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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Tumortherapie und Tumorprävention.
Insbesondere betrifft sie Verfahren und pharmazeutische Zubereitungen
zur Inhibierung von Östrogen-abhängigen Tumoren.
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Hintergrund
der Erfindung
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Viele Brusttumore sind Östrogen-abhängig, was
bedeutet, dass sie zum Wachstum Östrogene
benötigen. Über mehrere
Jahre wurden im Rahmen einer bekannten und erfolgreichen Behandlungsstrategie
von Brusttumoren Anti-Östrogene
eingesetzt. Anti-Östrogene
sind eine Klasse von Verbindungen, die Östrogene an der Auslösung ihrer
vollen Antwort in Zielgeweben inhibieren. Eine anti-östrogene
Verbindung, die über Jahre
als prophylaktisches und therapeutisches Arzneimittel für Brustkrebs
eingesetzt worden ist, stellt Tamoxifen dar. Progesteron und verwandte
Progestine sind ebenfalls umfassend zur Behandlung von Brustkrebs
in Versuchstieren und Menschen eingesetzt worden. In den letzten
Jahren sind viele weitere anti-östrogene
Verbindungen als mögliche
Alternativen für
Tamoxifen offenbart worden, einschließlich Aromatase-Inhibitoren (Bednarski,
U.S. Patent Nr. 4,745,109), anti-östrogene Hydrazone (Morgan,
U.S. Patent Nr. 4,732,904) und anti-östrogene Benzothiophene (Jones,
U.S. Patent Nr. 4,418,068).
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Jedoch wirken viele Anti-Östrogene
nicht als strikte Antagonisten, sondern wirken eher als partielle Agonisten
auf dem Östrogen-Rezeptor
(estrogen receptor, ER). Diese partielle Agonistenaktivität erwies
sich als ein "zweischneidiges
Schwert". Während sich
herausstellte, dass die partielle Agonistenaktivität zu vorteilhaften
Wirkungen wie der Senkung des Serumcholesterins und der Prävention
von Osteoporose führt,
wurde sie vor kurzem in einer Reihe unabhängiger Studien mit der Förderung
einer verstärkten
endometrialen Tumorbildung in Zusammenhang gebracht. (Endometriose-Zellen
bestehen aus stromalen und luminalen Epithelzellen, die zusätzlich zu
glatten Muskelmyometrialzellen die Hauptzelltypen der Gebärmutter
umfassen.) Beispielsweise wurde aus Befunden des "National Surgical
Adjuvant Breast and Bowel Project" gefolgert, dass "das Risiko von endometrialem Krebs nach
einer Tamoxifenbehandlung gegen Brustkrebs ansteigt; jedoch überwiegen
die Vorteile deutlich die Risiken" (Fisher et al. (1994)). Das erhöhte Auftreten
von endometrialem Krebs nach einer adjuvanten Tamoxifen-Therapie
gegen Brustkrebs wurde vor kurzem in einer Studie mit 87323 Frauen
mit Brustkrebs wie auch in weiteren Studien bestätigt (Rutquist et al. (1995),
Fornander et al. (1989), Mouridsen et al. (1988), Ryden et al. (1986)).
Die partielle agonistische oder "östrogen-ähnliche" Aktivität von Tamoxifen
in der menschlichen Gebärmutter
und die Wirkungen von Tamoxifen auf ein erhöhtes Auftreten von endometrialem
Krebs sind mit früheren
Studien an Versuchstieren und Zellkulturmodellen konsistent. Beispielsweise
induzierte Tamoxifen eine Gebärmutter-Hyperplasie in den
meisten Tiermodellen und ein Tumorwachstum in nackten Mäusen ohne
Thymusdrüse
(athymic), die transplantierte östrogen-responsive
endometriale Tumoren aufwiesen.
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Folglich führt die Behandlungsmethode
von östrogen-abhängigen Brusttumoren
nach dem Stand der Technik zu einem signifikanten Anstieg der Häufigkeit
von endometrialen Tumoren. Diese erhöhte Häufigkeit von endometrialen
Tumoren kann auf die östrogen-ähnliche
Wirkung von Tamoxifen in der Gebärmutter
zurückzuführen sein.
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In letzter Zeit hat sich ein weiterer
Forschungsbereich auf die anti-östrogene
Wirkung von Agonisten des Atyl-Kohlenwasserstoff-Rezeptors (aryl
hydrocarbon receptor, AhR) konzentriert, wobei 2,3,7,8,-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
(TCDD) als Modelverbindung eingesetzt wurde. TCDD und verwandte
Verbindungen inhibieren das Brusttumorwachstum in Nagetiermodellen
und 17β-Östradiol-induzierte
Antworten (17β-Estradiol, E2) in
der Nagetiergebärmutter
und humanen Brustkrebszellen. Während
für TCDD
nachgewiesen werden konnte, dass es ein wirksames Anti-Östrogen
in Ratten, Mäusen
und MCF-7 humanen Brustkrebszelllinien in Kultur darstellt, zeigte
sich, dass es für
eine Anwendung als ein therapeutisches Anti-Östrogen zu stark hepatokarzinogen
wirkt. Frühere
Studien haben gezeigt, dass TCDD in der Ratte toxische und biochemische
Antworten induziert; eine dieser biochemischen Antworten, die Instruktion
von CYP1A1-abhängiger
Aryl-Kohlenwasserstoff-Hydroxylase (AHH) oder Ethoxyresorufin-O-Deethylase
(EROD) Aktivitäten
in der Leber, korreliert mit der Toxizität von TCDD.
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Ursprünglich wurden eine Reihe von
6-Alkyl-1,3,8-trichlordibenzofurane (triCDFs) hergestellt, um deren
Aktivitäten
als partielle AhR-Antagonisten zu untersuchen. Die 6-Alkyl-1,3,8-triCDFs
weisen die folgende Formel auf:
worin R
1,
R
3 und R
8 Chlor
sind, R
6 eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe
mit 1–4
Kohlenstoffatomen ist und R
2, R
4,
R
7 und R
9 Wasserstoffe
sind. Als Prototyp für
diese Serie von Verbindungen wurde 6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran
(6-MCDF) verwendet.
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Anfängliche Untersuchungen zeigten,
dass 6-MCDF an den Ah-Rezeptor bindet, jedoch ein schwacher Induzierer
von CYP1A1 war und minimale Toxizität aufwies. Ferner inhibierte
6-MCDF TCDD-induzierte toxische Antworten und wurde als ein Ah-Rezeptorantagonist
charakterisiert (B. Astroff et al. (1988); M. Harris et al. (1989);
R. Bannister et al. (1989); C. Yao et al. (1989)). Jedoch inhibierte
6-MCDF nicht die TCDD-induzierte anti-östrogene Aktivität; 6-MCDF
war ebenfalls ein Anti-Östrogen
in der Rattengebärmutter.
(B. Astroff und Safe (1991)). Astroff und Safe berichteten 1988,
dass sowohl TCDD als auch 6-MCDF eine Dosis-abhängige Abnahme der nukleären und
cytosolen ER- und Progesteronrezeptor-(PR)-Bindung in 21–25 Tage
alten weiblichen Sprague-Dawley-Rattengebärmuttern verursachten. Ferner
war 6-MCDF nur etwa 300 bis 570 mal weniger aktiv als Anti-Östrogen
im Vergleich mit TCDD, während
es 157000 mal weniger stark als ein Induzierer von hepatischer CYP1A1
im Vergleich zu TCDD in den gleichen Tieren wirkte (CYP1A1 ist ein
Surrogat für toxische
Potenz). In folgenden Studien konnte gezeigt werden, dass 6-MCDF
und verwandte Verbindungen die E2-induzierte Hypertrophie, die Peroxidaseaktivität, die cytosolische
ER- und PR-Bindung und die Spiegel von EGF-Rezeptor und c-fos mRNA
in der Rattengebärmutter
inhibierten. Es war folglich ersichtlich, dass 6-MCDF die Fähigkeit
der günstigen
anti-östrogenen
Wirkung ohne die toxischen Nebenwirkungen von TCDD aufwies.
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Die in vivo anti-östrogene Aktivität einer
Reihe von Alkyl-substituierten polychlorierten Dibenzofuranen (PCDFs)
wurde an der Gebärmutter
von unreifen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten untersucht (B. Astroff
et al. (1991); R. Dickerson et al. (1995)). Die in dieser Studie
verwendeten Verbindungen enthalten zwei, drei oder vier laterale
Substituenten und umfassen: 6-MCDF, 6-Ethyl-1,3,8-triCDF, 6-n-Propyl-1,3,8-triCDF, 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF,
6-t-Butyl-1,3,8-triCDF, 8-MCDF (zwei laterale Substituenten); 6-Methyl-2,3,8-triCDF,
6-Methyl-2,3,4,8-tetraCDF, 8-Methyl-1,3,7-triCDF und 8-Methyl-1,2,4,7-tetraCDF
(drei laterale Substituenten); 8-Methyl-2,3,7-triCDF, 8-Methyl-2,3,4,7-tetraCDF (vier
laterale Substituenten). Ferner wurden zwei weitere Verbindungen,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzo-p-dioxin und 8-Methyl-2,3,7-tribromdibenzo-p-dioxin
(vier laterale Substituenten) untersucht. Alle Alkylsubstituierten
Verbindungen inhibierten den Östrogen-induzierten
Anstieg der Gebärmutterfeuchtmasse
und cytosolische und nukleäre
PR- und ER-Bindung. Es wurden quantitative Struktur-Anti-Östrogenität-Beziehungen
untersucht, indem 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF,
6-Methyl-2,3,4,8-tetraCDF und 8-Methyl-2,3,4,7-tetraCDF als verwandte
Repräsentanten
verwendet wurden, die jeweils zwei, drei oder vier laterale Substituenten
enthielten. Die ED50-Werte (ED50 wird
als jene Dosis definiert, die 50 % der Maximalantwort erzeugt) für Anti-Östrogenität waren
für die
drei Verbindungen ähnlich;
jedoch lagen die ED50-Werte für die Induktion
von hepatischer CYP1A1-abhängiger Aktivität bei 73600
(geschätzt),
8,52 bzw. 5,31 mMol/kg für
6-i-Propyl-1,3,8-triCDF,
6-Methyl-2,3,4,8-tetraCDF bzw. 8-Methyl-2,3,4,7-tetraCDF. Auf der Grundlage
von Ergebnissen aus früheren
Untersuchungen kann CYP1A1 als ein Surrogat für die toxische Potenz in der
Ratte verwendet werden; folglich sind hohe ED50 (CYP1A1-Induktion)/ED50 (Anti-Östrogenität)-Verhältnisse
ein Anzeichen für
eine geringe Toxizität
und eine hohe anti-östrogene
Potenz. Das Verhältnis
war für 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF
von 13990 bis 17100, während
die entsprechenden Verhältnisse
für die
Verbindungen mit drei oder vier lateralen Substituenten zwischen
0,64 bis 3,34 variierten. Diese Daten deuten darauf hin, dass alternierte
1,3,6,8-substituerte Alkyl-PCDFs geeignete Strukturmodelle zur Entwicklung
neuer AhR-vermittelter Anti-Östrogene
zur Behandlung von Brustkrebs darstellen. Im U.S. Patent Nr. 5,516,790
sind Daten im Hinblick auf die anti-östrogenen Wirkungen von 1,3,6,8-
oder 2,4,6,8-alterniertsubstituierten
Alkyldibenzofuranen dargestellt.
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Die in vivo Antitumoraktivität von 6-MCDF,
8-MCDF (8-Methyl-1,3,6-triCDF) und 6-Cyclohexyl-1,3,8-triCDF (6-CHDF) wurden
in dem DMBA-Rattenbrusttumormodell untersucht (McDougal et al.,
Inhibition of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced rat mammary
tumor growth by aryl hydrocarbon receptor agonists. Cancer Letters
120: 53–63,
1997). Bei Dosierungen von 5, 10 oder 25 mg/kg/Woche inhibierten
6- und 8-MCDF das
Wachstum von Brusttumoren signifikant, und bei der 5 mg/kg/Woche-Dosis
wurde für
beide Isomere > 50%
Wachstumsinhibierung beobachtet. Das 6-CHDF hingegen war bei der
5 mg/kg/Woche-Dosis inaktiv, und die Struktur-Antitumorigenität-Beziehungen
(6-/8-MCDF >> 6-CHDF) korrelierten
mit Stu dien über die
Struktur-Anti-Östrogenität (bei Rattengebärmutter)
und den relativen Bindungsaffinitäten dieser Verbindungen für den AhR.
Die antitumorigene Aktivität
von 6- oder 8-MCDF in der Brust wurde nicht von signifikanten Veränderungen
der Leber/Körpergewichtverhältnisse,
der Lebermorphologie oder einer Induktion von hepatischer CYP1A1-abhängiger Aktivität, die eine
der empfindlichsten Indikatoren für die Aussetzung gegenüber AhR-Agonisten
darstellt, begleitet. Eine RT-PCR- und Western-blot-Analyse von
Brusttumor-mRNS beziehungsweise von Proteinextrakten bestätigten das
Vorliegen des AhR, was darauf hindeutet, dass die AhR-vermittelten
Signalwege in Rattenbrusttumoren funktionell sind, jedoch durch
6- oder 8-MCDF schlicht nicht aktiviert werden.
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Ohne dass der Anmelder an eine bestimmte
Theorie gebunden werden will, wird davon ausgegangen, dass die meisten
Anti-Östrogene
(d. h. Tamoxifen) und Alkyl-PCDFs
nach zwei unterschiedlichen Mechanismen funktionieren. Es wird angenommen,
dass AhR den ER nach einem unbekannten Mechanismus verringert (wahrscheinlich
posttransskriptionell). Man nimmt an, dass Alkyl-PCDFs durch den
AhR arbeiten, der mit dem ER einen "cross-talk" eingeht. Es wird angenommen, dass Tamoxifen
an den ER bindet und die ER-Wirkung in der Brust blockiert. Man
geht davon aus, dass 6-MCDF über
den AhR agiert und folglich an den Rezeptor bindet. Es wird angenommen,
dass 6-MCDF ein AhR-Antagonist für
die toxischen Reaktionen darstellt (d. h. es inhibiert die TCDD-Toxizität in Co-Behandlungsstudien),
jedoch wird davon ausgegangen, dass es als Ah-Rezeptoragonist für die Anti-Östrogenität wirkt
(d. h. es wirkt wie TCDD).
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Das Behandlungsverfahren von Östrogen-abhängigen Brusttumoren
nach dem Stand der Technik umfasst häufig die Verabreichung von
Tamoxifen. Wie vorstehend ausgeführt
hat sich in mehreren unabhängigen Versuchen
herausgestellt, dass die Tamoxifenbehandlung mit einer signifikant
erhöhten
Häufigkeit
der Bildung von endometrialen Tumoren verbunden ist (Fornander et
al. (1989), Rutqvist et al. (1995), Mouridsen et al. (1988), Ryden
et al. (1986) Fisher et al. (1994)). Einige Studien wiesen darauf
hin, dass die Häufigkeit
der Bildung von endometrialen Tumoren mit niedrigeren Tamoxifendosierungen
reduziert werden kann. Der Stockholm-Versuch zeigte ein ungefähr 6mal
höheres
Risiko für
endometriale Tumore mit einem Behandlungsprotokoll von 40 mg/Tag
für 2 Jahre
(Fornander et al. (1989), Rutqvist et al. (1995)), während die
dänischen
und südschwedischen
Versuche nur jeweils 3,3mal und 2mal höhere Risiken zeigten. In den
letzten zwei Versuchen wurde Tamoxifen in einer Dosis von 30 mg/Tag
für 1 Jahr
verabreicht. In schottischen und Manchester-England-Versuchen, bei denen Tamoxifen
in einer Dosis von 20 mg/Tag verabreicht wurde, schien kein erhöhtes Risiko
für endometriale
Tumore aufzutreten (Stewart et al. (1989), Stewart (1992), Ribeiro
et al. (1992)). Jedoch zeigte eine dritte Studie, an der 2843 Patienten
teilnahmen, ein 7,5-fach erhöhtes
Risiko für endometriale
Tumorbildung mit der gleichen Dosis (20 mg/Tag) Tamoxifen (Fisher
et al. (1994)). Im Hinblick auf die geringere Populationsgröße der vorhergehenden
Studien sollten die Ergebnisse der schottischen und der Manchester-England-Versuche
vorsichtig interpretiert werden. Folglich geht aus der überwiegenden
Zahl der Studien eindeutig hervor, dass eine Tamoxifenbehandlung
zu signifikant erhöhten
Risiken für
eine Bildung von endometrialen Tumoren führt. Jedoch geht aus den vorliegenden
Versuchen zur Zeit nicht eindeutig hervor, ob eine Verringerung
der Tamoxifendosis zu einem verminderten Risiko der Bildung von
endometrialen Tumoren führt.
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Auch wenn es keinen klaren Hinweis
darauf gibt, dass die Verminderung der Tamoxifendosis das Risiko
für die
Bildung von endometrialen Tumoren entsprechend verringert, sollte
beachtet werden, dass keine Versuche auf der Grundlage einer großen Population
mit Tamoxifendosierungen von weniger als 20 mg/Tag durchgeführt worden
sind. Jedoch weisen die Ergebnisse aus Tier- und Zellkulturmodellen
auf einen Dosis-abhängigen
uterotropen Effekt für
Tamoxifen hin und dies stimmt mit den pharmakologischen Prinzipien überein. Beispielsweise
erzeugt Tamoxifen signifikante Dosis-abhängige Erhöhungen der Rattengebärmutter-Feuchtmasse,
die mit einer erhöhten
Arzneimittelkonzentration korreliert waren. Daraus folgt, dass ähnliche
Erniedrigungen der Tamoxifendosis auch zu einer verminderten Bildung
von endometrialen Tumoren führen
kann.
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Die vorliegende Erfindung verwendet
die Kombination einer traditionellen anti-östrogenen
Verbindung und einem Alkyl-PCDF (einer neuen Klasse von halogenierten,
aromatischen Anti-Östrogenen),
um die Konzentration der anti-östrogenen
Verbindungen zu reduzieren, ohne die Effizienz bei der Prävention
oder der Behandlung von Brustkrebs zu vermindern. Es ist bemerkenswert,
dass, obwohl der Stand der Technik lehrt, dass anti-östrogene
Arzneimittel seit mindestens einem Jahrzehnt zur Behandlung von
Brustkrebs eingesetzt worden sind, die Kombination von anti-östrogenen Verbindungen und
Alkyl-PCDFs nicht vorgenommen worden ist, was darauf hindeutet,
dass die Erfindung in der Tat nicht naheliegend ist.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
Erzeugnisse bereit, enthaltend eine erste Verbindung der Formel
worin
R
1, R
3, R
6 und R
8 oder R
2, R
4, R
6 und
R
8 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff
oder einen Substituenten, der aus Chlor, Fluor, Brom und einer linearen
oder verzweigten Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist,
darstellen, wobei diese erste Verbindung wenigstens einen Alkylsubstituenten
und wenigstens zwei Halogensubstituenten aufweist, und
eine
zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen,
Aromatase-Inhibitoren,
anti-östrogenen Hydrazonen,
anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalinen ausgewählt
ist,
als Kombinationspräparat
zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung zur Inhibierung
des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
folglich die Verabreichung und Verwendung von PCDFs in Kombination
mit steroidalen oder nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga und -Derivaten.
Die nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga
können
entweder Triphenylethylen-Verbindungen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogene
Hydrazone, anit-östrogene
Benzothiophene und Dihydronaphthalene sein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Insbesondere kann die zweite Verbindung aus Tamoxifen, Toremifen,
Clomiphen, Nafoxidin und Hydroxytamoxifen ausgewählt werden.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
weist der Ausdruck Inhibierung entweder auf eine Reduktion der Geschwindigkeit
des Tumorwachstums, der Tumorgröße, des
Tumorvolumens oder sogar auf eine vollständige Beseitigung eines Tumors
hin. Ferner deutet sie auf einen verzögerten Ausbruch eines Tumors
oder eine vollständige
Prävention
des Auftretens von Tumoren (zur prophylaktischen Behandlung von
Pati enten mit hohem Risiko) oder des Wiederauftretens von Tumoren
(nachfolgend zu einer vorhergehenden Östrogen-abhängigen Tumorbehandlung) hin.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner bereit:
- – Erzeugnisse, die eine erste
Verbindung enthalten, die aus
6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran
und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran
ausgewählt ist,
und eine zweite Verbindung enthalten, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren,
anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalinen ausgewählt
ist;
als Kombinationspräparat
zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung zur Inhibierung
des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor;
- – eine
pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung des Wachstums von Östrogen-abhängigen Tumoren,
umfassend eine erste Verbindung der Formel: worin
R1 bis R4, R6 und R8 wie vorstehend
definiert sind und eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen,
Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalenen ausgewählt
ist;
- – eine
pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung des Wachstums von
einem Östrogen-abhängigen Tumor,
umfassend eine erste Verbindung, die aus
6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran
und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran
ausgewählt ist,
und
eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen,
Aromatase-Inhibitoren,
anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalinen ausgewählt
ist;
- – Verwendung
einer ersten Verbindung der Formel: worin
R1 bis R4, R6 und R8 wie vorstehend
definiert sind, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung
in Kombination mit einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen,
Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalenen ausgewählt
ist, zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors;
- – Verwendung
einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren,
anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalenen ausgewählt
ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in Kombination
mit einer ersten Verbindung der Formel:
worin
R1 bis R4, R6 und R8 wie vorstehend
definiert sind, zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors;
- – Verwendung
einer ersten Verbindung, die aus
6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran
und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran
ausgewählt ist,
zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Inhibierung
des Wachstums eines Östrogen-abhängigen Tumors
in Kombination mit einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen,
Aromatase-Inhibitoren,
anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalenen ausgewählt
ist, und
- – Verwendung
einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren,
anti-östrogenen
Hydrazonen, anti-östrogenen
Benzothiophenen und anti-östrogenen
Dihydronaphthalenen ausgewählt
ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung zur Inhibierung
des Wachstums eines Östrogen-abhängigen Tumors
in Kombination mit einer ersten Verbindung, die aus
6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran
und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran
ausgewählt ist.
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Die vorliegende Erfindung sorgt für wichtige
Verbesserungen des Standes der Technik, indem sie eine Kombinationsformulierung
eines Triphenylethylen-Derivats und eines 1,3,6,8-substituierten
oder 2,4,6,8-substituierten Alkyl-PCDFs bereitstellt, die zusammen,
synergistisch oder additiv, wirken, um das Wachstum von Östrogenabhängigen Tumoren
zu inhibieren. Das Ergebnis dieser kombinierten Wirkung liegt darin,
dass die Konzentration, bei der die Triphenylethylen-Derivate wirksam
sind, reduziert werden kann, wodurch die Gefahr einer Induktion
von endometrialen Tumoren verringert wird. Zusätzlich zu der Reduktion der
endokrinen Tumorigenität
aufgrund der verminderten erforderlichen Konzentration von Triphenylethylen
wirken die 1,3,6,8-substituierten Alkyl-PCDF-Verbindungen ferner
als direkte Inhibitoren der anti-östrogen-induzierten Bildung
von endometrialen Tumoren.
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Andere und weitere Aufgaben, Merkmale
und Vorteile werden offensichtlich und möglicherweise besser verständlich beim
Lesen der nachfolgenden Beschreibung und durch den Bezug auf die
beiliegenden Zeichnungen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung mit Tamoxifen, mit
MDCF oder der Co-Behandlung.
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2 zeigt
das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung mit Tamoxifen.
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3 zeigt
das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung mit MCDF.
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4 zeigt
das Tumorvolumen und die Wirkung der Co-Behandlung mit Tamoxifen
und MCDF.
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Die 5a, 5b und 5c zeigen die Gebärmutterperoxidaseaktivität bei Behandlung
mit Tamoxifen, MCDF und Co-Behandlung.
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Die 6a und 6b zeigen das Gewicht von
Gebärmuttern
bei Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und der Co-Behandlung.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
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Es ist für den Fachmann offensichtlich,
dass verschiedene Ausführungsformen
und Modifikationen an der in der vorliegenden Anmeldung offenbarten
Erfindung vorgenommen werden können,
ohne dass vom Schutzbereich und dem Sinn der Erfindung abgewichen
wird.
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Eine besondere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Formulierung zur
Inhibierung von Östrogen-abhängigen Tumoren
umfassend ein 1,3,6,8-substituiertes oder 2,4,6,8-substituiertes
Alkyl-PCDF, das in Kombination mit einer zweiten Verbindung, die
ein Anti-Östrogen
darstellt, verwendet wird.
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Es ist für den Fachmann verständlich,
dass die vorliegende Erfindung die Verabreichung und die Verwendung
von PCDFs in Kombination mit steroidalen oder nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga und
-Derivaten umfasst. Die nicht-steroidalen
Anti-Östrogensubstrat-Analoga
können
entweder Triphenylethylen-Verbindungen,
Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogene
Hydrazone, anti-östrogene
Benzothiophene und Dihydronaphthalene sein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die Gruppe von anti-östrogenen
Triphenylethylen-Verbindungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Tamoxifen, Tamoxifen-Analoga und -Derivate und Toremifen, Toremifen-Analoga
und -Derivate. Dieses umfasst, ist aber nicht beschränkt auf,
alle Verbindungen und Äquivalente
davon, die z. B. in den folgenden U.S. Patenten offenbart sind,
von denen jedes in der Gesamtheit durch in Bezugnahme in die vorliegende
Beschreibung aufgenommen wird: U.S. Patent Nr. 5,807,899, erteilt
für Bohlmann
et al., 15. September 1998; U.S. Patent Nr. 5,750,576, erteilt für DeGregorio am
12. Mai 1998; U.S. Patent Nr. 4,656,187, erteilt für Black
et al. am 7. April 1987; U.S. Patent Nr. 5,554,628, erteilt für Bryant
et al. am 10. September 1996; U.S. Patent Nr. 5,604,248, erteilt
für Bryant
et al. am 18. Februar 1997; und U.S. Patent Nr. 5,691,355, erteilt
für Bryant
et al. am 25. November 1997. Die Gruppe von anti-östrogenen
Hydrazonverbindungen umfasst, ist aber nicht beschränkt auf,
Azido-, 4-Nitro-,
2,4-Dinitrophenylhydrazon und alle Verbindungen und Äquivalente
davon, die beispielsweise in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,732,904,
erteilt für
Morgan am 22. März
1988, beschrieben sind. Die Gruppe von anti-östrogenen Benzothiophenen umfasst,
ist aber nicht beschränkt
auf, Raloxifen, Raloxifen-Analoga und -Derivate und alle Verbindungen
und Äquivalente
davon, die beispielsweise in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,418,068,
erteilt für Jones
am 29. November 1983, beschrieben sind. Die Gruppe von Aromatase-Inhibitoren
umfasst, ist aber nicht beschränkt
auf, 4-Hydroxyandrostendion
(4-OHA), Letrozol, Anastrazol und alle Verbindungen oder Äquivalente
davon, die z. B. in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,745,109, erteilt
für Bednarski
et al., 17. Mai 1988, offenbart worden sind. Die Gruppe von Dihydronaphthalen-Verbindungen
umfasst, ist aber nicht beschränkt auf,
Trioxifenmesylat und alle Verbindungen und Äquivalente davon, die z. B.
in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,230,862, erteilt für Suarez
und Jones am 28. Oktober 1980, offenbart sind.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung eines 1,3,6,8-substituierten oder 2,4,6,8-substituierten
Alkyl-PCDFs. Die möglichen
Substituenten umfassen Halogene wie Brom, Chlor, Fluor und/oder
lineare oder verzweigte Substituenten wie Alkylgruppen mit etwa
ein bis fünf
Kohlenstoffatomen. Die 2,4,6 oder 8 und die 1,3,6 oder 8-Positionen
können
einzeln und unabhängig
voneinander mit einem Wasserstoff statt eines Substituenten besetzt
sein. Geeignete Alkylsubstituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl (i-Propyl), n-Butyl, sec-Butyl
oder tert-Butyl-Gruppen.
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Die PCDFs, die in der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden, sind z. B. in dem U.S. Patent Nr. 5,516,790,
erteilt für
Stephen Safe, am 14. Mai 1996, beschrieben. Die PCDFs können jene
der folgenden Formel umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt:
worin
R
1, R
3, R
6 und R
8 oder R
2, R
4, R
6 und
R
8 einzeln und unabhängig voneinander Wasserstoff
oder einen Substituenten darstellen, der aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Chlor, Fluor, Brom und einer linearen oder verzweigen Alkylgruppe
mit ein bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und worin die Verbindung
wenigstens einen Alkylsubstituenten und wenigstens zwei Halogensubstituenten
aufweist; ferner kann das Halogen Chlor sein, der Alkylsubstituent
kann aus der Gruppe ausgewählt
werden, bestehend aus Methyl, Ethyl und Propyl; R
6 kann
ein Alkylsubstituent sein und R
1, R
3 und R
8 können aus
der Gruppe ausgewählt
werden, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom; ferner kann R
8 ein Alkylsubstituent sein und R
1, R
3 und R
6 können
aus der Gruppe ausgewählt
werden, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom, der Alkylsubstituent
kann Methyl sein; des Weiteren kann R
6 ein
Alkyl sein und R
2, R
4 und
R
8 können
aus der Gruppe ausgewählt
werden, die aus Chlor, Fluor und Brom besteht; und z. B. kann R
8 ein Alkylsubstituent sein und R
2, R
4 und R
6 können
aus der Gruppe ausgewählt
werden, die aus Chlor, Fluor und Brom besteht. Beispiele für die PCDFs
können
die folgenden umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt,
6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran,
6-i-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran,
und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran.
-
Gemäß einer Ausführungsform
wird ein PCDF, das zwei laterale Substituenten aufweist ("laterale"-Substituenten können an
der Position 2,3,7 oder 8 von Dibenzofuran liegen) in Kombination
mit einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung
eingesetzt. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird 6-MCDF als Repräsentant
von PCDF in Kombination mit Tamoxifen eingesetzt. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird 6-tPropyl-1,3,8-triCDF in Kombination mit Tamoxifen verwendet.
Gemäß noch einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird 8-MCDF als Repräsentant
für PCDF
in Kombination mit Tamoxifen eingesetzt. Das PCDF und die zweiten
Anti-Östrogen-Verbindungen
werden in einem Gewichtsverhältnis
von im Wesentlichen 50 : 1 bis 1 : 50, bevorzugt 25 : 1 bis 1 :
25 und noch bevorzugter 10 : 1 bis 1 : 10 kombiniert. Die am meisten
bevorzugten Verhältnisse
von Alkyl-PCDF : Anti-Östrogen
sind 1 : 1 bis 1 : 4 bis 4 : 1 (PCDF : Anti-Östrogen).
-
Die vorliegende Erfindung eröffnet folglich
die Möglichkeit,
einen Patienten mit einem Östrogen-abhängigen Tumor
zu behandeln, indem dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge
an PCDF in Kombination mit einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung verabreicht wird (siehe vorstehend).
PCDF und die Anti-Östrogen-Verbindungen werden
simultan oder sequenziell verabreicht. Die simultane Verabreichung
der Verbindungen ist die bevorzugte Verabreichungsmethode. Im Fall
einer sequenziellen Verabreichung ist es jedoch bevorzugt, dass
die zuerst verabreichte Verbindung zu dem Zeitpunkt, zu dem die
zweite Verbindung verabreicht wird, noch biologisch wirksam ist.
Gemäß einer
Ausführungsform
wird sowohl PCDF als auch die Anti-Östrogen-Verbindungen oral verabreicht.
Sie können
ferner beispielsweise auch intraperitoneal verabreicht werden.
-
Die in der vorliegenden Anmeldung
und den Ansprüchen
beschriebenen Methoden sind keinesfalls abschließend und weitere Methoden,
die für
eine spezifische Applikation geeignet sind, sind für den Fachmann offensichtlich.
Ferner kann die wirksame Menge der Zusammensetzungen noch weiter
in Analogie zu Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie die
gewünschte
Wirkung aufweisen, abgeschätzt
werden.
-
Die folgenden Beispiele werden beispielhaft
angeboten, und sollen nicht den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung
in irgendeiner Weise beschränken.
-
Beispiel 1:
-
Weibliche jungfräuliche Sprague-Dawley-Ratten
wurden von Harlan (Houston) erhalten und man ließ sie für 10 Tage akklimatisieren,
ermöglichte
den Zugang zu Futter und Wasser ad libitum und hielt sie in einem 12
Stunden hell/dunkel-Rhythmus. Brusttumore wurden in 50 ± 3-Tage
alten Ratten induziert, indem durch künstliche Sondenernährung eine
Einzeldosis von 20 mg DMBA in 0,5 ml Maisöl verabreicht wurde. Nach 30 bis
75 Tagen konnten die Tumore durch Abtasten in den Ausführungsgängen der
Brustdrüsen
entdeckt werden. An einer einzigen Ratte entwickelten sich oft mehrere
Tumore. Wenn der Tumor oder der größte der Tumoren eine kleine
Größe (50–100 mm3) erreicht hatte, wurden die Ratten täglich mittels
künstlicher
Sondenernährung
mit Maisöl
allein (Vehikelkontrolle), einem PCDF, einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung
oder einer Co-Behandlung von PCDF und einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung für 20 Tage
behandelt, und anschließend
am 21 Tag euthanisiert. Die Tumorgrößen wurden mit Messschiebern
(Calipers) gemessen und die Volumen wurden nach der Formel (Länge × Breite × Tiefe)/6π berechnet
und als Prozentkontrolle ausgedrückt.
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Die Dosierungen des PCDFs und der
zweiten anti-östrogenen
Verbindung waren hoch genug, um in Kombination die gewünschte Inhibierung
des Krebswachstums zu erzielen. Im Allgemeinen wird jede der Verbindung
in einer Dosis von etwa 0,01 bis etwa 20 mg/kg/Tag verabreicht.
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Die PCDF-Verbindungen, die verabreicht
werden, sind, ohne darauf beschränkt
zu sein,
6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran,
6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran,
und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran.
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Die zweiten anti-östrogenen Verbindungen, die
verabreicht werden, sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Triphenylethylen-Verbindungen
(d. h. Tamoxifen, Toremifen, Clomiphen, Nafoxidin), Hydrazon-Verbindungen
(d. h. Azido-, 4-Nitro- und 2,4-Dinitrophenylhydrazone),
Benzothiophene (d. h. Raloxifen), Aromataseinhibitoren (d. h. 4-Hydroxyandrostenedion,
Letrozol und Anastrozol) und Dihydronaphthalene (d. h. Trioxifenmesylat).
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Beispiel 2:
-
Weibliche jungfräuliche Sprague-Dawley-Ratten
wurden von Harlan (Houston) erhalten und man ließ sie für 10 Tage akklimatisieren,
ermöglichte
den Zugang zu Futter und Wasser ad libitum und hielt sie in einem 12
Stunden hell/dunkel-Rhythmus. Brusttumore wurden in 50 ± 3-Tage
alten Ratten induziert, indem durch künstliche Sondenernährung eine
Einzeldosis von 20 mg DMBA in 0,5 ml Maisöl verabreicht wurde. Nach 30 bis
75 Tagen konnten die Tumore durch Abtasten in den Ausführungsgängen der
Brustdrüsen
entdeckt werden. An einer einzigen Ratte entwickelten sich oft mehrere
Tumore. Wenn der Tumor oder der größte der Tumoren eine kleine
Größe (50–100 mm3) erreicht hatte, wurden die Ratten täglich mittels
künstlicher
Sondenernährung
mit Maisöl
allein (Vehikelkontrolle), 0,4 mg/kg 6-MCDF, 0,4 mg/kg Tamoxifen
oder einer Co-Behandlung von 0,4 mg/kg 6-MCDF plus 0,4 mg/kg Tamoxifen
für 20
Tage behandelt, und anschließend
am 21 Tag euthanisiert. Die Tumorgrößen wurden mit Messschiebern
gemessen und die Volumen wurden nach der Fomel (Länge × Breite × Tiefe)/6π berechnet
und als Prozentkontrolle ausgedrückt.
Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Ratten durch Ersticken
euthanisiert. Alle Tumoren wurden entfernt, gewogen und geschnitten.
Ein Teil wurde in flüssigem
Stickstoff für
eine PCR-Analyse gefroren; ein Teil wurde in 10% Formalin für eine histopathologische
Analyse aufbewahrt; und der Großteil
wurde für
die Herstellung von mikrosomalen und cytosolischen Fraktionen unmittelbar
homogenisiert. Die Lebern wurden durchgeschwemmt (perfused) und gewogen
und Cytosol und Mikrosome wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt.
-
Die Ergebnisse dieser Studie sind
in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Bei Dosierungen von 0,4 mg/kg/Tag inhibierten sowohl Tamoxifen als
auch 6-MCDF allein das Tumorvolumen signifikant (jeweils 58,5 und
66,4% Inhibierung).
-
-
Tabelle 1. Prozentsatz-Inhibierung
des Tumorvolumens oder des Tumorgewichts mit Tamoxifen allein (0,4
mg/kg/Tag). 6-MCDF allein (0,4 mg/kg/Tag), und Tamoxifen plus 6-MCDF
(jeweils 0,4 mg/kg/Tag). * P < 0,05
im Vergleich mit unbehandelter Kontrolle unter Verwendung von ANOVA
und Duncan's statistischen
Tests für
die Signifikanz.
-
Auch die beiden Arzneimittel einzeln
verminderten das Tumorgewicht, jedoch war die diese Inhibitorantwort
nicht signifikant. Im Gegensatz dazu trat eine signifikante Inhibierung
von 86,2 und 78% von sowohl dem Brusttumorvolumen als auch dem Brusttumorgewicht
bei Tieren auf, bei denen eine Co-Behandlung mit Tamoxifen plus
6-MCDF durchgeführt
worden war. Die in der Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen
deutlich, dass das Tumorwachstum in Tieren, die eine Co-Behandlung
mit beiden Arzneimitteln erhielten, im Wesentlichen blockiert ist.
Ferner beeinflusste die Behandlung mit den Verbindungen allein oder
in Kombination nicht das Körpergewicht
oder das Gewicht von Organen und verursachte keine sichtbaren histopathologischen Veränderungen
in diesen Geweben. Die Induktion von CYP1A1-abhängiger EROD-Aktivität durch toxische halogenierte
Aromaten wie z. B. TCDD ist eine der empfindlichsten Indikatoren
für eine
Aussetzung gegenüber diesen
Verbindungen und es liegt eine hervorragende Korrelation zwischen
toxisch versus EROD-Induktionsfähigkeiten
vor. Alternierend substituierte PCDFs sind durch eine niedrige Toxizität und niedrige
Potenz als Induktoren von hepatischer EROD-Aktivität gekennzeichnet.
Die in Tabelle 1 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass Tamoxifen,
6-MCDF und Tamoxifen
plus 6-MCDF keine hepatische EROD-Aktivität induziert hat und dies ist
mit der niedrigen Toxizität
von 6-MCDF konsistent. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 6-MCDF
die antitumorigene Aktivität
von Tamoxifen in dem DMBA-induzierten
Rattenbrusttumormodell steigert, was darauf hinweist, dass die kombinierte
Behandlung mit Tamoxifen plus Alkyl-PCDFs eine neue und effizientere
Endokrintherapie zur Behandlung von Brustkrebs darstellt.
-
Beispiel 3:
-
Beispiel 3, das in der Tabelle 2
und der 1 zusammengefasst
ist, zeigt die Wirkungen von 6-MCDF und Tamoxifen, allein oder in
Kombination, in dem DMBA-induziertem
Rattenbrusttumormodell.
-
Methoden: Jungfräuliche weibliches Sprague-Dawleys-Ratten
mit einem genau bestimmten Alter wurden am Tag 55 am Nachmittag
mit 20 mg/Ratte 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen
in einem Volumen von 0,5 ml/Ratte Maisöl dosiert (Die Ratten wogen
ungefähr
165 g, was zu 120 mg/kg DMBA und 3 ml/kg Maisöl führt). Die Ratten wurden mittels
einer künstlichen
Sondenernährung
mit Maisöl
(Vehikel), 0,4 mg/kg 6-MCDF, 0,4 mg/kg Tamoxifen oder einer Co-Behandlung
von 0,4 mg/kg 6-MCDF plus 0,4 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am
Tag 21 euthanasiert.
-
TABELLE
2
WIRKUNGEN VON 6-MCDF UND TAMOXIFEN, ALLEIN ODER IN KOMBINATION,
IN DEM DMBA-INDUZIERTEM RATTENBRUSTTUMORMODELL
-
Die statistische Analyse wurde unter
Verwendung von ANOVA durchgeführt
und die Signifikanz wurde bestimmt, indem der „Duncan New Multiple Range
test" angewendet
wurde.
-
1 zeigt
das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung auf Brusttumore
von 0,4 mg/kg/Tag Tamoxifen, MCDF oder der Co-Behandlung.
-
Beispiel 4:
-
Das Beispiel 4, das in den Tabellen
3, 4 und den 2, 3 und 4 zusammengefasst ist, zeigt die Wirkungen
von geringen Dosierungen von 6-MCDF und Tamoxifen, allein oder in
Kombination, in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodell.
-
Methoden: Jungfräuliche weibliche Sprague-Dawley-Ratten
mit einem genau bestimmten Alter wurden am Tag 55 am Nachmittag
mit 20 mg/Ratte 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen
in einem Volumen von 0,5 ml/Ratte Maisöl dosiert (Die Ratten wogen
ungefähr
165 g, was zu 125 mg/kg DMBA und 3 ml/kg Maisöl führt). Die Ratten wurden mittels
einer künstlichen
Sondenernährung
mit Maisöl
(Vehikel), 0,1, 0,05 und 0,025 mg/kg 6-MCDF, 0,1, 0,05, 0,025 mg/kg
Tamoxifen oder einer Co-Behandlung von 0,1, 0,05, 0,025 mg/kg 6-MCDF plus
0,1, 0,05 und 0,025 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am
Tag 21 euthanasiert.
-
TABELLE
3
WIRKUNGEN VON 6-MCDF UND TAMOXIFEN, ALLEIN ODER IN KOMBINATION,
IN DEM DMBA-INDUZIERTEM RATTENBRUSTTUMORMODELL
-
Die 2, 3 und 4 zeigen das Tumorvolumen und die Wirkung
der Behandlung auf Brusttumoren von 0,1, 0,05 und 0,025 mg/kg/Tag
Tamoxifen, MCDF oder der Co-Behandlung.
-
TABELLE
4
WIRKUNGEN VON NIEDRIGEN DOSIERUNGEN VON 6-MCDF UND TAMOXIFEN,
ALLEIN ODER IN KOMBINATION, IN DEM DMBA-INDUZIERTEM RATTENBRUSTTUMORMODEL
KÖRPER UND
ORGANGEWICHTE
-
Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung
angegeben.
-
Die Organgewichte sind als Prozent-Körpergewicht
ausgedrückt.
-
Es wurden keine signifikanten Unterschiede
festgestellt.
-
Das Tamoxifen allein erniedrigte
bei einer Dosis von 0,1 mg/kg/Tag das Tumorwachstum signifikant (Gewicht
und Volumen), während
niedrigere Dosierungen (0,05 und 0,025 mg/kg/Tag) inaktiv waren.
Im Gegensatz dazu war 6-MCDF antitumorigen bei Dosierungen von 0,1
und 0,05 mg/kg/Tag, jedoch inaktiv bei der niedrigsten getesteten
Dosierung (0,025 mg/kg/Tag). In Kombinationsstudien wurden Dosierungen
von Tamoxifen plus 6-MCDF mit gleichem Gewicht untersucht, um die
interaktiven Effekte als antitumorigene Mittel zu bestimmen. Die
Ergebnisse, die in der Tabelle 3 und der 4 dargestellt sind, zeigen, dass alle
Kombinationen das Brusttumorwachstum signifikant inhibierten. Von
besonderer Bedeutung ist, dass die antitumorigene niedrige Dosierungskombination
(Tamoxifen plus 6-MCDF bei 0,025 mg/kg/Tag pro Verbindung) Dosierungen der
Verbindungen verwendete, die einzeln inaktiv waren. Eine statistische
Analyse dieser Daten zeigte, dass diese Interaktion von Tamoxifen
(0,025 mg/kg) plus 6-MCDF (0,025 mg/kg) synergistisch das Brusttumorwachstum
in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodel inhibierte. Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass 6-MCDF die antitumorigene Wirkung
von Tamoxifen in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodel verstärkt, was
darauf hinweist, dass die kombinierte Behandlung mit niedrigen Dosierungen
von Tamoxifen plus niedrigen Dosierungen von 6-MCDF eine neue und
effizientere Endokrintherapie zur Behandlung von Brustkrebs darstellt.
Ferner zeigen diese Daten, dass die beiden Verbindungen synergistisch
das Tumorwachstum in dem Nagetiermodel bei extrem niedrigen Dosierungen
blockieren. Mit der Verringerung von Tamoxifen auf diese niedrigen
Spiegel ohne eine Verringerung der Wirksamkeit behält die vorliegende
Erfindung die vorteilhaften Wirkungen von Tamoxifen bei und minimiert
die tumorigenen Wirkungen von Tamoxifen in der Gebärmutter.
-
Beispiel 5:
-
Beispiel 5 zeigt die Wirkungen von
täglichen
Dosierungen von Tamoxifen und 6-MCDF
auf die Knochen bei ovariektomierten Ratten. Die ovariektomierte
Ratte wird als ein Model für
Osteoporose verwendet. Gegenwärtige
Studien messen die Knochenhistomorphometrie (Evans et al. (1996))
oder die Knochenmineraldichte mittels der Röntgen-Absorptiometrie (Ezawa
(1995)) wie auch die Knochenlänge,
das Feuchtgewicht und das Trockengewicht (Takahasi et al. (1996)).
Im Jahr 1987 wurde berichtet, dass Tamoxifen als ein Östrogenagonist
in Knochengewebe von ovariektomierten Ratten wirkt (Turner et al
(1987)), obwohl eine Studie zeigte, dass Tamoxifen keine Wirkung
in Zyklus-Ratten (cycling rats) aufwies (Takahashi et al. (1996)).
Die Oberschenkelknochen von Ratten, die mit Tamoxifen, MCDF, oder
Tamoxifen plus MCDF behandelt worden waren, wurden untersucht, um
die Gewebe-spezifische Anti-Östrogenität von MCDF
zu untersuchen.
-
Methoden: Die Ratten wurden am Tag
97 ovariektomiert. Nach ungefähr
3 Wochen wurden die Ratten oral für 20 Tage mit Maisöl (Vehikel),
0,4 mg/kg Tamoxifen, 0,8 mg/kg/Tag 6-MCDF oder einer Behandlung
von 0,4 mg/kg Tamoxifen plus 0,8 mg/kg 6-MCDF pro Tag behandelt.
Die Ratten wurden am Tag 21 euthanasiert. Nachdem die Gebärmutter
entfernt und verarbeitet worden war, wurden sowohl der rechte als auch
der linke Oberschenkelknochen entnommen und die Länge wurde
mit einem Messschieber gemessen. Da aus der Literatur kein kostengünstiges
Protokoll zur Ablösung
des gesamten Muskels vom Knochen bekannt ist, wurde eine vierstündige Waschbehandlung
mit PBS, pH 2,0 durchgeführt,
die das Bindegewebe erweichte, ohne den Knochen sichtbar in Mitleidenschaft
zu ziehen. Die Feuchtgewichte wurden gemessen, nachdem das restliche Bindegewebe
entfernt worden war. Das Trockengewicht wurde gemessen, nachdem
die Knochen für
12 Stunden bei 130°C
getrocknet worden waren.
-
TABELLE
5
WIRKUNGEN AUF DIE KNOCHEN VON TÄGLICHEN DOSIERUNGEN VON TAMOXIFEN
(0,4 mg/kg) UND 6-MCDF (0,8 mg/kg) IN DER OVARIEKTONIERTEN SPRAGUE-DAWLEY
RATTE
-
Beispiel 6:
-
Beispiel 6 zeigt die Effekte auf
die Gebärmutter
von täglichen
Dosierungen von Tamoxifen und 6-MCDF in ovariektomierten Ratten.
-
Methoden: Die Ratten wurde am Tag
97 ovariektomiert. Nach ungefähr
3 Wochen wurden die Ratten oral für 20 Tage mit Maisöl (Vehikel),
0,4 mg/kg Tamoxifen, 0,4 mg/kg/Tag 6-MCDF oder einer Behandlung
von 0,4 mg/kg Tamoxifen plus 0,4 mg/kg 6-MCDF pro Tag behandelt,
wobei jede Behandlungsgruppe aus 5 Ratten bestand. Die Ratten wurden
am Tag 21 euthanasiert. 6-MCDF verursachte einen leichten, aber
signifikanten Anstieg des Milz-Feuchtgewichts.
-
TABELLE
6
WIRKUNGEN AUF DIE GEBÄRMUTTER
VON TÄGLICHEN
DOSIERUNGEN VON TAMOXIFEN (0,4 mg/kg) UND 6-MCDF (0,4 mg/kg) IN
DER OVARIEKTOMIERTEN SPRAGUE-DAWLEY RATTE
-
Beispiel 7:
-
Beispiel 7 zeigt die Wirkungen auf
das Körpergewicht
und Organgewicht der Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und der Co-Behandlung.
-
Methoden: Das Verfahren zur Herstellung
der Dosierungslösungen
ist wie folgt: Bei MCDF ist ein leichtes Erwärmen erforderlich, um es zu
lösen,
und Tamoxifen muss in Ethanol (5% des Endvolumens) gelöst werden,
das dann zu dem Maisöl
gegeben wird. Das Ethanol wird mit einem leichten Luftstrom verdampft.
Zuerst wurde das Maisöl
für die
Tamoxifendosis in einem kochenden Wasserbad erhitzt, und man ließ es abkühlen. Anschließend wurde
MCDF für
sowohl MCDF allein als auch TAM ± MCDF abgewogen und in einer
geeigneten Menge von Maisöl
unter Erhitzen gelöst.
Für das
Kontrollvehikel und das MCDF-Vehikel wurde Ethanol dazugegeben (5%
v/v) und anschließend
verdampft. Tamoxifen wurde sowohl für die Tamoxifenbehandlung als auch
die TAM ± MCDF
Behandlung in Ethanol gelöst.
Jeweils ein Aliquot wurde anschließend zu dem geeigneten Maisölvehikel
gegeben (das vorgewärmte
Maisöl
für Tamoxifen
und das Maisöl,
das MCDF enthielt, für TAM
+ MCDF), und das Ethanol wurde verdampft.
-
TABELLE
7
WIRKUNGEN DER BEHANDLUNG AUF DAS KÖRPERGEWICHT UND ORGANGEWICHTE
-
Beispiel 8:
-
Das Beispiel 8 (Tabellen 8 und 9
und 5 und 6) zeigt die Wirkungen auf
die Gebärmutter
von täglichen
Dosierungen von Tamoxifen und 6-MCDF in ovariektomierten Ratten.
-
Für
die Tabelle 8 und die 5 wurden
die Ratten am Tag 97 ovariektomiert. Nach ungefähr 3 Wochen wurden die Ratten
oral für
20 Tage mit Maisöl
(Vehikel), 0,4 mg/kg Tamoxifen, 0,8 mg/kg/Tag 6-MCDF oder einer
Co-Behandlung von 0,4 mg/kg Tamoxifen plus 0,8 mg/kg 6-MCDF pro
Tag behandelt. Die Ratten wurden am Tag 21 euthanasiert.
-
TABELLE
8
WIRKUNGEN AUF DIE GEBÄRMUTTER
VON TÄGLICHEN
DOSIERUNGEN VON TAMOXIFEN (0,4 mg/kg) UND 6-MCDF (0,8 mg/kg) IN
OVARIEKTOMIERTEN SPRAGUE-DAWLEY RATTEN
WIRKUNGEN DER BEHANDLUNG
AUF GEBÄRMUTTERASSAYS
-
Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen
angegeben.
- +
- Signifikant verschieden
(p < 0,05) von
der Kontrollbehandlung.
- ✝
- Signifikant verschieden
(p < 0,05) von
der Tamoxifenbehandlung.
-
Die 5a, 5b und 5c zeigen die Gebärmutterperoxidaseaktivität (nukleäre Extrakte)
bei Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und der Co-Behandlung.
-
Für
die Tabelle 9 und die 6a und 6b wurden jungfräuliche weibliches
Sprague-Dawley-Ratten mit einem genau bestimmten Alter am Tag 55
am Nachmittag mit 20 mg/Ratte 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen in einem
Volumen von 0,5 ml/Ratte Maisöl
dosiert (die Ratten wogen ungefähr
165 g, was zu 120 mg/kg DMBA und 3 ml/kg Maisöl führt). Die Ratten wurden mittels
einer künstlichen
Sondenernährung
mit Maisöl
(Vehikel), 0,4 mg/kg 6-MCDF, 0,4 mg/kg Tamoxifen oder einer Co-Behandlung von 0,4
mg/kg 6-MCDF plus 0,4 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am
Tag 21 euthanasiert.
-
TABELLE
9
WIRKUNGEN DER BEHANDLUNG AUF DAS KÖRPERGEWICHT UND DIE ORGANGEWICHTE
-
Die 6a und 6b zeigen die Gebärmuttergewichte
bei Behandlung mit Tamoxifen, 6-MCDF und einer Co-Behandlung.
-
LITERATURSTELLEN
-
- 1. B. Astroff et al., 6-Methyl-1,3,8-trichlorodibenzofuran
as a 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
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and related monoxygenase activites, Mol. Pharmacol. 33 (1988) 231–236;
- 2. B. Astroff et al., Comparative antiestrongenic activities
of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
and 6-methyl-1,3,8-trichlorodibenozofuran in the female rat, Itoxicol.
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- 3. B. Astroff et al., 6-Substituted-1,3,8-trichlorodibenzofurans
as 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
antagonists in the rat: structure-activity relationships, Toxicology,
59 (1989) 285–296;
- 4. B. Astroff et al., 6-Alkyl-1,3,8-trichlorodibenzofurans as
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- 5. R. Bannister et al., 6-Methyl-1,3,8-trichlorodibenzofuran
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and related compounds as antiestrogens in the female rat uterus;
structure-activity studies, Toxicol. Appl. Pharmacol. 135 (1995)
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with established osteropenia, Endo. (1996) 137: 4139–4144;
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