PT1390040E - Composição farmacêutica para ser utilizado na terapia hormonal de substituição. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA SER UTILIZADO NA TERAPIA

HORMONAL DE SUBSTITUIÇÃO

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de determinados compostos estrogénicos para a fabricação de um medicamento para ser utilizado numa terapia hormonal de substituição. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à fabricação de um medicamento para ser utilizado num método de terapia hormonal de substituição que compreende a sua administração, a uma pessoa necessitada deste tratamento, com uma quantidade eficaz de um componente estrogénico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Numa terapia hormonal de substituição (HRT), às vezes também referida como terapia estrogénica de substituição, os estrogénios são administrados para prevenir ou tratar sintomas resultantes de uma deficiência de estrogénios ou hipoestrogenismo. 0 hipoestrogenismo tanto se pode dar nas fêmeas assim como nos machos, e podem levar a doenças e perturbações como a osteoporose (perda de massa óssea), arteriosclerose, sintomas climatéricos como calores, suores, atrofia urogenital, mudanças do humor, insónia, palpitações. A deficiência estrogénica tem sido também associada com doenças cognitivas e com a doença de Alzheimer. 0 hipoestrogenismo, e em particular o hipoestrogenismo crónico, é muitas vezes observado nas mulheres (peri-)menopáusicas e pós-menopáusicas. No entanto este pode ser devido ainda ao hipogonadismo ou a uma castração, assim como a uma insuficiência 1 ovariana primária, a um tratamento de por exemplo cancro de mama com um inibidor de aromatase e um tratamento hormonal análogo de libertação da gonadotropina para doenças ginecológicas benignas como a endometriose, adenomiose, fibróides uterinos (leiomiomas), dismenorréia, menorragia e metrorragia.

Os estrogénios andógenos e exógenos cumprem funções nervosas centrais e metabólicas importantes no organismo feminino: Os níveis estrogénicos normais contribuem de forma decisiva para o bem-estar da mulher. Apesar da difusão da utilização dos estrogénios nos métodos da HRT, continua a haver problemas que ainda não foram resolvidos. Os estrogénios conhecidos, em particular os estrogénios biogénicos (isto é os estrogénios presentes de forma natural no corpo humano), são rapidamente eliminados do fluxo sanguíneo.m Por exemplo, para o principal estrogénio biogénico humano 17p-estradiol a meia -vida é de aproxímadamente 1 hora. 0 resultado é que, entre episódios separados de administração, os níveis do soro sanguíneo destes estrogénios biogénicos tendem a flutuar consideravelmente. Assim, logo após a administração, a concentração do soro é habitualmente várias vezes superior à concentração óptima. Adicionalmente, se o episódio da seguinte administração é atrasado, as concentrações de soro diminuirão rapidamente até um nível em que o estrogénio já não estará fisiologicamente activo. 0 esteroide estrogénico sinteticamente alterado mais importante é o 17a-etinil estradiol (EE). Este estrogénio é dominante na contracepção hormonal oral. Além do EE, nalguns casos tem sido utilizado o mestranol; o mestranol é um "profármaco" que é metabolizado no organismo em EE. Para os estrogénios o fígado é o órgão-alvo. A actividade da secreção que é afectada pelos estrogénios no fígado humano inclui uma síntese aumentada das proteínas de transporte CBG, SHBG, TBG, vários factores que são importantes para a fisiologia da coagulação do sangue, e das lipoproteínas. A forte estrogenícidade hepática do 2 etinilestradiol e do dietilstilbestrol (DES), especialmente o seu efeito nos factores da hemóstase, podem explicar porque estes estrogénios sintéticos têm sido associados com o risco aumentado de tromboembolismo. Outros efeitos secundários indesejáveis que têm sido referidos relacionados com a utilização de estrogénios sintéticos incluem a retenção de líquidos, náuseas, inchaço, colelitíase, dor de cabeça, dor de peito e com uma utilização prolongada um risco aumentado de cancro de mama. Os déficits anteriormente mencionados têm uma considerável importância clínica quando os habitualmente conhecidos estrogénios biogénicos e sintéticos são aplicados. Consequentemente, há uma necessidade ainda não satisfeita de que os estrogénios não apresentem estes déficits e que possam ser adequadamente empregues nos métodos HRT para substituir eficazmente a secreção ovariana endógena do estradiol, isto é para tratar ou prevenir os sintomas do hipoestrogenismo. 0 HRT emprega uma administração contínua de quantidades eficazes de um estrogénio durante períodos prolongados de tempo. No entanto, a administração de estrogénios tem sido associada, com a proliferação endometrial nas mulheres e actualmente está largamente aceite que a terapia estrogénica "não oposta" aumenta substancialmente o risco de cancro endometrial (Cushing et al., 1998. Obstet. Gynecol. 91, 35-39; Tavani et al., 1999. Drugs Aging, 14, 347-357). Há ainda evidências de um aumento significativo do cancro de mama com a utilizalção prolongada (10 a 15 anos) de um tratamento estrogénico (Tavani et al., 1999. Drugs Aging, 14, 347-357; Pike et al., 2000. Steroids, 65, 659-664) .

Para contrariar os efeitos negativos de uma terapia estrogénica não oposta, na actualidade é habitualmente aplicado um tratamento progestagénico adjunto. Pensa-se que a administração regular de progestogénios inibe a estimulação estrogénica contínua endometrial através de ura efeito antiproliferativo e parece reduzir a incidência do carcinoma endometrial nas 3 mulheres pósmenopáusicas que receberam a terapia estrogénica de substituição (Beral et al., 1999. J. Epidemiol. Biostat., 4, 191-210). Este tratamento adjunto, em que geralmente são utilizados os progestagénios sintéticos, tanto é dado em regimes contínuos combinados com o estrogénio, ou adicionado de forma sequencial, normalmente durante aproximadamente 14 dias por mês, a um tratamento estrogénico contínuo. Os regimes sequenciais estão associados com a hemorragia vaginal indesejada em resposta à retirada periódica dos progestogénios, enquanto que a terapia contínua combinada muitas vezes resulta numa hemorragia intermenstrual imprevisível. A hemorragia inaceitável deste tipo é a razão mais habitual para a interrupção da terapia hormonal de substituição.

Efeitos adicionais adversos de progestogénios adjuntos incluem edema, cãibras abdominais, dor no peito e sintomas de mudanças de humor (Hahn, 1989. Am. J. Obstet. Gynecol., 161, 1854-1858). Alguns progestogénios sintéticos não favoráveis afectam os modelos lipídicos e portanto negam ou atenuam os efeitos cardioprotectivos induzidos pelos estrogénios (Sitruk-Ware, 2000. Steroids, 65, 651-658).

Para evitar a necessidade de progestogénios adjuntos, têm sido realizados esforços para sintetizar moléculas com propriedades estrogénicas selectivas para obter os efeitos desejáveis nos tecidos alvo determinados, como por exemplo nos ossos, no fígado, no cérebro e nos tecidos que mediam a cardioprotecção, enquanto que minimamente afectam outros tecidos, como por exemplo o tecido endometrial e do peito. Estes esforços estão baseados no conhecimento emergente de que a interacção dos estrogénios com as proteínas reguladoras da reactividade dos estrogénios, isto é receptoras dos estrogénios, podem variar com tecidos alvo diferentes. Os compostos estrogénicos, que modulam selectivamente os receptores de estrogénios nos tecidos alvo diferentes e que consequentemente pode ser previsto que tenham efeitos selectivos agonistas/antagonistas dos estrogénios, são 4 conhecidos como moduladores selectivos dos receptores de estrogénios (SERMs) (Katzenellenbogen et al., 2000. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 74, 279-285; Burger 2000, Horm. Res., suppl 3, 25-29). É esperado que o SERM óptimo afecte funções celulares diferenciadas sem induzir à proliferação, porque uma proliferação aumentada está associada a um maior risco de cancro. Em relação ao endométrio, foi demonstrado que a proliferação exagerada (hiperplasia) é um precursor do cancro endometrial. Além de que, o SERM óptimo suprime a necessidade do tratamento progestogénico adjunto e os seus efeitos negativos. Um exemplo de um SERM sintético que está comercialmente disponível é o raloxifeno, um anti-estrogénio de benzotiofeno (Clemett et al., 2000. Drugs, 60, 379-411). Uma desvantagem conhecida do SERM sintético é que estas moléculas não se produzem de forma natural no corpo humano e que têm uma parecença pequena com os agonistas dos receptores estrogénicos que foram descobertos no corpo humano, por exemplo os estrogénios como a estrona, o estradiol e o estriol. É um objectivo da presente invenção a utilização de determinados compostos estrogénicos para a fabricação de um medicamento para ser utilizado num método de terapia hormonal de substituição, onde o componente estrogénico administrado não apresente os déficits que foram observados para os estrogénios biogénicos ou sintéticos habitualmente conhecidos e cujo componente estrogénico exibe propriedades como os SERM, podendo assim ser evitada a co-administraçâo do progestogénio. Adicionalmente, o método da presente invenção pretende empregar um componente estogénico que seja biogénico ou que se pareça muito a uma substância estrogénica biogénica. 5

RESUMO DA INVENÇÃO

Os inventores inesperadamente descobriram que estes objectivos podem ser realizados empregando as substâncias estrogénicas que estão representadas pela seguinte fórmula:

em que Ri, R2, Ra, R4 independentemente são um átomo de hidrogénio, um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi com 1 a 5 átomos de carbono; cada um de R5, Re, R7 é um grupo hidróxilo; e em que até 3 de Ri, R2, R3, R4 são átomos de hidrogénio.

Estes estrogénios são diferentes dos estrogénios habitualmente aplicados na terapia estrogégina de substituição, isto é o etinilestradiol, o estradiol e os seus ésteres como 0 acetato, o valerato ou o benzoato, o mestranol, os estrogénios equinos conjugados e o sulfato de estrona.

Um representante conhecido deste grupo de substâncias estrogénicas é o 1,3,5 (10)-estratrieno-3, 15a,16a,17p-tetrol, também conhecido com os nomes de estetrol, oestetrol e 15a-hidroxiestriol. O estetrol é um estrogénio que é produzido pelo fígado fetal durante a gestação humana. Os niveis de estetrol não conjugado no plasma materno no fim da gestação são cerca de 1.2 ng/ml e são aproximadamente 12 vezes maiores no plasma fetal 6 que no plasma materno (Tulchinsky et al., 1975. J. Clin. Endocrinol. Metab., 40, 560-567).

Apesar de que os inventores não desejem estar condicionados por uma teoria, pensamos que o componente estrogénico na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção interage com os receptores de estrogénios no endométrio humano de uma forma que é claramente diferente da interacção observada nestes estrogénios que são utilizados de forma habitual na terapia hormonal de substituição. Como será explicado à continuação, este fenómeno pode bem-estar associado com a interacção selectiva com os receptores de estrogénios Era e Εϊφ que foram observados para as presentes substâncias estrogénicas. Foi postulado que o estetrol funciona da mesma forma que um SERM interagindo selectivamente com os receptores de estrogénios para obter os efeitos estrogénicos e ao mesmo tempo minimizando os clássicos efeitos promotores do crescimento dos estrogénios habituais utilizados anteriormente mencionados. Em comparação com, por exemplo, o estradiol e o etinilestradiol, os componentes activos de acordo com a presente invenção apresentam um efeito proliferativo limitado no endométrio. Assim, diferentemente do caso anterior, para estes outros estrogénios, não há nenhuma necessidade de um tratamento adjunto com progestogénios (ou anti-progestogénios), particularmente se as substâncias estrogénicas da presente invenção são administradas em doses moderadas. A administração dos componentes estrogénicos de acordo com a invenção sem progestogénios ou anti-progestogénios suplementares produzem as vantagens totais da terapia estrogénica de substituição sem os inconvenientes relacionados com a utilização destas hormonas.

Em 1970, Fishman et al., "Fate of 15a-hydroxyestriol -3H in Adult Man", J. Clin. Endocrinol. Metab. (1970) 31, 436-438, descreveram os resultados de um estudo onde tinha sido administrado tritio marcado 15a-hidroxiestriol (estetrol) por 7 via intravenosa a duas mulheres adultas. Foi descoberto que o estetrol era rápido e completamente excretado na urina como o glucosiduronato e que praticamente não era produzido nenhum metabolismo excepto a conjugação.

Entre 1975 e 1985, vários investigadores estudaram as propriedades do estetrol e descreveram a sua potência estrogénica e a sua actividade uterotrófica. As publicações mais relevantes que apareceram durante este período são mencionadas abaixo: • Levine et al., 1984. Uterine vascular effects of estetrol in nonpregnant ewes. Am. J. Obstet. Gynecol., 148:73, 735-738: "Quando é administrado intravenosamente em ovelhas não gestantes, o estetrol é 15 a 30 vezes menos potente que o estriol e o 17p-estradiol numa vasodilação uterina". • Jozan et al., 1981. Different effects of oestradiol, oestriol, oestetrol and of oestrone on human breast câncer cells (MCF-7) in long term tissue culture. Acta

Endocrinologica, 98, 73-80: "A potência agonistíca do estetrol é 2% da magnitude observada durante a proliferação de uma célula in vitro de 17p~estradiol". • Holinka et al., 1980. Comparison of effects of estetrol and tamoxifem with those of estriol and estradiol on the immature rat uterus. Biol. Reprod. 22, 913-926: "O estetrol administrado subcutaneamente tem uma actividade uterotrófica muito fraca e é considerada menos potente que o 17p-estradiol e o estriol". • Holinka et al., 1979. In vivo effects of estetrol on the immature rat uterus. Biol. Reprod. 20, 242-246: "O estetrol administrado subcutaneamente tem uma actividade uterotrófica muito fraca e é considerado menos potente que o 17p-estradiol e o estriol". • Tseng et al., 1978. Heterogeneity of saturable estradiol binding sites in nuclei of human endometrium. Estetrol studies. J. Steroid Biochem. 9, 1145-1148: "A ligação relativa dos receptores de estetrol com os receptores de estrogénio no endométrio humano é 1.5 % de 17p-estradiol". • Martucci et al., 1977. Direction of estradiol metabolism as

a control of its hormonal action-uterotrophic activity of estradiol metabolites. Endocrin. 101, 1709-1715: "A administração continua do estetrol desde um depósito subcutâneo mostra uma actividade uterotrófica muito fraca e é consideravelmente menos potente do que o 17p-estradiol e o estriol". • Tseng et al., 1976. Competition of estetrol and

ethynylestradiol with estradiol for nuclear binding in human endometrium. J. Steroid Biochem. 7, 817-822: "A constante ligação relativa do estetrol com o receptor do estrogénio no endométrio humano é 6.25% comparado com ο 17β-estradiol (100%)". • Martucci et al., 1976. Uterine estrogem receptor binding of catecholestrogens and of estetrol (1,3,5(10)-estratriene-3, ISalpha, Í6alpha, 17beta-tetrol). Steroids, 27, 325-333: "A afinidade de ligação relativa do estetrol com um receptor de estrogénio citosol uterino da ratazana é 0.,5% de 17β-estradiol (100%). Além de que, a afinidade da ligação 9 relativa do estetrol num receptor estrógenico nuclear uterino de ratazana é 0.3% de 17p-estradiol (100%)".

Todas as publicações citadas têm em comum o facto de que os autores investigaram a potência estrogénica do estetrol. Todos sem excepção concluíram que o estetrol é um estrogénio fraco. Nalguns dos artigos citados foi descoberto que a potência estrogénica do estetrol era inferior à de outro estrogénio biogénico, isto é, ο 17β—estradiol, que é considerado um estrogénio relativamente fraco (quando por exemplo comparado com o etinilestradiol). Considerando estas descobertas, não é surpreendente que o interesse pelo estetrol tenha diminuído desde os anos oitenta e que desde então não tenha sido publicado nenhum estudo sobre as propriedades do estetrol. O Pedido de Patente estado-unidense US 5,468,736 (Hodgem) descreve um método de terapia hormonal de substituição que envolve a administração de um estrogénio juntamente com uma quantidade de antiprogestina (antiprogestagénio), que nas mulheres inibe a proliferação endometrial induzida pelo estrogénio. No exemplo 3 é mencionado a utilização combinada do estetrol e da lilopristona. Nos exemplos não foi dado nenhuma indicação relativa à forma e à frequência da administração ou em relação à quantidade de dosagem empregue. Uma desvantagem associada à utilização de antiprogestinas (ou anti-progestogénios), como a lilopristona, é o risco de que esta possa induzir a uma morfologia endometrial anormal, isto é a hiperplasia cística, como a que foi observada nas mulheres que estavam a receber um tratamento anti-progestagénico para tratar a endometriose (Murphy et al., 1995. Fértil. Steril., 95, 761— 766) . 10 0 Pedido de Parte estado-unidense US 5,340,586 (Pike et al.) refere composições e métodos que são eficazes para tratar mulheres ooforectomizadas, em que durante algum tempo foi administrada uma quantidade eficaz de uma composição estrogénica e de uma composição androgénica. Neste Pedido de Patente estado-unidense foi exposto que as composições estrogénicas naturais e sintéticas que podem ser utilizadas incluem hormonas e congéneres estrogénicos naturais, incluído mas não limitados ao estradiol, benzoato de estradiol, cipionato de estradiol, valerato de estradiol, estrona, dietilestilbestrol, sulfato de estrona de piperazina, etinilestradiol, mestranol, fosfato de poliestradiol, estriol, hemisuccinato de estriol, quinestrol, estropipato, pinestrol e sulfato de potássio de estrona, além de que podem também ser empregues os estrogénios equinos, como por exemplo a equilenina, sulfato de equilenina e estetrol. Exceptuando o inventário exaustivo dos estrogénios conhecidos, neste Pedido de Patente estado-unidense não é feita nenhuma outra referência ao estetrol (que é erradamente indicado como um estrogénio equino). Ά mesma lista exaustiva de estrogénios está indicada nos seguintes Pedidos de Patentes: • O Pedido de Patente estado-unidense 4,762,717 (Crowley): Método contraceptivo compreendendo a administração sequencial de: (1) uma combinação da hormona de libertação luteinizante (LHRH) e estrogénio e (2) uma combinação de LHRH, com estrogénio e com progestagénio. 11 • 0 Pedido de Patente estado-unidense 5,130,137 (Crowley): Método de tratamento da disfunção secretória ovariana benigna compreendendo a administração sequencial de: (1) uma combinação da hormona de libertação luteinizante (LHRH) e estrogénio e (2) combinação de LHRH, com estrogénio e com progestagénio. • O Pedido de Patente estado-unidense 5,211,952 (Spicer et al.): Método contraceptivo compreendendo a administração de uma composição hormonal de libertação de gonadotropina (GnRH) numa quantidade eficaz para inibir a ovulação, e a administração de estrogénio e de progestagénio para manter os níveis do soro superiores a um nível mínimo definido. • O Pedido de Patente estado-unidense 5,340,584 (Spicer et al.): Método para impedir a concepção ou tratar doenças ginecológicos benignas compreendendo a administração de uma composição de GnRH durante um primeiro período de tempo numa quantidade eficaz para suprimir a produção ovariana de estrogénio e de progesterona, administrando ao mesmo tempo uma composição estrogénica numa quantidade eficaz para prevenir sintomas de deficiência estrogénica e simultaneamente a administração de um progestagénio numa quantidade eficaz para manter o nível de soro do dito progestagénio num nível eficaz para reduzir a proliferação celular endometrial. • O Pedido de Patente estado-unidense 5,340,585 (Pike et al.): Método para o tratamento das doenças ginecológicas benignas numa doente em que o risco da estimulação endometrial com composições estrogénicas é minimizada ou inexistente, compreendendo a administração de uma composição de GnRH numa quantidade eficaz para suprimir a 12 produção ovariana de estrogénio e progesterona e a administração de uma composição estrogénica numa quantidade eficaz para prevenir sintomas de deficiência estrogénica. • 0 Pedido de Patente WO 00/73416 (Yifang et al.): Método para regular a fertilidade de um hospedeiro, compreendendo o contacto das células ovarianas do hospedeiro com uma quantidade segura e eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um oligonucleótido anti-sentido que é complementar à sequência nucleótida do receptor hormonal da estimulação folicular (FSH). Neste Pedido de Patente é mencionada a possibilidade da administração combinada deste oligonucleótido anti-sentido com um esteróide estrogénico.

As vantagens da presente invenção podem ser realizados sem a co-administração de anti-progestogénios, composições de LHRH, composições de GnRH e/ou oligonucleótidos anti-sentido que são complementares à sequência dos nucleótidos do receptor hormonal de estimulação folicular (FSH) como o que tinha sido proposto nos Pedidos de Patentes anteriormente mencionadas. A presente invenção pode ainda ser aplicada de forma apropriada a indivíduos que não foram ooforectomizados, ou nos que o risco da estimulação endométrica por composições estrogénicas não tenha sido minimizado ou seja inexistente. Além de que, o método da presente invenção não requer a utilização de uma formulação de libertação lenta como a que é especificada na maioria das publicações anteriormente mencionadas.

Devido à baixa potência estrogénica das substâncias do tipo estetrol que foram empregues de acordo com a invenção, é surpreendente que estas substâncias possam ser eficazmente utilizadas num método de terapia hormonal de substituição. Apesar de que os inventores não desejem estar condicionados por uma teoria, pensamos que a inesperada eficácia das substâncias 13 do tipo estetrol administradas via entérica ou parentérica resultante da combinação imprevista das propriedades favoráveis farmacocinéticas (ADME) e farmacodinâmicas destas substâncias.

No que se refere às propriedades farmacocinéticas das presentes substâncias estrogénicas, os inventores descobriram que a sua meia-vida in vivo é consideravelmente maior do que a de outros estrogénios biogénicos. Assim, ainda que o estetrol e as substâncias do tipo estetrol tenham uma potência estrogénica relativamente baixa, estas podem ser eficazmente empregues num método oral para HRT já que a sua baixa potência é compensada por uma estabilidade metabólica relativamente alta, como o demonstrado pela sua longa meia-vida.

Uma propriedade vantajosa das substâncias estrogénicas da presente invenção consiste no facto de que a globulina de ligação hormonal sexual (SHBG) raramente liga estas substâncias estrogénicas, o que significa que contrariamente à maioria dos estrogénios conhecidos, os níveis de soro são representativos dos níveis da bioactividade e independentes dos níveis de SHBG.

Também outra vantagem importante das substâncias estrogénicas da presente invenção é devida à sua relativa insensibilidade às interacções com outros medicamentos (interacções entre medicamento e medicamento). É bem conhecido o facto de que certos medicamentos podem reduzir a eficácia dos estrogénios, como o etinilestradiol, e que outros medicamentos podem aumentar a sua actividade, produzindo um possível aumento de efeitos secundários. Identicamente os estrogénios podem interferir no metabolismo de outros medicamentos. Geralmente, o efeito de outros medicamentos sobre os estrogénios é devido a uma interferência com a absorção, o metabolismo ou a excreção destes estrogénios, enquanto que o efeito dos estrogénios sobre outros medicamentos é devido a uma competição das vias metabólicas. 14 0 grupo clinicamente mais significativo das interacções de medicamento-estrogénio dá-se com medicamentos que podem induzir as enzimas microssómicas hepáticas, as quais podem reduzir os níveis em plasma dos estrogénios abaixo de um nível terapêutico (por exemplo, agentes anticonvulsivos; fenitoína, primidona, barbitúricos, carbamazepina, etosuximida, e metosuximida; medicamentos antituberculose como a rifampicina; medicamentos antifúngicos como a griseofulvina). As substâncias estrogénicas da presente invenção são menos dependentes da regulação por aumento ou regulação por diminuição do número de enzimas microssómicas hepáticas (por exemplo P450's) e também menos sensíveis à competição com outros substratos P450. De forma similar, estes não interferem significativamente no metabolismo de outros medicamentos.

Os conjugados da maioria dos estrogénios, por exemplo formados no fígado, são excretados na bílis e podem ser destruídos pelas bactérias intestinais no cólon para libertar a hormona activa que pode seguidamente ser reabsorbida (recirculação enterohepática) . Existem informações clínicas que sustentam a ideia de que uma recirculação enterohepática de estrogénios é reduzida nas mulheres que tomam antibióticos como a ampicilina, tetraciclina, etc. As formas conjugadas das substâncias estrogénicas da presente invenção dificilmente são excretadas na bílis, o que significa que estas são substancialmente insensíveis aos medicamentos que influem na recirculação enterohepática de outros estrogénios.

As observações anteriores servem para explicar porque as substâncias estrogénicas da invenção apenas sofrem as interacções entre medicamento e medicamento e consequentemente produzem um impacto muito consistente, isto é previsível. Assim, a eficácia das substâncias estrogénicas da invenção são extremamente fiáveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Consequentemente, um aspecto da presente invenção refere-se à utilização de certos compostos estrogénicos para a fabricação de um medicamento para ser utilizado num método de terapia hormonal de substituição, compreendendo o dito método a administração oral a uma pessoa necessitada deste tratamento, sem tratamento progestogénico ou antiprogestogénico adjunto, com uma quantidade eficaz de um componente estrogénico seleccionado do grupo composto por substâncias representadas pela seguinte fórmula:

em que Rx, R2, R3, R4 independentemente são um átomo de hidrogénio, um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi com 1 a 5 átomos de carbono; cada um de R5, Re, R7 é um grupo hidróxilo; e até 3 de Rx, R2, R3, R4 são átomos de hidrogénio; derivados destas substâncias onde o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxilo na dita fórmula foi substituído por um radical acilo de um hidrocarboneto carboxilico, ácido sulfónico ou sulfámico com 1 a 25 átomos de carbono: tetrahidrofuranilo; tetrahidropiranol: ou um resíduo de glicose de cadeia linear ou ramificada contendo 1 a 20 unidades de glicose por resíduo; e misturas derivadas; a dita composição não contém progestogénio nem antíprogestina. 16 0 método da HRT de acordo com a invenção pode ser vantajosamente utilizada para tratar todas as formas conhecidas de hipoestrogenismo, por exemplo o hipoestrogenismo associado a mulheres (peri-)menopáusicas e pós-menopáusicas, hipoestrogenismo derivado do hipogonadismo ou castração, assim como o hipoestrogenismo resultante de uma insuficiência ovariana primária, tratamento de por exemplo cancro da mama com inibidor da aromatase e tratamento análogo hormonal de libertação da gonadotropina para por exemplo doenças ginecológicas benignas. Exemplos de manifestações de hipoestrogenismo que podem ser eficazmente tratadas ou evitadas com o presente método tanto em mulheres como em homens, incluem a osteoporose, arteriosclerose, doenças cognitivas e doença de Alzheimer. 0 método pode também ser vantajosamente utilizado no tratamento (profiláctico) de sintomas climatéricos como os calores, suores, atrofia urogenital, mudanças de humor, insónia e palpitações. 0 presente método é particularmente adequado para tratar ou prevenir a osteoporose e os sintomas climatéricos. A designação "composto estrogénico" como é utilizado ao longo deste documento inclui substâncias que são capazes de desencadear uma resposta estrogénica in vivo, assim como precursores que são capazes de libertar este composto estrogénico in vivo quando são utilizados de acordo com a presente invenção. Para que os compostos estrogénicos possam desencadear esta resposta, estes normalmente têm que estar ligados a um receptor de estrogénios, os quais se encontram em vários tecidos no interior do corpo de um mamifero.

Deve ser salientado que a presente invenção não só abrange a utilização dos compostos estrogénicos mencionados neste Pedido de Patente, mas também os metabolitos destas hormonas que apresentam uma funcionalidade comparável in vivo. Neste contexto tem sido por exemplo, observado que o estriol é um metabolito de 17beta-estradiol. A designação "substâncias estrogénicas" como é utilizado neste documento não abrange as substâncias 17 estrogénicas marcadas com trítío (3H) como por exemplo o estetrol marcado com trítio.

As substâncias estrogénicas da presente invenção distinguem-se dos estrogénios biogénicos e sintéticos que habitualmente são aplicados nas formulações farmacêuticas porque estas contêm pelo menos 4 grupos hidróxilo. As substâncias da presente invenção são especiais porque 5 anéis dos membros no esqueleto do esteroide compreendem 3 substituintes de hidróxilo em vez de 0 a 2. Os estrogénios conhecidos que contêm pelo menos 4 grupos hidróxilo e seus derivados são: 1.3, 5(10)-estratrieno-2, 3, 15a, 16a, 17p-pentol 2-metil éter 1.3, 5(10)-estratrieno-2, 3, 15β, 16α, 17p~pentol 2-metil éter 1.3, 5(10)-estratrieno-2, 3, 16α, 17β— tetrol 1.3, 5(10)-estratrieno-3, 4, 16α, 17β— tetrol 4-metil éter 1.3, 5(10)-estratrieno-3, 15a, 16a, 17p-tetrol 1.3, 5(10)-estratrieno-3, 15a, 16a, 17p-tetrol tetra acetato 1.3, 5(10)-estratrieno-3, 15β, 16β, l?p-tetrol tetra acetato

Preferencialmente, a substância estrogénica aplicada como o composto activo na presente composição é o denominado estrogénio biogénico, isto é o estrogénio que se pruduz de forma natural no corpo humano, um precursor de um estrogénio biogénico ou suas misturas. Porque os estrogénios biogénicos estão de forma natural presentes no corpo fetal e feminino, não é esperado que se dê algum efeito secundário, particularmente quando os níveis no soro resultantes da administração exógena dos estrogénios deste tipo substancialmente não excedam as concentrações de 18 origem natural. Desde que os níveis de soro de estetrol no feto sejam várias vezes superiores aos que são encontrados nas fêmeas em gestação e sabendo que o feto é particularmente vulnerável, é considerado que o estetrol é um estrogénio biogénico particularmente seguro. Não é esperado que se dê algum efeito secundário, particularmente quando os níveis no soro resultanres da administração exógena destes estrogénios não excedam substancialmente as concentrações (fetais) produzidas naturalmente. Com os estrogénios sintéticos como por exemplo o etinilestradiol, há um risco (dependendo da dose) de efeitos secundários indesejáveis, como por exemplo uma tromboembolia, retenção de líquidos, náuseas, inchaço, colelitíase, dor de cabeça e dor de peito e com uma utilização prolongada um risco maior de cancro da mama.

Numa forma preferida de realizar a presente invenção a substância estrogénica contém 4 grupos hidróxilo. Também, na fórmula anteriormente mencionada, Fh preferencialmente representa um átomo de hidrogénio. Na dita fórmula preferencialmente pelo menos 2, mais preferencialmente pelo menos 3 dos grupos Ri, R2, R3 e R4 representam um átomo de hidrogénio.

As substâncias estrogénicas segundo a fórmula abrangem vários enantiómeros desde que os átomos de carbono que transportam os substituintes de hidróxilo R$, R6 e R? sejam quiralmente activos. Numa forma preferida de realizar a invenção, a presente substância estrogénica é o 15a-hidroxi substituído. Noutra forma preferida de realizar a presente invenção a substância é o 16a-hidroxi substituído. Ainda noutra forma preferida de realizar a invenção, a substância é o 17P~hidroxi substituído. Mais preferencialmente as substâncias estrogénicas são 15α, 16a, 17β-trihidroxi substituídos.

Noutra forma preferida de realizar a presente invenção R3 representa um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi. Noutra forma preferida de realizar a invenção os grupos Rlf R2 e R4 representam átomos de hidrogénio, e no caso de que R3, Rs, Re e R? sejam grupos hidróxilo, a substância é 1,3,5(10)-estratrieno-3, 15, 16, 17-tetrol. Um isómero preferido desta última substância é o 1,3,5 (10)-estratrieno-3, 15a,16a,17p-tetrol (estetrol). A invenção abrange também a utilização de derivados das substâncias estrogénicas da presente invenção que são utilizados como precursores, onde o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxilo foram substituídos por um radical acilo de um hidrocarboneto carboxílico, ácido sulfónico ou sulfámico com 1 a 25 átomos de carbono; tetrahidrofuranilo; tetrahidropirano; ou um resíduo glicosídico de cadeia linear ou ramificada que contém de 1 a 20 unidades glicosídicas por resíduo.

Alguns exemplos típicos dos precursores que podem ser adequadamente utilizados de acordo com a invenção são ésteres que podem ser obtidos com uma reacção dos grupos hidróxilo das substâncias estrogénicas com substâncias que contêm um ou mais grupos carbóxi (M" -OOC-), onde M+ representa um hidrogénio ou catião metálico (alcalino). Assim, numa forma particularmente preferida de realizar a invenção, os precursores são derivados das substâncias estrogénicas, onde o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxilo na dita fórmula tem sido substituído por -CO-R, onde R é um radical de hidrocarbonetos composto por 1 a 25 átomos de carbono. Preferencialmente R é hidrogénio, ou um radical alquilo, alquenilo ou arilo composto por 1 a 20 átomos de carbono.

As vantagens da presente invenção são mais pronunciadas quando a composição é utilizada numa terapia hormonal de substituição durante um período maior para minimizar os efeitos negativos de um hipoestrogenismo crónico. Consequentemente, o método de 20 terapia hormonal de substituição, preferencialmente, compreende a administração do componente estrogénico durante um período de pelo menos 1 mês, mais preferencialmente de pelo menos 3 meses. Numa forma preferida de realizar a presente invenção o componente estrogénico é administrado durante um período de pelo menos 4 meses, preferencialmente de pelo menos 6 meses. 0 componente estrogénico é habitualmente administrado de forma ininterrupta durante um período de pelo menos 10 dias, preferencialmente de pelo menos 20 dias. Os intervalos de interrupção preferencialmente não excedem um período de 20 dias, mais preferencialmente não excedem um período de 10 dias. Numa forma particularmente preferida de realizar a invenção, o composto estrogénico é administrado de forma ininterrupta durante um período de pelo menos 4 meses, preferencialmente pelo menos 6 meses. A designação "ininterrupta" como é utilizada neste documento, significa que o composto estrogénico é administrado em intervalos relativamente regulares, sem interrupções (terapeuticamente) significativas. Naturalmente, pode haver interrupções pouco importantes sem que estas afectem a eficácia global do presente método, e de facto estas aberrações estão abrangidas pela presente invenção. Numa forma preferida de realizar a invenção, e de forma mais aritmética, o regime de administração é considerado contínuo quando o intervalo maior entre 2 administrações consecutivas não é superior a mais de 3.5 vezes a média do intervalo. Ainda numa forma preferida de realizar a invenção, e de forma mais aritmética, o regime de administração é considerado contínuo quando o intervalo maior entre 2 administrações consecutivas não é superior a mais de 2.5 vezes a média do intervalo, mais preferencialmente não é superior a mais de 1.5 a média do intervale. 21 0 método da presente emprega a administração oral do componente estrogénico. A administração oral é idealmente adequada para ser administrada (pelo menos) uma vez ao dia.

Por uma questão de conveniência e também para obter índices de conformidade elevadas, a presente invenção preferencialmente utiliza intervalos de administração de 1 dia, 1 semana ou 1 mês. São particularmente preferidos os regimes que empregam a administração oral de uma vez ao dia. 0 componente estrogénico é preferencialmente administrado numa quantidade eficaz para obter uma concentração no soro sanguíneo de pelo menos 1 nanogramo por litro, mais preferencialmente de pelo menos 10 nanogramos por litro, mais preferencialmente de pelo menos 100 nanogramos por litro. Geralmente a concentração no soro sanguíneo resultante do composto estrogénico não excederá 100 pg por litro, preferencialmente não excederá 50 pg por litro, mais preferencialmente não excederá 25 μg por litro.

De acordo com a presente invenção, o componente estrogénico é habitualmente administrado numa quantidade inferior a 1 mg ao dia por kg de peso corporal, preferencialmente inferior a 0,4 mg ao dia por kg de peso corporal. Para obter um impacto impacto significativo com a administração do componente estrogénico, é aconselhável que ele seja administrado numa quantidade de pelo menos 1 pg ao dia por kg de peso corporal. Preferencialmente, a quantidade administrada seja de pelo menos 5 pg ao dia por kg de peso corporal. A administração oral do componente activo é preferencialmente dada numa quantidade inferior a 400 pg ao dia por kg de peso corporal, preferencialmente inferior a 200 pg ao dia por kg de peso corporal. Para obter um impacto significativo com a 22 administração do componente activor é aconselhável que este seja administrado oralmente numa quantidade de pelo menos 2 μg ao dia por kg de peso corporal. Preferencialmente, a quantidade administrada oralmente seja de pelo menos 5 pg ao dia por kg de peso corporal. No método da presente invenção, particularmente quando é utilizado nos seres humanos, o componente estrogénico é habitualmente administrado numa dose média de pelo menos 0.05 mg ao dia, preferencialmente de pelo menos 0.1 mg ao dia. A utilização de acordo com a presente invenção compreende a administração a uma pessoa necessitada deste tratamento com uma quantidade eficaz do componente estrogénico. As quantidades necessárias para serem eficazes serão diferentes de indivíduo para indivíduo e são determinadas por factores como por exemplo o nível de deficiência de estrogénios do indivíduo, a sua massa corporal, a forma de administração e a eficácia da substância estrogénica particular usada. De maneira adequada, o método de acordo com a invenção compreenderá a administração diária de pelo menos 0.001, preferencialmente de 0.001-1000 mg do componente estrogénico. Preferencialmente o método da HRT da invenção compreende a administração por via oral ou por via transdérmica, numa base diária de 0.01-1000 mg, e mais preferencialmente de 0.1-100 mg do componente estrogénico.

Os inventores descobriram surpreendentemente que as substâncias estrogénicas da presente invenção apresentam uma afinidade muito mais elevada ao receptor de estrogénios α (Era) do que ao receptor de estrogénios β(ΕΗβ). Esta característica é a única característica destas substâncias estrogénicas que pensamos estarem intrinsecamente ligadas com as propriedades benéficas destas substâncias como é manifestado no método da presente invenção. 23

Dada a complexidade da sinalização com ER, ao longo da expressão dc tecido específico de Era e ERP e seus co-factores, actualmente é reconhecido que os ligandos de ER podem agir como agonistas dos estrogénios ou ainda como antagonistas dos estrogénios de uma maneira específica num tecido. No caso das substâncias estrogénicas da presente invenção, a interacção com os co-factores pode resultar em acções biológicas muito diferentes destas substâncias, em tecidos diferentes. É sabido que os receptores de Era e ERp, têm sequências de aminoácidos significativamente diferentes no dominio da união do ligando e nos domínios da transactivação carboxi-terminal (aproximadamente 56% da identidade do aminoácido), e apenas 20% de homologia no seu domínio de transactivação amino-terminal. Isto explica porque as substâncias estrogénicas da presente invenção podem exibir uma afinidade muito mais elevada ao receptor Era do que ao receptor ERp.

As substâncias estrogénicas da presente invenção, ainda que apresentem uma afinidade muito mais alta a Era do que ERP, não devem ser consideradas como antagonistas do receptor ERp. Para excluir o risco de efeitos proliferativos indesejáveis, é aconselhável não empregar doses elevadas indevidas das substâncias estrogénicas da presente invenção. Preferencialmente o componente estrogénico é administrado numa dose média diária que não excederá os 50 mg, 40 mg, 30 mg ou 20 mg. Mais preferencialmente a dose média diária não excederá os 10 mg. Mais preferencialmente a dose média diária não excederá 5 mg. A utilização de acordo com a presente invenção emprega a administração oral do componente activo estrogénico. As formas de administração oral de acordo com as utilizadas na presente invenção abrangem também a administração oral por sonda esofágica. Os inventores surpreendentemente descobriram que, apesar da sua fraca potência, o estetrol e as substâncias 24 estrogénicas relacionadas podem ser vantajosamente administrados por via oral. Apesar de que os inventores não desejem estar condicionados por uma teoria, pensamos que a inesperada eficácia das substâncias do tipo estetrol administradas oralmente resultam da combinação das propriedades especiais farmacocinéticas e farmacodinâmicas destas substâncias.

Os inventores descobriram que a biodisponibilidade oral das substâncias do tipo estetrol é surpreendentemente alta e que sua meia-vida in vivo é consideravelmente maior do que a de outros estrogénios biogénicos. Assim, ainda que o estetrol e as substâncias do tipo estetrol tenham uma potência estrogénica relativamente baixa, estas podem ser administrados oralmente de forma eficaz porque as doses orais requeridas para obter o efeito desejado são idênticas às já utilizadas para por exemplo o 17p-estradiol.

Outra vantagem importante da administração oral do estetrol e das substâncias do tipo estetrol consiste em que é considerado que os efeitos hepáticos das substâncias do tipo estetrol são mínimos dado que estas raramente são metabolizadas durante a denominada "primeira fase". 0 efeito da primeira fase dos medicamentos oralmente administrados, refere-se ao processo de degradação do medicamento pelo fígado durante a transição do medicamento desde a sua ingestão inicial até à sua circulação no fluxo sanguíneo. Após a reabsorção no lúmen intestinal, os ingredientes activos administrados oralmente entram no organismo via fígado. Este facto tem uma importância específica para os agentes estrogénicas em virtude de que o fígado é o órgão-alvo para os estrogénios; uma toma oral de estrogénios resulta em fortes efeitos estrogénicos no fígado. As doses terapeuticamente equivalentes dos estrogénios biogénicos, quando são administradas oralmente, resultam em respostas evidentes dos parâmetros hepáticos, como por exemplo o aumento da SHBG, CBG, angiotensinogénio e HDL (alta densidade lipoproteíca). Estes 25 efeitos hepáticos dos estrogénios são também observados aquando da utilização de formulações de estrogénios equinos (denominados também estrogénios conjugados). 0 etinilestradiol e o dietilestilbestrol (DES) têm ainda uma estrogenicidade hepática maior. Elger et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. (1995), 55(3/4), 395-403, descreveram que o EE ou DES têm uma estrogenicidade hepatocelular muito mais elevada que a estrogenicidade sistémica: Em relação com uma actividade inibitória de secreção da FSH estes estrogénios são 4 a 18 vezes mais activos no fígado do que o sulfato de estrona.

Numa forma particularmente preferida de realizar a invenção a composição farmacêutica de acordo com a invenção está desenhada para uma administração diária, isto é representa uma unidade de dose diária. De acordo com esta forma de realização preferida a unidade de dose diária contém 0.001-1000 mg do componente estrogénico. Mais preferencialmente a quantidade do componente estrogénico está na margem de 0.01-1000 mg. Ainda mais preferencialmente a dita quantidade está na margem de 0.1-100 mg. Especialmente preferidas são as unidades de dose diárias que no máximo contêm 50 mg, 40 mg, 30 mg, 20 mg ou 10 mg do componente estrogénico. Mais preferencialmente a unidade de dose diária como máximo contém 5 mg do componente estrogénico.

Como foi anteriormente mencionado, é uma vantagem importante da composição farmacêutica da presente invenção que esta possa ser utilizada para obter as vantagens da terapia estrogénica de substituição sem o inconveniente de uma proliferação endometrial significativa induzida pelos estrogénios, obviando deste modo a necessidade de utilizar hormonas suplementares, como por exemplo os progestogénios e os anti-progestogénios, para suprimir essa proliferação endometrial. 26

Portanto, de acordo com a presente invenção, a composição praticamente não contém progestogénios ou anti-progestogénios. Mais preferencialmente a presente composição não contém progestogénios ou anti-progestogénios. A utilização combinada de estrogénios e da hormona de libertação da gonadotropina, estrogénios e da hormona de libertação luteinizante e estrogénios e oligonucleótidos antisentido para estimular o gene receptor da hormona folicular foram sugeridos nos documentos da técnica anterior que foram discutidos acima. Numa forma preferida de realizar o método da presente invenção, este não emprega análogos da hormona libertadora da gonadotropina. Noutra forma preferida de realizar o método da presente invenção esta não emprega uma hormona libertadora da hormona luteinizante. Ainda noutra forma preferida de realizar o método da invenção este não emprega um oligonucleótido antisentido que é complementar à sequência de nucleótidos do receptor da hormona de estimulação folicular.

Dado que as vantagens da presente invenção podem ser obtidas utilizando as presentes substâncias e os seus precursores como os únicos ingredientes activos, é preferível que além do componente estrogénico a composição praticamente não contenha nenhuma outra hormona sexual nem antagonistas de hormonas sexuais. Mais preferencialmente, o nível total das hormonas sexuais ou antagonistas das hormonas sexuais além do componente estrogénico é inferior a 1%, e mais preferencialmente é inferior a 0,1 % em peso do componente estrogénico.

No entanto, deve ser entendido que a presente composição pode de maneira adequada compreender uma variedade de outros componentes farmacêuticos suplementares. Em particular, pode ser vantajoso incluir adicionalmente androgénios cu agentes anti-reabsortivos como calcitoninas e bisfosfonatos. Pode ainda ser proveitoso incorporar componentes que ajam como agentes anabólicos, como por exemplo sais de fluoreto, hormona do crescimento, factores do crescimento do tipo insulina, paratiróide, estatinas, cálcio 27 e vitamina D. Além de que, pode ser vantajoso incluir agentes protectores cardiovasculares, como por exemplo as estatinas e o ácido fólico. A presente invenção é ilustrada mais detalhadamente com os exemplos seguintes, os quais, no entanto, não devem ser considerados limitativos. As formas de realizar a presente invenção anteriormente descritas, nos exemplos seguintes e nas reivindicações anexas podem, separadamente assim como em qualquer combinação entre elas, serem materializadas para realizar a invenção nas suas distintas formas.

EXEMPLOS

Exemplo 1 A cornificação vaginal foi escolhida como o critério de valorização tecidular especifico e sensivel ao estrogénio para determinar a estrogenicidade do estetrol (E4), após uma administração oral ou subcutânea, em ratazanas hipoestrogénicas. Nestes ensaios biológicos o 17a-etinilestradiol (EE), o 17 β— estradiol (E2) e o veiculo (10% etanol/óleo de sésamo) serviram de controlo.

O aumento de peso uterino na ratazana é habitualmente mais utilizado como medida de estrogenicidade. No entanto, o peso uterino também responde à progesterona, testosterona, e a outros agentes que caracteristicamente não são definidos como estrogénios. No início do ano 1920, foi descoberto que o fluido folicular do ovário de porco continha um(uns) factor(es) que provocava uma cornificação/queratinização do epitélio vaginal na ratazana (Allen & Doisy, 1923, JAMA, 81, 819-821; Allen & Doisy, 1924, Am. J. Physiol., 69, 577-588). A resposta da denominada cornificação vaginal nas ratazanas proporcionou subsequentemente um ensaio biológico para testar a estrogenicidade. A 28 corníficação/queratinização vaginal epitelial nas ratazanas ovariectomizadas somente pode ser produzida por compostos considerados como verdadeiros estrogénios (Jones et al, 1973, Fert. Steril. 24, 284-291). A cornificação/queratinização vaginal epitelial representa, portanto, um critério de valorização altamente selectivo para determinar a potência dos estrogénios (Reel et al., 1996, Fund. Appli. Toxicol. 34, 288— 305) .

As ratazanas CD fêmeas adultas intactas foram ovariectomizadas para induzir uma deficiência estrogénica. Durante sete dias foram feitas lavagens vaginais para garantir que as ratazanas demonstravam esfregaços vaginais de animais castrados (predomínio de leucócitos no esfregaço vaginal, e com um aspecto idêntico a um esfregaço vaginal do diestro). Os esfregaços vaginais dos animais castrados são indicativos de que uma ovariectomia completa foi obtida. O tratamento foi iniciado após finalizados os 7 dias de persistência (dia 0 = primeiro dia de dose). Os animais tomaram uma dose diária durante 7 dias consecutivos. As lavagens vaginais diárias foram feitas durante 7 dias após ter sido iniciada a dosagem para detectar uma cornificação vaginal, como uma indicação da resposta estrogénica. Uma gota da lavagem vaginal foi colocada numa lâmina de vidro e examinada num microscópio óptico para detectar a presença ou ausência de células epiteliais cornificadas. As lavagens vaginais foram obtidas antes de uma dosagem durante os dias de 0 a 6 e antes de uma necroscopia ao 7o dia. O ensaio biológico da cornificação vaginal foi executado para determinar o perfil estrogénico de E4 quando é subcutaneamente (sc) administrado a ratazanas adultas ovariectomizadas. 0 E2 foi utilizado como um controlo positivo. O veículo (10% de etanol/óleo' de sésamo) serviu de controlo negativo. Os esteróides foram dissolvidos em etanol absoluto e seguidamente introduzidos na concentração final com óleo de sésamo (10% de etanol em óleo de sésamo). Ao 2o dia deu-se uma resposta vaginal 29 estrogénica nas 8/8 ratazanas e que persistiu nas ratazanas injectadas sc com 50 pg/kg/dia de E2 durante 7 dias (quadro 1) . Os animais tratados com o veiculo não exibiram cornificação epitelial vaginal (quadro 1). A aparição de cornificação vaginal epitelial foi dependente da dose nas ratazanas injectadas sc com 0.1, 0.3, 1.0, e 3.0 mg/kg/dia de E4 e começou no mesmo dia do tratamento (2o. dia) como o observado para E2 (quadro 1). Ao 7o dia, com 0.1 mg/kg/dia de E4 já 4/8 ratazanas e com 0.3 mg/kg/dia de E4 mesmo 7/8 ratazanas exibiram uma resposta estrogénica vaginal. Ao 1°. dia, com 1.0 e 3.0 mg/kg/dia de E4 todas as ratazanas mostravam uma resposta estrogénica vaginal (quadro 1).

Quadro 1: Resposta vaginal estrogénica das ratazanas ovariectomizadas tratadas subcutaneamente (sc) com 17p-etinilestradiol (E2) ou estetrol (E4). Os dados são expressos como o número de ratazanas que apresentaram uma cornificação vaginal em relação (rácio) ao número de ratazanas tratadas.

Grupo de tratamento Via de dosagem Número de ratazanas que exibiram uma resposta estrogénica / número de ratazanas tratadas Dia do Estudo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 0.C5 mg/kg/dia de E2 SC 0/8 0/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 Controlo do veículo sc 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0.1 mg/kg/dia de E4 sc 0/8 0/6 0/8 1/8 1/8 4/8 3/8 4/8 0.3 mg/kg/dia de E4 sc 0/8 0/8 1/8 5/8 7/8 6/8 7/8 7/8 1.0 mg/kg/dia de E4 sc 0/8 0/8 1/8 6/8 8/8 7/8 8/8 1 8/8 30 3.0 mg/kg/dia de E4 sc 0/8 0/8 3/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 0 ensaio biológico da cornificação vaginal foi executado para determinar o perfil estrogénico de E4 quando é oralmente (po) administrado a ratazanas adultas ovariectomizadas. 0 EE foi utilizado como um controlo positivo. 0 veiculo (10% de etanol/óleo de sésamo) serviu de controlo negativo. Os esteróides foram dissolvidos em etanol absoluto e seguidamente introduzidos na concentração final com óleo de sésamo (10% de etanol em óleo de sésamo) . Ao 7o dia todas as ratazanas (8/8) que tomaram 50 mg/kg/dia de EE po tinham desenvolvido uma resposta vaginal estrogénica (quadro 2) . Identicamente, ao 7o dia foi observado uma cornificação epitelial vaginal em todas as ratazanas (8/8) tratadas po com qualquer de 0.1, 0.3, 1.0, ou 3.0 mg/kg/dia de E4 (quadro 1), enquanto que os animais tratados com o veiculo não exibiram cornificação epitelial vaginal (0/8). Surpreendentemente, até as ratazanas a que foram administradas doses relativamente baixas de E4 (por exemplo 0.1 e 0.3 mg/kg/dia), a aparição da cornificação vaginal (definida como a quantidade de animais que responderam ao estudo nos dias 1 a 3) foi mais rápida nos animais tratados po do que a nos animais tratados sc, demonstrando as características insuperáveis da biodisponibilidade do estetrol após a sua administração oral.

Quadro 2: Resposta vaginal estrogénica das ratazanas ovariectomizadas tratadas oralmente (po) com 17a-etinilestradiol (EE) ou estetrol (E4) . Os dados são expressos como o número de ratazanas que apresentaram uma cornificação vaginal em relação (rácio) ao número de ratazanas tratadas. 31

Grupo de tratamento Via de dosagem Número de ratazanas que exibiram uma resposta estrogénica / número de ratazanas tratadas Dia do Estudo Dia 0 Dia Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia Dia 6 Dia 7 0.05 mg/kg/dia de EE po 0/8 1/8 3/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 Controlo do veículo (2 ml/kg/dia) po 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0.1 mg/kg/dia de E4 po 0/8 0/8 1/8 7/8 8/8 8/8 8/8 8/8 0.3 mg/kg/dia de E4 po 0/8 0/8 1/8 7/8 8/8 8/8 8/8 8/8 1.0 mg/kg/dia de E4 po 0/8 0/8 4/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 3.0 mg/kg/dia de E4 po 0/8 0/8 6/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8

Exemplo 2 A ratazana ovariectomizada envelhecida foi utilizada como modelo para a doença de osteoporose humana. Este é um modelo de animal estabelecido, recomendado pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos da América (FDA), para interpretar e avaliar os agentes potenciais para a prevenção e tratamento da osteoporose. A eficácia anti-reabsortivas do estetrol (E4) foi testada com uma medição da densidade total mineral óssea trabecular e a resistência óssea ex vivo após 4 semanas de tratamento com necroscopia. 0 17a—etinil-estradiol (EE) e o veículo (1 % etanol/óleo de amendoim) neste ensaio biológico serviram de controlos. 32

As ratazanas fêmeas Sprague-Dawley com três meses foram falso operadas (Sham) ou ovaríectomizadas (OVX) um dia antes do estudo da dosagem. Os animais foram anestesiados utilizando uma mistura anestésica de quetamina/xilazina e foram submetidos a uma ovariectomia bilateral ou foram falso tratados. Uma secção de pelo na superfície dorsal foi rapada e foi realizada uma incisão ao longo da região lombar da coluna vertebral. Ά pele foi separada da fáscia subjacente para poder efectuar uma segunda incisão através da musculatura abdominal próxima do caudal dos rins. Os ovários foram seguidamente exteriorizados e extirpados e a musculatura foi fechada com uma sutura única. A incisão da pele foi fechada com a utilização de agrafes cirúrgicos.

Dez animais por cada grupo de tratamento tomaram uma dose oral uma vez ao dia durante quatro semanas consecutivas. A dosagem foi iniciada no Io. dia após terem sido extraídos cirurgicamente os ovários e foi administrada via oral por sonda utilizando uma seringa e uma agulha de aço inoxidável para sondas com doses de 0.1 mg/kg/dia de EE, ou qualquer de 2.5, 0.5 ou 0.1 mg/kg/dia de E4. 0 controlo do veículo foi administrado diariamente a um grupo de animais OVX e a ratazanas falso operadas. Depois do tratamento, as ratazanas anestesiadas foram submetidas a uma punção cardíaca e asfixiadas por inalação de C02. As tíbias e os fémures foram removidos, os seus tecidos brandos foram limpos, fixados e guardados em 70% de etanol/solução salina a 4°C (tíbias) ou solução salina a 4°C (fémures) para análises posteriores.

Uma Tomografia Computadorizada Quantitativa Periférica ex vivo (pQCT) foi realizada à tíbia esquerda por excisão utilizando um Stratec XCT-RM e um software associado (Stratec Medizintechnik GmbH, Pforzheim, Alemanha, software versão 5.40). As explorações foram realizadas em 12 % do comprimento máximo da extremidade proximal das tíbias. As posições foram comprovadas utilizando a visão de reconhecimento e foi adquirido um corte perpendicular de 0.5 mm no eixo ao longo do eixo tibíal de cada sítio. Os 33 reconhecimentos, foram analisados utilizando um limiar para o reconhecimento do limite externo. 0 conteúdo mineral ósseo total e trabecular, a área e a densidade em cada sítio foram determinados. Os valores principais são mostrados no quadro 3. Além de que, na figura 1 aparecem os dados de pQCT para indicar uma densidade mineral óssea total. A comparação dos dados da densitometria de pQCT da tibia proximal das ratazanas falso operadas e OVX demonstrou uma perda consistente óssea total e trabecular no grupo OVX, como o esperado, (quadro 3, figura 1) . Além de que, houve um aumento consistente em função da dose para cada um dos parâmetros associados com um conteúdo mineral ósseo total e trabecular e densidade mineral óssea nos animais tratados oralmente com E4

(quadro 3, figura 1). Em comparação com as ratazanas OVX hipoestrogénicas que receberam o tratamento com apenas o veículo, 0.5 e 2.5 mg/kg/dia de E4 evitaram a reabsorção óssea como o exemplificado para os níveis de densidade mineral óssea total equivalentes às ratazanas falso operadas (figura 1) . Além de que, a actividade anti-reabsortiva obtida com a dose mais alta de E4 (2.5 mg/kg/dia) foi equivalente ao efeito visto com o controlo positivo de EE.

Quadro 3: Dados da densitometria pQCT da tíbia proximal das ratazanas Sham e OVX tratadas oralmente (po) com 17a-etinilestradiol (EE), estetrol (E4) ou um veículo. Os dados são expressos como os valores principais obtidos para cada grupo (n=10). 34

Grupo de tratamento (n=10) Via de dosagem Mineral ósseo total principal Mineral ósseo trabecular principal Conteúdo (mg/mm) Área (mm2) Densidade (mg/cm3 ) Conteúdo (mg/mm) Área (mm2) Densidade (mg/cm3) SHAM + veículo po 9.36 14.10 664.07 1.49 6.34 235.48 OVX + veículo po 8.76 14.47 606.61 1.10 6.51 169.63 OVX+O.l mg/kg/dia de EE po 9.66 13.87 697.48 1.81 6,24 290.16 OVX +0.1 mg/kg/dia de E4 po 8.46 14.41 588.62 0.96 6.48 145,46 OVX +0.5 mg/kg/dia de E4 po 9.74 14.80 660.57 1.60 6.65 243.3 OVX + 2.5 mg/kg/dia de E4 po 9.61 13.59 707.11 1.89 6.12 309.58 « O 4* « 700 . tft tn if 650 V O ! 1 600 . I 550. i q 500- Falso ' OVX Veículo Veículo mg/Kg/dia mg/Kg/dia mg/Kg/dia mg/Kg/dia Dose 35

Figura 1: Densidade mineral óssea total da tibia proximal das ratazanas Sham e OVX tratadas oralmente (po) durante 4 semanas consecutivas com 17a-etinilestradiol (EE), estretol (E4) ou veículo. Os dados são expressos como os valores médios obtidos para cada grupo (n=10).

Uma interpretação ex vivo da resistência óssea biomecânica foi executada com um teste de indentação do fémur distai. Antes do teste mecânico o fémur foi enxaguado numa solução salina fria e cuidadosamente limpa para retirar qualquer resto de tecido brando ainda existente. Um segmento de 3 mm da metáfise femoral distai foi cortado directamente proximal ao côndilo femoral com uma serra de diamante de baixa velocidade com uma irrigação constante de solução salina. A carga foi aplicada com um indentador cilíndrico (com uma face de teste plana de 1.6 mm de diâmetro) no centro da cavidade medular na face distai do segmento. 0 indentador penetrou na cavidade a uma deslocação constante de 6 mm/min. até uma profundidade de 2 mm antes de inverter a carga.

Quadro 4: Prova de indentação do fémur distai das ratazanas Sham e OVX tratadas oralmente (po) com 17a-etinilestradiol (EE), estetrol (E4) ou um veículo. Os dados são expressos como os valores médios obtidos para cada grupo (n=10).

Grupo de tratamento (n=10) Via de dosagem Carga máxima (N) Rigidez (N/ma) Energia (mJ) Resistência definitiva (N/mm2) SHAM + veiculo po 8.61 131.96 0.48 4.57 OVX + veiculo po 2,77 42.08 0.21 1.47 OVX +0.1 mg/kg/dia de F.F, po 9.05 169.12 0.53 4.80 36 OVX +0.1 mg/kg/dia de E4 po 1.50 28.00 0.09 0.80 OVX + 0.5 mg/kg/dia de E4 po 7.25 132.57 0.31 3.85 OVX + 2.5 mg/kg/dia de E4 po 13.07 173.12 0.68 6.94 A carga máxima, rigidez e energia absorvida foram determinadas a partir das curvas de deslocação da carga. A resistência definitiva foi calculada dividindo a carga máxima pela área do indentador. Os valores médios de carga máxima, rigidez, energia e resistência definitiva são mostrados no quadro 4. Além de que, os valores médios de resistência definitiva são mostrados na figura 2. Em comparação com as ratazanas falso operadas, a resistência mecânica de um osso esponjoso resulta ser marcadamente reduzida nas ratazanas OVX tratadas com apenas o veículo (quadro 4, figura 2) . As reduções de carga máxima, rigidez, energia e resistência definitiva foram de -68%, -68%, -27% e -68%, respectivamente, claramente acompanhadas com perda da densidade mineral óssea nas ratazanas com deficiência estrogénica. 0 tratamento oral das ratazanas OVX hipoestrogénicas com E4 impediu a diminuição da carga máxima, rigidez, energia e resistência definitiva, numa forma dependente da dose (quadro 4, figura 2). Adicionalmente, a eficácia obtida com a dose máxima de E4 (2.5 mg/kg/dia) parece ser até superior à do controlo positivo de EE (quadro 4, figura 2). 37

Figura 2: Média da resistência definitiva do fémur distai das ratazanas Sham e OVX tratadas oralmente (po) durante 4 semanas consecutivas com 17a-etinilestradiol (EE), estretol (E4) ou veículos. Os dados são expressos como os valores médios obtidos para cada grupo (n=10)

Exemplo 3 A ratazana ovariectomizada (OVX) morfina dependente foi utilizada como modelo para os calores pós-menopáusicos. Foi testada a potência do estetrol (E4) para impedir que a temperatura cutânea da cauda aumente, habitualmente acompanhada por uma queda da temperatura interior do corpo, depois de ser testada a supressão opiácia induzida por naloxona. Neste ensaio biológico o 17a-etinil-estradiol (EE) e o veiculo (hidroxipropil-beta-ciclodextrina 20% em peso/volume) serviram de controlos. O sintoma mais característico e comum da menopausa humana são os calores, que são experimentados por mais de 70% das mulheres menopáusicas. Embora seja ainda desconhecido o exacto mecanismo subjacente a esta instabilidade vasomotora, as características 38 essenciais dos calores são um reflexo da adaptação mediada centralmente de uma descida progressiva nos níveis de estrogénios. As mulheres que sofrem de calores, os sintomas são manifestadas por: 1) subidas rápidas regionais na temperatura cutânea; 2) uma redução na temperatura interior do corpo; 3) aumento do ritmo cardíaco sem que se altere a pressão arterial; e 4) aumentos em intervalos de tempo curtos para a libertação da hormona luteinizante (lutropina) e β-endorfina. 0 modelo da ratazana ovariectomizada morfino-dependente (OVX) tem sido proposto como modelo animal para os calores por diferentes investigadores (Katovich et al, 1986, Maturitas, 67-76; Merchenthaler et al. 1998, Maturitas, 307-316). Durante a supressão opiácia com a naloxona antagonista da morfina, a temperatura cutânea da cauda (TST) aumenta e este aumento é acompanhado por uma queda da temperatura interior do corpo. Adicionalmente, as mudanças da temperatura são acompanhadas por variações na LH e uma taquicardia transitória. Estes episódios são idênticos em magnitude e natureza temporal aos que são observados durante os calores menopáusicos.

As ratazanas OVX de 8 semanas foram previamente tratadas oralmente (po) durante sete dias consecutivos com estetrol (E4), 17a-etinilestradiol (EE) ou um veículo de controlo (20% em peso/volume de hidroxi-propil-beta-ciclodextrina) e na manhã seguinte de uma supressão opiácia induzida por naloxona em animais morfinodependentes. Três dias antes do início da dosagem, os animais foram anestesiados utilizando uma mistura de quetamina/xilazina anestésica e submetidos a uma ovariectomia 39 bilateral. Foi rapada uma secção do pelo na superfície dorsal e foi realizada uma incisão ao longo da região lombar da coluna vertebral. A pele foi separada da fáscia subjacente para que pudesse ser feita uma segunda incisão através da musculatura abdominal próxima do caudal dos rins. Os ovários foram posteriormente exteriorizados e removidos e a musculatura foi fechada com uma sutura única. A incisão da pele foi fechada utilizando agrafos cirúrgicos. Seis ratazanas por grupo de tratamento tomavam uma dose diária durante oito dias consecutivos antes de e incluído o dia de supressão opiácia induzido por naloxona (a sessão de calores). A dosagem foi iniciada três dias depois de terem sido extirpados cirurgicamente os ovários e foi administrada por sonda utilizando uma seringa e uma agulha de aço inoxidável para sondas. A dependência à morfina foi induzida com uma implantação de umas pastilhas subcutâneas contendo 75 mg de morfina. A primeira pastilha foi implantada cinco dias antes dos calores com uma ligeira anestesia por inalação. Três dias antes da sessão dos calores, outras duas pastilhas de morfina foram implantadas nas mesmas condições.

Para as manipulações com calores, os animais foram colocados numa gaiola de ensaio. Depois de um período de adaptação de 5 a 10 minutos, as ratazanas foram anestesiadas com quetamina HCI aproximadamente durante 10 minutos antes do período dos calores. Um eléctrodo sensível à temperatura foi fixado na superfície ventral da cauda com adesivo e o eléctrodo foi ligado a um registador de temperatura multi-canal. A temperatura cutânea da cauda foi registada até à sua estabilização e os animais seguidamente foram injectados com naloxona HCI (1 mg/kg). Continuaram-se a registar as temperaturas durante mais um período de 60 minutos e a temperatura era registada de 5 em 5 minutos. No final da sessão dos calores, todos os animais foram mortos por asfixia com CO2 seguida de uma deslocação cervical. 40

Como o esperado, o veículo do controlo não foi efectivo para a prevenção dos aumentos de TST induzida por naloxona nas ratazanas ovx adictas à morfina (figura 34) . 0 17a- etinilestradiol (EE), na dose individual testada com 0.3 mg/kg/dia, impediu os aumentos da TST induzida por naloxona nas ratazanas GVX adictas à morfina (figura 3) . O tratamento oral com estetrol (E4) mostrou um claro efeito dose-dependente (figura 3). As três doses máximas de E4 (0.3, 1.0 e 3.0 mg/kg/dia) atenuaram todas a TST, com a dose ma is elevada (3.0 mg/kg/dia) tendo uma resposta supressora idêntica ao do estrogénio oral potente, 17a-etinilestradiol (EE).

Tempo (min) pós-naloxona

Figura 3: Os efeitos do estretol (£4) e do 17a-etinilestradiol (EE) na resposta de calor induzida por naxolona nas ratazanas fêmeas ovariectomizadas.

Exemplo 4 41 0 aumento do peso uterino na ratazana foi escolhido como outro importante critério de valorização tecidular especifico para determinar a potência hormonal do estetrol (E4), particularmente em relação à sua potência hormonal para induzir a cornificação vaginal e para corrigir a atrofia vaginal. Portanto, ο E4 administrado oralmente (po) foi testado num ensaio biológico da cornificação vaginal modificada de 7 dias (ver também exemplo 1), incluídas as medições do peso uterino húmido na necroscopia, para explicar os efeitos vaginais e uterotrófícos. Há já muitos anos que a resposta uterotrófica tem sido utilizada para avaliar a actividade estrogénica. 0 ensaio biológico habitual utiliza ratazanas fêmeas com níveis baixos de estrogénios endógenos (por exemplo ovariectomizadas ou animais imaduros). Na maioria dos ensaios projectados os animais são dosifícados, uma ou duas vezes por dia durante 3 ou 4 dias, e vinte e quatro horas depois da dose final os animais são mortos, e os úteros extirpados e pesados. No ensaio biológico actual, a cornificação do epitélio vagina, e o aumento do peso uterino foi avaliado em ratazanas adultas ovariectomizadas durante 7 dias. Desta maneira, dois parâmetros diferentes sensíveis ao estrogénio puderam ser avaliados ao mesmo tempo.

As ratazanas CD fêmeas adultas intactas foram ovariectomizadas para induzir uma deficiência estrogénica. Durante sete dias foram feitas lavagens vaginais para garantir que as ratazanas demonstravam esfregaços vaginais de animais castrados (predomínio de leucócitos no esfregaço vaginal, e com um aspecto idêntico a um esfregaço vaginal do diestro). Os esfregaços vaginais dos animais castrados são indicativos de que uma ovaríectomia completa foi obtida. 0 tratamento foi iniciado após finalizados os 7 dias de persistência (dia 0 = primeiro dia de dose). Os animais foram dosifícados oralmente uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos com um veículo de controlo (10% de etanol/óleo de sésamo) ou com qualquer de 0.1, 0.3, 1.0, ou 3.0 42 mg/kg/dia de E4. As lavagens vaginais diárias foram feitas durante 7 dias após ter sido iniciada a dosagem para detectar a cornificação vaginal, como uma indicação da resposta estrogénica. Uma gota de lavagem vaginal foi colocada numa lâmina de vidro e examinada num microscópio óptico para detectar a presença ou ausência de células epiteliais cornifiçadas. As células presentes nas lavagens vaginais foram obtidas antes de uma dosagem durante os dias de 0 a 6 e antes da necroscopia no 7o dia.

No 1° dia do estudo, depois da lavagem vaginal e 24 horas depois da dose final, todas as ratazanas foram mortas por asfixia com CO2. Foi feita uma incisão abdominal e o útero foi extirpado, manchado e pesado. A incidência da cornificação vaginal, indicativa de uma resposta estrogénica, é uma resposta "tudo ou nada". Consequentemente, os dados foram expressos como o número de ratazanas que apresentaram uma resposta vaginal estrogénica (durante um ou mais dias) em relação ao número de ratazanas tratadas (rácio). Um teste Z das proporções foi utilizado para comparar os quatro grupos do teste com o grupo do veiculo de controlo. As médias do grupo ± SEM foram também calculadas para os pesos uterinos. Estes dados não foram distribuídos normalmente e não demonstraram homogeneidade nas variações. Consequentemente, foram executados os testes paramétricos ANOVA, Wallis Kruskal e foram determinadas as diferenças significativas através dos quatro grupos de tratamento e do veículo de controlo utilizando o método de Dunn.

Nas ratazanas em que foi administrada uma gama de dose de E4 po, a aparição da cornificação vaginal foi dose dependente (ver quadro 2) . Ao 7o dia, todas as doses po de E4 testadas estavam acima do limiar para suscitar uma resposta vaginal estrogénica na ratazana ovariectomizada adulta e significativamente diferente (P<0,05) do veículo do controlo (quadro 5). Pelo contrário, no entanto, apenas E4, em doses po de 1.0 e 3.0 mg/kg/dia, aumentaram o peso uterino significativamente (P<0,05) 43 em comparação com o grupo do veículo do controlo (quadro 5). Consequentemente concluímos que o estetrol tem um perfil farmacológico favorável. Mostra actividade agonística no epitélio vaginal com doses baixas e intermédias com as quais não foi observada a actividade uterotrófica. Este resultado indica que, especialmente com dosagens mais baixas, não há nenhuma necessidade de administração do progestogénio adjunto para prevenir efeitos uterotróficos indesejados.

Quadro 5:Cornificação vaginal e respostas uterotróficas em ratazanas ovariectomizadas tratadas oralmente (po) com estetrol (E4). Os dados são expressos como ratazanas que mostraram corníficação vaginal (respondedoras) ou não (não respondedoras). Os dados do peso uterino são expressos como os valores médios e SEM obtido para cada grupo (n=8) . Para o veículo de controlo as diferenças significativas estão indicadas.

Grupo de tratamento (n=10) Via de dosagem Corníficação vaginal Peso uterino (mg) respondedoras Não respondedoras Significativamente diferentes do veículo (P<0,05) Media SEM Significativamente diferente do veículo (P<0,05) veiculo de 0VX+ po 0 8 n.a. 100.1 3.9 n.a. OVX+O.l mg/kg/dia E4 p° 8 0 sim 149.2 4,4 nâo OVX+O.3 mg/kg/dia E4 po 8 0 sim 181.2 9.6 náo OVX +1.0 mg/kg/dia E4 po 8 0 sim 253.7 24.0 sim OVX - 3.0 mg/kg/dia E4 po 8 0 sim 308.4 15.3 sim n.a.: não aplicável

J 44

Exemplo 5 A proliferação endometrial foi escolhida como outro importante critério de valorização do tecido especifico para determinar a potência hormonal do estetrol depois do tratamento oral crónico (4 semanas) em ratazanas ovariectomizadas. Foi utilizado um modelo animal estabelecido de 4 semanas, também recomendado para a avaliar os agentes para a prevenção e tratamento da osteoporose. A potência do E4 para induzir a proliferação endometrial foi analisada para doses administradas oralmente (po) 2.5 e 0.5 mg/kg/dia de E4, as quais mostraram eficácia anti-reabsortiva em análise ex vivo da densidade mineral óssea total e trabecular e na resistência óssea (ver exemplo 2). Neste ensaio biológico ol7a-etinil-estradiol (EE) e o veiculo (1 % etanol/óleo de amendoim) serviram como controlos adicionais.

As ratazanas fêmeas Sprague-Dawley com três meses foram falso operadas (Sham) ou ovariectomizadas (OVX) um dia antes do estudo da dosagem como o descrito no exemplo 2. Dez animais por cada grupo de tratamento tomaram uma dose oral uma vez ao dia durante quatro semanas consecutivas. A dosagem foi iniciada no Io dia após terem sido extraídos cirurgicamente os ovários e foi administrada via oral por sonda utilizando uma seringa e uma agulha de aço inoxidável para sondas com doses de 0.1 mg/kg/dia de EE, ou qualquer de 2.5, 0.5 ou 0.1 mg/kg/dia de E4. O veículo de controlo foi administrado diariamente a um grupo de animais OVX e a ratazanas falso operadas. Depois do tratamento, as ratazanas anestesiadas foram submetidas a uma punção cardíaca e asfixiadas por inalação de CO2. Os cornos uterinos foram isolados e pesados e fixados em 4% de formaldehído a 4°C. Passados 14 dias sobre a fixação, os úteros foram desidratados e embebidos em parafina. 45

As secções em série dos cornos uterinos foram cortadas e coradas com Hematoxilina/eosina (H/E) ou com o marcador da proliferação Ki67 de acordo com o método de von Rango et al. (1998, Hum. Reprod., 13, 3177-3189). Os índices proliferativos foram determinados marcando as células etiquetadas positivamente nas secções imunocoradas Ki67. Habitualmente, para cada critério de valorização foram avaliadas de 1000 células epiteliais luminais. A média dos dados do peso uterino é mostrada na figura 4. A ovariectomia das ratazanas resultou numa atrofia uterina, como é evidenciado pela perda de peso uterino nos animais tratados apenas com o veículo em comparação com os animais falso-tratados (figura 4). Com os níveis de doses orais, nos que EE (0.1 mg/kg/dia) e E4 (0.5 e 2.5 mg/kg/dia) estas duas doses impediram a perda óssea (ver exemplo 2), a média de peso uterino foi idêntico aos animais tratados com falso-veículo (figura 4). Surpreendentemente, a percentagem das células epiteliais luminais Ki67 positivas diminuiu como aumento das do tratamento oral com E4 (figura 5) . Depois de 4 semanas de tratamento oral com 2.5 mg/kg/dia de E4 a percentagem das células epiteliais luminais Ki67-positivas foi substancialmente inferior à dos animais tratados com 0.5 mg/kg/dia E4 ou mesmo com 0.1 mg/kg/dia de EE, sugerindo uma actividade promotora do crescimento inferior no tecido endometrial depois do tratamento crónico oral com doses relativamente altas de E4 (figura 5) . Consequentemente ο E4 parece ter menos actividade estrogénica no útero do que o EE, especialmente com doses em que os efeitos do E4 nos parâmetros ósseos (por exemplo resistência óssea) são equipotentes ou melhores do que os do EE. Consequentemente, é concluído que o estetrol tem um perfil farmacológico favorável. Estes resultados indicam que não há nenhuma necessidade de administrar o progestogénio adjunto para impedir o efeito endometrial proliferativo indesejado. 46

ϊ °-β W

Veículo Veículo mg/kg/dia mg/kg/dla mg/kg/dia DOSE

Figura 4: Pesos médios uterinos de ratazanas Sham e OVX oralmente (po) tratadas com 17a-etinil-estradiol (EE), estretol (E4) e o veiculo durante 4 semanas consecutivas. Os dados são expressos como os valores médios obtidos para cada grupo (n=10). S 35. | S 30. -_- « | 25. ^ „ 20. n iS ·· ~.....~i 1 - <0 9 -c 2 c 15 il <· ?1 s Φ 9 0 O 44 W 1 £ a. s. · -11 Sham- OVX· OVX-BEO.1 OVXSIO.5 WX-E42.5 Veículo Veículo mg/kg/dia mg/kg/dia mg/kg/dia Dose

Figura 5: Percentagem Ki67 das células epetiliais luminais positivas em secções uterinas imunocoradas de ratazanas Sham e OVX tratadas oralmente (po) com 17a-etinil-estradiol (EE), estretol (E4) e o veiculo durante 4 semanas consecutivas. Os 47 dados são expressos como os valores médios obtidos para cada grupo (n=10).

Exemplo 6

Para avaliar a biodisponibilidade oral (po) e subcutânea (sc) do estetrol (E4) e para determinar a meia-vida de eliminação, foram executados estudos de doses orais únicas em ratazanas fêmeas Sprague Dawley seguida de frequentes recolhas de amostras de sangue durante um intervalo de 24 horas.

Nas Ratazanas fêmeas Sprague Dawley foi colocado no coração um cateter permanente Silastic, como o que tinha sido descrito por Kuipers et al. (1985, Gastroenterology, 88, 403-411). Deixamos que as ratazanas durante 5 dias se recuperassem da cirurgia e foi-lhes administrado 0.05, 0.5, ou 5 mg/kg de E4 em 0.5 ml de óleo de amendoim. Para uma administração sc, ο E4 foi injectado na zona do pescoço utilizando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 20g. Para uma administração po de E4, as ratazanas foram ligeiramente anestesiadas com halotano/ N2O/O2 e ο E4 foi aplicado directamente de forma intragástrica utilizando uma sonda estomacal de plástico. As amostras de sangue foram subsequentemente colhidas através do cateter no coração em tubos heparínizados em períodos de 0.5, 1, 2, 4, 8 e 24 horas. Os eritrócitos foram eliminados por centrifugação a 5000xg durante 10 minutos a 4°C e o plasma sanguíneo foi guardado a -20°C. Depois de descongelar as amostras de plasma, foi empregue uma extracção líquido-líquido (hexano e éter dietílico) para preparar as amostras de plasma contendo E4 para a análise HPLC (Perkin Elmer 200) e uma espectroscopia de massa em série utilizando um espectrómetro de massa em série PE Sciex 3000 e uma interface APCI. Com cada lote de amostra, foi registada uma curva de calibraçâo com 6 calibradores. A curva de calibração foi calculada utilizando uma regressão linear (coeficiente de correlação > 0.98), que permitiu a quantificação das concentrações em plasma. Para cada plasma das ratazanas, os 48 dados das amostras foram colhidos em intervalos de tempo diferentes.

Os dados da concentração em plasma de E4 foram analisados com "WinNonLin, versão 3.1" e envolveram os parâmetros farmacocinéticos para Cmaxi meia-vida e AUC0-24· Especialmente, com a utilização de níveis de dose inferiores e intermédios a 0.05, 0.5 mg/kg, ο E4 demonstrou uma biodisponibilidade oral idêntica à biodisponibilidade obtida com uma administração sc ¢80-100 %) . No nível de dose máxima testada, 5.0 mg/kg de E4, as cinéticas de absorção deram origem a uma biodisponibilidade oral aproximada de 30 a 60% do E4 administrado sc. Interessantemente, nas experiências com doses sc e po, ο E4 demonstrou uma meia-vida relativamente grande de 2 a 3 horas, permitindo a detecção dos níveis bioactivos de E4 não conjugado em todos os períodos de tempo durante um intervalo de 24 horas.

Exemplo 7

Os ensaios de fixação dos esteróides competitivos estabelecidos foram utilizados para determinar a afinidade de fixação relativa do estetrol (E4), em comparação com o 17a-etinilestradiol (EE) e o 17p-estradiol (E2), para as formas α e β do receptor estrogénico (ER) humano.

O método empregue foi adaptado da bibliografia científica e descrito detalhadamente por Osbourn et al. (1993, Biochemistry, 32, 6229-6236). As proteínas humanas recombinantes Era e ER foram purificadas das células Sf9- modificadas. Os ensaios in vitro envolveram a utilização de proteínas Era ou ERP e [3H]E2, a uma concentração fixa de 0.5 nM, como o ligando marcado. As proteínas recombinantes humanas Era ou ERP foram dissolvidas num tampão de ligação (10 mM Tris-HCl, pH 7.5,10% glicerina, 1 mM DTT, 1 mg/ml BSA) e as partes alíquotas duplicadas foram seguidamente incubadas com [3H]E2 a uma concentração final de 0.5 49 nM, juntamente com um veículo de controlo (0.4% DMSO), ou a mesma quantidade do veículo que contém concentrações maiores de ligandos de esteróides não marcados como competidores. Após a incubação durante 2 h a 25C, os ligandos não unidos foram eliminados e as quantidades de [JH]E2 ligados às proteínas Era ou ERP foram medidas. As quantidades médias de [3H]E2 ligadas às proteínas Era ou Είφ em cada concentração de competidor foram utilizadas para formar as curvas de inibição. Os valores IC50 foram posteriormente determinados para uma análise de regressão não linear, de mínimos quadrados. As constantes de inibição (Ki) foram calculadas utilizando a equação de Cheng & Prusoff (Cheng et al., 1973, Biochem. Pharmacol., 22, 3099-3108), utilizando o IC50 medido dos compostos testados, a concentração do rádio-ligando empregue no ensaio, e os valores históricos para a kd do rádio-ligando, foram respectivamente estabelecidos em 0.2 nM e 0.13 nM para Era e ERp.

Quadro 6: Percentagem da inibição da ligação específica para as proteínas Era e ERP utilizando ο E4 como o ligando do esteroide não marcado e 0.5 nM [3H] como competidor marcado. Os resultados das três experiências separadas são mostrados.

Concentração final do E4 Percentagem da xmbxç9o da ligação específica no ensaio de ligação do esteroide ERa ensaio de ligação do esteroide ERp Teste 1 Teste 2 Teste 3 Teste 1 Teste 2 Teste 3 1 μΜ 98 nd nd 87 90 95 0.3 μΜ 92 94 101 74 74 77 0.1 μΜ 83 85 86 56 54 50 0.03 μΜ 64 66 63 19 25 30 10 nM 43 32 28 nd nd nd 3 nM 26 17 11 nd nd Nd nd: não determinado 50

Quadro 7: Constantes de inibição (Ki) determinadas experimentalmente para o estetrol (E4), o 17a-etinilestradiol (EE) e ol7p~estradíol (E2), para proteínas humanas Era e Είΐβ. Ά preferência relativa para a ligação à proteína Era é também mostrada.

Ligandos dos Kí ERa Ki ERP preferência relativa ERa/ΕΗβ esteróídes (DM) (nM) (%) EE 0.23 0.025 11 E2 0.21 0.015 7 E4 4.9 19 400

Os resultados do ensaio bioquímico para ο E4 são apresentados como a percentagem da inibição da ligação específica nas três experiências separadas (quadro 6) . Para a comparação das afinidades da ligação do E4, EE e E2 às proteínas humanas Era e ERP, os valores de Ki observadas experimentalmente são mostrados no quadro 7. Em comparação com EE e E2, ο E4 demonstra um único perfil de ligação com uma preferência forte (400%) para a ligação à proteína Era (quadro 7) . Pelo contrário, os valores de Ki para a proteína Εϋβ são mais pronunciados para os ligandos dos esteróídes EE e E2 (quadro 7).

Exemplo 8

Foi utilizado um ensaio de fixação de esteróídes competitivo estabelecido (Hammond e Lahteenmaki. 1983. Clín Chem Acta 132: 101-110) para determinar a afinidade da fixação relativa do estetrol (E4), 17a-etinilestradíol (EE2), Πβ-estradiol (E2), testosterona (T) e 5a-dihidrotestosterona (DHT) para a Globulina de Ligação às Hormonas sexuais humanas (SHBG). 51 A SHBG humana foi purificada a partir de soro de rato transgénico, como foi previamente descrito (Avvakumov GV et al., 2000. J Biol Chem 275: 25920-25925). A SHBG humana preparada desta maneira foi submetida a um ensaio para ser pura a >99% por electroforese em gel de poliacrilamida em condições de desnaturalização. As suas características de fixação aos esteróides não se distinguem da SHBG no soro humano (Avvakumov GV et al., 2000 J Biol Chem 275: 25920-25925). O ensaio in vitro inclui a utilização da SHBG humana purificada e [3H]DHT ou [3H]estradiol como ligandos marcados. A SHBG humana foi tratada durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma suspensão de carvão revestido com dextrano (DCC) numa solução salina com tampão de fosfato (PBS) para eliminar qualquer ligando de esteróides. Após a centrifugação (2,000 x g durante 10 min.) para sedimentar o DCC, o sobrenadante que continha a SHBG humana foi diluído em PBS numa concentração de 1 nM baseada na sua capacidade de fixação dos esteróides.

Partes alíquotas duplicadas (100 μΐ) desta solução da SHBG humana foram posteriormente incubadas com um volume igual de [3H]DHT ou de [3H]estradiol de 10 nM, juntamente com 100 μΐ de PBS sozinho ou a mesma quantidade de PBS contendo concentrações maiores de ligandos de esteróides não marcados como competidores em tubos de ensaio de poliestireno. Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, as misturas da reacção foram colocadas num banho de gelo durante mais 15 minutos. As partes alíquotas (600 μΐ) da suspensão gelada de DCC foram seguidamente adicionadas a cada tubo, e depois de uma mistura breve de 2 segundos, cada tubo foi incubado num banho com gelo durante 10 ou 5 minutos dependendo dos ligandos marcados empregues, respectivamente [3H]DHT ou [JH]estradiol. Os ligandos não fixados adsorbidos em DCC foram posteriormente eliminados por centrifugação (2,000 x g durante 15 minutos a 4°C), e as quantidades dos ligandos marcados [~H] ligados à SHBG foram calculadas numa mistura de cintilação ACS de 2 ml com a 52 utilização de um espectrofotómetro de cintilação líquida. As quantidades médias dos ligandos marcados [3H ] ligados à SHBG em cada concentração do competidor (B) foram expressas como uma percentagem das quantidades médias dos ligandos marcados [3H] ligados à SHBG na ausência do competidor (Bo) , e foram marcadas em relação à concentração de competidor em cada tubo de ensaio.

Os resultados dos ensaios de ligação competitivos são mostrados na figura 6. Como é claramente evidente com estes ensaios de ligação competitivos, o estetrol não se liga totalmente à SHBG humana quando é testado com ligandos marcados [3H]DHT ou [3H]estradiol. Estes num contraste marcado com esteróides do etinilestradiol, 17p-estradiol, testosterona e 5a-dihidrotestosterona, os quais, nesta ordem, mostram uma afinidade de ligação relativa aumentada para a SHBG humana. De maneira importante, a ligação do estetrol à SHBG foi insignificante quando comparado com os outros estrogénios testados do etinilestradiol e do 17p-estradiol. 53

Figura 6: Deslocação competitiva do [3H]DHT (painel A) e [3H]estradiol (painel B) desde o sitio de fixação dos esteróides da Globulina de Ligação às Hormonas sexuais humanas. Os ligandos dos esteróides não marcados utilizados como competidores são os seguintes: estretol (E4), 17a-etinil-estradiol (EE2), 17β- estradiol (E2), testosterona (T) e 5a-dihidrotestosterona (DHT)

Exemplo 9

Unidades de dosagem para a administração oral

Os compostos estrogénícos da presente invenção podem ser processados de forma adequada, juntamente com aditivos, 54 excipientes e/ou agentes aromatizantes habituais na farmácia galénica, de acordo com os métodos habituais nas formas usuais de administração. Para uma administração oral, adequada existem, em particular, comprimidos, pílulas, cápsulas, pílulas, suspensões, ou soluções. Comprimidos de estetrol: 1,000 comprimidos de 185 mg, compreendendo 1.5 mg de estetrol e 0.15 mg de levonorgestrel, são produzidos a partir da seguinte formulação:

Estetrol 1.500 g

Polivinilpirrolidona (Kollidon 25® ex BASF)

Lactose Celulose microcrístalina (Avicel pH 101®) Glicerilpalmitoestearato (Precirol ®) Sílica anidro coloidal (Aerosil 200 ®) Crospovidona (poliplasdona XL ®) Agente corante 13.500 g 135.645 g 26.250 g 2.775 g 1.000 g 4.000 g 0.180 g

Lisboa, 02 de Abril de 2007.

Pela Requerente O Agente Oficial

ROSÁRIO CRUZ GARCIA Agente Oficial da Propriedade Industrial lv.* Conselheiro Fernando de Sousa, 11*15.° 1070-072 LISBOA

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Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto estrogénico seleccionado do grupo composto pelas substâncias representadas pela seguinte fórmula:

   em que Ri, R2, R3, R4 independentemente são um átomo de hidrogénio, um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi com 1 a 5 átomos de carbono; até 3 de R5, Rô, R7 é um grupo hidróxilo; e no máximo de 3 de Ri, R2, R3, R4 são átomos de hidrogénio; derivados destas substâncias onde o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxilo na dita fórmula foi substituído por um radical acilo de hidrocarboneto, carboxílico, ácido sulfónico ou sulfámico de 1 a 25 átomos de carbono; tetrahidrofuranilo; tetrahidropirano; ou uma cadeia linear ou ramificada de um resíduo glicosídico contendo 1 a 20 unidades glicosídicas por resíduo; e suas misturas derivadas; para a preparação de uma composição para ser utilizada num método de terapia de hormonal de substituição, caracterizado por o método compreender a administração oral a uma pessoa necessitada deste tratamento com uma quantidade eficaz do componente estrogénico sem tratamento progestogénico ou antiprogestogénico adjunto, a dita composição não contém nenhum progestogénio ou antiprogestina. 1
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por 0 método compreender a administração do componente estrogénico numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir os sintomas do hipoestrogenismo que são seleccionados do grupo composto por: osteoporose, arterioesclerose, sintomas climatéricos, doenças cognitivas e doença de Alzheimer.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por menos 2 preferencialmente pelo menos 3 dos grupos Ri, R2, R3 e R4 representarem átomos de hidrogénio.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada por os grupos Ri, R2 e R4 representarem átomos de hidrogénio.
5. 5. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por o objectivo da terapia hormonal de substituição ser 0 de tratar alterações (peri) menopáusicas, alterações pós-menopáusicas, e/ou hipoestrogenismo resultantes do hipogonadismo, da castração, da insuficiência ovárica primária, do tratamento do análogo da hormona libertadora de gonadotropina ou o tratamento do cancro.
6. 6. Utilização de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada por o método compreender a administração oral diária de pelo menos 0.001 mg do componente estrogénico.
7. 7. Utilização de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada por a composição não conter 0 análogo da hormona libertadora de gonadotropina ou a hormona libertadora da hormona luteinizante ou um oligonucleótido antisentido que é complementar à sequência nucleótida do receptor hormonal da estimulação folicular. 2
8. 8. Utilização de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a 7, caracterizada por o componente estrogénico ser administrado numa quantidade eficaz para obter uma concentração no soro sanguíneo de pelo menos 1 nanogramo por litro, preferencialmente de pelo menos 10 nanogramos por litro.
9. 9. Utilização de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada por o componente estrogénico ser administrado numa quantidade de pelo menos 1 μ-g ao dia por kg de peso corporal, preferencialmente de pelo menos 5 μρ ao dia por kg de peso corporal.
10. 10. Utilização de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada por o método compreender a administração do componente estrogénico durante um período de pelo menos 1 mês, preferencialmente de pelo menos 3 meses.
11. 11. Utilização de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada por o método ser aplicado a indivíduos que não tinham sido ooforectomizados, ou nos que o risco de estimulação endometrial por composições estrogénicas não foi minimizado ou ausente.
12. 12. Utilização de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado por o método não empregar uma formulação de libertação lenta. Lisboa, 2 de Abril de 2007.

    1070-072 LISBOA 3