DE60020111T2 - Therapeutische anwendung von cannabinoiden zur hirntumorbehandlung - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Das technische Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Hirntumoren (Glioblastomen).
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine therapeutische Verwendung von Cannabinoid-Verbindungen zur Behandlung von Hirntumoren. Gegenwärtig verwendete Therapien für diese Tumore (Chirurgie, Strahlentherapie, Chemotherapie, Immuntherapie, Gentherapie) sind im Allgemeinen ineffektiv oder bestenfalls palliativ. Die Erfindung beinhaltet eine technisch einfache Methode, der nennenswerte Nebenwirkungen fehlen und die hoch effektiv in der Behandlung von Hirntumoren ist, einschließlich der bösartigsten (Glioblastome).
  • Hintergrund der Erfindung
  • Unter den verschiedenen Hirntumoren, die Menschen befallen, sind Glioblastome die häufigsten (einer pro 50.000 Personen und Jahr), die bösartigsten (Sterblichkeit nahe bei 100 %) und die sich am schnellsten entwickelnden (Lebenserwartung von Wochen/Monaten nach Diagnosestellung). Heutzutage ist die Behandlung von Glioblastomen im Allgemeinen ineffektiv oder bloß palliativ und beinhaltet solche Therapien wie Chiurgie, Strahlentherapie, Chemotherapie und Immuntherapie (Louis, D.N. & Gusella, J.F., Trends Genet. 11, 412 – 415, 1995; Avgeropoulos, N.G. & Batchelor, T.T., Oncologist 4, 209 – 224, 1999). Außerdem wird damit begonnen, Gentherapie als experimentelle Behandlungsmethode für Glioblastome zu verwenden, obwohl sie bis jetzt wenige positive Resultate lieferte (Martuza, R.L., Nature Med. 3, 1323, 1997). Die Unwahrscheinlichkeit des Erfolgs dieser therapeutischen Ansätze kann durch solche Faktoren wie dem schnellen Wachstum, der großen Heterogenität, dem hohen Maß an Infiltration und einer extremen Resistenz gegen Chemotherapie, die Glioblastome zeigen, weiter verkompliziert werden (Maintz et al., J. Neurpathol. Exp. Neurol. 56, 1098 – 1104, 1997; Mason, W. Louis, D.N. & Caimcross J.G. J. Clin. Oncol. 15, 3423 – 3426, 1997; Martruza, oben zitiert; Avregopoulos & Batchelor, oben zitiert). Es wäre daher höchst wünschenswert, neue therapeutische Alternativen für die Behandlung von Hirntumoren zu entwickeln.
  • Cannabinoide sind Verbindungen, die nach der Pflanze benannt sind, die sie synthetisiert, Cannabis sativa L. Diese Verbindungen, unter denen Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) sich durch seine hohe Wirksamkeit und sein reiches Vorkommen auszeichnet, sind für die zentralen und peripheren Wirkungen des Marihuanakonsums verantwortlich (Pertwee, R.G:, Pharmacol. Ther. 74, 129 – 180, 1997; Felder, C.C. 6 Glass, M., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 179 – 200, 1998). Cannabinoide aus C. sativa (1) wirken aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit gewissen Molekülen, die von Tieren (einschließlich Menschen) produziert werden, welche wahrscheinlich wichtige Funktionen im Nervensystem ausüben. Diese Moleküle sind daher als endogene Cannabinoide oder Endocannabinoide bekannt, unter denen Anandamid (= Arachidonylethanolamid) das maßgeblichste ist (Di Marzo, V., Melck, D., Bisogno, T. & De Petrocellis, L., Trends Neurosci. 21, 521 – 528, 1998; Martin B.R., Mechoulam, R. & Razdan, R.K. Life Sci. 65, 573 – 595, 1999). Außerdem wurden im Labor Verbindungen erhalten, die die Wirkung natürlicher Cannabinoide nachahmen, aber mit einer viel höheren Wirksamkeit. Diese sind als synthetische Cannabinoide bekannt, eines von diesen ist WIN-55,212-2 (2) (Pertwee oben zitiert; Barth, F. Expert Opin. Ther. Patents, 8, 301 – 313, 1998). Sowohl natürliche wie synthetische Cannabinoide wirken durch Bindung an spezifische Membranrezeptoren (Cannabinoid- oder CB-Typ-Rezeptoren), von denen heute zwei verschiedene Subtypen bekannt sind: CB1 und CB2. (Pertwee, oben zitiert, Howlett A. et al. In The IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification, Eds. Godfraind, T., Humphrey, P., Ruffolo, R. & Vanhoutte, P., IUPHAR Media, 97 – 104, 1998). Nicht alle Gewebe im Organismus haben diese Rezeptoren; sie werden hauptsächlich im Nervensystem gefunden, und daher betreffen die Wirkungen von Cannabinoiden hauptsächlich das Gehirn (Pertwee, oben zitiert, Childers, S.R. & Breivogel, C.S. Drug Alcohol Depen. 51, 173 – 187, 1999).
  • Zur Zeit gibt es eine große Zahl von Studien, die sich mit möglichen therapeutischen Anwendungen von Cannabinoiden befassen. Tatsächlich dürfen Ärzte im Vereinigten Königreich und in einigen Staaten der Vereinigten Staaten THC oder gewisse synthetische als Appetit-anregende Mittel oder als Mittel zum Verhindern von Erbrechen an Patienten mit AIDS oder mit Krebs, der chronisch mit Chemotherapie behandelt wird, verschreiben (Grinspoon, L. & Bakalar, J.B., JAMA 273, 1875 – 1876, 1995; Voth, E. & Schwanz, R. Ann. Intern. Med. 126, 791 – 798, 1997). Unter möglichen therapeutischen Verwendungen von Cannabinoiden mögen die folgenden erwähnt werden: (a) Es wurde gezeigt, dass sie als analgetische Mittel sehr effektiv im Lindem von stechendem und chronischem Schmerz sind; (b) als Mittel, welche motorische Aktivität reduzieren, werden sie heutzutage zur Behandlung von Funktionsstörungen, die mit Parkinson'scher Krankheit, Chorea Huntington und multipler Sklerose in Zusammenhang stehen, untersucht; (c) als Anticonvulsiva wird ihre Verwendung in der Behandlung von Epilepsie untersucht; (d) als Mittel, die den Innenaugendruck reduzieren, könnten sie bei der Glaucom-Behandlung verwendet werden (Voth & Schwartz, oben zitiert, Manzanares, J. et al., Trends Pharmacol. Sci., 20, 287 – 294, 1999; Sanudo-Pena, M.C., Tsou, K. & Walker, J.M., Life Sci. 65, 703 – 713, 1999). Einige dieser therapeutischen Verwendungen von Cannabinoid-Verbindungen sind bereits patentiert (siehe zum Beispiel US 4189491 , US 6939429 , WO 9711668, WO 9832441 und WO 9957105).
  • Eine der faszinierendsten und unerforschtesten Wirkungen von Cannabinoiden ist ihre Fähigkeit, das Wachstum von Zellen zu inhibieren, die in vitro transformiert wurden. So wurde gezeigt, dass einige Cannabinoide die Proliferation der Brusttumorzellen MCF-7 (De Petrocellis, L. et al., Proc. Natl. Academ. Sci. USA 95, 8375 – 8380, 1998), der Glioblastom-Zellen C6 (Sánchez, C., Galve-Roperh, I., Canova, C., Brachet, P. & Guzman, M., FEBS Lett. 436, 6 – 10, 1998) und der Prostata-Tumorzellen PC-3 inhibieren (Ruiz, L., Miguel, A. & Diaz-Laviada I., FEBS Lett. 458, 400 – 404, 1999). Allerdings wurden diese Ergebnisse in Zellkultursystemen niemals zuvor in vivo beobachtet, so dass ihre biomedizinische Bedeutsamkeit unbekannt ist.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung schafft eine neue Verwendung von Cannabinoiden in der Behandlung von Hirntumoren und basiert auf unseren Ausgangsbeobachtungen von Cannabinoid-induzierten, auffallenden Regressionen (was ein längeres Leben bedeutet) und sogar eine vollständige Beseitigung (was eine Heilung bedeutet) von Glioblastomen in Labortieren. Die Erfindung geht mit einer technisch einfachen Therapie einher, der jedwede bedeutsamen Nebenwirkungen fehlen und, was bedeutsamer ist, die sehr effektiv in der Behandlung von Hirntumoren ist, welche, wie zuvor erwähnt, heutzutage nicht zufriedenstellend durch irgendwelche anderen Methoden oder Verbindungen behandelt werden können. Die Experimente, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, sind unten beschrieben.
  • Antitumorale Wirkung von Cannabinoiden in Ratten
  • Die Injektion von C6-Glioblastoma-Zellen in ein Rattenhirn ist als experimentelles Modell für einen bösartigen Hirntumor weit verbreitet (Barth, R.F., J. Neurooncol. 36, 91 – 102, 1998). C6-Glioblastom-Zellen werden direkt in das Hirn von Wistar-Ratten inokuliert, und die Tumore werden mit Magnetresonanz beobachtet. Alle Tiere, die unbehandelt gelassen wurde, starben einheitlich 12 – 18 Tage nach der Inokulation mit den Zellen (3a). Um das Antitumor-Potential der Cannabinoide zu ermitteln, wurde einer Gruppe von Tieren 12 Tage nach der Inokulation der Zellen THC oder WIN-55,212-2 7 Tage lang durch eine Kanüle verabreicht, die an der Inokulationsstelle lokalisiert war. Mit Cannabinoiden behandelte Tiere hatten eine deutlich längere Lebenszeit als die Kontrolltiere (3a). So ermöglichte es das Verabreichen von Cannabinoiden, die Überlebenszeit auf 19 – 35 Tage bei 9/15 der Tiere (Behandlung mit THC) oder auf 19 – 43 Tage bei 4/15 der Tiere (Behandlung mit WIN-55,212-2) zu erhöhen. Außerdem ermöglichten es die Cannabinoide, den Tumor bei 3/15 der Tiere (Behandlung mit THC) oder bei 5/15 der Tiere (Behandlung mit WIN-55,212-2) vollständig zu entfernen. 3b zeigt eine Magnetresonanzaufnahme eines der Tiere, das mit THC geheilt wurde; nach Verabreichen des Cannabinoids war die Tumormasse vollständig verschwunden und an ihrer Stelle konnte ein verbliebener, hypointenser Bereich gesehen werden, der als fibröse Narbe an der Stelle der Inokulation gedeutet wird. Kein Wiederauftauchen des Tumors wurde bei irgendeinem der 8 Tiere beobachtet, die mit Cannabinoiden geheilt wurden.
  • Antitumorale Wirkung von Cannabinoiden bei immundefizienten Mäusen
  • Um zu unterscheiden, ob die anti-proliferative Wirkung der Cannabinoide an einer direkten Wirkung auf die Tumorzellen oder an einer indirekten Wirkung lag, die durch eine Immunantwort vermittelt wird, wurden C6-Glioblastom-Zellen subkutan in Mäuse mit einer Defizienz an Rekombinase RAG-2 (RAG-2-/-) inokuliert, welchen reife T- und B-Lymphocyten fehlen (Shinkai et al. Cell 68, 855 – 867, 1992). Wie in 4a gezeigt, war die Größe der Tumore in Tieren, die mit THC oder WIN-55, 212-2, behandelt wurden, außerordentlich viel kleiner als in den Kontrolltieren. 4b zeigt Beispiele von Tumor-tragenden Mäusen und von Tumoren, die nach 7-tägiger Behandlung mit oder ohne Cannabinoide präpariert wurden.
  • Sicherheit der in-vivo-Behandlung mit Cannabinoiden
  • Danach wurden die möglichen Nebenwirkungen der Behandlung mit Cannabinoiden untersucht. Ratten ohne Tumore, welche mit Cannabinoiden behandelt wurden, zeigten eine völlig unbeeinträchtigte Überlebensrate (3a). Wie bei den 8 oben erwähnten Tieren, deren Tumore mit Cannabinoiden beseitigt wurden, zeigte eine detaillierte Analyse mit Magnetresonanz von allen Tumor-losen Tieren, dass die Behandlung mit Cannabinoiden nicht zu irgendwelchen Anzeichen von Schäden durch Nekrose, Ödem, Infektion, Entzündung oder Trauma führte. Um die Möglichkeit von toxischen Wirkungen der Cannabinoide auf Nervenzellen, die eine Teilung durchlaufen, auszuschließen, wurden bei Ratten TUNEL-Tinkturen im subventrikularen Bereich des Hirns durchgeführt, welcher beim erwachsenen Tier weiter proliferiert. Das Verabreichen von Cannabinoiden hat nicht nur keine bedeutsamen apoptotischen Wirkungen im Hirn in vivo hervorgerufen, sondern außerdem war die leichte Markierung, die in dem caudado putamen der Kontrolltiere beobachtet wurde, in den mit Cannabinoiden behandelten Tieren nicht sichtbar.
  • Sowohl bei den Tumor-losen Tieren wie bei den Tumor-tragenden Tieren haben Cannabinoide keine bedeutsame Änderung von Verhaltensparametern wie motorischer Koordination und physischer Aktivität hervorgerufen. Die Aufnahme von Nahrung und Wasser und die Gewichtszunahme waren ebenso durch die Cannabinoide unbeeinflusst. Gleichermaßen waren biochemische Parameter in Blutanalysen (Glukose, Harnstoff, Harnsäure, Creatinin, Cholesterin, Billirubin) und Marker für Gewebeschäden (Alanin- und Aspartat-Aminotransferase, γ-Glutamyltransferase, Creatinkinase, Lactatdehydrogenase) nicht beeinträchtigt, weder während der 7 Tage-Periode der Verabreichung noch bis zu zwei Monate nach Beendigung der Behandlung mit Cannabinoiden. Daten von anderen Autoren stützen die Idee, dass Cannabinoide nicht nur nicht toxische Verbindungen für Nervenzellen sind, sondern dass sie diese stattdessen vor toxischen Stimuli wie glutamergischen Agonisten (Skaper et al. Proc. Natl. Academ. Sci. USA 93, 3984 – 3989, 1996; Shen, M. & Thayer, S.A., Mol. Pharmacol., 54, 459 – 462, 1998), oxidativen Agenzien (Hampson A.J., Grimaldi M., Axelrod J. & Wink, D. P Proc. Natl.Academ. Sci. USA 95, 8268 – 8273, 1998) und Ischämie schützen (Nagayama T. et al., J. Neurosci. 19, 2987 – 2995, 1999).
  • Pharmakologische Charakterisierung der anti-tumoralen Wirkung der Cannabinoide
  • Experimente wurden mit dem Ziel durchgeführt, eine pharmakologische Charakterisierung des Cannabinoid-induzierten Tods von C6-Glioblastom-Kulturzellen zu erhalten. Hochwirksame, synthetische Agonisten wie WIN-55,212-2, CP-55,940 und HU-210 induzierten den Tod dieser Zellen in niedrigeren Dosierungen als THC, wie wegen ihrer größeren Affinität für Cannabinoid-Rezeptoren erwartet werden konnten (Pertwee, oben zitiert). So war nach 5 Tagen der Cannabinoid-Exposition die Lebensfähigkeit von einem C6-Glioblastom bei Konzentrationen von 20 nM WIN-55,212-2, 45 nM CP-55,940, 10 nM HU-210 und 480 nM THC (n = 4) um 50 % reduziert. Weder SR141716 (ein selektiver Antagonist von CB1) noch SR144528 (ein selektiver Antagonist von CB2) (Shire, D. et al. Life Sci. 65, 627 – 635, 1999) waren einzeln dazu in der Lage, den durch THC induzierten Zelltod zu verhindern. Jedoch, wenn die zwei Antagonisten gemeinsam zu den Inkubationen hinzugefügt wurden, wurde eine effektive Verhinderung des THC-induzierten Zelltods beobachtet (5a). In Übereinstimmung damit zeigte ein Western-Blot-Test, dass C6-Glioblastom-Zellen sowohl den Rezeptor CB1 als auch CB2 exprimierten (5b).
  • Anwendung der Erfindung auf andere Fälle
  • Die Experimente, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurden mit Ratten und Mäusen als Tumor-tragenden Tieren durchgeführt. In Anbetracht des verwendeten experimentellen Designs und der Ähnlichkeit von Hirntumoren in verschiedenen Säugetieren (R. F. Barth, oben zitiert), kann die Erfindung jedoch auch auf die Behandlung von Hirntumoren in anderen Säugetieren, einschließlich Mensch, angewendet werden.
  • Die Experimente, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurden mit Glioblastomen als Modell eines Hirntumors durchgeführt.
  • Die Experimente, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurden mit zwei beispielhaften Cannabinoiden, einem natürlichen (THC) und einem synthetischen (WIN-55,212-2) durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Cannabinoid mit der wirksamsten anti-proliferativen Wirkung für einen gegebenen Tumor verwendet. Da die anti-proliferative Wirkung dieser Verbindungen durch Cannabinoid-Rezeptoren vermittelt wird (CB-Typ-Rezeptoren, Howlett et al., oben zitiert), ist die Erfindung jedoch auf jeden anderen Agonisten dieser Rezeptoren anwendbar, seien es Cannabinoide aus C. sativa (wie Δ9-Tetrahydrocannabinol, Cannabinol, Cannabidiol) (1) oder synthetische Cannabinoide (wie HU-210, CP-55,940, CP-50,556) (2) (Pertwee, oben zitiert; F. Barth, oben zitiert). Ebenso sind in dieser Sektion Arzneimittel enthalten, welche irgendein Cannabinoid in ihrer Zusammensetzung enthalten.
  • Die Experimente, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurden mit der intratumoralen Verabreichung des Cannabinoids durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wäre dies die Verabreichungsform der Wahl, da sie eine hohe Zugänglichkeit des Cannabinoids zum Tumor erlaubt. Da die Wirkung des Cannabinoids direkt am Tumor ist und da sie das periphere System nicht zu beeinträchtigen scheint, kann die Form der Verabreichung allerdings auch systemisch sein, wie intraperitoneal, intravenös oder oral.
  • Die Experimente, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurden mit einer kontinuierlichen Verabreichung einer Dosierung eines Cannabinoids für eine feste Zeit durchgeführt. In einer bevorzugt Ausführungsform der Erfindung können diese Parameter entsprechend den spezifischen Anforderungen der Behandlung geändert werden: Zustand des Patienten, Größe und Lokalisierung des Tumors, Zahl der Tumore, etc. So könnte zum Beispiel der Modus der Verabreichung kontinuierlich sein (bevorzugter Modus) oder sequentiell in einer oder mehreren Dosierungen pro Tag. Dies würde offensichtlich die Dosierung der verabreichten Verbindung und die gesamte Behandlungszeit beeinflussen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1
  • Strukturformel der hauptsächlichen Cannabinoide von C. sativa
  • 2
  • Strukturformeln der hauptsächlichen synthetischen Cannabinoide
  • 3
  • Antitumorale Wirkung von Cannabinoiden in Ratten.
    • (a) Überlebenskurven für Ratten mit Hirntumoren. Glioblastome wurden in 45 Ratten induziert (Tag 0); 15 Tiere wurden nicht mit Cannabinoiden behandelt (–), während weitere 15 Tiere zwischen Tag 12 und 19 mit THC (–) und weitere 15 Tiere mit WIN55,212-2 (...) behandelt wurden. Die mit Cannabinoiden behandelten Tiere lebten signifikant länger als die Kontrolltiere (P < 0,01 gemäß dem log-rank-Test). THC und WIN-55,212-2 wurden jeweils auch an 5 Ratten ohne induzierten Hirntumor verabreicht (– –).
    • (b) Magnetresonanzaufnahme in axialer Projektion (oben) und coronaler Projektion (unten) des Hirns einer Ratte vor (links) und nach (rechts) Behandlung mit THC. Ein Glioblastom von 100 mm3 (Pfeil) wurde durch 500 μg THC entfernt. Das Bild wurde 7 Tage nach Beendigung der Behandlung mit THC aufgenommen.
  • 4.
  • Antitumorale Wirkung von Cannabinoiden in immundefizienten Mäusen
    • (a) Glioblastome wurden in 18 Mäusen induziert. Wenn die Tumore die gewünschte Größe erreichten (Tag 0), wurden 6 Tiere 7 Tage lang mit Trägermittel behandelt (), während weitere 6 mit THC behandelt wurden () und weitere 6 mit WIN-55,212-2 behandelt wurden (=). Die Größe der Tumore in den mit Cannabinoiden behandelten Tieren war zu allen Zeitpunkten signifikant kleiner als bei den Kontrolltieren (P < 0,01 nach dem Student's t-Test).
    • (b) Beispiele von Glioblastomen in Mäusen (oben) und Präparaten (unten, Balkenlänge: 1 cm.) nach 7-tägiger Behandlung mit Trägermittel, THC oder WIN-55,212-2 (WIN).
  • 5
  • Auswirkung von Cannabinoid-Rezeptoren beim Zelltod
    • (a) C6-Glioblastom-Zellen wurden für 5 Tage in der Gegenwart oder in Abwesenheit von 1 μM THC, 1 μM SR141716 (SR1) und/oder 1 μM SR144528 (SR2) kultiviert (n = 6). *Signifikant anders als bei Inkubationen ohne Zusätze (P < 0,01 nach dem Student's t-Test).
    • (b) Vorhandensein von Cannabinoid-Rezeptoren CB1 und CB2 in C6-Glioblastom-Zellen. Die Detektion der Rezeptoren wurde mittels Western Blot mit spezifischen Antikörpern gegen jeden der beiden Rezeptoren durchgeführt.
  • Ausführungsform der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die unten beschriebenen Beispiele weiter erläutert.
  • Beispiel 1.
  • Heilung von Glioblastomen in Ratten
  • Männliche Wistar-Ratten (250 – 300 g an Körpergewicht) wurden mit 3 % Isofluoran in einer Sauerstoffmischung (0,8 l/min) und Protoxid (0,4 l/min) anästhetisiert. 5 × 108 C6-Glioblastom-Zellen wurden in 100 μl einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS), die mit 0,1 % Glukose supplementiert war, präpariert und stereotaktisch in den frontalen Parietallappen der rechten Gehirnhälfte injiziert (4 mm zur Rechten des Bregma, 4,5 mm Tiefe vom Cranium) (Izquierdo, M. et al., Gene Ther. 2, 66 – 69, 1995). Die Ratten erhelten für 3 Tage vor und für 7 Tage nach der Inokulation der Zellen Dexamethason (2 mg/l) und Tetracyclin (75 mg/kg pro Kilogramm Körpergewicht) in Wasser. Eine gründliche Überwachung der Tumore wurde mittels Magnetresonanz mit den von anderen Autoren beschriebenen Methoden durchgeführt (Izquierdo, M. et al., oben zitiert; Cortés, M.L., de Felipe, P., Martin, V. Hughes, M.A. & Izquierdo, M. Gene Ther. 5, 1499 – 1507, 1998).
  • Die Verabreichung der Cannabinoide an die Ratten begann 12 Tage nach der Inokulation der Zellen. Zu diesem Zeitpunkt betrug die durchschnittliche Tumorgröße 70 mm3 (Intervall von 25 – 100 mm3) wie mittels Magnetresonanz abgeschätzt wurde (Izquierdo, M. et al., oben zitiert; Cortés, de Felipe, Martin, V. Hughes & Izquierdo, M., oben zitiert). Cannabinoide wurden durch eine Kanüle verabreicht, die an dem Ort der Inokulation des Tumors platziert und am Cranium mit Dentalzement befestigt war; eine kleine Schraube aus rostfreiem Stahl verankerte die Kanüle und den Dentalzement. Die Kanüle war subkutan durch einen Katheter mit einer osmotischen Minipumpe (Alzet 2001) verbunden, die für 7 Tage mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 μl/h arbeitete. Die osmotische Pumpe wurde mit 500 – 2.500 μg THC oder 50 – 250 μg WIN-55,212-2 in 200 μl PBS gefüllt, das mit 5 mg/l Rinderserumalbumin (BSA) supplementiert war, das Lipid-frei gemacht und dialysiert war. Die Dosierung des verwendeten Cannabinoids hing von den Eigenschaften des zu behandelnden Tumors ab. Höhere Dosierungen wurden für große, dichte und invasive Tumore verwendet.
  • Wie in 3a zu sehen, starben alle Tiere, die unbehandelt gelassen wurden, einheitlich innerhalb von 12 – 18 Tagen nach der Inokulation der Zellen. Die mit Cannabinoiden behandelten Tiere hatten eine signifikant längere Lebenszeit als die Kontrolltiere. Außerdem beseitigten Cannabinoide den Tumor bei einem signifikanten Prozentsatz der Tiere vollständig. 3b zeigt eine Magnetresonanzaufnahme von einem der Tiere, das mit THC geheilt wurde; nach dem Verabreichen des Cannabinoids verschwand die Tumormasse vollständig, und ein verbleibender hypointenser Bereich wird beobachtet, der als fibröse Narbe am Ort der Inokulation gedeutet wird. Bei den mit Cannabinoiden geheilten Tieren wurde kein erneutes Auftreten beobachtet.
  • Beispiel 2.
  • Heilung von Glioblastomen in immundefizienten Ratten
  • Tumore wurden in RAG-2-/--Ratten durch subkutane Inokulation von 5 × 106 C6-Glioblastom-Zellen in 100 μl PBS induziert, das mit 0,1 % Glucose supplementiert war. Ungefähr 10 Tage später, als das durchschnittliche Tumorvolumen 250 mm3 (Intervall 200 – 300 mm3) betrug, wurden die Tiere zufällig in drei Gruppen eingeteilt, und ihnen wurden 7 Tage lang Trägermittel, 500 μg THC oder 50 μg WIN-55,212-2 pro Tag in 100 μl PBS injiziert, das mit 5 mg/ml Lipid-frei gemachtem und dialysiertem BSA supplementiert war. Die Tumorgrößen wurden mit einer Schieblehre gemessen, und ihr Volumen wurde entsprechend (4π/3) × (Breite/2)2 × (Länge/2) berechnet. Wie in 4a gezeigt, war die Tumorgröße bei den mit THC oder WIN-55,212-2 behandelten Tieren viel kleiner als bei den Kontrolltieren. In 4b sind Beispiele von Tumor-tragenden Mäusen und von Tumoren gezeigt, die nach 7-tägiger Behandlung mit oder ohne Cannabinoide präpariert wurden.
  • Beispiel 3
  • Auswirkung von Cannabinoid-Rezeptoren auf den Tod von Glioblastom-Zellen
  • C6-Glioblastom-Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in F-12-Medium kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum supplementiert war. 24 Stunden vor Beginn des Experiments wurden die Zellen in ein F-12-Medium transferiert, das frei von Serum war und das mit Insulin (5 μg/ml), Tranferrin (10 μg/ml), Natriumselenit (5 μg/ml) und Lipid-frei gemachtem und dialysiertem BSA (10 mg/ml) supplementiert war. Das Medium wurde alle 48 h erneuert, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach der MTT-Methode bestimmt (Sanchez, C., Galve-Roperh., I., Canova, C., Brachet, P & Guzman, M., oben zitiert). Wie in 5a gezeigt, war THC dazu in der Lage, den Tod von C6-Glioblastom-Zellen zu induzieren. Außerdem wurde der durch THC induzierte Zelltod verhindert, wenn SR141716 (ein selektiver Antagonist von CB1) und SR144528 (ein selektiver Antagonist von CB2) gleichzeitig zu dem Medium hinzugefügt wurden.
  • Um zu bestätigen, dass beide Rezeptoren in den C6-Zellen vorhanden waren, wurden die Zellen mit PBS gewaschen, die Platten in Lysis-Medium abgeschabt und die Partikelfraktion durch Zentrifugation für 60 Minuten bei 40.000 g erhalten. (Sanchez, C., Galve-Roperh., I., Canova, C., Brachet, P & Guzman, M., oben zitiert). Die Proben wurden einer Elektrophorese im Polyacrylamidgel mit Natriumdodecylsulfat unterzogen, und die Proteine wurden von den Gelen auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Die Membranen wurden mit 1 % Lipid-frei gemachtem und dialysiertem BSA geblockt und mit einem Antikörper gegen die Reste 1 – 14 des Ratten-CB1-Rezeptors (1 : 5.000 verdünnt) oder mit einem Antikörper gegen die Reste 350 – 361 des menschlichen CB2-Rezeptors (1 : 2.000 verdünnt) inkubiert. Die Proben wurden schließlich einer Entwicklung mit einem Elektrochemolumineszenz-Kit unterzogen (Amersham, Bucks, Vereinigtes Königreich). Wie in 5b, gezeigt, exprimieren C6-Glioblastom-Zellen sowohl den Rezeptor CB1 wie den Rezeptor CB2.
  • Beispiel 4
  • Sicherheit der in-vivo-Behandlung mit Cannabinoiden
  • Cannabinoide wurden für 7 Tage an Tumor-lose Ratten, wie oben beschrieben, verabreicht (2.500 μg THC oder 250 μg WIN-55,212-2). Die Ratten wurden dann getötet, und ihre Gehirne wurden in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert. Tod durch Apoptose wurde in 40 μm dicken Gehirnscheiben unter Verwendung eines TUNEL-Tinktur-Kits in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers (Boehringer, Mannheim, Deutschland) bestimmt. Die Markierung von DNA-Strängen mit Desoxyuridintriphosphat, das mit Fluoreszein markiert ist, wurde mit einem Konfokalmikroskop sichtbar gemacht (Anregungswellenlänge 488 nm, Emissionswellenlänge 525 nm). Die Laserintensität und die Sensitivität des Photodetektors wurden konstant gelassen, um einen Vergleich der Behandlungen zu erlauben. Mindestens 5 optische Felder pro Tier wurden untersucht.
  • TUNEL-Tinkturen wurden im subventrikularen Bereich der Rattenhirne durchgeführt, der beim erwachsenen Tier weiter proliferiert. Die Verabreichung von Cannabinoiden verursachte nicht nur keine signifikante apoptotische Wirkung im in-vivo-Gehirn, sondern außerdem wurde die leichte Markierung, die in dem caudado putamen der Kontrolltiere beobachtet wurde, nicht in den Tieren beobachtet, die mit Cannabinoiden behandelt wurden.

Claims (5)

  1. Verwendung von natürlichen und synthetischen Cannabinoiden bei der 5 Herstellung eines Medikaments zur therapeutischen Behandlung von Glioblastomen bei Säugetieren, einschliesslich Menschen
  2. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die natürlichen Cannabinoide aus der Gruppe gewählt werden, die Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC), Δ8- Tetrahydrocannabinol, Cannabinol und Cannabidinol umfasst.
  3. Verwendung gemäss einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das natürliche Cannabinoid Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) ist.
  4. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die synthetischen Cannabinoide aus der Gruppe gewählt werden, die WIN-55,212-2, HU-210, CP-55,940 und CP-50,556 (levonantradol) umfasst.
  5. Verwendung gemäss Anspruch 1 und 4, wobei das synthetische 20 Cannabinoid WIN-55,212-2 ist.
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