DE69912477T2

DE69912477T2 - Endokrintherapie für brustkrebs: kombinierte behandlung mit tamoxifen und alkyl-pcdfs

Info

Publication number: DE69912477T2
Application number: DE69912477T
Authority: DE
Inventors: H. Stephen SAFE
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: US6136845A; DE69912477D1; AU2376600A; WO2000037065A3; WO2000037065A2; EP1140047A2; CA2356624A1; JP2002532546A; ES2207981T3; AU772920B2; ATE252896T1; EP1140047B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Tumortherapie und Tumorprävention. Insbesondere betrifft sie Verfahren und pharmazeutische Zubereitungen zur Inhibierung von Östrogen-abhängigen Tumoren.
Hintergrund der Erfindung
Viele Brusttumore sind Östrogen-abhängig, was bedeutet, dass sie zum Wachstum Östrogene benötigen. Über mehrere Jahre wurden im Rahmen einer bekannten und erfolgreichen Behandlungsstrategie von Brusttumoren Anti-Östrogene eingesetzt. Anti-Östrogene sind eine Klasse von Verbindungen, die Östrogene an der Auslösung ihrer vollen Antwort in Zielgeweben inhibieren. Eine anti-östrogene Verbindung, die über Jahre als prophylaktisches und therapeutisches Arzneimittel für Brustkrebs eingesetzt worden ist, stellt Tamoxifen dar. Progesteron und verwandte Progestine sind ebenfalls umfassend zur Behandlung von Brustkrebs in Versuchstieren und Menschen eingesetzt worden. In den letzten Jahren sind viele weitere anti-östrogene Verbindungen als mögliche Alternativen für Tamoxifen offenbart worden, einschließlich Aromatase-Inhibitoren (Bednarski, U.S. Patent Nr. 4,745,109), anti-östrogene Hydrazone (Morgan, U.S. Patent Nr. 4,732,904) und anti-östrogene Benzothiophene (Jones, U.S. Patent Nr. 4,418,068).
Jedoch wirken viele Anti-Östrogene nicht als strikte Antagonisten, sondern wirken eher als partielle Agonisten auf dem Östrogen-Rezeptor (estrogen receptor, ER). Diese partielle Agonistenaktivität erwies sich als ein "zweischneidiges Schwert". Während sich herausstellte, dass die partielle Agonistenaktivität zu vorteilhaften Wirkungen wie der Senkung des Serumcholesterins und der Prävention von Osteoporose führt, wurde sie vor kurzem in einer Reihe unabhängiger Studien mit der Förderung einer verstärkten endometrialen Tumorbildung in Zusammenhang gebracht. (Endometriose-Zellen bestehen aus stromalen und luminalen Epithelzellen, die zusätzlich zu glatten Muskelmyometrialzellen die Hauptzelltypen der Gebärmutter umfassen.) Beispielsweise wurde aus Befunden des "National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project" gefolgert, dass "das Risiko von endometrialem Krebs nach einer Tamoxifenbehandlung gegen Brustkrebs ansteigt; jedoch überwiegen die Vorteile deutlich die Risiken" (Fisher et al. (1994)). Das erhöhte Auftreten von endometrialem Krebs nach einer adjuvanten Tamoxifen-Therapie gegen Brustkrebs wurde vor kurzem in einer Studie mit 87323 Frauen mit Brustkrebs wie auch in weiteren Studien bestätigt (Rutquist et al. (1995), Fornander et al. (1989), Mouridsen et al. (1988), Ryden et al. (1986)). Die partielle agonistische oder "östrogen-ähnliche" Aktivität von Tamoxifen in der menschlichen Gebärmutter und die Wirkungen von Tamoxifen auf ein erhöhtes Auftreten von endometrialem Krebs sind mit früheren Studien an Versuchstieren und Zellkulturmodellen konsistent. Beispielsweise induzierte Tamoxifen eine Gebärmutter-Hyperplasie in den meisten Tiermodellen und ein Tumorwachstum in nackten Mäusen ohne Thymusdrüse (athymic), die transplantierte östrogen-responsive endometriale Tumoren aufwiesen.
Folglich führt die Behandlungsmethode von östrogen-abhängigen Brusttumoren nach dem Stand der Technik zu einem signifikanten Anstieg der Häufigkeit von endometrialen Tumoren. Diese erhöhte Häufigkeit von endometrialen Tumoren kann auf die östrogen-ähnliche Wirkung von Tamoxifen in der Gebärmutter zurückzuführen sein.
In letzter Zeit hat sich ein weiterer Forschungsbereich auf die anti-östrogene Wirkung von Agonisten des Atyl-Kohlenwasserstoff-Rezeptors (aryl hydrocarbon receptor, AhR) konzentriert, wobei 2,3,7,8,-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) als Modelverbindung eingesetzt wurde. TCDD und verwandte Verbindungen inhibieren das Brusttumorwachstum in Nagetiermodellen und 17β-Östradiol-induzierte Antworten (17β-Estradiol, E2) in der Nagetiergebärmutter und humanen Brustkrebszellen. Während für TCDD nachgewiesen werden konnte, dass es ein wirksames Anti-Östrogen in Ratten, Mäusen und MCF-7 humanen Brustkrebszelllinien in Kultur darstellt, zeigte sich, dass es für eine Anwendung als ein therapeutisches Anti-Östrogen zu stark hepatokarzinogen wirkt. Frühere Studien haben gezeigt, dass TCDD in der Ratte toxische und biochemische Antworten induziert; eine dieser biochemischen Antworten, die Instruktion von CYP1A1-abhängiger Aryl-Kohlenwasserstoff-Hydroxylase (AHH) oder Ethoxyresorufin-O-Deethylase (EROD) Aktivitäten in der Leber, korreliert mit der Toxizität von TCDD.
Ursprünglich wurden eine Reihe von 6-Alkyl-1,3,8-trichlordibenzofurane (triCDFs) hergestellt, um deren Aktivitäten als partielle AhR-Antagonisten zu untersuchen. Die 6-Alkyl-1,3,8-triCDFs weisen die folgende Formel auf:
worin R₁, R₃ und R₈ Chlor sind, R₆ eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen ist und R₂, R₄, R₇ und R₉ Wasserstoffe sind. Als Prototyp für diese Serie von Verbindungen wurde 6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran (6-MCDF) verwendet.
Anfängliche Untersuchungen zeigten, dass 6-MCDF an den Ah-Rezeptor bindet, jedoch ein schwacher Induzierer von CYP1A1 war und minimale Toxizität aufwies. Ferner inhibierte 6-MCDF TCDD-induzierte toxische Antworten und wurde als ein Ah-Rezeptorantagonist charakterisiert (B. Astroff et al. (1988); M. Harris et al. (1989); R. Bannister et al. (1989); C. Yao et al. (1989)). Jedoch inhibierte 6-MCDF nicht die TCDD-induzierte anti-östrogene Aktivität; 6-MCDF war ebenfalls ein Anti-Östrogen in der Rattengebärmutter. (B. Astroff und Safe (1991)). Astroff und Safe berichteten 1988, dass sowohl TCDD als auch 6-MCDF eine Dosis-abhängige Abnahme der nukleären und cytosolen ER- und Progesteronrezeptor-(PR)-Bindung in 21–25 Tage alten weiblichen Sprague-Dawley-Rattengebärmuttern verursachten. Ferner war 6-MCDF nur etwa 300 bis 570 mal weniger aktiv als Anti-Östrogen im Vergleich mit TCDD, während es 157000 mal weniger stark als ein Induzierer von hepatischer CYP1A1 im Vergleich zu TCDD in den gleichen Tieren wirkte (CYP1A1 ist ein Surrogat für toxische Potenz). In folgenden Studien konnte gezeigt werden, dass 6-MCDF und verwandte Verbindungen die E2-induzierte Hypertrophie, die Peroxidaseaktivität, die cytosolische ER- und PR-Bindung und die Spiegel von EGF-Rezeptor und c-fos mRNA in der Rattengebärmutter inhibierten. Es war folglich ersichtlich, dass 6-MCDF die Fähigkeit der günstigen anti-östrogenen Wirkung ohne die toxischen Nebenwirkungen von TCDD aufwies.
Die in vivo anti-östrogene Aktivität einer Reihe von Alkyl-substituierten polychlorierten Dibenzofuranen (PCDFs) wurde an der Gebärmutter von unreifen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten untersucht (B. Astroff et al. (1991); R. Dickerson et al. (1995)). Die in dieser Studie verwendeten Verbindungen enthalten zwei, drei oder vier laterale Substituenten und umfassen: 6-MCDF, 6-Ethyl-1,3,8-triCDF, 6-n-Propyl-1,3,8-triCDF, 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF, 6-t-Butyl-1,3,8-triCDF, 8-MCDF (zwei laterale Substituenten); 6-Methyl-2,3,8-triCDF, 6-Methyl-2,3,4,8-tetraCDF, 8-Methyl-1,3,7-triCDF und 8-Methyl-1,2,4,7-tetraCDF (drei laterale Substituenten); 8-Methyl-2,3,7-triCDF, 8-Methyl-2,3,4,7-tetraCDF (vier laterale Substituenten). Ferner wurden zwei weitere Verbindungen, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzo-p-dioxin und 8-Methyl-2,3,7-tribromdibenzo-p-dioxin (vier laterale Substituenten) untersucht. Alle Alkylsubstituierten Verbindungen inhibierten den Östrogen-induzierten Anstieg der Gebärmutterfeuchtmasse und cytosolische und nukleäre PR- und ER-Bindung. Es wurden quantitative Struktur-Anti-Östrogenität-Beziehungen untersucht, indem 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF, 6-Methyl-2,3,4,8-tetraCDF und 8-Methyl-2,3,4,7-tetraCDF als verwandte Repräsentanten verwendet wurden, die jeweils zwei, drei oder vier laterale Substituenten enthielten. Die ED₅₀-Werte (ED₅₀ wird als jene Dosis definiert, die 50 % der Maximalantwort erzeugt) für Anti-Östrogenität waren für die drei Verbindungen ähnlich; jedoch lagen die ED₅₀-Werte für die Induktion von hepatischer CYP1A1-abhängiger Aktivität bei 73600 (geschätzt), 8,52 bzw. 5,31 mMol/kg für 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF, 6-Methyl-2,3,4,8-tetraCDF bzw. 8-Methyl-2,3,4,7-tetraCDF. Auf der Grundlage von Ergebnissen aus früheren Untersuchungen kann CYP1A1 als ein Surrogat für die toxische Potenz in der Ratte verwendet werden; folglich sind hohe ED₅₀ (CYP1A1-Induktion)/ED₅₀ (Anti-Östrogenität)-Verhältnisse ein Anzeichen für eine geringe Toxizität und eine hohe anti-östrogene Potenz. Das Verhältnis war für 6-i-Propyl-1,3,8-triCDF von 13990 bis 17100, während die entsprechenden Verhältnisse für die Verbindungen mit drei oder vier lateralen Substituenten zwischen 0,64 bis 3,34 variierten. Diese Daten deuten darauf hin, dass alternierte 1,3,6,8-substituerte Alkyl-PCDFs geeignete Strukturmodelle zur Entwicklung neuer AhR-vermittelter Anti-Östrogene zur Behandlung von Brustkrebs darstellen. Im U.S. Patent Nr. 5,516,790 sind Daten im Hinblick auf die anti-östrogenen Wirkungen von 1,3,6,8- oder 2,4,6,8-alterniertsubstituierten Alkyldibenzofuranen dargestellt.
Die in vivo Antitumoraktivität von 6-MCDF, 8-MCDF (8-Methyl-1,3,6-triCDF) und 6-Cyclohexyl-1,3,8-triCDF (6-CHDF) wurden in dem DMBA-Rattenbrusttumormodell untersucht (McDougal et al., Inhibition of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced rat mammary tumor growth by aryl hydrocarbon receptor agonists. Cancer Letters 120: 53–63, 1997). Bei Dosierungen von 5, 10 oder 25 mg/kg/Woche inhibierten 6- und 8-MCDF das Wachstum von Brusttumoren signifikant, und bei der 5 mg/kg/Woche-Dosis wurde für beide Isomere > 50% Wachstumsinhibierung beobachtet. Das 6-CHDF hingegen war bei der 5 mg/kg/Woche-Dosis inaktiv, und die Struktur-Antitumorigenität-Beziehungen (6-/8-MCDF >> 6-CHDF) korrelierten mit Stu dien über die Struktur-Anti-Östrogenität (bei Rattengebärmutter) und den relativen Bindungsaffinitäten dieser Verbindungen für den AhR. Die antitumorigene Aktivität von 6- oder 8-MCDF in der Brust wurde nicht von signifikanten Veränderungen der Leber/Körpergewichtverhältnisse, der Lebermorphologie oder einer Induktion von hepatischer CYP1A1-abhängiger Aktivität, die eine der empfindlichsten Indikatoren für die Aussetzung gegenüber AhR-Agonisten darstellt, begleitet. Eine RT-PCR- und Western-blot-Analyse von Brusttumor-mRNS beziehungsweise von Proteinextrakten bestätigten das Vorliegen des AhR, was darauf hindeutet, dass die AhR-vermittelten Signalwege in Rattenbrusttumoren funktionell sind, jedoch durch 6- oder 8-MCDF schlicht nicht aktiviert werden.
Ohne dass der Anmelder an eine bestimmte Theorie gebunden werden will, wird davon ausgegangen, dass die meisten Anti-Östrogene (d. h. Tamoxifen) und Alkyl-PCDFs nach zwei unterschiedlichen Mechanismen funktionieren. Es wird angenommen, dass AhR den ER nach einem unbekannten Mechanismus verringert (wahrscheinlich posttransskriptionell). Man nimmt an, dass Alkyl-PCDFs durch den AhR arbeiten, der mit dem ER einen "cross-talk" eingeht. Es wird angenommen, dass Tamoxifen an den ER bindet und die ER-Wirkung in der Brust blockiert. Man geht davon aus, dass 6-MCDF über den AhR agiert und folglich an den Rezeptor bindet. Es wird angenommen, dass 6-MCDF ein AhR-Antagonist für die toxischen Reaktionen darstellt (d. h. es inhibiert die TCDD-Toxizität in Co-Behandlungsstudien), jedoch wird davon ausgegangen, dass es als Ah-Rezeptoragonist für die Anti-Östrogenität wirkt (d. h. es wirkt wie TCDD).
Das Behandlungsverfahren von Östrogen-abhängigen Brusttumoren nach dem Stand der Technik umfasst häufig die Verabreichung von Tamoxifen. Wie vorstehend ausgeführt hat sich in mehreren unabhängigen Versuchen herausgestellt, dass die Tamoxifenbehandlung mit einer signifikant erhöhten Häufigkeit der Bildung von endometrialen Tumoren verbunden ist (Fornander et al. (1989), Rutqvist et al. (1995), Mouridsen et al. (1988), Ryden et al. (1986) Fisher et al. (1994)). Einige Studien wiesen darauf hin, dass die Häufigkeit der Bildung von endometrialen Tumoren mit niedrigeren Tamoxifendosierungen reduziert werden kann. Der Stockholm-Versuch zeigte ein ungefähr 6mal höheres Risiko für endometriale Tumore mit einem Behandlungsprotokoll von 40 mg/Tag für 2 Jahre (Fornander et al. (1989), Rutqvist et al. (1995)), während die dänischen und südschwedischen Versuche nur jeweils 3,3mal und 2mal höhere Risiken zeigten. In den letzten zwei Versuchen wurde Tamoxifen in einer Dosis von 30 mg/Tag für 1 Jahr verabreicht. In schottischen und Manchester-England-Versuchen, bei denen Tamoxifen in einer Dosis von 20 mg/Tag verabreicht wurde, schien kein erhöhtes Risiko für endometriale Tumore aufzutreten (Stewart et al. (1989), Stewart (1992), Ribeiro et al. (1992)). Jedoch zeigte eine dritte Studie, an der 2843 Patienten teilnahmen, ein 7,5-fach erhöhtes Risiko für endometriale Tumorbildung mit der gleichen Dosis (20 mg/Tag) Tamoxifen (Fisher et al. (1994)). Im Hinblick auf die geringere Populationsgröße der vorhergehenden Studien sollten die Ergebnisse der schottischen und der Manchester-England-Versuche vorsichtig interpretiert werden. Folglich geht aus der überwiegenden Zahl der Studien eindeutig hervor, dass eine Tamoxifenbehandlung zu signifikant erhöhten Risiken für eine Bildung von endometrialen Tumoren führt. Jedoch geht aus den vorliegenden Versuchen zur Zeit nicht eindeutig hervor, ob eine Verringerung der Tamoxifendosis zu einem verminderten Risiko der Bildung von endometrialen Tumoren führt.
Auch wenn es keinen klaren Hinweis darauf gibt, dass die Verminderung der Tamoxifendosis das Risiko für die Bildung von endometrialen Tumoren entsprechend verringert, sollte beachtet werden, dass keine Versuche auf der Grundlage einer großen Population mit Tamoxifendosierungen von weniger als 20 mg/Tag durchgeführt worden sind. Jedoch weisen die Ergebnisse aus Tier- und Zellkulturmodellen auf einen Dosis-abhängigen uterotropen Effekt für Tamoxifen hin und dies stimmt mit den pharmakologischen Prinzipien überein. Beispielsweise erzeugt Tamoxifen signifikante Dosis-abhängige Erhöhungen der Rattengebärmutter-Feuchtmasse, die mit einer erhöhten Arzneimittelkonzentration korreliert waren. Daraus folgt, dass ähnliche Erniedrigungen der Tamoxifendosis auch zu einer verminderten Bildung von endometrialen Tumoren führen kann.
Die vorliegende Erfindung verwendet die Kombination einer traditionellen anti-östrogenen Verbindung und einem Alkyl-PCDF (einer neuen Klasse von halogenierten, aromatischen Anti-Östrogenen), um die Konzentration der anti-östrogenen Verbindungen zu reduzieren, ohne die Effizienz bei der Prävention oder der Behandlung von Brustkrebs zu vermindern. Es ist bemerkenswert, dass, obwohl der Stand der Technik lehrt, dass anti-östrogene Arzneimittel seit mindestens einem Jahrzehnt zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt worden sind, die Kombination von anti-östrogenen Verbindungen und Alkyl-PCDFs nicht vorgenommen worden ist, was darauf hindeutet, dass die Erfindung in der Tat nicht naheliegend ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Erzeugnisse bereit, enthaltend eine erste Verbindung der Formel
worin R₁, R₃, R₆ und R₈ oder R₂, R₄, R₆ und R₈ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Substituenten, der aus Chlor, Fluor, Brom und einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, darstellen, wobei diese erste Verbindung wenigstens einen Alkylsubstituenten und wenigstens zwei Halogensubstituenten aufweist, und
eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist,
als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung zur Inhibierung des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor.
Die vorliegende Erfindung umfasst folglich die Verabreichung und Verwendung von PCDFs in Kombination mit steroidalen oder nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga und -Derivaten. Die nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga können entweder Triphenylethylen-Verbindungen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogene Hydrazone, anit-östrogene Benzothiophene und Dihydronaphthalene sein, ohne darauf beschränkt zu sein. Insbesondere kann die zweite Verbindung aus Tamoxifen, Toremifen, Clomiphen, Nafoxidin und Hydroxytamoxifen ausgewählt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung weist der Ausdruck Inhibierung entweder auf eine Reduktion der Geschwindigkeit des Tumorwachstums, der Tumorgröße, des Tumorvolumens oder sogar auf eine vollständige Beseitigung eines Tumors hin. Ferner deutet sie auf einen verzögerten Ausbruch eines Tumors oder eine vollständige Prävention des Auftretens von Tumoren (zur prophylaktischen Behandlung von Pati enten mit hohem Risiko) oder des Wiederauftretens von Tumoren (nachfolgend zu einer vorhergehenden Östrogen-abhängigen Tumorbehandlung) hin.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner bereit:

– Erzeugnisse, die eine erste Verbindung enthalten, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist, und eine zweite Verbindung enthalten, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist; als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung zur Inhibierung des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor;
– eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung des Wachstums von Östrogen-abhängigen Tumoren, umfassend eine erste Verbindung der Formel:
worin R₁ bis R₄, R₆ und R₈ wie vorstehend definiert sind und eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalenen ausgewählt ist;
– eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor, umfassend eine erste Verbindung, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist, und eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist;
– Verwendung einer ersten Verbindung der Formel:
worin R₁ bis R₄, R₆ und R₈ wie vorstehend definiert sind, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in Kombination mit einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalenen ausgewählt ist, zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors;
– Verwendung einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalenen ausgewählt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in Kombination mit einer ersten Verbindung der Formel:
worin R₁ bis R₄, R₆ und R₈ wie vorstehend definiert sind, zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors;
– Verwendung einer ersten Verbindung, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Inhibierung des Wachstums eines Östrogen-abhängigen Tumors in Kombination mit einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalenen ausgewählt ist, und
– Verwendung einer zweiten Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalenen ausgewählt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung zur Inhibierung des Wachstums eines Östrogen-abhängigen Tumors in Kombination mit einer ersten Verbindung, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist.

Die vorliegende Erfindung sorgt für wichtige Verbesserungen des Standes der Technik, indem sie eine Kombinationsformulierung eines Triphenylethylen-Derivats und eines 1,3,6,8-substituierten oder 2,4,6,8-substituierten Alkyl-PCDFs bereitstellt, die zusammen, synergistisch oder additiv, wirken, um das Wachstum von Östrogenabhängigen Tumoren zu inhibieren. Das Ergebnis dieser kombinierten Wirkung liegt darin, dass die Konzentration, bei der die Triphenylethylen-Derivate wirksam sind, reduziert werden kann, wodurch die Gefahr einer Induktion von endometrialen Tumoren verringert wird. Zusätzlich zu der Reduktion der endokrinen Tumorigenität aufgrund der verminderten erforderlichen Konzentration von Triphenylethylen wirken die 1,3,6,8-substituierten Alkyl-PCDF-Verbindungen ferner als direkte Inhibitoren der anti-östrogen-induzierten Bildung von endometrialen Tumoren.
Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden offensichtlich und möglicherweise besser verständlich beim Lesen der nachfolgenden Beschreibung und durch den Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung mit Tamoxifen, mit MDCF oder der Co-Behandlung.
2 zeigt das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung mit Tamoxifen.
3 zeigt das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung mit MCDF.
4 zeigt das Tumorvolumen und die Wirkung der Co-Behandlung mit Tamoxifen und MCDF.
Die 5a, 5b und 5c zeigen die Gebärmutterperoxidaseaktivität bei Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und Co-Behandlung.
Die 6a und 6b zeigen das Gewicht von Gebärmuttern bei Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und der Co-Behandlung.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Ausführungsformen und Modifikationen an der in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne dass vom Schutzbereich und dem Sinn der Erfindung abgewichen wird.
Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Formulierung zur Inhibierung von Östrogen-abhängigen Tumoren umfassend ein 1,3,6,8-substituiertes oder 2,4,6,8-substituiertes Alkyl-PCDF, das in Kombination mit einer zweiten Verbindung, die ein Anti-Östrogen darstellt, verwendet wird.
Es ist für den Fachmann verständlich, dass die vorliegende Erfindung die Verabreichung und die Verwendung von PCDFs in Kombination mit steroidalen oder nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga und -Derivaten umfasst. Die nicht-steroidalen Anti-Östrogensubstrat-Analoga können entweder Triphenylethylen-Verbindungen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogene Hydrazone, anti-östrogene Benzothiophene und Dihydronaphthalene sein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Gruppe von anti-östrogenen Triphenylethylen-Verbindungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Tamoxifen, Tamoxifen-Analoga und -Derivate und Toremifen, Toremifen-Analoga und -Derivate. Dieses umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, alle Verbindungen und Äquivalente davon, die z. B. in den folgenden U.S. Patenten offenbart sind, von denen jedes in der Gesamtheit durch in Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird: U.S. Patent Nr. 5,807,899, erteilt für Bohlmann et al., 15. September 1998; U.S. Patent Nr. 5,750,576, erteilt für DeGregorio am 12. Mai 1998; U.S. Patent Nr. 4,656,187, erteilt für Black et al. am 7. April 1987; U.S. Patent Nr. 5,554,628, erteilt für Bryant et al. am 10. September 1996; U.S. Patent Nr. 5,604,248, erteilt für Bryant et al. am 18. Februar 1997; und U.S. Patent Nr. 5,691,355, erteilt für Bryant et al. am 25. November 1997. Die Gruppe von anti-östrogenen Hydrazonverbindungen umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Azido-, 4-Nitro-, 2,4-Dinitrophenylhydrazon und alle Verbindungen und Äquivalente davon, die beispielsweise in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,732,904, erteilt für Morgan am 22. März 1988, beschrieben sind. Die Gruppe von anti-östrogenen Benzothiophenen umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Raloxifen, Raloxifen-Analoga und -Derivate und alle Verbindungen und Äquivalente davon, die beispielsweise in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,418,068, erteilt für Jones am 29. November 1983, beschrieben sind. Die Gruppe von Aromatase-Inhibitoren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, 4-Hydroxyandrostendion (4-OHA), Letrozol, Anastrazol und alle Verbindungen oder Äquivalente davon, die z. B. in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,745,109, erteilt für Bednarski et al., 17. Mai 1988, offenbart worden sind. Die Gruppe von Dihydronaphthalen-Verbindungen umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Trioxifenmesylat und alle Verbindungen und Äquivalente davon, die z. B. in dem folgenden U.S. Patent Nr. 4,230,862, erteilt für Suarez und Jones am 28. Oktober 1980, offenbart sind.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines 1,3,6,8-substituierten oder 2,4,6,8-substituierten Alkyl-PCDFs. Die möglichen Substituenten umfassen Halogene wie Brom, Chlor, Fluor und/oder lineare oder verzweigte Substituenten wie Alkylgruppen mit etwa ein bis fünf Kohlenstoffatomen. Die 2,4,6 oder 8 und die 1,3,6 oder 8-Positionen können einzeln und unabhängig voneinander mit einem Wasserstoff statt eines Substituenten besetzt sein. Geeignete Alkylsubstituenten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl (i-Propyl), n-Butyl, sec-Butyl oder tert-Butyl-Gruppen.
Die PCDFs, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind z. B. in dem U.S. Patent Nr. 5,516,790, erteilt für Stephen Safe, am 14. Mai 1996, beschrieben. Die PCDFs können jene der folgenden Formel umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt:
worin R₁, R₃, R₆ und R₈ oder R₂, R₄, R₆ und R₈ einzeln und unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Substituenten darstellen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chlor, Fluor, Brom und einer linearen oder verzweigen Alkylgruppe mit ein bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und worin die Verbindung wenigstens einen Alkylsubstituenten und wenigstens zwei Halogensubstituenten aufweist; ferner kann das Halogen Chlor sein, der Alkylsubstituent kann aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Methyl, Ethyl und Propyl; R₆ kann ein Alkylsubstituent sein und R₁, R₃ und R₈ können aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom; ferner kann R₈ ein Alkylsubstituent sein und R₁, R₃ und R₆ können aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom, der Alkylsubstituent kann Methyl sein; des Weiteren kann R₆ ein Alkyl sein und R₂, R₄ und R₈ können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Chlor, Fluor und Brom besteht; und z. B. kann R₈ ein Alkylsubstituent sein und R₂, R₄ und R₆ können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Chlor, Fluor und Brom besteht. Beispiele für die PCDFs können die folgenden umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt,
6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran,
6-i-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran, und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein PCDF, das zwei laterale Substituenten aufweist ("laterale"-Substituenten können an der Position 2,3,7 oder 8 von Dibenzofuran liegen) in Kombination mit einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung eingesetzt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird 6-MCDF als Repräsentant von PCDF in Kombination mit Tamoxifen eingesetzt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird 6-tPropyl-1,3,8-triCDF in Kombination mit Tamoxifen verwendet. Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird 8-MCDF als Repräsentant für PCDF in Kombination mit Tamoxifen eingesetzt. Das PCDF und die zweiten Anti-Östrogen-Verbindungen werden in einem Gewichtsverhältnis von im Wesentlichen 50 : 1 bis 1 : 50, bevorzugt 25 : 1 bis 1 : 25 und noch bevorzugter 10 : 1 bis 1 : 10 kombiniert. Die am meisten bevorzugten Verhältnisse von Alkyl-PCDF : Anti-Östrogen sind 1 : 1 bis 1 : 4 bis 4 : 1 (PCDF : Anti-Östrogen).
Die vorliegende Erfindung eröffnet folglich die Möglichkeit, einen Patienten mit einem Östrogen-abhängigen Tumor zu behandeln, indem dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge an PCDF in Kombination mit einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung verabreicht wird (siehe vorstehend). PCDF und die Anti-Östrogen-Verbindungen werden simultan oder sequenziell verabreicht. Die simultane Verabreichung der Verbindungen ist die bevorzugte Verabreichungsmethode. Im Fall einer sequenziellen Verabreichung ist es jedoch bevorzugt, dass die zuerst verabreichte Verbindung zu dem Zeitpunkt, zu dem die zweite Verbindung verabreicht wird, noch biologisch wirksam ist. Gemäß einer Ausführungsform wird sowohl PCDF als auch die Anti-Östrogen-Verbindungen oral verabreicht. Sie können ferner beispielsweise auch intraperitoneal verabreicht werden.
Die in der vorliegenden Anmeldung und den Ansprüchen beschriebenen Methoden sind keinesfalls abschließend und weitere Methoden, die für eine spezifische Applikation geeignet sind, sind für den Fachmann offensichtlich. Ferner kann die wirksame Menge der Zusammensetzungen noch weiter in Analogie zu Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie die gewünschte Wirkung aufweisen, abgeschätzt werden.
Die folgenden Beispiele werden beispielhaft angeboten, und sollen nicht den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
Beispiel 1:
Weibliche jungfräuliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von Harlan (Houston) erhalten und man ließ sie für 10 Tage akklimatisieren, ermöglichte den Zugang zu Futter und Wasser ad libitum und hielt sie in einem 12 Stunden hell/dunkel-Rhythmus. Brusttumore wurden in 50 ± 3-Tage alten Ratten induziert, indem durch künstliche Sondenernährung eine Einzeldosis von 20 mg DMBA in 0,5 ml Maisöl verabreicht wurde. Nach 30 bis 75 Tagen konnten die Tumore durch Abtasten in den Ausführungsgängen der Brustdrüsen entdeckt werden. An einer einzigen Ratte entwickelten sich oft mehrere Tumore. Wenn der Tumor oder der größte der Tumoren eine kleine Größe (50–100 mm³) erreicht hatte, wurden die Ratten täglich mittels künstlicher Sondenernährung mit Maisöl allein (Vehikelkontrolle), einem PCDF, einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung oder einer Co-Behandlung von PCDF und einer zweiten Anti-Östrogen-Verbindung für 20 Tage behandelt, und anschließend am 21 Tag euthanisiert. Die Tumorgrößen wurden mit Messschiebern (Calipers) gemessen und die Volumen wurden nach der Formel (Länge × Breite × Tiefe)/6π berechnet und als Prozentkontrolle ausgedrückt.
Die Dosierungen des PCDFs und der zweiten anti-östrogenen Verbindung waren hoch genug, um in Kombination die gewünschte Inhibierung des Krebswachstums zu erzielen. Im Allgemeinen wird jede der Verbindung in einer Dosis von etwa 0,01 bis etwa 20 mg/kg/Tag verabreicht.
Die PCDF-Verbindungen, die verabreicht werden, sind, ohne darauf beschränkt zu sein,
6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran,
6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran,
6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran,
8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran,
8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran, und
8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran.
Die zweiten anti-östrogenen Verbindungen, die verabreicht werden, sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Triphenylethylen-Verbindungen (d. h. Tamoxifen, Toremifen, Clomiphen, Nafoxidin), Hydrazon-Verbindungen (d. h. Azido-, 4-Nitro- und 2,4-Dinitrophenylhydrazone), Benzothiophene (d. h. Raloxifen), Aromataseinhibitoren (d. h. 4-Hydroxyandrostenedion, Letrozol und Anastrozol) und Dihydronaphthalene (d. h. Trioxifenmesylat).
Beispiel 2:
Weibliche jungfräuliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von Harlan (Houston) erhalten und man ließ sie für 10 Tage akklimatisieren, ermöglichte den Zugang zu Futter und Wasser ad libitum und hielt sie in einem 12 Stunden hell/dunkel-Rhythmus. Brusttumore wurden in 50 ± 3-Tage alten Ratten induziert, indem durch künstliche Sondenernährung eine Einzeldosis von 20 mg DMBA in 0,5 ml Maisöl verabreicht wurde. Nach 30 bis 75 Tagen konnten die Tumore durch Abtasten in den Ausführungsgängen der Brustdrüsen entdeckt werden. An einer einzigen Ratte entwickelten sich oft mehrere Tumore. Wenn der Tumor oder der größte der Tumoren eine kleine Größe (50–100 mm³) erreicht hatte, wurden die Ratten täglich mittels künstlicher Sondenernährung mit Maisöl allein (Vehikelkontrolle), 0,4 mg/kg 6-MCDF, 0,4 mg/kg Tamoxifen oder einer Co-Behandlung von 0,4 mg/kg 6-MCDF plus 0,4 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am 21 Tag euthanisiert. Die Tumorgrößen wurden mit Messschiebern gemessen und die Volumen wurden nach der Fomel (Länge × Breite × Tiefe)/6π berechnet und als Prozentkontrolle ausgedrückt. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Ratten durch Ersticken euthanisiert. Alle Tumoren wurden entfernt, gewogen und geschnitten. Ein Teil wurde in flüssigem Stickstoff für eine PCR-Analyse gefroren; ein Teil wurde in 10% Formalin für eine histopathologische Analyse aufbewahrt; und der Großteil wurde für die Herstellung von mikrosomalen und cytosolischen Fraktionen unmittelbar homogenisiert. Die Lebern wurden durchgeschwemmt (perfused) und gewogen und Cytosol und Mikrosome wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Bei Dosierungen von 0,4 mg/kg/Tag inhibierten sowohl Tamoxifen als auch 6-MCDF allein das Tumorvolumen signifikant (jeweils 58,5 und 66,4% Inhibierung).
% Inhibierung
Tabelle 1. Prozentsatz-Inhibierung des Tumorvolumens oder des Tumorgewichts mit Tamoxifen allein (0,4 mg/kg/Tag). 6-MCDF allein (0,4 mg/kg/Tag), und Tamoxifen plus 6-MCDF (jeweils 0,4 mg/kg/Tag). * P < 0,05 im Vergleich mit unbehandelter Kontrolle unter Verwendung von ANOVA und Duncan's statistischen Tests für die Signifikanz.
Auch die beiden Arzneimittel einzeln verminderten das Tumorgewicht, jedoch war die diese Inhibitorantwort nicht signifikant. Im Gegensatz dazu trat eine signifikante Inhibierung von 86,2 und 78% von sowohl dem Brusttumorvolumen als auch dem Brusttumorgewicht bei Tieren auf, bei denen eine Co-Behandlung mit Tamoxifen plus 6-MCDF durchgeführt worden war. Die in der Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Tumorwachstum in Tieren, die eine Co-Behandlung mit beiden Arzneimitteln erhielten, im Wesentlichen blockiert ist. Ferner beeinflusste die Behandlung mit den Verbindungen allein oder in Kombination nicht das Körpergewicht oder das Gewicht von Organen und verursachte keine sichtbaren histopathologischen Veränderungen in diesen Geweben. Die Induktion von CYP1A1-abhängiger EROD-Aktivität durch toxische halogenierte Aromaten wie z. B. TCDD ist eine der empfindlichsten Indikatoren für eine Aussetzung gegenüber diesen Verbindungen und es liegt eine hervorragende Korrelation zwischen toxisch versus EROD-Induktionsfähigkeiten vor. Alternierend substituierte PCDFs sind durch eine niedrige Toxizität und niedrige Potenz als Induktoren von hepatischer EROD-Aktivität gekennzeichnet. Die in Tabelle 1 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass Tamoxifen, 6-MCDF und Tamoxifen plus 6-MCDF keine hepatische EROD-Aktivität induziert hat und dies ist mit der niedrigen Toxizität von 6-MCDF konsistent. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 6-MCDF die antitumorigene Aktivität von Tamoxifen in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodell steigert, was darauf hinweist, dass die kombinierte Behandlung mit Tamoxifen plus Alkyl-PCDFs eine neue und effizientere Endokrintherapie zur Behandlung von Brustkrebs darstellt.
Beispiel 3:
Beispiel 3, das in der Tabelle 2 und der 1 zusammengefasst ist, zeigt die Wirkungen von 6-MCDF und Tamoxifen, allein oder in Kombination, in dem DMBA-induziertem Rattenbrusttumormodell.
Methoden: Jungfräuliche weibliches Sprague-Dawleys-Ratten mit einem genau bestimmten Alter wurden am Tag 55 am Nachmittag mit 20 mg/Ratte 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen in einem Volumen von 0,5 ml/Ratte Maisöl dosiert (Die Ratten wogen ungefähr 165 g, was zu 120 mg/kg DMBA und 3 ml/kg Maisöl führt). Die Ratten wurden mittels einer künstlichen Sondenernährung mit Maisöl (Vehikel), 0,4 mg/kg 6-MCDF, 0,4 mg/kg Tamoxifen oder einer Co-Behandlung von 0,4 mg/kg 6-MCDF plus 0,4 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am Tag 21 euthanasiert.
TABELLE 2 WIRKUNGEN VON 6-MCDF UND TAMOXIFEN, ALLEIN ODER IN KOMBINATION, IN DEM DMBA-INDUZIERTEM RATTENBRUSTTUMORMODELL
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von ANOVA durchgeführt und die Signifikanz wurde bestimmt, indem der „Duncan New Multiple Range test" angewendet wurde.
1 zeigt das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung auf Brusttumore von 0,4 mg/kg/Tag Tamoxifen, MCDF oder der Co-Behandlung.
Beispiel 4:
Das Beispiel 4, das in den Tabellen 3, 4 und den 2, 3 und 4 zusammengefasst ist, zeigt die Wirkungen von geringen Dosierungen von 6-MCDF und Tamoxifen, allein oder in Kombination, in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodell.
Methoden: Jungfräuliche weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem genau bestimmten Alter wurden am Tag 55 am Nachmittag mit 20 mg/Ratte 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen in einem Volumen von 0,5 ml/Ratte Maisöl dosiert (Die Ratten wogen ungefähr 165 g, was zu 125 mg/kg DMBA und 3 ml/kg Maisöl führt). Die Ratten wurden mittels einer künstlichen Sondenernährung mit Maisöl (Vehikel), 0,1, 0,05 und 0,025 mg/kg 6-MCDF, 0,1, 0,05, 0,025 mg/kg Tamoxifen oder einer Co-Behandlung von 0,1, 0,05, 0,025 mg/kg 6-MCDF plus 0,1, 0,05 und 0,025 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am Tag 21 euthanasiert.
TABELLE 3 WIRKUNGEN VON 6-MCDF UND TAMOXIFEN, ALLEIN ODER IN KOMBINATION, IN DEM DMBA-INDUZIERTEM RATTENBRUSTTUMORMODELL
Die 2, 3 und 4 zeigen das Tumorvolumen und die Wirkung der Behandlung auf Brusttumoren von 0,1, 0,05 und 0,025 mg/kg/Tag Tamoxifen, MCDF oder der Co-Behandlung.
TABELLE 4 WIRKUNGEN VON NIEDRIGEN DOSIERUNGEN VON 6-MCDF UND TAMOXIFEN, ALLEIN ODER IN KOMBINATION, IN DEM DMBA-INDUZIERTEM RATTENBRUSTTUMORMODEL KÖRPER UND ORGANGEWICHTE
Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.
Die Organgewichte sind als Prozent-Körpergewicht ausgedrückt.
Es wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt.
Das Tamoxifen allein erniedrigte bei einer Dosis von 0,1 mg/kg/Tag das Tumorwachstum signifikant (Gewicht und Volumen), während niedrigere Dosierungen (0,05 und 0,025 mg/kg/Tag) inaktiv waren. Im Gegensatz dazu war 6-MCDF antitumorigen bei Dosierungen von 0,1 und 0,05 mg/kg/Tag, jedoch inaktiv bei der niedrigsten getesteten Dosierung (0,025 mg/kg/Tag). In Kombinationsstudien wurden Dosierungen von Tamoxifen plus 6-MCDF mit gleichem Gewicht untersucht, um die interaktiven Effekte als antitumorigene Mittel zu bestimmen. Die Ergebnisse, die in der Tabelle 3 und der 4 dargestellt sind, zeigen, dass alle Kombinationen das Brusttumorwachstum signifikant inhibierten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die antitumorigene niedrige Dosierungskombination (Tamoxifen plus 6-MCDF bei 0,025 mg/kg/Tag pro Verbindung) Dosierungen der Verbindungen verwendete, die einzeln inaktiv waren. Eine statistische Analyse dieser Daten zeigte, dass diese Interaktion von Tamoxifen (0,025 mg/kg) plus 6-MCDF (0,025 mg/kg) synergistisch das Brusttumorwachstum in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodel inhibierte. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 6-MCDF die antitumorigene Wirkung von Tamoxifen in dem DMBA-induzierten Rattenbrusttumormodel verstärkt, was darauf hinweist, dass die kombinierte Behandlung mit niedrigen Dosierungen von Tamoxifen plus niedrigen Dosierungen von 6-MCDF eine neue und effizientere Endokrintherapie zur Behandlung von Brustkrebs darstellt. Ferner zeigen diese Daten, dass die beiden Verbindungen synergistisch das Tumorwachstum in dem Nagetiermodel bei extrem niedrigen Dosierungen blockieren. Mit der Verringerung von Tamoxifen auf diese niedrigen Spiegel ohne eine Verringerung der Wirksamkeit behält die vorliegende Erfindung die vorteilhaften Wirkungen von Tamoxifen bei und minimiert die tumorigenen Wirkungen von Tamoxifen in der Gebärmutter.
Beispiel 5:
Beispiel 5 zeigt die Wirkungen von täglichen Dosierungen von Tamoxifen und 6-MCDF auf die Knochen bei ovariektomierten Ratten. Die ovariektomierte Ratte wird als ein Model für Osteoporose verwendet. Gegenwärtige Studien messen die Knochenhistomorphometrie (Evans et al. (1996)) oder die Knochenmineraldichte mittels der Röntgen-Absorptiometrie (Ezawa (1995)) wie auch die Knochenlänge, das Feuchtgewicht und das Trockengewicht (Takahasi et al. (1996)). Im Jahr 1987 wurde berichtet, dass Tamoxifen als ein Östrogenagonist in Knochengewebe von ovariektomierten Ratten wirkt (Turner et al (1987)), obwohl eine Studie zeigte, dass Tamoxifen keine Wirkung in Zyklus-Ratten (cycling rats) aufwies (Takahashi et al. (1996)). Die Oberschenkelknochen von Ratten, die mit Tamoxifen, MCDF, oder Tamoxifen plus MCDF behandelt worden waren, wurden untersucht, um die Gewebe-spezifische Anti-Östrogenität von MCDF zu untersuchen.
Methoden: Die Ratten wurden am Tag 97 ovariektomiert. Nach ungefähr 3 Wochen wurden die Ratten oral für 20 Tage mit Maisöl (Vehikel), 0,4 mg/kg Tamoxifen, 0,8 mg/kg/Tag 6-MCDF oder einer Behandlung von 0,4 mg/kg Tamoxifen plus 0,8 mg/kg 6-MCDF pro Tag behandelt. Die Ratten wurden am Tag 21 euthanasiert. Nachdem die Gebärmutter entfernt und verarbeitet worden war, wurden sowohl der rechte als auch der linke Oberschenkelknochen entnommen und die Länge wurde mit einem Messschieber gemessen. Da aus der Literatur kein kostengünstiges Protokoll zur Ablösung des gesamten Muskels vom Knochen bekannt ist, wurde eine vierstündige Waschbehandlung mit PBS, pH 2,0 durchgeführt, die das Bindegewebe erweichte, ohne den Knochen sichtbar in Mitleidenschaft zu ziehen. Die Feuchtgewichte wurden gemessen, nachdem das restliche Bindegewebe entfernt worden war. Das Trockengewicht wurde gemessen, nachdem die Knochen für 12 Stunden bei 130°C getrocknet worden waren.
TABELLE 5 WIRKUNGEN AUF DIE KNOCHEN VON TÄGLICHEN DOSIERUNGEN VON TAMOXIFEN (0,4 mg/kg) UND 6-MCDF (0,8 mg/kg) IN DER OVARIEKTONIERTEN SPRAGUE-DAWLEY RATTE
Beispiel 6:
Beispiel 6 zeigt die Effekte auf die Gebärmutter von täglichen Dosierungen von Tamoxifen und 6-MCDF in ovariektomierten Ratten.
Methoden: Die Ratten wurde am Tag 97 ovariektomiert. Nach ungefähr 3 Wochen wurden die Ratten oral für 20 Tage mit Maisöl (Vehikel), 0,4 mg/kg Tamoxifen, 0,4 mg/kg/Tag 6-MCDF oder einer Behandlung von 0,4 mg/kg Tamoxifen plus 0,4 mg/kg 6-MCDF pro Tag behandelt, wobei jede Behandlungsgruppe aus 5 Ratten bestand. Die Ratten wurden am Tag 21 euthanasiert. 6-MCDF verursachte einen leichten, aber signifikanten Anstieg des Milz-Feuchtgewichts.
TABELLE 6 WIRKUNGEN AUF DIE GEBÄRMUTTER VON TÄGLICHEN DOSIERUNGEN VON TAMOXIFEN (0,4 mg/kg) UND 6-MCDF (0,4 mg/kg) IN DER OVARIEKTOMIERTEN SPRAGUE-DAWLEY RATTE
Beispiel 7:
Beispiel 7 zeigt die Wirkungen auf das Körpergewicht und Organgewicht der Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und der Co-Behandlung.
Methoden: Das Verfahren zur Herstellung der Dosierungslösungen ist wie folgt: Bei MCDF ist ein leichtes Erwärmen erforderlich, um es zu lösen, und Tamoxifen muss in Ethanol (5% des Endvolumens) gelöst werden, das dann zu dem Maisöl gegeben wird. Das Ethanol wird mit einem leichten Luftstrom verdampft. Zuerst wurde das Maisöl für die Tamoxifendosis in einem kochenden Wasserbad erhitzt, und man ließ es abkühlen. Anschließend wurde MCDF für sowohl MCDF allein als auch TAM ± MCDF abgewogen und in einer geeigneten Menge von Maisöl unter Erhitzen gelöst. Für das Kontrollvehikel und das MCDF-Vehikel wurde Ethanol dazugegeben (5% v/v) und anschließend verdampft. Tamoxifen wurde sowohl für die Tamoxifenbehandlung als auch die TAM ± MCDF Behandlung in Ethanol gelöst. Jeweils ein Aliquot wurde anschließend zu dem geeigneten Maisölvehikel gegeben (das vorgewärmte Maisöl für Tamoxifen und das Maisöl, das MCDF enthielt, für TAM + MCDF), und das Ethanol wurde verdampft.
TABELLE 7 WIRKUNGEN DER BEHANDLUNG AUF DAS KÖRPERGEWICHT UND ORGANGEWICHTE
Beispiel 8:
Das Beispiel 8 (Tabellen 8 und 9 und 5 und 6) zeigt die Wirkungen auf die Gebärmutter von täglichen Dosierungen von Tamoxifen und 6-MCDF in ovariektomierten Ratten.
Für die Tabelle 8 und die 5 wurden die Ratten am Tag 97 ovariektomiert. Nach ungefähr 3 Wochen wurden die Ratten oral für 20 Tage mit Maisöl (Vehikel), 0,4 mg/kg Tamoxifen, 0,8 mg/kg/Tag 6-MCDF oder einer Co-Behandlung von 0,4 mg/kg Tamoxifen plus 0,8 mg/kg 6-MCDF pro Tag behandelt. Die Ratten wurden am Tag 21 euthanasiert.
TABELLE 8 WIRKUNGEN AUF DIE GEBÄRMUTTER VON TÄGLICHEN DOSIERUNGEN VON TAMOXIFEN (0,4 mg/kg) UND 6-MCDF (0,8 mg/kg) IN OVARIEKTOMIERTEN SPRAGUE-DAWLEY RATTEN WIRKUNGEN DER BEHANDLUNG AUF GEBÄRMUTTERASSAYS
Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen angegeben.

+: Signifikant verschieden (p < 0,05) von der Kontrollbehandlung.
✝: Signifikant verschieden (p < 0,05) von der Tamoxifenbehandlung.

Die 5a, 5b und 5c zeigen die Gebärmutterperoxidaseaktivität (nukleäre Extrakte) bei Behandlung mit Tamoxifen, MCDF und der Co-Behandlung.
Für die Tabelle 9 und die 6a und 6b wurden jungfräuliche weibliches Sprague-Dawley-Ratten mit einem genau bestimmten Alter am Tag 55 am Nachmittag mit 20 mg/Ratte 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen in einem Volumen von 0,5 ml/Ratte Maisöl dosiert (die Ratten wogen ungefähr 165 g, was zu 120 mg/kg DMBA und 3 ml/kg Maisöl führt). Die Ratten wurden mittels einer künstlichen Sondenernährung mit Maisöl (Vehikel), 0,4 mg/kg 6-MCDF, 0,4 mg/kg Tamoxifen oder einer Co-Behandlung von 0,4 mg/kg 6-MCDF plus 0,4 mg/kg Tamoxifen für 20 Tage behandelt, und anschließend am Tag 21 euthanasiert.
TABELLE 9 WIRKUNGEN DER BEHANDLUNG AUF DAS KÖRPERGEWICHT UND DIE ORGANGEWICHTE
Die 6a und 6b zeigen die Gebärmuttergewichte bei Behandlung mit Tamoxifen, 6-MCDF und einer Co-Behandlung.
LITERATURSTELLEN

1. B. Astroff et al., 6-Methyl-1,3,8-trichlorodibenzofuran as a 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin antagonist inhibition of the induction of rat cytochrome P-450 isozymes and related monoxygenase activites, Mol. Pharmacol. 33 (1988) 231–236;
2. B. Astroff et al., Comparative antiestrongenic activities of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and 6-methyl-1,3,8-trichlorodibenozofuran in the female rat, Itoxicol. Appl. Pharmacol. 95 (1988) 435–443;
3. B. Astroff et al., 6-Substituted-1,3,8-trichlorodibenzofurans as 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin antagonists in the rat: structure-activity relationships, Toxicology, 59 (1989) 285–296;
4. B. Astroff et al., 6-Alkyl-1,3,8-trichlorodibenzofurans as antiestrogens in female Sprague-Dawley rats, Toxicology 69 (1991) 187–197;
5. R. Bannister et al., 6-Methyl-1,3,8-trichlorodibenzofuran (MCDF) as a 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin antagonist in C57BL/6 mice, Toxicology 54 (1989) 139–150;
6. R. Dickerson et al., Alkyl polychlorinated dibenzofurans and related compounds as antiestrogens in the female rat uterus; structure-activity studies, Toxicol. Appl. Pharmacol. 135 (1995) 287–298;
7. G. L. Evans et al., Raloxifene inhibits bone turnover and prevents further cancellous bone loss in adult ovariectomized rats with established osteropenia, Endo. (1996) 137: 4139–4144;
8. I. Ezawa et al., The effect of ovariectomy on bone metabolism in rats, Bone 17: 163S–167S;
9. Fisher et al., J. Natl. Cancer Inst. (1994); (86): 527–537;
10. Fornander et al., Lancet (1989); (1): 117–120;
11. M. Harris et al., Partial antagonism of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinmediated induction of aryl hydrocarbon hydroxylase by 6-methyl-1,3,8-trichlorodibenzofuran; mechanistic studies, Mol. Pharmacol. 35 (1989) 729– 735;
12. A. McDougal et al., Inhibition of 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced rat manunary tumor growth by aryl hydrocarbon receptor agonists, Cancer Letters (1997) 120: 53–63;
13. Mouridsen et al., Acta. Oncol. (1998); (27): 699–705;
14. Ribeiro et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (1992); (11): 121–125;
15. Rutqvist et al., J. Natl. Cancer Inst. (1995); (87): 645–651;
16. Ryden et al., Controlled Clin. Trials (1986); (7): 290–305;
17. Stewart et al., Lancet (1989); (1): 375–376;
18. Stewart, J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (1992); (11): 117–120;
19. Takahashi et al., The effect of tamoxifen on bone metabolism and skeletal growth is different in ovariectomized and intact rats, Calcif Tissue Int. 59: 271–276;
20. R. T. Turner et al., Tamoxifen, prevents the skeletal effects of ovarian hormone deficiency in rats, J. Bone and Min. Res. 2: 449–456;
21. C. Yao et al., 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced porphyria in genetically inbred mice; partial antagonism and mechanistic studies, Toxicol. Appl. Pharmacol. 100 (1989) 208–216);

Claims

Erzeugnisse, enthaltend eine erste Verbindung der Formel
worin R₁, R₃, R₆ und R₈ oder R₂, R₄, R₆ und R₈ unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Substituenten, der aus Chlor, Fluor, Brom und einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, darstellen, wobei diese erste Verbindung wenigstens einen Alkylsubstituenten und wenigstens zwei Halogensubstituenten aufweist, und eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist, als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung zur Inhibierung des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor.
Erzeugnisse gemäß Anspruch 1, worin die zweite Verbindung aus Tamoxifen, Toremifen, Clomiphen, Nafoxidin und Hydroxytamoxifen ausgewählt ist.
Erzeugnisse gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Halogen der ersten Verbindung Chlor ist.
Erzeugnisse gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Halogensubstituenten der ersten Verbindung aus Chlor, Brom und Fluor ausgewählt sind.
Erzeugnisse gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Alkylsubstituenten der ersten Verbindung aus Methyl, Ethyl und Propyl ausgewählt sind.
Erzeugnisse gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die erste Verbindung 6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran oder 6-i-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran ist.
Erzeugnisse gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die erste Verbindung aus 6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, 6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, ausgewählt ist.
Erzeugnisse, die eine erste Verbindung enthalten, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlordibenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist, und eine zweite Verbindung enthalten, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist; als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen oder sequentiellen Verwendung zur Inhibierung des Wachstums von einem Östrogen-abhängigen Tumor.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung des Wachstums von Östrogen-abhängigen Tumoren, umfassend eine erste Verbindung der Formel
worin R₁, R₃, R₆ und R₈ oder R₂, R₄, R₆ und R₈ unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Substituenten, der aus Chlor, Fluor, Brom und einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, darstellen, wobei diese erste Verbindung wenigstens einen Alkylsubstituenten und wenigstens zwei Halogensubstituenten aufweist, und eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, worin die zweite Verbindung aus Tamoxifen, Toremifen, Clomiphen, Nafoxidin und Hydroxytamoxifen ausgewählt ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder 10, worin das Halogen der ersten Verbindung Chlor ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder 10, worin die Halogensubstituenten der ersten Verbindung aus Chlor, Brom und Fluor ausgewählt sind.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, worin die Alkylsubstituenten der ersten Verbindung aus Methyl, Ethyl und Propyl ausgewählt sind.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder 10, worin die erste Verbindung 6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran oder 6-i-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder 10, worin die erste Verbindung aus 6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, 6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran ausgewählt ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung des Wachstums eines Östrogen-abhängigen Tumors, umfassend eine erste Verbindung, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist, eine zweite Verbindung, die aus Triphenylethylen-Anti-Östrogenen, Aromatase-Inhibitoren, anti-östrogenen Hydrazonen, anti-östrogenen Benzothiophenen und anti-östrogenen Dihydronaphthalinen ausgewählt ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 16, worin die Menge der ersten Verbindung bei 1–50 Gewichtsteilen und die Menge der zweiten Verbindung bei 1–50 Gewichtsteilen liegt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, worin die Menge der ersten Verbindung bei 1–10 Gewichtsteilen und die Menge der zweiten Verbindung bei 1–10 Gewichtsteilen liegt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, worin die Menge der ersten Verbindung bei 1–4 Gewichtsteilen und die Menge der zweiten Verbindung bei 1–4 Gewichtsteilen liegt.
Verwendung einer ersten, wie in Anspruch 1 definierten Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in Kombination mit einer zweiten, wie in Anspruch 1 definierten Verbindung zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors.
Verwendung einer zweiten, wie in Anspruch 1 definierten Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in Kombination mit einer ersten, wie in Anspruch 1 definierten Verbindung zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors.
Verwendung gemäß Anspruch 20 oder 21, worin die zweite Verbindung aus Tamoxifen, Toremifen, Clomiphen, Nafoxidin und Hydroxytamoxifen ausgewählt ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, worin das Halogen der ersten Verbindung Chlor ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, worin die Halogensubstituenten der ersten Verbindung aus Chlor, Brom und Fluor ausgewählt sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24, worin die Alkylsubstituenten der ersten Verbindung aus Methyl, Ethyl und Propyl ausgewählt sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, worin die erste Verbindung 6-Methyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,6-trichlordibenzofuran oder 6-i-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24, worin die erste Verbindung aus 6-Ethyl-1,3,8-trichlordibenzofuran, 6-Propyl-1,3,8-trichlordibenzofuran ausgewählt ist.
Verwendung einer ersten Verbindung, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung in Kombination mit einer zweiten, wie in Anspruch 1 definierten Verbindung zur Inhibierung eines Östrogen-abhängigen Tumors.
Verwendung einer zweiten, wie in Anspruch 1 definierten Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Inhibierung eines Östrogenabhängigen Tumors in Kombination mit einer ersten Verbindung, die aus 6-Methyl-2,3,8-trichlorbenzofuran, 6-Methyl-2,3,4,8-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-1,3,7-trichlordibenzofuran, 8-Methyl-1,2,4,7-tetrachlordibenzofuran, 8-Methyl-2,3,7-trichlordibenzofuran und 8-Methyl-2,3,4,7-tetrachlordibenzofuran ausgewählt ist.