rezirkulation von Östrogenen bei Frauen, die Antibiotika, wie Ampicillin, Tetracyclin und dergl., einnehmen, abnimmt. Konjugierte Formen der vorliegenden östrogenen Substanzen werden kaum in die Galle ausgeschieden, was bedeutet, dass sie im wesentlichen unempfindlich gegenüber Arzneistoffen sind, die die enterohepatische Rezirkulation von anderen Östrogenen beeinflussen.
Die vorstehenden Feststellungen dienen der Erläuterung, warum die erfindungsgemäßen östrogenen Substanzen auch unter Arzneistoff-Arzneistoff-Wechselwirkungen leiden und somit eine sehr konsistente, d. h. vorhersagbare Wirkung ausüben. Somit ist die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen östrogenen Substanzen in hohem Maße zuverlässig.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung bestimmter östrogener Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren der Hormonersatztherapie, wobei das Verfahren die orale Verabreichung einer wirksamen Menge einer Östrogenkomponente an eine Person, die einer derartigen Behandlung bedarf, ohne begleitende Progestogen- oder anti-Progestogen-Behandlung umfasst, wobei die Östrogenkomponente aus der Gruppe, die aus Substanzen der folgenden Formel ausgewählt ist, besteht
wobei in der Formel R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen bedeuten; jeder der Reste R₅, R₆ und R₇ eine Hydroxylgruppe bedeutet; und nicht mehr als drei der Reste R₁, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoffatome bedeuten; und
Derivate dieser Substanzen, wobei das Wasserstoffatom von mindestens einer der Hydroxylgruppen in der Formel durch einen Acylrest einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure, -sulfonsäure oder -sulfaminsäure mit 1-25 Kohlenstoffatomen; Tetrahydrofuranyl; Tetrahydropyranal; oder einen geradkettigen oder verzweigten Glycosidrest mit 1-20 Glycosid-Einheiten pro Rest ersetzt ist; und Gemische davon;
wobei die Zusammensetzung kein Progestogen oder anti-Progestin enthält.
Das erfindungsgemäße HRT-Verfahren kann in vorteilhafter Weise zur Behandlung sämtlicher bekannter Formen von Hypoöstrogenismus verwendet werden, z. B. von Hypoöstrogenismus bei (peri)-menopausalen und postmenopausalen Frauen, Hypoöstrogenismus, der sich aus Hypogonadismus oder Kastration ergibt, sowie Hypoöstrogenismus, der sich aus primärer Ovarialinsuffizienz, Behandlung beispielsweise von Brustkrebs mit einem Aromatase-Inhibitor oder einer Behandlung beispielsweise von gutartigen gynäkologischen Krankheiten mit einem Analogen des Gonadotropin freisetzenden Hormons ergibt. Beispiele für Manifestationen von Hypoöstrogenismus, die in wirksamer Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren sowohl bei Frauen als auch bei Männern behandelt oder verhütet werden können, umfassen Osteoporose, Arteriosklerose, kognitive Störungen und Alzheimer-Krankheit. Das Verfahren kann auch in vorteilhafter Weise bei der (prophylaktischen) Behandlung von klimakterischen Symptomen, wie Hitzewallungen, Schweißausbrüchen, urogenitaler Atrophie, Stimmungsstörungen, Schlaflosigkeit und Herzklopfen eingesetzt werden. Das vorliegende Verfahren eignet sich in besonderer Weise zur Therapie oder Prophylaxe von Osteoporose und klimakterischen Symptomen.
Der Ausdruck "Östrogenkomponente", der im gesamten vorliegenden Dokument verwendet wird, umfasst Substanzen, die in vivo zur Auslösung einer östrogenen Antwort befähigt sind, sowie Vorläufer, die in vivo zur Freisetzung einer derartigen Östrogenkomponente befähigt sind, wenn sie erfindungsgemäß eingesetzt werden. Damit Östrogenkomponenten eine derartige Antwort auslösen, müssen sie normalerweise an einen Östrogen-Rezeptor binden, wobei diese Rezeptoren in verschiedenen Geweben innerhalb des Säugetierkörpers auftreten.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung nicht nur die Verwendung von Östrogenkomponenten, die speziell in der vorliegenden Anmeldung erwähnt sind, umfasst, sondern auch Metaboliten dieser Hormone, die eine vergleichbare in vivo-Funktionalität aufweisen. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, dass beispielsweise Östriol ein Metabolit von 17β-Östradiol ist. Der Ausdruck "östrogene Substanzen", der im vorliegenden Dokument verwendet wird, umfasst nicht mit Tritium (³H) markierte östrogene Substanzen, wie mit Tritium markiertes Östetrol.
Die vorliegenden östrogenen Substanzen unterscheiden sich von biogenen und synthetischen Östrogenen, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, insofern, als sie mindestens vier Hydroxylgruppen enthalten. Die vorliegenden Substanzen weisen eine spezielle Beschaffenheit insofern auf, als der 5-gliedrige Ring im Steroidgerüst 3 Hydroxylsubstituenten umfasst anstelle von 0-2.
Bekannte Östrogene, die mindestens 4 Hydroxylgruppen enthalten, und Derivate davon sind:
1,3,5(10)-Östratrien-2,3,15α,16α,17β-pentol-2-methylether,
1,3,5(10)-Östratrien-2,3,15β,16α,17β-pentol-2-methylether
1,3,5(10)-Östratrien-2,3,16α,17β-tetrol,
1,3,5(10)-Östratrien-3,4,16α,17β-tetrol-4-methylether,
1,3,5(10)-Östratrien-3,15α,16α,17β-tetrol,
1,3,5(10)-Östratrien-3,15α,16α,17β-tetroltetraacetat,
1,3,5(10)-Östratrien-3,15β,16β,17β-tetroltetraacetat.
Vorzugsweise handelt es sich bei der östrogenen Substanz, die als Wirkstoff in der vorliegenden Zusammensetzung eingesetzt wird, um ein sogenanntes biogenes Östrogen, d. h. ein Östrogen, das natürlicherweise im menschlichen Körper vorkommt, um einen Vorläufer eines biogenen Östrogens oder um Gemische davon. Da biogene Östrogene natürlicherweise im fötalen und weiblichen Körper vorkommen, ist das Auftreten von Nebenwirkungen nicht zu erwarten, insbesondere dann nicht, wenn die Serumspiegel, die sich durch die exogene Verabreichung derartiger Östrogene ergeben, nicht wesentlich die natürlich auftretenden Konzentrationen übersteigen. Da die Serumspiegel von Östetrol im Fötus um ein Mehrfaches höher sind als die Serumspiegel bei schwangeren Frauen, und da bekannt ist, dass der Fötus besonders anfällig ist, gilt Östetrol als besonders sicheres biogenes Östrogen. Das Auftreten von Nebenwirkungen ist nicht zu erwarten, insbesondere wenn die Serumspiegel, die sich durch die exogene Verabreichung derartiger Östrogene ergeben, nicht wesentlich die natürlicherweise auftretenden (fötalen) Konzentrationen übersteigen. Bei synthetischen Östrogenen, wie Ethinylöstradiol, besteht ein (dosisabhängiges) Risiko von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Thromboembolie, Flüssigkeitsretention, Übelkeit, Blähungen, Cholelithiasis, Kopfschmerzen, Schmerzen in der Brust und ein erhöhtes Risiko von Brustkrebs bei längerer Anwendung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die östrogene Substanz 4 Hydroxylgruppen. Ferner bedeutet in der vorerwähnten Formel R₁ vorzugsweise ein Wasserstoffatom. In dieser Formel bedeuten mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 3 der Gruppen R₁, R₂, R₃ und R₄ ein Wasserstoffatom.
Die östrogenen Substanzen der vorstehenden Formel umfassen verschiedene Enantiomere, da die Kohlenstoffatome, die die Hydroxylsubstituenten R₅, R₆ und R₇ tragen, chiral aktiv sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die vorliegende östrogene Substanz mit einer 15α-Hydroxygruppe substituiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz mit einer 16α-Hydroxygruppe substituiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Substanzen mit einer 17β-Hydroxygruppe substituiert. Insbesondere sind die östrogenen Substanzen in 15α-, 16α- und 17β-Stellung trihydroxysubstituiert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bedeutet R₃ eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxygruppe. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeuten die Gruppen R₁, R₂ und R₄ Wasserstoffatome, wobei in diesem Fall dann, wenn R₃, R₅, R₆ und R₇ Hydroxylgruppen bedeuten, es sich bei der Substanz um 1,3,5(10)-Östratrien-3,15,16,17-tetrol handelt. Ein bevorzugtes Isomeres der letztgenannten Substanz ist 1,3,5(10)-Östratrien-3,15α,16α,17β-tetrol (Östetrol).
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Derivaten der vorliegenden östrogenen Substanzen, die als Vorläufer verwendet werden können, wobei das Wasserstoffatom von mindestens einer der Hydroxylgruppen durch einen Acylrest einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure, -sulfonsäure oder -sulfaminsäure mit 1-25 Kohlenstoffatomen; Tetrahydrofuranyl; Tetrahydropyranal; oder einen geradkettigen oder verzweigten Glycosidrest mit 1-20 Glycosid-Einheiten pro Rest ersetzt ist.
Zu typischen Beispielen für Vorläufer, die in geeigneter Weise erfindungsgemäß eingesetzt werden können, gehören Ester, die erhalten werden können, indem man die Hydroxylgruppen der östrogenen Substanzen mit Substanzen umsetzt, die eine oder mehrere Carboxygruppen (M⁺-OOC-) enthalten, wobei M⁺ ein Wasserstoff- oder (Alkali)-Metallkation bedeutet. Somit handelt es sich bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform bei den Vorläufern um Derivate der östrogenen Substanzen, bei denen das Wasserstoffatom von mindestens einer der Hydroxylgruppen in der genannten Formel durch -CO-R ersetzt ist, wobei R einen Kohlenwasserstoffrest mit 1-25 Kohlenstoffatomen bedeutet. Vorzugsweise bedeutet R Wasserstoff oder einen Alkyl-, Alkenyl- oder Arylrest mit 1-20 Kohlenstoffatomen.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung sind besonders ausgeprägt, wenn die Zusammensetzung bei einer länger anhaltenden Hormonersatztherapie verwendet wird, um die negativen Auswirkungen von chronischem Hypoöstrogenismus auf ein Minimum zu beschränken. Daher umfasst das Verfahren der Hormonersatztherapie vorzugsweise die Verabreichung der Östrogenkomponente für einen Zeitraum von mindestens einem Monat und vorzugsweise von mindestens drei Monaten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Östrogenkomponente während eines Zeitraums von mindestens vier Monaten und vorzugsweise von mindestens 6 Monaten verabreicht. Die Östrogenkomponente wird üblicherweise während eines Zeitraums von mindestens 10 Tagen und vorzugsweise von mindestens 20 Tagen ununterbrochen verabreicht. Die Unterbrechungszeiträume sind vorzugsweise nicht länger als 20 Tage und insbesondere nicht länger als 10 Tage. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Östrogenkomponente ununterbrochen während eines Zeitraums von mindestens 4 und vorzugsweise von mindestens 6 Monaten verabreicht.
Der hier verwendete Ausdruck "ununterbrochen" bedeutet, dass die Östrogenkomponente in relativ regelmäßigen Abständen verabreicht wird, wobei keine (therapeutisch) signifikanten Unterbrechungen vorliegen. Naturgemäß können geringfügige Unterbrechungen auftreten, die die gesamte Wirksamkeit des vorliegenden Verfahrens nicht beeinträchtigen. Derartige Abweichungen werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Bei einer bevorzugten Ausführungsform (und stärker arithmetisch ausgedrückt) gilt das Verabreichungsschema als ununterbrochen, wenn der längste Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Verabreichungen nicht mehr als das 3,5-fache des durchschnittlichen Abstands beträgt. Insbesondere beträgt dieser längste Abstand nicht mehr als das 2,5-fache und ganz besonders nicht mehr als das 1,5-fache des durchschnittlichen Abstands.
Das vorliegende Verfahren bedient sich einer oralen Verabreichung der Östrogenkomponente.
Eine orale Verabreichung eignet sich in idealer Weise für eine tägliche (mindestens einmal) Verabreichung.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen und zur Erzielung eines höheren Akzeptanzgrads werden erfindungsgemäß vorzugsweise Verabreichungsabstände von 1 Tag, 1 Woche oder 1 Monat eingehalten. Dosierungsschemata, bei denen eine einmalige tägliche orale Verabreichung erfolgt, werden besonders bevorzugt.
Die Östrogenkomponente wird vorzugsweise in einer Menge verabreicht, die das Erzielen einer Blutserumkonzentration von mindestens 1 ng pro Liter, vorzugsweise von mindestens 10 ng pro Liter und ganz besonders von mindestens 100 ng pro Liter bewirkt. Im allgemeinen übersteigt die sich ergebende Blutserumkonzentration der Östrogenkomponente 100 μg pro Liter nicht, vorzugsweise übersteigt sie 50 μg pro Liter nicht und ganz besonders übersteigt sie 25 μg pro Liter nicht.
Bei der erfindungsgemäßen Anwendung wird die Östrogenkomponente üblicherweise in einer Menge von weniger als 1 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise von weniger als 0,4 mg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Um durch die Verabreichung der Östrogenkomponente einen signifikanten Einfluss zu erreichen, ist es ratsam, sie in einer Menge von mindestens 1 μg pro kg Körpergewicht pro Tag zu verabreichen. Vorzugsweise beträgt die verabreichte Menge mindestens 5 μg pro kg Körpergewicht pro Tag.
Eine orale Verabreichung des Wirkstoffes wird vorzugsweise in einer Menge von weniger als 400 μg pro kg Körpergewicht pro Tag und insbesondere von weniger als 200 μg pro kg Körpergewicht pro Tag vorgenommen. Um einen signifikanten Einfluss der Verabreichung des Wirkstoffes zu erreichen, ist es ratsam, eine orale Verabreichung in einer Menge von mindestens 2 μg pro kg Körpergewicht pro Tag vorzunehmen. Vorzugsweise beträgt die oral verabreichte Menge mindestens 5 μg pro kg Körpergewicht pro Tag. Im vorliegenden Verfahren wird (insbesondere bei Anwendung beim Menschen) die Östrogenkomponente üblicherweise in einer durchschnittlichen Dosierung von mindestens 0,05 mg pro Tag und vorzugsweise von mindestens 0,1 mg pro Tag verabreicht.
Die erfindungsgemäße Verwendung umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge der Östrogenkomponente an eine Person, die einer derartigen Behandlung bedarf. Die Mengen, die zur Erzielung der angestrebten Wirkung notwendig sind, unterscheiden sich von Individuum zu Individuum und werden aufgrund von Faktoren, wie Grad des Östrogenmangels bei dem Individuum, Körpergewicht, Verabreichungsweg und Wirksamkeit der speziell verwendeten östrogenen Substanz, festgelegt. Geeigneterweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die tägliche Verabreichung von mindestens 0,001 und vorzugsweise von 0,001-1000 mg der Östrogenkomponente. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße HRT-Verfahren die orale oder transdermale Verabreichung von täglich 0,01 bis 1000 mg und insbesondere von 0,1-100 mg der Östrogenkomponente.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass die vorliegenden östrogenen Substanzen eine wesentlich höhere Affinität zum Östrogen-Rezeptor α (ERα) als zum Östrogen-Rezeptor β (Erβ) aufweisen. Diese Eigenschaft stellt ein besonderes Merkmal dieser östrogenen Substanzen dar, von dem angenommen wird, dass es eng mit den günstigen Eigenschaften dieser Substanzen, die sich beim erfindungsgemäßen Verfahren ergeben, verknüpft ist.
Aufgrund der gegebenen Komplexität der ER-Signalgebung in Zusammenhang mit der gewebespezifischen Expression von ERα und ERβ und deren Co-Faktoren hat man nunmehr erkannt, dass ER-Liganden als Östrogen-Agonisten oder auch als Östrogen-Antagonisten in einer gewebespezifischen Weise wirken können. Im Fall der vorliegenden östrogenen Substanzen kann die Wechselwirkung mit Co-Faktoren zu sehr unterschiedlichen biologischen Wirkungen dieser Substanzen in verschiedenen Geweben führen.
Es ist bekannt, dass ERα- und ERβ-Rezeptoren signifikant unterschiedliche Aminosäuresequenzen in der Ligandenbindungsdomäne und in den carboxyterminalen Transaktivierungsdomänen (etwa 56 % Aminosäureidentität) und nur eine 20 %-ige Homologie in ihrer aminoterminalen Transaktivierungsdomäne aufweisen. Dies erklärt, warum die vorliegenden östrogenen Substanzen eine wesentlich höhere Affinität zum ERα-Rezeptor als zum ERβ-Rezeptor aufweisen können.
Die vorliegenden östrogenen Substanzen zeigen zwar eine wesentlich höhere Affinität für ERα als für ERβ, sind aber nicht als Antagonisten des ERβ-Rezeptors anzusehen. Um die Gefahr von unerwünschten proliferativen Wirkungen auszuschließen, ist es ratsam, keine übermäßig hohen Dosen der vorliegenden östrogenen Substanzen zu verwenden. Vorzugsweise wird die Östrogenkomponente in einer durchschnittlichen täglichen Dosis verabreicht, die 50 mg, 40 mg, 30 mg oder 20 mg nicht übersteigt. Insbesondere übersteigt die durchschnittliche tägliche Dosis 10 mg nicht. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die durchschnittliche tägliche Dosis 5 mg nicht übersteigt.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bedient man sich einer oralen Verabreichung der aktiven Östrogenkomponente. Der Ausdruck "orale Verabreichung", der hier verwendet wird, umfasst auch eine orale Sondenverabreichung. Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass trotz ihrer geringen Wirkungsstärke Östetrol und verwandte östrogene Substanzen in vorteilhafter Weise oral verabreicht werden können. Obgleich sich die Erfinder nicht auf eine Theorie festlegen wollen, wird angenommen, dass die unerwartete Wirksamkeit von oral verabreichten östetrolartigen Substanzen sich aus der Kombination spezieller pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Eigenschaften dieser Substanzen ergibt.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die orale biologische Verfügbarkeit von östetrolartigen Substanzen überraschend hoch ist und dass ihre in vivo-Halbwertszeit erheblich länger ist als die von biogenen Östrogenen. Obgleich somit Östetrol und östetrolartige Substanzen eine relativ geringe östrogene Wirkungsstärke aufweisen, können sie in wirksamer Weise auf oralem Wege verabreicht werden, da die oralen Dosierungen, die zur Erzielung der angestrebten Wirkung erforderlich sind, ähnlich den Dosen sind, die beispielsweise für 17β-Östradiol verwendet werden.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der oralen Verabreichung von Östetrol und östetrolartigen Substanzen liegt in der Tatsache, dass die hepatischen Wirkungen dieser Substanzen für minimal angesehen werden, da sie während des sogenannten "ersten Durchgangs" kaum metabolisiert werden. Die Wirkung des ersten Durchgangs von oral verabreichten Arzneistoffen bezieht sich auf den Vorgang des Arzneistoffabbaus durch die Leber während der Passage eines Arzneistoffes von der ursprünglichen Einnahme bis in den Blutkreislauf. Nach Resorption aus dem intestinalen Lumen gelangen oral zugeführte Wirkstoffe über die Leber in den Organismus. Diese Tatsache ist von spezieller Bedeutung für östrogene Mittel, da die Leber ein Zielorgan für Östrogene darstellt. Eine orale Einnahme von Östrogenen führt zu starken östrogenen Wirkungen in der Leber. Therapeutisch gleichwertige Dosen von biogenen Östrogenen führen bei oraler Anwendung zu klaren Antworten von hepatischen Parametern, z. B. zu einer Zunahme von SHBG, CBG, Angiotensinogen und HDL (Lipoprotein hoher Dichte). Diese hepatischen Wirkungen von Östrogenen werden auch beobachtet, wenn equine Östrogenzubereitungen (sogenannte konjugierte Östrogene) verwendet werden. Ethinylöstradiol und Diethylstilböstrol (DES) weisen eine noch größere hepatische Östrogenizität auf. Elger et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., Bd. 55 (3/4) (1995), S. 395-403, berichten, dass EE oder DES eine wesentlich höhere hepatozelluläre als systemische Östrogenizität aufweisen: in bezug auf ihre FSH-Sekretionshemmaktivität sind diese Östrogene in der Leber 4- bis 18-fach stärker wirksam als Östronsulfat.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung für eine tägliche Verabreichung konzipiert, d. h. sie stellt eine Tagesdosierungseinheit dar. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform enthält die Tagesdosierungseinheit 0,001-1000 mg der Östrogenkomponente. Insbesondere liegt die Menge der Östrogenkomponente im Bereich von 0,01-1000 mg. Besonders bevorzugt ist es, dass die Menge im Bereich von 0,1-100 mg liegt. Ganz besonders bevorzugte Tagesdosierungseinheiten enthalten höchstens 50 mg, 40 mg, 30 mg, 20 mg oder 10 mg der Östrogenkomponente. Am meisten bevorzugt ist es, dass die Tagesdosierungseinheit höchstens 5 mg der Östrogenkomponente enthält.
Wie vorstehend erwähnt, stellt es einen wichtigen Vorteil der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung dar, dass sie dazu verwendet werden kann, die Vorteile einer Östrogenersatztherapie zu erreichen, ohne dass damit die Nachteile einer signifikanten, östrogeninduzierten, endometrialen Proliferation verbunden sind, wodurch die Notwendigkeit zur Verwendung ergänzender Hormone, z. B. von Progestogenen und anti-Progestogenen, zur Unterdrückung einer derartigen endometrialen Proliferation vermieden wird.
Somit enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung praktisch keine Progestogene oder anti-Progestogene. Insbesondere enthält die vorliegende Zusammensetzung keine Progestogene oder anti-Progestogene. Die kombinierte Verwendung von Östrogenen und Gonadotropin-freisetzendem Hormon, Östrogenen und Luteinisierungshormon freisetzendem Hormon sowie Östrogenen und antisense-Oligonucleotiden in bezug zum Gen des Rezeptors des follikelstimulierenden Hormons wurde in der vorstehend erörterten Literatur vorgeschlagen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bedient sich das vorliegende Verfahren keines Analogen des Gonadotropin-freisetzenden Hormons. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedient sich das vorliegende Verfahren keines Luteinisierungshormon freisetzenden Hormons. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedient sich das Verfahren keines antisense-Oligonucleotids, das komplementär zur Nucleotidsequenz des Rezeptors des follikelstimulierenden Hormons (FSH) ist.
Da somit die Vorteile der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der vorliegenden Substanzen und ihrer Vorläufer als einzige Wirkstoffe erzielt werden können, ist es bevorzugt, dass die Zusammensetzung praktisch keine weiteren Sexualhormone oder Sexualhormon-Antagonisten zusätzlich zur Östrogenkomponente enthält. Insbesondere beträgt der Gesamtanteil an Sexualhormonen oder Sexualhormon-Antagonisten, die sich von der Östrogenkomponente unterscheiden, weniger als 1 Gew.-% und insbesondere weniger als 0,1 Gew.-% der Östrogenkomponente.
Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Zusammensetzung in geeigneter Weise verschiedene weitere ergänzende pharmazeutische Komponenten enthalten kann. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, zusätzlich androgene oder antiresorptive Mittel, wie Calcitonine und Bisphosphonate, aufzunehmen. Ferner kann es vorteilhaft sein, Komponenten, die als anabolische Mittel wirken, wie Fluoridsalze, Wachstumshormon, insulinartige Wachstumsfaktoren, Parathyroidhormon, Statine, Calcium und Vitamin D, aufzunehmen. Ferner kann es vorteilhaft sein, kardiovaskuläre Schutzmittel, wie Statine und Folsäure, aufzunehmen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht als Beschränkung anzusehen sind. Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Beispielen und in den Ansprüchen beschriebenen Merkmale können einzeln und in beliebiger Kombination Bestandteile zur Realisation der Erfindung in ihren unterschiedlichen Formen darstellen.
Beispiele
Beispiel 1
Eine vaginale Hornhautbildung wurde als gewebespezifischer und östrogenempfindlicher Endpunkt zur Bestimmung der Östrogenizität von Östetrol (E4) sowohl nach oraler als auch nach subkutaner Verabreichung an hypoöstrogene Ratten gewählt. 17α-Ethinylöstradiol (EE), 17β-Östradiol (E2) und Träger (10 % Ethanol/Sesamöl) dienten in diesen biologischen Tests als Kontrollen.
Die Gewichtszunahme des Uterus in der Ratte ist als Maß für die Östrogenizität gebräuchlicher. Jedoch reagiert das Uterusgewicht auf Progesteron, Testosteron und andere Mittel, die nicht in charakteristischer Weise als Östrogene angesehen werden. In den frühen 1920er Jahren wurde festgestellt, dass die follikuläre Flüssigkeit aus dem Eierstock des Schweins einen oder mehrere Faktoren enthält, die eine Hornhautbildung/Keratinisierung des vaginalen Epithels in der Ratte herbeiführen (Allen und Doisy, JAMA, Bd. 81 (1923), S. 819-821; Allen und Doisy, Am. J. Physiol., Bd. 69 (1924), S. 577-588). Die Reaktion der sogenannten vaginalen Hornhautbildung bei Ratten ergab im Anschluss daran einen biologischen Test zur Bestimmung der Östrogenizität. Eine vaginale epitheliale Hornhautbildung/Keratinisierung in Ratten nach Ovarektomie kann nur durch Verbindungen hervorgerufen werden, die als echte Östrogene gelten (Jones et al., Fert. Steril., Bd. 24 (1973), S. 284-291). Die vaginale, epitheliale Hornhautbildung/Keratinisierung stellt daher einen hochgradig selektiven Endpunkt zur Bestimmung der Wirkungsstärke von Östrogenen dar (Reel et al., Fund. Appli. Toxicol., Bd. 34 (1996), S. 288-305).
Ausgewachsene weibliche CD-Ratten wurden einer Ovarektomie unterzogen, um einen Östrogenmangel herbeizuführen. Vaginale Spülungen wurden täglich an sieben Tagen durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die Ratten vaginale Kastratabstriche zeigten (vorwiegend von Leukozyten im vaginalen Abstrich und ein ähnliches Erscheinungsbild wie bei einem vaginalen Diöstrus-Abstrich). Vaginale Kastratabstriche sind ein Anzeichen dafür, dass eine vollständige Ovarektomie erreicht worden ist. Die Behandlung begann nach Beendigung der 7-tägigen Abstrichnahme (Tag 0 = erster Tag der Dosierung). Die Tiere erhielten einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen eine Dosis. Die täglichen vaginalen Spülungen wurden 7 Tage nach Einleitung der Dosierung fortgesetzt, um eine vaginale Hornhautbildung als Anzeichen einer östrogenen Reaktion nachzuweisen. Ein Tropfen der vaginalen Waschflüssigkeit wurde auf einen Glasobjektträger gebracht und mit dem Lichtmikroskop geprüft, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von verhornten Epithelialzellen festzustellen. Vaginale Spülungen wurden vor der Dosierung an den Tagen 0-6 und vor der Obduktion am Tag 7 durchgeführt.
Der vaginale Hornhautbildungs-Biotest wurde durchgeführt, um das östrogene Profil von E4 bei subkutaner Verabreichung (sc) an ovarektomierte ausgewachsene Ratten zu bestimmen. E2 wurde als positive Kontrolle verwendet. Der Träger (10 % Ethanol/Sesamöl) diente als negative Kontrolle. Steroide wurden in absolutem Ethanol gelöst und sodann mit Sesamöl (10 % Ethanol/Sesamöl) auf die endgültige Konzentration gebracht. Eine vaginale östrogene Reaktion erfolgte bei 8/8 Ratten am Tag 2 und hielt bis zum Tag 7 bei Ratten an, die eine subkutane Injektion von 50 μg/kg/Tag E2 an 7 Tagen erhalten hatten (Tabelle 1). Mit dem Träger behandelte Tiere zeigten keine vaginale epitheliale Hornhautbildung (Tabelle 1). Das Einsetzen der vaginalen epithelialen Hornhautbildung war bei Ratten mit einer subkutanen Injektion von 0,1, 0,3, 1,0 und 3,0 mg/kg/Tag E4 dosisabhängig und begann am gleichen Behandlungstag (Tag 2), wie es für E2 beobachtet wurde (Tabelle 1). Bei 0,1 mg/kg/Tag E4 zeigten bereits 4/8 Ratten und bei 0,3 mg/kg/Tag E4 sogar 7/8 Ratten eine vaginale östrogene Reaktion am Tag 7. Bei 1,0 und 3,0 mg/kg/Tag E4 zeigten sämtliche Ratten eine vaginale östrogene Reaktion am Tag 7 (Tabelle 1).
Tabelle 1: Vaginale östrogene Reaktion bei ovarektomierten Ratten bei subkutaner (sc) Behandlung mit 17β-Östradiol (E2) oder Östetrol (E4). Die Daten sind als die Anzahl der Ratten angegeben, die von den insgesamt behandelten Ratten eine vaginale Hornhautbildung zeigten (Verhältnis).
Der vaginale Hornhautbildungs-Biotest wurde durchgeführt, um das östrogene Profil von E4 bei oraler Verabreichung (po) an ovarektomierte ausgewachsene Ratten zu bestimmen. EE wurde als positive Kontrolle verwendet. Der Träger (10 % Ethanol/Sesamöl) diente als die negative Kontrolle. Steroide wurden in absolutem Ethanol gelöst und sodann mit Sesamöl (10 % Ethanol in Sesamöl) auf die endgültige Konzentration gebracht. Eine vaginale östrogene Reaktion erfolgte bei sämtlichen Ratten (8/8), die 50 μg/kg/Tag EE erhalten hatten, am Tag 7 (Tabelle 2). Gleichermaßen wurde am Tag 7 eine vaginale, epitheliale Hornhautbildung bei sämtlichen Ratten (8/8) beobachtet, die auf oralem Wege mit 0,1, 0,3, 1,0 oder 3,0 mg/kg/Tag E4 behandelt worden waren (Tabelle 2), während mit dem Träger behandelte Tiere keine vaginale epitheliale Hornhautbildung zeigten (0/8). Überraschenderweise war selbst bei Ratten, die relativ niedrige Dosen E4 erhalten hatten (z. B. 0,1 mg/kg/Tag), das Einsetzen der vaginalen Hornhautbildung (definiert als die Anzahl der Tiere, die an den Tagen 1-3 der Studie reagierten) bei auf oralem Wege behandelten Tieren rascher als bei den auf subkutanem Wege behandelten Tieren, was für die hervorragenden Bioverfügbarkeitseigenschaften von Östetrol nach oraler Verabreichung spricht.
Tabelle 2: Vaginale östrogene Reaktion bei ovarektomierten Ratten bei oraler (po) Behandlung mit 17α-Ethinylöstradiol (EE) oder Östetrol (E4). Die Daten sind als die Anzahl der Ratten angegeben, die von den insgesamt behandelten Ratten eine vaginale Hornhautbildung zeigten (Verhältnis).
Beispiel 2
Die ovarektomierte gealterte Ratte wurde als Modell für die humane Osteoporose-Krankheit herangezogen. Hier handelt es sich um ein eingeführtes Tiermodell, das von der United States Food and Drug Administration (FDA) zur Bewertung und zur Ermittlung potentieller Mittel für die Therapie und Prophylaxe von Osteoporose empfohlen wird. Die antiresorptive Wirksamkeit von Östetrol (E4) wurde durch ex vivo-Messung der gesamten und der trabekulären Knochenmineraldichte und Knochenfestigkeit bei der Obduktion nach 4-wöchiger Behandlung getestet. 17α-Ethinylöstradiol (EE) und Träger (1 % Ethanol/Erdnussöl) dienten bei diesem biologischen Test als Kontrollen.
Drei Monate alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden 1 Tag vor Beginn der Dosierungsstudie entweder einer Scheinoperation (Sham) oder einer Ovarektomie (OVX) unterzogen. Die Tiere wurden unter Verwendung eines Ketamin/Xylazin-Betäubungsgemisches betäubt und wurden einer bilateralen Ovarektomie oder einer Scheinoperation unterzogen. Ein Haarbereich an der dorsalen Oberfläche wurde rasiert und ein Schnitt wurde über der lumbalen Region des Rückgrats ausgeführt. Die Haut wurde von der darunterliegenden Faszie getrennt, so dass ein zweiter Schnitt durch die abdominale Muskulatur nahezu kaudal zu den Nieren vorgenommen werden konnte. Die Eierstöcke wurden sodann nach außen gelegt und entfernt. Die Muskulatur wurde mit einer einzigen Naht geschlossen. Der Hauteinschnitt wurde unter Verwendung von chirurgischen Klammern verschlossen.
10 Tiere pro Behandlungsgruppe erhielten einmal täglich an vier aufeinanderfolgenden Wochen eine orale Dosierung. Die Dosierung begann am Tag 1 nach der chirurgischen Entfernung der Eierstöcke und erfolgte über eine orale Sonde unter Verwendung einer Spritze und einer Sondennadel aus rostfreiem Stahl in Dosen von 0,1 mg/kg/Tag EE oder 2,5, 0,5 oder 0,1 mg/kg/Tag E4. Die Trägerkontrolle wurde täglich an eine Gruppe von OVX-Tieren und von scheinoperierten Ratten verabreicht. Nach der Behandlung wurden die betäubten Ratten einer Herzpunktion unterzogen und durch CO₂-Inhalation erstickt. Schienbein- und Oberschenkelknochen wurden entnommen, von weichem Gewebe gereinigt, fixiert und bis zur weiteren Analyse in 70 % Ethanol/Kochsalzlösung bei 4°C (Schienbein) oder in Kochsalzlösung bei 4°C (Oberschenkel) aufbewahrt.
Eine quantitative, periphere ex vivo-Computertomographie (pQCT) wurde an den herausgeschnittenen linken Schienbeinen unter Verwendung eines Stratec XCT-RM-Geräts und der dazugehörigen Software (Stratec Medizintechnik GmbH, Pforzheim, Deutschland, Software-Version 5.40) durchgeführt. Die Abtastungen wurden an 12 % der Gesamtlänge ausgehend vom proximalen Ende der Schienbeine durchgeführt. Die Positionen wurden unter Verwendung von Erkundungsansichten verifiziert und ein 0,5 mm-Schnitt senkrecht zur Längsachse des Schienbeinschaftes wurde von jeder Seite gewonnen. Die Abtastungen wurden unter Anwendung einer Schwelle zur Skizzierung der äußeren Abgrenzung analysiert. Der gesamte und trabekuläre Knochenmineralgehalt, die Fläche und die Dichte wurden auf jeder Seite bestimmt. Die Mittelwerte sind in Tabelle 3 aufgeführt. Ferner sind pQCT-Daten für die durchschnittliche Knochenmineraldichte in 1 dargestellt.
Ein Vergleich der pQCT-Densitometriedaten aus den proximalen Schienbeinen von scheinoperierten und OVX-Ratten zeigten erwartungsgemäß einen übereinstimmenden Verlust an gesamtem und trabekulärem Knochen in der OVX-Gruppe (Tabelle 3, 1). Ferner bestand eine übereinstimmende dosisabhängige Zunahme für jeden der Parameter in Verbindung mit dem gesamten und trabekulären Knochenmineralgehalt und der Knochenmineraldichte bei den oral mit E4 behandelten Tieren (Tabelle 3, 1). Im Vergleich zu hypoöstrogenen OVX-Ratten, die nur eine Trägerbehandlung erhalten hatten, verhinderten 0,5 und 2,5 mg/kg/Tag E4 eine Knochenresorption, wie es sich beispielsweise durch die Werte der gesamten Knochenmineraldichte ergibt, die gleichwertig wie bei scheinoperierten Ratten ist (1). Ferner war die antiresorptive Aktivität, die bei der höchsten Dosis von E4 (2,5 mg/kg/Tag) erreicht worden war, gleichwertig mit der Wirkung, die mit der positiven Kontrolle EE erzielt worden war. Tabelle 3: pQCT-Densitometriedaten aus den proximalen Schienbeinen von scheinoperierten und OVX-Ratten bei oraler (po) Behandlung mit 17α-Ethinylöstradiol (EE), Östetrol (E4) oder Träger. Die Daten stellen Mittelwerte für jede Gruppe (n = 10) dar.

1: Gesamte Knochenmineraldichte aus den proximalen Schienbeinen von Sham- und OVX-Ratten bei oraler (po) Behandlung mit 17α-Ethinylöstradiol (EE), Östetrol (E4) oder Träger für 4 aufeinanderfolgende Wochen. Die Daten stellen Mittelwerte für jede Gruppe (n = 10) dar.

Eine ex vivo-Bewertung der biomechanischen Knochenfestigkeit wurde mit einem Einfärbungstest am distalen Oberschenkel durchgeführt. Vor dem mechanischen Test wurde der Oberschenkel in kalter Kochsalzlösung gespült und sorgfältig von etwaigem anhaftenden weichen Gewebe gereinigt. Ein 3 mm-Segment der distalen Femoralmetaphyse wurde direkt proximal zum femoralen Kondylus mit einer langsamen Diamantsäge unter kontinuierlicher Spülung mit Kochsalzlösung geschnitten. Die Belastung wurde mit einem zylindrischen Stempel für einen Eindruckversuch (mit einer flachen Prüffläche mit 1,6 mm Durchmesser) auf die Mitte des Knochenmarkhohlraums an der distalen Fläche des Segments angelegt. Man ließ den Stempel mit einer konstanten Verschiebung von 6 mm/min in den Hohlraum in einer Tiefe von 2 mm eindringen, bevor eine Lastumkehr erfolgte.
Tabelle 4: Eindruckversuch am distalen Oberschenkel von Sham- und OVX-Ratten, die oral (po) mit 17α-Ethinylöstradiol (EE), Östetrol (E4) oder Träger behandelt worden waren. Die Daten stellen die Mittelwerte für jede Gruppe dar (n = 10).
Die maximale Belastung, die Steifigkeit und die absorbierte Energie wurden aus den Lastverschiebungskurven bestimmt. Der Festigkeitsgrenzwert wurde berechnet, indem die maximale Belastung durch die Eindruckfläche dividiert wurde. Die Mittelwerte für die maximale Belastung, die Steifigkeit, die Energie und den Festigkeitsgrenzwert sind in Tabelle 4 aufgeführt. Ferner sind die Mittelwerte der Festigkeitsgrenzwerte in 2 dargestellt. Im Vergleich zu scheinoperierten Ratten war die mechanische Festigkeit von spongiösem Knochen bei OVX-Ratten, die mit dem Träger allein behandelt worden waren, stark verringert (Tabelle 4, 2). Die Verringerungen der maximalen Belastung, der Steifigkeit, Energie und des Festigkeitsgrenzwerts betrugen –68%, –68%, –27% bzw. –68%, was klar mit dem Verlust der Knochenmineraldichte in Ratten mit Östrogenmangel einhergeht. Eine orale Behandlung von hypoöstrogenen OVX-Ratten mit E4 verhinderte die Verringerung der maximalen Belastung, der Steifigkeit, der Energie und des Festigkeitsgrenzwerts in dosisabhängiger Weise (Tabelle 4, 2). Ferner ist die mit der höchsten Dosis von E4 (2,5 mg/kg/Tag) erreichte Wirkung offensichtlich der Wirkung der positiven Kontrolle EE überlegen (Tabelle 4, 2).

2: Durchschnittlicher Festigkeitsgrenzwert des distalen Oberschenkels von scheinoperierten Sham- und OVX-Ratten bei oraler (po) Behandlung mit 17α-Ethinylöstradiol (EE), Östetrol (E4) oder Träger für 4 aufeinanderfolgende Wochen. Die Daten stellen die Mittelwerte für jede Gruppe dar (n = 10).

Beispiel 3
Die morphinabhängige, ovarektomierte (OVX) Ratte wurde als Modell für die postmenopausalen Hitzewallungen herangezogen. Die Wirkungsstärke von Östetrol (E4) zur Verhinderung des Anstiegs der Schwanzhauttemperatur, der normalerweise mit einem Abfall der Kernkörpertemperatur verbunden ist, nach Naloxon-induziertem Opiateentzug wurde getestet. 17α-Ethinylöstradiol (EE) und Träger (Hydroxypropylbeta-cyclodextrin 20 % Gew./Vol.) dienten bei diesem biologischen Test als Kontrollen.
Das häufigste und charakteristischste Symptom der humanen Menopause besteht in Hitzewallungen, die bei mehr als 70 % der Frauen in der Menopause auftreten. Obgleich der genaue Mechanismus, der dieser vasomotorischen Instabilität zugrunde liegt, unbekannt ist, spiegeln die charakteristischen Merkmale der Hitzewallungen offensichtlich eine zentral vermittelte Anpassung an einen zunehmenden Abfall der Konzentration an Östrogenen wieder. Bei Frauen, die an Hitzewallungen leiden, machen sich folgende Symptome bemerkbar: 1) rascher, regionaler Anstieg der Hauttemperatur; 2) Abnahme der Kernkörpertemperatur; 3) erhöhte Herzfrequenz ohne Veränderung des Blutdrucks; und 4) zeitlich eng abgestimmte Wellen der Freisetzung von luteinisierendem Hormon (LH) und β-Endorphin.
Das Modell der von Morphin abhängigen, ovarektomierten (OVX) Ratte wurde von einigen Forschungsgruppen (Katovich et al., Maturitas, (1986), S. 67-76; Mechenthaler et al., Maturitas, (1998), S. 307-316) als ein Tiermodell für Hitzewallungen vorgeschlagen. Während des Opiateentzugs mit dem Morphin-Antagonisten Naloxon steigt die Schwanzhauttemperatur (TST), wobei dieser Anstieg von einem Abfall der Kernkörpertemperatur begleitet ist. Ferner sind die Temperaturänderungen von LH-Wellen und einer vorübergehenden Tachykardie begleitet. Diese Ereignisse sind in bezug auf ihre Größe und temporale Natur ähnlich den bei menopausalen Hitzewallungen beobachteten Ereignissen.
8 Wochen alte OVX-Ratten wurden oral (po) mit Östetrol (E4), 17α-Ethinylöstradiol (EE) oder Trägerkontrolle (Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin 20 Gew./Vol.) an den sieben aufeinanderfolgenden Tagen vor dem durch Naloxon herbeigeführten Opiateentzug bei von Morphin abhängigen Ratten durchgeführt, wobei diese Behandlung auch am Morgen des Entzugsvorgangs vorgenommen wurde. Drei Tage vor Dosierungsbeginn wurden die Tiere unter Verwendung eines Ketamin/Xylazin-Betäubungsgemisches betäubt und einer bilateralen Ovarieektomie unterzogen. Ein Haarbereich an der dorsalen Oberfläche wurde rasiert und ein Schnitt wurde über der lumbalen Region des Rückgrats ausgeführt. Die Haut wurde von der darunterliegenden Faszie getrennt, so dass ein zweiter Schnitt durch die abdominale Muskulatur nahezu kaudal zu den Nieren vorgenommen werden konnte. Die Eierstöcke wurden sodann nach außen gelegt und entfernt. Die Muskulatur wurde mit einer einzigen Naht geschlossen. Der Hauteinschnitt wurde unter Verwendung von chirurgischen Klammern verschlossen. Sechs Ratten pro Behandlungsgruppe erhielten eine einmalige Dosierung pro Tag an acht aufeinanderfolgenden Tagen vor dem Tag (und unter Einschluss dieses Tages) des durch Naloxon induzierten Opiateentzugs (Hitzewallungssitzung). Die Dosierung begann drei Tage nach der chirurgischen Entfernung der Eierstöcke und wurde durch orale Sondenverabreichung unter Verwendung einer Spritze und einer Sondennadel aus rostfreiem Stahl vorgenommen. Die Morphinabhängigkeit wurde durch Implantieren von subkutanen Pellets mit einem Gehalt an 75 mg Morphin herbeigeführt. Das erste Pellet wurde fünf Tage vor der Hitzewallungssitzung unter leichter Inhalationsanästhesie implantiert. Drei Tage vor der Hitzewallungssitzung wurden zwei weitere Morphinpellets unter den gleichen Bedingungen implantiert.
Für die Hitzewallungsmanipulationen wurden die Tiere in einen Testkäfig gesetzt. Nach einer 5- bis 10-minütigen Anpassungsperiode wurden die Ratten mit Ketamin-HCl etwa 10 min vor der Hitzewallungssitzung betäubt. Eine temperaturempfindliche Elektrode wurde an der ventralen Oberfläche des Schwanzes mit einem Klebeband fixiert und die Elektrode wurde an ein Mehrkanal-Temperaturaufzeichnungsgerät angeschlossen. Die Schwanzhauttemperatur wurde bis zum Erreichen eines stabilen Zustands aufgezeichnet und die Tiere erhielten dann eine Injektion von Naloxon-HCl (1 mg/kg). Die Temperaturaufzeichnung wurde für einen Zeitraum von 60 min fortgesetzt. Die Temperatur wurde in Abständen von 5 min angegeben. Nach Beendigung der Hitzewallungssitzung wurden sämtliche Tiere unter Ersticken mit CO₂ getötet, wonach das Gehirn entfernt wurde.
Erwartungsgemäß erwies sich die Trägerkontrolle in bezug auf die Verhinderung der durch Naloxon induzierten TST-Zunahmen bei von Morphin abhängigen OVX-Ratten als unwirksam (34). 17α-Ethinylöstradiol (EE) verhinderte in der einzigen getesteten Dosis von 0,3 mg/kg/Tag die durch Naloxon induzierten TST-Zunahmen bei den von Morphin abhängigen OVX-Ratten (3). Eine orale Behandlung mit Östetrol (E4) zeigte eine klare dosisabhängige Wirkung (3). Die drei höchsten Dosen von E4 (0,3, 1,0 und 3.0 mg/kg/Tag) verringerten alle die TST, wobei die höchste Dosis (3,0 mg/kg/Tag) eine ähnliche suppressive Reaktion wie das starke orale Östrogen 17α-Ethinylöstradiol (EE) zeigte.

3: Einfluss von Östetrol (E4) und 17α-Ethinylöstradiol (EE) auf die durch Naloxon induzierte Hitzewallungsreaktion bei weiblichen ovarektomierten Ratten.

Beispiel 4
Die Zunahme des Uterusgewichts bei der Ratte wurde als weiterer relevanter, gewebespezifischer Endpunkt zur Bestimmung der hormonellen Wirkungsstärke von Östetrol (E4) gewählt, insbesondere in Beziehung zu seiner hormonellen Wirkungsstärke zur Herbeiführung von vaginaler Hornhautbildung und zur Korrektur von vaginaler Atrophie. Oral (po) verabreichtes E4 wurde daher in einem modifizierten, 7-tägigen, vaginalen Hornhautbildungs-Biotest getestet (vergl. auch Beispiel 1), der eine Messung des Uterusfeuchtgewichts bei der Obduktion umfasste, um vaginale und uterotrophe Wirkungen zu berücksichtigen.
Die uterotrophe Reaktion wird seit vielen Jahren zur Bestimmung der östrogenen Aktivität herangezogen. Der typische biologische Test verwendet weibliche Ratten mit geringen Konzentrationen an endogenen Östrogenen (z. B. ovarektomierte ausgewachsene oder unreife Tiere). Bei den meisten Testkonzeptionen erhalten die Tiere einmal oder zweimal täglich eine Dosierung für einen Zeitraum von 3 oder 4 Tagen. 24 Stunden nach der letzten Dosis werden die Tiere getötet. Die Uteri werden herausgeschnitten und gewogen. Beim gegenwärtigen biologischen Test wurden die vaginale, epitheliale Hornhautbildung und die Uterus-Gewichtszunahme in ovarektomierten erwachsenen Ratten über einen Zeitraum von 7 Tagen hinweg bewertet. Auf diese Weise konnten zwei unterschiedliche östrogenempfindliche Parameter gleichzeitig bewertet werden.
Ausgewachsene weibliche CD-Ratten wurden einer Ovarektomie unterzogen, um einen Östrogenmangel herbeizuführen. Vaginale Spülungen wurden täglich an sieben Tagen durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die Ratten vaginale Kastratabstriche zeigten (Vorwiegen von Leukozyten im vaginalen Abstrich und ähnliches Erscheinungsbild wie bei einem vaginalen Diöstrus-Abstrich). Vaginale Kastratabstriche sind ein Anzeichen dafür, dass eine vollständige Ovarektomie erreicht worden ist. Die Behandlung begann nach Beendigung der 7-tägigen Abstrichnahme (Tag 0 = erster Tag der Dosierung). Die Tiere erhielten einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen die Trägerkontrolle (10 % Ethanol/Sesamöl) oder 0,1, 0,3, 1,0 oder 3,0 mg/kg/Tag E4. Die täglichen vaginalen Spülungen wurden 7 Tage nach Einleitung der Dosierung fortgesetzt, um eine vaginale Hornhautbildung als Anzeichen einer östrogenen Reaktion nachzuweisen. Ein Tropfen der vaginalen Waschflüssigkeit wurde auf einen Glasobjektträger gebracht und mit dem Lichtmikroskop geprüft, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von verhornten Epithelialzellen festzustellen. Über die in den vaginalen Spülungen enthaltenen Zellen wurden Aufzeichnungen gemacht. Vaginale Spülungen wurden vor der Dosierung an den Tagen 0-6 und vor der Obduktionam Tag 7 durchgeführt.
Am Tag 7 der Studie wurden im Anschluss an eine vaginale Spülung 24 Stunden nach der letzten Dosis sämtliche Ratten durch Ersticken mit CO₂ eingeschläfert. Ein abdominaler Schnitt wurde ausgeführt und der Uterus wurde herausgeschnitten, abgetupft und gewogen. Das Auftreten einer vaginalen Hornhautbildung (ein Anzeichen für eine östrogene Reaktion) stellt eine "Alles-oder-Nichts"-Reaktion dar. Daher wurden die Daten als Anzahl von Ratten, die eine vaginale östrogene Reaktion (für einen oder mehrere Tage) zeigten, gegenüber der Anzahl an behandelten Ratten (Verhältnis) angegeben. Ein Z-Test der Verhältnisse wurde dazu verwendet, die vier Testgruppen mit der Träger-Kontrollgruppe zu vergleichen. Die Mittelwerte für die Gruppen ± SEM-Werte wurden für die Uterusgewichte ebenfalls berechnet. Diese Daten waren nicht normal verteilt und zeigten keine Varianzhomogenität. Daher wurde ein nicht-parametrischer Kruskal-Wallis-ANOVA-Test an den Rangzahlen durchgeführt und signifikante Unterschiede in den vier Behandlungsgruppen und der Trägerkontrolle wurden unter Anwendung des Dunn-Verfahrens bestimmt.
Bei Ratten, die eine Reihe von E4-Dosen erhalten hatten, war das Einsetzen der vaginalen Hornhautbildung dosisabhängig (vergl. Tabelle 2). Am Tag 7 lagen alle getesteten oralen E4-Dosen über dem Schwellenwert zur Erregung einer vaginalen östrogenen Reaktion bei der ovarektomierten erwachsenen Ratte und waren signifikant (P < 0,05) verschieden von der Trägerkontrolle (Tabelle 5). Im Gegensatz dazu wird festgestellt, dass E4 nur in oralen Dosen von 1,0 und 3,0 mg/kg/Tag das Uterusgewicht signifikant (p < 0,05) im Vergleich zur Träger-Kontrollgruppe (Tabelle 5) erhöhte. Wir schließen daraus, dass Östetrol ein pharmakologisch günstiges Profil aufweist. Es zeigt eine agonistische Aktivität am vaginalen Epithel in geringen und mittleren Dosen, bei denen eine uterotrophe Aktivität nicht beobachtet wird. Dieser Befund zeigt, dass (insbesondere bei geringeren Dosierungen) keine Notwendigkeit für eine begleitende Progestogen-Verabreichung besteht, um unerwünschte uterotrophe Wirkungen zu verhindern. Tabelle 5: Vaginale Hornhautbildung und uterotrophe Reaktionen bei ovarektomierten Ratten bei oraler (po) Behandlung mit Östetrol (E4). Die Daten sind als Anzahl der Ratten, die eine vaginale Hornhautbildung (reagierende Tiere) oder keine Hornhautbildung (nicht-reagierende Tiere) zeigen, angegeben. Die Daten für das Uterusgewicht sind als Mittelwerte und SEM-Werte für jede Gruppe (n = 8) angegeben. Signifikante Unterschiede zur Trägerkontrolle sind angegeben.

n.a.: nicht zutreffend

Beispiel 5
Die endometriale Proliferation wurde als weiterer relevanter gewebespezifischer Endpunkt zur Bestimmung der hormonellen Wirkungsstärke von Östetrol nach chronischer (4-wöchiger) oraler Behandlung der ovarektomierten Ratten gewählt. Es wurde ein eingeführtes, 4 Wochen dauerndes Tiermodell herangezogen, das auch zur Bewertung von Mitteln für die Osteoporose-Prophylaxe und -Therapie empfohlen wird. Die Wirkungsstärke von E4 zur Herbeiführung einer endometrialen Proliferation wurde bei oraler (po) Verabreichung von Dosen von 2,5 und 0,5 mg/kg/Tag E4 getestet, das bei ex vivo-Analysen der gesamten und der trabekulären Knochenmineraldichte und Knochenfestigkeit eine antiresorptive Wirksamkeit zeigte (vergl. Beispiel 2). 17α-Ethinylöstradiol (EE) und Träger (1 % Ethanol/Erdnussöl) dienten bei diesem biologischen Test als zusätzliche Kontrollen.
Drei Monate alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 einen Tag vor Beginn der Dosierungsstudie entweder einer Scheinoperation (Sham) oder einer Ovarektomie (OVX) unterzogen. 10 Tiere pro Behandlungsgruppe erhielten eine orale Dosierung einmal pro Tag für 4 aufeinanderfolgende Wochen. Die Dosierung begann 1 Tag nach der chirurgischen Entfernung der Eierstöcke und wurde durch orale Sondenverabreichung unter Verwendung einer Spritze und einer Sondennadel aus rostfreiem Stahl in Dosen von 0,1 mg/kg/Tag EE oder entweder 2,5 oder 0,5 mg/kg/Tag E4 vorgenommen. Die Trägerkontrolle wurde täglich an eine Gruppe von OVX-Tieren und scheinoperierten Ratten verabreicht. Nach der Behandlung wurden die betäubten Ratten einer Herzpunktur unterzogen und durch CO₂-Inhalation erstickt. Die Uterushörner wurden isoliert, gewogen und sodann bei 4°C in 4 % Formaldehyd fixiert. Nach 14-tägiger Fixierung wurden die Uteri dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Serielle Schnitte von Uterushörnern wurden angefertigt und entweder mit Hämatoxylin/Eosin (H/E) oder dem Ki67-Proliferationsmarker gemäß dem Verfahren von Rango et al. (Hum. Reprod., Bd. 13 (1998), S. 3177-3189) gefärbt. Die Proliferationsindices wurden durch Bewertung von positiv markierten Zellen an mit Ki67 immunologisch gefärbten Schnitten bestimmt. Typischerweise wurden für jeden Datenpunkt 1000 luminale Epithelzellen bewertet.
Die Daten für das durchschnittliche Uterusgewicht sind in 4 dargestellt. Eine Ovarektomie bei Ratten führte zu Uterusatrophie, wie sich durch den Verlust an Uterusgewicht bei mit Träger allein behandelten Tieren im Vergleich zu scheinbehandelten Tieren zeigt (4). Bei oralen Dosierungsniveaus, bei denen sowohl EE (0,1 mg/kg/Tag) als auch E4 (0,5 mg/kg/Tag) einen Knochenverlust verhindern (Vergleichsbeispiel 2), waren die durchschnittlichen Uterusgewichte ähnlich wie bei zum Schein mit Träger behandelten Tieren (4). Überraschenderweise nahm der prozentuale Anteil an Ki67-positiven, luminalen Epithelzellen mit steigenden Dosen der oralen E4-Behandlung ab (5). Nach einer 4-wöchigen oralen Behandlung mit 2,5mg/kg/Tag E4 war der prozentuale Anteil an Ki67-positiven, luminalen Epithelzellen erheblich geringer als bei mit 0,5 mg/kg/Tag E4 oder sogar mit 0,1 mg/kg/Tag EE behandelten Tieren, was für eine geringere wachstumsfördernde Aktivität auf endometriales Gewebe nach chronischer oraler Behandlung mit relativ hohen Dosen von E4 spricht (5). E4 scheint somit eine geringere östrogene Aktivität im Uterus als EE zu haben, insbesondere in Dosen, bei denen die Wirkungen von E4 auf die Knochenparameter (z. B. die Knochenfestigkeit) gleich stark oder besser sind als die von EE. Daher wird der Schluss gezogen, dass Östetrol ein pharmakologisch günstiges Profil aufweist. Dieser Befund zeigt, dass keine Notwendigkeit zu einer begleitenden Progestogen-Behandlung besteht, um unerwünschte endometriale proliferative Effekte zu verhindern.

4: Durchschnittliches Uterusgewicht von Sham- und OVX-Ratten bei oraler (po) Behandlung mit 17α-Ethinylöstriadiol (EE), Östetrol (E4) oder Träger für 4 aufeinanderfolgende Wochen. Die Daten sind als Mittelwerte für jede Gruppe (n = 10) angegeben.

5: Prozentualer Anteil an Ki67-positiven, luminalen Epithelzellen in immunologisch gefärbten Uterusschnitten von Sham- und OVX-Ratten bei oraler (po) Behandlung mit 17α-Ethinylöstradiol (EE), Östetrol (E4) oder Träger für 4 aufeinanderfolgende Wochen. Die Daten sind als Mittelwerte für jede Gruppe (n = 10) angegeben.

Beispiel 6
Zur Bewertung der oralen (po) und der subkutanen (sc) Bioverfügbarkeit von Östetrol (E4) und zur Bestimmung der Beseitigungshalbwertszeit wurden Einzeldosis-Studien an weiblichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt, wobei über einen Zeitraum von 24 Stunden häufig Blutproben genommen wurden.
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten erhielten einen permanenten Silikongummi-Herzkatheter gemäß den Angaben von Kuipers et al. (Gastroenterology, Bd. 88 (1985), S. 403-411). Man ließ die Ratten sich 5 Tage von der Operation erholen. Anschließend erhielten sie 0,05, 0,5 oder 5 mg/kg E4 in 0,5 ml Erdnussöl. Für die subkutane Verabreichung wurde E4 in den Halsbereich unter Verwendung einer 1 ml-Spritze und einer 20 g-Nadel injiziert. Für die orale Verabreichung von E4 erhielten die Ratten eine leichte Betäubung mit Halothan/N₂O/O₂. E4 wurde direkt intragastrisch unter Verwendung einer Magenintubationsvorrichtung aus Kunststoff zugeführt. Anschließend wurden Blutproben über den Herzkatheter in heparinisierten Röhrchen nach 0,5, 1, 2, 4, 8 und 24 Stunden gewonnen. Erythrozyten wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 × g bei 4°C entfernt und das Blutplasma wurde bei –20°C aufbewahrt. Nach Auftauen der Plasmaproben wurde eine Flüssig-Flüssig-Extraktion (Hexan und Diethylether) zur Vorbereitung der E4 enthaltenden Plasmaproben für die HPLC-Analyse (Perkin Elmer 200) und für die Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines PE Sciex 3000-Tandem-Massenspektrometers und einer APCI-Schnittstelle herangezogen. Mit jeder Probencharge wurde eine Eichkurve mit 6 Kalibratoren aufgezeichnet. Die Eichkurve wurde unter Anwendung einer linearen Regression (Korrelationskoeffizient > 0,98) berechnet, was die quantitative Bestimmung der Plasmakonzentrationen ermöglichte. Für jedes Rattenplasma, das zu den verschiedenen Zeitpunkten gewonnen worden war, wurden die Daten gesammelt.
Die Daten für die E4-Plasmakonzentration wurden mit "WinNonLin, Version 3.1" analysiert und beinhalteten die pharmakokinetischen Parameter für C_max, die Halbwertszeit und AUC_0-24. Insbesondere bei Anwendung geringerer und mittlerer Dosisniveaus von 0,05 und 0,5 mg/kg zeigte E4 eine orale Bioverfügbarkeit, die der bei subkutaner Verabreichung erzielten Bioverfügbarkeit (80-100 %) entsprach. Bei der höchsten getesteten Dosis von 5,0 mg/kg E4 stieg die Absorptionskinetik auf eine orale Bioverfügbarkeit von etwa 30-60 % von subkutan verabreichtem E4.
Interessanterweise zeigte E4 eine relativ lange Halbwertszeit von 2-3 Stunden, was den Nachweis von bioaktiven Konzentrationen von unkonjugiertem E4 zu sämtlichen Zeitpunkten über einen Zeitraum von 24 Stunden bei den Dosierungsexperimenten mit subkutaner und oraler Verabreichung ermöglichte.
Beispiel 7
Eingeführte kompetitive Steroid-Bindungstests wurden zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität von Östetrol (E4) im Vergleich zu 17α-Ethinylöstradiol (EE) und 17β-Östradiol (E2) an den humanen Östrogen-Rezeptor (ER) in den α- und β-Formen eingesetzt.
Es wurde das in der Literatur ausführlich von Osbourn et al. (Biochemistry, Bd. 32 (1993), S. 6229-6236) beschriebene Verfahren herangezogen und entsprechend angepasst. Rekombinante humane ERα- und ERβ-Proteine wurden aus transfizierten Sf9-Zellen gereinigt. Die in vitro-Tests beinhalteten die Verwendung von ERα- oder ERβ-Proteinen und [³H]E2 in einer feststehenden Konzentration von 0,5 nM als markierter Ligand. Rekombinante humane ERα- oder ERβ-Proteine wurden in Bindungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 % Glycerin, 1 mM DTT, 1 mg/ml BSA) gelöst und Aliquotanteile wurden im Doppelversuch mit [³H]E2 in einer Endkonzentration von 0,5 nM zusammen mit einer Trägerkontrolle (0,4 % DMSO) oder der gleichen Menge Träger mit einem Gehalt an steigenden Konzentrationen von unmarkierten Steroidliganden als Kompetitoren inkubiert. Nach 2-stündiger Inkubation bei 25°C wurden die ungebundenen Liganden entfernt und die Mengen an [³H]E2, das entweder an ERα-Protein oder an ERβ-Protein gebunden war, wurden gemessen. Die durchschnittlichen Mengen an [³H]E2, die an ERα- oder ERβ-Proteine bei den jeweiligen Konzentrationen des Kompetitors gebunden waren, wurden zur Aufstellung von Hemmkurven verwendet. Anschließend wurden die IC₅₀-Werte durch eine nicht-lineare Regressionsanalyse der kleinsten Fehlerquadrate bestimmt. Die Hemmkonstanten (Ki) wurden unter Anwendung der Gleichung von Cheng und Prusoff (Cheng et al., Biochem. Pharmakol., Bd. 22 (1973), S. 3099-3108) berechnet, wozu die gemessenen IC₅₀-Werte der getesteten Verbindungen, die Konzentration des beim Test verwendeten Radioliganden und die Literaturwerte für den Kd-Wert des Radioliganden, für den Werte von 0,2 nM und 0,13 nM für ERα bzw. ERβ festgestellt worden waren, verwendet wurden. Tabelle 6: Prozentuale Hemmung der spezifischen Bindung an ERα- und ERβ-Proteine unter Verwendung von E4 als unmarkiertem Steroidligand und 0,5 nM [³H] als markiertem Kompetitor. Die Ergebnisse von 3 getrennten Experimenten sind aufgeführt.

nd: nicht bestimmt

Tabelle 7: Experimentell bestimmte Hemmkonstanten (Ki) für Östetrol (E4), 17α-Ethinylöstradiol (EE) und 17β-Östradiol (E2) an humane ERα- und ERβ-Proteine. Es wird auch die relative Bevorzugung für die Bindung an ERα-Protein gezeigt.
Ergebnisse des biochemischen Tests auf E4 sind als prozentuale Hemmung der spezifischen Bindung in drei getrennten Experimenten aufgeführt (Tabelle 6). Zum Vergleich der Bindungsaffinitäten von E4, EE und E2 an humane ERα- und ERβ-Proteine sind in Tabelle 7 die experimentell festgestellten Ki-Werte angegeben. Verglichen mit EE und E2 zeigt E4 ein besonderes Bindungsprofil mit einer starken Bevorzugung (400 %) für die Bindung an das ERα-Protein (Tabelle 7). Im Gegensatz dazu sind die Ki-Werte für ERβ-Protein für EE und E2-Steroidliganden stärker ausgeprägt (Tabelle 7).
Beispiel 8
Ein eingeführter kompetitiver Steroid-Bindungstest (Hammond and Lahteenmaki, Clin. Chem. Acta, Bd. 132 (1983), S. 101-110) wurde zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität von Östetrol (E4), 17α-Ethinylöstradiol (EE2), 17β-Östradiol (E2), Testosteron (T) und 5α-Dihydrotestosteron (DHT) für das humane Sexualhormon-Bindungsglobulin (SHBG) eingesetzt.
Humanes SHBG wurde aus transgenem Mäuseserum gemäß Literaturangaben gereinigt (G. V. Avvakumov et al., J. Biol. Chem., Bd. 275 (2000), S. 25920-25925). Für das auf diese Weise hergestellte humane SHBG wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen eine Reinheit von > 99 festgestellt. Seine Steroid-Bindungseigenschaften sind von SHBG in humanem Serum nicht unterscheidbar (G. V. Avvakumov et al., J. Biol. Chem., Bd. 275 (2000), S. 25920-25925). Der in in vitro-Test beinhaltete die Verwendung des gereinigten humanen SHBG und von [³H]DHT oder [³H]Östradiol als markierten Liganden. Humanes SHBG wurde 30 min bei Raumtemperatur mit einer Suspension mit Dextran-beschichteter Aktivkohle (DCC) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) behandelt, um etwaige Steroidliganden zu entfernen. Nach Zentrifugation (2000 × g für 10 min) zum Absetzen der DCC wurde der Überstand, der das humane SHBG enthielt, in PBS auf eine Konzentration von 1 nM auf der Grundlage seiner Steroid-Bindungskapazität verdünnt.
Aliquotanteile (100 μl) dieser humanen SHBG-Lösung wurden im Doppelversuch anschließend mit einem gleichen Volumen entweder an [³H]DHT oder [³H]Östradiol in einer Konzentration von 10 nM zusammen mit 100 μl PBS allein oder der gleichen Menge an PBS mit einem Gehalt an steigenden Konzentrationen von unmarkierten Steroidliganden als Kompetitoren in Polystyrol-Teströhrchen inkubiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsgemische weitere 15 min in ein Eisbad gestellt. Aliquotanteile (600 μl) einer eiskalten Suspension von DCC wurden sodann in jedes Röhrchen gegeben. Nach einer kurzen Mischzeit von 2 sec wurde jedes Röhrchen im Eisbad entweder 10 min oder 5 min inkubiert, je nachdem ob [³H]DHT oder [³H]Östradiol als radioaktiver Ligand verwendet wurde. Die ungebundenen Liganden, die an DCC adsorbiert waren, wurden sodann durch Zentrifugation (2000 × g für 15 min bei 4°C) entfernt und die Mengen an [³H]-markierten Liganden, die an SHBG gebunden waren, wurden in 2 ml ACS-Szintillationsgemisch unter Verwendung eines Flüssigszintillations-Spektrophotometers ausgezählt. Die durchschnittlichen Mengen an [³H]-markierten Liganden, die an SHBG bei den einzelnen Konzentrationen des Kompetitors (B) gebunden waren, wurden als prozentuale Anteile der durchschnittlichen Mengen an [³H]-markierten Liganden, die an SHBG in Abwesenheit des Kompetitors (B₀) gebunden waren, angegeben und wurden gegen die Kompetitor-Konzentration in jedem Teströhrchen aufgetragen.
Die Ergebnisse der kompetitiven Bindungstests sind in 6 dargestellt. Aus diesen kompetitiven Bindungstests ist klar ersichtlich, dass Östetrol überhaupt nicht an humanes SHBG bindet, wenn ein Test entweder mit [³H]DHT oder [³H]Östradiol als markierter Ligand durchgeführt wird. Dies steht in deutlichem Gegensatz zu den Referenzsteroiden Ethinylöstradiol, 17β-Östradiol, Testosteron und 5α-Dihydrotestosteron, die in dieser Reihenfolge eine zunehmende relative Bindungsaffinität für humanes SHBG zeigen. Von Bedeutung ist, dass die Bindung von Östetrol an SHBG vernachlässigbar war, im Vergleich zu den übrigen getesteten Östrogenen Ethinylöstradiol und 17β-Östradiol.

6: Kompetitive Verdrängung von [³H]DHT (Feld A) und [³H]Östradiol (Feld B) von der humanen Sexualhormon-Bindungsglobulin-Steroidbindungsstelle. Bei den unmarkierten, als Kompetitoren verwendeten Steroidliganden handelte es sich um Östetrol (E4), 17α-Ethinylöstradiol (EE2), 17β-Östradiol (E2), Testosteron (T) und 5α-Dihydrotestosteron (DHT).

Beispiel 9
Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung
Die vorliegenden Östrogenkomponenten können in geeigneter Weise zusammen mit Additiven, Trägern und/oder Aromastoffen, die in der galenischen pharmazeutischen Praxis üblich sind, gemäß herkömmlichen Verfahren zu geeigneten Verabreichungsformen verarbeitet werden. Für die orale Verabreichung eignen sich insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Suspensionen oder Lösungen.
Östetrol-Tabletten:

1000 Tabletten mit einem Gewicht von 185 mg, die jeweils 1,5 mg Östetrol enthalten, werden aus der folgenden Zubereitung hergestellt:

Östetrol	1,500 g
Polyvinylpyrrolidon (Kollidon 25^® der Firma BASF)	13,500 g
Lactose	135,795 g
mikrokristalline Cellulose (Avicel PH 101^®)	26,250 g
Glycerylpalmitostearat (Precirol^®)	2,775 g
Wasserfreies kolloidales Siliciumdioxid (Aerosil 200^®)	1,000 g
Crospovidon (Polyplasdone XL^®)	4,000 g
farbgebendes Mittel	0,180 g

Claims

Verwendung einer Östrogenkomponente, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Substanzen der folgenden Formel:
wobei in der Formel R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen bedeuten; jeder der Reste R₅, R₆ und R₇ eine Hydroxylgruppe bedeutet; und nicht mehr als drei der Reste R₁, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoffatome bedeuten; Derivaten dieser Substanzen, wobei das Wasserstoffatom von mindestens einer der Hydroxylgruppen in der Formel durch einen Acylrest einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure-, sulfonsäure oder -sulfaminsäure mit 1-25 Kohlenstoffatomen; Tetrahydrofuranyl; Tetrahydropyranal; oder einen geradkettigen oder verzweigten Glycosidrest mit 1-20 Glycosid-Einheiten pro Rest ersetzt ist; und Gemischen davon; bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren der Hormonersatztherapie, wobei das Verfahren die orale Verabreichung einer wirksamen Menge der Östrogenkomponente an eine Person, die einer derartigen Behandlung bedarf, ohne begleitende Progestogen- oder anti-Progestogen-Behandlung umfasst, wobei die Zusammensetzung kein Progestogen oder anti-Progestin enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die Verabreichung der Östrogenkomponente in einer wirksamen Menge umfasst, um Symptome von Hypoöstrogenismus, die aus der Gruppe Osteoporose, Arteriosklerose, klimakterische Symptome, kognitive Störungen und Alzheimer-Krankheit ausgewählt sind, zu behandeln oder zu verhindern.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 3 der Gruppen R₁, R₂, R₃ und R₄ um ein Wasserstoffatom handelt.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Gruppen R₁, R₂ und R₄ Wasserstoffatome bedeuten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Zweck der Hormonersatztherapie darin besteht, (peri)-menopausale Störungen, post-menopausale Störungen und/oder Hypoöstrogenismus, der sich aus Hypogonadismus, Kastration, primärer Ovarialinsuffizienz, einer Behandlung mit einem Analogen des Gonadotropin freisetzenden Hormons oder einer Krebsbehandlung ergibt, zu behandeln.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die tägliche Verabreichung von mindestens 0,001 mg der Östrogenkomponente umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zusammensetzung kein Analoges des Gonadotropin freisetzenden Hormons, kein Luteinisierungshormon freisetzendes Hormon oder kein antisense-Oligonucleotid, das mit der Nucleotidsequenz des follikelstimulierenden Hormonrezeptors komplementär ist, enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Östrogenkomponente in einer Menge verabreicht wird, die zur Erzielung einer Blutserumkonzentration von mindestens 1 Nanogramm pro Liter und vorzugsweise von mindestens 10 Nanogramm pro Liter wirksam ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Östrogenkomponente in einer Menge von mindestens 1 μg pro kg Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise von mindestens 5 μg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren die Verabreichung der Östrogenkomponente für einen Zeitraum von mindestens 1 Monat und vorzugsweise von mindestens 3 Monaten umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren auf Personen angewandt wird, bei denen keine Oophorektomie vorgenommen worden ist oder bei denen die Gefahr einer endometrialen Stimulation durch östrogene Zusammensetzungen nicht auf ein Minimum beschränkt oder abwesend ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verfahren sich keiner Zubereitung mit langsamer Freisetzung bedient.